WO2008096028A1 - Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtención y sus usos - Google Patents

Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtención y sus usos Download PDF

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WO2008096028A1
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mitramycin
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group
subject
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PCT/ES2008/070015
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Jürgen ROHR
Irfan Baig
José Antonio SALAS FERNÁNDEZ
Alfredo FERNÁNDEZ BRAÑA
Carmen MÉNDEZ FERNÁNDEZ
María PÉREZ SOLARES
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University Of Kentucky Research Foundation
Universidad De Oviedo
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the invention is attached to the pharmaceutical field and specifically refers to 5 compounds with application in oncology, with chemical structure derived from mitramycin and which are obtained by fermentation of microorganisms.
  • Mithramycin is an antitumor drug produced by i or microorganisms of the genus Streptomyces, including Streptomyces argi ⁇ aceus ATCC
  • This drug is the most important representative of the aureolic acid group, and is used for the treatment of testicular carcinoma, Paget's disease and hypercalcemia caused by bone lesions associated with cancer (Oncology 1973, 28,147-
  • MTM is also a neuroprotective agent that could be useful for the treatment of neurological diseases such as stroke, amyotrophic lateral sclerosis, disease of
  • the chemical structure of the MTM is shown in Fig. 1.
  • the group of aureolic acid compounds includes MTM, chromomycin A 3 , olivomycin A, UCH9 and durhamycin (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). They all contain a
  • a tricyclic nucleus of polycytic origin with a highly functionalized side chain on carbon 3.
  • the residue on carbon 7 can be a hydrogen atom or a short chain alkyl.
  • these compounds have 4-6 deoxy sugars bound together in the form of trisaccharide or tetrasaccharide (in carbon 2) and monosaccharide or disaccharide (in carbon 6).
  • Aureolic acid compounds differ in nature and
  • MTM in Streptomyces argillaceus includes the condensation of 10 units of acylcoenzyme A to generate a tetracyclic intermediate, called premitramycinone
  • Fig. 2 Then, 5 units of deoxy sugars are added successively, generating tetracyclic intermediates with 3 sugars and 5 sugars. MtmGIII and MtmGIV glycosyltransferases are responsible for the formation of trisaccharide, while MtmGI and MtmGII glycosyltransferases catalyze the formation of disaccharide. Finally, the rupture of one of the rings, followed by the reduction of a keto group in the side chain, generates the MTM.
  • the present invention provides new bacterial strains derived from Streptomyces argillaceus. These strains are obtained by introducing certain additional nucleic acids into existing bacterial strains, which may be: (a) Streptomyces argillaceus, or (b) strains derived from Streptomyces argillaceus.
  • the strains of section (b) can be obtained (among other methods) by inactivating one (or several) of the genes responsible for mitramycin biosynthesis, and are useful for obtaining MTM derivatives (US 2005/0192432 Al; J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753; J Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1606-1614; Mol. Gen. Genet.
  • strain of section (b) is Streptomyces argillaceus M7U1, which was obtained from Streptomyces argillaceus by inactivating the mtmU gene ⁇ Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835).
  • the mtmU gene encodes a 4-ketoreductase involved in D-oliosa biosynthesis, and its inactivation results in accumulation of premitramycin and premitramycin A.
  • Another example of strain of section (b) is Streptomyces argillaceus M7W1, which was obtained from Streptomyces argillaceus by inactivation of the mtmW gene (US 2005/0192432 Al; J Am.
  • the mtmW gene encodes a ketoreductase, and its inactivation results in accumulation of desmicarosil-MTM-SK, MTM-SA, MTM-SDK, and MTM-SK.
  • the introduction of nucleic acids into Streptomyces argillaceus (or derived strains) can be performed by transformation of protoplasts, conjugation, or other known methods (such as described in Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000) , so that nucleic acids are replicable in the organism, either in the form of an extrachromosomal element or integrated into the chromosome of the organism.
  • nucleic acids encode enzymes for the biosynthesis of different sugars; Such sugars are not normally produced by Streptomyces argillaceus.
  • nucleic acids usable for the present invention are those contained in the following plasmids (which are cited by way of examples): pLNBIV (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65 , 1685-1689), pRHAM (J Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000, 2, 271-276), pLN2 (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729), pLNR (Chem. Biol. 2002, 9, 721 -729), and pFL845 (Chem. Commun. (Camb).
  • the aforementioned plasmids contain nucleic acids that encode enzymes for the biosynthesis of the following sugars (in the form of NDP derivatives), respectively: L-digitoxose, L-rhamnosa, L-olivosa, D-olivosa, and D-amicetosa.
  • nucleic acids may be used in the present invention, which encode enzymes for the biosynthesis of other sugars not mentioned.
  • the bacterial strains of this invention can be grown in any suitable medium, under conditions that allow their growth, as described in Gene 1996, 172, 87-91; J Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937; J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753. After several days of incubation, these cultures contain a high amount of cells (mycelium), together with a mixture of compounds, including MTM derivatives. Next, the cultures are subjected to processes for the separation of a liquid phase (supernatant) and a solid phase (mycelium).
  • MTM derivatives are antitumor agents and also act as neuroprotective agents.
  • the present invention provides compounds characterized by the following formula (I):
  • Ri is hydrogen, hydroxyl (OH), a hydroxyl group protected with a protecting group, a monosaccharide of formula (II)
  • R 2 is hydrogen, a proctor group, a monosaccharide of formula (III),
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 and R 8 , R 10 , R 1 1, R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 20 , R 21 , R 22 , R 23 and R 24 , R 25 , R 26 , R 27 , R 28 , R 29 , R 30 , R 31 are each and independently, hydrogen or a protecting group;
  • R 9 is hydrogen, a methyl group, or an alkyl group; and the stereochemistry of carbons a, b, c, d and e is R, S or mixture of both.
  • the protecting group may consist of an alkyl group, a cycloalkyl group, a heterocyclic cycloalkyl group, a hydroxyalkyl group, a halogenated alkyl group, an alkoxyalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heterocyclic aryl group, a alkylaryl group, an ester group, a carbonate group, a carboxylic acid group, an aldehyde group, a ketone group, a urethane group, a silyl group, a sulfoxo group or a combination thereof.
  • R 3 , R 4 , R 5 and R ⁇ 5 are hydrogen; O well
  • R3, R 4 , R 5 , R 6 , R7 and Rs are hydrogen; O well
  • R 9 is methyl; or the stereochemistry at carbons a, b, c and d is S, and the stereochemistry at carbon e is R; O well
  • the present invention provides, among others, the compounds with the following formulas (VIII, IX, X, XI, XII, XIII):
  • the compounds of the invention are tumor growth inhibitors and are therefore useful in the treatment of cancer.
  • compositions comprising an effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof together with a pharmaceutically acceptable excipient are object of the present invention.
  • inhibit means decrease, slow down, or stop. Therefore, a compound of this invention can decrease, slow down, or stop the growth of a tumor cell.
  • growth means increase in size, or proliferation, or both.
  • a compound of this invention may inhibit the increase in size of a tumor cell and / or may prevent the tumor cell from dividing and increase the number of tumor cells.
  • a cell tumor is a cell that constitutes a neoplasm (new growth), which can be cancerous (malignant) or non-cancerous (benign).
  • a cancerous tumor cell can invade the normal tissues around it and blood / lymphatic vessels and form metastases in tissues away from the original tumor.On the contrary, a non-cancerous tumor cell can grow and compress adjacent normal tissues but cannot invade normal tissues and blood / lymphatic vessels, nor can it metastasize in tissues away from the original tumor.
  • the object of the present invention is also a method of treating a subject, including a human being, diagnosed with cancer, which consists in treating said subject with a therapeutically effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate.
  • a "subject" may include domesticated animals (for example, cats, dogs, etc.), livestock (for example, cows, horses, pigs, sheep, goats, etc.), laboratory animals (for for example, mice, rabbits, guinea pigs, etc.) and birds.
  • the subject is a mammal such as a primate and, more preferably, a human being.
  • an "effective amount" of a compound is that amount necessary to achieve the desired result.
  • the effective amount of a compound of the present invention treats cancer by inhibiting the growth of the cells that constitute the tumor, thereby preventing invasion of normal tissues and blood / lymphatic vessels by tumor cells and therefore prevents metastasis.
  • cancers examples include, but are not limited to, lung, colon, ovary, prostate, testis, melanoma, kidney, breast, central nervous system and leukemia.
  • acceptable pharmaceutical composition consists of a biologically suitable material, that is, that the material can be administered to the subject without causing substantially harmful biological effects.
  • the doses or amounts of the compounds of the invention must be large enough to produce the desired effect. However, the dose should not be so large that it causes adverse side effects, for example, unwanted cross reactions, anaphylactic reactions, and the like. Generally, the dose will vary with the age, condition, sex and degree of the subject's disease, and can be determined by any person skilled in the art. The dose can be adjusted by each doctor, based on the clinical condition of the subject involved. The dose, dosage regimen and route of administration may be varied. The doses and dosing regimen currently used for MTM provide guidance for the dosages and dosing regimen that can be used for new MTM derivatives (see for example Cancer Treat. Rep. 1979, 63, 1835-1838; Ann Intern. Med. 1975, 83, 659-660).
  • the subject of the present invention is also a method of treating a subject, including a human being, diagnosed with Paget's disease, which it consists in treating said subject with a therapeutically effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate.
  • the subject may be a mammal, preferably a human being, and the compound may be, inter alia, administered parenterally.
  • the subject of the present invention is also a method of treating a subject, including a human being, diagnosed with hypercalcemia, which consists in treating said subject with a therapeutically effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate.
  • the subject may be a mammal, preferably a human being, and the compound may be, inter alia, administered parenterally.
  • the object of the present invention is also a method of treating a subject, including a human being, diagnosed with hypercalciuria, which consists in treating said subject with a therapeutically effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate.
  • the subject may be a mammal, preferably a human being, and the compound may be, inter alia, administered parenterally. It is also the object of the present invention to use a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of neurological diseases.
  • the subject of the present invention is also a method of treating a subject, including a human being, diagnosed with a neurological disease, which consists in treating said subject with a therapeutically effective amount of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate. acceptable.
  • the subject may be a mammal, preferably a human being, and the compound may be, inter alia, administered parenterally.
  • neurological diseases that can be treated include, but are not limited to, neurodegenerative diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, and Huntington's.
  • the compounds of the invention may be useful for research in biochemistry or cell biology.
  • the compounds may be useful for blocking the expression of c-Src (and other SpI-dependent enzymes) in osteoclasts or other cell types.
  • any of the compounds of the invention can be used therapeutically as part of an acceptable pharmaceutical composition.
  • Any person skilled in the art can create acceptable pharmaceutical compositions, which may consist of sterile solutions in water, saline solutions, or buffered solutions at physiological pH.
  • Any of the compounds of the invention can be prepared in the form of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical compositions may include various transport agents, thickeners, diluents, buffers, preservatives, surfactants, and others, in addition to the compound of the invention.
  • the pharmaceutical compositions may also include active ingredients such as antimicrobial, anti-inflammatory, anesthetic agents, etc.
  • the compounds of the invention can be administered to the subject in several different ways, depending on whether it is desired that the treatment be local or systemic, and depending on the area to be treated.
  • a compound of the present invention can be administered in the form of an ophthalmic solution, for application on the surface of the eye.
  • a compound can be administered to a subject vaginally, rectally, intranasally, orally, by inhalation, or parenterally, either intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intrarectally, intraarterially, intralymphatically, intravenously, intrathecally and intratracheally.
  • Parenteral administration if used, is generally performed by injection.
  • Injectables can be prepared in various forms, such as liquid solutions or suspensions, solid forms suitable to be dissolved or suspended before injection, or as emulsions.
  • parenteral administration employ slow or sustained release systems, so that a constant dose is maintained (see, for example, US Patent 3,710,795).
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions, which may also contain buffers and diluent additives and others.
  • non-aqueous solvents are: propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl leato.
  • aqueous solvents are: water, alcoholic-aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered solutions.
  • parenteral vehicles examples include: sodium chloride solution, Ringer's dextrose, sodium chloride and dextrose, etc. Preservatives and other additives may also be present, such as, for example, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, inert gases, etc.
  • Formulations for topical administration may include creams, lotions, gels, drops, suppositories, sprays, liquids and powders. Certain conventional pharmaceutical carriers, aqueous, oily, or powdered bases, thickeners, etc. may also be necessary or desirable.
  • Compositions for oral administration may include powders or granules, suspensions or solutions in water or non-aqueous medium, capsules, or tablets.
  • the term “derivative” of mitramycin should be interpreted as a compound covered by the general formula I.
  • the term “prodrug” of mitramycin should be interpreted for the purposes of present invention and the description thereof, as any compound that releases, when circulating in blood or entering the cell, mitramycin or a derivative, according to general formula I, thereof.
  • Example 1 Obtaining the bacterial strain Streptomyces argillacem (pLNBIV).
  • the strain Streptomyces argillaceus (pLNBIV) was generated by the introduction of plasmid pLNBIV in Streptomyces argillaceus ATCC 12956.
  • the introduction of the plasmid was carried out by transformation of protoplasts, following standard procedures (Kieser et al, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation,
  • Plasmid pLNBIV has been described previously, and contains a series of genes encoding nucleosidyldiphosphate (NDP) -L-digitoxose biosynthesis (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65 , 1685-1689).
  • NDP nucleosidyldiphosphate
  • strain Streptomyces argillaceus (pLNBIV) was deposited on 11/15/2006 in the
  • Burjassot 46100 Burjassot (Valencia, Spain) with the access number CECT 3384.
  • Example 2 Production of desmicarosyl-3D- ⁇ -D-digitoxosyl-MTM (formula VIII), desoliosyl-3C- ⁇ -L-digitoxosil-MTM (formula IX), desoliosyl-3C- ⁇ -D-mycarosyl-MTM (formula X), and 3A-desolivosyl-MTM (formula XI).
  • the S. argillaceus strain (pLNBIV) was grown in R5A medium using a two-step culture method, as described above (J Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). In the production step, 8 Erlenmeyer flasks of 2 liters were used, each containing 400 ml of medium, which were incubated for 5 days. The cultures were centrifuged and filtered, and the broth was extracted in solid phase as described (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531).
  • the obtained fractions were analyzed by HPLC-MS using chromatographic equipment coupled to a ZQ4000 mass spectrometer (Waters - Micromass), using acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water as solvents, and a reverse phase column (Symmetry C 18, 2.1 x 150 mm, Waters).
  • the samples were eluted with 10% acetonitrile during the first 4 min., Followed by a linear gradient 10-88% acetonitrile for 26 min., At a flow of 0.25 ml / min.
  • the detection and spectral characterization of the peaks was performed with a photodiode detector and Empower software (Waters).
  • the MS analyzes were done by electrospray ionization in positive mode, with a capillary voltage of 3 kV and cone voltages of 20 and 100 V. Those fractions containing MTM derivatives (eluting between 45 and 55 min.) Were gathered and dried in a vacuum.
  • This extract was redissolved and chromatographed on a ⁇ Bondapak C18 radial compression column (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters). An isocratic elution was used with a mixture of acetonitrile and 0.1% TFA in water (42:58), at 10 ml / min.
  • Desmicarosil-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM and 3A-desolivosil-MTM were repurified in a semi-preparative column (Symmetry C18, 7.8 x 300 mm, Waters) with isocratic elution with acetonitrile and 0.1% TFA in water (37: 63), at 3 ml / min.
  • Desoliosyl-3C- ⁇ -L-digitoxosil-MTM and desoliosyl-3C- ⁇ -D-mycosyrosyl-MTM were also repurified using the same column and the same solvents, but changing the mixture to 45:55.
  • Electrospray ionization mass spectra were acquired using a Thermo Finnigan LCQ mass spectrometer, with introduction of the sample by direct diffusion.
  • MS-MS spectrometry on pseudomolecular ion was performed in both + ve and -ve modes to study the fragmentation pattern of the molecule.
  • UV spectra were obtained with a Varian CARY50 spectrometer, and IR spectra were obtained from KBr discs on a Nicolet Magna IR-560 spectrometer. All NMR data were obtained on pyridine d5, using a Varian Inova instrument of 400 MHz, except for 13 C broadband spectra, which were obtained at 50.3 and 75.4 MHz in 200 and 300 MHz Inova Vary spectrometers, respectively. The ⁇ values were adjusted in reference to the solvent peaks ( ⁇ 8.74 ppm and ⁇ 150.35 ppm for 1 H and 13 C NMR, respectively).
  • Example 3 Obtaining the bacterial strain Streptomyces argillaceus (pFL845).
  • Streptomyces argillaceus strain (pFL845) was generated by the introduction of plasmid pFL845 into Streptomyces argillaceus.
  • the introduction of plasmid seo was carried out by transformation of protoplasts, following standard procedures (Kieser et al, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000).
  • Plasmid pFL845 has been described previously, and contains a series of genes encoding the nucleosidyldiphosphate (NDP) -D-amycetosa biosynthesis (Chem. Commun. (Camb). 2005 Mar 28; (12): 1604-6).
  • strain Streptomyces5 argillaceus (pFL845) was deposited on 11/15/2006 in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Burjassot Campus, 46100 Burjassot (Valencia, Spain) with the access number CECT 3383.
  • Example 4 Production of desmicarosil-MTM (formula XII) and 6-dediolivosyl-6- ⁇ - or D-amicetosyl-MTM (formula XIII).
  • this strain was grown in 8 2 L flasks containing 400 ml of R5A medium supplemented with thioestreptone (5 ⁇ g / ml cf). After 6 days of incubation at 3O 0 C, the cultures were centrifuged, filtered and a solid phase extraction was performed.5 Subsequently, the extract was subjected to a first chromatography using a ⁇ Bondapak C 18 cartridge. Elution was performed at 10 ml / min using a mixture of acetonitrile and TFA in water as mobile phase (42:58).
  • Table 5 shows the data of 1 H-NMR and 13 C-NMR.
  • Example 5 Obtaining the bacterial strain Streptomyces argillacem (pFL942).
  • Streptomyces argillaceus strain (pFL942) was generated by the introduction of plasmid pFL942 into Streptomyces argillaceus. Plasmid introduction was performed by protoplast transformation, following standard procedures
  • Plasmid pFL942 has been described previously, and contains a series of genes that encode nucleosidyldiphosphate (NDP) -Licamate biosynthesis (Chemistry & Biology. 2004, (11): 1709-18).
  • NDP nucleosidyldiphosphate
  • the strain Streptomyces argillaceus (pFL942) was deposited with date / 02/08 in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Burjassot Campus, 46100 Burjassot (Valencia, Spain) with the CECT access number
  • this strain was cultured in R5A solid medium. 100 agar plates and spores after 6 days incubation was uniformly inoculated to 28 0 C, the cultures were extracted 3 times with ethyl acetate. Subsequently, the extract was subjected to a first chromatography using a radial compression cartridge ⁇ Bondapak C 18. Elution was performed at 10 ml / min using as a mobile phase a mixture of acetonitrile and TFA in water (50:50).
  • Example 7 Obtaining the bacterial strain Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845).
  • Streptomyces argillaceus M7U1 strain (pFL845) was generated by introducing plasmid pFL845 into Streptomyces argillaceus M7U1.
  • the plasmid was introduced by protoplast transformation, following standard procedures (Kieser et al., Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000).
  • the strain Streptomyces argillaceus M7U1 has been described previously ⁇ Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835).
  • Plasmid pFL845 has been described previously, and contains a series of genes encoding the nucleosidyldiphosphate biosynthesis (NDP) -D-D-amicetosa (Chem. Commun. (Camb). 2005 Mar 28; (12): 1604-6 ).
  • the strain Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845) was deposited with date / 02/08 in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Burjassot Campus, 46100 Burjassot (Valencia, Spain) with the CECT access number
  • Example 8 Production of 6-desdiolivosyl-6- ⁇ -D-amicetosyl desoliosyl-desmicarosyl-3C- ⁇ -D-boivinosyl-MTM (formula XVIII); desoliosyl-desmicarosil-3C- ⁇ -D-olivosyl-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM (formula XIX); 6-desdiolivosyl-6- ⁇ -D-amytostosyl-desoliosyl-desmicarosyl-3C- ⁇ -D-olivosyl-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM (formula XX) and 6- dediolivosyl-6- ⁇ -D-amytostosyl- desoliosil-3C- ⁇ -D-olivosil-MTM (formula XXI).
  • Example 9 Antitumor activity of desmicarosil-3D- ⁇ -D-digitoxosyl-MTM (formula VIII), desoliosyl-3C- ⁇ -L-digitoxosil-MTM (formula IX), desoliosyl-3C- ⁇ -D-micarosil-MTM ( formula X), 3A-desolivosyl-MTM (formula XI), desmicarosyl-MTM (formula XII), 6-dediolivosyl-6- ⁇ -D-amicetosyl-MTM (formula XIII), desoliosyl-desmicarosil-3C- ⁇ -D- boivinosil-MTM [formula (XVII)]; 6-desdiolivosyl-6- ⁇ -D-amytostosyl-desoliosyl-desmicarosyl-3C- ⁇ -D-boivinosyl-MTM [formula
  • MTM derivatives were tested against a series of cell lines from tumors.
  • Cell growth and viability were determined quantitatively, using a colorimetric assay, using the reaction with sulforrodamine B (SRB), according to the technique described by Faircloth et al. ⁇ Journal of Tissue and Culture Methods 1988, 11, 201-205). The results are shown in Table 5.
  • 96-well microtiter plates are inoculated, with cells (5x10 3 cells per well) in 195 ⁇ l aliquots of medium, incubating them for 18 h, in medium without added compound, to allow the cells to adhere to the surface.
  • the compounds to be tested are added, in 5 ⁇ l samples, in a concentration range of 10 to 10 "8 ⁇ g / ml, dissolved in DMSO / EtOH (0.2% in PS buffer).
  • the anti-tumor effect is measured using the SRB technique: the cells are fixed by adding 50 ⁇ l of 50% cold trichloroacetic acid (w / v) and incubated for 60 min at 4 0 C.
  • the plates are washed with deionized water and dried, 100 ⁇ l of SRB solution (0.4% w / v in 1% acetic acid) is added to each well, and incubated for 10 min at room temperature, unbound SRB is removed, washing with acetic acid 1% The plates are air dried and the bound dye is dissolved with Tris buffer. The optical densities are read in an automatic plate spectrophotometer reader at a wavelength of 490 nm.
  • Table 12 shows the results of GI50 (growth inhibition) The six compounds tested showed cytotoxic activity against s tumor lines tested, with desmicarosil-3D- / 3-D-digitoxosyl-MTM (formula VIII) being the most active (with activity similar to that of MTM), and desmicarosil-MTM (formula XII) and 6-dediolivosil-6- ⁇ -D-amicetosyl-MTM (formula XIII) the least active.
  • GI50 growth inhibition
  • Fig. 1 Chemical structure of mitramycin.
  • Fig. 2 Mithramycin biosynthesis. Abbreviations: AcO, acetate; MaIO, malonate; Mtm PKS, mitramycin polyketide synthase; preMTMone, premitramycinone; preMTM-A3, premitramycin A3; preMTM-B, premitramycin B; MTM, mitramycin.
  • Fig. 4a Chemical structures of desmicarosil-3D- / 3-D-digitoxosil-MTM (formula VIII), desoliosyl-3C- ⁇ -L-digitoxosil-MTM [formula (IX)], desoliosil-3C- / 3-D-micarosil-MTM [formula (X)], 3A-desolivosyl-MTM [formula (XI)], desmicarosyl-MTM [formula (XII)], and 6-desdiolivosyl-6- ⁇ -D-amytostosil-MTM [formula (XIII)].
  • Fig. 4b Chemical structures of desoliosyl-desmicarosil-3C- ⁇ -D-boivinosyl-MTM [formula (XVII)]; ó-desdiolivosil-ó- ⁇ -D-amicetosyl-desoliosyl-desmicarosil-SC- ⁇ -D-boivinosyl-MTM [formula (XVIII)]; desoliosyl-desmicarosil-3C- ⁇ -D-olivosyl-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM [formula (XIX)]; 6-desdiolivosyl-6- ⁇ -D-amytostosyl-desoliosyl-desmicarosyl-3C- ⁇ -D-olivosyl-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM [formula (XX)], and 6- dediolivosyl-6- ⁇ -D -amy
  • XI 3A-desol ⁇ vosil-MTM
  • XII desmicarosil-MTM
  • XIII 6-desd ⁇ ol ⁇ vosil-6- ⁇ -D-am ⁇ cetosil-MTM
  • XVII desoliosil-desmiearos ⁇ l-3C- ⁇ -D-bo ⁇ v ⁇ nos ⁇ l- MTM
  • XVIIl 6-desdiolivosil-6- ⁇ -D-amicetos ⁇ l-desoliosil-desm ⁇ caros ⁇ I-3C- ⁇ -D-boivinosil-MTM
  • XIX desoliosil-desmicarosil-3C- ⁇ -D-olivosil-3D- ⁇ -D-digitoxosil-MTM
  • XX 6-desdioIivosil-6- ⁇ -D-amicetosyl-desol ⁇ osyl-desmicaiOS ⁇ l-3C-

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Abstract

La presente invención proporciona compuestos caracterizados por la fórmula (I), donde cada uno de los radicales sustituyente se describe en la memoria. La invención también describe el uso de dichos compuestos en el tratamiento de diferentes enfermedades, entre otras: cáncer o procesos tumorales, en general, enfermedad de Paget, hipercalcemia, hipercalciuria y enfermedades neurológicas (Parkinson, Alzheimer, Huntington, entre otras).

Description

DERIVADOS GLICOSILADOS DE MITRAMICINA. SU PROCEDIMIENTO
DE OBTENCIÓN Y SUS USOS
La invención se adscribe al campo farmacéutico y en concreto se refiere a 5 compuestos con aplicación en oncología, con estructura química derivada de mitramicina y que se obtienen por fermentación de microorganismos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La mitramicina (MTM) es un fármaco antitumoral producido por i o microorganismos del género Streptomyces, incluyendo Streptomyces argiííaceus ATCC
12956. Este fármaco es el representante más importante del grupo del ácido aureólico, y es empleado para el tratamiento del carcinoma testicular, la enfermedad de Paget y la hipercalcemia causada por lesiones óseas asociadas al cáncer (Oncology 1973, 28,147-
163; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 195, 1245-1253; Treat. Endocrinol. 2002,
15 1, 241-257; Treat. Endocrinol. 2003, 2, 273-292). La MTM es además un agente neuroprotector que podría ser útil para el tratamiento de enfermedades neurológicas tales como accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotrófϊca, enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y encefalitis vírica (J
Neurosci. 2004, 24, 10335-10342; J Biol. Chem. 2006, 281, 16672-16680). Además, la
20 MTM presenta actividad antibiótica {Antibiot. Chemother. 1962, 12, 182-186).
La estructura química de la MTM se muestra en la Fig. 1. El grupo de compuestos del ácido aureólico incluye MTM, cromomicina A3, olivomicina A, UCH9 y durhamicina (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). Todos ellos contienen un
25 núcleo tricíclico de origen policetídico, con una cadena lateral altamente funcionalizada en el carbono 3. El residuo en el carbono 7 puede ser un átomo de hidrógeno o un alquilo de cadena corta. Asimismo, estos compuestos poseen 4-6 desoxiazúcares unidos en forma de trisacárido o tetrasacárido (en el carbono 2) y monosacárido o disacárido (en el carbono 6). Los compuestos del ácido aureólico difieren en la naturaleza y el
30 modo de unión de sus cadenas glucídicas, que contienen diferentes 2,6- didesoxiazúcares. Estas variaciones estructurales son las responsables de las sutiles diferencias que existen entre los miembros del grupo en cuanto a su unión al ADN y su perfil de actividad biológica. Es bien conocido que el patrón de glicosilación de los fármacos antitumorales que actúan uniéndose al ADN, como es el caso de la MTM, tiene gran importancia en su actividad biológica (Biopofymers 2000, 54, 104-114). Por ello, la obtención de nuevos derivados de MTM con patrones glicosídicos alterados puede generar fármacos con actividad mejorada.
El conjunto de genes responsables de la biosíntesis de MTM ha sido ampliamente estudiado (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). La biosíntesis de
MTM en Streptomyces argillaceus incluye la condensación de 10 unidades de acil- coenzima A para generar un intermediario tetracíclico, denominado premitramicinona
(Fig. 2). A continuación, 5 unidades de desoxiazúcares son añadidas de forma sucesiva, generándose intermediarios tetracíclicos con 3 azúcares y con 5 azúcares. Las glicosiltransferasas MtmGIII y MtmGIV son responsables de la formación del trisacárido, mientras que las glicosiltransferasas MtmGI y MtmGII catalizan la formación del disacárido. Finalmente, la ruptura de uno de los anillos, seguida de la reducción de un grupo ceto en la cadena lateral, genera la MTM.
Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía), pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos {Trenas Biotechnol. 2001, 19, 449-456; J Mol. Microbio]. Biotechnol. 2005, 9, 77-85; Cw/τ. Opin. Drug Discov. Devel. 2005, 8, 748-756; J /«t/. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33, 560-568; Cwrr. Opin. Microbiol. 2006, 9, 252-260). Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nuevas cepas bacterianas derivadas de Streptomyces argillaceus. Estas cepas son obtenidas mediante la introducción de ciertos ácidos nucleicos adicionales en cepas bacterianas existentes, las cuales pueden ser: (a) Streptomyces argillaceus, o bien (b) cepas derivadas de Streptomyces argillaceus. Las cepas del apartado (b) pueden obtenerse (entre otros métodos) mediante la inactivación de uno (o varios) de los genes responsables de la biosíntesis de mitramicina, y son útiles para la obtención de derivados de MTM (US 2005/0192432 Al; J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753; J Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1606-1614; Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835; FEMS Microbiol. Lett. 2000, 186, 61-65; Mol. Gen. Genet. 2000, 262, 991-1000; J Biol. Chem. 2000, 275, 3065-3074; Mol. Gen. Genet. 1999, 261, 216- 225; Chem. Biol. 1999, 6, 19-30; J Bacteriol. 1999, 181, 642-647; J Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937; J Bacteriol. 1997, 179, 3354-3357; Mol. Gen. Genet. 1996, 251, 692- 698; Gene 1996, 172, 87-91). Un ejemplo de cepa del apartado (b), que puede ser utilizada en la presente invención, es Streptomyces argillaceus M7U1, que fue obtenida a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivación del gen mtmU {Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835). El gen mtmU codifica una 4-cetorreductasa implicada en biosíntesis de D-oliosa, y su inactivación resulta en acumulación de premitramicinona y premitramicina A. Otro ejemplo de cepa del apartado (b) es Streptomyces argillaceus M7W1, que fue obtenida a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivación del gen mtmW (US 2005/0192432 Al; J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753). El gen mtmW codifica una cetorreductasa, y su inactivación resulta en acumulación de desmicarosil-MTM-SK, MTM-SA, MTM-SDK, y MTM-SK. La introducción de ácidos nucleicos en Streptomyces argillaceus (o en cepas derivadas) se puede realizar mediante transformación de protoplastos, conjugación, u otros métodos conocidos (tales como lo descritos en Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000), de tal forma que los ácidos nucleicos son replicables en el organismo, bien en forma de elemento extracromosómico o bien integrados en el cromosoma del organismo. Dichos ácidos nucleicos codifican enzimas para la biosíntesis de diferentes azúcares; dichos azúcares no son producidos normalmente por Streptomyces argillaceus. Ejemplos de ácidos nucleicos utilizables para la presente invención son los contenidos en los siguientes plásmidos (los cuales son citados a modo de ejemplos): pLNBIV (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65, 1685-1689), pRHAM (J Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000, 2, 271-276), pLN2 (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729), pLNR (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729), y pFL845 (Chem. Commun. (Camb). 2005 Mar 28;(12): 1604-6). Los plásmidos citados contienen ácidos nucleicos que codifican enzimas para la biosíntesis de los siguientes azúcares (en forma de derivados NDP), respectivamente: L-digitoxosa, L-rhamnosa, L-olivosa, D-olivosa, y D-amicetosa. Sin embargo, otros ácidos nucleicos pueden usarse en la presente invención, que codifiquen enzimas para la biosíntesis de otros azúcares no citados.
Las cepas bacterianas de esta invención pueden ser cultivadas en cualquier medio adecuado, en condiciones que permitan su crecimiento, tal como se describe en Gene 1996, 172, 87-91; J Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937; J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753. Tras varios días de incubación, estos cultivos contienen una cantidad elevada de células (micelio), junto con una mezcla de compuestos, incluyendo derivados de MTM. A continuación, los cultivos son sometidos a procesos para la separación de una fase líquida (sobrenadante) y una fase sólida (micelio). Seguidamente las dos fases son sometidas, separadamente, a diversos procedimientos que pueden incluir extracción con diversos solventes orgánicos, y varios tipos de cromatografías (tales como HPLC, cromatografía líquida de alto rendimiento), con el fin de obtener los derivados de MTM en forma de compuestos puros. Los derivados de MTM son agentes antitumorales y también actúan como agentes neuroprotectores. Asimismo, la presente invención proporciona compuestos caracterizados por la siguiente fórmula (I):
Figure imgf000006_0001
donde
Ri es hidrógeno, hidroxilo (OH), un grupo hidroxilo protegido con un grupo protector, un monosacárido de fórmula (II)
Figure imgf000006_0006
R2 es hidrógeno, un grupo pro ector, un monosacárido de fórmula (III),
Figure imgf000006_0002
un monosacárido de fórmula (IV),
Figure imgf000006_0003
un disacárido de fórmula (V),
Figure imgf000006_0004
un disacárido de fórmula (VI),
Figure imgf000006_0005
o un disacárido de fórmula (VII).
Figure imgf000007_0001
un monosacárido de fórmula (XIV),
Figure imgf000007_0002
un disacárido de fórmula (XV),
Figure imgf000007_0003
o un disacárido de fórmula (XVI)
Figure imgf000007_0004
R3, R4, R5, R6, R7 y R8 , R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23 y R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 son cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector;
R9 es hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo alquilo; y la estereoquímica de los carbonos a, b, c, d y e es R, S o mezcla de ambos. El grupo protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehido, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxo o una combinación de ellos.
Los compuestos de fórmula (I) incluyen aquellos donde:
R3, R4, R5 y R<5 son hidrógeno; o bien
R3, R4, R5, R6, R7 y Rs son hidrógeno; o bien
R9 es metilo; o bien la estereoquímica en los carbonos a, b, c y d es S, y la estereoquímica en el carbono e es R; o bien
R3, R4, R5, R6, R7, Rs, Rio, Rn, R12, Rn, R14, R15, Ri6, Rn, Ri8, y R19 , R20, R21, R22, R23 , R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 son hidrógeno, R9 es metilo, la estereoquímica en los carbonos a, b, c y d es S, y la estereoquímica en el carbono e es R.
En particular, la presente invención proporciona, entre otros, los compuestos con las siguientes fórmulas (VIII, IX, X, XI, XII, XIII):
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
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(XVIII)
Figure imgf000010_0002
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Figure imgf000011_0001
Los compuestos de la invención son inhibidores de crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento del cáncer.
De esta forma, son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para inhibir el crecimiento de un tumor.
Tal como es usado aquí, "inhibir" significa disminuir, hacer más lento, o detener. Por tanto, un compuesto de esta invención puede disminuir, hacer más lento, o detener el crecimiento de una célula tumoral. Tal como es usado aquí, "crecimiento" significa aumento en tamaño, o proliferación, o ambos. Por tanto, un compuesto de esta invención puede inhibir el aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la célula tumoral se divida y aumente el número de células tumorales. Una "célula tumoral" es una célula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo), el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno). Una célula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y formar metástasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una célula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar metástasis en tejidos alejados del tumor original.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para tratar el cáncer.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento con actividad antitumoral.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cáncer, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable.
Tal como es usado aquí, un "sujeto" puede incluir animales domesticados (por ejemplo, gatos, perros, etc.), ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser humano. En general, una "cantidad efectiva" de un compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención trata el cáncer mediante la inhibición del crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que previene la invasión de tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por tanto, previene metástasis. Ejemplos de cánceres que pueden ser tratados incluyen, pero no están limitados a, pulmón, colon, ovario, próstata, testículo, melanoma, riñon, mama, sistema nervioso central y leucemia. La expresión "composición farmacéutica aceptable" consiste en un material adecuado biológicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.
Las dosis o cantidades de los compuestos de la invención deben ser suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafϊlácticas, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo y el grado de la enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada médico, en base a la condición clínica del sujeto implicado. La dosis, régimen de dosificación y ruta de la administración pueden variarse. Las dosis y el régimen de dosificación actualmente empleados para la MTM proporcionan una guía para las dosis y el régimen de dosificación que pueden emplearse para los nuevos derivados de MTM (ver por ejemplo Cáncer Treat. Rep. 1979, 63, 1835-1838; Ann. Intern. Med. 1975, 83, 659- 660).
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Paget.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con la enfermedad de Paget, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento de la hipercalcemia.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con hipercalcemia, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento de la hipercalciuria.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con hipercalciuria, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente. Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurológicas.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con una enfermedad neurológica, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Ejemplos de enfermedades neurológicas que pueden ser tratadas incluyen, pero no están limitados a, enfermedades neurodegenerativas tales como las de Parkinson, Alzheimer, y Huntington.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles para la investigación en bioquímica o biología celular. Por ejemplo, los compuestos pueden ser útiles para bloquear la expresión de c-Src (y otros enzimas dependientes de SpI) en osteoclastos u otros tipos celulares.
Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una composición farmacéutica aceptable. Cualquier experto en la materia puede crear composiciones farmacéuticas aceptables, las cuales pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas, o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser preparado en forma de composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir diversos agentes transportadores, espesantes, diluentes, tamponantes, conservantes, tensoactivos, y otros, además del compuesto de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc. Los compuestos de la invención pueden ser administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de si se desea que el tratamiento sea local o sistémico, y dependiendo del área a ser tratada. Así, por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede ser administrado en forma de solución oftálmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal, rectal, intranasal, oral, por inhalación, o por vía parenteral, ya sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante inyección. Los inyectables pueden ser preparados de diversas formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por ejemplo, patente US 3,710,795). Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones, que además pueden contener tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como etilo leato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua, soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos de vehículos parenterales son: solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. También pueden ser necesarios o deseables ciertos transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, o tabletas. Puede ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes, diluentes, emulsionantes, dispersantes, etc. A los efectos de la presente invención y su descripción, el término "derivado" de la mitramicina debe interpretarse como un compuesto cubierto por la fórmula general I. Del mismo modo, el término "prodroga" de la mitramicina debe interpretarse a los efectos de la presente invención y de la descripción de la misma, como cualquier compuesto que libere, al circular en sangre o entrar en la célula, la mitramicina o un derivado, de acuerdo con la fórmula general I, de la misma.
EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE
Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.
Ejemplo 1. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces argillacem (pLNBIV).
La cepa Streptomyces argillaceus (pLNBIV) se generó mediante la introducción del plásmido pLNBIV en Streptomyces argillaceus ATCC 12956. La introducción del plásmido se realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo procedimientos estándar (Kieser et al, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation,
Norwich, Gran Bretaña, 2000). El plásmido pLNBIV ha sido descrito con anterioridad, y contiene una serie de genes que codifican la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-L-digitoxose (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65, 1685-1689).
La cepa Streptomyces argillaceus (pLNBIV) fue depositada con fecha 15/11/2006 en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de
Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT 3384.
Ejemplo 2. Producción de desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII), desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM (fórmula IX), desoliosil-3C-β-D-micarosil- MTM (fórmula X), y 3A-desolivosil-MTM (fórmula XI).
Para la purificación de los derivados de MTM, la cepa S. argillaceus (pLNBIV) fue cultivada en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En el paso de producción, se emplearon 8 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno de ellos conteniendo 400 mi de medio, los cuales fueron incubados durante 5 días. Los cultivos fueron centrifugados y filtrados, y el caldo fue extraído en fase sólida tal como se ha descrito (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531). Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC-MS empleando un equipo cromatográfico acoplado a un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters - Micromass), usando como solventes acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroacético (TFA) en agua, y una columna de fase reversa (Symmetry C 18, 2.1 x 150 mm, Waters). Las muestras fueron eluidas con 10% acetonitrilo durante los primeros 4 min., seguido de un gradiente lineal 10-88% acetonitrilo durante 26 min., a un flujo de 0.25 ml/min. La detección y la caracterización espectral de los picos fue realizada con un detector de fotodiodos y software Empower (Waters). Los análisis de MS fueron hechos mediante ionización de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Aquellas fracciones que contenían derivados de MTM (que eluían entre 45 y 55 min.) fueron reunidas y secadas en vacío.
Este extracto fue redisuelto y cromatografiado en una columna μBondapak C18 de compresión radial (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters). Se empleó una elución isocrática con una mezcla de acetonitrilo y 0.1% TFA en agua (42:58), a 10 ml/min. La desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM y la 3A-desolivosil-MTM fueron repurificadas en una columna semipreparativa (Symmetry C18, 7.8 x 300 mm, Waters) con elución isocrática con acetonitrilo y 0.1% TFA en agua (37:63), a 3 ml/min. La desoliosil-3C-α- L-digitoxosil-MTM y la desoliosil-3C-β-D-micarosil-MTM fueron también repurificadas empleando la misma columna y los mismos solventes, pero cambiando la mezcla a 45:55. En todos los casos, después de cada paso de purificación, los compuestos recogidos eran diluidos 4 veces con agua y eran desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida, para ser finalmente liofilizados. De esta manera se obtuvieron 14.3 mg de desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII), 5.8 mg de desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM (fórmula IX), 3.3 mg de desoliosil-3C-β-D- micarosil-MTM (fórmula X), y 10.9 mg de 3A-desolivosil-MTM (fórmula XI).
Los productos se caracterizaron mediante espectroscopia de NMR y espectroscopia de masas. Los espectros de masas de ionización por electrospray (ESI- MS) fueron adquiridos empleando un espectrómetro de masas Thermo Finnigan LCQ, con introducción de la muestra por difusión directa. La espectrometría de masas FAB ("fast atom bombardment") de alta resolución, en modo positivo, fue adquirida empleando un espectrómetro de masas modelo VG70SQ (con "double focusing magnetic sector"). La espectrometría MS-MS sobre ion pseudomolecular fue realizada en ambos modos +ve y -ve para estudiar el patrón de fragmentación de la molécula. Los espectros UV fueron obtenidos con un espectrómetro Varían CARY50, y los espectros IR fueron obtenidos a partir de discos de KBr en un espectrómetro Nicolet Magna IR- 560. Todos los datos de NMR fueron obtenidos en pyridine d5, empleando un instrumento Varían Inova de 400 MHz, excepto los espectros de 13C de banda ancha, que fueron obtenidos a 50.3 y 75.4 MHz en espectrómetros Varían Inova de 200 y 300 MHz, respectivamente. Los valores δ fueron ajustados en referencia a los picos del solvente (δ 8.74 ppm y δ 150.35 ppm para NMR de 1H y de 13C, respectivamente). Todas las asignaciones de NMR están basadas en espectros de 1H y de 13C empleando espectros de 1U, 13C-HSQC y CIGAR-HMBC, espectros 1H5 1H-DQ-COSY y NOESY, lo que permitió asignar sin ambigüedades todas las señales de NMR. La desmicarosil- 3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII) fue además estudiada mediante espectros ID- TOCSY para identificar separadamente los patrones de spin de los azúcares. La estructura química de los compuestos se muestra en la Fig. 4.
Análisis NMR y MS de desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula
VIII), C5IH74O24. ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 1069 (100) [M-H],
1105/1107 (22) [M+C1~], 939 (7) [M-H-Azúcar IA]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 1093 (100) [M+Na], 1109 (11) [M+K], 833 (7) [M+H-{Azúcar IA y
1B}+Na], 811 (16) [M+H-Azúcar IA y IB], 681 (14) [M+H-Trisacárido], 421 (18) [M+H-Tri y disacárido]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 1093.4467; obtenido, 1093.4447. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 412 (1532), 317 (1663), 279 (5112), 229 (5042) nm. IR (KBr) v: 3420 (OH), 2920 (CH), 2848 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1382, 1130, 1064 cm 1. La Tabla 1 muestra los datos de 1H-NMR y 13C- s NMR.
Análisis NMR y MS de desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM (fórmula IX),
C52H76O24. ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 1083 (100) [M-H], 1119/1121 (26) [M+Cl"]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 1107 (100) [M+Na+], 1123 io (13) [M+K+], 847 (5) [M+H- {Disacárido} +Na], 825 (27) [M+H-Disacárido], 681 (11) [M+H-Trisacárido], 551 (34) [M+H-Azúcares 1A,1B,1D y IE] y 421 (22) [M+H-Tri y disacárido]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 1107.4603; obtenido, 1107.4624. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 412 (2148), 317 (2491), 278 (6851), 230 (6420) nm. IR (KBr) v: 3409 (OH), 2924 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1634 (C=O), 1514 (C=C), i5 1374, 1126, 1064 cm"1. La Tabla 2 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Análisis NMR y MS de desoliosil-3C-β-D-micarosil-MTM (fórmula X),
C46H66O2I. ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 953 (100) [M-H]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 977 (100) [M+Na+], 993 (5) [M+K+], 695 (8) [M- 20 Azúcar IA y IB], 681 (10) [M-Azúcar IC y ID] y 421 (20) [M+H-bis-disacárido]. HR- FAB m/z [M + Na+]: calculado, 977.3745; obtenido, 977.3948. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 412 (1357), 316 (1629), 278 (3274), 230 (2982) nm. IR (KBr)v: 3425 (OH), 2924 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1122, 1064 cm"1. La Tabla 3 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
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Análisis NMR y MS de 3A-desolivosil-MTM (fórmula XI), C46H66O2I. ESI-
MS negativo m/z (intensidad relativa): 953 (100) [M-H], 989/991 (9) [M+Cl"], 823 (5)
[M- Azúcar IB], 809 (8) [M+H-Azúcar ID]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa):
955 (100) [M+Na+], 993 (10) [M+K+], 833 (13) [M+H-{Azúcar 1D}+Na+], 825 (11) so [M+H- Azúcar IB], 695 (5) [M+H-Azúcar IA y IB], 681 (25) [M+H-Azúcar IC y ID], 551 (50) [M+H-Azúcares 1A,1B y ID] y 421 (33) [M+H-Tri y monosacárido]. HR- FAB m/z [M+Na+]: calculado, 977.3735; obtenido, 977.3950. UV/Vis (Metanol) λmax (ε):412 (2178), 316 (2310), 278 (8099), 231 (7363) nm. IR (KBr)v: 3421 (OH), 2924 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1634 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1122, 1060 cm"1. La s Tabla 4 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Ejemplo 3. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces argillaceus (pFL845).
La cepa Streptomyces argillaceus (pFL845) se generó mediante la introducción del plásmido pFL845 en Streptomyces argillaceus. La introducción del plásmido seo realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo procedimientos estándar (Kieser et al, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). El plásmido pFL845 ha sido descrito con anterioridad, y contiene una serie de genes que codifican la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-D- amicetosa (Chem. Commun. (Camb). 2005 Mar 28;(12): 1604-6). La cepa Streptomyces5 argillaceus (pFL845) fue depositada con fecha 15/11/2006 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT 3383.
Ejemplo 4. Producción de desmicarosil-MTM (fórmula XII) y 6-desdiolivosil-6-β- o D-amicetosil-MTM (fórmula XIII).
Para purificar los nuevos derivados de mitramicina producidos por S. argillaceus (pFL845), se cultivó esta cepa en 8 matraces de 2 L conteniendo 400 mi de medio R5A suplementado con tioestreptona (5 μg/ml c.f). Tras 6 días de incubación a 3O0C, los cultivos se centrifugaron, filtraron y se realizó una extracción en fase sólida.5 Posteriormente el extracto se sometió a una primera cromatografía utilizando un cartucho μBondapak C 18. La elución se realizó a 10 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y TFA en agua (42:58). A continuación se realizó una segunda cromatografía en Symmetry Cl 8 (7.8 x 300), a 3 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y TFA en agua (37:63, para 845-1 Pl; 42:58, para 0 845-1 P3). Se obtuvo el siguiente rendimiento: 16.1 mg de desmicarosil-MTM (fórmula XII), y 4.3 mg de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM (fórmula XIII). Los productos fueron caracterizados por HPLC-MS, de la forma descrita en el Ejemplo 2.
Análisis NMR y MS de desmicarosil-MTM (fórmula XII), C45H64O2I. Sólido s amarillo amorfo. [α]25 D -25 (c 0.032, MeOH); ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 939 (100) [M-H], 975/977 (28) [M+Cl"], 809 (10) [M-H- {azúcar A}], 679 (5)
[M-H- {Disacárido}]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 963 (100) [M+Na+],
979 (10) [M+K+], 833 (9) [M+H-{Sugar A}+Na+], 811 (5) [M+H-azúcar A], 681 (20)
[M+H-{disacárido}], 703 (8) [M+H- {Disacárido} +Na], 421 (15) [M+H-{bis- io disacárido}]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 963.3804; obtenido, 963.3793. UV/Vis
(Metanol) λmax (ε): 430(10,200), 316(6400), 281(50,400), 231(11,000) nm. IR (KBr)v:
3421 (OH), 2924 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1122,
1064 cm"1. La Tabla 5 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
i5 Análisis NMR y MS de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM (fórmula
XIII), C46H66O20. Sólido amarillo amorfo. [α]25 D -22 (c 0.027, MeOH); ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 937 (100) [M-H], 973/975 (23) [M+C1~], 823 (10) [M-H- {azúcar A}]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 961 (100) [M +Na+], 977 (15) [M +K+], 825 (10) [M+H-{azúcar A}], 535 (9) [M+H-{Trisacárido}], 421 (12) 20 [M+H-{Tri- y monosacárido}]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 961.4053; obtenido, 961.4045. UV/Vis (Metanol) λmax (ε):430 (10,500), 316 (6,500), 281 (48,400), 230 (12,600). IR (KBr)v: 3425 (OH), 2928 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1122, 1064 cm"1. La Tabla 6 muestra los datos de 1H-NMR y 13C- NMR.
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Ejemplo 5. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces argillacem (pFL942).
La cepa Streptomyces argillaceus (pFL942) se generó mediante la introducción del plásmido pFL942 en Streptomyces argillaceus. La introducción del plásmido se realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo procedimientos estándar
30 (Kieser et al, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). El plásmido pFL942 ha sido descrito con anterioridad, y contiene una serie de genes que codifican la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-L- micarosa (Chemistry & Biology. 2004, (11):1709-18). La cepa Streptomyces argillaceus (pFL942) fue depositada con fecha /02/08 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT
Ejemplo 6. Producción de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM (fórmula XVII) y desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII). Para purificar los nuevos derivados de mitramicina producidos por S. argillaceus
(pFL942), se cultivó esta cepa en medio sólido R5A. Se inocularon uniformemente 100 placas de agar con esporas y tras 6 días de incubación a 280C, los cultivos se extrajeron 3 veces con acetato de etilo. Posteriormente el extracto se sometió a una primera cromatografía utilizando un cartucho de compresión radial μBondapak C 18. La elución se realizó a 10 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y TFA en agua (50:50). A continuación se realizó una segunda cromatografía en una columna Sunfire PrepClδ (1O x 250mm, Waters), a 7 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% TFA en agua (37:63). Las fracciones de HPLC se colectaron sobre 0.1M potassium phosphate buffer (pH=7) y tras cada purificación, las muestras se diluyeron 4 veces con agua, se desalaron, concentraron y liofilizaron. Se obtuvo el siguiente rendimiento: 3 mg de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil- MTM (fórmula XVII), y 6.9 mg de desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII). Los productos fueron caracterizados por HPLC-MS, de la forma descrita en el Ejemplo 2. El compuesto desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII) está caracterizado en el Ejemplo 2.
Análisis NMR y MS de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM
(fórmula XVII), C45H64O2I. Sólido amarillo amorfo. [α]25 D -22 (c 0.029, MeOH); ESI-
MS negativo m/z (intensidad relativa): 939 (100) [M-H]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 963 (100) [M+Na+], 979 (10) [M+K+], 833 (10) [M+Na+- {Azúcar
A}], 703 (50) [M+H-{disacárido}], 443 (12) [aglicón+ Na+]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 939.3849; obtenido, 939.3867. UV/Vis (Metanol) λmax (ε):430 (10,600), 317 (6800), 281 (49,500), 230 (10,000) nm. IR (KBr)v: 3431 (OH), 2926 (CH), 2851 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1121, 1064 cm"1. La Tabla 7 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Ejemplo 7. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845).
La cepa Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845) se generó mediante la introducción del plásmido pFL845 en Streptomyces argillaceus M7U1. La introducción del plásmido se realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo procedimientos estándar (Kieser et al., Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). La cepa Streptomyces argillaceus M7U1 ha sido descrita con anterioridad {Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835). El plásmido pFL845 ha sido descrito con anterioridad, y contiene una serie de genes que codifican la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-D- D-amicetosa (Chem. Commun. (Camb). 2005 Mar 28;(12): 1604-6). La cepa Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845) fue depositada con fecha /02/08 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT
Ejemplo 8. Producción de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil- 3C-β-D-boivinosil-MTM (fórmula XVIII); desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil- 3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula XIX); 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil- desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula XX) y 6- desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil-MTM (fórmula XXI).
Para purificar los nuevos derivados de mitramicina producidos por S. argillaceus M7U1 (pFL845), se cultivó esta cepa en medio sólido R5A. Se inocularon uniformemente 100 placas de agar con esporas y tras 6 días de incubación a 280C, los cultivos se extrajeron 3 veces con acetato de etilo. Posteriormente el extracto se sometió a una primera cromatografía utilizando un cartucho de compresión radial μBondapak C 18. La elución se realizó a 10 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y TFA en agua (50:50). A continuación se realizó una segunda cromatografía en una columna Sunfϊre PrepClδ (10 x 250mm, Waters), a 7 ml/min utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% TFA en agua (40:60). Las fracciones de HPLC se colectaron sobre 0.1M potassium phosphate buffer (pH=7) y tras cada purificación, las muestras se diluyeron 4 veces con agua, se desalaron, concentraron y liofilizaron. Se obtuvo el siguiente rendimiento: 1.7 mg de 6- desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D-boivinosil-MTM (fórmula XVIII), 6.7 mg de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D- digitoxosil-MTM (fórmula XIX), 12.2 mg de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil- desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula XX) y 17mg de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil-MTM (fórmula XXI). Los productos fueron caracterizados por HPLC-MS, de la forma descrita en el Ejemplo 2.
Análisis NMR y MS de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil- desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM (fórmula XVIII): C39H54O17. Sólido amarillo amorfo. [α]25 D -23 (c 0.026, MeOH); ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 793
(10%) [M-H], 777(100%) (M-H20). ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 795
(25) [M+H], 817 (20) [M +Na+], 687 (100), [M+H- {azúcar A}], 673 (11) [M+H{azúcar
A y 1C}], 443 (12) [aglicón+Na]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 817.3253; obtenido, 817.3238. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 430 (10,800), 316 (6700), 280
(50,700), 231 (13,000) nm. IR (KBr)v: 3428 (OH), 2925 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O),
1632 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1121, 1063 cm 1. La Tabla 8 muestra los datos de 1H-
NMR y 13C-NMR.
Análisis NMR y MS de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D- digitoxosil-MTM (fórmula XIX), C5IH74O24. Sólido amarillo amorfo. [α]25 D -21 (c 0.020, MeOH); ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa): 1069 (20) [M-H]. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 1071 (48) [M+H], 1093 (26) [M+Na+], 963 (28) [M+Na+-{monosacárido}], 833 (16) ) [M+Na+-{disacárido}], 703 (12) [M+Na+- {Trisacárido}], 550 (14) [M+Na+-{tetrasacárido], 443 (26) [M+H-{Tri- y disacárido}]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 1093.4462; obtenido, 1093.4447. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 430 (10,600), 316(6500), 280 (49,500), 231 (12,800) nm. IR (KBr)v: 3423 (OH), 2921 (CH), 2850 (CH), 1716 (C=O), 1631 (C=O), 1514 (C=C), 1382, 1131, 1064 cm"1. La Tabla 9 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Análisis NMR y MS de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil- desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula XX), C45H62O20. Sólido amarillo amorfo. [Cc]25D -15 (c 0.024, MeOH); ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): 947 (25) [M +Na+], 817 (100) [M +Na+- {azúcar Q], 795 (12) [M +H-azúcar C]. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 947.3883; obtenido, 947.3867. UV/Vis (Metanol) λmax (ε): 430 (10,400), 316 (6500), 281 (48,000), 232 (11,900) nm. IR (KBr)V: 3426 (OH), 2928 (CH), 2843 (CH), 1716 (C=O), 1632 (C=O), 1514 (C=C), 1374, 1121, 1063 cm"1. La Tabla 10 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Análisis NMR y MS de 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β-D- olivosil-MTM (fórmula XXI), C45H64O2I. ESI-MS negativo m/z (intensidad relativa):
XXX. ESI-MS positivo m/z (intensidad relativa): XXX. HR-FAB m/z [M+Na+]: calculado, 940.39; obtenido, XXX. UV/Vis (Metanol) λmax (ε):XXX. IR (KBr)v:
XXX. La Tabla 11 muestra los datos de 1H-NMR y 13C-NMR.
Ejemplo 9. Actividad antitumoral de desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII), desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM (fórmula IX), desoliosil-3C-β- D-micarosil-MTM (fórmula X), 3A-desolivosil-MTM (fórmula XI), desmicarosil- MTM (fórmula XII), 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM (fórmula XIII), desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM [fórmula (XVII)]; 6-desdiolivosil-6-β- D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM [fórmula (XVIII)]; desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM [fórmula (XIX)]; 6- desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D-olivosil-SD-β-D- digitoxosil-MTM [fórmula (XX)], y 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β- D-olivosil-MTM [fórmula (XXI)]. Los derivados de MTM se ensayaron frente a una serie de líneas celulares procedentes de tumores. Se determinó cuantitativamente el crecimiento celular y la viabilidad, utilizando un ensayo tipo colorimétrico, usando la reacción con sulforrodamina B (SRB), según la técnica descrita por Faircloth y colaboradores {Journal ofTissue and Culture Methods 1988, 11, 201-205). Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Se inoculan placas de "microtiter" de 96 pocilios, con células (5x103 células por pocilio) en alícuotas de 195 μl de medio, incubándolas durante 18 h, en medio sin compuesto añadido, para permitir que las células se adhieran a la superficie. A continuación, se añaden los compuestos a ensayar, en muestras de 5 μl, en un rango de concentraciones de 10 a 10"8 μg/ml, disueltas en DMSO/EtOH (0.2% en tampón PS). Tras 48 h de exposición, se mide el efecto antitumoral utilizando la técnica de SRB: se fijan las células añadiendo 50 μl de ácido tricloroacético frío al 50% (p/v) y se incuba durante 60 min. a 40C. Las placas se lavan con agua desionizada y se secan. Se añaden 100 μl de solución de SRB (0.4% p/v en ácido acético al 1%) a cada pocilio, y se incuba durante 10 min. a temperatura ambiente. Se elimina la SRB no unida, lavando con ácido acético al 1%. Las placas se secan al aire y el colorante unido se disuelve con tampón Tris. Se leen las densidades ópticas en un lector espectrofotómetro de placas automático a una longitud de onda de 490 nm. En la Tabla 12 se muestran los resultados de las GI50 (inhibición del crecimiento). Los seis compuestos ensayados mostraron actividad citotóxica frente a las líneas tumorales ensayadas, siendo desmicarosil-3D-/3-D- digitoxosil-MTM (fórmula VIII) el más activo (con actividad similar a la de MTM), y desmicarosil-MTM (fórmula XII) y 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM (fórmula XIII) los menos activos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Estructura química de la mitramicina.
Fig. 2. Biosíntesis de mitramicina. Abreviaturas: AcO, acetato; MaIO, malonato; Mtm PKS, policétido sintasa de mitramicina; preMTMone, premitramicinona; preMTM-A3, premitramicina A3; preMTM-B, premitramicina B; MTM, mitramicina.
Fig. 3A. Análisis por HPLC de un extracto de Streptomyces argillaceus (pFL845). Identificador de los picos: 1 = mitramicina (MTM); 2 = premitramicina Al (preMTM); 3 = desmicarosil-MTM [fórmula (XII)]; 4 = 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM [fórmula (XIII)];
Fig. 3B. Análisis por HPLC de un extracto de Streptomyces argillaceus (pLNBIV). Identificador de los picos: 1 = mitramicina (MTM); 2 = premitramicina Al (preMTM); 3 = desmicarosil-MTM [fórmula (XII)], 3A-desolivosil-MTM (XI), y desmicarosil-3D- β-D-digitoxosil-MTM [fórmula (VIII)]; 4 = desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM [fórmula (IX)]; 5 = desoliosil-3C-β-D-micarosil-MTM [fórmula (X)].
Fig. 3C. Análisis por HPLC de un extracto de Streptomyces argillaceus (pFL942). Identificador de los picos: 1 = mitramicina (MTM); 2 = desmicarosil-3D-/3-D- digitoxosil-MTM [fórmula (VIII)]; 3 = desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil- MTM [fórmula (XVII)];
Fig. 3D. Análisis por HPLC de un extracto de Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845). Identificador de los picos: 1 = premitramicina Al (preMTM); 2 = 6- desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D-boivinosil-MTM [fórmula (XVIII)]; 3 = desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil- MTM [fórmula (XIX)]; 4 = 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil- 3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM [fórmula (XX)]; 5 = 6-desdiolivosil-6-β-D- amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil-MTM [fórmula (XXI)].
Fig. 4a. Estructuras químicas de desmicarosil-3D-/3-D-digitoxosil-MTM (fórmula VIII), desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-MTM [fórmula (IX)], desoliosil-3C-/3-D-micarosil-MTM [fórmula (X)], 3A-desolivosil-MTM [fórmula (XI)], desmicarosil-MTM [fórmula (XII)], y 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-MTM [fórmula (XIII)].
Fig. 4b. Estructuras químicas de desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-MTM [fórmula (XVII)]; ó-desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D- boivinosil-MTM [fórmula (XVIII)]; desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D- digitoxosil-MTM [fórmula (XIX)]; 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil- desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM [fórmula (XX)], y 6- desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil-MTM [fórmula (XXI)]
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla 12 Ensayo de la actividad antitumorul de derivados de MTM frente a líneas celulares tumorales. Se incluyen también los datos obtenidos con MTM, como referencia. Los valores numéricos hacen referencia a Ia GI50 (μM), o concentración a la que el compuesto ensayado inhibe el 50% del crecimiento celular en comparación con células no tratadas. VIII = desmicarosil-3D-/?-D-d¡gitoxos¡l-MTM; IX = desol¡os¡l-3C-αr-L-digiloxosil-MTM: X = desoliosil-3C-/?-D-micarosil-MTM: XI = 3A-desol¡vosil-MTM; XII = desmicarosil-MTM: XIII = 6-desd¡ol¡vosil-6-β-D-am¡cetosil-MTM: XVII = desoliosil-desmiearos¡l-3C-β-D-bo¡v¡nos¡l-MTM; XVIIl = 6-desdiolivosil-6-β-D- amicetos¡l-desoliosil-desm¡caros¡I-3C-β-D-boivinosil-MTM: XIX = desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM; XX = 6-desdioIivosil-6-β-D-amicetosil-desol¡osil-desmicaiOS¡l-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM: XXI = 6-desdiolivosil-6-β-D- amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil-MTM
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto con la fórmula (I)
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donde
Ri es hidrógeno, hidroxilo (OH), un grupo hidroxilo protegido con un grupo protector, un monosacárido de fórmula (II)
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R2 es hidrógeno, un grupo protector, un monosacárido de fórmula (III),
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un monosacárido de fórmula (IV),
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un disacárido de fórmula (V),
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un disacárido de fórmula (VI),
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un disacárido de fórmula (VII),
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un monosacárido de fórmula (XIV),
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un disacárido de fórmula (XV),
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o un disacárido de fórmula
Figure imgf000066_0004
R3, R4, R5, Re, R7 y Rs, Rio, Rn, R12, Rn, R14, R15, R16, Rn, Ris, R19, R20, R21, R22, R23 , R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 son cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector;
R9 es hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo alquilo; y la estereoquímica de los carbonos a, b, c, d y e es R, S o mezcla de ambos.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde el grupo protector se selecciona entre: un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquiladlo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehido, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxo o una combinación de cualquiera de ellos.
3. El compuesto de la reivindicación 1, donde R3, R4, R5 y R6 son hidrógeno.
4. El compuesto de la reivindicación 1, donde R3, R4, R5, RÓ, R7 y Rs son hidrógeno.
5. El compuesto de la reivindicación 1, donde R9 es metilo.
6. El compuesto de la reivindicación 1, donde la estereoquímica en los carbonos a, b, c y d es S, y la estereoquímica en el carbono e es R.
7. El compuesto de la reivindicación 1, donde R3, R4, R5, R5, R7, Rs, Rio, Rn, R12, Ri3, RH, R15, Ri6, Rn, RiS, R19, R20, R21, R22, R23 , R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30,
R3i son hidrógeno, R9 es metilo, la estereoquímica en los carbonos a, b, c y d es S, y la estereoquímica en el carbono e es R.
8. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (VIII):
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9. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (IX):
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10. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (X):
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11. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XI):
Figure imgf000068_0003
12. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XII):
Figure imgf000069_0001
13. El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XIII):
Figure imgf000069_0002
14 El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XVII):
Figure imgf000069_0003
El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XVIII):
(XVIII)
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El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XIX):
Figure imgf000070_0002
El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XX):
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El compuesto de la reivindicación 1, con la fórmula (XXI):
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19. Cepas bacterianas derivadas de Streptomyces argillaceus, caracterizadas porque cada una de dichas cepas posee un ácido nucleico adicional que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no están presentes en Streptomyces argillaceus.
20. Una cepa bacteriana según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces argillaceus (pLNBIV).
21. Una cepa bacteriana de la reivindicación 19, caracterizada porque dicho ácido nucleico está contenido en el plásmido pLNBIV y codifica enzimas activos para la biosíntesis de nucleosidildifosfato-L-digitoxosa y sus intermediarios bio sintéticos.
22. Una cepa bacteriana según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces argillaceus (pFL845).
23. Una cepa bacteriana de la reivindicación 19, caracterizada porque dicho ácido nucleico está contenido en el plásmido pFL845 y codifica enzimas activos para la biosíntesis de nucleosidildifosfato-D-amicetosa y sus intermediarios bio sintéticos.
24. Una cepa bacteriana según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces argillaceus (pFL942).
25. Una cepa bacteriana de la reivindicación 19, caracterizada porque dicho ácido nucleico está contenido en el plásmido pFL942 y codifica enzimas activos para la biosíntesis de L-micarosa y sus intermediarios biosintéticos.
26. Una cepa bacteriana según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845).
27. Una cepa bacteriana de la reivindicación 26, caracterizada porque dicho ácido nucleico está contenido en el plásmido pFL845, el cual codifica enzimas activos para la biosíntesis de D-amicetosa y sus intermediarios biosintéticos.
28. Un método para obtener las cepas bacterianas de la reivindicación 19, que comprende la introducción de un ácido nucleico en Streptomyces argillaceus o en una cepa derivada de Streptomyces argillaceus, que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no estén presentes en Streptomyces argillaceus.
29. El método de la reivindicación 28, que comprende la introducción del plásmido pLNBIV en Streptomyces argillaceus.
30. El método de la reivindicación 28, que comprende la introducción del plásmido pFL845 en Streptomyces argillaceus .
31. El método de la reivindicación 28, que comprende la introducción del plásmido pFL942 en Streptomyces argillaceus.
32. El método de la reivindicación 28, que comprende la introducción del plásmido pFL845 en Streptomyces argillaceus M7U1.
33. Un método para producir derivados de mitramicina de acuerdo con la fórmula I, que comprende:
a) incubar una cepa bacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 para producir una composición que incluye un derivado de mitramicina de acuerdo con la fórmula I; y b) aislar un derivado de mitramicina, de acuerdo con la fórmula I, a partir de la composición producida en el paso (a).
34. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces argillaceus (pLNBIV).
35. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces argillaceus (pFL845).
36. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces argillaceus (pFL942).
37. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845).
38. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-mitramicina [fórmula (VIII)].
39. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desoliosil-3C-α-L-digitoxosil-mitramicina [fórmula (IX)].
40. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desoliosil-3C-β-D-micarosil-mitramicina [fórmula (X)].
41. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de 5 mitramicina es 3A-desolivosil-mitramicina [fórmula (XI)].
42. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desmicarosil-mitramicina [fórmula (XII)].
io 43. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-mitramicina [fórmula (XIII)].
44. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-boivinosil-mitramicina [fórmula
I5 (XVII)].
45. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es ó-desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D- boivinosil-mitramicina [fórmula (XVIII)].
20
46. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es desoliosil-desmicarosil-3C-β-D-olivosil-3D-β-D-digitoxosil- mitramicina [fórmula (XIX)].
25 47. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es ó-desdiolivosil-ó-β-D-amicetosil-desoliosil-desmicarosil-SC-β-D- olivosil-3D-β-D-digitoxosil-mitramicina [fórmula (XX)].
48. Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el derivado de mitramicina es 6-desdiolivosil-6-β-D-amicetosil-desoliosil-3C-β-D-olivosil- mitramicina [fórmula (XXI)].
49. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, obtenible según el método de la reivindicación 33.
50. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, caracterizado por ser producido por una cepa bacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27.
51. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces argillaceus (pLNBIV) de la reivindicación 20.
52. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces argillaceus (pFL845) de la reivindicación 22.
53. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces argillaceus (pFL942) de la reivindicación 24.
54. Un compuesto derivado de mitramicina, según la fórmula I, caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces argillaceus M7U1 (pFL845) de la reivindicación 26.
55. Una preparación farmacéutica que comprende, entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la reivindicación 1, o una sal, solvato o prodroga farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
56. Una preparación farmacéutica que comprende, entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la reivindicación 50, o una sal, solvato o prodroga farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
57. Uso de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, o una sal, solvato o prodroga farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento útil en el tratamiento del cáncer en un sujeto diagnosticado de dicha enfermedad.
58. Uso según la reivindicación 57, donde el sujeto es un ser humano.
59. Uso de cualquier de las preparaciones farmacéuticas de las reivindicaciones 55 o 56 para preparar un medicamento destinado a tratar el cáncer en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
60. Uso según de la reivindicación 59, donde el sujeto es un ser humano.
61. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 55 para preparar un medicamento destinado a tratar la enfermedad de Paget en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
62. Uso según de la reivindicación 61, donde el sujeto es un ser humano.
63. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 56 para preparar un medicamento destinado a tratar la enfermedad de Paget en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
64. Uso según de la reivindicación 63, donde el sujeto es un ser humano.
65. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 55 para preparar un medicamento destinado a tratar hipercalcemia en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
66. Uso según de la reivindicación 65, donde el sujeto es un ser humano.
67. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 56 para preparar un medicamento destinado a tratar la hipercalcemia en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
68. Uso según de la reivindicación 67, donde el sujeto es un ser humano.
69. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 55 para preparar un medicamento destinado a tratar hipercalciuria en un sujeto diagnosticado con hipercalciuria.
70. Uso según de la reivindicación 69, donde el sujeto es un ser humano.
71. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 56 para preparar un medicamento destinado a tratar hipercalciuria en un sujeto diagnosticado con hipercalciuria.
72. Uso según de la reivindicación 71, donde el sujeto es un ser humano.
73. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 55 para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad neurológica en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
74. Uso según de la reivindicación 73, donde el sujeto es un ser humano.
75. Uso de la preparación farmacéutica de la reivindicación 56 para preparar un medicamento destinado a tratar una enfermedad neurológica en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
76. Uso según de la reivindicación 75, donde el sujeto es un ser humano.
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