WO2008143150A1 - 遺伝子破壊株、組換えプラスミド、形質転換体、及び3-カルボキシムコノラクトンの製造方法 - Google Patents

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WO2008143150A1
WO2008143150A1 PCT/JP2008/058988 JP2008058988W WO2008143150A1 WO 2008143150 A1 WO2008143150 A1 WO 2008143150A1 JP 2008058988 W JP2008058988 W JP 2008058988W WO 2008143150 A1 WO2008143150 A1 WO 2008143150A1
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acid
ring
strain
cis
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PCT/JP2008/058988
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Toshihisa Shimo
Kohei Mase
Yoshihiro Katayama
Eiji Masai
Masao Fukuda
Kiyotaka Shigehara
Seiji Ohara
Masaya Nakamura
Yuichiro Otsuka
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki
National University Corporation, Tokyo University Of Agriculture And Technology
Nagaoka University Of Technology
Forestry And Forest Products Research Institute
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
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    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11003—Protocatechuate 3,4-dioxygenase (1.13.11.3)

Definitions

  • the present invention relates to a gene-disrupted strain of protocatechuic acid 4,5-ring-cleaving enzyme, terephthalic acid via protocatechuic acid, and 3-carboxyoxy-cis, ci s-muconic acid and / or 3-carboxymuconolac.
  • Terephthalic acid is an aromatic compound that is separated from petroleum components, and is produced in large quantities and at low cost as a PET raw material. If new functional plastics with biodegradability can be developed using terephthalic acid as a raw material, the development of polymer materials with excellent biodegradability by copolymerization with petroleum polymer materials such as PET Is possible.
  • the present inventors found that the terephthalic acid-degrading microorganism Comamonas sp.) E6 strain once converted terephthalic acid into protocatechuic acid, and then converted 2H-pyran-2-one-4,6-dicarboxylic acid. After that, it has been found that it can be completely decomposed (Patent Document 1).
  • the present inventors have obtained 3-carboxy-cis, cis-muconic acid and / or 3 from plant-derived components such as vanillin, vanillic acid, and protocatechuic acid through a multi-stage enzymatic reaction.
  • plant-derived components such as vanillin, vanillic acid, and protocatechuic acid
  • -A method for fermentative production of carboxymucono lactone has been reported (Japanese Patent Application No. 2006-218524).
  • terephthalic acid is converted to 3-carboxy-cis, cis-muconic acid via 1,2-dihydroxy-3,5-cyclohexagen-1,4-dicarboxylate and protocatechuic acid.
  • this protocatechuic acid is cleaved in 2,3-bond, 3,4-bond or 4,5-bond depending on the type of microorganism (hereinafter, 2,3-bond cleavage of protocatechuic acid).
  • 3, 4-bond cleavage and 4 5-bond cleavage may be referred to as “2,3-ring cleavage”, “3,4-ring cleavage” and “4,5-ring cleavage”, respectively) .
  • 3-streptoxy-cis, cis-muconic acid which is a 3,4-ring cleavage product of protocatechuic acid, is a compound of 3-carpoxime conoractolone or 4-streptocylconolactone under certain microorganisms. Via either method, it is further decomposed and metabolized.
  • terephthalic acid is passed through protocatechuic acid to form 3-carboxyl.
  • a method for fermentative production of cis-cis, cis-muconic acid on an industrial scale and / or fermentative production of carboxy-cis, ci s-muconic acid from terephthalic acid via protocatechuic acid and acid-treating it is to provide a method for obtaining 3-force lupoxime conoractone on an industrial scale.
  • the present inventors have converted protocatechuic acid into 2H-bilan-2-one-4,6-dicarboxylic acid if the cleavage activity of protocatechuic acid 4,5-ring cleavage enzyme is destroyed. Considering that the process is completely destroyed, a gene-disrupted strain of protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme that has disrupted the cleavage activity of protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme was prepared. By using this disrupted strain, 3-streptoxy-cis, cis-muconic acid and / or its acid-treated 3-carboxymuconolactone can be produced from terephthalic acid at a high yield and at low cost. The present invention has been completed by finding out what can be done. (1) The present invention provides the following, which is present on the chromosome DNA of a microbial cell:
  • a gene-disrupted strain of protocatechuic acid 4,5-ring-cleaving enzyme in which the gene coding for is disrupted is provided.
  • the present invention also relates to the presence of chromosomal DNA on microbial cells.
  • a DNA that is complementary to the base sequence of (a) is hybridized under stringent conditions with DNA, and the enzyme having pro-reactive technic acid 4,5-ring cleavage activity is coded.
  • a gene-disrupted strain of protocatechuate 4,5-ring cleaving enzyme in which the gene containing is disrupted.
  • the present invention also resides on the chromosome DNA of microbial cells:
  • the present invention is also described in any one of (1) to (3), wherein the parent strain of the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme gene-disrupted strain is a bacterium of the genus Comamonas sp. Gene-disrupted strains.
  • the present invention also provides the gene-disrupted strain according to (4), wherein the genus Comamonas is Comamonas s £ .E6 strain.
  • the present invention also provides a telefusate, dioxygenase gene.
  • TPA-DOX gene NADPH-reductase gene, 1,2-dihydroxy-3,5-cyclohexagen-1,4-dicarboxylate 'dehydrogenase gene (DCD dehydrogenase gene)
  • DCD dehydrogenase gene 1,2-dihydroxy-3,5-cyclohexagen-1,4-dicarboxylate 'dehydrogenase gene
  • DCD dehydrogenase gene 1,2-dihydroxy-3,5-cyclohexagen-1,4-dicarboxylate 'dehydrogenase gene
  • pcaHG gene protocatechuate 3,4-dioxygenase gene
  • the present invention also provides a transformant obtained by introducing the recombinant plasmid of (6) into the gene-disrupted strain of any one of (1) to (5).
  • the present invention further comprises culturing the transformant according to (7) in the presence of terephthalic acid, wherein 3-carboxy-cis, cis-muconic acid and / or 3-strength is obtained.
  • a method for producing lupoxime conolactone is provided.
  • 3-carboxy-cis, cis-muconic acid and / or 3-carboxymuconolactone can be fermented and produced from terephthalic acid at high yield and at low cost.
  • FIG. 1 shows the restriction enzyme and 0RF map of 5.1-kbSall-Xhol.
  • FIG. 2 shows the positional relationship between the 10-kb Sacl fragment of pCS18 and the 10-kb Sail fragment of pPVIO.
  • FIG. 3 is a diagram showing a group of pro-technic acid 4,5-cleavage enzyme genes derived from Coma ⁇ as sp. E6 strain.
  • Fig. 4 shows the pmdBl disrupted strain plasmid pDBKM.
  • Figure 5 shows the disruption of the pmdB 1 gene in Comamonas SP. E6 strain. 5 (A) shows how to create the pmdBl gene disruption strain of E6 strain. (B) shows the results of Southern hybridization analysis of the pmdBl gene-disrupted strain.
  • FIG. 6 shows the production of recombinant plasmid pKHG.
  • FIG. 7 shows the production of recombinant plasmid pKHG / C.
  • FIG. 8 shows the production of recombinant plasmid pKTphHG / C.
  • the gene-disrupted strain of the present invention only needs to have at least one of the 2,3-ring cleavage function, 3,4-ring cleavage function, and 4,5-ring cleavage function disrupted.
  • the gene-disrupted strain of the present invention may retain a 3,4-ring cleavage function, as long as the function of further metabolizing 3-carboxy-cis, cis-muconic acid is disrupted. .
  • cis-muconic acid for example, 3-carboxymuconolactonase or 4-carboxymuconolactonase may be discarded.
  • 3-carboxy-cis, cis-muconic acid of the present invention can be achieved by, for example, i) having a metabolic function (terephthalic acid assimilation ability) from terephthalic acid to protocatechuic acid.
  • terephthalic acid does not have a 2,3-ring cleavage function, but terephthalic acid has a 3,4-ring cleavage function or a 4,5-ring cleavage function, or ii) utilization of terephthalic acid
  • a host microorganism that has the ability to assimilate protocatechuic acid, but has the 2,3-ring cleavage function, 3,4-ring cleavage function, or 4,5-ring cleavage function of protocatechuic acid. Achieved by introducing.
  • the protocatechuic acid 4,5-ring cleavage enzyme gene group is designated as “pmd”. It has a dioxygenase activity that cleaves the protocatenic acid 4,5-ring and converts it to 4-carboxy-2-hydroxyximonic acid-6-semialdehyde.
  • the gene encoding the enzyme subunit is “pmdAl” (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3 and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4), and the gene encoding the subunit is “pmdBl” ( The amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence is represented by SEQ ID NO: 2).
  • the method for obtaining a gene encoding protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme is not particularly limited.
  • an appropriate probe or primer is prepared based on information on the base sequence of the gene, It can be obtained by screening the cDNA library of the strain and the genomic DNA library.
  • the gene for protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme can also be obtained by PCR.
  • PCR can be carried out using a chromosomal DNA or cDNA library of the strain as a saddle and using a pair of primers designed to amplify the base sequence of the gene.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, 94 for 30 seconds (denaturation), 55 for 30 seconds to 1 minute (annealing), 72 for 2 minutes (extension) For example, after 30 cycles, the reaction can be performed at 72 for 7 minutes.
  • the amplified DNA fragment can then be cloned into an appropriate vector.
  • the vector it is preferable to select a vector that replicates autonomously in E.
  • the gene disrupted strain of the present invention is a disrupted strain that selectively disrupts protocatechuic acid 4,5-ring cleavage. More specifically, the following is present on the chromosomal DNA chromosome DNA: (a) the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3; or (b) the amiso acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3. Or an amino acid sequence in which two or more amino acids have been deleted, substituted, added, and Z or inserted, and the amino acid sequence having protocatechuic acid 4,5-ring cleavage activity has been disrupted .
  • the above gene includes (a) a base sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4; or (b) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence of (a) under stringent conditions, And a gene comprising a base sequence encoding an enzyme having prototechnic acid 4,5-ring cleavage activity.
  • the gene to be disrupted may be the pmdBl gene represented by SEQ ID NO: 2, the pmdAl gene represented by SEQ ID NO: 4, or both of these genes may be disrupted.
  • the range of “two or more” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted” in the amino acid sequence is not particularly limited. 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, particularly preferably 1 ⁇ Means about three.
  • stringent hybridization conditions refers to the hybridization of DNA strands whose sequences are highly complementary.
  • highly stringent conditions include 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 65-68, or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M queen at 42. Examples include sodium acid and 50% formamide. Specific examples of “moderately stringent conditions” include 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 50-65, or 0.015 at 37-50.
  • DNA that can be hybridized is calculated using analysis software such as BLAST [J. Mol. Biol., 2J_5, 403 (1990)], FASTA [Method in Enzymology, ⁇ 83. 63 (1990)]. And at least 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. Mention may be made of DNA having a homology of 95% or more, most preferably 97% or more.
  • “having protocatechuic acid 4,5-ring cleavage activity” means that protocatechuic acid 4,5-ring is cleaved to give protocatechuic acid 4-force loxy-2-hydroxyximonic acid-6 -Means having the same activity as an enzyme that converts to semialdehyde.
  • the gene-disrupted strain of the present invention can be obtained by introducing a mutation and / or a selection marker into the gene encoding the above-mentioned protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme obtained by PCR or cloning. It can be prepared by obtaining DNA that has lost the 5-ring cleavage activity and then performing homologous recombination using the DNA.
  • a method for introducing a selection marker into a gene encoding protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme for example, after cleaving the above gene with an appropriate restriction enzyme, an irrelevant gene, preferably homologous recombination, is used.
  • an irrelevant gene preferably homologous recombination
  • One example is a method of inserting a gene for a selection marker that can select the strain that has occurred. If there is no appropriate restriction enzyme site, an appropriate restriction enzyme site may be inserted by PCR or the like.
  • a drug resistance marker is preferable, and examples thereof include a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a tetracycline resistance gene.
  • the DNA that lost the protocatechuic acid 4,5-ring cleavage activity used for the production of the gene disruption strain of the present invention is the corresponding protocatechuic acid 4,5 on the chromosome under physiological conditions, that is, in microbial cells.
  • -Homologous recombination with the gene coding for the ring-cleaving enzyme so that it has enough homology to destroy the gene for the prototechnic acid 4,5-ring-cleaving enzyme. That's fine.
  • Such homology is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Homology.
  • the DNA used for homologous recombination is the corresponding protocatechuic acid on the chromosome under physiological conditions, that is, in microbial cells.
  • the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme gene can be disrupted by homologous recombination with the 5-ring cleaving enzyme gene, the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme It may be part of a gene.
  • the term “part” includes those having a length of preferably 50 bases or more, more preferably 100 bases or more.
  • a recombinant DNA in which an appropriate selection marker is inserted into the DNA containing the base sequence of the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme gene or its mutant DNA.
  • an appropriate selection marker is inserted into the DNA containing the base sequence of the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme gene or its mutant DNA.
  • a drug resistance marker it is necessary to select a drug resistance gene to which the wild-type strain is sensitive before undergoing homologous recombination. By doing so, it is possible to discriminate between strains that have undergone homologous recombination and strains that do not, by the presence or absence of growth in the presence of antibiotics.
  • the marker is selected with a marker, whereby the target gene is transformed into the host microorganism by homologous recombination. It can be integrated on the chromosome.
  • the parent strain of the protocatechuic acid 4,5-ring cleaving enzyme gene disruption strain may be derived from a soil bacterium such as the genus Comamonas, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Saccharomyces, or Candida. If it does not specifically limit.
  • the parent strain may be a strain derived from a microorganism having “terephthalic acid assimilation ability” or a strain derived from a microorganism having no “terephthalic acid utilization ability” but having “protocatechuic acid utilization ability”. Good.
  • Microorganisms capable of assimilating terephthalate can be obtained from terephthalic acid. Has metabolic function to strong technic acid.
  • strains capable of assimilating terephthalic acid include, for example, the genus Comamonas sp. E6, Pseudomonas putida PPY1100, Testosteroni T-2, Comamonas testes. Testosteroni) YZW-D, Delphtia tsuruhatensis) T7, Rhodococcus sp. DK17, Rhodococcus jostii RHA1, etc.
  • E6 strain has a metabolic function from terephthalic acid to protocatechuic acid and a metabolic function from protocatechuic acid to 2H-pyran-2-one-4,6-dicarboxylic acid (4, 5 -A ring-cleaving function) and does not have a 2,3-ring cleavage function or a 3,4-ring cleavage function.
  • Comamonas SP. E6 strain is used as the parent strain, fermentative production systems from vanillic acid etc.
  • Microorganisms that do not have terephthalic acid assimilation ability but have protocatechuic acid assimilation ability have 2,3-ring cleavage function, 3,4-ring cleavage function, or 4,5-ring cleavage function.
  • Examples of such microorganisms include the genus Syudomonas, the genus Bacillus, the genus Burkholderia, and the genus Agropacteria.
  • Gene-disrupted strains that have disrupted the protocatechuic acid 2,3-ring cleavage function or 3,4-ring cleavage function can be prepared in the same manner as the 4,5-ring cleavage function disruption strain described above.
  • Microorganisms that have terephthalic acid utilization ability are generally more capable of taking up terephthalic acid or substitute for microorganisms that do not have terephthalic acid utilization ability. It is estimated that the conversion function is high due to the development of an award function.
  • An example of such a strain is the Pseudomonas putida PPY1100 strain. When the Pseudomonas putida PPY1100 strain was used, the reaction efficiency was slightly lower than that of the Coma monas sp. E6 strain.
  • the plasmid is an enzyme gene that catalyzes a multi-step process for producing 3-force l-poxy-cis, cis-muconic acid from terephthalic acid via protocatechuic acid (Positive Regiyure, TPA-Transporter., TPA -D0X, DCD-dehydrogenase, NADPH-reductase, protocatechuate 3, 4-ring cleavage gene) in this order from the upstream (Fig. 8).
  • TPA-transporter gene is the DNA molecule described in SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO: 10 in the present specification) and TPA-D0X genes (tphA2, tphA3) described in the same specification, respectively.
  • DNA molecules described in SEQ ID NOs: 2 and 4 In the detailed description, SEQ ID NO: 1 and 1 2) and DCD-dehydrogenase gene (tphB) are the DNA molecules described in SEQ ID NO: 6 described in the same specification (SEQ ID NO: 13 in this specification).
  • the NADPH-Redac gene (tphAl) is a DNA molecule described in SEQ ID NO: 8 described in the specification (SEQ ID NO: 14 in the present specification).
  • the protocatechuic acid 3,4-ring cleavage gene (pcaHG) used in the present invention is a DNA fragment obtained from Pesudomonas putida KT2440, and the sequence of PcaH gene is shown in SEQ ID NO: 1 of Japanese Patent Application No. 2006-218524.
  • the nucleotide sequence of the PcaG gene is described in SEQ ID NO: 3 in the same specification (SEQ ID NO: 15 and 16 in the present specification, respectively).
  • tphR, tphC, tphA2, tphA3, tphB and tphAl may be collectively referred to as “Tph gene cluster” or “Tph gene group”.
  • the fermentative production plasmid of 3-force lupoxy-cis, cis-muconic acid from terephthalic acid according to the present invention can be prepared specifically as shown in FIGS.
  • the PcaH gene (SEQ ID NO: 1) and PcaG gene (SEQ ID NO: 2) described in Japanese Patent Application No. 2006-218524 are used downstream of LacZ promotion of pBluescript using a known ligase.
  • Recombinant plasmid pBluescript II SK "/ pcaHG is prepared by ligating to the multicloning site in the gene encoding the LacZ ⁇ -fragment.
  • pBluescript II SK- / pcaHG was cleaved with restriction enzymes Pvul I and BamHI, and then digested with DNA fragments.
  • Recombinant plasmid pKHG is prepared by ligating the DNA fragment obtained by (1) with a known ligase (FIG. 6).
  • Recombinant plasmid pKHG / C is prepared by ligating the DNA fragment and the DNA fragment obtained by cleaving pKHG with the restriction enzyme Kpnl and then treating with a known ligase (Fig. 7). .
  • With the restriction enzyme EcoRI and a DNA fragment obtained by cleaving the pKHG / C obtained in (2) with EcoRI and then terminal treatment with a known ligase.
  • Recombinant plasmid pKTphHG / C can be prepared by binding.
  • a known method such as a protoplast method, a competent cell method, or an electroporation method may be used.
  • the selection of transformants can be based on the selection marker of the plasmid used, for example, the drug resistance acquired by DNA recombination of the transformants.
  • a transformant containing the desired recombinant plasmid is selected, for example, by a colony hybridization method using a partial DNA fragment of the gene as a probe. Is preferred.
  • a label for this probe for example, a radioisotope, digoxigenin, an enzyme or the like can be used.
  • the transformant of (II) of the present invention may be cultured under appropriate conditions using a medium containing a carbon source, nitrogen source, metal salt, mineral, vitamin, etc. in the presence of terephthalic acid.
  • the pH of the medium is such that the transformant grows
  • the pH may be within a range to be obtained, and it is preferable to adjust the pH to about 6 to 8.
  • Culture conditions are 1540, preferably 28-37, and cultured for 2-7 days with shaking or aeration and agitation.
  • 3 -It By treating the culture medium containing 3-strength loxy-cis, cis-3-muconic acid obtained as described above or unpurified 3-carboxy-cis, cis-3-muconic acid with acid treatment, 3 -It can be converted to carboxymuconolactone with high yield.
  • acid hydrochloric acid having a pH of about 1-2 is preferable.
  • 3-Carboxyoxy-cis, cis-muconic acid and / or 3-carboxymucono lactone obtained by the production method of the present invention can be used as a plastic material, a chemical product material, etc. as 2H-bilan-2-one-4, 6 -Different or higher functional expression than dicarboxylic acid can be expected, and production of useful plastic materials can be expected.
  • Sp_hin3 ⁇ 4o.monas oaucimobiHs SYK-1 igA gene of 6 strains Ar throbacte From the alignment of amino acid sequences estimated from pcmA gene of L keyser i 12B strain, pmdAlBl gene of Comamonas testosteroni BR6020 strain, and fldVU gene of Sphingomonas sp. LB126 strain, a highly homologous region was found, and Comamonas sp.
  • the E6 strain total DNA of the protocatechuic acid 4,5-dioxygenase gene of the strain was used as a saddle and PCR was performed using the following aF /) 8 R primer.
  • aF in the ⁇ -subunit 26 mer: ATGWSSCTGATGAARSCSGARAACCG; SEQ ID NO: 5;
  • PCR was performed between 8 F-) 8 R using this PCR product in a cage and using F as a nested primer. As a result, an expected size of 450 bp was obtained.
  • the obtained PCR product was subcloned into the pT7Blue vector, and the nucleotide sequence of the 449 bp fragment was determined. A homologous sequence was searched based on the DD BJ database, and the gene encoding protocatechuate 4,5-dioxygenase j8-subunit of Comamonas testosteroni BR6020 strain at the amino acid level (DDBJ accession number: AF305325) and 99 % Identity.
  • Sphingomonas paucimobil is SYK-6 ligB (DDBJ accession number: AB035122) and 68%, Arthrobacter keys eri 12B strain pcmA (DDBJ accession number: AF331043), Sphingomonas s ⁇ .
  • Il126 of LB126 strain (DDBJ accession number: AJ277295) showed 66% identity.
  • a clone pKS10F (R) was constructed in which the 10-kb Sail fragment of pPVIO was inserted in both the forward and reverse directions of the 1 ac promoter of pBluescript II KS (+) downstream.
  • Three fragments of 1.9 kb, 3.2 kb, and 4: 9 kb obtained by digesting pKS 10F with Sail and Xhol were blunted and introduced into the SBlue site of pBluescript II KS (+). After introducing these fragments in both forward and reverse directions downstream of the lac promoter, they were named pKlSXF (R), pK3XF (R), and pK4XSF (R), respectively (Fig. 1).
  • a library was prepared by cloning the Sacl digest of total DNA from E6 strain into charomid 9-36. Isolation of pCS18 with 10-kb Sacl fragment containing pmdA 1B1 by colony hybridization using 1,150 bp fragment obtained by digesting 1.9-kb Sall-Xhol fragment with Sail and EcoRI ( Figure 2). pSC18 containing p mdAlBl 2. Confirm that the ⁇ kb SacII fragment is adjacent to the 6. ⁇ kb Sacl-Sal I fragment by sequencing, and 6.
  • SEQ ID NO: 8 contains pmdJ described in Figure 3.
  • a 3.6-kb Sal I-EcoRV fragment containing the pmdAlBlC gene was excised from pKSlOF and inserted into pBluescript II KS (+) digested with Sal I-EcoRV to obtain PSDB36.
  • digestion was performed with Stul in the pmdBl gene, and a 1.2-kb EcoRV fragment containing the kanamycin resistance gene derived from PIK03 was inserted between them (sequence indicated by the underline of SEQ ID NO: 1). It was confirmed by Smal digestion that a fragment was inserted in the same direction as the transcription direction of the lac promoter of pBluescript II KS (+), and PKS78F was obtained.
  • a 4.9-kb Sall-EcoRV fragment was excised from pKS78F and inserted into the Sail-Smal site of pK19mobsacB to construct a plasmid pDBKM for producing a pm dBl-disrupted strain (Fig. 4).
  • Bio-Rad Bio-Rad
  • LB medium containing 100 g / ml kanamycin.
  • the obtained kanamycin resistant strain was collected in 1 ml of LB medium, inoculated into 10 ml LB medium containing 10% sucrose, and cultured for 12 hours. 200 l was inoculated into fresh LB medium and this was repeated three times. Finally, the culture solution was applied to LB medium containing 100 ag / ml kanamycin, and the obtained colonies were used as gene-disrupted strain candidates.
  • the gene-disrupted strain candidate was pre-cultured in 3 ml of LB medium containing 100 g / ml kanamycin, inoculated once into 10 ml of the same medium, and main-cultured. After that, all DNA of candidate gene disruption strains is collected, digested with EcoRV, and then a Southern hybrid using a 3.4-kb Hindlll-Kpnl fragment containing pmdAlBl and a 1.2-kb EcoRV fragment containing a pIK03-derived kanamycin resistance gene as a probe. Digestion was performed (Fig. 5).
  • Lanes 3 and 3 show the total DNA of the EcoRV-digested wild type E6 strain, and lanes 2 and 4 show the total DNA of the EcoRV-digested gene-disrupted strain.
  • the probes used are 3, 4- kb Hindlll-Kpnl fragment containing pmdBl for lanes 1 and 2, and kanamycin for lanes 3 and 4.
  • the plasmid PHSG398 (manufactured by Yukari) containing the chloramphenicol resistance gene was cleaved with the restriction enzyme Cfrl3I and then digested. Recombinant plasmids are obtained by binding the MA fragment obtained by blunting and the DNA fragment obtained by terminal blunting after cleaving pKHG with the restriction enzyme Kpnl by T4DNA ligase (Roche). ⁇ HG / C was fabricated (Fig. 7).
  • the recombinant plasmid pKTphHG / C was prepared by binding the MA fragment obtained by digestion with EcoRI with T4DNA ligase (Roche) (Fig. 8).
  • Recombinant plasmid pKTphHG / C was transformed into Escherichia coli HB101, and cultured in LB medium (100 ml) containing 25 mg / L kanamycin at 37 for 18 hours with shaking. Recombinant plasmid pKTphHG / C was extracted from the cultured cells.
  • the gene disruption strain (Comamonas sp. EDB strain) prepared in Example 2 was cultured in LB liquid medium (500 ml) at 28 for 23 hours and cooled in ice for 30 minutes. 4: Centrifugal cells were collected at 10,000 rpin for 10 minutes, washed gently with 500 ml of 0 distilled water, and then collected again by centrifugation. Subsequently, the cells were gently washed with 250 ml of 0 distilled water and collected by centrifugation. Further, 125 ml of 0 was gently washed with distilled water and collected by centrifugation. The collected microbial cells were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0.
  • the culture medium in the fermenter was transferred to a plastic container (bucket).
  • the bacterial cell components are precipitated and removed from the culture by centrifugation (at 6000 rpm, 20), and hydrochloric acid is added to the resulting supernatant to a pH of 1.0 or less.
  • hydrochloric acid is added to the resulting supernatant to a pH of 1.0 or less.
  • 3-carboxy-cis, cis-muconic acid was converted to 3-carboxymuconolactone.
  • Complete conversion to 3-carboxymuconolactone was confirmed by GC-MS, and 3-carpoximeconolactone was extracted with an organic solvent (ethyl acetate).
  • the 3-carpoxime conolactone extracted and dried from 1 L of the culture broth reached about 9.8 g, and was recovered in a yield of about 87% relative to the added substrate (terephthalic acid).
  • the obtained 3-carboxymuconolactone was treated with activated carbon, and its structure was confirmed by NMR and MS spectra.

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Abstract

テレフタル酸から3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸を工業的スケールで発酵生産すること。　微生物細胞の染色体ＤＮＡ上の、（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が破壊された、プロトカテク酸4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株；Tph遺伝子及びプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；該破壊株に、該組換えプラスミドを導入してなる形質転換体；並びに、テレフタル酸の存在下に、該形質転換体を培養することを特徴とする、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの製造方法。

Description

明 細 書 遺伝子破壊株、 組換えプラスミ ド、 形質転換体、 及び 3-カルポキシ ムコノ ラク 卜ンの製造方法 技術分野
本発明は、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺伝子破壊株、 テ レフタル酸からプロ トカテク酸を経由して、 3-カルポキシ -c i s， c i s-ムコン酸及び/又は 3-カルボキシムコノラク トンを発酵生産する ための多段反応プロセスを構成する酵素をコー ドする遺伝子を含む 組換えプラスミ ド、 前記組換えプラスミ ドを前記破壊株に導入した 形質転換体、 及びそれを用いる 3-カルボキシ -c i s, c i s-ムコン酸及 び/又は 3-カルポキシムコノラク トンの工業的製造法に関する。 背景技術
テレフタル酸は石油成分から分離される芳香族化合物で、 PET原 料として大量かつ安価に生産されている。 テレフタル酸を原料に生 分解性を持つ新しい機能性プラスチックスを開発することができれ ば、 PET等の石油系高分子材料との共重合などにより生分解性に優 れた高分子材料の開発が可能となる。
一方、 本発明者らは、 テレフタル酸分解微生物コマモナス属 mamonas S P. ) E6株が、 テレフタル酸を一旦プロ トカテク酸に変換 した後、 2H-ピラン -2-オン- 4, 6-ジカルボン酸を経て完全に分解で きることを見出している （特許文献 1 ) 。 また、 当該微生物の染色 体 DNAから、 プロ トカテク酸 4， 5-ジォキシゲナ一ゼ及び 4-カルボキ シ- 2-ヒ ドロキシムコン酸- 6-セミアルデヒ ドデヒ ドロゲナ一ゼをコ ー ドする遺伝子を取り除く ことにより、 テレフ夕レー ト · ジォキシ ゲナーゼ （TPA-DOX) 、 1, 2-ジヒ ドロキシ- 3， 5-シクロへキサジェ ン- 1, 4-ジカルボキシレー ト · デヒ ド口ゲナ一ゼ （DCD- dehydrogena se) 、 テレフ夕レー ト · トランスポー夕一 （TPA transporter)及び ポジティ ブレギユレ一夕一 （positive regulator) をそれぞれコー ドする遺伝子を含む組換えベクター、 それを含む形質転換細胞、 並 びに当該形質転換細胞を用いるテレフタル酸からの 2H -ビラン- 2 -才 ン -4, 6-ジカルボン酸の製造法を報告している （特願 2005-298242号 明細書） 。
また、 本発明者らは、 植物由来成分であるバニリ ン、 バニリ ン酸 、 プロ トカテク酸等から、 多段階の酵素反応を介して、 3-カルポキ シ -cis， cis-ムコン酸及び/又は 3 -カルボキシムコノ ラク トンを発酵 生産する方法を報告している （特願 2006-218524号明細書） 。
ここで、 テレフタル酸は、 1， 2-ジヒ ドロキシ- 3, 5-シクロへキサ ジェン -1,4-ジカルボキシレート、 プロ トカテク酸を経て、 3-カル ポキシ -cis, cis-ムコン酸に変換されるが、 このプロ トカテク酸は 、 微生物の種類によってはその 2， 3-結合、 3， 4-結合又は 4， 5-結合が 開裂される （以下、 プロ トカテク酸の 2, 3-結合開裂、 3, 4-結合開裂 及び 4, 5-結合開裂を、 それぞれ、 「2, 3-環開裂」 、 「3, 4-環開裂」 、 「4, 5-環開裂」 と称することがある） 。 また、 プロ トカテク酸の 3, 4-環開裂物である 3-力ルポキシ- cis, cis-ムコン酸は、 特定の微 生物下では、 3-カルポキシムコノラク トン又は 4 -力ルポキシムコノ ラク トンのいずれかを経て、 更に分解代謝される。
従って、 これまで、 テレフタル酸を原料として、 3_力ルポキシ- c is, cis-ムコン酸を発酵生産する方法は知られていなかった。 発明の開示
本発明は、 テレフタル酸からプロ トカテク酸を経て 3 -カルボキ シ - cis， cis-ムコン酸を工業的スケールで発酵生産する方法、 及び/ 又はテレフタル酸からプロ トカテク酸を経て 3-カルボキシ- cis， ci s-ムコン酸を発酵生産し、 これを酸処理することにより、 3-力ルポ キシムコノラク トンを工業的スケールで得る方法を提供することを 目的とする。
3-カルポキシ -cis, cis-ムコン酸を効率良く得るためには、 2， 3- 環開裂機能、 3.4-環開裂機能又は 4, 5-環開裂機能を有する遺伝子を 破痺するか、 あるいは 3-カルボキシ -cis, cis-ムコン酸を更に代謝 する遺伝子を破壊する必要がある。
本発明者らは、 鋭意検討した結果、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵 素の開裂活性を破壊すればプロ トカテク酸から 2H-ビラン -2-オン - 4 , 6-ジカルボン酸への変換プロセスが完全に破壊されると考え、 プ ロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の開裂活性を破壊したプロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺伝子破壊株を作製した。 そして、 この破壊株 を用いることにより、 テレフ夕ル酸から 3-力ルポキシ- cis, cis-ム コン酸及び/又はその酸処理物である 3-カルボキシムコノラク トン を高収率かつ安価に製造できることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 （ 1 ) 本発明は、 微生物細胞の染色体 DN A上に存在 する下記 ：
( a ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列 ； 又は
(b) 配列番号 1もしくは 3に記載のアミノ酸配列において、 1 又は 2以上のアミノ酸が欠失、 置換、 付加及び Z又は挿入されてい るアミノ酸配列であって、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂活性を有す るアミ ノ酸配列、
をコー ドする遺伝子が破壊された、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵 素の遺伝子破壊株を提供する。
( 2) 本発明はまた、 微生物細胞の染色体 D N A上に存在する下 ( a ) 配列番号 2もしくは 4に記載の塩基配列 ； 又は
( b ) ( a) の塩基配列と相補的な塩基配列からなる D NAとス トリ ンジェン卜な条件でハイブリダィズし、 かつプロ 卜力テク酸 4 ， 5 -環開裂活性を有する酵素をコ一ドする塩基配列であって、 かつ プロ トカテク酸 4, 5_環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配 列、
を含む遺伝子が破壊された、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺 伝子破壊株を提供する。
( 3 ) 本発明はまた、 微生物細胞の染色体 D N A上に存在する下 記 ：
( a ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列 ； 又は
( b ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列において、 1 又は 2以上の塩基が欠失、 置換、 付加及び/又は挿入されているァ ミノ酸配列であって、 プロ トカテク酸 4， 5-環開裂活性を有するァ ミノ酸配列、
をコードする遺伝子と相同組換えを起こすことができる DNA配列 を有し、 かつ、 プロ トカテク酸 4， 5-環開裂活性を喪失している相 同組換え用 DNAと、 当該遺伝子との相同組換えにより、 プロ トカ テク酸 4, 5-環開裂酵素遺伝子が破壊された、 （ 1 ) 又は （ 2 ) 記 載の遺伝子破壊株を提供する。
( 4 ) 本発明はまた、 プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素遺伝子破 壊株の親株が、 コマモナス属 (Comamonas sp. ) 細菌である、 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれか 1に記載の遺伝子破壊株を提供する。
( 5 ) 本発明はまた、 前記コマモナス属細菌が、 Comamonas s£. E6株である、 （ 4 ) 記載の遺伝子破壊株を提供する。
( 6 ) 本発明はまた、 テレフ夕レート ， ジォキシゲナ一ゼ遺伝子 (TPA- DOX遺伝子） 、 NADPH-レダク夕一ゼ遺伝子、 1, 2-ジヒ ドロキ シ -3， 5-シクロへキサジェン -1， 4-ジカルボキシレ一ト ' デヒ ドロゲ ナ一ゼ遺伝子 （DCD dehydrogenase遺伝子） 、 ポジティブレギユレ —夕一遺伝子、 テレフタレート · トランスポー夕一遺伝子 （TPA tr ansporter遺伝子） 、 及びプロ トカテク酸 3, 4-ジォキシゲナーゼ遺 伝子 （pcaHG遺伝子） を含む、 組換えプラスミ ドを提供する。
( 7 ) 本発明はまた、 （ 1 ) 〜 （ 5 ) のいずれか 1 に記載の遺伝 子破壊株に、 （ 6 ) の組換えプラスミ ドを導入してなる形質転換体 を提供する。
( 8 ) 本発明は更に、 テレフタル酸の存在下に、 （ 7 ) 記載の形 質転換体を培養することを特徴とする、 3 -カルボキシ - cis， cis-ム コン酸及び/又は 3-力ルポキシムコノラク トンの製造方法を提供す る。
本発明によれば、 テレフタル酸から、 3-カルボキシ -cis, cis -ム コン酸及び/又は 3-カルボキシムコノラク トンを高収率かつ安価に 発酵生産することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 5. 1- kbSall- Xholの制限酵素及び 0RFマップを示す図であ る。
図 2は、 pCS18の 10-kb Sacl断片及び pPVIOの 10- kb Sail断片の位 置関係を示す図である。
図 3は、 Coma瞧 as sp. E6株由来のプロ力テク酸 4, 5-開裂系酵 素遺伝子群を示す図である。
図 4は、 pmdBl破壊株プラスミ ド pDBKMを示す図である。
図 5は、 Comamonas SP. E6株における pmdB 1遺伝子の破壊を示す 図である。 5 ( A) は、 E6株の pmdBl遺伝子破壊株の作製法を、 5 (B) は、 pmdBl遺伝子破壊株のサザンハイブリダィゼーシヨン解 析の結果を示す図である。
図 6は、 組み換えプラスミ ド pKHGの作製を示す図である。
図 7は、 組み換えプラスミ ド pKHG/Cの作製を示す図である。
図 8は、.組み換えプラスミ ド pKTphHG/Cの作製を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子破壊株は、 2, 3-環開裂機能、 3, 4-環開裂機能及び 4, 5-環開裂機能の中の少なく とも 1以上の機能が破壊されていれば よい。 あるいは、 本発明の遺伝子破壊株は、 3, 4-環開裂機能を保持 していてもよいが、 3-カルボキシ- c is, cis-ムコン酸を更に代謝す る機能が破壊されていればよい。 カルポキシ -cis, cis-ムコン酸の 代謝活性を破壊するためには、 例えば、 3-カルボキシムコノラク ト ン化酵素や 4-カルボキシムコノラク トン化酵素を破棄すればよい。 本発明の 3-カルボキシ -cis, cis-ムコン酸の製造は、 本発明の遺 伝子破壊株を、 例えば、 i ) テレフタル酸からプロ トカテク酸への 代謝機能 （テレフタル酸資化能） を有し、 かつ、 テレフタル酸の 2, 3 -環開裂機能を有さないが、 テレフタル酸の 3, 4-環開裂機能又は 4， 5 -環開裂機能を有する宿主微生物、 又は i i ) テレフタル酸資化能 を有さないが、 プロ トカテク酸の 2， 3-環開裂機能、 3, 4-環開裂機能 又は 4, 5-環開裂機能を有する 「プロ トカテク酸資化能」 を有する宿 主微生物に導入することによって達成される。
以下に、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂機能が破壊された遺伝子破 壊株を例に、 本発明を詳述する。
( I ) プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素 （プロ トカテク酸 4, 5-ジォ キシゲナ一ゼ） をコードする遺伝子の獲得
本発明では、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂系酵素遺伝子群を 「pmd 遺伝子群」 と称するが、 当該 pmd遺伝子群の内、 特に、 プロ トカテ ク酸 4， 5-環を開裂し 4-カルボキシ -2-ヒ ドロキシムコン酸- 6-セミ アルデヒ ドに変換するジォキシゲナーゼ活性を有する酵素のひ-サ ブユニッ トをコードする遺伝子を 「pmdAl」 （アミノ酸配列を配列 番号 3で、 塩基配列を配列番号 4で示す） 、 ）8 -サブユニッ トをコ —ドする遺伝子を 「pmdBl」 （アミノ酸配列を配列番号 1で、 塩基 配列を配列番号 2で示す） と称する。
また、 4-力ルポキシ- 2-ヒ ドロキシムコン酸 -6-セミアルデヒ ドを 開環し 2H-ピラン- 2-オン- 4, 6-ジカルボン酸に変換するデヒ ドロゲ ナ一ゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を 「pmd (：」 と称する。
プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素をコードする遺伝子の取得方法 は特に限定されず、 例えば、 当該遺伝子の塩基配列の情報に基づい て適当なプローブやプライマ一を調製し、 それらを用いて、 菌株の c D NAライブラリ一やゲノム D NAライブラリーをスクリ一ニン グすることにより得ることができる。
プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺伝子を P C R法により取得 することもできる。 菌株の染色体 D NA又は c D NAライブラリ一 を铸型として使用し、 当該遺伝子の塩基配列を増幅できるように設 計した 1対のプライマ一を使用して P C Rを行えばよい。 P C Rの 反応条件は適宜設定することができ、 例えば、 94でで 30秒間 （変性 ) 、 55でで 30秒〜 1分間 （アニーリング） 、 72でで 2分間 （伸長） からなる反応工程を 1サイクルとして、 例えば 30サイクル行った後 、 72でで 7分間反応させる条件などを挙げることができる。 次いで 、 増幅された D NA断片を、 適切なベクター中にクローニングする ことができる。 ベクターとしては、 大腸菌で自立複製し、 Coma瞧 a s 株において染色体外では自立複製できないベクターを選択す ることが好ましい。 上記のブローブ又はプライマーの調製、 C D NAライブラリ一の 構築、 c DNAライブラリーのスクリーニング及び目的遺伝子のク ローニングなどの操作は当業者に公知であり、 例えば、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 第 2版， Cold Spring Harbor Lab oratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement pp.1-38, John Wiley & Sons (1 987-1997)等に記載された方法に準じて行うことができる。
( I I ) 遺伝子破壊株の作製
本発明の遺伝子破壊株は、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂を選択的に 破壊する破壊株である。 より詳細には、 微生物細胞の染色体 D NA 上に存在する下記 ： （ a ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸 配列 ； 又は （ b ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミソ酸配列にお いて 1又は 2以上のアミノ酸が欠失、 置換、 付加及び Z又は挿入さ れているアミノ酸配列であって、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂活性 を有するアミノ酸配列、 をコードする遺伝子が破壊されている。 上記の遺伝子としては、 （ a ) 配列番号 2もしくは 4に記載の塩 基配列 ； 又は （ b) ( a ) の塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス トリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、 かつプロ ト 力テク酸 4, 5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列、 を 含む遺伝子が挙げられる。
具体的には、 破壊する遺伝子は、 配列番号 2で示される pmdBl遺 伝子でも、 配列番号 4で示される pmdAl遺伝子でもよく、 またこれ ら双方の遺伝子を破壊してもよい。
本明細書において、 「アミノ酸配列において 1又は 2以上のアミ ノ酸が欠失、 置換、 付加及び/又は挿入されているアミノ酸配列」 における 「 2以上」 の範囲は特には限定されないが、 例えば、 1〜 20、 好ましくは 1〜10、 より好ましくは 1〜 7、 特に好ましくは 1 〜 3程度を意味する。
本明細書における 「ス トリ ンジェン 卜なハイブリダィゼーシヨ ン 条件」 とは、 配列が高度に相補的である D NA鎖のハイブリダィゼ
—シヨ ンを可能にし、 そして有意に不一致な （mismatched) D NA のハイブリダイゼーショ ンを除外するように設計された 「高度にス トリ ンジェン 卜な条件」 、 又は 「高度にス ト リ ンジェン 卜な条件」 下で生じ得るより もより大きい程度の塩基対不一致を有する D NA 二重鎖を形成し得る 「中程度にス トリ ンジェン 卜な条件」 を言う。
「高度にス ト リ ンジェン卜な条件」 の具体例としては、 65〜68 で の、 0.015 M 塩化ナトリウム、 0.0015 M クェン酸ナ トリウム、 又 は 42 での、 0.015 M塩化ナ トリウム、 0.0015 Mクェン酸ナ ト リウ ム、 及び 50% ホルムアミ ドが挙げられる。 「中程度にス トリ ンジェ ン トな条件」 の具体例としては、 50〜65ででの、 0.015 M 塩化ナ ト リウム、 0.0015 M クェン酸ナト リウム、 又は 37〜50 での、 0.015
M 塩化ナ トリ ウム、 0.0015 M クェン酸ナ トリ ウム、 及び 20%ホル ムアミ ドが挙げられる。
ハイブリダィズ可能な D N Aとして具体的には、 BLAST 〔 J . Mol . Biol. , 2J_5, 403 ( 1990) 〕 、 FASTA [Method in Enzymology, 丄 83. 63 ( 1990) 〕 等の解析ソフ トを用いて計算したときに、 配列 番号 2又は 4の塩基配列を含むポリヌク レオチドと少なく とも 60% 以上、 好ましく は 70%以上、 より好ましく は 80%以上、 さ らに好ま しくは 90%以上、 さらにより好ましく は 95%以上、 最も好ましくは 97%以上の相同性を有する DNAを挙げることができる。
本明細書において 「プロ トカテク酸 4, 5-環開裂活性を有する」 とは、 プロ トカテク酸 4, 5-環を開裂して、 プロ トカテク酸を 4-力 ルポキシ- 2-ヒ ドロキシムコン酸- 6-セミアルデヒ ドに変換する酵素 と同等の活性を有することを意味する。 本発明の遺伝子破壊株は、 P C R又はクローニングにより得られ た上記のプロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素をコ一ドする遺伝子に変 異及び/又は選択マーカーを導入することによりプロ トカテク酸 4， 5-環開裂活性を喪失した D NAを得、 次いで当該 DNAを用いて相 同組み換えを行うことにより作製できる。
プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素をコードする遺伝子に選択マー カーを導入する方法としては、 例えば、 上記遺伝子を適当な制限酵 素で切断した後に、 無関係な遺伝子、 好ましくは相同組換えを起こ した菌株を選択できる選択マーカ一の遺伝子を挿入する方法が挙げ られる。 適当な制限酵素部位がない場合には P C R等により、 適当 な制限酵素部位を入れてもよい。 選択マーカ一としては、 薬剤耐性 マーカーが好ましく、 例えば、 カナマイシン耐性遺伝子、 アンピシ リン耐性遺伝子、 テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。 また、 プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素をコードする遺伝子に変 異を導入する方法としては、 D NAの塩基配列を操作する組換え D NA技術 （Sambruck, J. , Fri tsch, E. F. and Maniatis, T. (198 9) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 、 P C Rを応用した技術 (Ling M. M. and Robinson BH. , Anal. Biochem. 254 (2) : 157-78, 1997) 等、 多くの公知の方法が適用可能である。
本発明の遺伝子破壊株の作製に用いるプロ トカテク酸 4, 5-環開 裂活性を喪失した D NAは、 生理的条件下、 すなわち微生物細胞内 で、 染色体上の対応するプロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素をコード する遺伝子と相同組換えを起こすことができ、 それによつてプロ ト 力テク酸 4, 5-環開裂酵素の遺伝子を破壊することができる程度の 相同性を有していればよい。 このような相同性としては、 好ましく は 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以上の 相同性である。 また、 相同組換えに用いる D N Aは、 生理的条件下 、 すなわち微生物細胞内で、 染色体上の対応するプロ トカテク酸 4
， 5-環開裂酵素の遺伝子と相同組換えを起こすことができ、 それに よってプロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素の遺伝子を破壊することが できれば、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺伝子の一部であつ てもよい。 ここで一部とは、 好ましくは 50塩基以上、 より好ましく は 100塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
相同組み換えにより遺伝子破壊株を作製するためには、 先ず、 プ ロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素の遺伝子の塩基配列を含む D N A又 はその変異 D N A中に適当な選択マーカーを挿入した組み換え D N Aを構築する。 選択マーカーとして薬剤耐性マーカ一を使用する場 合には、 相同組み換えを受ける前の野生型の菌株が感受性を示す薬 剤の耐性遺伝子を選択することが必要である。 そうすることにより 相同組み換えを起こした菌株と起こさない菌株とを、 抗生物質の存 在下での生育の有無により判別することができる。 次いで、 上記の 選択マーカ一を遺伝子の配列中に挿入した D N Aを、 エレク トロポ レーシヨン法等により菌体内に導入した後、 マ一カーで選択するこ とにより、 相同組換えによって目的遺伝子を宿主微生物染色体上へ 組み込むことができる。
プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素遺伝子破壊株の親株としては、 コマモナス属、 シユードモナス属、 バチルス属、 ラク トバチルス属 、 ス トレプトコッカス属、 サッカロミセス属、 カンディダ属等の土 壌細菌由来であれば特に限定されない。 また、 親株は、 「テレフタ ル酸資化能」 を有する微生物由来の菌株でも、 又は 「テレフタル酸 資化能」 を有さないが 「プロ トカテク酸資化能」 を有する微生物由 来の菌株でもよい。
テレフ夕ル酸資化能を有する微生物は、 テレフタル酸からプロ ト 力テク酸への代謝機能を有する。 テレフ夕ル酸資化能を有する菌株 としては、 例えば、 コマモナス属 (Comamonas sp. ) E6、 シユー ド モナス . プチダ (Pseudomonas putida) PPY1100, コマモナス · テ ス トステロニ （ testosteroni) T- 2、 コマモナス · テス 卜ステロ 二 testosteroni) YZW-D, デルフチア . ツルハテンシス） Derf t ia tsuruhatensis) T7、 ロ ドコッカス属 (Rhodococcus SP. ) DK17 、 ロ ドコッカス ' ジヨスティ (Rhodococcus jostii) RHA1等が挙げ られる。 これらの中で、 Comamonas sp. E6株は、 テレフタル酸から プロ トカテク酸への代謝機能と、 プロ トカテク酸から 2H-ピラン- 2- オン- 4, 6 -ジカルボン酸への代謝機能 （4， 5-環開裂機能） とを保持 する菌株であり、 2, 3-環開裂機能及び 3， 4-環開裂機能を保持してい ない。 親株として Comamonas SP. E6株を用いた場合には、 バニリ ン 酸等から 2H-ピラン- 2-オン- 4， 6-ジカルボン酸への発酵生産系 （特 開 2005- 278549号公報） や 3-カルポキシ -cis, cis-ムコン酸及び/又 は 3-カルボキシムコノラク トンへの発酵生産系 （特願 2006- 218524 号明細書） とほぼ同等の、 3-カルボキシ -cis, cis-ムコン酸生産効 率が達成された。
テレフ夕ル酸資化能を有さないがプロ トカテク酸資化能を有する 微生物は、 2, 3-環開裂機能、 3， 4-環開裂機能又は 4, 5-環開裂機能を 有する。 このような微生物としては、 例えば、 シユー ドモナス属、 バチルス属、 バークホルデリア属、 ァグロパクテリゥム属等が挙げ られる。
プロ トカテク酸 2， 3-環開裂機能や 3, 4-環開裂機能を破壊した遺 伝子破壊株についても、 上述の 4, 5-環開裂機能破壊株と同様に作製 できる。
テレフ夕ル酸資化能を有する微生物は、 テレフタル酸資化能を有 さない微生物に比べて、 一般的に、 テレフタル酸の取り込み能や代 謝機能が発達しており、 変換効率が高いと推測される。
なお、 本発明の遺伝子欠損株ではないが、 プロ トカテク酸の 3, 4- 環開裂機能を保持し、 かつ開裂生成物である 3-カルボキシ- cis， ci s -ムコン酸を更に分解代謝しない菌株を使用しても、 3-カルボキ シ - cis， cis-ムコン酸を効率良く製造することができる。 そのよう な菌株としては、 例えば、 Pseudomonas putida PPY1100株が挙げら れるが、 Pseudomonas putida PPY1100株を使用した場合には、 Coma monas sp. E6株に比べて反応効率が若干低下した。
なお、 3-力ルポキシ- cis, cis-ムコン酸を更に効率良く製造する には、 プロ トカテク酸 2， 3-及び 4, 5-環開裂活性を破壊し、 かつ、 3- カルボキシ -cis， cis-ムコン酸を更に分解代謝する可能性を完全に 抑えるために 3-カルポキシ -cis, cis-ムコン酸の代謝活性を破壊し た、 遺伝子破壊株を用いることがより好ましい。
( I I I ) 3-カルボキシ- cis, cis-ムコン酸の発酵生産プラスミ ド を導入した形質転換体の作製
当該プラスミ ドは、 テレフタル酸からプロ トカテク酸を経て 3-力 ルポキシ -cis, cis-ムコン酸を生産する多段階プロセスを触媒する 酵素遺伝子 （ポジティブレギユレ一夕一、 TPA-トランスポーター.、 TPA-D0X, DCD-デヒ ドロゲナ一ゼ、 NADPH-レダクタ一ゼ、 プロ トカ テク酸 3， 4-環開裂遺伝子） を上流からこの順に含むプラスミ ドで ある （図 8 ) 。
上記のポジティブレギユレ一夕一遺伝子 （tphR) は、 特願 2005-2 98242号明細書に記載の配列番号 1 1 に記載の D N A分子 （本明細 書において配列番号 9 ) 、 TPA-トランスポーター遺伝子 （tphC)は 、 同明細書に記載の配列番号 1 3に記載の D N A分子 （本明細書に おいて配列番号 1 0 ) 、 TPA-D0X遺伝子 （tphA2、 tphA3) は、 それ ぞれ、 同明細書に記載の配列番号 2、 4に記載の D NA分子 （本明 細書において、 それぞれ配列番号 1 1、 1 2 ) 、 DCD-デヒ ドロゲナ ーゼ遺伝子 （tphB)は、 同明細書に記載の配列番号 6に記載の D N A分子 （本明細書において配列番号 1 3 ) 、 NADPH-レダク夕一ゼ遺 伝子 （tphAl) は、 同明細書に記載の配列番号 8に記載の D NA分 子 （本明細書において配列番号 1 4 ) である。 また、 本発明で使用 するプロ トカテク酸 3, 4-環開裂遺伝子 （pcaHG) は、 Pesudomonas putida KT2440株から取得した DNA断片であり、 特願 2006- 218524 号明細書の配列番号 1 に PcaH遺伝子の塩基配列が、 同明細書の配列 番号 3に PcaG遺伝子の塩基配列がそれぞれ記載されている （本明細 書において、 それぞれ配列番号 1 5、 1 6 ) 。 尚、 本明細書では、 tphR, tphC、 tphA2、 tphA3、 tphB及び tphAlを纏めて 「Tph遺伝子ク ラスター」 又は 「Tph遺伝子群」 と言うことがある。
本発明の、 テレフタル酸からの 3-力ルポキシ- cis, cis-ムコン酸 の発酵生産プラスミ ドは、 具体的には図 6〜 8に記載のようにして 作製できる。
(1) 先ず、 特願 2006- 218524号明細書に記載の PcaH遺伝子 （配列 番号 1 ) 及び PcaG遺伝子 （配列番号 2 ) を、 公知のリガ一ゼを用い て、 pBluescriptの LacZプロモー夕一の下流に存在する LacZの αフ ラグメントをコードする遺伝子内に存在するマルチクローニンダサ ィ 卜に連結することにより、 組換えプラスミ ド pBluescript II SK" /pcaHGを作製する。
次に、 pBluescript II SK— /pcaHGを制限酵素 Pvul I及び BamHIによ り切断した後末端処理によって得られる DNA断片と、 Ampプロモ —夕一を含むプラスミ ドを制限酵素 Xbalにより切断した後末端処理 によって得られる D NA断片とを、 公知のリガ一ゼにより結合させ ることにより、 組み換えプラスミ ド pKHGを作製する （図 6 ) 。
(2) 次いで、 クロラムフエ二コール耐性遺伝子を含むプラスミ ドを制限酵素 Cfrl3Iにより切断した後に末端処理によって得られる
D N A断片と、 pKHGを制限酵素 Kpnlによって切断した後に末端処理 によ て得られる DNA断片とを、 公知のリガ一ゼにより結合させ ることにより、 組み換えプラスミ ド pKHG/Cを作製する （図 7 ) 。
(3) 更に、 特願 2005- 298242号明細書の図 2に記載の、 tphR、 tp hC、 tphA2、 tphA3、 tphB及び tphAlを上流からこの順に連結した組 換えプラスミ ド pHE96/pBluescript II SK (+)を制限酵素 EcoRIで切 断することによって得られる D NA断片と、 （2) で得た pKHG/Cを E coRIによって切断した後に末端処理によって得られる D N A断片と を、 公知のリガ一ゼにより結合させることにより、 組み換えプラス ミ ド pKTphHG/Cを作製することができる。
( I ) の遺伝子破壊株を組み換えプラスミ ド pKTphHG/Cを用いて 形質転換するには、 プロ トプラス ト法、 コンビテントセル法、 エレ ク トロポレーシヨン法等の公知の方法を用いればよい。
形質転換体の選択は、 用いたプラスミ ドの選択マーカ一、 例えば 形質転換体の D N A組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にするこ とができる。 これらの形質転換体の中から目的の組換えプラスミ ド を含有する形質転換体の選択は、 例えば遺伝子の部分的な D N A断 片をプローブとして用いたコロニーハイブリダィゼ一シヨン法によ り行うのが好ましい。 このプローブの標識としては、 例えば放射性 同位元素、 ジゴキシゲニン、 酵素等を用いることができる。
なお、
( I V) 3-カルボキシ -C is, c is-ムコン酸及び/又は 3 -カルボキシム コノラク トンの発酵生産
( I I ) の本発明の形質転換体は、 テレフタル酸の存在下で、 炭 素源、 窒素源、 金属塩、 ミネラル、 ビタミン等を含む培地を用いて 適当な条件下で培養すればよい。 培地の pHは、 形質転換体が生育し 得る範囲の pHであればよく、 pH 6〜8程度に調整するのが好適であ る。 培養条件は、 15 40 、 好ましくは 28〜37でで 2〜 7 日間、 振 盪又は通気攪拌培養する。
遺伝子破壊株の培養物から、 3-カルボキシ -cis, cis-ムコン酸を 単離精製するには、 通常の有機化合物の単離、 精製法を用いればよ い。 例えば、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液 に懸濁後、 超音波破砕機等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得 る。 当該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から 、 有機化合物の通常の単離精製法を用いて目的物を得ることができ る。
上記のようにして得られた 3-力ルポキシ -cis, cis-3-ムコン酸、 又は未精製の 3 -カルボキシ- cis, cis-3-ムコン酸を含む培養液を酸 処理することより、 3-カルボキシムコノラク トンに収率良く変換す ることができる。 酸としては pH 1〜2程度の塩酸が好ましい。
本発明の製造法によって得られる 3-カルポキシ -cis, cis-ムコン 酸及び/又は 3 -カルボキシムコノ ラク トンは、 プラスチック材料、 化学製品材料等として、 2H-ビラン- 2-オン- 4, 6-ジカルボン酸とは 異なった又は更に高機能の発現ができ、 有用なプラスチック材料の 製造が期待できる。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれら 実施例に何ら限定されるものではない。
実施例 1 pmd遺伝子群のクロ一ニング
( 1 ) PCRによるプロ トカテク酸 4, 5-ジォキシゲナーゼ遺伝子の増 幅と塩基配列の決定
Sp_hin¾o.monas oaucimobiHs SYK - 6株の 1 igA遺伝子、 Ar throbacte L keyser i 12B株の pcmA遺伝子、 Comamonas testosteroni BR6020株 の pmdAlBl遺伝子、 Sphingomonas sp. LB126株の f ldVU遺伝子から推 定されるアミノ酸配列のァライメントから相同性の高い領域を見出 し、 Comamonas sp. E6株のプロ トカテク酸 4, 5-ジォキシゲナーゼ 遺伝子の E6株全 DNAを铸型として以下の aF/ )8 Rプライマ一を用いて PCRを行った。
α-サブユニッ ト内の aF (26 mer: ATGWSSCTGATGAARSCSGARAACCG ； 配列番号 5 ) ；
j8-サブユニッ ト内の iSF (27 mer: GTSWTCCTGGTSTAYAACGAYCAYGC Y； 配列番号 6 ) ； 及び
]8 -サブユニッ ト内の R (25 mer: CCCTGMARCTGRTGGCTCATGCCGC ； 配列番号 7 )。
その結果、 予想される 900 bpのサイズに増幅が見られた。 次にこ の PCR産物を铸型に用いて nested pr imerである Fを用いて）8 F- )8 R 間で PCRを行った。 その結果予想されるサイズである 450 bpの断片 の増幅を得た。 得られた PCR産物を pT7Blueベクタ一にサブクローニ ングし、 449 bp断片の塩基配列を決定した。 相同性を示す配列を DD BJデータ一ベースで検索したところ、 ァミノ酸レベルで Comamonas testosteroni BR6020株のプロ トカテク酸 4， 5-ジォキシゲナーゼ j8 -サブュニッ トをコードする遺伝子 （DDBJ受入番号 ： AF305325) と 99 %の同一性を示した。 また、 Sphingomonas paucimobil is SYK- 6株の ligB (DDBJ受入番号 ： AB035122) と 68 %, Arthrobacter keys eri 12B株の pcmA (DDBJ受入番号 ： AF331043) 、 Sphingomonas s^. LB126株の ildU (DDBJ受入番号 ： AJ277295) のいずれとも 66 %、 の 同一性を示した。
( 2 ) プロ トカテク酸 4， 5-ジデォキシゲナ一ゼ遺伝子を含むコス ミ ドの単離 E6株 Sal I部分消化断片を含むコスミ ドライブラリーから、 PCR産 物をプローブとしたコロニーハイブリダィゼーシヨンによって陽性 クローンを得た。 得られた陽性クローンから抽出したコスミ ドを Sa IIで消化し、 同プローブでサザンハイプリダイゼーショ ンを行った 結果、 10 kMこ交雑が認められ、 本コスミ ドを pPVIOと命名した。
( 3 ) pPVIO由来 1.9- kb Sail- Xhol断片と 3.2- kb Xhol断片の塩基配 列
pPVIOの 10- kb Sail断片を pBluescript II KS (+)の 1 acプロモータ —下流に正逆両方向に挿入したクローン pKS10F(R)を作製した。 pKS 10Fを Sailと Xholで消化して得られる、 1.9 kb, 3.2 kb, 4: 9 kbの 3 つの断片を平滑化し pBluescript II KS (+)の Smalサイ トに導入した 。 lacプロモーターの下流にこれら断片を正逆両方向に導入後、 そ れぞれ pKlSXF (R)、 pK3XF(R)、 pK4XSF (R)と命名した （図 1 ) 。 pKIS XF(R)の 1.9-kb Sail- Xhol断片と pK3Xに含まれる 3.2- kb Xhol断片の 全塩基配列を決定した。 また、 これら断片が Xholを介して隣接して いることを PKSTSの 2.2_kb Stul断片のシークェンスから確認した （ 図 1 ) 。 図 1 において、 Placは lacプロモー夕一を、 矢印は転写方 向を示す。
( 4 ) 10- kb Sail断片上流域の単離
PPV10の 10- kb Sail断片の上流域を単離するために、 E6株の全 DNA の Sacl消化物を charomid 9- 36にクローン化したライブラリーを作 製した。 1.9 - kb Sall-Xhol断片を Sailと EcoRI 消化して得られる 1， 150 bp断片を用いてコロニーハイブリダィゼ一ショ ンによつて pmdA 1B1を含む 10-kb Sacl断片をもつ pCS18を単離した（図 2 )。 pSC18の p mdAlBlを含む 2.卜 kb SacII断片が 6.卜 kb Sacl- Sal I断片と隣接して いることを塩基配列の決定により確認し、 6.卜 kb Sacl-Sall断片を 平滑化し、 pBluescript II KS (+)の lacプロモーター下流 EcoRVサイ 卜に正逆両方向に挿入したクローン PSA2-6F OOを作製し、 全塩基配 列の決定を行なった （図 3 ) 。 配列番号 8には、 図 3に記載の pmdJ
(塩基番号 1〜1029) 、 pmdK (塩基番号 1162〜 1845) 、 pmdl (塩基 番号 1942〜2934) 、 pmdAl (配列番号 2 ) 、 pmdBl (配列番号 4 ) 及 び pmdC (塩基番号 4427〜5386) の各遺伝子を含む遺伝子配列を示す 実施例 2 pmdBl遺伝子破壊株の作製
( 1 ) pmdBl遺伝子破壊プラスミ ドの作製
pmdAlBlC遺伝子を含む 3.6-kb Sal I- EcoRV断片を pKSlOFから切り 出し、 pBluescript II KS (+)を Sal I- EcoRV消化したものに挿入し、 PSDB36を得た。 次に pmdBl遺伝子内にある Stulで消化し、 その間 （ 配列番号 1の下線で示した配列） に PIK03由来のカナマイシン耐性 遺伝子を含む 1.2- kb EcoRV断片を挿入した。 pBluescript II KS (+) の lacプロモータ一転写方向と同じ向きに断片が挿入されたことを S mal消化によって確認し、 PKS78Fを得た。 pKS78Fから 4.9- kb Sall-E coRV断片を切り出し、 pK19mobsacBの Sail- Smalサイ 卜に挿入して pm dBl破壊株作製用プラスミ ド pDBKMを構築した（図 4)。
( 2 ) pmdBl遺伝子破壊株の作製
3 mlの LB培地で前培養した E6株を 10 mlの LB培地に 1 %植菌し、 本 培養した。 0D 600 = 0.5に生育後、 5, 000 rpm、 4で、 15分で遠心分 離し、 集菌した。 1 mlの 0.3 Mスクロースで 2回洗浄し、 1 mlの 0.5 Mスクロースに懸濁した。 100 の菌液に 1 / lに調製した 遺伝子破壊プラスミ ド pDBKMを 1 1加えて、 抵抗 800 Ω、 電圧 12 V 、 静電容量 25 の条件下で Gene pulser (B io- Rad)を用いてパル スをかけた。 パルス後即座に 1 mlの LB培地を加えて 30でで 6時間培 養した。 300 lを 100 g/ml カナマイシンを含む LB培地に塗布し た。 得られたカナマイシン耐性株を 1 mlの LB培地で集菌し、 10 %スゥ ロースを含む 10 ml LB培地に植菌、 12時間培養した。 新しい LB培地 に 200 lを植菌し、 これを 3回繰り返した。 最後に培養液を 100 a g/ml カナマイシンを含む LB培地に塗布し、 得られたコロニーを遺 伝子破壊株の候補とした。
( 3 ) pmdBl遺伝子破壊の確認
遺伝子破壊株候補を 100 g/ml カナマイシンを含む LB培地 3 ml で前培養し、 同培地 10 mlに 1 ¾植菌し本培養した。 その後、 遺伝子 破壊株候補の全 DNAを回収し、 EcoRVで消化後、 pmdAlBlを含む 3.4 - k b Hindlll-Kpnl断片と pIK03由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む 1 .2-kb EcoRV断片をブローブに用いるサザンハイブリダィゼーショ ンを行った（図 5 )。 レーン及び 3は、 EcoRV消化した野生型 E6株の全 DNA、 レーン 2及び 4は、 EcoRV消化した遺伝子破壊株の全 DNAを示す 。 使用したプローブは、 レーン 1及び 2については、 pmdBlを含む 3， 4 - kb Hindlll- Kpnl断片、 レーン 3及び 4については、 カナマイシン
(Km) 耐性遺伝子を含む 1.2- kb EcoRV断片である。
実施例 3 3 -カルボキシムコノラク トンの製造
( 1 ) 3-カルポキシ - cis， cis-ムコン酸の組換えプラスミ ド pKTphHG /Cの作製
1-1) 特願 2006-218524号明細書に記載の組換えプラスミ ド pBlues cript II SK_/pcaHGを制限酵素 pvull及び BamHIにより切断した後に 末端平滑化によって得られる DNA断片と、 特開 2005-278549号公報に 記載の PKT230MCを制限酵素 Xbalにより切断した後に末端平滑化によ つて得られる DNA断片とを、 T4DNAリガーゼ （ロシュ製） により結合 させることにより、 組換えプラスミ ド pKHGを作製した （図 6) 。
1-2) 次いで、 クロラムフエ二コール耐性遺伝子を含むプラスミ ド PHSG398 (夕カラ製） を制限酵素 Cfrl3Iにより切断した後に末端 平滑化によつて得られる MA断片と、 pKHGを制限酵素 Kpnlにより切 断した後に末端平滑化によって得られる DNA断片とを、 T4DNAリガ一 ゼ （ロシュ製） により結合させることにより、 組換えプラスミ ド ρΚ HG/Cを作製した （図 7) 。
1- 3) 更に、 特願 2006-218524号明細書に記載の組換えプラスミ ド pHE96/pBluescript II SK (+)を制限酵素 EcoRIで切断して得られる MA断片と、 pK HG/Cを制限酵素 EcoRIで切断して得られる MA断片と を、 T4DNAリガ一ゼ （ロシュ製） により結合させることにより、 組 換えプラスミ ド pKTphHG/Cを作製した （図 8) 。
( 2 ) 形質転換
2- 1) 組換えプラスミ ド pKTphHG/Cを大腸菌 HB101株に形質転換し 、 25 mg/Lのカナマイシンを含む LB培地 （100 ml) で、 37でで 18時 間振とう培養し.、 増殖した培養細胞から組み換えプラスミ ド pKTphH G/Cを抽出した。
2-2) 実施例 2で作製した遺伝子破壊株 (Comamonas sp. EDB株） を、 LB液体培地 500 mlで、 28でで 23時間培養し氷中で 30分冷却した 。 4 ：、 10, 000 rpin、 10分で遠心集菌し、 500 mlの 0 蒸留水で温 和に洗浄後再び遠心集菌した。 続いて 250 mlの 0 蒸留水で温和に 洗浄後、 遠心集菌した。 さらに 125 mlの 0で蒸留水で温和に洗浄後 、 遠心集菌した。 集菌した微生物細胞を、 10 %グリセロールを含む 蒸留水に懸濁し、 0 にて保持した。
2-3) ( 1 ) のプラスミ ド pKTphHG/Cの DNA約 0.05 を含む蒸留 水 4 1を 0.2 cmのキュべッ トに入れ、 2-2) の 10 %グリセ口一ルを 含む蒸留水に懸濁した細胞液 40 lを加え、 （25 β ¥、 2500 V、 12 msec) の条件でエレク トロボレ一シヨンにかけた。
2-4) 上記処理した細胞全量を 10 mlの LB液体培地に接種し、 28で で 6時間培養した。 培養後遠心によって菌体を集め 25 mg/Lのカナマ イシン、 50 mg/Lのアンピシリ ン、 30 mg/Lのク口ラムフエ二コール を含む LB平板に展開し 28でで 48時間培養し、 プラスミ ド pKTphHG/C を保持するクロラムフエ二コール耐性を示す形質転換株を得た。 本 菌を KTphHG/C/Comamonas s£. ECB株と名付けた。
2-5) pKTphHG/C/Comamonas sp. ECB株を、 200 mlの LB液体培地 （ 30 mg/Lのクロラムフエ二コールを含む） に接種し、 28でで 16時間 培養し、 前培養菌体懸濁液とした。 5 Lの LB液体培地及び消泡剤 （A n t i f o rm A) 3 mlを 10 L容量のジャーフアーメン夕一 （発酵槽） を 用いて調製し、 そこに培養した pKTphHG/C/Comamoiias sp. ECB株の 前培養菌体懸濁液 200 m lとテレフタル酸 8 gを溶解した水溶液を混 合し、 28でで 500 rpm/分の通気攪拌下、 0D 518 = 3程度まで培養し た （8時間〜 12時間） 。
2-6) 10 L容量のジャーフアーメン夕一 （発酵槽） を用いた培養 で、 0D 518 = 3に達した時点で、 発酵槽から 500 mlの培養液を三角 フラスコに抜き取り、 氷上で保存した。
2-7) 0D 518 = 3に達した発酵槽の培養液に、 テレフタル酸 42 gを 0. 1 N NaOH水溶液 500 m lに溶解し （pH 8. 5に調整） 、 ペリス夕ボン プを用いて 10〜 12時間かけて添加した。 反応の進行に伴う 3-カルボ キシ- c i s; c i s-ムコン酸の生成により、 培養液の pHの低下を防ぐた め、 pHセンサーに連結したベリス夕ポンプで 0. 1 Nの NaOH溶液を添 加して培養液の PHを維持した。 反応の進行は HPLCによって確認した 。 36時間後、 添加したテレフタル酸は殆ど消失した。 2-5) で調製 した氷冷菌体懸濁 500 m lを発酵槽の培養液に加えて 12時間培養を続 けた。
2-8) 反応終了後、 発酵槽の培地をプラスチック容器 （バケツ） に移した。 培養液から遠心分離 （ 6000 rpm, 20で） により菌体成分 を沈殿除去し、 得られた上清に塩酸を加えることにより pH 1. 0以下 に低下させ低温で保存することにより 3-カルポキシ -c is, c is-ムコ ン酸を 3-カルボキシムコノラク トンに変換した。 3 -カルボキシムコ ノラク トンへの完全変換を GC-MSにより確認し、 有機溶媒 （酢酸ェ チル） により 3-カルポキシムコノ ラク トンの抽出を行った。 培養液 1 Lから抽出乾固した 3-カルポキシムコノ ラク トンは約 9.8 gに達し 、 添加した基質 （テレフタル酸） 比 87 %程度の収率で回収された。 得られた 3-カルボキシムコノラク トンを活性炭で処理し、 その構造 を NMR及び MSスぺク トルによって確認した。
Ή-NMR (400MHz, DMS0d6) δ 2.67, 3.10, 5.55, 6.81, 12.5-13. 0
l 3C-NMR (100MHz, DMS0d6) δ 36.5, 78.5, 125.9, 157.9, 162.1 ， 170.4， 170.8
MS m/z :330 (MM ( 3-カルポキシムコノ ラク トンの TMS (トリ メチ ルシリル） 体として）

Claims

1. 微生物細胞の染色体 D Ν Α上に存在する下記 ：
( a ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列 ； 又は
( b ) 配列番号 1 もしくは 3.に記載のアミノ酸配列において、 1 又は 2以上のアミノ酸が欠失、 置換、 付加及び 又は挿入されてい るアミノ酸配列であって請、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂活性を有す るアミノ酸配列、
をコードする遺伝子が破壊されたの、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵 素の遺伝子破壊株。
範
2. 微生物細胞の染色体 D N A上に存在する下記 ：
囲
( a ) 配列番号 2 もしくは 4に記載の塩基配列 ； 又は
( b) ( a ) の塩基配列と相補的な塩基配列からなる D NAとス トリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、 かつプロ トカテク酸 4 , 5 -環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列であって、 かつ プロ トカテク酸 4， 5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配 列、
を含む遺伝子が破壊された、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂酵素の遺 伝子破壊株。
3. 微生物細胞の染色体 D N A上に存在する下記 ：
( a ) 配列番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列 ； 又は
( b) 配列.番号 1 もしくは 3に記載のアミノ酸配列において、 1 又は 2以上の塩基が欠失、 置換、 付加及び Z又は挿入されているァ ミノ酸配列であって、 プロ トカテク酸 4, 5-環開裂活性を有するァ ミノ酸配列、
をコードする遺伝子と相同組換えを起こすことができる DNA配列 を有し、 かつ、 プロ トカテク酸 4， 5-環開裂活性を喪失している相 同組換え用 DNAと、 当該遺伝子との相同組換えにより、 プロ トカ テク酸 4, 5-環開裂酵素遺伝子が破壊された、 請求項 1又は 2記載 の遺伝子破壊株。
4. プロ トカテク酸 4， 5-環開裂酵素遺伝子破壊株の親株が、 コ マモナス属 （Comamonas sp. ) 細菌である、 請求項 1 〜 3のいずれ か 1項記載の遺伝子破壊株。
5 . 前記コマモナス属細菌が、 Comamonas sp. E6株である、 請求 項 4記載の遺伝子破壊株。
6. テレフ夕レート · ジォキシゲナ一ゼ遺伝子 （TPA-D0X遺伝子 ) 、 NADPH-レダク夕ーゼ遺伝子、 1， 2-ジヒ ドロキシ- 3， 5-シクロへ キサジェン -1, 4-ジカルポキシレート · デヒ ドロゲナーゼ遺伝子 （D CD dehydrogenase遺伝子） 、 ポジティブレギユレ一夕一遺伝子、 テ レフ夕レート · トランスポーター遺伝子 （TPA transporter遺伝子 ) 、 及びプロ トカテク酸 3, 4-ジォキシゲナーゼ遺伝子 （pcaHG遺伝 子） を含む、 組換えプラスミ ド。
7 . 請求項 1 〜 5のいずれか 1項記載の遺伝子破壊株に、 請求項 6記載の組換えプラスミ ドを導入してなる形質転換体。
8 . テレフタル酸の存在下に、 請求項 7載の形質転換体を培養す ることを特徴とする、 3-カルポキシ -cis, cis-ムコン酸及び/又は 3- カルボキシムコノラグトンの製造方法。
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