DE102007033078B4

DE102007033078B4 - Polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen

Info

Publication number: DE102007033078B4
Application number: DE200710033078
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Dr. Buchmeiser
Original assignee: LEIBNIZ-INSTITUT fur OBERFLAECHENMODIFIZIERUNG EV; Leibniz Institut fuer Oberflachenmodifizierung eV
Current assignee: Leibniz-Institut fur Oberflaechenmodifizierun De
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2009-09-03
Anticipated expiration: 2027-07-14
Also published as: WO2009010194A1; DE102007033078A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, welches insbesondere in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering Anwendung findet.

Description

Die Erfindung betrifft ein polymeres Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, welches insbesondere in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering Anwendung findet.
Tissue Engineering beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichem Gewebe oder von Organen, welche die Funktionen von beschädigtem oder krankem Gewebe oder Organen aufrechterhalten oder wiederherstellen. Ziel ist dabei die Herstellung neuer funktioneller Gewebe durch gesunde, lebende Zellen. Diese Zellen können verschiedenen Ursprungs sein. Primäre Zellen (autogen, allogen oder xenogen) werden aus frischem Gewebe präpariert und unmodifiziert weiter verarbeitet. Autogene Zellen stammen vom selben Organismus, allogen Zellen von einem anderen Individuum derselben Art, während xenogen Zellen aus einer anderen Spezies gewonnen werden. Als Quelle dient sowohl adultes, fetales als auch neonatales Gewebe.
Neben den primären Zellen können auch Zelllinien und gentechnisch veränderte Zellen verwendet werden. Diese müssen in der Regel vor der Ansiedelung auf den entsprechenden Matrizes gezielt in ihren Eigenschaften verändert werden. Die Zellen werden dann in einer Matrix, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, oder einer Mischung beider, kultiviert.
Als Matrixmaterial bzw. Trägermaterial werden gegenwärtig implantierbare, natürliche oder synthetische Polymere, beispielsweise (Bulk-)Polymere oder Biomaterialien verwendet.
Bei implantierbaren Materialien unterscheidet man zusätzlich geschlossene Systeme, z. B. implantierbare Mikrokapseln, und offene Systeme, z. B. gewebte und nicht gewebte poröse Matrizes verschiedener Formen.
Unter dem Begriff porös bzw. Porosität werden dabei in diesem Zusammenhang und im Sinne der Erfindung miteinander verbundene und nicht verbundene Intra- und/oder Interpartikelhohlräume bzw. Inter- und/oder Intrafaserhohlräume bzw. generell Hohlräume in den für die o. a. Anwendungen verwendeten (Bulk-)Polymeren verstanden. Solche Hohlräume sind für Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering von großer Bedeutung und müssen in der Regel groß genug (d. h. in der Regel > 100 μm) sein, um das Einwachsen von Blutgefäßen zu erlauben.
Heutzutage finden Zellträger Systeme, basierend auf entsprechenden Trägermaterialien, Anwendung in der Herstellung von künstlichem Hautersatz bis hin zum Ersatz von Teilorganen. Zum Ersatz ganzer Organe mittels Tissue Engineering muss jedoch die künstliche Imitation weitgehend an das natürliche Gewebe angepasst sein. Dies erfordert die Durchführung von in vitro-Untersuchungen. Weiterhin sind Knochenrekonstruktionen und die Wiederherstellung von Weichgeweben zu nennen. Somit ist es notwendig, für all diese spezifischen Anwendungen spezielle Trägersysteme, auch Scaffolds genannt, zu Verfügung zu stellen. Die künstliche Matrix muss dabei dem natürlichen Gewebe in Struktur und Eigenschaften so ähnlich wie möglich sein. Gelingt dies, vergrößert sich die Wahrscheinlichkeit, dass die in diesem Trägersystem befindlichen Zellen vom natürlichen Gewebe integriert und nicht abgestoßen werden.
Diese „Akzeptanz” des künstlichen Gewebes durch das natürliche wird auch mit dem Begriff „biokompatibel” umschrieben.
Eine große Bedeutung bei diesem Integrationsprozess spielen dabei naturgemäß das Trägermaterial selbst bzw. dessen Struktur.
Ein beträchtlicher Teil der derzeit existierenden Materialien für die o. a. Anwendungen beruht u. a. auf Poly(milchsäure) = Poly(lactid). Ungeachtet der exzellenten Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit dieses Materials neigt es zum so genannten „bulk Abbau”, einem nach einiger Zeit nach Implantation in den Körper auftretenden schlagartigen Abbau großer Teile des Materials, was zu massiven Reizungen und Entzündungen im betroffenen Gewebsbereich bei in vivo Anwendungen führen kann.
Aus dem Stand der Technik sind mehrere Materialien für die Herstellung von Trägermaterialien (Scaffolds) bzw. deren Herstellung bekannt, z. B.:
– Lösungsmittel-Gießen mit Partikelauswaschung:
Diese Methode ist am besten bekannt für die Herstellung von Scaffolds für die Knochenregeneration. Dabei werden wasserlösliche Partikel, wie Zucker oder Natriumchlorid der Polymerlösung zugegeben. Die Dispersionslösung wird in eine Form gegossen um eine 3-dimensionale Struktur zu produzieren. Die Porosität resultiert grundlegend aus der selektiven Auslösung der Partikel aus dem Polymer/Salz-Komposit. Dabei sind die Porosität und die Porengröße über die Menge und die Größe der Salzpartikel kontrollierbar. Als Polymere werden u. a. Stärke-basierte oder andere natürliche Polymere eingesetzt.
– Schmelz-basierte Techniken (Spritzguss oder Extrusion mit Blähmitteln):
Diese Methode wird bisher meist nicht allein genutzt, sondern normalerweise in Kombination mit porogenen System oder zum Vorformen des finalen Materials verwendet. Dabei werden Polymere mit Blähmittel gemischt. Die Blähmittel werden in Abhängigkeit der Abbautemperatur und der Nicht-Toxizität auserwählt. Die poröse Struktur entsteht, da die Blähmittel sich bei der Extrusion oder Spritzguss abbauen und dabei Gase freisetzen. Bei dieser Methode lässt sich die Porengröße sehr schlecht kontrollieren. Der Vorteil ist jedoch, dass das Spritzgussverfahren sehr reproduzierbar ist und die Entwicklung einer sehr komplexen 3D-Struktur ermöglicht. Bei dieser Methode werden Stärke-basierte Polymere (oder andere natürliche Polymere) oder bioabbaubare Polymer, wie Polylactid, Polyglykolsäure oder Polycaprolacton verwendet, die mittels Schmelztechnik verarbeitet werden können.
– Gefriertrocknung:
Bei dieser Methode wird die Phasenseparation ausgenutzt. Hier wird das Basisprinzip der thermisch induzierten Phasenseparation ausgenutzt, die auftritt, wenn die Temperatur einer homologen Polymerlösung, die in eine Form gebracht wurde, erniedrigt wird. Wenn das phasenseparierte System stabilisiert ist, kann die lösungsmittelreiche Phase durch verminderten Druck abgezogen werden. Resultierend erhält man den Polymerschaum. Unter anderem kann man Chitosan Flocken oder andere natürliche oder bioabbaubare Polymere verwenden. Im Falle von Komposit als Trägermaterialien können auch Biofüllstoffe zugegeben werden.
Ein generelles Problem aller existierenden Trägermaterialien liegt weiterhin in den beträchtlichen Limitationen in der Herstellung 3-dimensionaler Strukturen. Diese können bis dato nur mit erheblichem Aufwand, z. B. mittels ink jet Printing, Spritzguss oder anderer Verfahren (s. u.) aus löslichen Polymeren hergestellt werden. Speziell die Generierung poröser Strukturen mit Poren im Bereich von einigen 10 bis 100 μm stellt dabei ein beträchtliches technologisches Problem in der industriellen Produktion dar.
Aus der JP 2005/344059 A ist eine Harzformulierung aus Poly(milchsäure) und u. a. lineare Polymere auf Basis von Poly(norbornenen)en bzw. Poly(tetracyclodocecen) bekannt. Diese beiden Polymere liegen separat in der Formulierung vor, wobei diese nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Die US 6,211,315 B1 offenbart eine Möglichkeit zur Herstellung polymerer Materialien aus erneuerbaren Quellen (biogene Öle), wobei dafür eine die Lewis-Säure basierte (kationische) Polymerisation genannt wird. Es sind weiterhin die metathetische Umwandlung biogener Öle und deren Verwendung in der anschließenden Polymerisation beschrieben; jedoch keine Metathesepolymerisation. Der Veröffentlichung ist außerdem detailliert die Herstellung des Polymers aus biogenen Ölen mittels kationischer Polymerisation zu entnehmen.
Eine Veröffentlichung (J. U. Otaigbe et al., Polymer 41(2000), 7925) beschreibt die kationische Polymerisation biogener Öle (Fischöl) zur Herstellung polymerer Materialien. Als eines der Comonomere wird Norbornen für diese kationische Polymerisation genannt.
Aus der WO 02/086099 A2 sind ein Epoxypolysaccharid-produzierendes Bakterium, das produzierte Epoxypolysaccharid selbst und Anwendungen dieses Epoxypolysaccharides als Hilfsstoff (nicht Träger) für das Tissue Engineering bekannt.
Die Herstellung eines vernetzten Biopolymers oder einer vernetzten Matrix (scaffolds) sind aus der US 2007/0026046 A1 bekannt. Diese Vernetzung erfolgt mit einem neoglycopolymer (collagen) und die Verwendung im Bereich des Tissue Engineering. Auch erfolgt die Vernetzung des Materials nicht über die Polymerisation selbst, sondern über eine reduktive Aminierung, z. B. zwischen dem Neoglycopolymer und Collagen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Trägermaterial bereit zu stellen, welches es gewährleistet die Probleme des bulk Abbaus durch Verwendung geeigneter (vernetzter), bioabbaubarer Polymere zu umgehen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die einfache und schnelle Generierung 3-dimensionaler, monolithischer, poröser Strukturen beliebiger Form für Anwendungen in der Regenerativmedizin bzw. im Tissue Engineering erlaubt.
Die Aufgabe der Erfindung bezüglich eines solchen Trägermaterials wird dabei durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.
Erfindungswesentlich ist, dass das erfindungsgemäße poröse Trägermaterial zumindest auf monolithischen, vernetzten, biokompatiblen und bioabbaubaren polymeren Materialien basiert.
Die Erfindung hat monolithische, vernetzte, poröse, biokompatible und bioabbaubare polymere Materialien, insbesondere hergestellt mittels Ring öffnender Metathesepolymerisation (ROMP) bzw. radikalischer Polymerisation als Trägermaterialien (Scaffolds) für die Regenerativmedizin bzw. das Tissue Engineering, „Biokompatibel” im Sinne der Erfindung bedeutet, dass kein negativer Einfluss auf Zellen in Umgebung des Materials besteht, ihre Anwendung führt zu keiner klinisch relevanten Reaktion des Körpers.
„Bioabbaubar” im Sinne der Erfindung bedeutet, dass ein Material im menschlichen Körper zu nicht-toxischen Produkten abgebaut und vom Körper ausgeschieden bzw. metabolisiert werden kann.
Im Folgenden sind besonders günstige Ausführungsformen der Erfindung exemplarisch aufgezeigt, ohne die Erfindung damit zu begrenzen.
Experimentelles
A.1 Allgemeines
Die für das Tissue Engineering verwendeten monolithischen Strukturen, welche als Trägermaterial (Scaffolds) dienten, wurden mit Hilfe der Ring öffnenden Metathesepolymerisation (ROMP) bzw. mittels radikalischer Polymerisation hergestellt. Für die ROMP wurden Norborn-2-en (NBE) als Monomer und ein Gemisch aus Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat)acrylat (3:1) als Vernetzer (V) verwendet. Alternativ können auch Cycloocten, substituierte Cyclooctene, 1,4,4a,5,8,8a-Hexahydro-1,4,5,8-exo-endo-dimethanonaphtalin oder Tris(cyclooct-4-enyl-1-oxy)methylsilan, siehe M. R. Buchmeiser, Polymer 2007, 48, 2187, verwendet werden. Das porogene System wurde aus 2-Propanol (Makroporogen) und Toluol (Mikroporogen) gebildet, grundsätzlich sind jedoch auch andere Porogensysteme möglich. Als Initiator diente RuCl₂(Pyridin)₂(IMesH₂)(CHC₆H₅)(IMesH₂=1,3-Dimesityl-4,5-tetrahydroimidazolin-2-yliden). Wo zweckmäßig, wurde Pyridin zur Regulierung der Polymerisation eingesetzt.
¹H- und ¹³C-NMR Spektren wurden mit einem Bruker Spectrospin 250 bei 250 bzw. 62 MHz und 25°C aufgenommen. GC-MS-Messungen wurden an einem GCMS QP5050 (Shimadzu), mit einer SPB-5 fused silica Säule (30 m × 25 μm Filmdicke) bei einem Säulenfluss von 1.0 mL/min, durchgeführt. Alle ATR-Infrarot-Messungen wurden an einem Vector 22 (Bruker), ausgestattet mit einer Golden Gate, durchgeführt. Für jede Probe wurden 32 Scans gemessen. Zur Datenanalyse wurde die Bruker Opus 5.5 US Software verwendet. Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden teils mit einem JSM-6600 (Jeol, Japan) und teils mit dem ULTRA 55 (Carl Zeiss SMT, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen. Die Proben für das Rasterelektronenmikroskop von Jeol wurden in Vorfeld mit einer Goldschicht bedampft. Die Proben, welche mit dem ULTRA 55 abgebildet wurden, waren unbehandelt. Zur Erstellung der Fotos wurde eine Digitalkamera CAMEDIA C-4000 ZOOM von Olympus (Deutschland) benutzt. Für die Größenausschlusschromatographie wurden ein L-4500 UV Detektor (Merck) und eine L-6200A HPLC Pumpe (Merck) mit manueller Probeninjektion genutzt. Zur Datenerfassung und Auswertung kam die Chromatography Data Station Software D-7000 HPLC System Manager zum Einsatz. Die inverse Größenausschlusschromatographie diente als Charakterisierungsmethode des Monolithen und wurde mit Chloroform als Laufmittel durchgeführt. Dabei wurden die Standards, mit einer Konzentration von 0.25 mg/mL Chloroform, per Hand injiziert. Die Menge an injizierten Standards betrug 10 μL je Messung. Die Durchflussrate betrug dabei 0.57 mL/min. Die ICP-OES Messungen wurden an einem CIROS System (Spectro A. I., Kleve) durchgeführt. Die Mikrowellenaufschlüsse wurden mittels einem MLS 1200 mega Mikrowellengerät (MSL GmbH, Deutschland) bewerkstelligt. Zyklus: Aufheizen in 9 Minuten von 20 auf 180°C bei 700 W, 12 Minuten bei konstanter Temperatur bei 180°C und Abkühlung von 180°C auf 20°C in 90 Minuten. Die Messung des Rutheniumgehalts wurde bei den Wellenlängen λ = 267.876 nm und λ = 240.272 nm durchgeführt. Zum Vergleich wurden zwei Lösungen mit den Rutheniumkonzentrationen 0.5 mg/L und 1 mg/L angefertigt. Mit dem pH-Meter 766 Calimatic (Knick) wurden, nach entsprechender Kalibrierung, pH-Werte bei Temperaturen zwischen 26°C und 29°C gemessen. Für die Sterilisation wurden der Autoklav Variomag S (H+P Labortechnik AG) mit Vorvakuum genutzt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem Axiovert 25 (Zeiss), ausgestattet mit einer Kamera AxiocamMR5 fotografiert. Zur Auswertung der Bilder und zur Zellzählung wurde die dazugehörige Software Axiovision Rel.4.5 verwendet.
A.2 Reagenzien und Standards
Alle Reaktionen mit luft- bzw. hydrolyseempfindlichen Substanzen wurden mit Hilfe der Schlenktechnik unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre in einer Schutzgasbox (LabMaster, Braun, Germany) durchgeführt. [RuCl₂(PCy₃)(IMesH₂)(CHPh)] (PCy₃=Tricyclohexylphosphin), Phosphat-Pufferlösung (pH ~7.2) und Natriumazid wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Furan (99+%, Sigma-Aldrich), wurde vor der Benutzung nochmals destilliert. Dimethylsulfoxid (DMSO) (≥99%), Toloul (reinst) wurden von Merck (Deutschland) bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ethylvinylether (EVE) (~99%), Bicyclo[2.2.1]hept-2-en (Norborn-2-en, NBE) (≥95%), 2-Propanol und Acrylsäurechlorid (≥96%) wurden von Fluka, Kaliumhydroxid 85-, Pyridin (99,5%), Dichlormethan (DCM) (p. a.), Ethanol (99,8%), Chloroform (99%) wurden von der KMF Laborchemie Handels-GmbH (Deutschland) bezogen. Triethylamin (Merck), 2-Propanol, Pyridin und Chloroform wurden über CaH₂ getrocknet. Tetrahydrofuran (THF) (99%) wurde bei AppliChem (Darmstadt, Deutschland), 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan (≥97%) bei Acros (Belgien), Diethylether bei Sasol, 5-(Bicycloheptenyl)trichlorosilan bei ABCR (Deutschland) und Aceton bei VWR (Deutschland) bestellt und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die Polystyrol (PS) Standards mit den Molekularmassen (M_w): 1180, 17200, 23800, 75000, 1260000, 3150000 und 1 × 10⁷ g/mol wurden von Polymer Standards Service (PSS, Pittsburg, PA, USA), die Standards mit den Molekularmassen: 4000, 30000, 200000 und 400000 g/mol von Pressure Chemical (Pittsburg, USA) bezogen.
A.3 Synthesen
A.3.1 Synthese der Vernetzer (V1=Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxyl)acrylat, 3:1)
1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan (1.91 g; 0.016 mol) wurde in trockenem Dichlormethan suspendiert und mit Triethylamin (5.77 g; 0.057 mol) versetzt. Anschließend wurde die Lösung auf –35°C gekühlt. Danach wurde endo/exo-7-Oxabicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-carbonsäurechlorid (7.58 g; 0.0478 mol) zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur 3 Tage gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde das Produkt unter Argonatmosphäre in 50 mL Diethylether gelöst und 30 min gerührt. Die Etherlösung wurde abfiltriert und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde Natriumsulfat zur organischen Phase zugegeben und erneut filtriert. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Produkt, ein dunkelgelbes Öl, wurde unter Vakuum 1 Stunde lang getrocknet. Das Produkt repräsentierte eine Mischung aus Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxyl)acrylat (3:1).
Ausbeute: 6.61 g (85.3%); M = 486.26 g/mol; FTIR (ATR mode): 2958 (s), 1723 (s), 1633 (m), 1407 (m), 1273 (m), 1165 (s), 1016 (s) and 703 (m) cm^–1. ¹H-NMR (CDCl₃): δ (ppm) 1.07 (m, 3H, CH₃), 2.16-2.46 (m), 3.16 (m, 1H, CH), 4.12 (m, 2H), 5.03 (d, J = 4.5 Hz, 1H, CH), 5.06 (d, J = 4.4 Hz, 1H, CH), 5.16 (s, 1H, CH), 5.88 (d, J = 7.3, 1H, CH), 6.14 (m, 1H), 6.38 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl₃): δ (ppm) 173.7, 172.0, 165.9, 137.3, 134.7, 132.6, 131.6, 128.0 81.0, 79.0, 78.1, 66.3, 66.0, 42.9, 38.8, 29.3, 28.6, 17.4.
A.3.2 Herstellung der monolithisch strukturierten Scaffolds mittels ROMP
Zwei verschiedene Lösungen A und B wurden hergestellt und auf eine Polymerisationstemperatur von 0°C gekühlt.
Lösung A bestand aus dem Monomer, dem Vernetzer und dem Makroporogen (z. B. 2-Propanol);
Lösung B beinhaltete den Initiator im Mikroporogen (z. B. Toluol) und ggf. Pyridin als Moderator.
Lösung A und B wurden vereint und für einige Sekunden gerührt. Die verschiedenen Zusammensetzungen der Polymerisationslösungen sind in Tabelle 1 angegeben. Die Polymerisationsmischung wurde in die zu befüllende Vorrichtung gegossen, welche in ihrer Form dem letztendlich zu generierenden Polymer entsprach. Die Lösung polymerisierte bei Raumtemperatur unter Luft innerhalb von 1 h aus. Anschließend wurde der Monolith mit einer Lösung bestehend aus THF, DMSO und Ethylvinylether, im Verhältnis 1:1:1 (32 Gew.-%; 40 Gew.-%; 28 Gew.-%), mehrmals gespült bzw. extrahiert, um den Katalysator und überschüssiges Monomer zu entfernen. Zum Schluss wurde der Monolith mit Methanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Die relevanten physico-chemischen Parameter wurden mittels inverser Größenauschlusschromatographie bestimmt. Sie ergaben z. B. für Monolith 6 eine Zwischenkornporosität (ε_z) von 77%, eine Microglobulporosität (ε_p) von 7%, eine Gesamtporosität (ε_t) von 84%, einen mittleren Porendurchmesser (Φ_m) von 1080 Å und ein spezifisches Porenvolumen (V_P,S) von 604 μL/g. Aus diesen Werten wurde eine spezifische Oberfläche von 22 m²/g ermittelt. Die monolithische Struktur wies dabei eine durchschnittliche Zwischenkornporengröße von 100–200 μm auf.
Tabelle 1:

Zusammensetzung der mittels ROMP hergestellten Monolithen. NBE = Norborn-2-ene, COE = Cycloocten, V1 = Pentaglyceroltris(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat) und Pentaglycerolbis(7-oxanorborn-5-en-2-ylcarboxylat)acrylat (3:1), V2 = DMN-116, V3 = Tris(cyclooct-4-enyl-1-oxy)methylsilan, V4 = Di(cyclooct-4-en-1-yl)maleat, M = Mischung aus 6,7-Dihydro-2(5H)-oxepinon und 6,7-Dihydro-2(3H)-oxepinon (ca. 1:1), 2-PrOH = 2-Propanol, dabei¹⁾ Gew.-Teile.

Monolith	V1¹⁾	NBE¹⁾	2-PrOH¹⁾	Toluol¹⁾	Initiator¹⁾	Pyridin¹⁾
1	20	20	40	20	0.42	0
2	20	20	40	20	0.03	0.5
3	13,25	13,25	60	13,5	0.04	0.0055
4	20	20	40	20	0.03	0.074
5	20	20	40	20	0.03	0.066
6	20	20	50	10	0.03	0.071
7	15	15	60	10	0.025	0.17
8	25	25	40	10	0.03	0.1
9	15	15	50	20	0.028	0.1
10	15	15	40	30	0.031	0.11
12	20	20	50	10	0.01	0.025
13	15	15	50	20	0.03	0.07
Monolith	V2¹⁾	NBE¹⁾	2-PrOH¹⁾	Toluol¹⁾	Initiator1)	Pyridin¹⁾
14	22.5	22.5	42.5	12.5	0.4	-
15	15	35	40	10	0.2	-
Monolith	V3¹⁾	COE¹⁾	2-PrOH¹⁾	Toluol¹⁾	Initiator¹⁾	Pyridin¹⁾
16	35	5	40	10	0.2	-
17	20	20	50	10	0.2	-
18	20	20	50	10	0.2	-
19	22.5	22.5	42.5	12.5	0.2	-
20	25	25	40	10	0.2	-
21	30	30	30	10	0.2	-
22	10	30	50	10	0.2	-
23	20	30	40	10	0.2	-
24	15	35	40	10	0.2	-
25	25	35	30	10	0.2	-
26	20	20	50	10	0.2	-
27	22.5	22.5	42.5	12.2	0.2	-
28	25	25	40	10	0.2	-
Monolith	V4¹⁾	M¹⁾	2-PrOH¹⁾	Toluol¹⁾	Initiator¹⁾	Pyridin¹⁾
29	25	25	40	10	0.2	-
30	25	25	40	10	0.2	0.1

A.3.3 Herstellung der monolithischen Scaffolds mittels radikalischer Polymerisation
Die Herstellung monolithischer Systeme mittels thermisch induzierter freier radikalischer Polymerisation, Tetramethylpiperidyloxy-(TEMPO-) induzierter Polymerisation oder photochemisch induzierter Polymerisation erfolgte in der jeweils zu befüllenden Vorrichtung analog zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren (siehe M. R. Buchmeiser, Polymer 2007, 48, 2187). Die Elektronenstrahlhärtungen wurden an einem 10 MeV Linearbeschleuniger ELEKTRONIKA (Toriy Company, Moskau) durchgeführt. Der Beschleuniger wurde bei 50 Hz Wiederholungsrate und 4 μs Pulslänge unter Verwendung eines Horns (Bestrahlungsbreite bis 40 cm, Frequenz 1 Hz) und einem beweglichen Tisch betreiben. Als Referenzdosis wurde die auf Graphit applizierte Dosis kalorimetrisch ohne weitere Korrektur ermittelt. Die Gesamtdosis wurde dabei in kleinen Schritten (–3 kGy) stufenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten appliziert um den Temperaturanstieg in der Lösung unter 50°C zu halten. Die Monolithe wurden abschließend zur Reinigung mit Chloroform für 4 Stunden und mit THF für 30 min jeweils bei einem Fluss von 0.2 mL/min gespült.
Tabelle 2:

Zusammensetzung der mittels radikalischer Polymerisation hergestellten Monolithen. EMA = Ethylmethacrylat, V5 = Trimethylolpropantriacrylat. I1 = Azobis(i-butyronitril), I2 = TEMPO, 2-PrOH = 2-Propanol, dabei ¹⁾T = 76°C, ²⁾T = 125°C, ³⁾Gew.-Teile.

Monolith	EMA³⁾	V5³⁾	2-PrOH³⁾	1-Dodecanol³⁾	Toluol³⁾	Dosis [kGy)
31	15	15	30	30	10	22
32	20	20	25	25	10	22
33	22.5	22.5	22.5	22.5	10	22
34	25	25	20	20	10	22
35	15	15	30	30	10	35
Monolith	EMA²⁾	TMPTA²⁾	2-PrOH²⁾	1-Dodecanol²⁾	Toluol²⁾	I1²⁾
36¹⁾	15	15	30	30	10	1
37²⁾	15	15	-	60	10	1

A.3.4. Herstellung monolithischer Strukturen auf Basis von Methylendoxolanen
n-Dodecanol wurde 24 h lang im Hochvakuum getrocknet. Der Vernetzer wurde über trockenem Al₂O₃ filtriert um mögliche Verunreinigung zu eliminieren, 2-Propanol wurde über CaH₂ getrocknet. Aufgrund der geringen Stabilität des Monomers an Luft (wasser- und säureempfindlich) wurden die Polymerisationslösungen mittels Schlenktechnik hergestellt. Die dabei verwendeten Glasgefäße wurden vor der Verwendung ins Laugenbad gegeben, mit Wasser gespült und im Trockenschrank getrocknet. Die Herstellung erfolgte mittels Elektronenstrahlhärtung.
Tabelle 3:

Zusammensetzung der mittels radikalischer Polymerisation hergestellten Monolithen. EMA = Ethylmethacrylat, V5 = Trimethylolpropantriacrylat. Monomer = 2-Methylene-4-phenyl-1,3-dioxolan; 2-PrOH = 2-Propanol, dabei ¹⁾Gew.-Teile. Dosis: 22 kGy.

#	V5¹⁾	Monomer¹⁾	2-PrOH¹⁾	n-Dodecanol¹⁾	Toluol¹⁾
38	15	15	30	35	5
39	15	15	15	45	10
40	20	10	10	49	11
41	21	10	30	30	10
42	24	5	29	31	11
43	20	10	31	30	10
44	20	10	40	21	10
45	20	10	30	35	6
46	20	10	25	25	20
47	23	11	54	0	12
48	15	7	38	19	21
49	15	7	44	23	11

B. Medizinische Untersuchung an monolithischen Strukturen
B.1 Humane Fettgewebsstromazellen
Die Fettgewebestromazellen wurden aus humanem Fettgewebe gewonnen, das bei Routineoperationen aus der Beckenregion entnommen wurde. Das Fettgewebe wurde steril zerteilt und mittels Kollagenaselösung (Kollagenase Typ II, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) digestiert. Die Enzymaktivität wurde durch Medium mit Serumzusatz (Iscove's DMEM/HAM F12 1:1, supplementiert mit 10% NCS = neonatal calf serum, alles von Life Technologies, Paisley, Schottland) gestoppt. Die Suspension wurde durch ein 100 μm Nylonnetz gefiltert und zentrifugiert (300 g, 10 min). Die Kultivierung der Zellen im Pellet erfolgte bei 37°C und 5% CO₂-Atmosphäre im Inkubator. Das Kulturmedium (Iscove's DMEM/HAM F12 1:1, supplementiert mit 10% NCS) wurde jeden 2. Tag gewechselt und die Zellen im Verhältnis 1:4 passagiert. Die anschließende Besiedlung der Trägersubstanz (Beispiel s. 1, Anhang) erfolgte mit Zellen der dritten Passage. Die so kultivierten Zellen besitzen Multipotentialität, sind somit in unterschiedliche mesenchymale Zellen differenzierbar. In durchflußzytometrischen Analysen waren derart kultivierte Zellen positiv für CD29 (β-1 integrin), CD44, CD73 (SH3, Ecto-5'-nucleotidase), CD90 (Thy-1), CD 105 (Endoglin) and negativ für hämatopoetische Marker (CD31, CD34, CD45, CD133, CD166). Ihr Oberflächenmarkerprofil entsprach somit weitgehend dem mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark. Die Zellen waren nach Kultivierung in entsprechenden Induktionsmedien sowohl in konventioneller zwei-dimensionaler Kultur als auch in dreidimensionalen Gewebeaggregaten adipogen, ostengen und glattmuskulär differenzierbar.
B.2 Erstellung der Wachstumskurve
Die Gassterilisation wurde mit Formalin bei 60°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben gewässert, um das Restformalin zu beseitigen. Die Besiedelung der Monolithscheiben wurde mit mesenchymalen Stammzellen durchgeführt. Diese wurden in Iscove's Modified Dulbecco's Medium gemischt mit HAM-FIZ kultiviert. 16 Monolithen wurden in Medium gewässert und einzeln in die Wells einer 24-Multiwellplatte platziert. Die Besiedlung erfolgte mit 18.000 Zellen pro Well (10.000 Zellen pro cm²). Je drei Monolithen wurden nach 3, 6, 9 und 12 Tagen entnommen und zunächst die Vitalität mit einer Acridin-Orange Vitalfärbung (Sigma-Aldrich) gezeigt (fotografische Dokumentation). Ethidiumbromid wurde als Farbstoff für abgestorbene Zellen verwendet. Danach erfolgte Fixierung in 4%igem Paraformaldehyd und die nochmalige Färbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die Auszählung erfolgte unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Zählrasters (0.8 × 0.8 cm), welches in das Okular des Mikroskops eingesetzt wurde.
Aus den Zellzahlen der 6 Felder pro Probe und den ausgezählten Monolithenscheiben wurde ein Mittelwert pro Entnahmezeitpunkt gebildet. Die Werte wurden gegen die Zeitachse aufgetragen. Die Zellen verblieben bei der Zählung auf dem Material. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und 2 dargestellt. Tabelle 4: Mittelwerte der Zellzählung.

Besiedlungsdauer Zellzahl/cm²

eingesetzte Zellmenge am Starttag 10000

3 Tage 25000

6 Tage 26875

9 Tage 36250

12 Tage 38125
B.3 Zelldifferenzierung auf der Trägestruktur (Monolith)
Die Sterilisation der Monolithproben im Autoklav erfolgte bei einer Temperatur von 121°C und einem Druck von 1 bar über einen Zeitraum von 45 min. Die Gassterilisation wurde mit Formalin bei 60°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben zur Entfernung des Retformalins gewässert. Acht Monolithen wurden zunächst mit etwa 10⁸ Fettgewebsstromazellen der 3. Passage besiedelt und über 10 Tage in rotierenden Kulturcontainern kultiviert. Danach erfolgte die adipogene Differenzierung der Zellen auf 4 Monolithen mittels Kultivierung in einem adipogenen Induktionsmedium (Isobutylmethylxanthin, IBMX 0.5 mM, Insulin 1.72 μM, zusätzliche Supplementierung von Biotin und Pantothenat). Dieses wurde nach drei Tagen durch ein IBMX-freies Erhaltungsmedium (Insulin 1.72 μM, zusätzliche Supplementierung von Biotin und Pantothenat) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany) ersetzt und nach weiteren drei Tagen erneut für drei Tage verwendet. Die Fettzellen wurden dafür mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die 4 weiteren Monolithenkulturen wurden durch Zugabe eines osteogenen Differenzierungsmediums (β-glycerolphosphat, Dexamethason und Vitamin D3, alle von Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim) der knöchernen Differenzierung zugeführt. Nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen wurde jeweils ein halber, mittig geteilter Monolith entnommen und in Paraformaldehyd 4% in PBS fixiert. Die Monolithen wurden in Paraffin eingebettet und histologische Schnitte senkrecht zur Oberfläche angefertigt. Schnitte der adipogen differenzierten Kulturen wurden mittels HE gefärbt, in den ostengen differenzierten Kulturen erfolgte der Nachweis von Matrixmineralisationen mittels von Kossa Färbung. Die Auswertung erfolge semiquantitativ unter dem Lichtmikroskop und 20-facher Vergrößerung. Fettzellen: 6 Wochen nach Beginn der Differenzierung hatten sich Adipozyten voll ausgebildet. Zellkern und das Zellplasma lagen weitgehend am Rand der Zellen. Die Zellen hatten eine Größe ≤30 μm erreicht. Die Entwicklung war noch nicht abgeschlossen, aber doch schon sehr weit fortgeschritten. 3 (Anhang) visualisiert die gebildeten Fettzellen. Aus dem Mesenchym entwickeln sich auch Knochenvorläuferzellen die sich zu Knochen bildenden Zellen, wie Osteoblasten oder Osteozyten, differenzierten. Nach 6 Wochen war fast der gesamte mikroskopisch untersuchte Bereich gleichmäßig mit Kalziumeinlagerungen übersät. 4 zeigt die gebildeten Knochenzellen.
B.4 In vitro Inkubation
Es wurden 36 Monolithen hergestellt, wovon 12 Autoklav sterilisiert und 12 gassterilisiert wurden. Die restlichen 12 blieben als Referenz unbehandelt. Nachdem alle Proben gewogen waren, wurden sie in 30 mL Phosphatpuffer-Lösung in Wasser (pH ~7.2) (mit 0,02 Gew.-% Natriumazid versetzt, um bakterielle Kontaminierung zu verhindern) gesetzt. Die verschlossenen Gläser wurden mit Parafilm^® abgedichtet und in ein dunkles Wasserbad mit einer Temperatur von 37°C platziert. Zu jedem Zeitpunkt (Entnahmezeitpunkte: 5., 10., 20., 30., 40., 50. und 60. Tag) wurden sechs Proben dem Wasserbad und ebenso der Pufferlösung entnommen. Dies waren jeweils zwei unsterilisierte, zwei Autoklav sterilisierte und zwei gassterilisierte Proben. Sie wurden mit destilliertem Wasser abgespült, anschließend wurde das überschüssige Wasser vorsichtig von der Oberfläche entfernt. Jede Probe wurde erneut in nassem Zustand gewogen und anschließend in den Vakuumofen gestellt und bei 40°C getrocknet. Die Proben wurden bis zur Gewichtskonstanz gewogen.
B.5 Vitalitätsbestimmung
Die Monolithen wurden vor der Anwendung gründlichst sterilisiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Laminar-Flow-Kapelle auf die Monolithenscheiben in einem 24-well-plate aufgebracht und die wells mit Nährmedium aufgefüllt. Dieses Nährmedium bestand aus einem Grundmedium, welches sich aus einem Puffersystem, Nährstoffen und Salzen zusammensetzte und speziellen Zusätzen, wie z. B. Wachstumsfaktoren und Serum. Das 24-well-plate wurde dann in einen Inkubator gestellt und nach 3 Tagen mit dem Vitalfarbstoff Acridin-Orange angefärbt und unter dem Lichtmikroskop beobachtet.
B.6 Abbauverhalten
Das Abbauverhalten wurde mittels pH-Messungen untersucht. Es wurden unsterilisierte, Autoklav sterilisierte und gassterilisierte Proben verwendet, da Wert auf den Vergleich der drei verschieden behandelten Materialien gelegt wurde. Um den Abbau zu charakterisieren, wurde der Masseverlust und in diesem Zusammenhang auch der Quellgrad bestimmt. Ebenso wurden auch Infrarotspektren der Materialien aufgenommen, der pH-Wert der Inkubationslösungen nach der Inkubation bestimmt, sowie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt. Der Biodegradationsversuch lief über 15 bzw. 30 Wochen. Es wurden jeweils zwei unsterile Proben, zwei Autoklav sterilisierte Proben und zwei gassterile Proben inkubiert. Die Proben befanden sich über diesen Zeitraum in einem 37°C warmen, dunklen Wasserbad. Bei allen Probe konnte ein kontinuierlicher Abbau, jedoch kein „bulk Abbau” festgestellt werden.
1 Teil einer Monolithenprobe (Monolith 6), die zur Zellbesiedelung verwendet wurde. Die Partikelgröße liegt bei 1–2 μm.
2 Graphische Darstellung der Zellzahl in Abhängigkeit von der Besiedlungsdauer (Monolith 6).
3 Adipogene Zellen auf Autoklav sterilisierten Monolithen nach 6 Wochen; L = Zettzelle mit Vakuole (Monolith 6).
4 Ostipogene Zellen auf Autoklav sterilisierten Monolithen nach 6 Wochen (Monolith 6).

Claims

Polymeres poröses Trägermaterial für die Kultivierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Trägermaterial zumindest aus monolithischen, vernetzten, biokompatiblen und bioabbaubaren polymeren Materialien besteht.
Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monolithischen, polymeren Materialien innerhalb einer Form gebenden Struktur angeordnet sind.
Trägermaterial gemäß der Ansprüche 1 und 2, für die Regenerativ Medizin und für das Tissue Engineering.
Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen Herstellung Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene der allgemeinen Formel
verwendet werden, mit der Maßgabe, dass in obiger Formel A und B getrennt oder miteinander verbunden sein können und Wasserstoff, eine C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkyloxy-, Aryl-, Aryloxy, C₁-C₁₈-Alkenyl-, C₁-C₁₈-Arylalkyl, C₁-C₁₈-Alkylaryl-, C₁-C₁₈-Arylalkenyl- oder eine Halogengruppe, C₁-C₁₈-Hydroxyalkyl, (poly)-Hydroxyphenyl, C₁-C₁₈-Hydroxyalkylaryl, C₁-C₁₈-Aminoalkyl, (C₁-C₁₈)-mono- oder di-(C₁-C₁₈-Alkyl)aminoalkyl, C₁-C₁₈-Cyanoalkyl Cyanoaryl sowie eine Carboxylat-C₁-C₁₈-Alkylcarboxylat, C₁-C₁₈-Alkylcarboxyl bedeuten können. Des Weiteren können zwei oder mehrere Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene miteinander über C₁-C₁₈ Ether-, Ester-, oder Amidbrücken miteinander verbunden sein.
Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen Herstellung zyklische, einfach und mehrfach ungesättigte Ester und Amide verwendet werden.
Trägermaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für dessen Herstellung C₁-C₁₈ acrylate, C₁-C₁₈ methacrylate, C₁-C₁₈ diacrylate, C₁-C₁₈ triacrylate, C₁-C₁₈ dimethacrylate, C₁-C₁₈ trimethacrylate eingesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass deren Herstellung mittels Ring öffnender Metathesepolymerisation (ROMP) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass für die Herstellung der monolithischen Strukturen Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene der allgemeinen Formel
verwendet werden, mit der Maßgabe, dass in obiger Formel A und B getrennt oder miteinander verbunden sein können und Wasserstoff, eine C₁-C₁₈-Alkyl, C₁-C₁₈-Alkyloxy-, Aryl-, Aryloxy, C₁-C₁₈-Alkenyl-, C₁-C₁₈-Arylalkyl, C₁-C₁₈-Alkylaryl-, C₁-C₁₈-Arylalkenyl- oder eine Halogengruppe, C₁-C₁₈-Hydroxyalkyl, (poly)-Hydroxyphenyl, C₁-C₁₈-Hydroxyalkylaryl, C₁-C₁₈-Aminoalkyl, (C₁-C₁₈)-mono- oder di-(C₁-C₁₈-Alkyl)aminoalkyl, C₁-C₁₈-Cyanoalkyl Cyanoaryl sowie eine Carboxylat- C₁-C₁₈-Alkylcarboxylat,C₁-C₁₈-Alkylcarboxyl bedeuten können, wobei zwei oder mehrere Norborn-2-ene, 7-Oxanorbornene, Norbornadiene oder Cyclooctene miteinander über C₁-C₁₈ Ether-, Ester-, oder Amidbrücken miteinander verbindbar sind.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für die Herstellung der monolithischen Strukturen zyklische, einfach und mehrfach ungesättigte Ester und Amide verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels Elektronenstrahl induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels photochemisch induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Herstellung mittels thermisch induzierter freier radikalischer Polymerisation erfolgt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 10–12, dadurch gekennzeichnet, dass für die Herstellung der monolithischen Strukturen C₁-C₁₈ acrylate, C₁-C₁₈ methacrylate, C₁-C₁₈ diacrylate, C₁-C₁₈ triacrylate, C₁-C₁₈ dimethacrylate, C₁-C₁₈ trimethacrylate eingesetzt werden.
Verwendung eines polymeres Trägermaterials für die Kultivierung von Zellen mit den Merkmalen zumindest eines der Ansprüche 1 bis 6, für die Regenerativ Medizin und für das Tissue Engineering.