WO2008113870A1 - Método de diagnóstico y/o pronóstico de cancer vesical - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
Definitions
- CTSE cathepsin E gene (also called CATE), located at 1q31, codes for an intracellular protease.
- the KLF9 gene (Kruppel-like factor 9) (also called BTEB1), codes for a transcription factor.
- said diagnostic and / or prognostic method is contemplated based on the detection and individual quantification of the expression of the POSTN gene.
- the bladder cancer diagnosis and / or prognosis kit comprises a set of probes suitable for the detection and quantification of the expression pattern of the combination of ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3 genes,
- the probes were synthesized by a direct mareaje method
- the final objective of this study was to select a reduced set of bladder-related CCT genes and to quantify their expression, diagnostic and prognostic information was obtained from the tumor.
- DNA microarrays By means of microarray technology thousands of genes are tested in each experiment and a greater quantity of RNA and of better quality is needed to perform the experiments than with the qRT-PCR methodology.
- the latter is a more precise technology and the exact number of genes of interest can be quantified. Therefore, it was decided to use the TaqMan Low Density Arrays (TLDA) technology, based on qRT-PCR, in the following phases of the study.
- TLDA TaqMan Low Density Arrays
- bladder fluids are sub-grouped into a set of samples that grouped in the upper part of the cluster (from sample B155-RV_T2alto to B288-RV1_TaG2alto) and that is formed only by samples of tumor bladder fluids, and another set of samples in the lower part of the cluster (from sample B71- RV_TaG2bajoCIS to Ia B109-RV_T2alto) which is formed by a mixture of tumor bladder fluids and controls.
- the upper cluster we can differentiate between high-grade and low-grade tumors, while in the lower one there is a cluster with almost only control samples and another with a mixture of controls and tumors. It has to be taken into account that it has gone from analyzing tissue in poles to bladder fluids in individual samples, so this loss of discrimination power by cluster was relatively predictable.
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Abstract
La presente invención se refiere a un método in vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical basado en la detección y cuantificación en fluidos vesicales de la expresión génica de determinados genes y/o sus combinaciones que actúan como marcadores genéticos de dicha enfermedad. Asimismo, se contempla un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical basado en el empleo de un set de sondas adecuado para la detección y cuantificación del patrón de expresión de dichos genes.
Description
MÉTODO DE DIAGNOSTICO Y/O PRONÓSTICO DE CÁNCER VESICAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente en los campos de Ia "Urología Oncológica" y "Biología Molecular". En concreto, esta invención está dirigida a métodos de diagnóstico y pronóstico del cáncer vesical.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de vejiga, o cáncer vesical, es el segundo tumor más frecuente del tracto genito-urinario, después del cáncer de próstata [Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cáncer statistics, 2002. CA Cáncer J Clin 2002; 52:23-47\. En un contexto global representa aproximadamente el 3 y el 1 %, en hombres y mujeres respectivamente, de todas las muertes por cáncer. En valores absolutos, esto significa que unos 95.000 hombres y unas 35.000 mujeres mueren cada año debido a esta patología. La proporción entre incidencia y muerte es distinta dependiendo del grado de desarrollo de cada país. Como ejemplos extremos, podríamos comentar que en Ia zona de América del norte esta proporción se encontraría próxima a 0,2, mientras que en las regiones sub-saharianas aumentaría hasta 0,6 [Edwards BK, Brown ML, Wingo PA et al. Annual repon to the nation on the status of cáncer, 1975-2002, featuring population- based trends in cáncer treatment. J Nati Cáncer Inst 2005; 97:1407-27; Pisani P, Parkin DM, Bray F, Ferlay J. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int J Cáncer 1999; 83: 18-29] .
A diferencia de otros tumores, por el momento no se han detectado prácticamente factores genéticos familiares de predisposición. En cambio, si se han detectado diversos factores ambientales fuertemente relacionados con los tumores de vejiga. Uno de los factores más importantes, no solo por su relación con Ia enfermedad sino también por su incidencia en Ia población, es el tabaquismo. Se ha observado que los fumadores tienen un riesgo tres veces superior a los no fumadores de desarrollar un
tumor de vejiga. De hecho, un tercio de los tumores de vejiga se encuentran asociados al consumo de tabaco. Desgraciadamente, los agentes carcinógenos presentes en el tabaco aún no han sido claramente identificados [Burch JD, Rohan TE, Howe GR et al. Risk of bladder cáncer by source and type of tobáceo exposure: a case-control study. lnt J Cáncer 1989,44:622-28; Zeegers MP, Kellen E, Buntinx F, van den Brandt PA.
The association between smoking, beverage consumption, diet and bladder cáncer: a systematic literature review. World J Urol 2004; 21:392-401].
A nivel celular podemos encontrar distintos tipos de alteraciones en Ia vejiga. Existen cambios benignos como las hiperplasias epiteliales, las metaplasias uroteliales y los nidos de Von Brunn, entre otras. Las displasias en cambio, corresponderían a alteraciones más o menos intermedias entre el epitelio normal y el carcinoma.
Finalmente, nos encontramos con distintos tipos de carcinomas uroteliales en Ia vejiga, que podemos dividir en adenocarcinomas, tumores escamosos y carcinomas de células transicionales (CCT).
Más del 90% de los tumores de vejiga son CCTs. En el momento de su diagnóstico, aproximadamente el 75% son tumores superficiales, el 20% están invadiendo las capas musculares (CCTs infiltrantes o invasivos) y un 5% ya son metastáticos. De los casos superficiales, aproximadamente un 20% se curan mediante una única intervención quirúrgica, mientras que entre un 50 y un 70% recurren tras Ia cirugía una o más veces, pero nunca se transforman en infiltrantes. Entre un 10 y un 30% de estos tumores superficiales se transforman en infiltrantes. Éstos son tumores agresivos, de mal pronóstico, con una mortalidad a los 5 años del 50% y en aquellos casos metastatizados Ia mortalidad a dos años es del 100% [Sanchez-Carbayo M, Socci ND,
Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder cáncer using cDNA microarrays: defining histogenesis and biological phenotypes. Cáncer Res 2002,62:6973-80; Adshead JM, Kessling AM, Ogden CW. Genetic initiation, progression and prognostic markers in transitional cell carcinoma of the bladder: a summary of the structural and transcriptional changes, and the role of developmental genes. Br J Urol 1998,82:503-
12; Babaian RJ, Johnson DE, Llamas L, Ay ala AG. Metastases from transitional cell carcinoma of urinary bladder. Urology 1980; 16:142-44].
Las vías genéticas de los CCTs superficiales e invasivos, aunque relacionadas, parecen ser bastante distintas. La progresión más habitual en los tumores superficiales parece ser Ia hiperplasia, Ia atipia y, finalmente, los CCTs papilares de bajo grado. En los tumores invasivos Io más habitual es progresar desde una atipia a una displasia, para luego pasar a un tumor in situ (Tis) y terminar en un tumor infiltrante [Knowles MA.
What we could do now: molecular pathology of bladder cáncer. Mol Pathol 2001; 54:215-21].
Los sistemas de diagnóstico actuales se basan en una combinación de Ia citología urinaria (a partir de células descamadas en Ia orina) y de Ia observación directa de Ia vejiga mediante cistoscopia. Esta última es de hecho Ia principal técnica diagnóstica y de seguimiento de los tumores. Se realiza vía transuretral, por Io que es una técnica invasiva y bastante molesta para los pacientes. La sensibilidad y especificidad de esta técnica se creían bastante elevadas, aunque mejoras en Ia propia técnica (cistoscopia fluorescente) nos indican que probablemente no sea así y que parte de Ia recurrencia observada en los tumores superficiales podría ser debida a Ia falta de resección total de partes no visibles de los mismos [Jones JS. DNA-based molecular cytology for bladder cáncer surveillance. Urology 2006; 67:35-45]. La citología urinaria, por su parte, es una técnica diagnóstica no invasiva y con una alta sensibilidad y especificidad para los tumores de alto grado. Sin embargo, esta técnica muestra limitaciones para Ia detección de los tumores de bajo grado [Bastacky S, lbrahim S, Wilczynski SP, Murphy WM. The accuracy of urinary cytology in daily practice. Cáncer 1999; 87:118-28]. Además, Ia interpretación de Ia citología es altamente observador-dependiente, con Io que pueden existir diferencias inter-observador, especialmente en los tumores de bajo grado.
Todas estas limitaciones han llevado a Ia búsqueda de marcadores de cáncer de vejiga no invasivos más fiables. Encontrar un marcador no invasivo, con una alta sensibilidad y especificidad para el CCT de vejiga sería de gran ayuda a Ia práctica clínica. De hecho, varios estudios describen nuevos marcadores tumorales en orina, como el test para el antígeno de tumor de vejiga NMP22 [Wiener HG, Mian C, Haitel A, Pycha A, Schatzl G, Marberger M. Can uriñe bound diagnostic tests replace cystoscopy
in the management of bladder cáncer? J Urol 1998, 159:1876-80; Soloway MS, Briggman V, Carpinito GA et al. Use of a new tumor marker, urinary NMP22, in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract following surgical treatment. J Urol 1996; 156:363-67], productos de degradación de Ia fibrina [Schmetter BS, Habicht KK, Lamm DL et al. A multicenter trial evaluation of the fibrín/fibrinogen degradation producís test for detection and monitoring of bladder cáncer. J Urol 1997; 158:801-5.], telomerasa JTakihana Y, Tsuchida T, Fukasawa M, Araki I, Tanabe N, Takeda M. Real-time quantitative analysis for human telomerase reverse transcriptase mRNA and human telomerase RNA component mRNA expressions as markers for clinicopathologic parameters in urinary bladder cáncer, lnt J
Urol 2006, 13:401-8], tests basados en hibridación in situ fluorescente [Halling KC, King W, Sokolova IA et al. A comparíson of BTA stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in uriñe. J Urol 2002, 167:2001-6] o citometría de flujo [Takahashi C, Miyagawa I, Kumano S, Oshimura M. Detection of telomerase activity in prostate cáncer by needle biopsy. Eur Urol
1997,32:494-98; Trott PA, Edwards L. Comparíson of bladder washings and uriñe cytology in the diagnosis of bladder cáncer. J Urol 1973, 110:664-66], pero aunque Ia mayoría de ellos tienen una mayor sensibilidad que Ia citología urinaria, ésta sigue siendo Ia más específica [Bassi P, De M, V, De Lisa A et al. Non-invasive diagnostic tests for bladder cáncer: a review of the literature. Urol Int 2005; 75: 193-200].
Conocemos que las alteraciones genéticas que encontramos en los tumores uroteliales son elevadas y muy variadas, por ello, Ia tendencia actual es Ia búsqueda de marcadores genéticos (ya sea a nivel de DNA, RNA o proteínas) que nos puedan indicar Ia presencia de carcinomas en Ia muestra analizada. Además, sería muy interesante poder discriminar con estos mismos marcadores Ia agresividad del tumor que presenta un paciente, ya que esto nos podría permitir un tratamiento mucho más personalizado y efectivo. Finalmente, algunos de estos marcadores podrían ser posibles dianas terapéuticas para desarrollar nuevas drogas de lucha contra el cáncer.
Hasta hace poco tiempo, Ia capacidad de análisis de los patrones de expresión génica se encontraba limitada a pocos genes por experimento. Nuevas tecnologías, como los
microarrays de DNA, han cambiado completamente el panorama. Actualmente, se pueden analizar miles de genes en un único ensayo [Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat Genet 1999,21:10-14; Granjeaud S, Bertucci F, Jordán BR. Expression profiling: DNA arrays in many guises. Bioessays 1999;21:781-90]. Por tanto, han empezado a aparecer en Ia literatura resultados de expresión masivos de todos los tipos tumorales, entre los que se encuentran los tumores de vejiga [ Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder cáncer using cDNA microarrays: defining histogenesis and biological phenotypes. Cáncer Res 2002,62:6973-80; Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass cáncer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Nati Acad Sci U S A 200198:15149-54; Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Lozano JJ et al. Gene discovery in bladder cáncer progression using cDNA microarrays. Am J Pathol 2003; 163:505-16; Sanchez-Carbayo M, Capodieci P, Cordón- Cardo C. Tumor suppressor role ofKiSS-1 in bladder cáncer: loss of KiSS-1 expression /s associated with bladder cáncer progression and clinical outcome. Am J Pathol
2003; 162:609-17; Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M et al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet 2003,33:90-96], aunque Ia gran mayoría de resultados no se han hecho públicos en su totalidad. Sin embargo, hasta el momento, los estudios que se han realizado con marcadores específicos de cáncer de vejiga se han centrado en uno o en muy pocos genes [Olsburgh J, Harnden P, Weeks
R et al. Uroplakin gene expression in normal human tissues and locally advanced bladder cáncer. J Pathol 2003, 199:41-49; Fichera E, Liang S, Xu Z, Guo N, Mineo R, Fujita-Yamaguchi Y. A quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction assay for human IGF-II allows direct comparison of IGF-II mRNA levéis in cancerous breast, bladder, and prostate tissues. Growth Horm IGF Res 2000, 10:61-70; Simoneau
M, Aboulkassim TO, LaRue H, Rousseau F, Fradet Y. Four tumor suppressor loci on chromosome 9q in bladder cáncer: evidence for two novel candidate regions at 9q22.3 and 9q31. Oncogene 1999;18:157-63].
Dado que Ia naturaleza de estos tumores es muy heterogénea, parece poco probable poder identificar todos o Ia gran mayoría de carcinomas con un único marcador. Así, para poder caracterizar Ia mayoría de los tumores parece imprescindible combinar
varios de los mejores marcadores en algún tipo de medida.
Por otro lado, aunque el análisis de tejido urotelial directo sea Ia alternativa más cómoda para desarrollar un método diagnóstico rutinario, sería de gran interés, como se ha comentado anteriormente, que dicho método no fuera invasivo, ya que éstos disminuyen Ia calidad de vida de los pacientes y representan una carga económica para Ia sanidad mucho mayor.
Los fluidos vesicales (orina o lavado vesical) que están en contacto con todo el epitelio vesical, y por Io tanto con Ia masa tumoral, parecen una buena alternativa para Ia detección de marcadores tumorales, dado que representan una manera fácil y no invasiva de obtención de Ia muestra a analizar. Así, un gran número de trabajos se ha centrado en el estudio de marcadores tumorales en orina en busca de un método diagnóstico no invasivo para el CCT de vejiga. De hecho, se han comercializado diferentes tests con este objetivo (NMP22, UroVysion, ImmunoCyt, Accu-Dx, etc.).
Una alternativa, que aún no ha sido comercializada, es Ia detección del CCT de vejiga en muestras de orina mediante Ia determinación de Ia expresión génica de marcadores de cáncer vesical. De hecho, hay algunos estudios que sugieren Ia utilidad de esta metodología, aunque se han realizado con uno o pocos genes marcadores [Parekattil
SJ, Fisher HA, Kogan BA. Neural network using combined uriñe nuclear matrix protein- 22, monocyte chemoattractant protein-1 and urinary intercellular adhesión molecule-1 to detect bladder cáncer. J Urol 2003; 169:917-20; Eissa S, Kenawy G, Swellam M, El Fadle AA, Abd EI-AaI AA, El Ahmady O. Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided uriñe samples as diagnostic tools for bladder carcinoma. Clin
Biochem 2004,37:803-10; Larsson PC, Beheshti B, Sampson HA, Jewett MA, Shipman R. Allelic deletion fingerprinting of uriñe cell sediments in bladder cáncer. Mol Diagn 2001;6:181-88].
En respuesta a estas necesidades, los autores de Ia invención, tras una importante labor de investigación, han identificado 14 genes marcadores del tumor vesical, a partir de los cuales han desarrollado un método de diagnóstico y pronóstico de cáncer
vesical basado en Ia detección y cuantificación de Ia expresión génica de estos genes mediante PCR cuantitativa a tiempo real, en RNA extraído de fluidos vesicales, y su posterior combinación informática mediante un "sistema de alarmas".
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 (A-J): Electroferogramas obtenidos con el Bioanalyzer Agilent 2100 de las muestras de RNA intacto (LVO) (figura 1.A) y parcialmente degradado (LV1, LV2, LV3) (figuras 1.B, 1.C, 1.D) de lavado vesical, tumor de vejiga (TO, T1, T2, T3) (figuras 1.E, 1.F, 1.G, 1.H) y pool de muestras control (C) (figura 1.1) y gel con las bandas de los RNAs ribosómicos (28S y 18S) de cada una de las muestras analizadas (figura 1.J). Los números 0, 1 , 2 y 3 se asignan a las muestras en orden creciente de degradación y para las muestras con RNA de calidad comparable.
Figura 2: (a) Semi-matriz de comparación entre parejas de arrays de los 100 genes más diferencialmente expresados en cada array. La parte superior e inferior sombreada en gris de Ia semi-matriz muestra el porcentaje de genes diferencialmente expresados en común entre las parejas de arrays de lavado vesical (LV) y entre las parejas de arrays de tumores (T), hibridados con RNA de diferente grado de degradación. La parte no sombreada de Ia semi-matriz corresponde al porcentaje de genes expresados diferencialmente en común entre las parejas de arrays de lavado vesical y tumor, (b) Cluster no supervisado de todos los clones contenidos en el microarray, incluyendo los duplicados con intercambio de fluorocromos {dye swap) (DS).
Figura 3: Validación mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) de 4 genes (KRT20, GSN, IGF2 y CCL2) expresados diferencialmente en los microarrays de cDNA y relacionados con cáncer de vejiga, en 36 muestras adicionales de lavado vesical tumoral. Los valores positivos indican sobre-expresión en los lavados vesicales tumorales respecto a los controles. Las muestras están agrupadas en el gráfico en función del Iog2ratio según estadio y grado tumoral:
tumores superficiales de bajo grado (8 pTa y 3 pT1 ), tumores superficiales de alto grado (5 pTa, 5 pT1 y 4 pTis) y tumores invasivos (9 pT2 y 2 pT4).
Figura 4: Clasificación de las muestras mediante cluster global no supervisado (distancia euclidiana y UPGMA). pT2_1, pT2_2 y pT2_3 (tumores infiltrantes); pT1
AG_1, pT1 AG_2 y pT1 AG_3 (tumores superficiales de alto grado); pT1 BG_1, pT1 BG_2, pT1 BG_3 (tumores superficiales de bajo grado).
Figura 5: Resultados de PCR cuantitativa a tiempo real (q RT-PC R) de los pooles y las muestras individuales contenidos en los mismos. La tabla se encuentra dividida en pooles (parte izquierda) y en muestras individuales (derecha). Las columnas de los pooles indican el número de pool (No.), los niveles de expresión observados en los microarrays (μarrays) y los niveles cuantificados mediante qRT-PCR (qRT-PCR). La primera columna de las muestras individuales corresponde a Ia media aritmética de las expresiones de las muestras individuales contenidas en el pool (YnediaJ, las cuales se indican en las columnas siguientes (1-5). Cada fila corresponde a un gen (TCN 1 , SORBS1 , MYH11 , SRPX, CRH, KRT14, RRM2, FOSB, CEACAM6, CES1 ), con los diferentes niveles de expresión para cada pool.
Figura 6: Clasificación de las 60 muestras individuales de fluidos vesicales mediante un cluster global no supervisado de 384 genes (distancia euclidiana y UPGMA). La nomenclatura de las muestras sigue Ia siguientes normas: si Ia muestra empieza con Ia letra "B", se refiere a una muestra de fluido vesical tumoral; si empieza por "CB", se refiere a una muestra de fluido vesical control; si después del número de muestra aparecen las iniciales "RV", se refiere a una muestra de lavado vesical; si por el contrario aparece Ia inicial "O", se refiere a una muestra de orina y después del guión bajo se indica el grado tumoral y el estadio patológico de Ia muestra tumoral. Las flechas indican una mala clasificación de Ia muestra que señalan en relación a las categorías establecidas: T_AG (tumores de alto grado); T_BG (tumores de bajo grado), y C (controles).
Figura 7 (A y B): Clasificación de las 140 muestras individuales de fluidos vesicales mediante un cluster global no supervisado de 96 genes (distancia euclidiana y UPGMA). Las flechas indican una mala clasificación de Ia muestra que señalan en relación a las categorías establecidas (C, controles; figura 7.A y T, muestras tumorales; figura 7.B). La nomenclatura de las muestras sigue Ia siguiente norma: si Ia muestra empieza con Ia letra "B", se refiere a una muestra de fluido vesical tumoral; si empieza por "CB", se refiere a una muestra de fluido vesical control; si después del número de muestra aparece Ia inicial "R", se refiere a una muestra de lavado vesical; si por el contrario aparece Ia inicial "O", se refiere a una muestra de orina.
Figura 8 (A-T): Listado de 384 genes de diagnóstico, pronóstico y controles endógenos para cáncer vesical. Este listado se ha obtenido del análisis mediante microarrays de Affymetrix de pooles de muestras de tejido tumoral de vejiga de diferentes estadios y grados tumorales y de muestras de mucosa vesical control.
Figura 9 (A-D): Listado de 96 genes de diagnóstico, pronóstico y controles endógenos para cáncer vesical. Este listado se ha obtenido mediante el análisis de 60 muestras de fluidos vesicales en tarjetas microfluídicas que contienen los 384 genes de Ia figura 8. Se indica el símbolo del gen y el nombre del TaqMan Gene Expression
Assay seleccionado para Ia tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array.
Figura 10 (A y B): Listado de 48 genes de diagnóstico, pronóstico y controles endógenos para cáncer vesical. Este listado se ha obtenido mediante el análisis de 140 muestras de fluidos vesicales en tarjetas microfluídicas que contienen los 96 genes de Ia figura 9. Se indica el símbolo del gen y el nombre del TaqMan Gene Expression Assay seleccionado para Ia tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de Ia presente invención se refiere a un método in vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical basado en Ia detección y cuantificación en
fluidos vesicales de Ia expresión génica de determinados genes y/o sus combinaciones que actúan como marcadores genéticos de dicha enfermedad.
Asimismo, es objeto de Ia presente invención el empleo de dichos genes como marcadores genéticos de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical.
Finalmente, otro objeto de Ia invención se refiere a un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical basado en el empleo de dichos genes como marcadores genéticos de Ia enfermedad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene como principal objetivo el desarrollo de un método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical basado en Ia detección y cuantificación de determinados genes que actúan como marcadores genéticos de Ia enfermedad.
Para Ia realización del método se parte de una muestra de fluido vesical obtenida de un sujeto sobre Ia que se lleva a cabo un análisis para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de determinados genes y/o sus combinaciones. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales para así establecer el diagnóstico y/o pronóstico.
El término "sujeto" empleado en Ia presente invención se refiere a un ser humano.
La muestra de fluido vesical obtenida del sujeto puede ser una muestra de orina o de lavado vesical y puede ser obtenida mediante cualquier método convencional.
En Ia presente invención, se entiende como método de diagnóstico de cáncer vesical a aquel que permite detectar y cuantificar genes diferencialmente expresados entre tumores y muestras control (de individuos sanos) (genes de diagnóstico). El método de pronóstico se refiere a aquellos que permiten detectar genes
diferencialmente expresados en los diferentes tipos de tumores (genes de pronóstico), Io que permite clasificar los tumores según agresividad y personalizar el tratamiento en cada caso.
La clasificación tumoral de los diferentes tipos de carcinomas de células transicionales
(CCTs) se basa actualmente en Ia observación macroscópica y microscópica en el laboratorio de anatomía patológica. Mediante unas observaciones más o menos estandarizadas, basadas en Ia profundidad del tumor y en el aspecto microscópico de las células, se decide su clasificación. Estudios moleculares recientes parecen indicar que en realidad hay dos perfiles genéticos diferenciales que mayoritariamente separan los tumores de tipo superficial y los tumores infiltrantes.
Así, los carcinomas superficiales de vejiga se denominan como Ta, Tis y T1. El carcinoma Ta es un carcinoma exofítico no invasivo o confinado al epitelio. Tis es un carcinoma in situ (tumor superficial plano) y T1 es un tumor que invade el tejido conectivo subepitelial o que invade Ia lámina propia.
En Ia presente invención se emplea las siglas AG para determinar tumores de Alto Grado y BG para aquellos de Bajo Grado.
Los carcinomas Ta y T1 se pueden extirpar mediante resección transuretral (RTU). Los Tis y T1 de Alto Grado (AG), aunque son carcinomas superficiales confinados a Ia mucosa, por ser tumores de Alto Grado se ha demostrado con técnicas de biología molecular y por Ia experiencia clínica, que tienen gran potencial de malignidad y de invasión.
Por otra parte, los carcinomas infiltrantes de vejiga se clasifican en T2, T3 y T4. Así, T2 se refiere a un tumor que invade Ia capa muscular vesical. A su vez, este tipo se divide en T2a, que invade Ia capa muscular superficial o Ia mitad interna y T2b, que invade Ia capa muscular profunda o Ia mitad externa. T3 se refiere a un tumor que invade más allá de Ia capa muscular o que invade Ia grasa perivesical. A su vez, este tipo se divide en T3a, de invasión microscópica y T3b, de invasión macroscópica. Finalmente T4 se refiere a un tumor que invade estructuras adyacentes a Ia vejiga urinaria y que se divide a su vez en T4a, con invasión de Ia próstata, útero o vagina y T4b, con invasión de Ia pared pélvica o pared abdominal. La detección y cuantificación de Ia expresión génica de los genes se puede llevar a
cabo mediante cualquier técnica de Biología molecular no invasiva adecuada a los fines de Ia invención, como por ejemplo microarrays de expresión, PCR cuantitativa a tiempo real, northern blot, PCR convencional, etc.
Concretamente, el empleo de arrays de DNA permite obtener resultados de expresión de un número de genes muy elevado, permitiendo testar miles de genes en cada experimento. El empleo de esta técnica requiere grandes cantidades de RNA y de buena calidad (no degradado).
De forma preferida, en Ia presente invención se emplea Ia técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) para detectar y cuantificar los genes de diagnóstico y/o pronóstico. Esta técnica es más precisa, además de permitir Ia utilización de RNA con importante grado de degradación, sin que esto afecte al resultado final. Asimismo, permite cuantificar el RNA específico de los genes de interés. En realizaciones particulares, las sondas de hibridación empleadas son sondas Taqman.
Los resultados obtenidos en Ia detección y cuantificación de Ia expresión de los genes en Ia muestra de fluido vesical, se comparan con los valores normales, de referencia, para dichos genes en muestras procedentes de sujetos sanos. En general, el incremento o Ia disminución en los niveles de los genes marcadores se estiman mediante Ia comparación de los resultados obtenidos de los análisis de las muestras correspondientes a los sujetos del ensayo con los resultados de las muestras controles, que se analizan en paralelo. La decisión final de clasificación de cada muestra se lleva a cabo mediante un "sistema de alarmas" basado en los valores de expresión de los genes marcadores, de forma que si alguno de los valores observados muestra una desviación muy significativa respecto a Io esperado en una muestra control, aumenta mucho Ia probabilidad de que Ia clasificación final sea tumoral, independientemente del gen que haya "dado al alarma".
De forma más concreta, en un aspecto principal de Ia invención, el método de diagnóstico y/o pronóstico, no invasivo, de cáncer vesical descrito comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y
cuantificación en dicha muestra del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales. De forma preferida, Ia muestra de fluido vesical es orina, dado que su obtención es mucho más sencilla. No obstante, el lavado vesical, en ocasiones, se hace de manera rutinaria y se obtiene un RNA de mejor calidad.
El gen ANXA 10 (annexin A10) (también denominado ANX14), localizado en 4q32.3, participa en Ia regulación de Ia división celular y en diferentes vías de transducción de señales, pero su función exacta todavía no ha sido determinada.
El gen C14orf78 (chromosome 14 open reading frame 78) (también denominado AHNAK2 o KIAA2019), está localizado en 14q32.33. Su función aún no ha sido determinada.
El gen CTSE (catepsine E) (también denominado CATE), localizado en 1q31 , codifica para una proteasa intracelular.
El gen CRH (corticotropin releasing hormone) (también denominado CRF), localizado en 8q13, codifica para Ia hormona de liberación de Ia corticotropina, segregada en el hipotálamo en respuesta al estrés.
El gen IGF2 (insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)) (también denominado 11orf43, FLJ22066, FLJ44734, INSIGF), localizado en 11p15.5, codifica para el factor de crecimiento similar a Ia insulina.
El gen KLF9 (Kruppel-like factor 9) (también denominado BTEB1 ), codifica para un factor de transcripción.
El gen KRT20 (Keratine 20) (también denominado K20; CK20; KRT21 ; MGC35423), localizado en 17q21.2, codifica para una proteína que forma parte de los filamentos
intermedios responsables de dar Ia estructura e integridad a las células epiteliales.
El gen MAGEA3 (melanoma antigen family A, 3) (también denominado HIP8; HYPD;
MAGE3; MAGEA6; MGC14613), está localizado en Xq28. Su función es desconocida.
El gen POSTN (periostin, osteoblast specific factor) (también denominado PN; OSF-2;
PDLPOSTN; MGC119510; MGC119511 ; periostin; RP11-412K4.1 ), está localizado en 13q13.3, y tiene una función relacionada con Ia movilidad celular.
El gen PPP1 R14D (protein phosphatase 1 , regulatory (inhibitor) subunit 14D) (también denominado GBPI-1 ; FLJ20251 ; MGC119014; MGC119016; CPI17-like), está localizado en 15q15.1 y codifica para una fosfatasa.
El gen SLC1A6 (solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6) (también denominado EAAT4; MGC33092; MGC43671 ), localizado en 19p13.12, participa en el transporte intracelular.
El gen TERT (telomerase reverse transcriptase) (también denominado TP2; TRT;
EST2; TCS1 ; hEST2), localizado en 5p15.33, codifica para una polimerasa de los telómeros con actividad transcriptasa reversa.
El gen ASAM (adipocyte-specific adhesión molecule) (también denominado ASAM;
ACAM; CLMP; FLJ22415), localizado en 11q24.1 , participa en Ia adhesión celular.
Finalmente, el gen MCM10 (minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae))
(también denominado CNA43; PRO2249; MGC126776), localizado en 10p13, codifica para una proteína implicada en el inicio de Ia replicación genómica.
En otro aspecto de Ia invención, el método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación en dicha muestra del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3,
SLC1A6, TERT, y MCM10. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de Ia invención, el método in vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación en dicha muestra de fluido vesical de Ia expresión de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN,
PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
Así, en un aspecto particular de Ia invención, se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en Ia detección y cuantificación individual de Ia expresión del gen C14orf78.
En otro aspecto particular de Ia invención se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en Ia detección y cuantificación individual de Ia expresión del gen KLF9.
En otro aspecto particular de Ia invención se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en Ia detección y cuantificación individual de Ia expresión del gen POSTN.
En otro aspecto particular se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en Ia detección y cuantificación individual de Ia expresión del gen PPPIR14D. En otro aspecto particular de Ia invención se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en Ia detección y cuantificación individual de Ia expresión del gen ASAM.
En otra realización particular de Ia invención se contempla un método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical basado en Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM y sus combinaciones y, adicionalmente, al menos un gen seleccionado entre
ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
En otro aspecto de Ia invención se contempla un método in vitro no invasivo centrado en el diagnóstico de cáncer vesical que comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT, según el método descrito anteriormente. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de Ia invención el método in vitro no invasivo de diagnóstico de cáncer vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de Ia invención el método in vitro no invasivo de diagnóstico de cáncer vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación de Ia expresión de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En una realización particular de Ia invención, dicho método de diagnóstico se basa en Ia detección y cuantificación del gen C14orf78.
En otra realización particular de Ia invención, dicho método de diagnóstico se basa en Ia detección y cuantificación del gen KLF9.
En otra realización particular de Ia invención, dicho método de diagnóstico se basa en Ia detección y cuantificación del gen POSTN.
En otra realización particular de Ia invención, dicho método de diagnóstico se basa en
Ia detección y cuantificación del gen PPPIR14D.
En otra realización particular de Ia invención dicho método de diagnóstico se basa en Ia detección y cuantificación de Ia expresión de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones y, adicionalmente, al menos, un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
En otro aspecto de Ia invención se contempla un método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical que comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ASAM y MCM 10. Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
Otro aspecto de Ia invención proporciona un método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical que comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo Ia detección y cuantificación de Ia expresión del gen ASAM.
Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para dicho gen en fluidos vesicales.
En otro aspecto de Ia invención, se contempla el empleo de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D,
SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se centra en el empleo de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otro aspecto de Ia invención se contempla el empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones, como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En una realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen C14orf78
como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen KLF9 como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen POSTN como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención se contempla el empleo del gen PPP1R14D como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen ASAM como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se centra en el empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10, como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al empleo de Ia combinación de genes ANXA10,
C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se centra en el empleo de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones como marcadores de diagnóstico del cáncer vesical.
En una realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen C14orf78
como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
Asimismo, en otra realización particular de Ia invención se contempla el empleo del gen
KLF9 como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen POSTN como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de Ia invención, se contempla el empleo del gen PPP1 R14D como marcadores de diagnóstico del cáncer vesical.
En otro aspecto de Ia invención, se contempla el empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1 A6 y TERT, como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
En otro aspecto de Ia invención se contempla el empleo de Ia combinación de genes ASAM y MCM10 como marcadores de pronóstico del cáncer vesical.
En otro aspecto de Ia invención se contempla el empleo del gen ASAM como marcador de pronóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y
MCM10.
En otro aspecto de Ia invención, el kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3,
SLC1A6, TERT y MCMIO.
En otro aspecto de Ia invención se contempla un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical basado en un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM y sus combinaciones. En una realización particular de Ia invención, dicho kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical, basado en el set de sondas para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones, comprende adicionalmente un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
En otro aspecto de Ia invención, se contempla un kit de diagnóstico del cáncer vesical, basado en un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 y TERT.
En otro aspecto de Ia invención, el kit de diagnóstico del cáncer vesical, comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
En otro aspecto de Ia invención se contempla el kit de diagnóstico del cáncer basado en un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones.
En otro aspecto de Ia invención, dicho kit, basado en el set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones, comprende, adicionalmente, sondas adecuadas para Ia detección y cuantifiación de al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1 A6 y TERT.
En otro aspecto de Ia invención se contempla un kit de pronóstico del cáncer vesical,
basado en un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ASAM y MCM10.
En otro aspecto de Ia invención, el kit de pronóstico se basa en una sonda adecuada para Ia detección y cuantificación del gen ASAM.
En Ia tabla 1 se pueden observar los 14 genes identificados como marcadores genéticos de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical. Los genes ASAM y MCM10 son los 2 genes específicos para pronóstico.
A continuación se presentan algunos ejemplos que sirven para ilustrar pero no limitar Ia presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Determinación de Ia importancia de Ia degradación en las muestras de fluido vesical.
Para llevar a cabo el objetivo final de Ia invención, en primer lugar fue necesario conocer el impacto que tenían diferentes niveles de degradación del RNA en los perfiles de expresión génica, dado que Ia calidad del RNA obtenido de los fluidos vesicales (orina y/o lavado vesical) es generalmente baja. También debía determinarse si los perfiles de expresión génica obtenidos de los fluidos vesicales se correspondían con los obtenidos en los correspondientes tumores.
1. Selección de muestras y preparación del RNA
Se seleccionó una muestra de tejido tumoral (T) y de lavado vesical (LV) de un mismo paciente diagnosticado como pT2 alto grado (G3) [según los métodos descritos en Lopez-Beltran A, Sauter G, Gasser T, Hartmann A, Schmitz-Dráger BJ, Helpap B,
Ay ala AG, Tamboni P, Knowles MA, Sidransky D, Cordón-Cardo C, Jones PA, Cairns P, Simón R, Amin MB, Tyczynsky JE. Tumours of the Urinary System. In: EbIe JN,
Sauter G, Epstein Jl, Sesterhenn IA (eds.), Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. World Health Organization Classification of Tumours. Lyon: IARC Press; 2004: 89-157; Sobin LH, Wittekind CH. TNM Classification of Malignant Tumours. International Union Against Cáncer., 6th ed. New York: Jonh Wiley & Sons; 2002]. Se extrajo el RNA de ambas muestras (TO y LVO) con TRIzol
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor. Seguidamente, se degradaron alícuotas de ambos RNAs (TO y LVO) incubándolos a 80 0C durante 15 (T1 y LV1 ), 30 (T2 y LV2) y 60 (T3 y LV3) minutos, obteniendo tres niveles de degradación, tal y como se describe en Xiang CC, Chen M, Ma L et al. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31:53, con Ia excepción de que se utilizó agua en vez de un tampón básico.
También se recolectaron muestras de mucosa vesical sana de 4 pacientes sin evidencia de patología vesical (muestras control), se obtuvo RNA de Ia misma manera que se procedió con las muestras anteriores y se mezclaron los 4 RNAs en proporciones equimolares (CO).
Un μl de cada uno de los RNAs, intactos y degradados, se analizaron en el Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer para determinar Ia calidad de cada RNA (según el método descrito en lmbeaud S, Graudens E, Boulanger V et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res 2005; 33:e56) (figuras 1.A-H). En Ia figura 1 (J) se muestra el gel con las bandas de los RNAs ribosómicos (28S y 18S) de cada una de las muestras analizadas donde se observa Ia degradación progresiva de estas bandas.
Por otro lado, se recolectaron 36 lavados vesicales tumorales (8 pTa bajo grado (BG), 5 pTa alto grado (AG), 3 pT1 BG, 5 pT1 AG, 4 pTis, 9 pT2 AG and 2 pT4 AG) y 14 lavados vesicales controles de pacientes sin patología vesical y se extrajo el RNA de Ia misma manera que en los casos anteriores.
2. Amplificación in vitro del RNA y mareaje
Se amplificaron 5 μg de RNA intacto (TO y LVO) y degradado (T1 , T2, T3, LV1 , LV2 y
LV3) mediante Ia utilización de cebadores de secuencia al azar de 9 nucleótidos (random nonamer primers) modificados por Ia adición en 3' de Ia secuencia promotora del T3 (T3N9) (según Xiang CC, Chen M, Ma L et al. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res
2003; 31:e53). Las sondas se sintetizaron mediante un método de mareaje directo
(según Richter A, Schwager C, Hentze S, Ansorge W, Hentze MW, Muckenthaler M. Comparison of fluorescent tag DNA labeling methods used for expression analysis by
DNA microarrays. Biotechniques 2002; 33:620-8, 630).
3. Procesado del array y análisis de datos
Se utilizaron los Oncochip-v2 glass human cDNA microarrays
(http://qrupos.cnio.es/qenomica/arravs/reports/ochip v2.xls) para co-hibridar cada una de las cuatro alícuotas de RNA progresivamente degradadas, tanto de tumor como de lavado vesical (TO, T1 , T2, T3, LVO, LV1 , LV2 y LV3), con el pool de los RNAs provenientes de las muestras de mucosa vesical sana (CO). Las imágenes fluorescentes se obtuvieron con el G2565BA Microarray Scanner System (Agilent,
Technologies, Waldbronn, Germany) y las imágenes TIFF fueron cuantificadas utilizando el programa Spot (http://experimental.act.cmis.csiro.au/Spot) bajo el entorno estadístico R (http://www.r-project.org). La medida final de intensidad de cada punto del microarray fue calculada tal y como se había sugerido previamente (http://www.stat.berkeley.edu/users/terrv/zarrav/Html/imaqe.html) (datos accesibles públicamente en Ia base de datos GEO; GSE3192). Finalmente se obtuvieron 1111 clones válidos que cumplían todos los criterios de calidad y se escogieron los 100 más diferencialmente expresados de cada array para comparar entre arrays y calcular los porcentajes de genes en común entre ellos. Se detectó un elevado porcentaje de genes en común diferencialmente expresados entre los arrays de tejido tumoral (85 al
91 %) y entre los arrays de lavado vesical (78 al 93%) (Figura 2a), Io que indicaba que degradación del RNA prácticamente no afectaba los perfiles de expresión génica.
También se realizó un cluster no supervisado de todos los clones contenidos en el microarray utilizando UPGMA (Unweighted Pair-Group Meted with Arithmetic Mean) y Ia correlación de Pearson. Este cluster indicaba que el porcentaje de genes en común identificados entre 2 arrays hibridados con RNA de diferente nivel de degradación (por ejemplo, LVO y LV1 ), era en ocasiones más alto que el porcentaje entre duplicados dye swap (DS) del mismo array (por ejemplo, LVO vs LVO-DS) (Figura 2b), Io que reforzaba Ia conclusión de que los perfiles de expresión génica no quedaban prácticamente alterados al trabajar con RNA parcialmente degradado.
Para determinar si los perfiles de expresión génica obtenidos de las muestras de lavado vesical se correspondían con los obtenidos en el correspondiente tumor, se comparó el porcentaje de genes en común diferencialmente expresados entre los arrays de tejido tumoral y los de lavado vesical. Se obtuvo una elevada similaridad entre el tumor y el lavado vesical (52 al 60%) y esta similaridad resultó ser independiente del estado de degradación del RNA.
En conclusión, estos datos sugirieron que el RNA parcialmente degradado de lavado vesical podía ser utilizado para estudios de expresión génica utilizando microarrays y que este RNA es un reflejo de Ia expresión génica del tumor.
4. RT-PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR)
Para validar que los resultados obtenidos en los microarrays de un paciente particular eran extrapolables a una cohorte más larga, se analizaron mediante qRT-PCR 4 genes diferencialmente expresados en los arrays y que estaban relacionados con el proceso de carcinogénesis vesical según Ia literatura (KRT20, IGF2, GSN y CCL2). Para esta validación se utilizaron 36 lavados vesicales tumorales adicionales y 14 lavados vesicales controles.
El cDNA se sintetizó a partir de 1 ug de RNA utilizando el High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor,
excepto que se disminuyó el volumen final de Ia reacción a 50 μl. El gen GUSB se utilizó como control endógeno. Las PCRs se realizaron utilizando Assays-on-Demand™ Gene Expression Products en un ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor, excepto que el volumen de Ia reacción se disminuyó a 20 μl.
El método del ΔΔCt (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2: Relative Quantification of Gene Expression P/N 4303859) se utilizó para calcular Ia cantidad relativa de expresión de cada gen en relación a un promedio de Ia expresión de las 14 muestras controles. Para establecer el valor de referencia en los controles se obtuvo Ia media aritmética de los valores de expresión de los 14 lavados vesicales controles provenientes de pacientes sin patología vesical.
Los resultados de este análisis, expresados como Iog2ratio, definido como Ia proporción o división (ratio) entre las 2 condiciones comparadas (en este caso el control endógeno contra cada gen indicado) expresado como logaritmo en base 2, confirmaron los resultados de los microarrays en un 81% de las muestras para KRT20, en un 89% para GNS, en un 64% para IGF2 y en un 89% para CCL2 (Figura 3). La elevada concordancia entre los datos de microarrays obtenidos del análisis de un solo paciente y los de qRT-PCR obtenidos del análisis de una cohorte de 36 pacientes adicionales confirmaban que los perfiles de expresión génica obtenidos en los microarrays no eran debidos al análisis de un solo paciente.
5. Conclusión ejemplo 1
Es posible Ia utilización de RNA de lavado vesical para inferir los perfiles de expresión génica de los correspondientes tumores vesicales, tanto mediante microarrays de cDNA como de qRT-PCR.
Ejemplo 2. Determinación inicial de genes candidatos para el modelo predictivo
Una vez conocido que era posible determinar los perfiles de expresión génica en las
muestras de fluido vesical, el siguiente objetivo era obtener datos propios de expresión génica Io más extensos posibles. La estrategia que nos propusimos seguir fue empezar analizando Ia mayor cantidad posible de genes en un numero reducido de muestras, para en fases sucesivas ir analizando progresivamente cada vez una cantidad menor y más seleccionada de genes en una serie más extensa de muestras.
El protocolo a su vez pasaba por el establecimiento de unos controles de calidad muy estrictos en todos los pasos críticos del proceso. Esto incluía Ia obtención de las muestras biológicas con las características deseadas en el quirófano, por parte de los cirujanos del equipo de Ia Fundado Puigvert, el almacenaje y conservación de las muestras en las condiciones adecuadas, el análisis anatomo-patológico de las muestras y el procesado molecular por el equipo de laboratorio.
1. Obtención y selección de las muestras biológicas
Las muestras de tejido fueron obtenidas en quirófano utilizando un resector de pinza fría (muestras tumorales) o directamente con tijeras (muestras control). Parte del tejido obtenido fue inmediatamente congelado a -8O0C hasta ser procesados posteriormente para Ia extracción de RNA y Ia parte restante fue enviado al departamento de Anatomía Patológica para su análisis anatomo-patológico. Para Ia extracción de RNA los tejidos fueron homogeneizados mecánicamente y los RNAs fueron extraídos siguiendo el protocolo del TRIzol (Invitrogen, Calsbad, CA, USA). Finalmente, los RNAs se cuantificaron midiendo espectrofotométricamente Ia absorbancia a 260 nm.
2. Grupos de muestras a estudiar
Dado que los tumores superficiales y los invasivos parecen tener perfiles genéticos distintos, se decidió comparar los grupos tumorales más extremos (superficiales de bajo grado versus infiltrantes). Además también decidimos averiguar el perfil molecular de un tipo de tumor de comportamiento clínico poco claro, ya que son superficiales pero con un alto grado de aberraciones celulares (clasificados como T1 de alto grado, pT1 AG) y en muchos casos (alrededor del 50%) acaban siendo infiltrantes. Así se
definieron cuatro grupos de estudio:
Grupo 1 ; muestras de tumores superficiales de bajo grado (BG) y que invadiesen solamente Ia mucosa vesical (patológicamente clasificadas como pTa BG).
- Grupo 2: muestras de tumores superficiales de alto grado (AG) y que invadiesen el tejido conectivo subepitelial (patológicamente clasificadas como pT1 AG).
Grupo 3: muestras de tumores infiltrantes (patológicamente como mínimo pT2) y alto grado.
- Grupo 4: muestras de mucosa vesical sana (control).
Con Ia intención de reducir Ia varianza biológica, que era bastante elevada, se realizaron pooles de muestras de un mismo tipo tumoral, es decir, con una misma clasificación anatomo-patológica. Así se realizaron 3 pooles de 4-5 muestras tumorales para cada uno de los grupos; pTa BG, pT1 AG, pT2 AG y controles.
3. Microarrays de Affvmetrix
Aunque anteriormente se había trabajado con una plataforma de microarrays basados en cDNA, era conocido por Ia bibliografía que existían otras plataformas comerciales basadas en oligonucleotidos que permitirían obtener resultados de expresión de un número de genes más elevado. Finalmente, se decidió utilizar Ia plataforma de Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx), dado que eran muchos los datos de los que se disponía en las bases de datos públicas para esta plataforma, prácticamente todas las referencias comentaban su alta calidad de resultados y acababa de salir al mercado un nuevo microarray (U133 plus 2.0) que permitía determinar Ia expresión génica de Ia gran mayoría de los genes humanos.
Los microarrays de Affymetrix fueron hibridados y escaneados por una compañía especializada (Progenika) y los datos crudos de expresión (o ficheros cel) fueron directamente analizados por nosotros bajo el entorno estadístico R utilizando el
algoritmo RMA (Robust Multi array Analysis).
4. Análisis de los microarrays de Affvmetrix
Una vez obtenidos los datos normalizados de expresión para cada clon se decidió estudiar como se agrupaban las distintas muestras que habíamos seleccionado realizando un cluster no supervisado (Figura 4). En éste se podía observar que todos los controles agrupaban juntos y claramente diferenciados de los tumores, Io que indicaba que existen muchos genes diferencialmente expresados entre tumores y controles (genes de diagnóstico). Por otro lado, también se observa que los 3 pooles de tumores infiltrantes (pT2_1 , pT2_2 y pT2_3) y tumores superficiales de alto grado
(pT1 AG_1 , pT1 AG_2 y pT1 AG_3) agrupan juntos y diferenciados de los 3 pooles de tumores superficiales de bajo grado (pT1 BG_1 , pT1 BG_2, pT1 BG 3), Io que debería permitir localizar genes marcadores de una u otra vía (genes de pronóstico).
Como sistema de clasificación (ranking) para comparar los distintos grupos y obtener los mejores genes diferencialmente expresados se decidió utilizar Ia proporción entre el valor de intensidad máximo del grupo con Ia menor media y el valor de intensidad mínimo del grupo con Ia mayor media, en escala logarítmica. Esta medida es equivalente al menor nivel de cambio (minimum fold change) que podríamos obtener comparando cualquier réplica de un grupo contra cualquier réplica del otro grupo. El resultado final que obtuvimos fueron literalmente miles de genes con diferencias de expresión entre tumores y controles suficientemente significativas.
5. Validación de los resultados de microarrays mediante PCR cuantitativa a tiempo real
Una vez ordenados los genes, de más a menos diferencialmente expresados, se decidió verificar los resultados obtenidos con una técnica completamente independiente y, según Ia literatura, mucho más precisa, Ia PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR). Se seleccionaron 10 de los genes más diferencialmente expresados para realizar esta verificación técnica y se cuantificó su expresión génica mediante qRT-PCR tanto usando exactamente los mismos pooles hibridados en los microarrays (para poder comparar los resultados de ambas técnicas), como utilizando las muestras
individuales de cada pool (para poder estudiar Ia replicabilidad de Ia propia técnica de qRT-PCR) (Figura 5). En Ia comparación entre microarrays y qRT-PCR obtuvimos un coeficiente de regresión de 0.978, Io que nos indicaba una muy buena replicabilidad entre las 2 técnicas. Cuando comparamos las medias aritméticas de las muestras individuales obtenidas mediante qRT-PCR y su expresión en los pooles mediante Ia misma técnica el coeficiente de regresión fue de 0.995, Io que confirmaba los datos bibliográficos de que Ia cuantificación mediante qRT-PCR tiene una calidad técnica excelente.
6. Conclusión ejemplo 2
Teniendo en cuenta los resultados observados mediante Ia cuantificación de Ia expresión génica utilizando dos técnicas completamente independientes en un pequeño grupo de genes, podemos extrapolar que las expresiones observadas mediante microarrays parecen ser suficientemente fiables como para ser utilizadas para definir un grupo de genes candidatos robusto para un análisis posterior más extenso y específico.
Paralelamente, se concluyó que aunque los microarrays eran adecuados para cuantificar las expresiones génicas, Ia qRT-PCR era aún más precisa, además de permitir unos niveles de degradación del RNA mayores en Ia muestra sin que esto perjudicara el resultado final.
Ejemplo 3. Primera selección de genes candidatos
El objetivo final de este estudio era seleccionar un conjunto reducido de genes relacionados con CCT de vejiga y que al cuantificar su expresión se obtuviera información diagnóstica y pronostica del tumor. Para ello, se ha comprobado que se pueden utilizar dos técnicas; los microarrays de DNA y Ia PCR cuantitativa a tiempo real. Mediante Ia tecnología de microarrays se testan miles de genes en cada experimento y se necesita mayor cantidad de RNA y de mejor calidad para realizar los experimentos que con Ia metodología de Ia qRT-PCR. Además, ésta última es una tecnología más precisa y se puede cuantificar el número exacto de genes de interés.
Por ello se decidió utilizar en las siguientes fases del estudio Ia tecnología TaqMan Low Density Arrays (TLDA), basada en qRT-PCR.
1. Selección de 384 genes para las tarjetas TaqMan Low Density Arrays (TLDA)
Las TLDA son tarjetas microfluídicas que contienen liofilizados los prímers y Ia sonda TaqMan para un máximo de 384 genes (existen diferentes configuraciones de TLDA que permiten analizar en una misma tarjeta desde 384 genes y una sola muestra hasta 48 genes y 8 muestras). Por Io tanto, de los experimentos realizados previamente mediante microarrays de Affymetrix hibridados con RNA de tejido se tenía que seleccionar un sub-conjunto de 384 genes. Se seleccionaron los genes más diferencialmente expresados entre tumores y controles (genes de diagnóstico) y también aquellos genes diferencialmente expresados entre los tres grupos tumorales: pTa BG, pT1 AG y pT2 AG (genes de pronóstico).
Por otro lado, dado que uno de los objetivos del proyecto era trabajar con fluidos vesicales, en esta fase del proyecto se pretendía poder estudiar estos 384 genes no con RNA de tejido, como se había estado haciendo hasta ahora, sino directamente con fluidos vesicales (orina o lavados vesicales).
2. Recogida y procesamiento de los lavados vesicales y orinas
Las muestras de lavado vesical fueron recogidas por barbotage intraoperatoriamente, antes de Ia resección del tumor vesical o antes de Ia cistectomía. Las muestras de orina fueron recogidas por micción espontánea antes de que el paciente entrase en Ia cirugía. Tanto las muestras de lavado vesical como las de orina eran transportadas al laboratorio en hielo inmediatamente después de ser recogidas. Las muestras se mezclaban con 1/25 volúmenes de 0.5M EDTA, pH8.0 y se centrifugaban a 1000 Xg durante 10 minutos. Los pellets celulares se resuspendían en 1 mi de TRIzol (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) y se congelaban a -8O0C hasta Ia extracción del RNA.
Se recogieron y almacenaron 425 muestras de lavado vesical tumoral, 30 muestras de
lavado vesical control, 43 muestras de orinas tumorales y 158 muestras de orinas controles.
3. Extracción del RNA y síntesis del cDNA
Los RNAs fueron extraídos siguiendo el protocolo del TRIzol (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) y se cuantificaron midiendo espectrofotométricamente Ia absorbancia a 260 nm.
El cDNA se sintetizó a partir de 1 ug de RNA utilizando el High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor, excepto que se disminuyó el volumen final de Ia reacción a 50 μl.
4. Selección de "TaqMan gene expression producís" y RT-PCR cuantitativa a tiempo real (αRT-PCR).
Una vez conocidos los genes de interés, se seleccionaron los primers y sonda fluorescente (TaqMan Assays-on-Demand™ Gene Expression Products) para Ia cuantificación de Ia expresión génica mediante qRT-PCR en Ia web de Applied Biosystems (http://www.appliedbiosystems.com/).
Se configuró una tarjeta multifluídica (TaqMan Low Density Array, TLDA) que contenía 384 ensayos que correspondían tanto a genes de diagnóstico, como a genes de pronóstico, como a los genes controles endógeno (figura 8). Esta configuración de TLDA permite analizar una sola muestra por tarjeta. En Ia tabla de Ia figura 8 se indica el nombre y símbolo del gen, así como el clon de Affymetrix en el que se encontró Ia expresión diferencial del gen. También se define el nombre del TaqMan Gene Expression Assay (http://www.appliedbiosystems.com/) seleccionado para Ia tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array. Este nombre de ensayo a su vez está indicando Ia región génica que se amplificará en Ia qRT-PCR. Finalmente, se indica uno de los transcritos mayoritarios que se amplificará con este ensayo (Ref Seq o
Gene Bank mRNA).
Las PCRs se realizaron en un ABI PRISM 9700 HD SDS (Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Se analizaron mediante TLDA de 384 genes un total de 60 muestras: - 39 muestras de lavado vesical tumoral
15 muestras de lavado vesical control 3 muestras orina tumoral
3 muestras de sangre periférica; esto se realizó dado que en el análisis anterior, basado en microarrays de Affymetrix, habíamos observado contaminación de tejido muscular en las supuestamente muestras puras de mucosa vesical y teníamos indicios para sospechar que en las muestras de fluidos vesicales pudiese haber contaminación debida al sistema inmune. Por ello se decidió analizar 3 muestras de linfocitos para poder eliminar por comparación aquellos genes que se expresasen mucho en sangre (dado que Ia sangre sería un contaminante constante en las muestras de fluido vesical procedente de pacientes con tumor vesical).
5. Análisis de las TLDA de 384 genes
Una vez realizadas todas las PCRs se establecieron los niveles de corte {thresholds) y niveles básales (baseline) más apropiados para cada gen y se calcularon los Ct (cicle threshold) o datos de expresión crudos mediante el programa SDS 2.1 (Applied Biosystems).
Posteriormente, se calculó Ia medida de expresión relativa de cada gen o delta Ct (Ct del gen diana - Ct del control endógeno, GUSB en nuestro caso) y se estudió como se agrupaban las muestras individuales mediante un cluster no supervisado (usando distancias euclidianas y UPGMA) (Figura 6). El primer nivel de clasificación que se observa en este cluster es Ia diferenciación entre las 3 muestras provenientes de sangre periférica y las muestras de los fluidos vesicales (lavados vesicales y orinas). Por otro lado, los fluidos vesicales se sub-agrupan en un conjunto de muestras que
agrupan en parte superior del cluster (desde Ia muestra B155-RV_T2alto hasta Ia B288-RV1_TaG2alto) y que está formado sólo por muestras de fluidos vesicales tumorales, y otro conjunto de muestras en Ia parte inferior del cluster (a partir de Ia muestra B71-RV_TaG2bajoCIS hasta Ia B109-RV_T2alto) que está formado por una mezcla de fluidos vesicales tumorales y controles. A su vez, dentro del cluster superior podemos diferenciar entre tumores de alto grado y bajo grado, mientras que en el inferior aparece una agrupación con casi sólo muestras controles y otra con mezcla de controles y tumores. Se ha de tener en cuenta que se ha pasado de analizar tejido en pooles a fluidos vesicales en muestras individuales, por Io que era relativamente previsible esta pérdida de potencia de discriminación mediante cluster.
El objetivo de este análisis era reducir el número de genes a estudiar en Ia siguiente fase, con un número mayor de muestras, de 384 a 96. Para el proceso de selección de los mejores genes se tuvieron en cuenta distintos parámetros, entre ellos el estadístico descrito anteriormente {mínimum fold change), pero también Ia proporción en escala logarítmica de las medianas de los 2 grupos comparados (median fold change) y un análisis manual individualizado por genes de los distintos valores de intensidad. Esto nos permitió reducir el grupo inicial de 384 genes a los 96 genes que requeríamos para Ia siguiente fase de experimentos (figura 9).
Ejemplo 4. Segunda selección de genes para incrementar Ia potencia diagnóstica/pronostica
En esta fase de nuestro trabajo el objetivo era conseguir aumentar Ia potencia de discriminación entre muestras tumorales y controles. Para ello, pretendíamos analizar un número mayor de muestras de fluido vesical y reducir, si era posible, al menos a Ia mitad el número de genes en los que se debería basar el prototipo inicial de nuestro sistema de diagnóstico y pronóstico.
1. Muestras a analizar y TLDA de 96 genes
Las tarjetas multifluídicas (TaqMan Low Density Arrays) que contenían 96 ensayos
(figura 9) se configuraron y procesaron de Ia misma manera que se hizo con las de 384 genes, con Ia diferencia que esta configuración de TLDA permite analizar 4 muestras por tarjeta.
Se analizaron mediante TLDA de 96 genes un total de 80 muestras:
- 42 muestras de lavado vesical tumoral
- 8 muestras de lavado vesical control 15 muestras orina tumoral
15 muestras orina control
2. Análisis de las TLDA de 96 genes
Dado que Ia tecnología utilizada en Ia fase anterior de experimentos (ejemplo 3) era exactamente Ia misma que en este ejemplo y los genes analizados en esta fase estaban ya incluidos en las TLDA de 384 genes analizadas previamente, se decidió extraer y sumar las 60 muestras del ejemplo 3, con los datos de las nuevas 80 muestras (Total= 140 muestras).
Se realizó un primer análisis mediante cluster no supervisado de las 140 muestras con las expresiones de los 96 genes y pudimos observar 2 grandes grupos claramente diferenciados (Figura 7). En el primer grupo (Figura 7.B) todas las muestras son tumorales sin excepción. En cambio, en el segundo grupo (Figura 7.A) Ia mayor parte de muestras son controles, pero hay algunas muestras tumorales, con un perfil genético no distinguible de las muestras normales. La conclusión que se podía extraer de este resultado era que Ia mayor parte de tumores presentaban unos perfiles genéticos característicos y diferenciados de las muestras control, aunque había algunos casos en los que el perfil general no se distinguía de una muestra normal y, por tanto, no podrían ser detectados. Estábamos observando otra vez el mismo efecto que para el ejemplo 3, aunque ahora nuestra capacidad de discriminación en las muestras era superior.
Basándonos en los datos que se habían observado de los clusters y en análisis
exploratorios propios intentando utilizar otros algoritmos de clasificación (como análisis lineal discriminante, k-nearest neighbor (KNN), etc.) se pudo observar que el problema de Ia discriminación de algunos tumores respecto a las muestras control persistía. La nueva hipótesis de trabajo fue que cualquier sistema de cálculo global de una medida discriminatoria utilizando un grupo de genes concreto tendría el mismo problema. Este consistía en que, debido a Ia elevada heterogeneidad de los tumores, resultaba relativamente fácil reconocer los perfiles de Ia mayoría, que tendrían alteraciones mayoritariamente parecidas, aunque siempre habría una minoría de casos para los que el comportamiento global de los genes seleccionados para su análisis no se distinguiría de las muestras controles, ya que tendrían alteradas vías minoritarias.
Para detectar tanto los tumores mayoritarios como los minoritarios, se estableció un "sistema de alarmas" mediante el establecimiento de un rango de valores entre los que oscilaban las muestras control y añadiendo un intervalo de confianza de manera que se pudiera determinar un punto a partir del cual una expresión que estuviera por encima (o por debajo en caso de los genes infraexpresados) fuera indicativa de tumor, independientemente de los valores de expresión observados en los otros genes. La ventaja de este sistema es que, aunque el tumor presente perfiles generales de expresión parecidos a muestras sanas, si uno de los genes alarma se dispara, permite afirmar que nos encontramos frente a una muestra tumoral.
El primer paso en el desarrollo de dicho sistema fue Ia estimación de los rangos de expresión de los controles y sus intervalos de confianza. Ya que ahora era muy importante que en los valores controles no hubiera errores técnicos, que alterarían falsamente los rangos, se decidió eliminar aquellos controles que no presentaran un nivel de calidad mínimo. Para calcular esta medida de calidad se utilizaron 3 genes (GUSB, 18S y PPIA) que además sirvieron como controles endógenos (calculando su media geométrica) para Ia cuantificación relativa de todos los genes. Analizando el comportamiento individual de Ia distribución de cada gen no se pudo verificar que se cumpliera un ajuste suficiente a una distribución normal, por Io que no se pudo establecer unos intervalos de confianza basados en su varianza. Como alternativa, se decidió establecer unos intervalos de confianza arbitrarios y fijos con distintos niveles
de estringencia (como punto de corte se decidió utilizar el doble, 4 veces u 8 veces el valor del control con valores de expresión más parecidos a los tumores).
Una vez determinado el punto de corte para cada gen, se sumarizó toda esta información en una matriz con los 96 genes contra las muestras tumorales. Se marcaron con 0 los valores que no superaron el nivel de corte y con 1 los que si Io superaron (para cada nivel de estringencia). Para seleccionar los mejores genes (con los que se pretendía reducir el perfil al menos a 48) se tuvieron en cuenta dos propiedades: 1 ) que el gen pudiera detectar un gran número de tumores (buscando los que tuvieran una mayor suma de valores 1 ) y 2) que esta detección fuera el máximo de independiente de otros genes alarma (para poder detectar el máximo de vías minoritarias).
Como resultado, se hubiera podido reducir el número de genes interesantes a menos de 48, aunque por razones técnicas y siendo conservadores se decidió mantener este número para su análisis en fases posteriores, ya que algunos intervalos en los controles podrían no ser completamente correctos (debido al bajo número de muestras control analizadas hasta el momento).
Para automatizar el proceso de análisis de nuevas muestras a partir del perfil genético de los 48 genes seleccionados (figura 10) se creó un programa informático que partiendo de los resultados de Cts obtenidos de Ia qRT-PCR es capaz de realizar una predicción diagnóstica. Este programa es capaz de utilizar distintos ficheros de parámetros (dependiendo de Ia estringencia en los intervalos), con Io que los valores de sensibilidad (SN) y especificidad (SP) varían. Utilizando el fichero de parámetros menos estringente (punto de corte al doble del control más cercano a los tumores) se obtuvo SN=100% y SP=100%. En el caso del segundo fichero de parámetros (punto de corte 4 veces del control más cercano a los tumores) se obtuvo SN=98,96% y SP=100%. En el último caso (punto de corte 8 veces el peor control) se obtuvo SN=97,93% y SP=100%. Es importante señalar que estos resultados se han obtenido sobre las mismas muestras utilizadas para generar los ficheros de parámetros, por Io que probablemente se esta produciendo una sobreestimación (overfítting) que seria
necesario estimar en experimentos posteriores con muestras nuevas.
Ejemplo 5. Desarrollo de un modelo final de diagnóstico
Los objetivos en esta fase del proyecto eran probar y mejorar el modelo de predicción de tumores así como reducir al mínimo el número de genes utilizados para realizar Ia predicción.
Para esta fase fue necesario ampliar mucho más el conjunto de muestras tanto tumorales como normales. Se analizaron 440 nuevas muestras mediante tarjetas microfluídicas de 48 genes, que se han añadido a los datos del ejemplo 3 (60 muestras) y del ejemplo 4 (80 muestras).
Una vez realizados los controles de calidad mínimos en las muestras, se procedió a analizarlas mediante el modelo cualitativo de alarmas descrito previamente. El resultado que obtuvimos (SN=O.81 y SP=O.81 ) difería bastante del obtenido con el modelo final del ejemplo 4, por Io que se decidió intentar mejorarlo, ya que probablemente tenía bastante sobreentrenamiento.
A partir de Ia observación de los histogramas de frecuencias discretizadas de cada uno de los genes, se pudo observar como se distribuían las muestras tanto tumorales como controles. Debido al hecho de haber aumentado mucho el muestreo, el límite de solapamiento entre las distribuciones se había reducido de forma importante. También se pudo observar que, aunque en muy baja frecuencia, algunos casos controles tenían unos niveles de expresión muy parecidos a los tumores.
Aunque, a nivel conceptual, el sistema cualitativo de alarmas desarollado se seguía considerando una buena aproximación al comportamiento celular de las expresiones génicas, el no poder cuantificar Ia importancia de cada uno de los genes representaba una seria limitación al poder predictivo del mismo.
En base al mismo concepto de alarmas se decidió intentar desarrollar un modelo
cuantitativo, lo cual fue posible utilizando el teorema de las probabilidades condicionadas de Bayes.
Ya que el número de muestras analizadas es suficientemente elevado, se puede estimar a partir de las frecuencias de expresión observadas las probabilidades de que dado un valor de expresión Ia muestra sea o un tumor o un control.
Una de las ventajas de un modelo basado en el teorema de Bayes es que se puede aplicar a cada gen sensor de forma independiente. La expresión génica observada modificará Ia probabilidad que se tenía a priori de ser un tumor dando una probabilidad a posteriori, Ia cual podrá ser usada de nuevo como probabilidad a priori para el siguiente gen. De hecho, implícitamente se está asumiendo independencia entre los distintos genes.
El número final de muestras sobre las que se ha podido aplicar el modelo fue de 308 tumores y 156 controles.
Cuando se aplicó nuestro modelo iterativamente sobre los 48 genes se obtuvo una mejora significativa en el poder de predicción del modelo cualitativo anterior (SN=O.86 y SP=O.92), aunque estudiando los histogramas de frecuencias pudimos observar que muchos genes parecían no aportar información significativa al modelo final. Por tanto, se propuso seleccionar el subconjunto de genes suficiente y necesario para capturar el máximo de información diagnóstica de las muestras.
Utilizando el modelo cuantitativo no se tenía una forma clara de realizar Ia selección de genes más interesantes. El antiguo modelo cualitativo si que permitía seleccionar los genes más informativos y, a Ia vez, con una mayor independencia entre ellos. El resultado de utilizar los mejores genes detectados con el modelo cualitativo (CTSE, MAGEA3, CRH, SLC1A6, PPP1 R14D, IGF2, C14orf78 y KLF9) sobre el nuevo modelo cuantitativo mostró una mejora importante en los resultados (SN=O.89 y SP=0.96).
De todas formas, se decidió intentar otras aproximaciones. A partir del análisis visual
de los histogramas de frecuencias de los 48 genes, se seleccionó el subconjunto aparentemente más informativo (ANXA10, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, POSTN, SLC1A6 y TERT) y con histogramas más variados entre si (esperando que este hecho indicara una mayor independencia entre ellos). El resultado obtenido también mostraba una mejora significativa respeto al análisis de los 48 genes (SN=O.90 y SP=O.96).
Finalmente, ya que tanto el subconjunto de genes obtenidos mediante el modelo cualitativo como los genes seleccionados visualmente mostraban mejoras respecto al modelo cuantitativo inicial, se decidió combinar los genes de las 2 aproximaciones (ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D,
SLC1A6 y TERT). El resultado del modelo combinado fue ligeramente mejor que cualquiera de ellos (SN=0.91 y SP=0.96).
Una vez obtenido el modelo, se decidió estudiar si existía algún patrón común tanto en los tumores como en los controles mal clasificados. En el caso de los controles, se pudo detectar una presencia significativa de muestras con tumores en contacto con el sistema urinario (tumores de próstata, de riñon y de pene principalmente).
Probablemente, este tipo de muestras tienen patrones de expresión comunes con los tumores de vejiga, con Io que pueden confundir al método de predicción. Por tanto, se decidió eliminar de las muestras control todos aquellos casos con tumores que pudieran encontrarse en contacto con el sistema urinario.
El número de muestras control descendió de 156 a 126, quedando igualmente 308 muestras tumorales. Utilizando el modelo cuantitativo con los 48 genes sobre esta nueva población se observó una mejora importante (SN=O.90 y SP=O.93). En el caso de los 8 genes más independientes se obtuvo: SN=O.91 y SP=O.97. En el subconjunto con los histogramas más interesantes se obtuvo: SN=O.91 y SP=0.97. Finalmente, en el subconjunto combinado de genes se obtuvo: SN=O.93 y SP=O.97. Volviendo a calcular los datos con cada subconjunto seleccionado previamente podemos ver que en general se había conseguido aumentar Ia potencia del modelo eliminando este tipo de controles.
En Io referente al estudio de los tumores mal clasificados, se detectó un incremento significativo en el número de cistectomias presentes en este grupo. Se cree que Ia previa resección transuretral (RTU) que frecuentemente se realiza muy cercana en el tiempo a Ia cirugía radical podría estar alterando el perfil molecular que se observó, ya que las masas tumorales han sido retiradas físicamente de forma parcial o total de las paredes epiteliales de Ia vejiga. Aunque en este estudio no se han eliminado los casos de cistectomia por no ser los datos concluyentes, es recomendable no incluir este tipo de muestras en el análisis de nuevas poblaciones.
Ejemplo 6. Desarrollo de un modelo final de pronóstico
Aunque Ia preocupación más importante era Ia predicción tumoral (predicción de diagnóstico) también se estaba interesado en clasificar los distintos tipos de tumores (predicción de pronóstico), Io cual constituye el objetivo principal de este apartado. Esta clasificación podría permitir personalizar más el tratamiento en cada caso.
La clasificación tumoral se basa actualmente en Ia observación macroscópica y microscópica en el laboratorio de anatomía patológica. Mediante unas observaciones más o menos estandarizadas basadas en Ia profundidad del tumor y en el aspecto microscópico de las células se decide su clasificación. Estudios moleculares recientes parecen indicar que en realidad hay dos perfiles genéticos diferenciales que mayoritariamente separan los tumores de tipo superficial y los tumores infiltrantes.
Para poder realizar un modelo de clasificación de pronóstico se necesitaría tener los distintos grupos tumorales correctamente separados. Las observaciones anatomo- patológicas no garantizan Ia correspondencia con el comportamiento a nivel molecular de las muestras, por Io que no parecía buena idea derivar un modelo pronóstico únicamente a partir de esta clasificación. Se optó por utilizar un sistema de clasificación mediante cluster no supervisado (que mayoritariamente separaba las muestras en 2 grandes grupos) además de tener en cuenta Ia gradación anatomo-patológica (AP).
Como grupo de muestras tumorales superficiales válidas era necesario que agruparan
según el cluster en el conjunto que les correspondía y según AP debían ser tumores Ta, T1 grado bajo y sin carcinoma in situ (cis) asociado. Los tumores infiltrantes debían pertenecer al grupo correspondiente del cluster y según AP debían ser tumores tipo T1 alto grado, T2, T3 o T4 y cualquier tumor con presencia de CIS.
En el grupo de muestras definido como superficiales se clasificaron 129 de los 308 tumores. En el grupo definido como infiltrantes se clasificaron 100 de los 308. Finalmente, 79 muestras tumorales o presentaban discordancias entre su clasificación por anatomo-patológica y su perfil molecular o no quedaban claramente definidas dentro de los dos grupos mayoritarios del cluster.
La metodología utilizada para crear un modelo que discriminara entre tumores superficiales e infiltrantes es exactamente Ia misma que Ia utilizada en el ejemplo 5 para obtener un modelo diagnóstico.
Cuando se aplicó el teorema de Bayes utilizando los 48 genes se obtuvo una buena clasificación (SN=O.97 y SP=0.96).
Analizando los histogramas de frecuencias se pudo observar que los genes interesantes para diagnóstico coincidian en gran medida con los genes de pronóstico.
Sin embargo, habia algunos genes (MCM 10 y ASAM) que no eran adecuados para diagnóstico y sí para pronóstico, por Io que estos dos fueron añadidos a los 12 genes previamente seleccionados. El modelo de 14 genes resultante demostró funcionar casi a Ia perfección (SN=O.99 y SP=LOO). En Ia tabla 1 se incluyen los 14 genes, indicando el símbolo del gen y el nombre del TaqMan Gene Expression Assay seleccionado para
Ia tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array.
Tabla 1
ANXA10 Hs00200464 m1
C14orf78 Hs00746838 s1
CTSE HsOOI 57213 m1
CRH HsOOI 74941 m1
IGF2 HsOOI 71254 m1
KLF9 Hs00230918 m1
KRT20 Hs00300643 m1
MAGEA3 Hs00366532 m1
POSTN HsOOI 70815 m1
PPP1R14D Hs00214613 m1
SLC1A6 HsOOI 92604 m1
TERT HsOOI 62669 m1
ASWM* P* .-- Hs00293345'im1
MCM'10 "' Hs00218560 m1
Claims
1. Método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT,
ASAM y MCM 10; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
2. Método in vitro no invasivo, según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia muestra de fluido vesical es orina.
3. Método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
4. Método in vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical Ia expresión de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
5. Método, según Ia reivindicación 4, que comprende Ia detección y cuantificación del gen C14orf78.
6. Método, según Ia reivindicación 4, que comprende Ia detección y cuantificación del gen KLF9.
7. Método, según Ia reivindicación 4, que comprende Ia detección y cuantificación del gen POSTN.
8. Método, según Ia reivindicación 4, que comprende Ia detección y cuantificación del gen PPPIR14D.
9. Método, según Ia reivindicación 4, que comprende Ia detección y cuantificación del gen ASAM.
10. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, que comprende adicionalmente Ia detección y cuantificación de al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
11. Método in vitro no invasivo para diagnosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH,
IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
12. Método in vitro no invasivo para diagnosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1 A6 y TERT; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
13. Método in vitro no invasivo para diagnosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical Ia expresión de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
14. Método, según Ia reivindicación 13, que comprende Ia detección y cuantificación del gen C14orf78.
15. Método, según Ia reivindicación 13, que comprende Ia detección y cuantificación del gen KLF9.
16. Método, según Ia reivindicación 13, que comprende Ia detección y cuantificación del gen POSTN.
17. Método, según Ia reivindicación 13 que comprende Ia detección y cuantificación del gen PPPIR14D.
18. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, que comprende adicionalmente Ia detección y cuantificación de al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
19. Método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de Ia combinación de genes ASAM y MCM 10; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
20. Método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical que comprende:
a. recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto; b. detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical Ia expresión del gen ASAM; y c. comparar los resultados obtenidos en Ia etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
21. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Ia cuantificación de Ia expresión de los genes en b) se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
22. Empleo de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2,
KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM 10 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
23. Empleo de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
24. Empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM y sus combinaciones, como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
25. Empleo, según Ia reivindicación 24, del gen C14orf78 como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
26. Empleo, según Ia reivindicación 24, del gen KLF9 como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
27. Empleo, según Ia reivindicación 24, del gen POSTN como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
28. Empleo, según Ia reivindicación 24, del gen PPP1 R14D como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
29. Empleo, según Ia reivindicación 24, del gen ASAM como marcador de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
30. Empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10, como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
31. Empleo de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2,
KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
32. Empleo de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico del cáncer vesical.
33. Empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D y sus combinaciones como marcadores de diagnóstico del cáncer vesical.
34. Empleo, según Ia reivindicación 33, del gen C14orf78 como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
35. Empleo, según Ia reivindicación 33, del gen KLF9 como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
36. Empleo, según Ia reivindicación 33, del gen POSTN como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
37. Empleo, según Ia reivindicación 33, del gen PPP1 R14D como marcador de diagnóstico del cáncer vesical.
38. Empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT, como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
39. Empleo de Ia combinación de genes ASAM y MCM10 como marcadores de pronóstico del cáncer vesical.
40. Empleo del gen ASAM como marcador de pronóstico del cáncer vesical.
41. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical, para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 1 , que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10.
42. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical, para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 3, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
43. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 4, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones.
44. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 10 que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones, y al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6,
TERT y MCMIO.
45. Kit de diagnóstico del cáncer vesical, para llevar a cabo el método de Ia reivindicacación 11 , que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes
ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT.
46. Kit de diagnóstico del cáncer vesical, para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 12, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
47. Kit de diagnóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 13, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones.
48. Kit de diagnóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 18, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación de un gel seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones, y al menos un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
49. Kit de pronóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 19, que comprende un set de sondas adecuado para Ia detección y cuantificación del patrón de expresión de Ia combinación de genes ASAM y MCM10.
50. Kit de pronóstico del cáncer vesical para llevar a cabo el método de Ia reivindicación 20, que comprende una sonda adecuada para Ia detección y cuantificación del gen ASAM.
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