WO2008134933A1 - Trousse de fluorescence à deux couleurs utiles pour détecter la réaction en chaîne de la polymérase de coamplification - Google Patents

Trousse de fluorescence à deux couleurs utiles pour détecter la réaction en chaîne de la polymérase de coamplification Download PDF

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WO2008134933A1
WO2008134933A1 PCT/CN2008/000871 CN2008000871W WO2008134933A1 WO 2008134933 A1 WO2008134933 A1 WO 2008134933A1 CN 2008000871 W CN2008000871 W CN 2008000871W WO 2008134933 A1 WO2008134933 A1 WO 2008134933A1
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amplification
gapdh
dna
dscr
primer
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PCT/CN2008/000871
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Qingjie Xia
Lin Yang
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Shandong Yada Pharmacy Co. Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the invention relates to a preparation and application of a DNA in vitro amplification kit for quantitatively detecting the relative copy number of a specific DNA sequence by two-color fluorescence, belonging to the field of molecular biological detection and diagnosis, in particular to a two-color fluorescence quantification of chromosome 21 ploidy detection.
  • the polymerase chain reaction in vitro co-amplification PCR kit can be applied to the rapid genetic detection of Down's syndrome.
  • Doyn Syndrome also known as congenital wrongity, is one of the most common chromosomal abnormalities in live births, with an incidence of about 1/600-1/800.
  • the signs of DS are very diverse and usually involve abnormalities in a variety of tissues and organs, but their most prominent and most serious clinical manifestations are mental retardation.
  • the main clinical features of the disease are: severe mental retardation, and mental retardation phenotype gradually with age, movement development and sexual development retardation, basically no self-care ability.
  • With unique facial and physical deformities, congenital heart disease, digestive tract malformations, etc. the incidence of leukemia is also 10-30 times higher than the average incidence of the population. The average life expectancy of patients is around 30 years old.
  • chromosome 21 can be selected.
  • Single-copy genes such as DSCR1 and single-copy genes on autosomes such as the GAPDH gene are detected by fluorescence quantitative PCR to determine the ploidy of chromosome 21, thereby The detection of Down's syndrome has important practical significance.
  • Real-time PCR technology is a new technology for quantifying the quantification of specific DNA (gene) copy numbers in recent years.
  • the basic principle is to add a TaqMan probe to the PCR reaction system [the 5' end of the specific oligonucleotide probe is labeled with a fluorescent reporter group (R), and in this The 3, end of the oligonucleotide probe is labeled with a fluorescent quencher group (Q).
  • R fluorescent reporter group
  • Q fluorescent quencher group
  • the probe can specifically hybridize to the target gene of PCR, and then be degraded by the exo-activity of Taq DNA polymerase 5 to separate R and Q, and the free R emits a fluorescent signal to be detected.
  • the free R corresponds to an increase in the PCR product. Therefore, the amount of PCR reaction product can be measured in real time based on the intensity of the fluorescent signal generated by R after each cycle. If a DNA standard with known copy number is used as a standard curve, the target DNA of the detected sample can be accurately quantified.
  • the object of the present invention is to establish a two-color fluorescence quantitative co-amplification polymerase chain reaction technique which is simple and convenient to operate and can accurately and accurately detect Down's syndrome and assemble corresponding kits.
  • the two-color fluorescence quantitative co-amplification polymerization drunken chain reaction kit of the invention firstly synthesizes the specific primer and the two-color Taqman fluorescent probe according to the sequence of the chromosome 21 specific sequence DSCR segment and the GAPDH gene sequence on the chromosome 16, respectively, the sequences are as follows: : DSCR upstream primer 5 ' -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT- 3 '; DSCR downstream primer: 5, -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT - 3 '; DSCR TaqMan probe: 5, - [FAM] CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC [TAMRA] -3 '; GAPDH upstream primer: 5, - etc cct ctt tct tg cag caa t_3, ; GAPDH downstream primer: 5, -cag etc tea tac cat gag tec t-3, ; GAPDHTaqMan Probe: 5,-[HE
  • the concentration content of each component is as follows: DSCR and GAPDH specific Primer, two-color fluorescent Taqman probe 0.1-0.5umol/L, Taq DNA polymerase l-3U/50ul, dNTPs substrate 0.1-0.5 mmol, template DNA, magnesium ion 1.5-3.5 ol/L, buffer 0.5 -1.5XPCR; 1X PCR buffer includes 50 mraol/L KC1, 10 mmol/L Tris. HCl PH8.
  • Nx No * Y cto " Ctx; wherein: Nx is the starting copy number of the target gene samples x, Y is the efficiency of the amplification, the Ct value corresponding to 1 reduction
  • the two-color fluorescence quantitative co-amplification polymerase chain reaction kit of the invention has the following advantages compared with other methods for detecting the ploidy of chromosome 21: 1. The operation is simple and rapid, and accurate detection results can be obtained within 2-3 hours; 2. Closed tube detection will not cause contamination of amplification products; 3. High degree of automation, low labor cost, high-throughput detection, more than 90 specimens per test; 4. Required sample materials for testing, Each reaction requires only 50-100 ng of DNA to be tested, which is convenient for taking materials.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi: 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5 -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT - 3 '
  • Downstream primer DSCRR 5 ' -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3
  • TaqMan Probe DSCRT 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3,
  • the amplified product is 96 bp, and the position in the gene is as follows:
  • the primers for designing the internal control GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase] according to [gi: 32891804] in genebank are as follows:
  • the downstream primer GAPDR 5, -cagctctcataccatgagtcct-3 '
  • TaqMan probe GAPDTM 5'-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRAJ-3', amplification product 112bp, the position in the gene is as follows:
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi : 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5, - CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT - 3
  • Downstream primer DSCRR 5, - CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
  • TaqMan Probe DSCRTM 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3,
  • Downstream primer GAPDR 5 -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
  • the positions of the primer probe and the amplification product in the gene were the same as in Example 1.
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi: 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5 -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
  • Downstream primer DSCRR 5 -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3
  • TaqMan Probe DSCRTM 5 ' - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] - 3 '
  • Downstream primer GAPDR 5 -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
  • TaqMan probe GAPDTM 5,-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3,,
  • the positions of the primer probe and the amplification product in the gene were the same as in Example 1.
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi : 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5, -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3,
  • Downstream primer DSCRR 5 -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
  • TaqMan Probe DSCRTM 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3,
  • Upstream primer GAPDF 5 ' -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ,
  • Downstream primer GAPDR 5 -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi: 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5 -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
  • Downstream primer DSCRR 5 -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
  • TaqMan Probe DSCRTM 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 '
  • the primers for designing the internal control GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase] according to [gi: 32891804] in genebank are as follows:
  • Downstream primer GAPDR 5 -cagctctcataccatgagtcct-3' ,
  • TaqMan probe GAPDTM 5,-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3,,
  • the positions of the primer probe and the amplification product in the gene were the same as in Example 1.
  • the mixture is mixed with a 50 ul reaction system containing 25 pmol of each primer, 25 pmol of each probe, 50-100 ng of DNA of the patient or normal, 1 X PCR buffer, Taq DNA polymerase 2 u, Mg++ final concentration 2. 5 mmol /L, at 96. Denature at C for 2 min, then press 96 on the FTC2000 real-time PCR instrument. C20sec, 53'C 30sec, A total of 45 cycles at 60 ° C for 40 sec and photographing at 60 ° C extension. Three experiments were repeated for each specimen.
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes.
  • the primers for designing DSCR according to the sequence of DSCR1 [gi : 7768679] in genebank are as follows:
  • Upstream primer DSCRF 5 -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
  • Downstream primer DSCRR 5 ' -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3
  • TaqMan Probe DSCRTM 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3,
  • GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, glycerol triphosphate dehydrogenase
  • Downstream primer GAPDR 5 -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
  • TaqMan probe GAPDTM 5,-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA] -3',
  • the positions of the primer probe and the amplification product in the gene were the same as in Example 1.
  • the DNA template was diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold to make a standard curve of the DSCR1 and GAPDH genes to compare and obtain the amplification efficiency of the two genes. 4. Results

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Description

双色荧光定量共扩增聚合酶链反应检测试剂盒 技术领域
本发明涉及一种双色荧光定量检测特定 DNA序列相对拷贝数的 DNA体外扩增 试剂盒的制备和应用， 属于分子生物学检测诊断领域， 具体是涉及一种 21号染色体 倍性检测的双色荧光定量聚合酶链反应体外共扩增 PCR试剂盒，可以应用于唐氏综合 症的快速基因检测诊断。 技术背景
唐氏综合征（Doyn Syndrome, DS) , 又称为先天愚型， 是活产胎儿中最常见的染 色体异常综合征之一， 其发病率约为 1/600— 1/800。 DS的体征非常多样， 通常涉及 多种组织器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精神发育迟滞。该病的主要 临床特征为： 严重智力低下， 且智力低下的表型随年龄增长逐渐明显， 动作发育和 性发育迟緩， 基本无生活自理能力。 具有独特的面部和身体畸形、 先天性心脏病、 消化道畸形等， 白血病的发病率也比人群平均发病率高 10— 30倍。 患者的平均寿命 在 30岁左右。
DS 绝大多数都是偶发的， 每个孕妇都有生患儿的可能， 发病无明显的种族差异 和家族聚积现象。世界各地大量群体调查的结果表明种族之间发病率几乎相同，唐氏 综合征的每个体细胞中 21号染色体为 3条， 而其它常染色体为 2条， 淋巴母细胞体 外培养和染色体制备观察是其实验室检测的常规方法， 该方法虽然准确度高，但技术 复杂耗时长， 不能实现自动化和高通量检测。 由于唐氏综合征患者 21号染色体上的 单拷贝基因剂量是其它常染色体上的单拷贝基因剂量的 1.5倍， 而 DSCR是唐氏综合 征发病的关键单拷贝区段，因此可以选择 21号染色体上的单拷贝基因如 DSCR1和常 染色体上的单拷贝基因如 GAPDH基因， 通过荧光定量 PCR技术来检测出它们的相 对拷贝数的比值来判断 21 号染色体的倍性， 从而对从微量 DNA标本中检测出唐氏 综合征具有重要现实意义。
实时荧光定量 PCR技术是近年来发 来的能够对特异 DNA (基因）拷贝数进行 精确定量的最先进的基因剂量定量新技术。 其基本原理是在 PCR反应体系中同时加 入 TaqMan探针 [特异寡核苷酸探针的 5'端标记了一条荧光报告基团 （ R ), 而在这条 寡核苷酸探针的 3，端标记了一条荧光淬灭基团 （Q )。 当这条探针处于完整状态或者 没有反应时， R所产生的一部分荧光将被 Q吸收或淬灭。 在 PCR反应过程中， 该探' 针可与 PCR目标基因特异性杂交， 然后被 Taq DNA聚合酶的 5， 外切活性降解， 使 R和 Q分离， 游离的 R发出荧光信号被检测。 随着 PCR反应的进行， 游离的 R与 PCR产物相对应的增加。 因此， 根据每个循环后 R产生的荧光信号的强度， 即可实 时测量出 PCR反应产物的数量。如果同时使用拷贝数已知的 DNA标准品做标准曲线， 即可对所检测的标本的靶 DNA做精确定量。 发明内容
本发明目的在于建立一种操作简便，能够快速准确检测唐氏综合征的双色荧光定 量共扩增聚合酶链反应技术和组装相应的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案得以达成：
本发明双色荧光定量共扩增聚合醉链反应试剂盒首先根据 21号染色体特异序列 DSCR 区段序列和 16 号染色体上的 GAPDH基因序列分别合成其特异引物和双色 Taqman荧光探针， 其序列分别如下： DSCR上游引物 5 ' -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT- 3 ' ； DSCR 下游引物： 5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT - 3 ' ； DSCR TaqMan 探针： 5， - [FAM] CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC [TAMRA] -3 ' ； GAPDH上游引物： 5， - etc cct ctt tct ttg cag caa t_3， ； GAPDH下游引物： 5， -cag etc tea tac cat gag tec t-3， ； GAPDHTaqMan探针: 5，-[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3,。然后在 同一含有耐热 DNA聚合酶、 dNTPs、 模板 DNA、 镁离子、 PCR緩冲液、 超纯水等组 成的扩增緩冲反应体系中， 各个成分的浓度含量分别如下： DSCR和 GAPDH特异的 引物、 双色荧光 Taqman探针 0.1-0.5umol/L、 Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、 dNTPs底 物 0.1-0.5 mmol、 模板 DNA若干、 镁离子 1.5-3.5 隱 ol/L、 緩冲液 0.5-1.5XPCR; 其 中 1XPCR緩冲液包括 50 mraol/L KC1、 10 mmol/L Tris. HCl PH8. 3、 0.01%明胶; 反 应体系在多色荧光定量热循环仪上进行 94°C预变性 2 min ； 94°C变性 10 sec, 52 - 58°C复性 30 sec, 60°C延伸 40 sec, 共 45个循环， 并在 60°C延伸时检测荧光强度， 使两对引物分别同时引导新链合成， 实现两对引物的共扩增。 同时通过检测扩增过程 中由于降解 Taqman探针获得的荧光信号的强弱， 获得各自的扩增曲线图， 进而得出 各个基因的 Ct值。 根据样品的 Ct值和标准曲线， 利用以下公式计算分别计算 DSCR 区段序列和 16号染色体上的 GAPDH基因序列含量： Nx = No * Y cto "Ctx; 其中 ： Nx为样本 x的靶基因的起始拷贝数, Y为扩增效率，相当于 Ct值减少 1个循环对应的 模板 DNA的增加的倍数， 由公式 Υ=10'/Δ" ( A t =靶 DNA每稀释 10倍， 平均增加的 Ct值数）计算获得； Ctx为扩增管 X的耙基因的 Ct值； Cto为标准曲线上靶基因拷 贝数为 No时的 Ct值； No为起始拷贝数。根据以下公式计算二者的比值 R : R= Nd/ Ng, 其中 Nd为 DSCR拷贝数， Ng为 GAPDH拷贝数； 最后根据二者的比值 R判断 21号染色 体的倍性。
本发明双色荧光定量共扩增聚合酶链反应试剂盒与其它检测 21号染色体倍性的方法 相比，具有以下优点： 1、 操作简便快速，可以在 2-3小时内获得准确的检测结果； 2、 闭管检测， 不会造成扩增产物污染； 3、 自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检 测，每次检测可以检测 90个以上标本； 4、 需要的检测样本材料微量，每个反应仅需要 待检 DNA 50-100 ng, 便于取材. 具体实施方式：
实施例 1
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi： 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下：
上游引物 DSCRF： 5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT - 3 '
下游引物 DSCRR： 5 ' -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，
TaqMan探针 DSCRT ： 5， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3，
扩增产物 96bp,在基因中的位置见下：
cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac 34812197
tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg 34812147
gtggc agaaa tcccagttca tgttgct cag aagagaatjca aggccgtgtc | 34812097
|cccttgttc|t aatgctgcac accagtljact gttcatggca cccgggaatg) 34812047
根据 genebank中 [gi : 32891804]设计内对照 GAPDH [ glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下：
上游引物 GAPDF : 5， -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ，
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ， TaqMan探针 GAPDTM:5'-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRAJ-3', 扩增产物 112bp,在基因中的位置如下：
gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648
gaaggcaggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698
tcccctgact tgcgccccgc tccctctttc tttgcagcaa tgcctc|ctgc| 6516748
|accaccaact gcttagcacc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798 tatcgtgga|a ggactcatgg tatgagagct glggqaatqqg actgaggctc 6516848
2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 10 pmol , 各探针 10 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩冲液， Taq DNA 聚合酶 2 u, Mg++终浓度 2 mmol/L, 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上 96 °C下变性 2 min, 随后按 94 °C变性 10 sec, 52°C复 性 30 sec，60°C延伸 40 sec, 共 45个循环， 并在 60°C延伸时照相。 每一个标本重复 三次实验。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。
4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH与 DSCR1的差值为 1. 85土 0. 27,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 06 ± 0. 176,用 2 Δ Δ 方法计算换成拷贝数的差异约为: 1/1. 58 ~ 1. 43,两者间的差异有统计学差异意义。 实施例 2
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi : 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下:
上游引物 DSCRF： 5， - CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT - 3， 下游引物 DSCRR： 5， - CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
TaqMan探针 DSCRTM： 5， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3，
根据 genebank中 [gi : 32891804]设计内对照 GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下：
上游引物 GAPDF : 5， -ctccctctttctttgcagcaat-3' ,
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
TaqMan探针 GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRAJ-3',
引物探针和扩增产物在基因中的位置和实施例 1相同。
2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 15 pmol , 各探针 15 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩冲液， Taq DNA 聚合酶 2 u, Mg++终浓度 3 mmol/L, 在 96°C 下变性 2min， 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上按 96°C 20sec， 56°C 30sec , 60 'C40sec共 45个循环， 并在 60°C延伸时照相。 每一个标本重复三次实验。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。
4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 88土 0. 29,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 16 ± 0. 17，用 方法计算换成拷贝数的差异约为： 1/1. 61 ~ 1. 53，两者间的差异有统计学差异意义。 实施例 3
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi： 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下：
上游引物 DSCRF : 5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
下游引物 DSCRR： 5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，
TaqMan探针 DSCRTM : 5 ' - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] - 3 '
根据 genebank中 [gi: 32891804]设计内对照 GAPDH C glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢醉]的引物如下： 上游引物 GAPDF : 5， -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ,
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
TaqMan探针 GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，，
2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 15 pmol , 各探针 15 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩冲液， Taq DNA 聚合酶 2 u, Mg++终浓度 3 mmol/L, 在 96°C 下变性 2min， 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上按 96。C 20sec， 53°C 30sec, 60 °C40sec共 45个循环， 并在 60°C延伸时照相。 每一个标本重复三次实验。
引物探针和扩增产物在基因中的位置和实施例 1相同。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。
4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 78土 0. 27,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 05 ± 0. 25,用 2— Δ Δ0Τ方法计算换成拷贝数的差异约为： 1/1. 51 ~ 1. 43,两者间的差异有统计学差异意义。 实施例 4
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi : 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下：
上游引物 DSCRF： 5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，
下游引物 DSCRR： 5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
TaqMan探针 DSCRTM： 5， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3，
根据 genebank中 [gi : 32891804]设计内对照 GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下：
上游引物 GAPDF : 5 ' -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ,
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ，
TaqMan探针 GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRAJ-3',
引物探针和扩增产物在基因中的位置和实施例 1相同。 2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 15 pmol , 各探针 15 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng， 1. 5 X PCR緩冲液， Taq DNA 聚合酶 2 u, Mg++终浓度 3 mmol/L, 在 96 'C下变性 2min, 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上按 96。C 20sec， 53°C 30sec, 60'C40sec共 45个循环， 并在 60。C延伸时照相。 每一个标本重复三次实验。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。
4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 69土 0. 15,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 02 ± 0. 12，用 2 - Δ ώ(:τ方法计算换成拷贝数的差异约为： 1/1. 53 : ~ 1. 46,两者间的差异有统计学差异意义。 实施例 5
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi： 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下：
上游引物 DSCRF: 5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
下游引物 DSCRR： 5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 '
TaqMan探针 DSCRTM： 5， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 '
根据 genebank中 [gi : 32891804]设计内对照 GAPDH [ glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下：
上游引物 GAPDF : 5， -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ,
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3' ,
TaqMan探针 GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，，
引物探针和扩增产物在基因中的位置和实施例 1相同。
2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 25 pmol , 各探针 25 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng， 1 X PCR緩沖液， Taq DNA 聚合酶 2 u， Mg++终浓度 2. 5 mmol/L, 在 96 。C下变性 2min , 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上按 96。C20sec， 53'C 30sec, 60°C40sec共 45个循环， 并在 60°C延伸时照相。 每一个标本重复三次实验。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。
4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 85土 0. 22,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1. 24 ± 0. 32,用 2 ^方法计算换成拷贝数的差异约为： 1/1. 55 : ~ 1. 48,两者间的差异有统计学差异意义。 实施例 6
1. 引物和探针的设计
根据 genebank中 DSCR1 [gi : 7768679]的序列设计 DSCR的引物如下：
上游引物 DSCRF： 5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 '
下游引物 DSCRR： 5 ' -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，
TaqMan探针 DSCRTM： 5， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3，
根据 genebank中 [gi : 32891804]设计内对照 GAPDH [ glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油趁脱氢酶]的引物如下：
上游引物 GAPDF : 5， -ctccctctttctttgcagcaat-3 ' ,
下游引物 GAPDR : 5， -cagctctcataccatgagtcct-3 ' ,
TaqMan探针 GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA] -3',
引物探针和扩增产物在基因中的位置和实施例 1相同。
2. 双色荧光定量 PCR反应
混合 50 ul反应体系， 内含两引物各 20 pmol , 各探针 20 pmol, 患者或正常人 DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩沖液， Taq DNA 聚合酶 1. 5 u, Mg++终浓度 2. 5 mmol/L, 在 96°C下变性 2min, 然后在 FTC2000实时荧光定量 PCR仪上按 96°C20sec, 54°C30sec, 60'C40sec共 45个循环， 并在 60。C延伸时照相。 每一个标本重复三次实验。
3. 荧光定量 PCR的标准曲线
将 DNA模板 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍等比稀释做 DSCR1和 GAPDH基因的 标准曲线， 以比较和得出两个基因的扩增效率。 4. 结果
实验表明唐氏综合征患者的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1.75 ± 0.28,而正常人的 GAPDH 与 DSCR1的差值为 1.15 ±0.12，用 2 ΔΔα方法计算换成拷贝数的差异约为： 1/1.65: - 1.55,两者间的差异有统计学差异意义。

Claims

权利 要求
、 一种 21号染色体倍性检测的双色荧光共扩增定量 PCR试剂盒， 含有扩增 21号 染色体特异单拷贝区段 DSCR和 16号染色体特异单拷贝区段 GAPDH扩增的荧光 定量 PCR试剂， 其特征在于： 将 0.1-0.5umol/L DSCR和 GAPDH特异的引物、 双 色荧光 Taqman探针加入同一个 PCR反应体系， 实现两个基因片段的共扩增和其 拷贝数的定量检测； 所述 PCR反应体系包括耐热 l-3U/50ul Taq DNA聚合酶、 0.1-0.5 画 ol dNTPs底物、 模板 DNA、 1.5-3.5 画 ol/L镁离子、 0.5-1.5XPCR緩冲 液、 引物探针 0.1-lumol/L、 超纯水的反应体系进行高温 (94'C- 96。C)、 低温 (52- 56 。C )、 中温 (60-72 °C )反复热循环而达到目的 DNA片段大量扩增的同时能够检测两 种基因片段共扩增进程， 获得两种基因 Ct值的 DNA体外扩增技术。
、 根据权利要求 1所述的 DNA体外扩增试剂盒，其特征在于： 所述 1XPCR緩冲液 包括 50 圆 ol/L KC1、 10 圆 ol/L Tris. HCl PH8. 3、 0.01%明胶。
、 根据权利要求 1所述的 DNA体外扩增试剂盒，其特征在于：所述 DSCR和 GAPDH 特异的引物和探针的序列和荧光标记为： DSCR上游引物 5， -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3' ； DSCR下游引物： 5， - CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT- 3， ； DSCR TaqMan探针： 5， - [FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC [TAMKA] -3 ' ； GAPDH上游 引物： 5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3' ； GAPDH下游引物： 5， -cag etc tea tac cat gag tec t-3' ； GAPDHTaqMan探针: 5，-[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3' 。
、 根据权利要求 1所述的 DNA体外扩增试剂盒， 其特征在于： 所述引物探针的序 列长度为 18 - 25nt。
、 根据权利要求 1所述的 DNA体外扩增试剂盒， 其特征在于： DSCR和 GAPDH 两个基因片段特异的引物探针混合在同一个反应管中，实现荧光定量 PCR共扩增。
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