WO2009052942A2 - Stabilisierung von hydrophoben proteintherapeutika - Google Patents

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    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to a stabilized solution comprising a hydrophobic protein, a process for its preparation and the stabilized solution as a medicament and its use.
  • Hydrophobic proteins are often used as therapeutic agents in human medicine.
  • the problem with this use is that the hydrophobic protein therapeutics, in the absence of specific stabilizers, form aggregates containing inactive and immunogenic protein, depending on their concentration, pH, and ionic strength of the reagents during processing, formulation, and storage.
  • human serum albumin HSA
  • HSA Since the use of recombinant HSA for financial reasons is not economical, HSA is no longer used today. Also, HSA will no longer be approved by the regulatory authorities for the reasons stated above and the fact that the presence of HSA makes it difficult to control quality in terms of purity.
  • Carbohydrates and detergents such as polysorbates are currently used as HSA substitutes, but these are disadvantageous because of their tendency to form immunogenic aggregates.
  • carbohydrate amino acids are used to stabilize the protein therapeutics, but they require the addition of high arginine concentrations (up to 50 mg / ml) and still fail to provide satisfactory stabilization results.
  • high arginine concentrations necessitates an extremely low pH of the therapeutics stabilized therewith, so that, for example, parenteral administration aggregates the applied proteins and thus causes noxae at the puncture sites.
  • the object of the present invention is therefore to provide a stabilized solution of a hydrophobic protein, in which the risk of virus contamination is not present and their application with simultaneous health compatibility causes no undesirable reactions in the patient. Furthermore, during their storage no activity losses and aggregate formation should occur and the solution be easy and inexpensive to manufacture. This object is achieved by the stabilized solution, the process for its preparation and the medicament and its use according to the present invention. solved independent claims. Advantageous embodiments are given in the dependent claims.
  • hydrophobic hydrophobic
  • Protein to understand a protein that is characterized by a high proportion of hydrophobic amino acids and low solubility For example, natural or recombinant human interferon- ⁇ has a content of 40% of hydrophobic amino acids.
  • a low solubility is to be understood as a solubility of ⁇ 0.3 mg / ml.
  • proteins are used as hydrophobic proteins, which bind high affinity with the respective receptor proteins via hydrophobic sites (binding sites).
  • hydrophobic proteins used in the present invention are preferably natural or recombinant interferon-alpha, - ⁇ , -gamma, erythropoietin, interleukin II, G-CSF, colony stimulating factors, insulin, growth hormones, cytokines and / or mixtures thereof. Preference is given to mentioning natural or recombinant human interferon- ⁇ .
  • the polyhydric alcohols used for stabilization are alcohols which have at least two OH groups, wherein the OH groups are arranged such that the alcohols have a hydrophilic and hydrophobic region. Furthermore, the polyhydric alcohols used should have no harmful properties and may be approved for parenteral administration.
  • Examples of the polyhydric alcohols suitable for the invention are short-chain polyhydric alcohols and oligomers thereof. Preference is given to propylene glycol, glycerol, butylene glycol, pentane diol and / or mixtures thereof. Particular preference is given to propylene glycol and glycerol.
  • the concentration of the alcohol to be used depends on the degree of hydrophobicity of the hydrophobic protein. For example, in the case of rhul- terferon- ⁇ , 1-60% polyhydric alcohols are used for stabilization.
  • the polyhydric alcohols are in a concentration of from 1 to 60% by volume, preferably from 1 to 20% by volume, particularly preferably from 5 to 15% by volume, based on the total volume of the stabilized solution, in the stabilized solution Solution included.
  • the hydrophobic proteins according to the invention are contained in the stabilized solution in a concentration of 10 to 300 ⁇ g / ml, preferably of 10 to 200 ⁇ g / ml, particularly preferably of 80 to 120 ⁇ g / ml, based on the total volume of the stabilized solution ,
  • the hydrophobic protein and the polyhydric alcohol of the present invention are usually present in a ratio of from 1: 1,000 to 1: 10,000, preferably from 1: 200 to 1: 2,000, more preferably from 1: 500 to 1: 1,500, in the stabilized solution.
  • neutral pH is to be understood as meaning a pH of from pH 6 to pH 8, preferably from pH 6.5 to 7.5, particularly preferably from 6.8 to 7.2.
  • the solution stabilized according to the invention may contain further auxiliary substances and additives.
  • sugar alcohols such as mannitol and / or sorbitol.
  • Suitable buffer media which may optionally be present in the stabilized solution of the invention are buffered salt solutions of neutral pH.
  • the preferred buffer medium is a sodium
  • Phosphate buffer used. Similarly, Tris buffer or Hepes buffer can be used.
  • the solution stabilized according to the invention can also be lyophilized.
  • the corresponding lyophilizate must be dissolved in a suitable buffer medium before administration.
  • Another object of the present invention is a process for the preparation of a stabilized solution according to the invention, which is characterized by the successive use of polyhydric alcohols and maintaining a neutral pH during the individual process steps.
  • the preparation of a stabilized solution according to the invention comprising a hydrophobic protein according to the method of the invention is characterized in that the processing of the hydrophobic protein via at least one chromatographic step, preferably three chromatographic steps, takes place, in which at least one polyhydric alcohol obtained from the cell cultivation Cell culture supernatant and / or the eluants obtained from the respective chromatographic steps and / or the eluents is added, and the individual steps are carried out at a neutral pH.
  • a multivalent alcohol can be added already during the cultivation (expression and secretion) of the cells producing the respective hydrophobic protein.
  • work-up in the present context means the concentration of the respective hydrophobic protein with simultaneous separation of secreted host cell proteins and foreign protein fractions, which for example result from the protein admixtures already present in the media mixture used for cell cultivation Separation methods which lead to a high purification of the hydrophobic protein are chromatographic methods.
  • Preferred chromatography methods for the individual chromatographic steps according to the invention are affinity chromatography and / or gel filtration chromatography methods.
  • affinity column chromatography columns are preferably used whose column matrix form hydrophobic interactions and / or metal chelate complexes with the hydrophobic proteins.
  • gel filtration column chromatography columns are used which separate the proteins due to their different sizes.
  • the claimed sequence of the individual chromatographic steps is not mandatory and can be varied. Furthermore, it is possible to perform only one chromatography step.
  • Suitable eluents for performing affinity chromatography in which the column matrix forms hydrophobic interactions with the hydrophobic protein are elution agents which eliminate the interactions between hydrophobic protein and hydrophobic affinity chromatography material, such as ethylene glycol, propylene glycol,
  • Glycerol and / or mixtures thereof.
  • Zende columns are Cibacron Blue Sepharose, poly (A), glutathione, ConA, heparin sepharose columns and / or combinations of these columns, preferably a Cibacron Blue Sepharose column in question, but also any other type of support material in the form of similar polymer materials.
  • Suitable eluents for carrying out an affinity chromatography in which the column matrix forms metal chelate complexes with the hydrophobic protein are salts which are suitable for causing a change in the pH and / or imidazole.
  • chelate, nickel chelate, chromium chelate columns and / or combinations of these columns, preferably zinc chelate (chelating sepharose) columns are suitable.
  • Suitable eluents for carrying out a gel filtration chromatography are eluents which are suitable for separating, depending on the column material, the particular hydrophobic protein in a molecular weight range from 5 to 200,000 Da.
  • the column material should be chosen so that only minor hydrophobic interactions are formed between the column material and the hydrophobic protein.
  • Suitable columns to be used are P75, S-100, S-200, Bio-GeI P30 columns, preferably a P75 column.
  • Another object of the present invention is the stabilized solution according to the invention as
  • Medicaments this still further auxiliary and additives, like e.g. Sugar alcohols, such as mannitol and / or sorbitol.
  • Sugar alcohols such as mannitol and / or sorbitol.
  • the application of the medicament according to the invention is carried out parenterally, for example intramuscularly, subcutaneously. cutaneous or intravenous.
  • the respective hydrophobic protein is contained in each case in an amount of 5 to 300 ⁇ g / dose, preferably of 5 to 100 ⁇ g / dose, the injection frequency being dependent on the particular hydrophobic protein used and the indication.
  • the medicament according to the invention may also comprise further medicaments.
  • the combination of human interferon- ⁇ with glutamate acetate (copaxone) may be mentioned as an example.
  • the present invention is the use of the stabilized solution according to the invention for the production of a medicament for the treatment of diabetes, anemia, viral infections, tumors, autoimmune diseases and / or combinations of these diseases.
  • the cells used are CHO cells (Chinese hamster ovary cells). The cells are cultured in a media mixture of 50% MEM-alpha and 50% CHO-S-SFM-II with 1% MEM vitamin and 1% glycerol. There was no effect on cell vitality due to glycerol. 1st column step: Cibacron Blue Sepharose column
  • the added ethylene glycol is completely separated in the later steps.
  • Cibacron Blue Sepharose (Blue Sepharose Eluate) to 0.02 M phosphate buffer pH 7.0 with 0.5 M NaCl and 30% ethylene glycol.
  • Fig. 2 shows the silver stain and western blot of the individual fractions of a gel filtration.
  • the interferon beta is found only in fraction III of the gel filtration. Striking here is the good separation of the interferon (fraction III) from foreign proteins.
  • the eluate of Chelating Sepharose served as a reference.
  • FIG. 3 An overview of the stability test is given in FIG. 3:

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte Lösung umfassend ein hydrophobes Protein, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die stabilisierte Lösung als Arzneimittel und dessen Verwendung.

Description

Stabilisierung von hydrophoben Proteintherapeutika
Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte Lösung umfassend ein hydrophobes Protein, ein Verfah- ren zu dessen Herstellung sowie die stabilisierte Lösung als Arzneimittel und dessen Verwendung.
Hydrophobe Proteine werden in der Humanmedizin häufig als Therapeutika eingesetzt. Problematisch bei diesem Einsatz ist jedoch, dass die hydrophoben Proteintherapeutika in Abwesenheit von speziellen Stabilisatoren abhängig von ihrer Konzentration, pH-Wert und Ionenstärke der Reagenzien während der Aufarbeitung, Formulierung und Lagerung Aggregate bilden, die inak- tives und immunogenes Protein enthalten. Um diese Problematik zu umgehen, wurde in der Vergangenheit humanes Serumalbumin (HSA) während der Kultivierung, Aufarbeitung und Formulierung eingesetzt. Da bei dem Einsatz von natürlichem HSA (welches aus menschlichem Blutplasma gewonnen wird) die Gefahr einer Viruskon- tamination gesteigert ist und der Einsatz von rekom- binantem HSA aus finanziellen Gründen nicht wirtschaftlich ist, wird HSA heutzutage nicht mehr eingesetzt. Auch wird HSA von den Zulassungsbehörden aus vorstehend genannten Gründen und der Tatsache, dass die Anwesenheit von HSA die Qualitätskontrolle in Bezug auf den Reinheitsgrad erschwert, nicht mehr zugelassen.
Als HSA-Ersatz werden derzeit Kohlenhydrate und De- tergenzien wie Polysorbate eingesetzt, die jedoch aufgrund ihrer Neigung immunogene Aggregate auszubilden nachteilig sind. Alternativ werden Aminosäuren mit Kohlenhydraten zur Stabilisierung der Proteinthe- rapeutika eingesetzt, die jedoch den Zusatz von hohen Argininkonzentrationen (bis zu 50 mg/ml) erfordern und dennoch keine zufrieden stellenden Ergebnisse im Hinblick auf die Stabilisierung liefern. Zusätzlich bedingt der Zusatz von hohen Argininkonzentrationen einen extrem niedrigen pH-Wert der damit stabilisierten Therapeutika, so dass bei beispielsweise parenteraler Applikation die applizierten Proteine aggregie- ren und somit Noxen an den Einstichstellen bedingen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine stabilisierte Lösung eines hydrophoben Proteins bereitzustellen, bei der die Gefahr einer Viruskontamination nicht gegeben ist und deren Applikation bei gleichzeitiger gesundheitlicher Verträglichkeit keine unerwünschten Reaktionen bei dem Patienten hervorruft. Desweiteren sollte bei deren Lagerung keine Aktivitätsverluste und Aggregatbildungen auftreten und die Lösung einfach und kostengünstig in der Herstellung sein. Diese Aufgabe wird durch die stabilisierte Lösung, das Verfahren zu deren Herstellung sowie das Arzneimittel und dessen Verwendung gemäß den vorlie- genden unabhängigen Ansprüchen gelöst. Vorteilhafte Ausführungen werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.
Erfindungsgemäß ist unter dem Begriff hydrophobes
Protein ein Protein zu verstehen, das durch einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren und eine geringe Löslichkeit gekennzeichnet ist. Beispielsweise weist natürliches oder rekombinantes humanes Interfe- ron-ß einen Anteil von 40% hydrophober Aminosäuren auf. Unter einer geringen Löslichkeit ist eine Löslichkeit von < 0,3 mg/ml zu verstehen. In der vorliegenden Erfindung werden als hydrophobe Proteine Proteine eingesetzt, die mit den jeweiligen Rezeptorpro- teinen über hydrophobe sites (Bindungsstellen) hoch affin binden. Bevorzugt werden in der vorliegenden Erfindung als hydrophobe Proteine natürliches oder rekombinantes Interferon-alpha, -ß, -gamma, Erythro- poetin, Interleukin II, G-CSF, Kolonie stimulierende Faktoren, Insulin, Growth Hormone, Cytokine und/oder Mischungen hiervon eingesetzt. Bevorzugt ist natürliches oder rekombinantes humanes Interferon- ß zu nennen.
Die zur Stabilisierung eingesetzten mehrwertigen Alkohole sind Alkohole, die mindestens zwei OH-Gruppen aufweisen, wobei die OH-Gruppen derart angeordnet sind, dass die Alkohole einen hydrophilen und hydrophoben Bereich aufweisen. Desweiteren sollten die eingesetzten mehrwertigen Alkohole keine gesundheitsschädlichen Eigenschaften aufweisen und gegebenenfalls für eine parenterale Applikation zugelassen sein. Beispiele der für die Erfindung geeigneten mehrwertigen Alkohole sind kurzkettige, mehrwertige Alkohole sowie Oligomere hiervon. Bevorzugt zu nennen sind Propylenglycol, Glycerin, Butylenglycol, Pentan- diol und/oder Mischungen hiervon. Besonders bevorzugt sind Propylenglycol und Glycerin zu nennen. Die Konzentration des einzusetzenden Alkohols ist abhängig von dem Hydrophobizitätsgrad des hydrophoben Prote- ins. So werden beispielsweise im Falle von rhulnter- feron-ß 1-60 %ige mehrwertige Alkohole zur Stabilisierung eingesetzt.
Erfindungsgemäß sind die mehrwertigen Alkohole in ei- ner Konzentration von 1 bis 60 Vol.-%, bevorzugt von 1 bis 20 Vol.-%, besonders bevorzugt von 5 bis 15 Vol.-% bezogen auf das Gesamtvolumen der stabilisierten Lösung, in der stabilisierten Lösung enthalten.
Die erfindungsgemäßen hydrophoben Proteine sind in einer Konzentration von 10 bis 300 μg/ml , bevorzugt von 10 bis 200 μg/ml, besonders bevorzugt von 80 bis 120 μg/ml, bezogen auf das Gesamtvolumen der stabilisierten Lösung, in der stabilisierten Lösung enthal- ten.
Das erfindungsgemäße hydrophobe Protein und der mehrwertige Alkohol liegen üblicherweise in einem Verhältnis von 1:1.000 bis 1:10.000, bevorzugt von 1:200 bis 1:2.000, besonders bevorzugt von 1:500 bis 1:1.500, in der stabilisierten Lösung vor.
Erfindungsgemäß ist unter dem Begriff neutraler pH- Wert ein pH-Wert von pH 6 bis pH 8, bevorzugt pH 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt von 6,8 bis 7,2 zu verstehen.
Neben den mehrwertigen Alkoholen kann die erfindungs- gemäß stabilisierte Lösung weitere Hilfs- und Zusatz- Stoffe enthalten. Beispiele hierfür sind Zuckeralkohole, wie z.B. Mannitol und/oder Sorbitol . Geeignete Puffermedien, die gegebenenfalls in der erfindungsgemäßen stabilisierten Lösung enthalten sein können sind gepufferte Salzlösungen mit neutralem pH- Wert. Bevorzugt wird als Puffermedium ein Na-
Phosphatpuffer eingesetzt. Ebenso können Trispuffer oder Hepes- Puffer eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäß stabilisierte Lösung kann auch lyophilisiert werden. Das entsprechende Lyophilisat ist vor Applikation in einem entsprechenden Puffermedium aufzulösen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen stabilisierten Lösung, welches durch den sukzessiven Einsatz von mehrwertigen Alkoholen und der Einhaltung eines neutralen pH-Wertes während der einzelnen Verfahrensschritte gekennzeichnet ist. Die Herstellung einer erfindungsgemäß stabilisierten Lösung umfassend ein hydrophobes Protein gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Aufarbeitung des hydrophoben Proteins über mindestens einen chromatographischen Schritt, bevor- zugt drei chromatographische Schritte, erfolgt, in denen mindestens ein mehrwertiger Alkohol dem aus der Zellkultivierung erhaltenen Zellkulturüberstand und/oder den aus den jeweiligen Chromatographieschritten erhaltenen Eluaten und/oder den Elutionsmitteln zugesetzt wird, und die einzelnen Schritte bei einem neutralen pH-Wert durchgeführt werden. Gegebenenfalls kann bereits bei der Kultivierung (Expression und Sekretion) der das jeweilige hydrophobe Protein produzierenden Zellen ein mehrwer- tiger Alkohol zugegeben werden. Unter dem Begriff „Aufarbeitung" ist im vorliegenden Zusammenhang die Aufkonzentrierung des jeweiligen hydrophoben Proteins unter gleichzeitiger Abtrennung von sekretierten Wirtszellproteinen und Fremdprotein- anteilen, welche beispielsweise aus den in der Medienmischung, die zur Zellkultivierung dient, bereits vorhandenen Proteinzusätzen resultieren, zu verstehen. Als bevorzugte Trennverfahren, die zu einer Hochreinigung des hydrophoben Proteins führen, sind chromatographische Verfahren zu nennen.
Als bevorzugte Chromatographieverfahren für die einzelnen erfindungsgemäßen Chromatographieschritte sind Affinitätschromatographie- und/oder Gelfiltrati- onschromatographieverfahren zu nennen. Bevorzugt werden für die Affinitätssäulenchromatographie Säulen eingesetzt, deren Säulenmatrix mit den hydrophoben Proteinen hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Me- tallchelatkomplexe ausbilden. Für die GeIfiltrations- Säulenchromatographie werden Säulen eingesetzt, die die Proteine aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe auftrennen.
Die anspruchsgemäße Reihenfolge der einzelnen Chroma- tographieschritte ist nicht zwingend und kann variiert werden. Desweiteren ist es möglich, lediglich einen Chromatographieschritt durchzuführen.
Geeignete Elutionsmittel zur Durchführung einer Affi- nitätschromatographie, bei der die Säulenmatrix hydrohobe Wechselwirkungen mit dem hydrophoben Protein ausbildet, sind Elutionsmittel, die die Wechselwirkungen zwischen hydrophobem Protein und hydrophobem Affinitätschromatographiematerial eliminieren, wie beispielsweise Ethylenglycol, Propylenglycol,
Glycerin und/oder Mischungen hiervon. Als einzuset- zende Säulen kommen Cibacron Blue-Sepharose, poly(A)- , Glutathion- , ConA- , Heparinsepharose Säulen und/oder Kombinationen dieser Säulen, bevorzugt eine Cibacron Blue-Sepharose-Säule, in Frage, aber auch jede andere Art von Trägermaterial in Form von ähnlichen Polymermaterialien.
Geeignete Elutionsmittel zur Durchführung einer Affinitätschromatographie, bei der die Säulenmatrix Me- tallchelatkomplexe mit dem hydrophoben Protein ausbildet, sind Salze, die geeignet sind eine Änderung des pH-Wertes zu bewirken und/oder Imidazol. Als einzusetzende Säulen kommen Zink Chelat-, Nickel Chelat, Chrom Chelat-Säulen und/oder Kombinationen dieser Säulen, bevorzugt Zink Chelat (Chelating Sepharose) Säulen, in Frage.
Geeignete Elutionsmittel zur Durchführung einer GeI- filtrationschromatographie sind Elutionsmittel, die geeignet sind abhängig vom Säulenmaterial das jeweilige hydrophobe Protein in einem Molekulargewichtsbereich von 5 bis 200 000 Da aufzutrennen. Das Säulenmaterial sollte so gewählt werden, dass zwischen Säulenmaterial und hydrophoben Protein nur geringe hyd- rophobe Wechselwirkungen ausgebildet werden. Als einzusetzende Säulen kommen P75-, S-100-, S-200-, Bio- GeI P30-Säulen, bevorzugt eine P75-Säule, in Frage.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße stabilisierte Lösung als
Arzneimittel, wobei dieses noch weitere Hilfs- und Zusatzstoffe, wie z.B. Zuckeralkohole, wie bspw. Man- nitol und/oder Sorbitol umfassen kann.
Die Applikation des erfindungsgemäßen Arzneimittels erfolgt parenteral beispielsweise intramuskulär, sub- kutan oder intravenös. In dem erfindungsgemäßen Arzneimittel ist das jeweilige hydrophobe Protein jeweils in einer Menge von 5 bis 300 μg/Dosis, bevorzugt von 5 bis 100 μg/Dosis enthalten, wobei die In- jektionsfrequenz von dem jeweiligen eingesetzten hydrophoben Protein und der Indikation abhängig ist.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann neben der erfindungsgemäßen stabilisierten Lösung auch noch wei- tere Arzneistoffe umfassen. Lediglich beispielhaft sei die Kombination von humanem Interferon-ß mit GIa- tirameracetat (Copaxone) genannt.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß stabilisierten Lösung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes, Anämie, Virusinfektionen, Tumoren, Autoimmunerkrankungen und/oder Kombinationen dieser Erkrankungen .
Lediglich beispielhaft wird nachstehend anhand von humanem Interferon-ß (IFN-ß) eine mögliche Ausführung der vorliegenden Erfindung erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.
Bei %-Angaben wird im Folgenden immer von Volumenprozent (V/V) ausgegangen.
Kultivierung der Zellen
Als Zellen werden CHO-Zellen (Ovarialzellen des chinesischen Hamsters) eingesetzt. Die Zellen werden in einer Medienmischung aus 50 % MEM-alpha und 50 % CHO- S-SFM-II mit 1 % MEM Vitamins und 1 % Glycerin kulti- viert. Es konnte kein Einfluss auf die Zellvitalität durch das Glycerin festgestellt werden. 1. Säulenschritt: Cibacron Blue-Sepharose-Säule
Einstellen des Zellkulturüberstandes auf 15 % Ethy- lenglycol und 1 M NaCl in einem Zellkulturpuffer (Na- carbonat, Kohlensäurepuffer) pH 7,2.
Elution von der Säule mit einem 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 1 M NaCl und 60 % Ethylenglycol .
Das zugesetzte Ethylenglycol wird in den späteren Schritten vollständig abgetrennt. Möglich ist jedoch auch, auf Ethylenglycol vollständig zu verzichten und anstelle dessen Propylenglycol einzusetzen.
2. Säulenschritt: Zink-Chelat-Säule (Chelating Sepha- rose)
Einstellen des Eluats der Cibacron Blue-Sepharose (Blue Sepharose Eluat) auf 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,0 mit 0,5 M NaCl und 30 % Ethylenglycol.
Nach dem Auftrag waschen mit einem Waschpuffer der 10 % Glycerin und 0,5 M NaCl in einem 0,02 M Phosphat pH 7,0 enthält.
Elution mit einem Phosphatpuffer (0,02 M) mit 0,5 M NaCl, 10 % Glycerin und 0,1 M Imidazol .
3. Säulenschritt: Gelfiltration in einer P75 16 60
Einspritzen des Eluats der Chelatsäule; Lauf dann im Puffer:
0,02 M Phosphatpuffer, 10 % Propylenglycol, 0,5 M NaCl pH 6 , 8 Eine anschließende sofortige Stabilisierung mit HSA ist nicht erforderlich.
Übersicht über die Bilanzen der Aufarbeitungsmethode
Figure imgf000011_0001
Fig. 1 zeigt eine Übersicht über die Aufarbeitung ü- ber alle Säulen sowohl in der Silberfärbung als auch im spezifischen Westernblot.
Fig. 2 zeigt die Silberfärbung und den Westernblot der einzelnen Fraktionen einer Gelfiltration. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, ist das Interferon beta lediglich in Fraktion III der Gelfiltration zu finden. Auffällig hierbei ist die gute Trennung des Interferons (Fraktion III) von Fremdproteinen. Als Referenz diente das Eluat der Chelating Sepharose.
Einen Überblick über den Stabilitätstest gibt Fig. 3:
Um die Stabilität der Formulierung zu überprüfen, wurde das Produkt der Gelfiltration aufkonzentriert und sterilfiltriert. Eine Probe wurde 15 Tage bei Raumtemperatur inkubiert, als Vergleich diente ein Aliquot bei 4 0C. Es zeigte sich, dass keine Abbau- Produkte oder Degradation festzustellen waren. Auch die Aktivität der Probe im Vergleich zu der 4 0C Kontrolle und dem Messwert vor der Inkubation war innerhalb der Messungsgenauigkeit identisch. Dies belegt, dass hydrophobe Proteine alleine durch mindestens einen mehrwertigen Alkohol stabilisierbar sind.
Fig. 3 zeigt den Stabilitätstest des gelfiltrations- gereinigten und aufkonzentrierten Produktes. Es ist deutlich zu erkennen, dass keine Degradation nach 15 Tagen bei Raumtemperatur festzustellen ist

Claims

Patentansprüche
1. Stabilisierte Lösung umfassend ein hydrophobes Protein und mindestens einen mehrwertigen Alkohol zur Stabilisierung der Lösung, wobei die Lösung einen neutralen pH-Wert aufweist und frei von humanem Serumalbumin ist.
2. Stabilisierte Lösung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung zur Stabilisierung außer mindestens einem mehrwertigen Alkohol keine weiteren Stoffe zur Stabilisierung ent- hält.
3. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Protein ein humanes oder tierisches hydrophobes Protein ist .
4. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Stabilisator mindestens ein mehrwertiger Alkohol enthalten ist.
5. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mehrwertige Alkohol mindestens zwei OH- Gruppen und einen hydrophilen und hydrophoben Bereich aufweist.
6. Stabilisierte Lösung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der mehrwertige Alkohol, ausgewählt ist aus der Gruppe Ethylenglycol, Propylenglycol Glycerin, Butylenglykol, Pentan- diol und/oder Mischungen hiervon.
7. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mehrwertige Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 60 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der stabilisierten Lösung, in der stabilisierten Lösung enthalten ist.
8. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Protein ausgewählt ist aus der Gruppe natürliches oder rekombinantes humanes Interferon-alpha, -ß, gamma, Erythropoietin, In- terleukin II, G-CSF, Kolonie stimulierende Fak- toren, Insulin, Growth Hormon, Cytokin, und/oder
Mischungen hiervon.
9. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Protein in einer Konzentration von 10 bis 300 μg/ml, bezogen auf das Gesamtvolumen der stabilisierten Lösung, in der stabilisierten Lösung enthalten ist.
10. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Protein und der mehrwertige Alkohol in einem Verhältnis von 1:1.000 bis 1:10.000 (hydrophobes Protein zu mehrwertigen Alkohol) in der stabilisierten Lösung enthalten sind.
11. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das natürliche oder rekombinante humane Interfe- ron-ß und der mehrwertige Alkohol in einem Verhältnis von 1:500 bis 1:1.500 (natürliches oder rekombinantes humanes Interferon-ß zu mehrwertigen Alkohol) in der stabilisierten Lösung enthalten sind.
12. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die stabilisierte Lösung zusätzlich ein Puffermedium umfasst.
13. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Puffermedium eine gepufferte Salzlösung, insbesondere ein Na-Phosphatpuffer, ist.
14. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der neutrale pH-Wert in einem Bereich von pH 6,0 - 8,0 liegt.
15. Stabilisierte Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die stabilisierte Lösung aus mindestens einem hydrophoben Protein, mindestens einem mehrwerti- gen Alkohol zur Stabilisierung und mindestens einem Puffermedium besteht.
16. Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Lösung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zellkulturüber- stand enthaltend das hydrophobe Protein ohne
Einsatz von humanem Serumalbumin durch mindestens einen Chromatographieschritt aufgearbeitet wird, wobei der Zellkulturüberstand und/oder die jeweiligen Eluate aus den jeweiligen Chroma- tographieschritten und/oder die jeweiligen Elutionsmittel einen neutralen pH-Wert aufweisen und mindestens einen mehrwertigen Alkohol enthalten.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Chromatographieschritt (e) Affinitätschromatographie- und/oder Gelfiltrati- onschromatographieschritte ist/sind.
18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst : a) gegebenenfalls Kultivierung der das jeweilige hydrophobe Protein produzierenden Zellen in ei- ner Medienmischung enthaltend mindestens einen mehrwertigen Alkohol bei einem neutralen pH- Wert, b) Aufarbeitung des das hydrophobe Protein enthaltenden Zellkulturüberstandes durch Affini- täts-Säulenchromatographie, wobei die Säulenmatrix mit dem hydrophoben Protein hydrophobe Wechselwirkungen ausbildet, und/oder c) Aufarbeitung des Zellkulturüberstands oder des aus Schritt b) erhaltenen Eluats durch Affi- nitats-Säulenchromatographie, wobei die Säulenmatrix mit dem Eluat Metallchelatkomplexe ausbildet, und/oder d) Aufarbeitung des Zellkulturüberstands oder des aus Schritt b) oder c) erhaltenen Eluats durch GeIfiltrations-Säulenchromatographie e) Stabilisierung des zuvor erhaltenen hydrophoben Proteins.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine Cibacron Blue- Sepharose- und/oder in Schritt c) eine Zink-
Chelat-Säule verwendet wird.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) der Zellkulturüberstand mit einer Lösung enthaltend mindestens einen mehrwertigen Alkohol auf einen neutralen pH-Wert eingestellt und anschließend mit einem Elutionsmittel von der Säule eluiert wird.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18-20, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der Zellkulturüberstand oder das aus Schritt b) erhaltene Eluat mit einer Lösung enthaltend mindestens einen mehrwertigen Alkohol auf einen neutralen pH-Wert eingestellt, nach dem Auftrag auf die Säule gegebenenfalls mit einem neutralen Waschpuffer enthaltend mindestens einen mehrwertigen Alkohol gewaschen und anschließend mit einem Elutionsmittel von der Säule eluiert wird.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18-21, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelfiltration des Zellkulturüberstands oder des aus Schritt b) o- der c) erhaltenen Eluats bei einem neutralen pH- Wert erfolgt und ein Laufmittel enthaltend min- destens einen mehrwertigen Alkohol verwendet wird.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18-22, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) der Zellkulturüberstand oder das aus Schritt b) , c) oder d) erhaltene Eluat mit mindestens einem mehrwertigen Alkohol bei einem neutralen pH-Wert stabilisiert wird.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16-23, dadurch gekennzeichnet, dass der mehrwertige Alko- hol ausgewählt ist aus der Gruppe Ethylenglykol,
Propylenglykol , Glycerin, Butylenglycol, Pentan- diol und/oder Mischungen hiervon.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16-24, dadurch gekennzeichnet, dass der neutrale pH-Wert in einem Bereich von pH 6,0 - 8,0 liegt.
26. Stabilisierte Lösung gemäß einem der Ansprüche 1-15 als Arzneimittel.
27. Arzneimittel gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Protein in einer Menge von 5 bis 300 μg pro Dosis in dem Arzneimittel enthalten ist.
28. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 26 bis
27, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ein Lyophilisat ist.
29. Verwendung einer stabilisierten Lösung gemäß einem der Ansprüche 1-15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes, Anämie, Virusinfektionen, Tumoren, Autoimmunerkrankungen und/oder Kombinationen dieser Erkrankungen.
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