WO2009010194A1 - Polymeres trägermaterial für die kultivierung von zellen - Google Patents

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WO2009010194A1
WO2009010194A1 PCT/EP2008/005419 EP2008005419W WO2009010194A1 WO 2009010194 A1 WO2009010194 A1 WO 2009010194A1 EP 2008005419 W EP2008005419 W EP 2008005419W WO 2009010194 A1 WO2009010194 A1 WO 2009010194A1
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preparation
cells
alkyl
cig
monolithic
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PCT/EP2008/005419
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Michael R. Buchmeiser
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Institut für Oberflächenmodifizierung e.V.
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08G61/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
    • C08G61/02—Macromolecular compounds containing only carbon atoms in the main chain of the macromolecule, e.g. polyxylylenes
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    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
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    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the invention relates to a polymeric carrier material for the cultivation of cells, which is used in particular in regenerative medicine or in tissue engineering.
  • Tissue engineering is concerned with the development of artificial tissue or organs that maintain or restore the functions of damaged or diseased tissue or organs.
  • the goal is the production of new functional tissues by healthy, living cells. These cells can be of different origin.
  • Primary cells autogenous, allogenic or xenogeneic
  • Autogenic cells are from the same organism, allogeneic cells from another individual of the same species, while xenogeneic cells are derived from another species.
  • the source is both adult, fetal and neonatal tissue.
  • cell lines and genetically modified cells can also be used. As a rule, these must be changed in their properties before they are settled on the corresponding matrices. The cells are then cultured in a matrix of natural or synthetic origin, or a mixture of both.
  • implantable, natural or synthetic polymers for example (buccal) polymers or biomaterials, are used as the matrix material or carrier material.
  • porous or porosity means interconnected and unconnected intra- and / or interparticle cavities or inter- and / or intra-fiber cavities or generally cavities in the buildings used for the abovementioned applications.
  • Understood polymers Such cavities are for applications in the field of tissue
  • Carrier systems also called scaffolds, to provide.
  • the artificial matrix must be as similar as possible to the natural tissue in structure and properties. If this succeeds, the probability that the cells in this carrier system are integrated by the natural tissue and not repelled increases.
  • This method is best known for the production of scaffolds for bone regeneration.
  • water-soluble particles such as sugar or sodium chloride are added to the polymer solution.
  • the dispersion solution is poured into a mold to produce a 3-dimensional structure.
  • the porosity results fundamentally from the selective release of the particles from the polymer / salt composite.
  • the porosity and pore size are controllable by the amount and size of the salt particles.
  • polymers u. a. Starch-based or other natural polymers used.
  • This method is usually not used alone, but usually used in combination with porogenic system or for preforming the final material.
  • polymers are mixed with blowing agent.
  • the blowing agents are selected depending on the degradation temperature and the non-toxicity.
  • the porous structure is created because the blowing agents degrade during extrusion or injection while releasing gases. With this method, the pore size is very difficult to control.
  • the advantage is that the injection molding process is very reproducible and allows the development of a very complex 3D structure.
  • This method uses starch-based polymers (or other natural polymers) or biodegradable polymers, such as polylactide, polyglycolic acid or polycaprolactone, which can be melt-processed.
  • phase separation This method exploits the phase separation.
  • the basic principle of the thermally induced phase separation is used, which occurs when the temperature of a homologous polymer solution that has been brought into a mold is lowered.
  • the solvent-rich phase can be withdrawn by reduced pressure. resultant you get the polymer foam.
  • biofillers may also be added.
  • the object of the invention is to provide a carrier material which ensures that the problems of bulk degradation by using suitable (crosslinked) to avoid biodegradable polymers. It is another object of the invention to provide a method which allows the simple and rapid generation of 3-dimensional, monolithic, porous structures of any shape for applications in regenerative medicine or in tissue engineering.
  • porous support material according to the invention is based at least on monolithic, crosslinked, biocompatible and biodegradable polymeric materials.
  • the invention relates to monolithic, crosslinked, porous, biocompatible and biodegradable polymeric materials, in particular produced by means of ring-opening metathesis polymerization (ROMP) or free-radical polymerization as support materials (scaffolds) for regenerative medicine or tissue engineering.
  • the radical polymerization can be free by means of thermal or photochemical initiators or initiator, z. B. by electron beam curing or be triggered by ⁇ -radiation.
  • the structure of the matrix is porous.
  • a bimodal or multimodal pore distribution is desired.
  • those monomers and crosslinkers are used which are biocompatible or biodegradable.
  • cyclic, unsaturated esters and amides, substituted norbornenes, norbornadienes, cyclooctenes, acrylates and methacrylates are used.
  • “Monolithic” in the sense of the invention means that in the course of the polymer synthesis, a crosslinked, porous polymeric network, consisting of one piece, is produced.
  • Biocompatible in the sense of the invention means that there is no negative influence on cells in the environment of the material, their application does not lead to a clinically relevant reaction of the body.
  • Biodegradable in the sense of the invention means that a material in the human body can be degraded to non-toxic products and excreted or metabolized by the body.
  • cyclooctene, substituted cyclooctenes, 1,4,4a, 5,8,8a-hexahydro-l, 4,5,8-exo-e / 7 ⁇ -dimethanonaphthalene or tris may also be used.
  • oxy) methylsilane see MR Buchmeiser, Polymer 2007, 48, 2187.
  • the porogenic system was formed from 2-propanol (macroporogen) and toluene (microporogen), but in principle also other porogen systems are possible.
  • the scanning electron micrographs were taken partly with a JSM-6600 (Jeol, Japan) and partly with the ULTRA 55 (Carl Zeiss SMT, Oberkochen, Germany).
  • the samples for the scanning electron microscope from Jeol were vapor-deposited in advance with a gold layer.
  • the samples which were imaged with the ULTRA 55 were untreated.
  • a digital camera CAMEDIA C-4000 ZOOM from Olympus (Germany) was used.
  • an L-4500 UV detector (Merck) and an L-6200A HPLC pump (Merck) with manual sample injection were used.
  • the fluorescence micrographs were taken with an Axiovert 25 (Zeiss) equipped with an AxiocamMR5 camera.
  • the corresponding software Axiovision ReI.4.5 was used to evaluate the images and to count the cells.
  • Ethyl vinyl ether (EVE) (-99%), bicyclo [2.2.1] hept-2-ene (norborn-2-ene, NBE) (> 95%), 2-propanol and acryloyl chloride (> 96%) were obtained from Fluka, Potassium hydroxide 85-, pyridine (99.5%), dichloromethane (DCM) (pa), ethanol (99.8%), chloroform (99%) were purchased from KMF Laboratory Chemistry bottles-GmbH (Germany). Triethylamine (Merck), 2-propanol, pyridine and chloroform were dried over CaH 2 . Te trahydro furan (THF) (99%) was obtained from AppliChem (Darmstadt, Germany), 1,1,1-tris (hydroxymethyl) ethane (> 97%) at Acros (Belgium),
  • endo / exo-1-oxabicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2-carboxylic acid chloride (7.58 g, 0.0478 mol) was added and the solution stirred at room temperature for 3 days.
  • the product was dissolved under argon atmosphere in 50 mL diethyl ether and stirred for 30 min.
  • the ether solution was filtered off and washed twice with distilled water. Subsequently, sodium sulfate was added to the organic phase and filtered again. The solvent was removed and the product, a dark yellow oil, was dried under vacuum for 1 hour.
  • Solution A consisted of the monomer, the crosslinker and the macroporogen (e.g., 2-propanol);
  • Solution B contained the initiator in the microporogen (eg toluene) and possibly pyridine as a moderator.
  • microporogen eg toluene
  • Solution A and B were combined and stirred for a few seconds.
  • the various compositions of the polymerization solutions are given in Table 1.
  • the polymerization mixture was poured into the device to be filled, which in their shape corresponded to the final polymer to be generated.
  • the solution polymerized at room temperature in air within 1 h.
  • the monolith was repeatedly rinsed or extracted with a solution consisting of THF, DMSO and ethyl vinyl ether in a ratio of 1: 1: 1 (32% by weight, 40% by weight, 28% by weight) in order to obtain the Remove catalyst and excess monomer.
  • the monolith was washed with methanol and dried under vacuum.
  • the relevant physicochemical parameters were determined by inverse size exclusion chromatography. For example, they yielded an intermediate grain porosity ( ⁇ z ) of 77%, a microglobulosity ( ⁇ p ) of 7%, a total porosity ( ⁇ t ) of 84%, a mean pore diameter ( ⁇ m ) of 1080 ⁇ and a specific pore volume for monolith 6 (Vp 1S ) of 604 ⁇ L / g. From these values, a specific surface area of 22 m 2 / g was determined.
  • the monolithic structure had an average pore grain size of 100-200 ⁇ m.
  • NBE norborn-2-ene
  • COE cyclooctene
  • V 1 pentaglycerol tris (7-oxanorborn-5-en-2-yl carboxylate) and pentaglycerol bis (7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylate) acrylate (3: 1)
  • V2 DMN-H6
  • V3 tris (cyclooct-4-enyl-1-oxy) methylsilane
  • V4 di (cyclooct-4-en-1-yl) maleate
  • M mixture of 6,7-dihydro-2 (5 //) - oxepinon and 6,7-dihydro-2 (3 / f) -oxepinon (about l: l)
  • 2-PrOH 2-propanol, thereby ⁇ parts by wt..
  • the total dose was then applied in small increments ( ⁇ 3 kGy) in stages over a period of 15 minutes to keep the temperature rise in the solution below 50 ° C.
  • the monoliths were finally rinsed for purification with chloroform for 4 hours and with THF for 30 minutes each at a flow of 0.2 mL / min.
  • EMA ethyl methacrylate
  • V5 trimethylolpropane triacrylate
  • Il azobis (/ - butyronitrile)
  • I2 TEMPO
  • 2-PrOH 2-propanol
  • T 125 ° C, 3) parts by weight.
  • EMA ethyl methacrylate
  • V5 trimethylolpropane triacrylate
  • Monomer 2-methylene-4-phenyl-1,3-dioxolane
  • 2-PrOH 2-propanol, while 1 ⁇ parts by weight. Dose: 22 kGy.
  • the adipose tissue stromal cells were obtained from human adipose tissue taken from the pelvic region during routine operations.
  • the suspension was filtered through a 100 ⁇ m nylon mesh and centrifuged (300 g, 10 min).
  • the cultivation of the cells in the pellet was carried out at 37 0 C and 5% CO 2 - atmosphere in the incubator.
  • the culture medium (Iscove 's DMEM / HAM F12 1: 1, supplemented with 10% NCS) was changed every other day and the cells were passaged in a ratio of 1: 4. Subsequent colonization of the vehicle (example see Fig. 1, Appendix) was carried out with cells of the third passage. The cells thus cultured possess multipotentiality, thus being differentiable into different mesenchymal cells.
  • Table 4 Mean values of the cell count.
  • the sterilization of the monolith samples in the autoclave was carried out at a temperature of 121 0 C and a pressure of 1 bar over a period of 45 min.
  • Induction medium isobutylmethylxanthine, IBMX 0.5 mM, insulin 1.72 ⁇ M, additional supplementation of biotin and pantothenate. This was replaced after three days by an IBMX-free maintenance medium (insulin 1.72 ⁇ M, additional supplementation of biotin and pantothenate) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany) and used again after another three days for three days.
  • the Fat cells were stained with hematoxylin and eosin.
  • the 4 further monolith cultures were subjected to bony differentiation by adding an osteogenic differentiation medium ( ⁇ -glycerol phosphate, dexamethasone and vitamin D3, all from Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim).
  • Bone precursor cells that differentiated into bone forming cells such as osteoblasts or osteocytes. After 6 weeks almost all of the microscopically examined area was uniformly littered with calcium deposits. Fig. 4 shows the formed bone cells.
  • the monoliths were thoroughly sterilized before use. Subsequently, the cells were applied in a laminar-flow chapel to the monolithic discs in a 24-well-plate and filled with nutrient medium.
  • This nutrient medium consisted of a basal medium composed of a buffer system, nutrients and salts, and special additives, e.g. Growth factors and serum.
  • the 24-well-plate was then placed in an incubator and stained after 3 days with the vital dye acridine orange and observed under the light microscope.
  • the degradation behavior was investigated by pH measurements. Unsterilized, autoclave sterilized and gas sterilized samples were used because of the importance of comparing the three differently treated materials. To characterize the degradation, the loss of mass and, in this context, the degree of swelling was determined. Likewise, infrared spectra of the materials were recorded, the pH of the incubation solutions determined after incubation, and made by SEM micrographs. Of the
  • Biodegradation experiment ran for 15 or 30 weeks. There were two each unsterile Samples, two autoclave sterilized samples and two gas sterile samples incubated. The samples were in a 37 ° C dark water bath over this period. All samples showed continuous degradation but no bulk degradation.
  • the particle size is 1-2 ⁇ m.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, welches insbesondere in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering Anwendung findet.

Description

BESCHREIBUNG
Polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen
Die Erfindung betrifft ein polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, welches insbesondere in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering Anwendung findet.
Tissue Engineering beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichem Gewebe oder von Organen, welche die Funktionen von beschädigtem oder krankem Gewebe oder Organen aufrechterhalten oder wiederherstellen. Ziel ist dabei die Herstellung neuer funktioneller Gewebe durch gesunde, lebende Zellen. Diese Zellen können verschiedenen Ursprungs sein. Primäre Zellen (autogen, allogen oder xenogen) werden aus frischem Gewebe präpariert und unmodifiziert weiter verarbeitet. Autogene Zellen stammen vom selben Organismus, allogene Zellen von einem anderen Individuum derselben Art, während xenogene Zellen aus einer anderen Spezies gewonnen werden. Als Quelle dient sowohl adultes, fetales als auch neonatales Gewebe.
Neben den primären Zellen können auch Zelllinien und gentechnisch veränderte Zellen verwendet werden. Diese müssen in der Regel vor der Ansiedelung auf den entsprechenden Matrizes gezielt in ihren Eigenschaften verändert werden. Die Zellen werden dann in einer Matrix, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, oder einer Mischung beider, kultiviert.
Als Matrixmaterial bzw. Trägermaterial werden gegenwärtig implantierbare, natürliche oder synthetische Polymere, beispielsweise (BuIk-) Polymere oder Biomaterialien verwendet.
Bei implantierbaren Materialien unterscheidet man zusätzlich geschlossene Systeme, z.B. implantierbare Mikrokapseln, und offene Systeme, z. B. gewebte und nicht gewebte poröse Matrizes verschiedener Formen. Unter dem Begriff porös bzw. Porosität werden dabei in diesem Zusammenhang und im Sinne der Erfindung miteinander verbundene und nicht verbundene Intra- und/oder Interpartikelhohlräume bzw. Inter- und/oder Intrafaserhohlräume bzw. generell Hohlräume in den für die o. a. Anwendungen verwendeten (BuIk-) Polymeren verstanden. Solche Hohlräume sind für Anwendungen im Bereich des Tissue
Engineering von großer Bedeutung und müssen in der Regel groß genug (d. h. in der Regel >100 μm) sein, um das Einwachsen von Blutgefäßen zu erlauben.
Heutzutage finden Zellträger Systeme, basierend auf entsprechenden Trägermaterialien, Anwendung in der Herstellung von künstlichem Hautersatz bis hin zum Ersatz von Teilorganen. Zum Ersatz ganzer Organe mittels Tissue Engineering muss jedoch die künstliche Imitation weitgehend an das natürliche Gewebe angepasst sein. Dies erfordert die Durchführung von in v/Yro-Untersuchungen. Weiterhin sind Knochenrekonstruktionen und die Wiederherstellung von Weichgeweben zu nennen. Somit ist es notwendig, für all diese spezifischen Anwendungen spezielle
Trägersysteme, auch Scaffolds genannt, zu Verfügung zu stellen. Die künstliche Matrix muss dabei dem natürlichen Gewebe in Struktur und Eigenschaften so ähnlich wie möglich sein. Gelingt dies, vergrößert sich die Wahrscheinlichkeit, dass die in diesem Trägersystem befindlichen Zellen vom natürlichen Gewebe integriert und nicht abgestoßen werden.
Diese „Akzeptanz" des künstlichen Gewebes durch das natürliche wird auch mit dem Begriff „biokompatibel" umschrieben.
Eine große Bedeutung bei diesem Integrationsprozess spielen dabei naturgemäß das Trägermaterial selbst bzw. dessen Struktur. Ein beträchtlicher Teil der derzeit existierenden Materialien für die o. a. Anwendungen beruht u. a. auf Poly(milchsäure) = Poly(lactid). Ungeachtet der exzellenten Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit dieses Materials neigt es zum so genannten „bulk Abbau", einem nach einiger Zeit nach Implantation in den Körper auftretenden schlagartigen Abbau großer Teile des Materials, was zu massiven Reizungen und Entzündungen im betroffenen Gewebsbereich bei in vivo Anwendungen führen kann. Aus dem Stand der Technik sind mehrere Materialien für die Herstellung von Trägermaterialien (Scaffolds) bzw. deren Herstellung bekannt, z. B.:
- Lösungsmittel-Gießen mit Partikelauswaschung:
Diese Methode ist am besten bekannt für die Herstellung von Scaffolds für die Knochenregeneration. Dabei werden wasserlösliche Partikel, wie Zucker oder Natriumchlorid der Polymerlösung zugegeben. Die Dispersionslösung wird in eine Form gegossen um eine 3-dimensionale Struktur zu produzieren. Die Porosität resultiert grundlegend aus der selektiven Auslösung der Partikel aus dem Polymer/Salz- Komposit. Dabei sind die Porosität und die Porengröße über die Menge und die Größe der Salzpartikel kontrollierbar. Als Polymere werden u. a. Stärke-basierte oder andere natürliche Polymere eingesetzt.
- Schmelz-basierte Techniken (Spritzguss oder Extrusion mit Blähmitteln):
Diese Methode wird bisher meist nicht allein genutzt, sondern normalerweise in Kombination mit porogenen System oder zum Vorformen des finalen Materials verwendet. Dabei werden Polymere mit Blähmittel gemischt. Die Blähmittel werden in Abhängigkeit der Abbautemperatur und der Nicht-Toxizität auserwählt. Die poröse Struktur entsteht, da die Blähmittel sich bei der Extrusion oder Spritzguss abbauen und dabei Gase freisetzen. Bei dieser Methode lässt sich die Porengröße sehr schlecht kontrollieren. Der Vorteil ist jedoch, dass das Spritzgussverfahren sehr reproduzierbar ist und die Entwicklung einer sehr komplexen 3D-Struktur ermöglicht. Bei dieser Methode werden Stärke-basierte Polymere (oder andere natürliche Polymere) oder bioabbaubare Polymer, wie Polylactid, Polyglykolsäure oder Polycaprolacton verwendet, die mittels Schmelztechnik verarbeitet werden können.
- Gefriertrocknung: Bei dieser Methode wird die Phasenseparation ausgenutzt. Hier wird das Basisprinzip der thermisch induzierten Phasenseparation ausgenutzt, die auftritt, wenn die Temperatur einer homologen Polymerlösung, die in eine Form gebracht wurde, erniedrigt wird. Wenn das phasenseparierte System stabilisiert ist, kann die lösungsmittelreiche Phase durch verminderten Druck abgezogen werden. Resultierend erhält man den Polymerschaum. Unter anderem kann man Chitosan Flocken oder andere natürliche oder bioabbaubare Polymere verwenden. Im Falle von Komposit als Trägermaterialien können auch Biofüllstoffe zugegeben werden.
Ein generelles Problem aller existierenden Trägermaterialien liegt weiterhin in den beträchtlichen Limitationen in der Herstellung 3-dimensionaler Strukturen. Diese können bis dato nur mit erheblichem Aufwand, z. B. mittels inkjet Printing, Spritzguss oder anderer Verfahren (s. u.) aus löslichen Polymeren hergestellt werden. Speziell die Generierung poröser Strukturen mit Poren im Bereich von einigen 10 bis 100 μm stellt dabei ein beträchtliches technologisches Problem in der industriellen Produktion dar.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Trägermaterial bereit zu stellen, welches es gewährleistet die Probleme des bulk Abbaus durch Verwendung geeigneter (vernetzter), bioabbaubarer Polymere zu umgehen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die einfache und schnelle Generierung 3- dimensionaler, monolithischer, poröser Strukturen beliebiger Form für Anwendungen in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering erlaubt.
Die Aufgabe der Erfindung bezüglich eines solchen Trägermaterials wird dabei durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.
Erfindungswesentlich ist, dass das erfindungsgemäße poröse Trägermaterial zumindest auf monolithischen, vernetzten, biokompatiblen und bioabbaubaren polymeren Materialien basiert.
Die Erfindung hat monolithische, vernetzte, poröse, biokompatible und bioabbaubare polymere Materialien, insbesondere hergestellt mittels Ring öffnender Metathesepolymerisation (ROMP) bzw. radikalischer Polymerisation als Trägermaterialien (Scaffolds) für die Regenerativmedizin bzw. das Tissue Engineering, zum Inhalt. Die radikalische Polymerisation kann dabei mittels thermischer oder photochemischer Initiatoren oder aber auch Initiator frei, z. B. mittels Elektronenstrahl Härtung oder mittels γ-Strahlung ausgelöst werden. Die Struktur der Matrix ist dabei porös.
Die Unteransprüche 2 bis 6 zeigen vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Trägermaterials auf, ohne diese abschließend zu beschreiben.
Vorzugsweise aber nicht ausschließlich wird eine bi- oder multimodale Porenverteilung angestrebt.
Vorzugsweise werden solche Monomere und Vernetzer verwendet, welche biokompatibel bzw. bioabbaubar sind.
Vorzugsweise aber nicht ausschließlich werden zyklische, ungesättigte Ester und Amide, substituierte Norbornene, Norbornadiene, Cyclooctene, Acrylate und Methacrylate verwendet.
Weiterhin wird die Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines polymeren Trägermaterials für die Kultivierung von Zellen gemäß den Merkmalen der Ansprüche 7 sowie alternativ gemäß den Merkmalen der Ansprüche 10, 11 und 12 gelöst.
Die Unteransprüche 8 bis 9 sowie 13 bis 14 zeigen vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren auf, ohne diese abschließend zu beschreiben.
„Monolithisch" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass im Zuge der Polymersynthese ein vernetztes, poröses polymeres Netzwerk, aus einem Stück bestehend, erzeugt wird.
„Biokompatibel" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass kein negativer Einfluss auf Zellen in Umgebung des Materials besteht, ihre Anwendung führt zu keiner klinisch relevanten Reaktion des Körpers. „Bioabbaubar" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass ein Material im menschlichen Körper zu nicht-toxischen Produkten abgebaut und vom Körper ausgeschieden bzw. metabolisiert werden kann.
Im Folgenden sind besonders günstige Ausfuhrungsformen der Erfindung exemplarisch aufgezeigt, ohne die Erfindung damit zu begrenzen.
Experimentelles A.l Allgemeines Die für das Tissue Engineering verwendeten monolithischen Strukturen, welche als Trägermaterial (Scaffolds) dienten, wurden mit Hilfe der Ring öffnenden Metathesepolymerisation (ROMP) bzw. mittels radikalischer Polymerisation hergestellt. Für die ROMP wurden Norborn-2-en (NBE) als Monomer und ein Gemisch aus Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7- oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat)acrylat (3:1) als Vernetzer (V) verwendet. Alternativ können auch Cycloocten, substituierte Cyclooctene, l,4,4a,5,8,8a-Hexahydro-l,4,5,8- exo-e/7<io-dimethanonaphtalin oder Tris(cyclooct-4-enyl-l-oxy)methylsilan, siehe M. R. Buchmeiser, Polymer 2007, 48, 2187, verwendet werden. Das porogene System wurde aus 2-Propanol (Makroporogen) und Toluol (Mikroporogen) gebildet, grundsätzlich sind jedoch auch andere Porogensysteme möglich. Als Initiator diente RuCl2(Pyridin)2(IMesH2)(CHC6H5) (IMesH2=l,3-Dimesityl-4,5-tetrahydroimidazolin- 2-yliden). Wo zweckmäßig, wurde Pyridin zur Regulierung der Polymerisation eingesetzt.
1H- und 13C-NMR Spektren wurden mit einem Bruker Spectrospin 250 bei 250 bzw. 62 MHz und 25°C aufgenommen. GC-MS-Messungen wurden an einem GCMS QP5050 (Shimadzu), mit einer SPB-5 fused silica Säule (30m x 25 μm Filmdicke) bei einem Säulenfluss von 1.0 mL/min, durchgeführt. Alle ATR-Infrarot-Messungen wurden an einem Vector 22 (Bruker), ausgestattet mit einer Golden Gate, durchgeführt. Für jede Probe wurden 32 Scans gemessen. Zur Datenanalyse wurde die Bruker Opus 5.5 US Software verwendet. Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden teils mit einem JSM-6600 (Jeol, Japan) und teils mit dem ULTRA 55 (Carl Zeiss SMT, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen. Die Proben für das Rasterelektronenmikroskop von Jeol wurden in Vorfeld mit einer Goldschicht bedampft. Die Proben, welche mit dem ULTRA 55 abgebildet wurden, waren unbehandelt. Zur Erstellung der Fotos wurde eine Digitalkamera CAMEDIA C-4000 ZOOM von Olympus (Deutschland) benutzt. Für die Größenausschlusschromatographie wurden ein L-4500 UV Detektor (Merck) und eine L-6200A HPLC Pumpe (Merck) mit manueller Probeninjektion genutzt. Zur Datenerfassung und Auswertung kam die
Chromatography Data Station Software D-7000 HPLC System Manager zum Einsatz. Die inverse Größenausschlusschromatographie diente als Charakterisierungsmethode des Monolithen und wurde mit Chloroform als Laufmittel durchgeführt. Dabei wurden die Standards, mit einer Konzentration von 0.25 mg/mL Chloroform, per Hand injiziert. Die Menge an injizierten Standards betrug 10 μL je Messung. Die Durchflussrate betrug dabei 0.57 mL/ min. Die ICP-OES Messungen wurden an einem CIROS System (Spectro A. L, Kleve) durchgeführt. Die Mikrowellenaufschlüsse wurden mittels einem MLS 1200 mega Mikrowellengerät (MSL GmbH, Deutschland) bewerkstelligt. Zyklus: Aufheizen in 9 Minuten von 20 auf 180°C bei 700 W, 12 Minuten bei konstanter Temperatur bei 180°C und Abkühlung von 1800C auf 20°C in 90 Minuten. Die Messung des Rutheniumgehalts wurde bei den Wellenlängen λ=267.876 nm und λ=240.272 nm durchgeführt. Zum Vergleich wurden zwei Lösungen mit den Rutheniumkonzentrationen 0.5 mg/L und 1 mg/L angefertigt. Mit dem pH-Meter 766 Calimatic (Knick) wurden, nach entsprechender Kalibrierung, pH-Werte bei Temperaturen zwischen 26°C und 29°C gemessen. Für die Sterilisation wurden der Autoklav Variomag S (H+P Labortechnik AG) mit Vorvakuum genutzt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem Axiovert 25 (Zeiss), ausgestattet mit einer Kamera AxiocamMR5 fotografiert. Zur Auswertung der Bilder und zur Zellzählung wurde die dazugehörige Software Axiovision ReI.4.5 verwendet. A.2 Reagenzien und Standards
Alle Reaktionen mit luft- bzw. hydrolyseempfindlichen Substanzen wurden mit Hilfe der Schlenktechnik unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre in einer Schutzgasbox (LabMaster, Braun, Germany) durchgeführt. [RuCl2(PCy3)(IMeSH2)(CHPh)] (PCy3=Tricyclohexylphosphin), Phosphat-Pufferlösung (pH ~ 7.2) und Natriumazid wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Furan (99+%, Sigma-Aldrich), wurde vor der Benutzung nochmals destilliert. Dimethylsulfoxid (DMSO) ( ≥ 99% ), Toloul (reinst) wurden von Merck (Deutschland) bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ethylvinylether (EVE) (-99%), Bicyclo[2.2.1]hept-2-en (Norborn-2-en, NBE) (> 95% ), 2-Propanol und Acrylsäurechlorid ( > 96% ) wurden von Fluka, Kaliumhydroxid 85-, Pyridin (99,5%), Dichlormethan (DCM) (p.a.), Ethanol (99,8%), Chloroform (99%) wurden von der KMF Laborchemie Handels-GmbH (Deutschland) bezogen. Triethylamin (Merck), 2-Propanol, Pyridin und Chloroform wurden über CaH2 getrocknet. Te trahydro furan (THF) (99%) wurde bei AppliChem (Darmstadt, Deutschland), 1,1,1 -Tris(hydroxymethyl)ethan ( > 97% ) bei Acros (Belgien),
Diethylether bei Sasol, 5-(Bicycloheptenyl)trichlorosilan bei ABCR (Deutschland) und Aceton bei VWR (Deutschland) bestellt und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die Polystyrol (PS) Standards mit den Molekularmassen (Mw): 1 180, 17200, 23800, 75000, 1260000, 3150000 und 1x107 g/mol wurden von Polymer Standards Service (PSS, Pittsburg, PA, USA), die Standards mit den Molekularmassen: 4000, 30000, 200000 und 400000 g/mol von Pressure Chemical (Pittsburg, USA) bezogen.
A.3 Synthesen
A.3.1 Synthese der Vernetzer (Vl=Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxyl)acrylat, 3: 1) 1 , 1 , 1 -Tris(hydroxymethyl)ethan (1.91 g; 0.016 mol) wurde in trockenem Dichlormethan suspendiert und mit Triethylamin (5.77 g; 0.057 mol) versetzt. Anschließend wurde die Lösung auf-35°C gekühlt. Danach wurde endo/exo-1- Oxabicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-carbonsäurechlorid (7.58 g; 0.0478 mol) zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur 3 Tage gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde das Produkt unter Argonatmosphäre in 50 mL Diethylether gelöst und 30 min gerührt. Die Etherlösung wurde abfiltriert und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde Natriumsulfat zur organischen Phase zugegeben und erneut filtriert. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Produkt, ein dunkelgelbes Öl, wurde unter Vakuum 1 Stunde lang getrocknet. Das Produkt repräsentierte eine Mischung aus Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxyl)acrylat (3:1). Ausbeute: 6.61 g (85.3%); M=486.26 g/mol; FTIR (ATR mode): 2958 (s), 1723 (s), 1633 (m), 1407 (m), 1273 (m), 1 165 (s), 1016 (s) and 703 (m) cm"1. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 1.07 (m, 3H, CH3), 2.16-2.46 (m), 3.16 (m, IH, CH), 4.12 (m, 2H), 5.03 (d, J = 4.5 Hz, IH, CH), 5.06 (d, J = 4.4 Hz, IH, CH), 5.16 (s, IH, CH), 5.88 (d, J = 7.3, IH, CH), 6.14 (m, IH), 6.38 (m, 4H); 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 173.7, 172.0, 165.9, 137.3, 134.7, 132.6, 131.6, 128.0 81.0, 79.0, 78.1, 66.3, 66.0, 42.9, 38.8, 29.3, 28.6, 17.4.
A.3.2 Herstellung der monolithisch strukturierten Scaffolds mittels ROMP
Zwei verschiedene Lösungen A und B wurden hergestellt und auf eine Polymerisationstemperatur von O0C gekühlt.
Lösung A bestand aus dem Monomer, dem Vernetzer und dem Makroporogen (z. B. 2- Propanol);
Lösung B beinhaltete den Initiator im Mikroporogen (z. B. Toluol) und ggf. Pyridin als Moderator.
Lösung A und B wurden vereint und für einige Sekunden gerührt. Die verschiedenen Zusammensetzungen der Polymerisationslösungen sind in Tabelle 1 angegeben. Die Polymerisationsmischung wurde in die zu befüllende Vorrichtung gegossen, welche in ihrer Form dem letztendlich zu generierenden Polymer entsprach. Die Lösung polymerisierte bei Raumtemperatur unter Luft innerhalb von 1 h aus. Anschließend wurde der Monolith mit einer Lösung bestehend aus THF, DMSO und Ethylvinylether, im Verhältnis 1 : 1 : 1 (32 Gew.-%; 40 Gew.-%; 28 Gew.-%), mehrmals gespült bzw. extrahiert, um den Katalysator und überschüssiges Monomer zu entfernen. Zum Schluss wurde der Monolith mit Methanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Die relevanten physico-chemischen Parameter wurden mittels inverser Größenauschlusschromatographie bestimmt. Sie ergaben z.B. für Monolith 6 eine Zwischenkornporosität (εz) von 77%, eine Microglobulporosität (εp) von 7%, eine Gesamtporosität (εt) von 84%, einen mittleren Porendurchmesser (Φm) von 1080 Ä und ein spezifisches Porenvolumen (Vp1S) von 604 μL/g. Aus diesen Werten wurde eine spezifische Oberfläche von 22 m2/g ermittelt. Die monolithische Struktur wies dabei eine durchschnittliche Zwischenkornporengröße von 100-200 μm auf.
Tabelle 1:
Zusammensetzung der mittels ROMP hergestellten Monolithen. NBE=Norborn-2-ene, COE=Cycloocten, V 1 =Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat)acrylat (3: 1), V2=DMN-H6, V3=Tris(cyclooct-4-enyl- 1 -oxy)methylsilan, V4=Di(cyclooct-4-en- 1 -yl)maleat, M=Mischung aus 6,7-Dihydro-2(5//)-oxepinon und 6,7-Dihydro-2(3/f)-oxepinon (ca. l : l),.2-PrOH=2-Propanol, dabei υ Gew. -Teile.
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
A.3.3 Herstellung der monolithischen Scaffolds mittels radikalischer Polymerisation
Die Herstellung monolithischer Systeme mittels thermisch induzierter freier radikalischer Polymerisation, Tetramethylpiperidyloxy- (TEMPO-) induzierter Polymerisation oder photochemisch induzierter Polymerisation erfolgte in der jeweils zu befüllenden Vorrichtung analog zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren (siehe M. R. Buchmeiser, Polymer 2007, 48, 2187). Die Elektronenstrahlhärtungen wurden an einem 10 MeV Linearbeschleuniger ELEKTRONIKA (Toriy Company, Moskau) durchgeführt. Der Beschleuniger wurde bei 50 Hz Wiederholungsrate und 4μs Pulslänge unter Verwendung eines Horns (Bestrahlungsbreite bis 40 cm, Frequenz 1 Hz) und einem beweglichen Tisch betreiben. Als Referenzdosis wurde die auf Graphit applizierte Dosis kalorimetrisch ohne weitere Korrektur ermittelt. Die Gesamtdosis wurde dabei in kleinen Schritten (~3 kGy) stufenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten appliziert um den Temperaturanstieg in der Lösung unter 50°C zu halten. Die Monolithe wurden abschließend zur Reinigung mit Chloroform für 4 Stunden und mit THF für 30 min jeweils bei einem Fluss von 0.2 mL/min gespült.
Tabelle 2:
Zusammensetzung der mittels radikalischer Polymerisation hergestellten Monolithen. EMA=Ethylmethacrylat, V5=Trimethylolpropantriacrylat. Il =Azobis(/-butyronitril), I2=TEMPO, 2-PrOH=2-Propanol, dabei '^760C, 2)T=125°C, 3) Gew.-Teile.
Monolith EMA3) V53) 2- 1- Toluol3) Dosis PrOH3) Dodecanol3) [kGy]
31 15 15 30 30 10 22
32 20 20 25 25 10 22
33 22.5 22.5 22.5 22.5 10 22
34 25 25 20 20 10 22
35 15 15 30 30 10 35
Monolith EMA2) TMPTA2) 2- 1- Toluol2) Il2)
PΪ OK2) Dodecanoϊ2)
36» 15 15 30 30 10 1
372) 15 15 - 60 10 1
A.3.4. Herstellung monolithischer Strukturen auf Basis von Methylendoxolanen
«-Dodecanol wurde 24 h lang im Hochvakuum getrocknet. Der Vernetzer wurde über trockenem Al2O3 filtriert um mögliche Verunreinigung zu eliminieren, 2-Propanol wurde über CaH2 getrocknet. Aufgrund der geringen Stabilität des Monomers an Luft (wasser- und säureempfindlich) wurden die Polymerisationslösungen mittels Schlenktechnik hergestellt. Die dabei verwendeten Glasgefaße wurden vor der Verwendung ins Laugenbad gegeben, mit Wasser gespült und im Trockenschrank getrocknet. Die Herstellung erfolgte mittels Elektronenstrahlhärtung.
Tabelle 3:
Zusammensetzung der mittels radikalischer Polymerisation hergestellten Monolithen. EMA=Ethylmethacrylat, V5=Trimethylolpropantriacrylat. Monomer=2-Methylene-4- phenyl-l,3-dioxolan; 2-PrOH=2-Propanol, dabei 1^ Gew.-Teile. Dosis: 22 kGy.
# V5!) Monomer0 2-PrOH0 n-Dodecanolυ Toluol0
38 15 15 30 35 5
39 15 15 15 45 10
40 20 10 10 49 11
41 21 10 30 30 10
42 24 5 29 31 11
43 20 10 31 30 10
44 20 10 40 21 10
45 20 10 30 35 6
46 20 10 25 25 20
47 23 11 54 0 12
48 15 7 38 19 21
49 15 7 44 23 11
B. Medizinische Untersuchung an monolithischen Strukturen B.l Humane Fettgewebsstromazellen
Die Fettgewebestromazellen wurden aus humanem Fettgewebe gewonnen, das bei Routineoperationen aus der Beckenregion entnommen wurde. Das Fettgewebe wurde steril zerteilt und mittels Kollagenaselösung (Kollagenase Typ II, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) digestiert. Die Enzymaktivität wurde durch Medium mit Serumzusatz (Iscove's DMEM/HAM Fl 2 1 : 1, supplementiert mit 10% NCS=neonatal calf serum, alles von Life Technologies, Paisley, Schottland) gestoppt. Die Suspension wurde durch ein 100 μm Nylonnetz gefiltert und zentrifugiert (300 g, 10 min). Die Kultivierung der Zellen im Pellet erfolgte bei 370C und 5% CO2- Atmosphäre im Inkubator. Das Kulturmedium (Iscove's DMEM/HAM F12 1 : 1, supplementiert mit 10% NCS) wurde jeden 2. Tag gewechselt und die Zellen im Verhältnis 1 :4 passagiert. Die anschließende Besiedlung der Trägersubstanz (Beispiel s. Abb. 1 , Anhang) erfolgte mit Zellen der dritten Passage. Die so kultivierten Zellen besitzen Multipotentialität, sind somit in unterschiedliche mesenchymale Zellen differenzierbar. In durchflußzytometrischen Analysen waren derart kultivierte Zellen positiv für CD29 (ß-1 integrin), CD44, CD73 (SH3, Ecto-5'-nucleotidase), CD90 (Thy- 1), CD 105 (Endoglin) and negativ für hämatopoetische Marker (CD31 , CD34, CD45, CD 133, CD 166). Ihr Oberflächenmarkerprofil entsprach somit weitgehend dem mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark. Die Zellen waren nach
Kultivierung in entsprechenden Induktionsmedien sowohl in konventioneller zweidimensionaler Kultur als auch in dreidimensionalen Gewebeaggregaten adipogen, osteogen und glattmuskulär differenzierbar.
B.2 Erstellung der Wachstumskurve
Die Gassterilisation wurde mit Formalin bei 60°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben gewässert, um das Restformalin zu beseitigen. Die Besiedelung der Monolithscheiben wurde mit mesenchymalen Stammzellen durchgeführt. Diese wurden in Iscove's Modified Dulbecco's Medium gemischt mit HAM-FIZ kultiviert. 16 Monolithen wurden in Medium gewässert und einzeln in die Wells einer 24- Multiwellplatte platziert. Die Besiedlung erfolgte mit 18.000 Zellen pro Well (10.000 Zellen pro cm2). Je drei Monolithen wurden nach 3, 6, 9 und 12 Tagen entnommen und zunächst die Vitalität mit einer Acridin-Orange Vitalfärbung (Sigma-Aldrich) gezeigt (fotografische Dokumentation). Ethidiumbromid wurde als Farbstoff für abgestorbene Zellen verwendet. Danach erfolgte Fixierung in 4%igem Paraformaldehyd und die nochmalige Färbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die Auszählung erfolgte unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Zählrasters (0.8 x 0.8 cm), welches in das Okular des Mikroskops eingesetzt wurde. Aus den Zellzahlen der 6 Felder pro Probe und den ausgezählten Monolithenscheiben wurde ein Mittelwert pro Entnahmezeitpunkt gebildet. Die Werte wurden gegen die Zeitachse aufgetragen. Die Zellen verblieben bei der Zählung auf dem Material. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Abb. 2 dargestellt.
Tabelle 4: Mittelwerte der Zellzählung.
Besiedlungsdauer Zellzahl/cm2 eingesetzte Zellmenge am Starttag 10000
3 Tage 25000
6 Tage 26875
9 Tage 36250
12 Tage 38125
B.3 Zelldifferenzierung auf der Trägestruktur (Monolith)
Die Sterilisation der Monolithproben im Autoklav erfolgte bei einer Temperatur von 1210C und einem Druck von 1 bar über einen Zeitraum von 45 min. Die
Gassterilisation wurde mit Formalin bei 60 0C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben zur Entfernung deb> Recformaiins gewässert. Acht Monolithen wurden zunächst mit etwa 10 Fettgewebsstromazellen der 3. Passage besiedelt und über 10 Tage in rotierenden Kulturcontainern kultiviert. Danach erfolgte die adipogene Differenzierung der Zellen auf 4 Monolithen mittels Kultivierung in einem adipogenen
Induktionsmedium (Isobutylmethylxanthin, IBMX 0.5 mM, Insulin 1.72 μM, zusätzliche Supplementierung von Biotin und Pantothenat). Dieses wurde nach drei Tagen durch ein IBMX-freies Erhaltungsmedium (Insulin 1.72 μM, zusätzliche Supplementierung von Biotin und Pantothenat) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany) ersetzt und nach weiteren drei Tagen erneut für drei Tage verwendet. Die Fettzellen wurden dafür mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die 4 weiteren Monolithenkulturen wurden durch Zugabe eines osteogenen Differenzierungsmediums (ß-glycerolphosphat, Dexamethason und Vitamin D3, alle von Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim) der knöchernen Differenzierung zugeführt. Nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen wurde jeweils ein halber, mittig geteilter Monolith entnommen und in Paraformaldehyd 4% in PBS fixiert. Die Monolithen wurden in Paraffin eingebettet und histologische Schnitte senkrecht zur Oberfläche angefertigt. Schnitte der adipogen differenzierten Kulturen wurden mittels HE gefärbt, in den osteogen differenzierten Kulturen erfolgte der Nachweis von Matrixmineralisationen mittels von Kossa Färbung. Die Auswertung erfolge semiquantitativ unter dem Lichtmikroskop und 20-facher Vergrößerung. Fettzellen: 6 Wochen nach Beginn der Differenzierung hatten sich Adipozyten voll ausgebildet. Zellkern und das Zellplasma lagen weitgehend am Rand der Zellen. Die Zellen hatten eine Größe <30 μm erreicht. Die Entwicklung war noch nicht abgeschlossen, aber doch schon sehr weit fortgeschritten. Abb. 3 (Anhang) visualisiert die gebildeten Fettzellen. Aus dem Mesenchym entwickeln sich auch
Knochenvorläuferzellen die sich zu Knochen bildenden Zellen, wie Osteoblasten oder Osteozyten, differenzierten. Nach 6 Wochen war fast der gesamte mikroskopisch untersuchte Bereich gleichmäßig mit Kalziumeinlagerungen übersät. Abb. 4 zeigt die gebildeten Knochenzellen.
B.4 In vitro Inkubation
Es wurden 36 Monolithen hergestellt, wovon 12 Autoklav sterilisiert und 12 gassterilisiert wurden. Die restlichen 12 blieben als Referenz unbehandelt. Nachdem alle Proben gewogen waren, wurden sie in 30 mL Phosphatpuffer-Lösung in Wasser (pH~7.2) (mit 0,02 Gew.-% Natriumazid versetzt, um bakterielle Kontaminierung zu verhindern) gesetzt. Die verschlossenen Gläser wurden mit Parafilm® abgedichtet und in ein dunkles Wasserbad mit einer Temperatur von 37°C platziert. Zu jedem Zeitpunkt (Entnahmezeitpunkte: 5., 10., 20., 30., 40., 50. und 60. Tag) wurden sechs Proben dem Wasserbad und ebenso der Pufferlösung entnommen. Dies waren jeweils zwei unsterilisierte, zwei Autoklav sterilisierte und zwei gassterilisierte Proben. Sie wurden mit destilliertem Wasser abgespült, anschließend wurde das überschüssige Wasser vorsichtig von der Oberfläche entfernt. Jede Probe wurde erneut in nassem Zustand gewogen und anschließend in den Vakuumofen gestellt und bei 40 °C getrocknet. Die Proben wurden bis zur Gewichtskonstanz gewogen.
B.5 Vitalitätsbestimmung
Die Monolithen wurden vor der Anwendung gründlichst sterilisiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Laminar-Flow-Kapelle auf die Monolithenscheiben in einem 24-well-plate aufgebracht und die weih mit Nährmedium aufgefüllt. Dieses Nährmedium bestand aus einem Grundmedium, welches sich aus einem Puffersystem, Nährstoffen und Salzen zusammensetzte und speziellen Zusätzen, wie z.B. Wachstumsfaktoren und Serum. Das 24-well-plate wurde dann in einen Inkubator gestellt und nach 3 Tagen mit dem Vitalfarbstoff Acridin-Orange angefärbt und unter dem Lichtmikroskop beobachtet.
B.6 Abbauverhalten
Das Abbauverhalten wurde mittels pH- Messungen untersucht. Es wurden unsterilisierte, Autoklav sterilisierte und gassterilisierte Proben verwendet, da Wert auf den Vergleich der drei verschieden behandelten Materialien gelegt wurde. Um den Abbau zu charakterisieren, wurde der Masseverlust und in diesem Zusammenhang auch der Quellgrad bestimmt. Ebenso wurden auch Infrarotspektren der Materialien aufgenommen, der pH- Wert der Inkubationslösungen nach der Inkubation bestimmt, sowie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt. Der
Biodegradationsversuch lief über 15 bzw. 30 Wochen. Es wurden jeweils zwei unsterile Proben, zwei Autoklav sterilisierte Proben und zwei gassterile Proben inkubiert. Die Proben befanden sich über diesen Zeitraum in einem 37°C warmen, dunklen Wasserbad. Bei allen Probe konnte ein kontinuierlicher Abbau, jedoch kein „bulk Abbau" festgestellt werden.
Abb. 1
Teil einer Monolithenprobe (Monolith 6), die zur Zellbesiedelung verwendet wurde.
Die Partikelgröße liegt bei 1-2 μm. Abb. 2
Graphische Darstellung der Zellzahl in Abhängigkeit von der Besiedlungsdauer
(Monolith 6).
Abb. 3
Adipogene Zellen auf Autoklav sterilisierten Monolithen nach 6 Wochen; L =Zettzelle mit Vakuole (Monolith 6).
Abb. 4
Ostipogene Zellen auf Autoklav sterilisierten Monolithen nach 6 Wochen (Monolith 6).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Polymeres poröses Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Trägermaterial zumindest aus monolithischen, vernetzten, biokompatiblen und bioabbaubaren polymeren Materialien besteht.
2. Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monolithischen, polymeren Materialien innerhalb einer Form gebenden Struktur angeordnet sind.
3. Trägermaterial gemäß der Ansprüche 1 und 2, für die Regenerativ Medizin und für das Tissue Engineering.
4. Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen
Herstellung Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene der allgemeinen Formel
Figure imgf000020_0001
verwendet werden, mit der Maßgabe, dass in obiger Formel A und B getrennt oder miteinander verbunden sein können und Wasserstoff, eine Ci-Cig-Alkyl, d-Cig-Alkyloxy-, Aryl-, Aryloxy, Ci-Ci8-Alkenyl-, Ci-C18-Arylalkyl, Ci-Ci8- Alkylaryl-, Ci-Cig-Arylalkenyl-oder eine Halogengruppe, C>-Cis-Hydroxyalky!, (poly)-Hydroxyphenyl, Ci-Cig-Hydroxyalkylaryl, Ci-Cig-Aminoalkyl, (Ci-Ci8)- mono- oder di-(Ci-Cig-Alkyl)aminoalkyl, Ci-Cig-Cyanoalkyl Cyanoaryl sowie eine Carboxylat- Ci-Ci g-Alkylcarboxylat, Ci-Ci 8-Alkylcarboxyl bedeuten können. Des Weiteren können zwei oder mehrere Norborn-2-ene, 7- Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene miteinander über C|-C)g Ether-, Ester-, oder Amidbrücken miteinander verbunden sein.
5. Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen Herstellung zyklische, einfach und mehrfach ungesättigte Ester und Amide verwendet werden.
6. Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen Herstellung Ci-Ci8 acrylate, Ci-Ci8 methacrylate, Ci-Ci8 diacrylate, Ci-Ci8 triacrylate, Ci-Cj8 dimethacrylate, Ci-Ci8 trimethacrylate eingesetzt werden.
7. Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass deren Herstellung mittels Ring öffnender Metathesepolymerisation (ROMP) erfolgt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass für die Herstellung der monolithischen Strukturen Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene der allgemeinen Formel
Figure imgf000021_0001
verwendet werden, mit der Maßgabe, dass in obiger Formel A und B getrennt oder miteinander verbunden sein können und Wasserstoff, eine Ci-Ci8-Alkyl, Ci-Ci8-Alkyloxy-, Aryl-, Aryloxy, Ci-Cig-Alkenyl-, Ci-Ci8-Arylalkyl, Ci-Ci8- Alkylaryl-, Ci-Cis-Arylalkenyl-oder eine Halogengruppe, Ci-Ci8-Hydroxyalkyl, (poly)-Hydroxyphenyl, Ci-Ci8-Hydroxyalkylaryl, Ci-Ci8-Aminoalkyl, (Ci-Ci8)- mono- oder di-(C i -C 18-Alkyl)aminoalkyl, Ci-Ci 8-Cyanoalkyl Cyanoaryl sowie eine Carboxylat- Ci-Cis-Alkylcarboxylat, Ci-Ci8-Alkylcarboxyl bedeuten können, wobei zwei oder mehrere Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene miteinander über Ci-Ci8 Ether-, Ester-, oder Amidbrücken miteinander verbindbar sind.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für die Herstellung der monolithischen Strukturen zyklische, einfach und mehrfach ungesättigte Ester und Amide verwendet werden.
10. Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels Elektronenstrahl induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
1 1. Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels photochemisch induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
12. Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels thermisch induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
13. Verfahren gemäß den Ansprüchen 10-12, dadurch gekennzeichnet, dass für die
Herstellung der monolithischen Strukturen Ci-Ci8 acrylate, Ci-Ci8 methacrylate, Ci-Ci8 diacrylate, C]-Ci8 triacrylate, Ci-Ci8 dimethacrylate, Ci-Ci8 trimethacrylate eingesetzt werden.
14. Verwendung eines polymeres Trägermaterials für die Kultivierung von Zellen mit den Merkmalen zumindest eines der Ansprüche 1 bis 6, für die Regenerativ Medizin und für das Tissue Engineering.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016012612A1 (de) 2016-10-19 2018-04-19 Ratz Aqua & Polymer Technik Trägermaterial kombiniert mit einer biologisch abbaubaren Kohlenstoffquelle und Verfahren zur Anwendung

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4598102A (en) * 1983-11-17 1986-07-01 Hercules Incorporated Method, composition and product produced by delayed gelation in the polymerization of cycloolefins
WO2003000766A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Venkatram Prasad Shastri Functionalized degradable polymers
WO2006026325A2 (en) * 2004-08-26 2006-03-09 Pathak Chandrashekhar P Implantable tissue compositions and method
WO2006082270A1 (es) * 2005-02-01 2006-08-10 Laura Santos Esteve Nuevo scaffold polimérico 3d para la regeneración de tejidos y su técnica de preparación
WO2006113984A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Rimon Therapeutics Ltd. Pro-angiogenic polymer scaffolds
US20070026046A1 (en) * 2005-05-27 2007-02-01 University Of Ottawa Neoglycopolymer-cross-linked biopolymer matrix

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6211315B1 (en) * 1998-11-12 2001-04-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Lewis acid-catalyzed polymerization of biological oils and resulting polymeric materials
DE10120061A1 (de) * 2001-04-24 2002-10-31 Werner Lubitz Exopolysaccharidproduktion
JP4869566B2 (ja) * 2004-06-04 2012-02-08 三井化学株式会社 ポリ乳酸系樹脂組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4598102A (en) * 1983-11-17 1986-07-01 Hercules Incorporated Method, composition and product produced by delayed gelation in the polymerization of cycloolefins
WO2003000766A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Venkatram Prasad Shastri Functionalized degradable polymers
WO2006026325A2 (en) * 2004-08-26 2006-03-09 Pathak Chandrashekhar P Implantable tissue compositions and method
WO2006082270A1 (es) * 2005-02-01 2006-08-10 Laura Santos Esteve Nuevo scaffold polimérico 3d para la regeneración de tejidos y su técnica de preparación
WO2006113984A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Rimon Therapeutics Ltd. Pro-angiogenic polymer scaffolds
US20070026046A1 (en) * 2005-05-27 2007-02-01 University Of Ottawa Neoglycopolymer-cross-linked biopolymer matrix

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURKOTH, A.K.; BURDICK, J.; ANSETH, K.S.: "Surface and bulk modification to photocrosslinked polyanhydrides to control degradation behavior", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH, vol. 51, 2000, pages 352 - 359, XP002499127 *
DATABASE CA [online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 10 August 2006 (2006-08-10), SANTOS ESTEVE, LAURA: "Method for fabrication of 3-D polymer scaffold for tissue regeneration", XP002505657, retrieved from STN Database accession no. 2006:790979 *
ENHOLM ET AL: "Photocurable hard and porous biomaterials from ROMP precursors cross-linked with diyl radicals", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, PERGAMON, ELSEVIER SCIENCE, GB, vol. 15, no. 23, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 5262 - 5265, XP005149680, ISSN: 0960-894X *
HAMILTON J G ET AL: "The swelling characteristics of some hydrogels prepared by ring-opening metathesis polymerization", JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS. A, CHEMICAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 133, no. 1-2, 13 July 1998 (1998-07-13), pages 83 - 91, XP004650145, ISSN: 1381-1169 *
SEEHERMAN H ET AL: "Delivery of bone morphogenetic proteins for orthopedic tissue regeneration", CYTOKINE AND GROWTH FACTOR REVIEWS, OXFORD, GB, vol. 16, no. 3, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 329 - 345, XP004964513, ISSN: 1359-6101 *
WANG, Y; KIM, Y.M.; LANGER, R.: "In vivo degradation characteristics of poly(glycerol sebacate)", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART A, vol. 66A, no. 1, 10 June 2003 (2003-06-10), pages 192 - 197, XP002499126 *

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