WO2008069232A1

WO2008069232A1 - 分子モジュール

Info

Publication number: WO2008069232A1
Application number: PCT/JP2007/073482
Authority: WO
Inventors: Eisaku Katayama; Takashi Murayama; Taku Kashiyama; Takuya Kobayashi
Original assignee: The University Of Tokyo; Juntendo University
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2008-06-12
Also published as: US8304520B2; JP5152807B2; US20100105882A1; EP2098538A1; EP2098538A4; JPWO2008069232A1

Abstract

　薬物など特定のリガンドに対する受容体となる高分子に特異的に結合し、その性質を探索するためのさまざまな過程に一貫して対応できる汎用の実験用ツールを提供することを目的とする。この目的を達成するため、標的化合物と結合し、その化合物を精製又は標識するために使用する分子モジュールであって、棒状構造物質と、標的化合物と相互作用をする相互作用物質と、タグと、標識物質とを有し、相互作用物質が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とする分子モジュールを開発した。

Description

明細書

分子モジユーノレ

技術分野

[0001] 本発明は、標的化合物を精製又は標識するために使用する分子モジュール、並びにこの分子モジュールを利用したタグ及び標識付加タンパク質、及びタンパク質の精製方法に関する。

背景技術

[0002] タンパク質や核酸など細胞を構成する何らかの高分子成分に結合して作用する生理活性物質や薬物、抗体など特定のリガンドに対する受容体となる分子の性質を探索するには、通常、各種の既存技術の中から必要に応じて選んだいくつかの手法を組み合わせて用いる。例えば、未知の受容体を薬物などの誘導体をリガンドとした光ァフィ二ティ標識法などにより同定する手法、細胞内におけるその受容体の局在部位を明らかにする手法、当該受容体を単離精製して性質を調べる手法、受容体 (複合体）分子内における結合部位をより高い分解能で明らかにする手法など、目的に応じてさまざまな手法を併用せざるを得なレ、。たとえ一種類のリガンドに関する研究であつても、それぞれの手法に適したリガンド誘導体を別々に作製する必要があり、そのために必要とされる負担は多大なものである。

[0003] 特定の薬物が結合する成分を同定するための方法として、ァフィ二ティ標識法が知られている。この方法は、リガンドに蛍光色素や放射性同位元素などを付加した誘導体を対象に光架橋して、電気泳動や各種のクロマトグラフィを用いて、標識された分子の分子量やアミノ酸配列などの情報を得るものである。

[0004] また、受容体などリガンドの結合対象となる物質の単離精製にはァフィ二ティ精製と称される一連の手法がしばしば用いられる。対象がタンパク質やその複合体の場合、共有結合によりリガンドを固定化した樹脂ビーズをカラムに詰めて対象を含む原材料の溶液を通し、結合した分画のみを解離させて溶出する古典的クロマトグラフィ法が標準的であるが、カラムにかけ難い大きな膜分画や浮遊細胞を対象とする場合には、上述と同様の樹脂ビーズや磁気ビーズなどを用いて遠心分離や磁力で集めるバッチ法も使われる。特に細胞内小器官や浮遊細胞などの膜内に埋まるタンパク質を結合させて目的対象を分離する際には、樹脂や磁気ビーズの表面に直接固定化されたリガンドが相手に触れ難い場合も多ぐその問題を解決するにはビーズとリガンドの間に直鎖状の炭素でできたスぺーサーを揷入する。し力、し炭素鎖を長くすると往々にして疎水性が強くなり、リガンドによる対象との結合が必ずしもそれらの特異性を反映しなくなる可能性も高い。この問題を軽減するには水溶性が高ぐし力、も常にその長レ、距離を保てるスぺーサーを用いることが望ましレ、。

[0005] 一方、細胞内外におけるリガンド結合タンパク質の局在部位を顕微鏡的に示すには、生化学ある!/、は分子生物学的手法で調製したタンパク質の一部または全部を用 V、て特異抗体を作製し、それを用いた蛍光抗体法や免疫電子顕微鏡法などにより存在部位を明らかにする。さらに標的分子 (複合体）内における結合部位の探索には受容体'リガンド複合体を純化そして結晶化して X線回折にかけるなど、原子分解能の得られる手段により構造データを得るのが常套手段である。

[0006] 作業ロボット化などにより多くの材料を網羅的に探索する方法は工夫されてはいるものの、当初の目的を果すには、基本的にはこれらを組み合わせて一歩一歩地道に進めて行く外に術がない。どのような過程を採用するにせよ、それぞれの手法に合わせて個別の探索用リガンドを跳える必要があり、労力、時間、さらには費用の面で相当の負担を強!/、られるのが常である。

[0007] 特許文献 1：特開 2005— 291836号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 上述したような状況に際し、リガンド ' ·受容体間の特異的親和性（ァフイエティ）を生力、して全ての探索過程に共通に使うことのできる便利な材料が存在すれば、上記の負担を大幅に削減することが可能である。タンパク質工学や有機化学を駆使してそのような目的に使える汎用のタンパク質モジュールを新たに開発することが望まれる。本発明は、そのような要望に応え、薬物など特定のリガンドに対する受容体となる高分子に特異的に結合し、その性質を探索するためのさまざまな過程に一貫して対応できる汎用の実験用ツールを提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、探索対象とする化合物にタグと標識とを棒状構造物質を介して付加することにより、対象化合物の性質を変えることなぐ同定、単離、顕微鏡観察などの広範な探索手法に適した形態にでさることを見出した。

[0010] 標識とタグは、棒状構造物質を介さずに対象化合物に直接付加することも可能ではある。例えば、探索対象化合物を標識とタグとの融合タンパク質とする方法、標識とタグのそれぞれに探索対象化合物と親和性のある物質を付加し、探索対象化合物に結合させる方法などが考えられる。しかし、前者の場合、標識とタグが揷入されたことにより、探索対象化合物の立体構造が破壊または変形され、本来の性質が失われてしまう可能性がある。また、後者の場合、探索対象化合物又はその近傍に存在する化合物の構造上の問題力も標識とタグが探索対象化合物にうまく結合できない場合があり、また、結合できたとしても、標識やタグが探索対象化合物の表面から十分に露出せず、標識やタグとしての機能が不十分になる可能性がある。

[0011] 本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。

即ち、本発明は、以下の（1)〜（； 14)を提供するものである。

[0012] (1)標的化合物と結合し、その化合物を精製又は標識するために使用する分子モジユールであって、棒状構造物質と、標的化合物と相互作用をする相互作用物質と、タグと、標識物質とを有し、相互作用物質が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とする分子モジユール。

(2)棒状構造物質、相互作用物質、タグ、及び標識物質が、一本のポリペプチド鎖を形成していることを特徴とする（1)に記載の分子モジュール。

(3)棒状構造物質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺクトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする（1)又は（2)に記載の分子モジユーノレ。

[0013] (4)タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする（1)乃至

(3)の V、ずれかに記載の分子モジュール。 (5)標識物質が、 GFP又は DsRedであることを特徴とする（1)乃至（4)の!/、ずれかに記載の分子モジュール。

(6)タンパク質本体と、棒状構造物質と、タグと、標識物質とを有し、タンパク質本体が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とするタグ及び標識付加タンパク質。

[0014] (7)タンパク質本体、棒状構造物質、タグ、及び標識物質が、一本のポリペプチド鎖を形成していることを特徴とする（6)に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

(8)棒状構造物質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺクトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする（6)又は（7)に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

(9)タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする（6)乃至 (8)の!/、ずれかに記載のタグ及び標識付加タンパク質。

[0015] (10)標識物質が、 GFP又は DsRedであることを特徴とする（6)乃至（9)のいずれかに記載のタグ及び標識付加タンパク質。

(11)タンパク質本体と、棒状構造タンパク質と、タグと、標識タンパク質を有し、タンノ^質本体が棒状構造タンパク質の一端に配置され、タグと標識タンパク質が棒状構造タンパク質の別の一端に配置されている構造の融合タンパク質をコードする DN Aを細胞内で発現させる工程、前記細胞を破砕し、その破砕液をタグと親和性を持つ物質と接触させる工程、タグと親和性を持つ物質に結合した融合タンパク質を回収する工程を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。

[0016] (12)棒状構造タンパク質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺクトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする（11)に記載のタンパク質の精製方法。

(13)タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする（11)又は（12)に記載のタンパク質の精製方法。

(14)標識タンパク質が、 GFP又は DsRedであることを特徴とする（11)乃至（13)のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。

発明の効果 [0017] 従来、物質の性質を探索するためには、探索手法ごとに探索対象物質をその手法に適した形態に変換することが必要であった力本発明の分子モジュールを用いることにより、そのような煩雑な作業を省略することが可能になる。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]本発明の分子モジュールの模式図（A)及び本発明のタグ及び標識付加タンパク質の模式図 (B)。

[図 2]ダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質 (棒状構造の短!/、タイプのタンパク質を使用している。以下、このタイプのものを「shortタイプ」という。）、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 GFPを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が GFPであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分がダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質である。

[図 3]ダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質（shortタイプ）、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 DsRedを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が DsRedであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分がダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質である。

[図 4]ダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質 (棒状構造の長!/、タイプのタンパク質を使用している。以下、このタイプのものを「longタイプ」という。）、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 GFPを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が GFPであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分がダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質である。

[図 5]ダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質（longタイプ）、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 DsRedを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が DsRedであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分がダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質である。

[図 6]—本の α—ァクチニンの棒状領域、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 GFP を含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が GFPであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分が aーァクチニンの棒状領域である。

[図 7]スぺーサーモジュールの構造を模式的に示した図。

[図 8]Niビーズで精製したスぺーサーモジュールの電気泳動図（A)、及び Mビーズで精製したスぺーサーモジュールと Streptavidinとの反応性実験の結果を示す図（B)。

[図 9]ロータリーシャドウイング法によるスぺーサーモジュールの観察結果を示す図。図中の矢印がスぺーサーモジュールを示す。

[図 10]スぺーサーモジュールと結合させた融合タンパク質の細胞内における局在を示す図。

[図 11]スぺーサーモジュールと結合させたクラスリン軽鎖と力べォリン- 1の細胞内における局在を示す図。

[図 12]スぺーサーモジュールと IP3R1の融合タンパク質を Niカラムで精製した際の各精製段階の画分の電気泳動図。 Aがスぺーサーモジュール付カロ IP3R1を示し、 Bが H isタグ付加 IP3R1を示す。レーン 1 :カラムに添加したサンプル、レーン 2 :カラム通過物、レーン 3 :—回目の洗浄画分、レーン 4 :二回目の洗浄画分、レーン 5〜8：溶出画分。

[図 13]スぺーサーモジュールを C末に結合させたクラスリン軽鎖を発現させた HEK細胞抽出物を Mカラムで精製した際の電気泳動図。対照ではスぺーサーモジュールの代わりにヒスチジンタグを付加してある。

[図 14]スぺーサーモジュール結合クラスリン軽鎖を発現させた HEK細胞からモジユールを用いて精製したクラスリン分子（triskelion)のロータリーシャドウイング法による観察結果。図中の矢印はスぺーサーモジュールの GFPを指す。 shortタイプ（図中の「sh ortj )と longタイプ（図中の「long」 )では長さが異なるが、 V、ずれも分子の中心から突出し、そこにモジュールの他端が局在することが分かる。

園 15]スぺーサーモジュール融合クラスリン軽鎖を発現させた HEK細胞から精製した被覆小胞（coated vesicle)のネガティブ染色法による観察結果。低倍率の視野（下）中に見られる粒子の大部分が被覆小胞である。矢印で指す個々の粒子の拡大図を上パネルに示す。挿入図は被覆小胞中の分子配列の模式図。

園 16]スぺーサーモジュール融合クラスリン軽鎖を発現した HEK細胞から精製した被覆小胞（coated vesicle)の電気泳動図（右)。中央は可溶化後に単独で精製したクラスリン分子 (triskeli_0n)。左は分子量マーカー.。被覆小胞として精製された分画はクラスリン以外の多数の構成タンパク質を含む。

[図 17]スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールと結合させた細胞質ダイニン軽鎖の細胞内における局在を示す図。 Aが単独のスぺーサーモジュールを示し、 Bが細胞質ダイニン軽鎖と結合したものを示す。

[図 18]スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールを融合したクラスリン軽鎖の細胞内局在。スぺーサーモジュール単独発現の場合には特定部位に局在しな!、 (A)力クラスリン軽鎖に融合した場合には野生型クラスリンと同等の局在を示す (B)。

[図 19]二本の α—ァクチニンの棒状領域、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド、 GFP を含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。一本下線を付けた部分が GFPであり、二本下線を付けた部分がビォチン化ペプチドであり、破線の下線を付けた部分がヒスチジンタグであり、枠で囲った部分がリンカ一であり、下線等をつけていない部分が aーァクチニンの棒状領域である。

符号の説明

1 タグ

2 標識物質

3 棒状構造物質

4 相互作用物質

5 標的化合物 6 タン/ ク質本体発明を実施するための最良の形態

[0020] 以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の分子モジュールは、標的化合物と結合し、その化合物を精製又は標識するために使用するものであって、棒状構造物質と、標的化合物と相互作用をする相互作用物質と、タグと、標識物質とを有し、相互作用物質が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されて V、ることを特徴とするあのである。

[0021] 標的化合物は、本発明の分子モジュールにより精製又は標識可能なものであれば特に制限はなぐタンパク質や核酸など生体高分子やこれらと結合する低分子化合物などを広く使用することができる。

[0022] 棒状構造物質としては、棒状構造をとり得る物質であれば特に制限はないが、タンノク質であること力 S好ましく、例えば、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、スぺクトリンリピート構造をとるタンパク質、繊維状ファージ、ファージの繊維状タンパク質などが好ましい。逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質としては、例えば、モータータンパク質であるダイニンのストーク部位や、このダイニンのストーク部位に対して、逆平行型コイルドコイル構造がより強固になるように人為的な変異を加えたタンパク質を挙げること力 Sできる。このような人為的な変異を加えたタンパク質として、配列番号 6記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列番号 7記載のアミノ酸配列で表されるペプチドとからなるタンパク質（shortタイプ)や配列番号 8記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列番号 9記載のアミノ酸配列で表されるペプチドとからなるタンパク質 (longタイプ)を例示できる。本例においては、長尺型の棒状構造は短尺型の 150%の長さを有する。逆平行コイルドコイル構造は他にも、「Current Opinion i n StructuralBiology 2001, 11 :450-457」などを参照して行うことができる。スぺクトリンリピート構造をとるタンパク質としては、例えば、 α—ァクチニンの棒状領域や、スぺタトリンリピート構造がより強固になるように人為的な変異を加えたタンパク質を挙げることができる。 α—ァクチニンの棒状領域としては、例えば、配列番号 10記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質や、配列番号 13記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列番号 14記載のアミノ酸配列で表されるペプチドの二つからなるタンパク質を挙げること力 Sできる。なお、この二つのペプチドからなるタンパク質の場合、標識物質等は二つのペプチドの間に揷入する。繊維状ファージとしては、 flファージ、 fdファージ、 M13ファージなどを例示できる。棒状構造物質は、タンパク質以外の物質であってもよく、そのような非タンパク質性の物質としては、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、アミロースなどを例示できる。

[0023] 棒状構造物質の長さ及び直径は、標的化合物とタグ及び標識物質との間に適当な距離を確保できるのであれば特に制限はないが、長さは 5〜50 nmとするのが好ましく、 10〜30 nmとするのが更に好ましぐ直径は 1〜10 nmとするのが好ましぐ 2〜5 nmとするのが更に好ましい。

[0024] 相互作用物質は、標的化合物と相互作用をするものであればどのようなものでもよぐタンパク質や低分子リガンドなどを例示できる。どのような相互作用物質を選択するかは、標的化合物の種類に応じて決めればよい。例えば、標的化合物がタンパク質であれば、相互作用物質はそれを認識する抗体とすることができ、標的化合物が抗体であれば、相互作用物質はその抗体が認識する抗原とすることができ、標的化合物が受容体であれば相互作用物質はその受容体に対するリガンドとすることができ、逆に標的化合物カ^ガンドであれば相互作用物質はそのリガンドに対する受容体とすること力 Sでさる。

[0025] タグとしては、タンパク質の精製などに利用されている一般的なものでよぐ例えば、ヒスチジンタグ、ビォチン化ペプチド (例えば、配列番号 11記載のアミノ酸配列で表されるペプチド）、ポリアルギニン、 FK506結合タンパク質（FKBP)などを挙げることができる。タグは、分子モジュール中に一つだけでもよいが、二つ以上あってもよい。標識物質がタンパク質である場合、タグはそのタンパク質の内部に揷入されていてもよい。タグを揷入する部位は、標識物質として使用するタンパク質の機能を失わせない部位であれば特に限定されないが、ループ構造をとっている部位が好ましい。ループ構造をとっている挿入部位としては、 GFPにおける 173番目のアミノ酸残基と 174番目のアミノ酸残基の間、 DsRedにおける 170番目のアミノ酸残基と 171番目のアミノ酸残基の間などを例示できる。標識物質としては、生体分子などの標識に一般的に用いられているものでよぐ例えば、蛍光物質、色素、重金属化合物、重金属コロイド、酸化還元酵素などを使用すること力 Sできる。標識物質は、タンパク質性のものを使用するのが好ましぐ蛍光タンパク質を使用するのが更に好ましい。蛍光タンパク質としては、 GFP (Aeauorea victor ia green fluorescent oroteinノゃ DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein )などを使用するのが好ましい。これらの蛍光タンパク質以外にも、 GFPの変異体である強化緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescence Protein:EGFP)、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein :YFP)、強化黄色蛍光タンパク質（Enhanced Y ellow f luorescence Protein： EYFP)、ンノ'ノ光タンノヽク貧 (Cyan Fluorescence Prote in:CFP)、強化シアン蛍光タンパク質（Enhanced Cyan Fluorescence Protein:ECFP) 、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein:BFP)、及び強化青色蛍光タンパク質（Enhanced Blue Fluorescence Protein： EBFP)、並びに DsRedの変異体であるモノマーバナナ色蛍光タンパク質（mBanana)、モノマーオレンジ色蛍光タンパク質（mO range)、モノマーミカン色蛍光タンパク質（mTangerine)、モノマーイチゴ色蛍光タンパク質（mStrawberry)、及びモノマーサクランボ色蛍光タンパク質（mCherry)などを使用することもできる。標識物質として非タンパク質性の蛍光物質を使用してもよぐ例えば、フルォレセイン系、ローダミン系、ェォシン系、 NBD系の蛍光物質を使用することができ、具体的には、フルォレセイン 5—イソチオシァネート、ジァシル (イソブチリル、ァセチル又はビバロイル）フルォレセイン 5及び/又は 6—力ルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル、 6—（ジァシルー 5及び/又は 6—カルボキサミドーフルォレセイン）ァミノへキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル、テキサス ·レッド（Texa s Red: Molecular Probes, In の商標）、テトラメチルローダミン一 5 (及び 6)イソチオシァネート、ェォシンイソチオシァネート、エリトロシン 5—イソチオシァネート、 4 クロロー 7 二トロべンズー2 ォキサ 1 , 3 ジァゾ一ノレ、 4ーフノレオロー 7 二トロベンズー2 ォキサ—1 , 3 ジァゾール、 3—（7 二トロべンズー2 ォキサ—1 , 3 ジァゾ一ルー 4ーィノレ）メチルァミノプロピオ二トリル、 6 - (7 二トロべンズー2 ォキサ一 1 , 3 ジァゾール 4 ィル）ァミノへキサン酸、スクシンイミジノレ 12— (N メチルー N— (7 二トロべンズー2 ォキサ 1 , 3 ジァゾ一ルー 4 ィル）アミノドデカノエート、 7—ジェチルアミノー 3—（4' イソチオシアナトフェニノレ） 4ーメチルクマリン（CP)、 7—ヒドロキシクマリンー4 酢酸、 7—ジメチルァミノクマリンー4 酢酸、スクシンィミジル 7—ジメチルァミノクマリンー4 アセテート、 7—メトキシクマリンー4 酢酸、 4 ァセトアミドー 4，一イソチオシアナトスチルベン 2, 2，一ジスルホン酸（ SITS) , 9 クロロアタリジン、スクシンィミジル 3—（9一力ルバゾール）プロピオネート、スクシンィミジル 1ーピレンブチレート、スクシンィミジル 1ーピレンノナノエート、 p 二トロフエニル 1ーピレンブチレート、 9 アントラセンプロピオン酸、スクシンィミジルァントラセンー9 プロピオネート、 2 アントラセンスルホユルクロリドなどを使用してもよい。

[0027] 棒状構造物質、タグ、及び標識物質の三者は一つのポリペプチド鎖からなる融合タンパク質であってもよい。この場合、相互作用物質が低分子リガンドであるときは、棒状構造物質の先端部分の活性基 (N末アミノ酸のアミノ基、 C末アミノ酸のカルボキシル基、またはシスティン残基のチオール基など）を介して共有結合させることができる。また、相互作用物質がタンパク質であるときは、相互作用物質も含めた四者の融合タンノク質としてもよい。

[0028] 本発明の分子モジュールは、標的とする化合物の精製又は標識のために使用される。具体的には、以下の用途に使用することができる。

[0029] (1)生体成分の精製

本発明の分子モジュールを生体成分の粗抽出物に加えれば、その一端が目的の生体成分に特異的に結合して複合体を形成する。その複合体をタグを介して樹脂ビーズゃ磁気ビーズで回収することができる。その際、目的に応じて溶液中に塩ゃ界面活性剤を添加することにより、純化を目標とする対象を単体で、あるいは複合体のまま、ひいてはさらに大きな細胞内小器官や細胞全体としても精製することができる。

[0030] (2)顕微鏡観察時の標識

標識物質として蛍光物質を用いることで、蛍光シグナルを顕微鏡観察することにより、細胞内あるいは小器官内における標的化合物の局在を示したり、生きた状態でその化合物の動態を追跡することもできる。また、タグに結合する適当な金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡法により、組織試料中におけるリガンド結合部位の探索も可能である。更に、本発明の分子モジュールは棒の先端に球状部分を有す特有な形状を示すので、高分解能の電子顕微鏡画像を用いてタンパク質分子や複合体中の結合領域を直接示すことも可能と思われる。

[0031] 棒状構造物質、相互作用物質、タグ、標識物質の位置関係は、例えば、図 1 (A)に示すようになる。相互作用物質〔4〕は、棒状構造物質〔3〕の一端に配置され、タグ〔1 〕と標識物質〔2〕が棒状構造物質〔3〕の別の一端に配置されている。この図では、タグ〔1〕は、標識物質〔2〕と結合してレ、る力棒状構造物質〔3〕に直接結合してもよ!/、。また、この図とは逆に、タグ〔1〕が棒状構造物質〔3〕に直接結合し、標識物質〔2〕がタグ〔1〕に結合するような位置関係になってもよい。このように位置関係をとることにより、標的化合物〔5〕と、タグ〔1〕及び標識物質〔2〕とが一定の距離を保つができ、両物質が近接することによる様々な悪影響を排除することができる。

[0032] 本発明のタグ及び標識付加タンパク質は、タンパク質本体と、棒状構造物質と、タグと、標識物質とを有し、タンパク質本体が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とするものである

〇

本発明のタグ及び標識付加タンパク質における棒状構造物質、タグ、標識物質は、本発明の分子モジュールと同様のものを使用でき、また、各物質の位置関係も分子モジュールの場合と同様である（図 1 (B) )。タンパク質本体としては特に制限はなぐ受容体タンパク質など生体内で重要な働きをしているタンパク質などを使用することができる。

[0033] 棒状構造物質、タグ、標識物質はいずれもタンパク質であることが好ましぐこれらはタンパク質本体と共に、一つのポリペプチド鎖からなる融合タンパク質であることが更に好ましい。図 2〜6及び図 19にこのような融合タンパク質の具体例を示す（但し、タンパク質本体は含まれない。）。図 2は、棒状構造物質としてダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質（shortタイプ）、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ペプチド、標識物質として GFPを用いた融合タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。図 3は、棒状構造物質としてダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質 (shortタイプ）、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ペプチド、標識物質として Ds Redを用いた融合タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。図 4は、棒状構造物質としてダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質（longタイプ）、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ペプチド、標識物質として GFPを用いた融合タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。図 5は、棒状構造物質としてダイニンのストーク部位に変異を加えたタンパク質（longタイプ）、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ぺプチド、標識物質として DsRedを用いた融合タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。図 6は、棒状構造物質として一本の α—ァクチニンの棒状領域、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ペプチド、標識物質として GFPを用いた融合タンパク質のァミノ酸配列を示すものである。図 19は、棒状構造物質として二本の α—ァクチニンの棒状領域、タグとしてヒスチジンタグ及びビォチン化ペプチド、標識物質として GFPを用いた融合タンパク質のアミノ酸配列を示すものである。なお、図 2、図 3、図 4、図 5、図 6、及び図 19のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号 1、 2、 3、 4、 5、及び 12にも示す。

[0034] 本発明のタンパク質の精製方法は、タンパク質本体と、棒状構造タンパク質と、タグと、標識タンパク質を有し、タンパク質本体が棒状構造タンパク質の一端に配置され、タグと標識タンパク質が棒状構造タンパク質の部位の別の一端に配置される構造をとる融合タンパク質をコードする DNAを細胞内で発現させる工程、前記細胞を破砕し、その破砕液をタグと親和性を持つ物質と接触させる工程、タグと親和性を持つ前記物質に結合した融合タンパク質を回収する工程を含むことを特徴とするものである。

[0035] このタンパク質の精製方法は、本発明のタグ及び標識付加タンパク質を応用したものである。また、この方法は、タグ及び標識タンパク質を、棒状構造タンパク質を介して付加することを除き、通常のタグ付きタンパク質の精製方法と同様に行うことができ実施例

[0036] 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

[0037] 〔実施例 1〕スぺーサーモジュールの設計

図 2及び図 4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、このタンパク質を「スぺーサーモジユーノレ」という。）を設計した。このスぺーサーモジユーノレは、 GFP、ヒスチジンタグ（8 X His)、ビォチン化ペプチド（biotin acceptor domain, BAD)、逆平 fi型コィルドコイル構造をとるタンパク質を有する。図 7にこのスぺーサーモジュールの構造の模式図を示す。 His-tagとビォチン化ペプチドは、 GFPのループ部分（173-174)に揷入されており、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質は、 GFPの N末端及び C末端に付加されている。逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質は、細胞質ダィニンの stalkをもとにして、より安定するように人工的な変異を導入した。図 2に示すスぺーサーモジユーノレと図 4に示すスぺーサーモジユーノレとでは、逆平 fl型コイノレドコイル構造をとるタンパク質が異なり、前者は短いタイプの棒状構造を有し、後者は長!/、タイプの棒状構造を有する。

また、 GFPの代わりに DsRedを用い同様のスぺーサーモジュールも設計した（図 3及び図 5)。

[0038] 〔実施例 2〕 Mビーズによるスぺーサーモジュールの精製

実施例で設計した 4種類のスぺーサーモジュールをコードする cDNAを pColdベクタ一に挿入して大腸菌で大量発現させた（GFP-short、 DsRed_short、 GFP_long、 DsRe d_long)。菌体を破砕後、上清を Niビーズに結合した。ビーズを 20 mM imidazoleを含む溶液で洗った後、 300 mM imidazoleで溶出した。溶出画分を SDS-PAGEした。この結果を図 8Aに示す。

V、ずれのスぺーサーモジュールも単一のバンドとして検出されたことから、ヒスチジンタグが精製用タグとして機能していることわかる。なお、 shortタイプのスぺーサーモジュールの棒状部分の長さは 16 nm、 longタイプのスぺーサーモジュールの棒状部分の長さは 24 nmと予想された。

[0039] 〔実施例 3〕 Streptavidin HRPによるビォチン化の検出

Niビーズで精製したスぺーサーモジュールを SDS-PAGE後、 PVDF膜に転写し、 str eptavidin HRPでブロッテイングした。この結果を図 8Bに示す。

いずれのスぺーサーモジュールも streptavidinに反応しており、ビォチン化されていること力 Sわ力、る。

[0040] 〔実施例 4〕ロータリーシャドウイング法によるスぺーサーモジュールの形態観察上記スぺーサーモジュールをコードする cDNAを pCold TFベクターに揷入し、大腸菌タンパク質である trigger factorとの融合タンパク質として発現させた。精製した融合タンパク質をロータリーシャドウイング法で観察した。この結果を図 9に示す。

shortタイプ及び longタイプのいずれのスぺーサーモジュールもダンベル様構造を示した。球状構造の間の棒状部分は長尺型の方が長力、つた。これは上の予想と一致している。

[0041] 〔実施例 5〕スぺーサーモジュールを融合させたタンパク質の細胞内局在

スぺーサーモジュール（GFP-short)を単独、又は他のタンパク質との融合タンパク質として HeLa細胞へ発現させ、細胞内の GFP蛍光を検出した。単独で発現させた場合、クラスリン軽鎖との融合タンパク質（C末融合）として発現させた場合、力べォリン- 1との融合タンパク質 (N末融合）として発現させた場合、及び 1型リアノジン受容体 (R yRl)との融合タンパク質（内部揷入， 1379-1380)として発現させた場合のスぺーサ一モジュールの細胞内局在を示す顕微鏡写真をそれぞれ図 10A、図 10B、図 10C 及び図 10Dに示す。

[0042] スぺーサーモジュールを単独で発現させた場合、スぺーサーモジュールは核を除く細胞内に散在していた。クラスリン軽鎖及び力べォリン- 1との融合タンパク質して発現させた場合、スぺーサーモジュールは核周囲と細胞質に点状に局在した。 RyRlとの融合タンパク質して発現させた場合、スぺーサーモジュールは細胞内に網目状に局在し、小胞体に存在することが示された。いずれの融合タンパク質についても、内在性タンパク質と局在部位が一致していたことから、スぺーサーモジュールは、融合対象としてタンパク質の構造、機能に影響を与えないことが示唆された。

[0043] 〔実施例 6〕異なるスぺーサーモジュールによる二重標識

クラスリン軽鎖の C末に GFP-shortを結合させた融合タンパク質と力べォリン- 1の N 末に DsRed-shortを結合させた融合タンパク質を、それぞれ HeLa細胞に発現させ、両者が発現して!/、る細胞を観察した。この結果を図 11に示す。

両融合タンパク質は、核周囲と細胞質に点状に局在していたが、その存在位置は異なっていた。

[0044] 〔実施例 7〕哺乳類細胞に発現させたスぺーサーモジュール融合タンパク質の精製例（その 1) GFP-shortと IP3R1の融合タンパク質（N末融合）をコードする DNAを、 Flp-In T-REx HEK細胞に導入し、安定発現株を選択した。 doxycyclineにより発現誘導した後、膜画分を調製した。 IP3R1は CHAPSで可溶化し、 Mカラムにかけた。カラムは 100 mM i midazoleで洗浄後、 300 mM imidazoleで溶出した。各精製段階の画分中に含まれるタンパク質を電気泳動により分離した。また、比較のため、 N末にヒスチジンタグを揷入した IP3R1についても同様に発現させ、各精製段階の画分中に含まれるタンパク質を調べた。この結果を図 12に示す。

スぺーサーモジュールとの融合タンパク質は、 N末にヒスチジンタグを揷入した IP3R

1と同様に精製されたことから、スぺーサーモジュールは精製用タグとして機能することがわかった。

[0045] 〔実施例 8〕哺乳類細胞に発現させたスぺーサーモジュール融合タンパク質の精製例（その 2)

GFP-shortまたは GFP-longとクラスリン軽鎖の融合タンパク質（C末融合）をコードする DNAを、 Flp-In T-REx HEK細胞に導入し、安定発現株を選択した。 doxycyclineにより発現誘導した後、膜画分を調製した。 0.5 M NaCretriskelionを抽出して Niカラムに力、けた。カラムは 100 mM imidazoleで洗浄後、 300 mM imidazoleで溶出した。 300 mM imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を電気泳動により検出した。対照として C末にヒスチジンタグを揷入したクラスリン軽鎖を発現させた。この結果を図 13に示す。

スぺーサーモジュールを融合したクラスリン軽鎖とともに分子量 160 kDaのクラスリン重鎖が精製されたことからタンパク質複合体として精製されていることがわ力た。

[0046] 〔実施例 9〕ロータリーシャドウイング法によるスぺーサーモジュール融合クラスリン複合体の形態観察

実施例 8で精製したクラスリン複合体をロータリーシャドウイング法で観察した。この結果を図 14に示す。

C末にヒスチジンタグを揷入したクラスリン複合体は典型的な三脚巴構造 (triskelion )を示した。 shortタイプのスぺーサーモジュールを融合したクラスリン軽鎖では、クラスリン軽鎖の C末に一致する triskelionの中心からやや離れた位置に GFPに対応する球状構造が観察された。 longタイプのスぺーサーモジュールを融合したクラスリン軽鎖では、中心からさらに離れた位置に GFPに対応する球状構造力 S、さらに棒状部分も観察され、タンパク質複合体中におけるスぺーサーモジュールの局在が確認できた

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[0047] 〔実施例 10〕スぺーサーモジュール融合タンパク質を発現させた細胞からの細胞内小器官の精製例

スぺーサーモジュール（GFPにヒスチジンタグとビォチン化配列を含み両脇に TEV プロテアーゼ部位を有する）とクラスリン軽鎖の融合タンパク質（C末融合）をコードする DNAを、 Flp-In T-REx HEK細胞に導入し、安定発現株を選択した。 doxycyclineにより発現誘導した後、 0.1 M MES, pH 6.5， 0.5 mM MgC12, 1 mM EGTA溶液で細胞をホモジナイズして膜画分を調製した。膜画分を Streptavidin磁気ビーズに結合させて上記緩衝液で洗浄後、 TEVプロテアーゼで室温、 1時間処理した。溶出画分をネガティブ染色法により電子顕微鏡観察した。その結果を図 15に示す。

溶出画分には直径 100 匪程度の小胞が多数観察された。拡大すると小胞はサッカ一ボール状の骨格で取り囲まれており、典型的なクラスリン被覆小胞（coated vesicles )の形状を示すことが確認された。

[0048] 〔実施例 1 1〕哺乳類細胞に発現させたスぺーサーモジュール融合タンパク質を含む細胞内小器官の精製例

実施例 10で得られた被覆小胞画分中に含まれるタンパク質を電気泳動により分離した。また、比較のため、同膜画分を 0.5 M NaClで抽出した triskelionを同様に精製した。この結果を図 16に示す。

被覆小胞画分では、 triskelionに含まれるクラスリン重鎖および軽鎖に加えて多数の別の構成タンパク質のバンドが検出された。 27 kDa付近のバンドは TEVプロテアーゼ由来である。スぺーサーモジュールが細胞内小器官精製用タグとして有効に機能することがわかった。

[0049] 〔実施例 12〕スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールを融合させたタンパク質の細胞内局在 (その 1 )

スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュール (配列番号 10記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質を含む）を単独、又は他のタンパク質との融合タンパク質として HeLa 細胞へ発現させ、細胞内の GFP蛍光を検出した。単独で発現させた場合、及び細胞質ダイニン軽鎖 (TcTex-1)との融合タンパク質として発現させた場合のスぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールの細胞内局在を示す顕微鏡写真をそれぞれ図 17A 及び図 17Bに示す。

[0050] スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールを単独で発現させた場合は核を除く細胞内に散在していた。細胞質ダイニン軽鎖との融合タンパク質して発現させた場合、スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールは核周囲に局在していた。内在性タンパク質と局在部位が一致していたことから、スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールは、融合対象としてタンパク質の構造、機能に影響を与えないことが示唆された。

[0051] 〔実施例 13〕スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールを融合させたタンパク質の細胞内局在 (その 2)

スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュール (配列番号 13記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列番号 14記載のアミノ酸配列で表されるペプチドを含む）を単独、又は他のタンパク質との融合タンパク質として HeLa細胞へ発現させ、細胞内の GFP 蛍光を検出した。単独で発現させた場合、及びクラスリン軽鎖との融合タンパク質として発現させた場合のスぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールの細胞内局在を示す顕微鏡写真をそれぞれ図 18A及び図 18Bに示す。

[0052] スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールを単独で発現させた場合は核を除く細胞内に散在していた。クラスリン軽鎖との融合タンパク質して発現させた場合、スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールは核周囲と細胞質に点状に局在していた。スぺクトリンリピート型スぺーサーモジュールは、融合対象としてタンパク質の構造、機能に影響を与えないことが示唆された。

[0053] 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願 2006-332530号）の明細書および/または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[I] 標的化合物と結合し、その化合物を精製又は標識するために使用する分子モジュールであって、棒状構造物質と、標的化合物と相互作用をする相互作用物質と、タグと、標識物質とを有し、相互作用物質が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とする分子モジユール。

[2] 棒状構造物質、相互作用物質、タグ、及び標識物質が、一本のポリペプチド鎖を形成して!/、ることを特徴とする請求項 1に記載の分子モジュール。

[3] 棒状構造物質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺクトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の分子モジユール。

[4] タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする請求項 1乃至 3の!/、ずれか一項に記載の分子モジュール。

[5] 標識物質が、 GFP、又は DsRedであることを特徴とする請求項 1乃至 4のいずれか一項に記載の分子モジュール。

[6] タンパク質本体と、棒状構造物質と、タグと、標識物質とを有し、タンパク質本体が棒状構造物質の一端に配置され、タグと標識物質が棒状構造物質の別の一端に配置されていることを特徴とするタグ及び標識付加タンパク質。

[7] タンパク質本体、棒状構造物質、タグ、及び標識物質が、一本のポリペプチド鎖を形成して V、ることを特徴とする請求項 6に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

[8] 棒状構造物質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺクトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする請求項 6又は 7に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

[9] タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする請求項 6乃至 8のいずれか一項に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

[10] 標識物質が、 GFP又は DsRedであることを特徴とする請求項 6乃至 9のいずれか一項に記載のタグ及び標識付加タンパク質。

[I I] タンパク質本体と、棒状構造タンパク質と、タグと、標識タンパク質を有し、タンパク質本体が棒状構造タンパク質の一端に配置され、タグと標識タンパク質が棒状構造タンパク質の別の一端に配置されている構造の融合タンパク質をコードする DNAを細胞内で発現させる工程、前記細胞を破砕し、その破砕液をタグと親和性を持つ物質と接触させる工程、タグと親和性を持つ物質に結合した融合タンパク質を回収するェ程を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。

[12] 棒状構造タンパク質が、逆平行型コイルドコイル構造をとるタンパク質、又はスぺタトリンリピート構造をとるタンパク質であることを特徴とする請求項 11に記載のタンパク質の精製方法。

[13] タグが、ヒスチジンタグ、又はビォチン化ペプチドであることを特徴とする請求項 11 又は 12に記載のタンパク質の精製方法。

[14] 標識タンパク質が、 GFP又は DsRedであることを特徴とする請求項 11乃至 13のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。