WO2008087010A1 - Verwendung von nikotinamid zur behandlung und/oder prävention von arteriosklerose - Google Patents

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WO2008087010A1
WO2008087010A1 PCT/EP2008/000268 EP2008000268W WO2008087010A1 WO 2008087010 A1 WO2008087010 A1 WO 2008087010A1 EP 2008000268 W EP2008000268 W EP 2008000268W WO 2008087010 A1 WO2008087010 A1 WO 2008087010A1
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nicotinamide
phosphate
drug
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substance
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PCT/EP2008/000268
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Inventor
Florian Lang
Diana Maria Sandulache
Original Assignee
Medice Arzneimittel Puetter Gmbh & Co. Kg
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the treatment and / or prevention of arteriosclerosis, a process for the preparation of such a medicament, and a process for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a subject afflicted with arteriosclerosis and / or at risk of arteriosclerosis ,
  • Medicaments for the treatment and / or prevention of arteriosclerosis methods for the preparation of such medicaments and methods for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a subject affected by atherosclerosis are well known in the art.
  • Arteriosclerosis is a highly complex, active pathological process at the center of which is an inflammatory reaction in the walls of blood-bearing vessels of an affected individual.
  • the emergence of arteriosclerosis can be divided into several phases.
  • the early phase of arteriosclerosis is characterized by a so-called endothelial dysfunction.
  • a number of different risk factors such as Smoking, obesity, physical inactivity, hyperlipoproteinemia and type II diabetes as well as other factors not yet identified lead to endothelial damage.
  • the permeability of the endothelium for lipoproteins and other circulating substances in the plasma increases as a result.
  • endothelial cells are activated and increasingly express so-called adhesion molecules on the cell surface.
  • so-called selectins initially mediate the temporary contact of certain blood cells such as monocytes and T lymphocytes with the endothelium.
  • CAMs Cellular Adhesion Molecules
  • This penetration is by another group of molecules, e.g. chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-I). It comes to the differentiation of monocytes in macrophages in the subintimal space.
  • MCP-I chemokine monocyte chemoattractant protein-1
  • oxidation of low-density lipoprotein (LDL) also occurs, thereby forming oxLDL.
  • the oxLDL is released into the subintimal space, where it loads the macrophages produced there from monocytes. These macrophages are transformed into so-called foam cells by loading with oxLDL, the characteristic cells of the arterial osklerotic plaques containing as further components, inter alia, T lymphocytes and immigrated from the media smooth muscle cells.
  • arteriosclerotic plaque deposits on the arterial walls and is thereby covered by a stabilizing fibrous cap consisting of smooth muscle cells and extracellular matrix.
  • Arteriosclerotic plaque is now at the center of an inflammatory reaction that causes the production of various inflammatory mediators, such as cytokines, chemokines, proteases, etc. This can lead to tissue necrosis, in the vicinity of which lime salts are deposited. As a result, the vessel lumen can be narrowed to complete closure with the result of circulatory disorders.
  • MMPs matrix-metalloproteinases
  • the plaque may rupture due to the thinning of the fibrous cap, exposing the thrombogenic lipid core and collagen in the vessel wall.
  • the consequent activation of the hemostatic system results in occlusive and non-occlusive thrombus formation, i. for activating the coagulation cascade, at the center of which is the so-called Tissue Factor (TF).
  • TF Tissue Factor
  • statins lipid-lowering or statins.
  • the statins include u.a. Atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin (mevinolin), mevastatin (compatinine), pravastatin and simvastatin.
  • These substances have various effects on lipid metabolism, e.g. by competitive inhibition of the key enzyme of cholesterol synthesis, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, by reducing cholesterol biosynthesis in the liver, by increasing the LDL receptors on the liver cell and by modifying the lipoprotein composition.
  • Statins have a major influence on the composition of the serum lipids and cause u.a. to a slight increase in the concentration of so-called "High Density Lipoproteins" (HDL) and to a strong reduction in LDL concentration. Overall, due to the action of the statins less fats circulate in the blood, so that the arteriosclerotic plaques store less fats and the risk of thrombosis and the consequent dangers thereby decreases.
  • HDL High Density Lipoproteins
  • statins are credited with a number of other positive attributes, they have come under criticism for their conspicuous accumulation of rare but serious side effects on muscles and kidneys. Therefore, in particular the active substance cerivastatin (for example Lipobay®, Zenas®) was withdrawn from the market in Germany in August 2001 and alternatives are being sought.
  • cerivastatin for example Lipobay®, Zenas®
  • Criscuoli et al .: Glunicate (Lg 13979) protects the arterial wall from cholesterol-induced arterosclerotic changes in the rabbit without affecting plasma lipids.
  • the protective effect of nicotinic acid was not significant in any of the cases shown.
  • nicotinic acid amide inhibits the cellular uptake of phosphate and the accumulation of calcium phosphate in the cell. This reduces the risk that the solubility product of calcium phosphate will be exceeded, less calcium phosphate precipitates and the risk of arteriosclerosis and the occurrence of calcified arteriosclerotic plaques is significantly reduced.
  • nicotinic acid amide which is also referred to as nicotinamide, pyridine-3-carbamide or niacinamide, so far completely different properties are attributed.
  • Nicotinamide prevents the development of hyperphosphataemia by suppressing intestinal sodium-dependent phosphate transporters in rats with adenine-induced renal failure.
  • nicotinic acid amide For nicotinic acid amide has also been described that a deficiency thereof can lead to the disease of the so-called. Pellagra, which manifests as dermatitis with hyperpigmentation in the area of sun-exposed skin. The administration of nicotinic acid amide is therefore proposed for the treatment of pellagra.
  • nicotinic acid amide to extend the life span or to delay the onset of aging; see. Crane and Low: Plasma membrane redox and control of sirtuin. Age 2005; 27: 147-152, Bitterman et al .: Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRT1. /. Biol. Chem. 2002; 277: 45099-45107 (in yeast), and Kang et al .: Nicotinamide extends replicative life span of human cells. Aging Cell 2006; 5: 423-436 (in human cells).
  • nicotinic acid and nicotinic acid amide hydroiodide are low molecular weight compounds in which small modifications can already lead to a complete change in their biological effects.
  • isonicotinamide for any antiarteriosclerotic effects and found that such a compound which is only slightly modified with respect to nicotinamide is unsuitable as a substance for arteriosclerosis.
  • the object underlying the invention is completely solved by the provision of nicotinamide.
  • the object is further achieved by a process for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of arteriosclerosis comprising the steps of: (1) providing nicotinic acid amide, and (2) formulating the nicotinamide in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • This measure has the advantage that the drug is already designed in a suitable manner, depending on the desired application form.
  • the treating physician is thereby provided with a selection of different embodiments of the drug, whereby the specific form can be based on the condition of the patient, the respective treatment program and other factors.
  • the drug is formed in a form selected from the group consisting of: powder, tablet, juice, drops, capsule, suppository, solution, solution for injection, aerosol, ointment, conditioner, patch, Pellet, dragee.
  • the medicament has nicotinamide in a concentration which is selected from the group consisting of (in each case given by weight of the active substance nicotinic acid amide based on the total weight of the medicament): 1 ⁇ g / g, 10 ⁇ g / g, 100 ⁇ g / g, 1 mg / g, 10 mg / g, 100 mg / g, 1 g / g.
  • This measure has the advantage that the drug already has the active ingredient nicotinamide in a concentration which is particularly suitable for the treatment or prevention of arteriosclerosis.
  • the absolute amount of the active substance nicotinamide in a dosage unit of the medicament is between about 1 and about 3000 mg, preferential between about 10 and about 1500 mg, more preferably between about 100 and about 750 mg, and most preferably about 500 mg.
  • a dosage unit according to the invention denotes an above-mentioned formulation variant, for example a tablet, a dragee, a capsule, etc.
  • the medicament additionally has a further substance which is effective against arteriosclerosis.
  • This measure has the advantage that the addition of the antiarteriosclerotic effects of the medicament of the invention can be further improved. It is thus possible, by combining with another substance, to bring about an intervention in arteriosclerosis at another site in order to combat the clinical picture even more effectively by synergistic effects.
  • the further substance according to the invention is preferably a lipid-lowering agent (statin) which is more preferably selected from the group consisting of atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin (mevinolin), mevastatin (compactin), pravastatin and simvastatin.
  • statin lipid-lowering agent
  • This measure has the advantage that the drug contains such a further substance which has been shown to exhibit antiarteriosclerotic activity and is routinely used. According to the invention, synergistic effects may possibly be achieved by the interaction of nicotinic acid amide and the further substance.
  • the medicament additionally has an anti-flushing substance.
  • Cutaneous vasodilation also known as “flushing” has occasionally occurred in patients given nicotinic acid, but the occurrence of "flushing" after nictinamide has not been previously reported.
  • Such substances are known to the person skilled in the art.
  • the "flushing" proven substances are inhibitors of cyclooxygenase (COX), for example acetylsalicylic acid derivatives (including aspirin), arylpropionic acid derivatives (including ibuprofen, flurbiprofen, naproxen, ketoprofen, tiaprofenic acid), arylacetic acid derivatives (including diclofenac), indoleacetic acid derivatives (including indomethacin), anthranilic acid derivatives (including flufenamine, mefenamic acid), oxicams (including piroxicam, tenoxicam, meloxicam), pyrazolidinediones (including phenylbutazone) and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs or NSAIDs), and DP antagonists.
  • COX cyclooxygenase
  • acetylsalicylic acid derivatives including aspirin
  • arylpropionic acid derivatives including ibupro
  • another object of the present invention relates to a method for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a living being affected by arteriosclerosis or / and in which there is a risk of arteriosclerosis, comprising the following steps: (1) provision of nicotinamide, (2) introduction of the nicotinamide into the animal, and (3) if necessary, multiple repetition of steps (1) and (2).
  • the nicotinic acid amide can be provided in this process in the form of the medicament according to the invention and introduced into the animal.
  • the above-described characteristics, features and advantages apply accordingly to this method. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.
  • 7 shows the phosphate excretion via the urine of the experimental animals before and after the administration of nicotinic acid amide
  • 8 shows the phosphate excretion via faeces of the test animals before and after administration of nicotinic acid amide
  • FIG. 14 shows the influence of three different concentrations of isonicotinic acid amide on the uptake of phosphate by intestinal epithelial cells
  • Figure 15 shows the effect of three different concentrations of thiamine hydrochloride on phosphate uptake by intestinal epithelial cells. embodiments
  • mice were performed on 6-10 month old mice maintained on a control diet (C1314, 0.2% Na + , 1% K + , 0.9% Ca + *, Altromin, Heidenau, Germany). Before and during the experiments, the mice had free access to tap water with and without nicotinic acid amide (0.1-2 mg / g) as indicated. To evaluate the renal and fecal excretion, the mice were individually placed for 24 hours in the urine collection with free access to drinking water in metabolic cages (Tecniplast Hohenpeissenberg, Germany). The inner wall of the metabolic cages was silicified and the urine was collected under water-saturated oil.
  • the animals were anesthetized with diethyl ether (Roth, Düsseldorf, Germany) and about 150 ⁇ l of blood was drawn by puncturing the retro-orbital plexus into heparinized capillaries.
  • Feces were dried at about 8O 0 C for about 3 hours and then the fecal dry weight was determined. 5 ml of 0.75 M HNO3 was added to the faeces and the sample was placed on an electric bath for 48 hours. see shakers shaken. The samples were then centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes and 1 ml of the supernatant was collected. The supernatant was again centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was stored at -20 0 C until analysis. The supernatant was analyzed as described below.
  • the concentration of phosphate (P 1 ) in plasma, urine and faeces was measured using a photometric kit (Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer's instructions with adjustments to the different origin of the samples.
  • the small intestinal segments were rinsed with ice-cold saline solution and opened lengthwise.
  • the mucosa was scraped with a glass slide in buffer containing (in mM): 250 sucrose, 20 Tris (pH 7.5), 5 EGTA and protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany). The suspension was homogenized with an omnimixer for 7 seconds. MgCb was added to the homogenate at a final concentration of 10 mM.
  • the suspension was shaken on ice and then centrifuged at 1600 g for 15 minutes.
  • the plasma membranes remaining in the supernatant were collected by centrifugation at 20,000 g for 30 minutes.
  • the resulting pellet was suspended in pH 7.4 buffer containing (in mM): 125% sucrose, 10% tris (pH 7.5), 2.5% EGTA, 2.5% MgSO 4 .
  • This suspension was homogenized with 50 "up-down" strokes with a glass homogenizer and centrifuged at 20,000 g for 30 minutes.
  • the final pellet containing the cleaned brush border membrane vesicles was homogenized by forcing the suspension through 25 and 28 gauge needles and subsequent solubilization All steps were performed at 4 ° C the samples were frozen at -80 0 C for later use.
  • the membrane protein was determined as described by Bradford.
  • Nicotinic acid amide (NA): DSM Nutritional Products, product no. 0587848, CAS no. 98-92-0, Lot 404023; Stock solution: 10 mg / ml in culture medium (MEM) without additives; Substance is readily soluble, pH-neutral
  • Isonicotinic acid amide (INA): Acros Organics, product no. 12258,0000, CAS no. 1453-82-3, Lot A0214246; Stock solution: 10 mg / ml in culture medium (MEM) without additives; Substance is readily soluble, pH-neutral
  • Thiamine hydrochloride DSM Nutritional Products, product no. 0413038, CAS no. 67-03-8, Lot UQ50308195; Stock solution: 10 mg / ml in culture medium (MEM) without additives; Substance is easily soluble, but acidic pH of 4.82. Therefore neutralized by adding a few drops of 1 N NaOH.
  • Incubation solutions at a concentration of 5 mg / ml and 1 mg / ml were prepared from the stock solutions by further dilution with culture medium. All solutions were concentrated 10 fold, i. the concentrations in the cell biological test were thus 100 ⁇ g / ml, 500 ⁇ g / ml and 1000 ⁇ g / ml.
  • Caco-2 human Caucasian colon adenocarcinoma; ECACC 86010202, DSMZ ACC 169); Passage 67 internally.
  • the Caco-2 cells were mass-cultures in Minimum Essential Medium with L-glutamine (MEM) supplemented with 5% fetal bovine serum and 100 U / ml Penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin and 1% NEAA (nonessential amino acid solution, 100 fold).
  • MEM Minimum Essential Medium with L-glutamine
  • the 100f concentrated phosphate stock solution for incubation of the cells contained, based on the phosphate concentration in Dulbecco's phosphate-buffered saline for cell culture:
  • Phosphate reagent freshly prepared each day: 10% ascorbic acid solution and 0.42% molybdate solution mixed in the ratio 1 + 6 (6 ml 10% ascorbic acid solution + 36 ml molybdate solution)
  • Caco-2 cells were seeded at a density of 750,000 cells / culture dish (growth area per 55 cm culture dish) and for 3 days until reaching approximately 90% confluency in Minimum Essential Medium (MEM) with the addition of 5% fetal calf serum and 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin and 1% NEAA (nonessential amino acid solution, 100 fold).
  • MEM Minimum Essential Medium
  • the Caco-2 cells were then incubated with minimum essential medium (MEM) without further additions (contains 140 mg / l sodium dihydrogen phosphate x H 2 O) ⁇ 100, 500 resp. 1000 ⁇ g / ml test substance preincubated for 15 min at 37 ° C. in the incubator.
  • MEM minimum essential medium
  • the culture medium was aspirated and fresh MEM with 100 ug / ml potassium dihydrogen phosphate and 575 ug / ml disodium hydrophosphate dihydrate from the lOOfach concentrated phosphate stock solution ⁇ 100, 500 resp. 1000 ug / ml test substance was added and incubated for 60 min at 37 ° C in an incubator.
  • the incubation medium was aspirated, washed once with 10 ml per dish of 0.9% saline, the cells were detached by trypsin / EDTA short-term treatment (5 ml trypsin / EDTA for 5 min at 37 ° C.) and suspended (+5 ml saline)
  • the cell suspension was centrifuged (7 min at 240 x g), the supernatant was aspirated with a Pasteur pipette and the cell pellet was taken up in 1 ml saline
  • Figures 1 to 8 show the arithmetic mean ⁇ SEM of fluid intake (ml / 24 hours, Figure 1), food intake (mg / 24 h, Figure 2), faeces dry weight (g / 24 hours, Fig. 1) 3), body weight (g; Fig. 4), urinary flow rate (ml / 24 hours, Fig. 5), urinary phosphate concentration (mg / dl, Fig. 6), urinary phosphate excretion (mg / 24 h, Fig. 7) Fig.
  • nicotinamide As illustrated in Fig. 1, administration of low doses of nicotinamide also results in a slight decrease in the fluid intake of the experimental animals, the effect attaining significance at 0.3 mg / g body weight for one week. Conversely, administration of 0.5 mg / g body weight of nicotinic acid amide tends to result in a slight but significant increase in fluid intake.
  • nicotinic acid amide did not result in significant changes in body weight of the experimental animals; see. Fig. 4.
  • the urinary flow rate of the test animals significantly decreased nicotinamide after two weeks of administration of 0.1 to 0.3 mg / g body weight; see. Fig. 5.
  • 0.1 mg / g body weight of nicotinamide increased urinary phosphate excretion of the experimental animals, this effect being significant one week after initiation of treatment; Fig. 7. 2.1.8 Faecal phosphate excretion
  • protein abundance was significantly higher in the first (jejunal) than in the second (ileal) half of the small intestine before administration of nicotinic acid amide.
  • the nicotinamide treatment leads to the complete disappearance of the NaPillb protein from the borders of the small intestinal border.
  • FIG. Shown are the arithmetic mean ⁇ SEM of the plasma phosphate concentration (mg / dl) before (control) or one or two weeks after the administration of 0.1, 0.3, 0.5, 1 or 2 [mg / g body weight] nicotinic acid. mid. * indicates a statistically significant (p ⁇ 0.05) difference from the value before administration of nicotinic acid amide.
  • the inventors have established a cellular test system with intestinal epithelial cells (cell line Caco-2), on which the phosphate uptake of the cells depending on Nicotinic acid amide can be determined quantitatively.
  • cell line Caco-2 intestinal epithelial cells
  • two other test substances were tested for their ability to affect the phosphate uptake of the cell, namely isonicotinic acid amide and thiamine hydrochloride.
  • Table 1 shows the phosphate measured values at a dilution of 1:10.
  • Tab. 1 Tabular representation of the phosphate measured values at a dilution of 1:10 for documentation of the linear measuring range
  • the maximum optical densities (OD) at 820 nm were 0.8 and were therefore still within the linear range of the calibration curve.
  • the phosphate uptake of the cells is 27.63 ⁇ 6.6% (mean ⁇ standard deviation) and is significant (p ⁇ 0.05, Student's t-test).
  • p ⁇ 0.05, Student's t-test p ⁇ 0.05, Student's t-test
  • NA nicotinic acid amide
  • the inventors have now recognized that the decreased cellular uptake of phosphate reduces the cellular accumulation of calcium phosphate (CaHPO) and thus the risk of arteriosclerosis.
  • CaHPO calcium phosphate
  • FIG. 14 shows the influence of three different concentrations of isotinic acid amide (INA) on the uptake of phosphate by the intestinal epithelial cells.
  • INA isotinic acid amide
  • thiamine hydrochloride causes a dose-dependent promotion of phosphate uptake by about 29 to 9% with opposite proportionality, i. the lower the test concentration, the greater the promotion of phosphate uptake. However, only at the lowest test concentration of 100 ⁇ g / ml is the promotion significant (p ⁇ 0.05, Student's t-test).
  • Tab. 2 Tabular representation of all measured values for phosphate uptake under the influence of the three different concentrations of the three different test substances.
  • nicotinic acid amide can significantly reduce the uptake of phosphate into the cell from the plasma and thereby represents an effective substance for the treatment and prophylaxis of arteriosclerosis.
  • nicotinic acid amide is the only test substance that reduced phosphate uptake into the cells at all concentrations tested.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist und/oder bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht.

Description

Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist und/oder bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht.
Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, Verfahren zur Herstellung solcher Arzneimittel sowie Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines von Arteriosklerose betroffenen Lebewesens sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Die Arteriosklerose ist ein hochkomplexer, aktiver pathologischer Prozess, in dessen Zentrum eine inflammatorische Reaktion in den Wänden der blutführenden Gefäße eines betroffenen Individuums steht. Die Entstehung der Arteriosklerose kann in mehrere Phasen unterteilt werden.
Die frühe Phase der Arteriosklerose ist gekennzeichnet durch eine sogenannte endotheliale Dysfunktion. Eine Reihe unterschiedlicher Risikofaktoren wie z.B. Rauchen, Übergewicht, körperliche Inaktivität, Hyperlipoproteinämie und Typ-II-Diabetes sowie andere bislang noch nicht identifizierte Faktoren führen zu einer Schädigung des Endothels. Die Permeabilität des Endothels für Lipoproteine und andere zirkulierende Stoffe im Plasma nimmt hierdurch zu. In der Folge werden Endothelzellen aktiviert und exprimieren vermehrt sogenannte Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche. Darunter vermitteln vor allem sogenannte Selektine zunächst den temporären Kontakt bestimmter Blutzellen wie Monocyten und T-Lymphocyten mit dem Endothel. Durch eine weitere Gruppe von Adhäsionsmolekülen, den sogenannten Cellular Adhesion Molecules (CAMs), kommt es zur festen Anheftung dieser Zellen an die Gefäßwand. Insbesondere an Gefäßverzweigungen - den Stellen, an denen gehäuft arteriosklerotische Läsionen entstehen - spielen zudem mechanische Kräfte eine Rolle. Erhöhte Scherkräfte können die Bildung von endothelialem Stickstoff (NO) verringern. NO wirkt Gefäßerweiternd und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Darüber hinaus führen erhöhte Scherkräfte zu gesteigerter Bildung von Adhäsionsmolekülen mit den oben geschilderten Folgen.
Im weiteren Verlauf dringen vor allem Monocyten und in geringerem Ausmaß T- Lymphocyten in den subintimalen Raum ein. Dieses Eindringen wird durch eine andere Gruppe von Molekülen, zu denen z.B. das Chemokin Monocyte- Chemoattractant-Protein-1 (MCP-I) gehört, vermittelt. Es kommt zur Differenzierung der Monocyten in Makrophagen im subintimalen Raum.
Im geschädigten Endothel kommt es ferner zur Oxidation von Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) und dadurch zur Bildung von oxLDL. Das oxLDL wird in den subintimalen Raum abgegeben, wo es die dort aus Monocyten hervorgegangenen Makrophagen belädt. Diese Makrophagen werden durch die Beladung mit oxLDL zu sogenannten Schaumzellen transformiert, den charakteristischen Zellen der arteri- osklerotischen Plaques, die als weitere Bestandteile u.a. T-Lymphocyten und aus der Media eingewanderte Glattmuskelzellen enthalten.
Ein solcher arteriosklerotischen Plaque lagert sich an den Arterienwänden ab und wird dabei von einer stabilisierenden fibrösen Kappe bestehend aus Glattmuskelzellen und extrazellulärer Matrix überzogen. Der arteriosklerotischen Plaque steht nun im Zentrum einer inflammatorischen Reaktion, bei der es zur Produktion von verschiedensten Entzündungsmediatoren kommt, wie Cytokinen, Chemokinen, Proteasen etc. Dabei kann es zu Gewebenekrosen kommen, in deren Nachbarschaft Kalksalze abgelagert werden. Dadurch kann das Gefäßlumen bis zum völligen Verschluss mit der Folge von Durchblutungsstörungen verengt werden.
Im weiteren Verlauf der Arteriosklerose kommt es zur Ausschüttung von Matrixme- talloproteinasen (MMP) durch Makrophagen und Schaumzellen. Durch die proteolytische Aktivität der MMP kommt es zu einem verstärkten Abbau von extrazellulärer Matrix in der arteriosklerotischen Umgebung. Der verstärkte Abbau bzw. die verminderte Neubildung der extrazellulären Matrix führen zur Ausdünnung der fibrösen Kappe des arteriosklerotischen Plaques mit konsekutiver Plaqueinstabilität und drohender Rupturgefahr.
Der Plaque kann durch die Ausdünnung der fibrösen Kappe aufreißen, wodurch der thrombogene Lipidkern und Kollagen in der Gefäßwand freigelegt werden. Die dadurch bedingte Aktivierung des Hämostasesystems führt zur okkludierenden und nicht-okkludierenden Thrombusbildung, d.h. zur Aktivierung der Gerinnungskaskade, in dessen Zentrum der sogenannte Tissue Factor (TF) steht. Klinisch manifestiert sich die Plaqueruptur mit Thrombusformation als instabile Angina pectoris oder akuter Myokardinfarkt.
Bekannt ist, dass bei der Arteriosklerose auch dem Calcium-Phosphat-Haushalt eine wichtige Bedeutung zukommt. So ist beschrieben worden, dass Störungen des Calci- um-Phosphat-Gleichgewichts zur vaskulären Calcifizierung beitragen, die bei der Arteriosklerose beobachtet wird, vgl. . Ketteier et al.: Novel insights into vascular calcification. Kidney. Int. Suppl. 2006 (105): 5-9; Ketteier et al.: Inhibitors of caldfica- tion: general aspects and implications in renal failure, Pediatr. Nephrol. 2005 20(3): 383-8.
Derzeit wird die Arteriosklerose in der Regel über die Verabreichung von Lipidsenkern bzw. Statinen behandelt. Hierbei handelt es sich um eine Gruppe von Wirkstoffen, die letztlich die endogene Cholesterinsynthese hemmen. Zu den Statinen zählen u.a. Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compac- tin), Pravastatin und Simvastatin. Diese Substanzen haben auf verschiedene Weise Einfluss auf den Lipidstoffwechsel, z.B. durch kompetitive Hemmung des Schlüsselenzyms der Cholesterinsynthese, der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A- Reductase, durch Verminderung der Cholesterinbiosynthese in der Leber, durch Vermehrung der LDL-Rezeptoren auf der Leberzelle und durch Modifikation der Lipoproteinzusammensetzung. Statine haben einen großen Einfluss auf die Zusammensetzung der Serumlipide und führen u.a. zu einer leichten Anhebung der Konzentration von sogenannten "High Density Lipoproteinen" (HDL) und zu einer starken Senkung der LDL-Konzentration. Insgesamt zirkulieren durch die Wirkung der Statine weniger Fette im Blut, so dass die arteriosklerotischen Plaques weniger Fette einlagern und das Risiko einer Thrombose und der daraus folgenden Gefährdungen sinkt dadurch.
Obwohl den Statinen noch eine Reihe weiterer positiver Eigenschaften zugeschrieben wird, sind diese auf Grund einer auffälligen Häufung von seltenen, jedoch schwerwiegenden Nebenwirkungen an Muskeln und Nieren im Zusammenhang mit der Einnahme in die Kritik geraten. Deshalb wurde insbesondere der Wirkstoff Cerivastatin (z.B. Lipobay®, Zenas®) in Deutschland im August 2001 vom Markt genommen und es wird nach Alternativen gesucht.
Criscuoli et al.: Glunicate (Lg 13979) protects the arterial wall from cholesterol- induced arterosclerotic changes in the rabbit without affecting plasma lipids. Arten- osclerosis 1984, 53: 59-68, beschreiben die Verwendung von Nicotinsäure zum Schutz der Arterienwand gegenüber Cholesterin-induzierten Veränderungen bei der Arteriosklerose. Die protektive Wirkung von Nicotinsäure war jedoch in keinem der gezeigten Fälle signifikant.
Feinblatt et al.: Treatment of arteriosclerosis and vague abdominal distress with niacinamide hydroiodide (without side-effects). Amer. Jour. Dig. Dis. 1955; Januar: 5- 6, schlagen die Behandlung von Arteriosklerose durch eine Kombination von Iodiden und Nicotinsäureamid-Hydroiodiden vor. Eine solche Behandlung hat sich jedoch in der Praxis nicht bewährt.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Substanz bereitzustellen, mit der die Arteriosklerose behandelt oder dieser vorgebeugt werden kann, und mit der die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Lipidsenker oder sonstigen Substanzen reduziert oder weitgehend vermieden werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Nicotinsäureamid gelöst.
Die Erfinder haben erkannt, dass Nicotinsäureamid die zelluläre Aufnahme von Phosphat und die Akkumulation von Calciumphosphat in der Zelle hemmt. Dadurch wird die Gefahr reduziert, dass das Löslichkeitsprodukt von Calciumphosphat überschritten wird, weniger Calciumphosphat ausfällt und die Gefahr der Arteriosklerose und das Auftreten verkalkter arteriosklerotischer Plaques deutlich vermindert wird.
Diese Erkenntnis der Erfinder war überraschend, da dem Nicotinsäureamid, das auch als Nicotinamid, Pyridin-3-carbamid oder Niacinamid bezeichnet wird, bislang völlig andere Eigenschaften zugeschrieben werden.
So beschreiben bspw. Eto et al.: Nicotinamide prevents the development of hyper- phosphataemia by suppressing intestinal sodium-dependent phosphate transporter in rats with adenine-induced renal failure. Nephrol. Dial. Transplant. 2005; 20:1378- 1384, dass Nicotinsäureamid in Ratten den natriumabhängigen Phosphattransporter NaPiIIb und damit die Aufnahme von Phosphat in den Organismus hemme.
Tenenhouse H.S. und Chu Y. L.: Hydrolysis of nicotinamide-adenine dinucleotide by purified renal brush-border membranes. Mechanism of NAD+ inhibition of brush- border membrane phosphate-transport activity. Biochem. J. 1982; 204:635-638, behaupten ferner, dass Nicotinsäureamid die renale Resorption von Phosphat hemme und damit die renale Ausscheidung von Phosphat steigere.
Die von Eto et al. (a.a.O.) und Tenenhouse und Chu (a.a.O.) beschriebenen Wirkungen des Nicotinsäureamids sollten deshalb die Plasmakonzentration von Phosphat reduzieren, was von Eto et al auch behauptet wird. Die Erfinder haben jedoch genau den gegenteiligen Effekt von Nicotinsäureamid beobachten können. So wurde von den Erfindern nämlich überraschenderweise festgestellt, dass Nicotinsäureamid die Konzentration von Phosphat im Plasma erhöht.
Bei den Erkenntnissen der Erfinder handelt es sich deshalb um eine Abkehr von der im Stand der Technik vertretenen Auffassung bezüglich der Eigenschaften des Nicotinsäureamids.
Für Nicotinsäureamid ist ferner beschrieben worden, dass ein Mangel hiervon zum Krankheitsbild der sog. Pellagra führen kann, das sich als Dermatitis mit Hyperpigmentierung im Bereich sonnenexponierter Haut manifestiert. Die Verabreichung von Nicotinsäureamid wird deshalb zur Behandlung von Pellagra vorgeschlagen.
Verschiedene Autoren schlagen die Verabreichung von Nicotinsäureamid zur Verlängerung der Lebensdauer bzw. zur Verzögerung von Altersprozessen vor; vgl. Crane und Low: Plasma membrane redox and control of sirtuin. Age 2005; 27:147-152, Bitterman et al.: Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRTl. /. Biol. Chem. 2002; 277:45099-45107 (in Hefe), und Kang et al.: Nicotinamide extends replicative life- span of human cells. Aging Cell 2006; 5:423-436 (in humanen Zellen).
Obgleich Feinblatt et al. (a.a.O.) und Criscuoli et al. (a.a.O.) einen Zusammenhang zwischen Arteriosklerose und Niacinamidhydroiodid bzw. Arteriosklerose und Nico- tinsäure herstellen, war wegen der von Eto et al. (a.a.O.) und Tenenhouse und Chu (a.a.O.) beschriebenen Wirkungen nicht zu erwarten, dass auch Nicotinsäureamid antiarteriosklerotische Wirkung zeigt. Hinzu kommt, dass Nicotinsäure und Nicotin- säureamid-Hydroiodid niedermolekulare Verbindungen sind, bei denen kleine Modifikationen bereits zu einer vollständigen Änderung ihrer biologischen Wirkungen führen können. So haben die Erfinder bspw. auch Isonicotinsäureamid auf etwaige antiarteriosklerotische Wirkungen getestet und dabei festgestellt, dass eine solche gegenüber Nicotinsäureamid nur gering modifizierte Verbindung als Substanz gegen Arteriosklerose ungeeignet ist.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Nicotinsäureamid vollkommen gelöst.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, und (2) Formulierung des Nicotinsäureamids in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Beispielhaft wird verwiesen auf Bauer et al.: Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart 1999; Rowe et al.: Handbook of pharmaceutical excipients 5. Aufl., Pharmaceutical Press and American Pharmacist Association 2006. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der Anmeldung. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel je nach gewünschter Applikationsform bereits auf geeignete Weise ausgestaltet ist. Dem behandelnden Arzt steht dadurch eine Auswahl verschiedenster Ausgestaltungsformen des Arzneimittels zur Verfügung, wobei sich die konkrete Form an dem Zustand des Patienten, dem jeweiligen Behandlungsprogramm und weiteren Faktoren orientieren kann.
Vor diesem Hintergrund ist es auch bevorzugt, wenn das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise bereits eine Formulierungsvariante bereitgestellt, die den unmittelbaren Einsatz von Nicotinsäureamid zur Behandlung bzw. Prävention von Arteriosklerose ermöglicht.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es außerdem bevorzugt, wenn das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel den Wirkstoff Nicotinsäureamid bereits in einer Konzentration aufweist, die sich zur Behandlung bzw. Prävention von Arteriosklerose besonders eignet.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittel zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, Vorzugs- weise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
Mit dieser Maßnahme wird Nicotinsäureamid bereits in einer solchen Menge bereitgestellt, dass in dem Patient ohne weiteres die gewünschten Nicotinsäureamidspiegel erzielt werden können. Unter einer Dosierungseinheit wird erfindungsgemäß eine oben genannte Formulierungsvariante bezeichnet, bspw. eine Tablette, ein Dragee, eine Kapsel etc.
Weiter ist es bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wenn das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch den Zusatz die antiarteriosklerotischen Wirkungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels noch verbessert werden können. So ist es möglich, durch die Kombination mit einer weiteren Substanz einen Eingriff in die Arteriosklerose an einer anderen Stelle zu bewirken, um das Krankheitsbild durch synergistische Effekte noch wirksamer zu bekämpfen.
Bei der weiteren Substanz handelt es sich erfindungsgemäß vorzugsweise um einen Lipidsenker (Statin), der weiter vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel eine solche weitere Substanz beinhaltet, die nachweislich antiarteriosklerotische Wirkung zeigt und routinemäßig eingesetzt wird. Erfindungsgemäß können durch das Zusammenwirken von Nicotinsäureamid und der weiteren Substanz ggf. synergistische Effekte erzielt werden.
Erfindungsgemäß ist es ferner bevorzugt, wenn das Arzneimittel zusätzlich eine gegen „Flush" wirksame Substanz aufweist. Bei Patienten, denen Nicotinsäure verabreicht wurde, kam es vereinzelt zu einer kutanen Vasodilatation, die auch als „Flush" bezeichnet wird. Das Auftreten von „Flush" nach der Einnahme von Nictinsäureamid ist bislang nicht beschrieben. Um jedoch einen wider Erwarten auftretenden „Flush" auch nach der Einnahme von Nicotinsäureamid auszuschließen, ist es von Vorteil, dem Arzneimittel eine weitere Substanz zuzugeben, mit der bekanntermaßen das „Flush"-Phänomen inhibiert bzw. verhindert werden kann. Derartige Substanzen sind dem Fachmann bekannt.
Besonders bevorzugte, weil bewährte Substanzen zur Verhinderung des „Flush" sind Inhibitoren der Cyclooxygenase (COX), bspw. Acetylsalicylsäurederivate (einschließlich Aspirin), Arylpropionsäurederivate (einschließlich Ibuprofen, Flurbiprofen, Naproxen, Ketoprofen, Tiaprofensäure), Arylessigsäurederivate (einschließlich Diclofenac), Indolessigsäurederivate (einschließlich Indometacin), Anthranilsäurede- rivate (einschließlich Flufenamin-, Mefenaminsäure), Oxicame (einschließlich Piroxicam, Tenoxicam, Meloxicam), Pyrazolidindione (einschließlich Phenylbutazon) und weitere nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR bzw. NSAID), sowie DP- Antagonisten. Geeignete DP-Antagonisten sind bspw. in der WO 2006/052555 A2, S. 19 ff. beschrieben, auf die explizit Bezug genommen wird.
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, (2) Einbringung des Nicotinsäureamids in das Lebewesen, und (3) ggf. mehrfaches Wiederholen der Schritte (1) und (2).
Das Nicotinsäureamid kann bei diesem Verfahren in Form des erfindungsgemäßen Arzneimittels bereitgestellt und in das Lebewesen eingebracht werden. Die vorstehend beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile gelten insofern für dieses Verfahren entsprechend. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften, Merkmale und Vorteile ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigelegten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 zeigt die Flüssigkeitsaufnahme der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 2 zeigt die Nahrungsaufnahme der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 3 zeigt das Kot-Trockengewicht der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 4 zeigt das Körpergewicht der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 5 zeigt die Harnflussrate der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 6 zeigt die Phosphatkonzentrationen im Harn der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 7 zeigt die Phosphatausscheidung über den Harn der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid, Fig. 8 zeigt die Phosphatausscheidung über den Kot der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 9 zeigt die Abundanz des Transportproteins NaPiIIb in der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarmes der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 10 zeigt die Phosphatkonzentration im Plasma der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
Fig. 11 zeigt eine Eichkurve zur Messung von freiem Phosphat an Kulturen von Darmepithelzellen,
Fig. 12 zeigt die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in der Kontrolle (Kulturmedium mit Phosphat und ohne Testsubstanz) im Vergleich zu Zellen in Kulturmedium (Kulturmedium ohne Phosphat und ohne Testsubstanz),
Fig. 13 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Nicotinsäureamid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen,
Fig. 14 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Isonicotin- säureamid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen, und
Fig. 15 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Thiamin- hydrochlorid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen. Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Tierversuche
1.1.1 Experimente an den Tieren
Sämtliche Tierversuche wurden gemäß der Richtlinien der Amerikanischen Physiologischen Gesellschaft und in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt und von den lokalen Behörden genehmigt.
1.1.2 Stoffwechselkäfige
Die Experimente wurden an 6 - 10 Monate alten Mäusen durchgeführt, die bei einer Kontrolldiät gehalten wurden (C1314; 0,2 % Na+, 1 % K+, 0,9 % Ca+*, Altromin, Heidenau, Deutschland). Vor und während den Experimenten hatten die Mäuse freien Zugang zu Leitungswasser mit und ohne Nicotinsäureamid (0,1 - 2 mg/g), wie angegeben. Zur Bewertung der renalen und fäkalen Ex- kretion wurden die Mäuse einzeln für 24 Stunden zur Harnsammlung mit freiem Zugang zu Trinkwasser in Stoffwechselkäfige (Tecniplast Hohenpeissen- berg, Deutschland) gesetzt. Die innere Wand der Stoffwechselkäfige war sili- konisiert und der Urin wurde unter Wasser-gesättigtem Öl gesammelt.
Um Blutproben zu erhalten, wurden die Tiere mit Diethylether (Roth, Karlsruhe, Deutschland) anästhesiert und etwa 150 μl Blut wurde durch Punktieren des retro-orbitalen Plexus in heparinisierte Kapillaren entnommen.
Kot wurde bei etwa 8O0C für etwa 3 Stunden getrocknet und anschließend wurde das Kot-Trockengewicht bestimmt. 5 ml von 0,75 M HNO3 wurde zu dem Kot hinzugegeben und die Probe wurde für 48 Stunden auf einem elektri- sehen Schüttler geschüttelt. Die Proben wurden dann bei 3500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und 1 ml des Überstandes wurde gesammelt. Der Überstand wurde erneut bei 14.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bei -200C bis zur Analyse gelagert. Der Überstand wurde analysiert, wie unten beschrieben.
1.1.3 Bestimmung der Phosphatkonzentrationen im Plasma, Harn und Kot
Die Konzentration von Phosphat (P1) in Plasma, Harn und Kot erfolgte unter Verwendung eines photometrischen Kits (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß der Anweisungen des Herstellers mit Anpassungen an den unterschiedlichen Ursprung der Proben.
Sämtliche Substanzen stammten von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) oder Roth (Karlsruhe, Deutschland).
1.1.4 Western-Blot- Analyse der Abundanz des NaPillb-Proteins
Aus der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarmes wurde Darmgewebe entnommen. Im Folgenden wurde das Epithelgewebe abgeschabt und das Gesamtprotein aus unbehandelten und mit Nicotinsäureamid behandelten Mäusen isoliert (jeweils n = 3 Tiere, gepoolt und doppelt bestimmt). Die kleinen Darmsegmente wurden mit eiskalter Salinelösung gespült und der Länge nach geöffnet. Die Mucosa wurde mit einem Glasobjektträger in Puffer abgeschabt, der Folgendes enthielt (in mM): 250 Saccharose, 20 Tris (pH 7,5), 5 EGTA und Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland). Die Suspension wurde mit einem Omnimixer für 7 Sekunden homogenisiert. MgCb wurde zu dem Homogenat in einer Endkonzentration von 10 mM hinzugegeben. Die Suspension wurde auf Eis geschüttelt und anschließend bei 1600 g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Plasmamembranen, die in dem Überstand verblieben, wurden durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 Minuten gesammelt. Das re- sultierende Pellet wurde in einem Puffer bei pH 7,4 suspendiert, der Folgendes enthielt (in mM): 125 Saccharose, 10 Tris (pH 7,5), 2,5 EGTA, 2,5 MgSO4. Diese Suspension wurde mit 50 "up-down" strokes mit einem Glashomogenizer homogenisiert und bei 20.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das End-Pellet, das die gereinigten Bürstensaummembranvesikel („brush border membrane vesicles", BBMV) enthielt, wurde durch Hindurchdrücken der Suspension durch 25- und 28-gauge-Nadeln und anschließende Solubilisierung homogenisiert. Sämtliche Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben bei -800C für die spätere Verwendung eingefroren. Das Membranprotein wurde bestimmt, wie von Bradford beschrieben. Das Gesamtprotein (20-30μg/μl) wurden durch SDS-Page (8% Tris-Glycin) aufgetrennt, auf Nitro- cellulosemembranen transferiert, über Nacht in Blockierungspuffer (5 % fettfreie Milch in PBS enthaltend 0,15 % Tween) blockiert und über Nacht bei 4°C mit einem monoklonalen Anti-NaPillb-Antikörper (verdünnt 1:1000 in Blockierungspuffer) inkubiert (Alpha Diagnostics, Deutschland). Nach der Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Maus- Sekundärantikörper (Amersham, Freiburg, Deutschland) wurden die Banden mit verstärkter Chemolumineszenz (ECL) gemäß der Anweisungen des Herstellers visualisiert.
1.1.5 Statistische Analyse
Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM, n stellt die Anzahl der unabhängigen Experimente dar. Sämtliche Daten wurden auf ihre Signifikanz unter Verwendung des ungepaarten Student's t-Test mit Welch-Korrektur getestet, sofern erforderlich. 1.2 Zellkulturversuche
1.2.1 Testsubstanzen
Nicotinsäureamid (NA): DSM Nutritional Products, Produkt-Nr. 0587848, CAS-Nr. 98-92-0, Lot 404023; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, pH-neutral
Isonicotinsäureamid (INA): Acros Organics, Produkt-Nr. 12258,0000, CAS-Nr. 1453-82-3, Lot A0214246; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, pH-neutral
Thiaminhydrochlorid (THC): DSM Nutritional Products, Produkt-Nr. 0413038, CAS-Nr. 67-03-8, Lot UQ50308195; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, jedoch saurer pH- Wert von 4,82. Daher durch Zugabe von wenigen Tropfen 1 N NaOH neutralisiert.
Aus den Stammlösungen wurden durch weitere Verdünnung mit Kulturmedium Inkubationslösungen mit einer Konzentration von 5 mg/ml und 1 mg/ml hergestellt. Alle Lösungen waren lOfach konzentriert, d.h. die Konzentrationen im zellbiologischen Test waren somit 100 μg/ml, 500 μg/ml und 1000 μg/ml.
1.2.2 Verwendete Zelllinie und Routinekultur
Humane Darmepithelzellen, Zelllinie Caco-2 (Human Caucasian colon adeno- carcinoma; ECACC 86010202, DSMZ ACC 169); Passage 67 intern. Die Caco-2- Zellen wurden als Massenkulturen in Minimum Essential Medium mit L- Glutamin (MEM) unter Zusatz von 5 % fetalem Rinderserum sowie 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin und 1 % NEAA (nichtessentielle Aminosäure-Lösung, lOOfach) inkubiert.
1.2.3 Phosphat-Stammlösung zur Exposition der Zellen
Die 100f ach konzentrierte Phosphat-Stammlösung zur Inkubation der Zellen enthielt in Anlehnung an die Phosphatkonzentration in Dulbecco's Phosphatgepufferter Saline für die Zellkultur:
• KH2PO4 wasserfrei 10,OgA = 100 μg/ml im Kulturmedium zur Inkubation
• Na2HPO4XZH2D 57,5 g/l = 575 μg/ml im Kulturmedium zur Inkubation
1.2.4 Bestimmung von anorganischem Phosphat
Reagenzien und Lösungen
• 1 raM NazHPO4 zur Erstellung der Eichkurve (Lösung 1): 178 mg Na2HPO4 x 2 H2O in 1 Liter Aqua dest. gelöst Lagerung bei 4°C im Kühlschrank.
0,5 M H2SO4 aus konz. H2SO4 (18 M): 28 ml konz. H2SO4 in 900 ml Aqua dest. unter Rühren und ggf. Kühlung eingegossen und auf 1000 ml mit Aqua dest. aufgefüllt
• 0,42 % (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O: 4,2 g (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O in 0,5 M H2SO4 gelöst und auf 1000 ml mit 0,5 M H2SO4 aufgefüllt. Lagerung in einer braunen Glasflasche bei 4°C im Kühlschrank. • 10%ige Ascorbinsäure-Lösung (jeweils am Versuchstag frisch hergestellt): 1,11 g Ascorbinsäure in 10 ml Aqua dest. gelöst
• Phosphatreagenz (jeweils am Versuchstag frisch angesetzt): 10%ige Ascorbinsäure-Lösung und 0,42%ige Molybdat-Lösung im Verhältnis 1+6 gemischt (6 ml 10%ige Ascorbinsäure-Lösung + 36 ml Molybdat- Lösung)
Eichkurven und Durchführung der Bestimmung
• Probe A: 10 μl Lösung 1 + 990 μl Aqua dest. = 1 μM im Test
• Probe C: 50 μl Lösung 1 + 950 μl Aqua dest. = 5 μM im Test
• Probe D: 100 μl Lösung 1 + 900 μl Aqua dest. = 10 μM im Test
• Probe F: 200 μl Lösung 1 + 800 μl Aqua dest. = 20 μM im Test
• Probe G: 300 μl Lösung 1 + 700 μl Aqua dest. = 30 μM im Test
• Probe H: 500 μl Lösung 1 + 500 μl Aqua dest. = 50 μM im Test
Zu 100 μl der Probe bzw. Aqua dest. für den Leerwert wurden 900 μl Phosphatreagenz pipettiert und für 60 min bei 37°C im Schüttelwasserbad im Dunkeln inkubiert. Danach erfolgte die Messung der Extinktion bei 820 nm mit einem ATI Unicam UV/Vis UV4 Spektrometer. 1.2.5 Durchführung der Zellkulturversuche
• Caco-2-Zellen wurden in einer Dichte von 750.000 Zellen/Kulturschale (Wachstumsfläche pro Kulturschale 55 cm) ausgesät und für 3 Tage bis zum Erreichen einer etwa 90%igen Konfluenz in Minimum Essential Medium (MEM) unter Zusatz von 5 % fetalem Kälberserum sowie 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin und 1 % NEAA (nichtessentielle Aminosäure-Lösung, lOOfach) inkubiert.
• Die Caco-2-Zellen wurden dann mit Kulturmedium (Minimum Essential Medium; MEM) ohne weitere Zusätze (enthält 140 mg/1 Natriumdi- hydrogenphosphat x H2O) ± 100, 500 resp. 1000 μg/ml Testsubstanz für 15 min bei 37°C im Brutschrank präinkubiert.
• Das Kulturmedium wurde abgesaugt und frisches MEM mit 100 μg/ml Kaliumdihydrogenphosphat und 575 μg/ml Dinatriumhydrophosphat- Dihydrat aus der lOOfach konzentrierten Phosphat-Stammlösung ± 100, 500 resp. 1000 μg/ml Testsubstanz zugegeben und für 60 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
• Das Inkubationsmedium wurde abgesaugt, einmal mit jeweils 10 ml pro Schale 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen, die Zellen durch kurzzeitige Trypsin/EDTA-Behandlung abgelöst (5 ml Trypsin/EDTA für 5 min bei 37°C) und suspendiert (+ 5 ml Kochsalzlösung)
• Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (7 min bei 240 x g), der Überstand mit einer Pasteurpipette abgesaugt und das Zellsediment in 1 ml Kochsalzlösung aufgenommen
β Die Proben wurden in Eppendorfcups bei -200C eingefroren und bis zur Phosphatbestimmung gelagert • Nach dem Auftauen am Tag der Phosphatbestimmung wurden die Ep- pendorfcups mit den Zellproben zum Zerstören der Zellmembranen kurz in Flüssigstickstoff schockgefroren (ca. 30 sec) und die Proben anschließend wieder bei Raumtemperatur aufgetaut
• Das entsprechende Volumen (Verdünnung 1:10) zur Phosphatbestimmung wurde zugegeben
• Messung am ATI Unicam UV/Vis Spectrometer UV4 bei einer Wellenlänge von 820 nm
• Die Untersuchungen wurden in dreifachem Parallelansatz durchgeführt
1.2.6 Interne Probenbezeichnungen
• Unbehandelte Zellen in Kulturmedium (KM)
• Kochsalzlösung (NaCl)
• 15 min MEM ohne TS + 60 min IM ohne TS (K)
• 15 min MEM mit 100 μg/ml TS + 60 min IM mit 100 μg/ml TS (TSlOO)
• 15 min MEM mit 500 μg/ml TS + 60 min IM mit 500 μg/ml TS (TS500)
• 15 min MEM mit 1000 μg/ml TS + 60 min IM mit 1000 μg/ml TS (TSlOOO)
Abkürzungen: IM = Inkubationsmedium = Kulturmedium mit Phosphat 1:100; TS = Testsubstanz, d.h. NA = Nicotinamid, INA = Isonicotinamid und THC = Thiamin- hydrochlorid. 2. Ergebnisse
2.1 Tierversuche
In den Fig. 1 bis 8 sind die arithmetischen Mittel ± SEM der Flüssigkeitsaufnahme (ml/24 Stunden; Fig. 1), der Nahrungsaufnahme (mg/24 h; Fig. 2), des Kot-Trockengewichts (g/24 Stunden, Fig. 3), des Körpergewichts (g; Fig. 4), der Harnflussrate (ml/24 Stunden; Fig. 5), der Harnphosphatkonzentration (mg/dl; Fig. 6), der Harnphosphatausscheidung (mg/24 h; Fig. 7) und der Kotphosphatausscheidung (mg/24 h; Fig. 8) der Versuchstiere vor (Kontrolle) oder ein oder zwei Wochen nach der Verabreichung von 0,1/ 0,3, 0,5, 1 oder 2 [mg/g Körpergewicht] Nicotinsäureamid dargestellt. * zeigt eine statistisch signifikante (p < 0,05) Differenz gegenüber dem Wert vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid an.
2.1.1 Flüssigkeitsaufnahme
Wie in Fig. 1 illustriert, folgt auch die Verabreichung von niedrigen Dosen von Nicotinsäureamid eine leichte Abnahme der Flüssigkeitsaufnahme der Versuchstiere, wobei der Effekt bei 0,3 mg/g Körpergewicht für eine Woche die Signifikanz erreicht. Umgekehrt führt die Verabreichung von 0,5 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid eher zu einer leichten, aber signifikanten Zunahme der Flüssigkeitsaufnahme.
2.1.2 Nahrungsaufnahme
Gleichermaßen nimmt die Nahrungsaufnahme der Versuchstiere nach der Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid leicht ab und nach der Verabreichung von 0,5 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid leicht zu; vgl. Fig. 2. 2.1.3 Kot-Trockengewicht
Parallel zu der Auswirkung auf die Nahrungsaufnahme führt die Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid eher zu einer Abnahme des Kot-Trockengewichts der Versuchstiere, wobei dieser Effekt jedoch keine statistische Signifikanz erreicht; vgl. Fig. 3.
2.1.4 Körpergewicht
Die Verabreichung von Nicotinsäureamid führte nicht zu signifikanten Veränderungen des Körpergewichts der Versuchstiere; vgl. Fig. 4.
2.1.5 Harnfluss
Die Harnflussrate der Versuchstiere nahm nach zwei Wochen der Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid signifikant ab; vgl. Fig. 5.
2.1.6 Harnphosphatkonzentration
Die Verabreichung von 0,1 und 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid erhöhte die Harnphosphatkonzentration der Versuchstiere, wobei die Effekte eine bzw. zwei Wochen nach dem Beginn der Behandlung signifikant waren; vgl. Fig. 6.
2.1.7 Harnphosphatausscheidung
Gleichermaßen erhöhte 0,1 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid die Harnphosphatausscheidung der Versuchstiere, wobei dieser Effekt eine Woche nach Beginn der Behandlung signifikant war; Fig. 7. 2.1.8 Fäkalphosphatausscheidung
Nach der Verabreichung von 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid nimmt die Fäkalphosphatausscheidung der Versuchstiere signifikant zu; Fig. 8.
2.1.9 Expression des Phosphattransporters NaPiIIb
Anschließend wurden Western-Blot-Experimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Nicotinsäureamid-Behandlung die Expression des Phosphattransporters NaPiIIb im Darm beeinflusst. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in Fig. 9 dargestellt. Die oberen Balken zeigen die Original-Blots, die unteren Balken die arithmetischen Mittel ± SEM der NaPillb-Abundanz (willkürliche Einheiten) vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid (0 Tage) und 7 Tage nach der Behandlung mit 2 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid. # zeigt statistische Signifikanz (d < 0,05) zwischen der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarms an.
Wie in dieser Abbildung illustriert, war die Proteinabundanz deutlich höher in der ersten (jejunalen) als in der zweiten (ilealen) Hälfte des Dünndarms vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid. Die Nicotinamidbehandlung führt zum vollständigen Verschwinden des NaPillb-Proteins von den Grenzen des Dünndarmborstensaums.
2.1.10 Phosphatkonzentration im Plasma
Als Nächstes wurde untersucht, ob die Verabreichung von Nicotinsäureamid zu einer Abnahme der Phosphatkonzentration im Plasma der Versuchtiere führt. Das Ergebnis eines entsprechenden Experimentes ist in Fig. 10 dargestellt. Gezeigt sind die arithmetischen Mittel ± SEM der Plasmaphosphatkonzentration (mg/dl) vor (Kontrolle) oder eine oder zwei Wochen nach der Verabreichung von 0,1, 0,3, 0,5, 1 oder 2 [mg/g Körpergewicht] Nicotinsäurea- mid. * zeigt einen statistisch signifikanten (p < 0,05) Unterschied gegenüber dem Wert vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid an.
Dabei zeigt sich, dass es bei höheren Dosen (> 0,5 mg/g) Nicotinsäureamid zu einer Abnahme der Plasmaphosphatkonzentration kommt. Dieser Effekt erreicht statistische Signifikanz zwei Wochen nach dem Beginn der Verabreichung von 0,5 und 1 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid und eine Woche nach der Verabreichung von 2 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid. Im Gegensatz zu dem erniedrigenden Effekt von Nicotinsäureamid bei > 0,5 mg/g, erhöhte die Verabreichung von Nicotinsäureamid bei niedriger Dosierung (0, 1 mg/g und 0,3 mg/g) die Plasmaphosphatkonzentration. Dieser Effekt erreichte statistische Signifikanz zwei Wochen nach 0,1 und 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid- Verabreichung.
2.2 Zellkulturversuche
Um zu überprüfen, ob der Anstieg der Plasmaphosphatkonzentration bei niedrigen Dosen von Nicotinsäureamid mit einer verringerten Aufnahme von Phosphat in die Zellen einhergeht, haben die Erfinder ein zelluläres Testsystem mit Darmepithelzellen (Zelllinie Caco-2) etabliert, an welchem die Phosphataufnahme der Zellen in Abhängigkeit von Nicotinsäureamid quantitativ bestimmt werden kann. Ferner wurden zwei weitere Testsubstanzen in ihrer Fähigkeit untersucht, die Phosphataufnahme der Zelle zu beeinflussen, nämlich Isonicotinsäureamid und Thiaminhydrochlorid.
2.2.1 Phosphateichkurve
Zunächst wurde eine Phosphateichkurve zur Dokumentation des linearen Messbereiches erstellt. In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Phosphatmesswerte bei einer Verdünnung von 1:10 dargestellt.
Figure imgf000026_0001
Tab. 1: Tabellarische Darstellung der Phosphat-Messwerte bei einer Verdünnung von 1:10 zur Dokumentation des linearen Messbereiches
Fig. 11 zeigt eine graphische Darstellung der Phosphatmesswerte aus Tabelle 1 zur Dokumentation des linearen Messbereiches.
Bei den anschließenden Phosphatmessungen lagen die maximalen optischen Dichten (OD) bei 820 nm bei 0,8 und waren damit noch im linearen Bereich der Eichkurve.
2.2.2 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Kontrollen)
In Fig. 12 ist die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Caco-2) in der Kontrolle (K = Kulturmedium mit Phosphat 1:100 ohne Testsubstanz) im Vergleich zu Zellen in Kulturmedium (KM = Kulturmedium ohne Phosphat 1:100 und ohne Testsubstanz) dargestellt. Die Phosphataufnahme der Zellen beträgt 27,63 ± 6,6 % (Mittelwert ± Standardabweichung) und ist signifikant (p < 0,05; Student's t-Test). Somit ist gezeigt, dass alle mit den Testsubstanzen gemessenen Wirkungen tatsächlich auf einer durch die einstündige Inkubation mit Phosphat 1:100 erhöhten basalen Phosphataufnahme durch die Zellen beruhen. 2.2.3 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Nicotinsäureamid
In Fig. 13 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Nicotinsäureamid (NA) auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Caco- 2) dargestellt. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Dabei ist eindeutig zu erkennen, dass Nicotinsäureamid eine Dosis-abhängige Reduktion der Phosphataufnahme mit steigender Nicotinsäureamid- konzentration um ca. 22 bis 26 % bewirkt. Selbst bei der niedrigsten Testkonzentration von 100 μg/ml ist die Reduktion bereits signifikant (p < 0,05; Stu- dent's t-Test).
Dieses Experiment bestätigt demnach, dass eine Erhöhung der Plasmaphosphatkonzentration mit einer Reduktion der Phosphataufnahme durch Nicotinsäureamid einhergeht.
Die Erfinder haben nun erkannt, dass die herabgesetzte zelluläre Aufnahme von Phosphat die zelluläre Akkumulation von Calciumphosphat (CaHPO^ und damit die Gefahr der Arteriosklerose mindert.
2.2.4 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Isonicotinsäu- reamid
In Fig. 14 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Isoni- cotinsäureamid (INA) auf die Phosphataufnahme durch die Darmepithelzellen dargestellt. Angegeben ist wieder der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).
Dabei zeigt sich, dass Isonicotinsäureamid die Phosphataufnahme der Zelle weitgehend unbeeinflusst lässt. So ist bei den Konzentrationen 500 μg/ml bzw. 1000 μg/ml keine Abweichung gegenüber der Kontrolle feststellbar (p < 0,05; Student's t-Test). 2.2.5 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Thiamin- hydrochlorid
In Fig. 15 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Thia- minhydrochlorid (THC) auf die Phosphataufnahme durch die Darmepithelzellen dargestellt. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichungen (n = 3).
Dabei zeigt sich, dass Thiaminhydrochlorid eine Dosis-abhängige Förderung der Phosphataufnahme um ca. 29 bis 9 % mit umgekehrter Proportionalität bewirkt, d.h. je geringer die Testkonzentration, desto größer wird die Förderung der Phosphataufnahme. Nur bei der niedrigsten Testkonzentration von 100 μg/ml ist allerdings die Förderung signifikant (p < 0,05; Student's t-Test).
2.2.6 Alle Testsubstanzen im Vergleich/Zusammenfassung
Die mit den drei getesteten Substanzen erzielten Ergebnisse zur Phosphataufnahme in die Zellen sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
Tab. 2: Tabellarische Darstellung aller Messwerte zur Phosphataufnahme unter dem Einfluss der drei verschiedenen Konzentrationen der drei verschiedenen Testsubstanzen.
Die Erfinder konnten anhand von Tierversuchen und mittels eines zellulären Testsystems nachweisen, dass Nicotinsäureamid die Aufnahme von Phosphat in die Zelle aus dem Plasma signifikant reduzieren kann und dadurch eine wirksame Substanz zur Behandlung und Prophylaxe von Arteriosklerose darstellt. Beeindruckenderweise ist Nicotinsäureamid die einzige Testsubstanz, die die Phosphataufnahme in die Zellen bei allen getesteten Konzentrationen reduziert.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Nicotinsäureamid zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittels zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, vorzugsweise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein Lipidsenker (Statin) ist.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidsenker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Atorvastatin, Cerivastatin, FIu- vastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine gegen „Flush" wirksame Substanz aufweist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die gegen „Flush" wirksame Substanz ein Inhibitor der Cyclooxygenase (COX) ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die gegen „Flush" wirksame Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Acetylsalicylsäurederivaten (einschließlich Aspirin), Arylpropionsäurede- rivate (einschließlich Ibuprofen, Flurbiprofen, Naproxen, Ketoprofen, Tiaprofensäure), Arylessigsäurederivate (einschließlich Diclofenac), Indolessig- säurederivate (einschließlich Indometacin), Anthranilsäurederivate (einschließlich Flufenamin-, Mefenaminsäure), Oxicame (einschließlich Piroxicam, Tenoxicam, Meloxicam), Pyrazolidindione (einschließlich Phenylbutazon) und weitere nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR bzw. NSAID), sowie DP-Antagonisten.
12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, das die folgenden Schritte aufweist:
(1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, und (2) Formulierung des Nicotinsäureamids in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittels zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, vorzugsweise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein ein Lipidsenker (Statin) ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidsenker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Atorvastatin, Cerivastatin, FIu- vastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine gegen „Flush" wirksame Substanz aufweist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die gegen „Flush" wirksame Substanz ein Inhibitor der Cyclooxygenase (COX) ist.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die gegen „Flush" wirksame Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Acetylsalicylsäurederivaten (einschließlich Aspirin), Arylpropionsäurede- rivate (einschließlich Ibuprofen, Flurbiprofen, Naproxen, Ketoprofen, Tiaprofensäure), Arylessigsäurederivate (einschließlich Diclofenac), Indolessig- säurederivate (einschließlich Indometacin), Anthranilsäurederivate (einschließlich Flufenamin-, Mefenaminsäure), Oxicame (einschließlich Piroxicam, Tenoxicam, Meloxicam), Pyrazolidindione (einschließlich Phenylbutazon) und weitere nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR bzw. NSAID), sowie DP- Antagonisten.
23. Verfahren zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht, das folgende Schritte aufweist:
(1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid,
(2) Einbringung des Nicotinsäureamids in das Lebewesen, und
(3) ggf. mehrfaches Wiederholen der Schritte (1) und (2).
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