WO2008053573A1 - Remède pour néoplasme malin - Google Patents

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WO2008053573A1
WO2008053573A1 PCT/JP2006/325412 JP2006325412W WO2008053573A1 WO 2008053573 A1 WO2008053573 A1 WO 2008053573A1 JP 2006325412 W JP2006325412 W JP 2006325412W WO 2008053573 A1 WO2008053573 A1 WO 2008053573A1
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Takashi Nishimura
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    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to a malignant neoplastic therapeutic agent that can be used for cancer immunotherapy, and an antigenic polypeptide that can be used therefor.
  • One treatment method for cancer includes so-called cancer immunotherapy in which cancer cells are regressed using the immune system of individual patients.
  • cancer immunotherapy in which cancer cells are regressed using the immune system of individual patients.
  • the important point in this method is how to make the immune system recognize the cancer cell as a foreign substance and lead to an immune cell that is aggressive to the cancer cell.
  • CD8 + T cells are T cells that, when activated, lyse cells that present antigens that bind to HLA class I molecules.
  • CD4 + T cells are cytoplasmic Th cells that are activated by macrophages and / or rod-like cells that present antigen by HLA class II molecules, and are responsible for the induction and maintenance of CD8 + T cells. For helper function.
  • Th cells also produce Thl cells (producing IFN- ⁇ , etc.), Th2 cells (producing IL-4, etc.), and ThO cells (having low cytokine production capacity, depending on the type of cytodynamic in secretion. It is known to be classified as IFN- ⁇ and IL-4 together, and the role of each cell is being elucidated.
  • CD4 + T cells can also be expressed by an indirect mechanism for MHC class II molecule-negative tumors (MHC class ⁇ tumors), through macrophage activation, or by a direct mechanism for MHC class ⁇ positive tumors. It can also have a function.
  • Patent Document 1 T cell research in human cancer immunotherapy has focused primarily on the identification and induction of CD8 + HLA class I restricted CTL responses.
  • Patent Document 2 tyrosinase, which is one of cancer antigens, and identification of epitopes for CD4 + T cells have been reported (Patent Document 2).
  • Tyrosinase is the only melanoma-associated tissue-specific antigen that binds to MHC class II molecules, expressed in melanocyte lineage normal and tumor cells and shown as a specific target for CD4 + melanoma-reactive T cells.
  • tyrosinase is an antigen that is expressed only in limited types of tumors, and is not a promising cancer antigen in cancer immunotherapy.
  • Non-Patent Document 2 a gene family encoding a tumor-specific antigen recognized by CD8 + T cells, called MAGE
  • Patent Document 4 Patents
  • the MAGE family also has about 12 member forces expressed in various types of tumors.
  • MAGE-A3 some peptide fragments are presented by HLA class I molecules (Patent Document 5), and some other peptide fragments are HLA class. It was shown to be a peptide (HLA class II-binding peptide) having a function of binding to the II molecule (Patent Document 6, Patent Document 7).
  • MAGE-A3 contains HLA class II-binding peptides.
  • activation of helper T cells by MAGE-A3 peptide There are a number of patients for whom the treatments they contain do not work. Therefore, there is a need to identify additional tumor-related antigens, including epitopes that bind to MHC class II molecules and are recognized by CD4 + T cells.
  • MAGE-A4 a member of the MAGE family, is a tumor-specific antigen consisting of all 317 amino acid residues (SEQ ID NO: 3). MAGE-A4 is highly expressed in many melanoma and tumor tissue types such as esophageal cancer, head and neck cancer, and lung cancer, but it is known that it is expressed in normal cells other than the testis and placenta. (Non-Patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 Regarding the antigenicity of MAGE-A4, it has been reported to present an epitope recognized by CD8 + T cells with amino acid sequence at positions 143-1151 of MAGE-A4 (Non-patent Document 6). As for the function of MAGE-A4, binding to gankyrin has been reported (Patent Document 8), and the portion corresponding to amino acids 211 to 317 corresponding to the C-terminal portion of MAGE-A4 is defined as gankyrin. It is disclosed that it is involved in the binding property. However, at the same time, it has been reported that the C-terminal part of MAGE-A 4 containing the 211st amino acid force up to 97 residues has a binding ability to gankyrin! RU Non-Patent Document l: Topalian, S ⁇ . Et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91st, 946 1-9465
  • Non-Patent Document 2 Plaen et al., 1994, Immunogenetics, pp. 40-360-369
  • Non-Patent Document 3 Traversari, 1992, Immunogenetics ⁇ 35, 145
  • Non-Patent Document 4 van der Bruggen et al., 1991, Science, 254, 1643
  • Non-Patent Document 5 Duffour MT et al., 1999, Eur. J. Immunol., 29th, pp. 3329-3337
  • Non-Patent Document 6 Yoshihiro, M. et al., 2005, Clin. Cancer Res., 121 ⁇ , pp. 5581-5589
  • Patent Document 1 W095 / 19783
  • Patent Document 2 ⁇ ⁇ 097/11669
  • Patent Document 3 PCT / US92 / 04354
  • Patent Document 4 US Pat. No. 5,342,774
  • Patent Document 5 US Pat. No. 5,591,430
  • Patent Document 6 US Pat. No. 5,965,535
  • Patent Document 7 PCT / US99 / 21230
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-123752
  • the present invention provides a novel therapeutic agent useful in a method for treating a malignant neoplasm using a tumor antigen, and a tumor antigen usable for the therapeutic agent.
  • the present inventors have a therapeutic agent comprising a tumor antigen and a Th cell specific for the tumor antigen.
  • the present invention has an effect of remarkably reducing a malignant neoplasm expressed by expressing the tumor antigen.
  • the inventors have experimentally found that the present invention has identified novel antigenic peptides that can be used as the tumor antigens, and have completed the following inventions.
  • a therapeutic agent for malignant neoplasm comprising a tumor antigen and Th cells specific for the tumor antigen.
  • the antigenic partial peptide is a peptide that binds to an MHC class II molecule.
  • Antigenic partial peptide power of MAGE-A4 protein Thy cells that have the amino acid sequence of any of the following a) to f) and that are specific for MAGE-A4 are made to produce cyto force-in.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm according to (6) which is a polypeptide having activity.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of the following a) to f) and having the activity of producing cytodynamic force in Th cells specific for MAGE-A4.
  • a vaccine for immunotherapy of malignant neoplasm comprising at least one of the polypeptides according to (8) as an active ingredient.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention can more strongly promote the production of cytodynamic force for Th cells by combining the tumor antigen with Th cells specific for the tumor antigen. wear.
  • the produced cytokine elicits a specific anti-tumor immune response against the malignant neoplasm expressing the tumor antigen in the living body, causing the tumor to regress.
  • the peptide of the present invention induces Th cells specific to MAGE-A4 (hereinafter referred to as A4 / Th cells) by incubating the peptide with antigen-presenting cells and CD4 + T cells. In addition, it has an activity to produce cyto force-in for this A4 / Th cell.
  • A4 / Th thin Since the cell specifically attacks a malignant neoplasm that expresses MAGE-A4, the peptide of the present invention can be used as a component of the therapeutic agent for malignant neoplasm that is one of the present invention.
  • polypeptide of the present invention is not limited to genetic recombination techniques with a small number of constituent amino acid residues, and can be produced in large quantities by an organic synthetic method, so that it can be stably and clinically used in clinical research or clinical applications. It can be supplied inexpensively.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for malignant neoplasm comprising a tumor antigen and Th cells specific for the tumor antigen.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm according to the present invention is preferably a tumor antigen that is expressed / excluded in a tumor cell of a patient having a malignant neoplasm to be treated, and a CD4 + T cell cassette recovered from the patient.
  • a therapeutic agent comprising Th cells specific for the tumor antigen, induced by the tumor antigen.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention comprises a combination of a tumor antigen and a Th cell specific to the tumor antigen, whereby each of the tumor antigen or Th cell specific to the tumor antigen is used. Compared to when administered alone to patients, it has a marked effect on the regression of malignant neoplasms.
  • a Th cell specific for a tumor antigen is any ThO cell, Thl cell, or Th2 cell as long as it is a Th cell that produces cytoforce-in by being specifically stimulated by the tumor antigen.
  • Thl cells are even better.
  • Th cells specific for such tumor antigens can be obtained by incubating the tumor antigens, antigen-presenting cells expressing HLA class II molecules, and CD4 + T cells under appropriate conditions. Cell force can be induced and prepared.
  • CD4 + T cells that can be used in the method of the present invention can be isolated by a general method of collected blood force, for example, a method using MACS (Miltenyi Biotech) or the like. In the present invention, it is preferable to use CD4 + T cells collected from a patient having a malignant neoplasm to be treated.
  • Antigen-presenting cells that can be used in the method of the present invention may be B cells, macrophages, monocytes, nonproliferative cells in addition to rod-shaped cells as long as cells expressing HLA class II molecules on the surface. This is not limited to the force that can be used. [0036] Incubation may be performed by incubating the tumor antigen, antigen-presenting cells, and CD4 + T cells at the same time, or by incubating the tumor antigen and antigen-presenting cells first and then allowing the CD4 + T cells to coexist. You may incubate.
  • Incubation conditions are as follows: in the presence of IL-2, antigen-presenting cells are presented with the desired antigen via HLA class II molecules, and mature Th cells specific for the antigen are induced from CD4 + T cells.
  • the method described in Tim et al. (Immunology Today, 1996, Vol. 17, No. 3, pp. 138-146) may be used.
  • the method described in Tim et al. (Immunology Today, 1996, Vol. 17, No. 3, pp. 138-146) may be used.
  • Nishimura et al. J. Exp. Med 190-5, 617-6, p. 27, 1999
  • by changing various conditions of incubation CD4 + T cells, ThO cells, Thl It is possible to specifically induce either cells or Th2 cells.
  • ThO cells Thl cells
  • Th2 cells The induction of ThO cells, Thl cells, or Th2 cells can be performed by confirming the cytodynamic force-in of each cell produced when restimulation with a tumor antigen (for example, Tim et al. Described above). Confirmation of cyto force-in production can utilize ELISA and other various methods.
  • the tumor antigen used in the present invention is a polypeptide, lipid, sugar, or a complex thereof, which is specifically expressed in a malignant neoplastic cell to be treated or a normal cell.
  • antigenicity is a biomolecule that is present in large amounts in malignant neoplastic cells and that can also induce CD4 + T cell power in Th cells specific for the antigen. Anything is acceptable.
  • the tumor antigen is a protein. Examples of tumor antigen proteins include tyrosinase, CEA, MARTI, and MAGE family proteins.
  • a substance that is not originally expressed in tumor cells can be artificially expressed as a specific antigenic substance in the tumor cells, this is used as a tumor antigen. Ming can also be applied. For example, as shown in the Examples, tumor cells are transformed so as to express a specific antigenic substance (typically a protein) that is not originally expressed by tumor cells. In addition, by using a specific Th cell induced with the antigenic substance in combination with the antigenic substance, tumor cells expressing the specific antigenic substance can be regressed.
  • a specific antigenic substance typically a protein
  • the substance corresponds to a part of the tumor antigen, Th specific to the tumor antigen
  • Any substance capable of presenting antigenicity capable of inducing cells to CD4 + T cell lines via antigen-presenting cells can be used as a tumor antigen in the present invention.
  • it corresponds to the 259th to 278th amino acid sequence of MAGE-A4 (SEQ ID NO: 1, hereinafter referred to as M38) and the 280th to 299th amino acid sequence of MAG E-A4 (SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as M41).
  • Antigenic polypeptides can be used as tumor antigens.
  • M38 and M41 have the ability to produce cyto force-in for A4 / Th cells, which are also induced in CD + 4T cell force by incubating MAGE-A4, antigen-presenting cells, and CD + 4T cells. have. This is shown by MHC class II molecules expressed on the surface of antigen-presenting cells in which M38 and M41 have epitopes that are recognized by A4 / Th cells, and the epitopka MAGE-A4 has been incorporated. It means that it is a lepitope. Therefore, a therapeutic agent for malignant neoplasm containing MAGE-A4, M38 and Z or M41 and A4 / Th cells is one embodiment of the present invention.
  • MAGE-A4, M38 and Z or M41, antigen-presenting cells and CD4 + T cells are incubated with CD4 + T cell force, and M38 and Z or M41-specific Th cells are included.
  • a malignant neoplasm therapeutic agent is also an embodiment of the present invention.
  • polypeptides of M38 SEQ ID NO: 1
  • M41 SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of b) to f) above retains an epitope present in M38 or M41, and has an activity of producing cytoforce-in for A4 / Th cells, or CD4 + T Cell force is also defined as an amino acid sequence constituting a polypeptide having an epitope that induces Th cells specific for MAGE-A4, M38 and Z or M41.
  • the types of amino acid residues to be substituted, deleted or added as defined in b) to f) are not particularly limited as long as the activity or function of the polypeptide shown above is retained.
  • the addition of 1 to several tens of amino acids in b) and e) is the addition of 1 to 50 amino acids, preferably 1 to 30 amino acids, more preferably 1 to 15 amino acids.
  • M38 is HLA-DRB1 * 0101 and HLA-DRB1 * 1405!
  • M41 is a human with HLA genotypes HLA-DPB1 * 0201 and HLA-DPB1 * 0501 Since the polypeptides identified as tumor antigens in M38 and M38 based on this, the polypeptide having the amino acid sequence strength of 0 is particularly suitable for humans with HLA genotype strength SHLA-DRB1. It is considered to be an effective polypeptide.
  • M 41 and a polypeptide having the amino acid sequence of b) to f) based on this are considered to be particularly effective polypeptides for humans whose HLA genotype is HLA-DPB1.
  • each of the above polypeptides is a novel polypeptide that can be used as a component of the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention
  • the CD4 + T cell cell is a Th cell specific for the polypeptide. It has the activity of inducing vesicles and the activity of producing cytosine in Z cells or Th4 or A4 / Th cells.
  • the activity of producing a cyto force-in in Th cells specific to the polypeptide or MAGE-A4 is such that the Th cell is stimulated with the polypeptide and the produced cyto force-in is varied. It can be confirmed by measuring by a known method. For example, the production of interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) can be easily measured and confirmed using other commercially available ELISA kits manufactured by BD Bioscience.
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • each of the above-described polypeptides that is one embodiment of the present invention has, for example, a His-Tag widely used as a tag sequence useful for protein separation and purification, as long as it has an amino acid sequence constituting the polypeptide, A simple linker sequence, amino acid sequence of a marker protein such as GFP Further, a labeling compound such as piotin can be added to the polypeptide. Therefore, the amino acid sequence constituting the poly rain-like polypeptide of the present invention can cause Th cells or A4 / Th cells specific for those polypeptides to produce cyto force-in, or CD4 + T.
  • Cell force A polypeptide having an amino acid sequence power to which any amino acid residue used for purposes other than inducing cells is added, or a suitable labeling compound is added to the polypeptide of the present invention.
  • polypeptides are still within the scope of the present invention as long as they have an activity that causes the cells to produce cyto force-in or an epitope that induces CD4 + T cell force-specific Th cells. It is.
  • the polypeptides of the present invention can be produced as recombinant proteins by applying various known gene recombination techniques to the DNA encoding them.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention is synthesized using an appropriate DNA synthesizer, and a reference book in the art, for example, Sambrook et al., Molecular ionization: A laboratory Manual, 2nd edition (Cold In the Spring Harbor laboratory Press ⁇ 1989, etc.), various methods are appropriately selected, and an expression vector that expresses the polypeptide of the present invention is constructed in combination.
  • the polypeptide may be produced by transformation with an expression vector. At that time, as described above, various operations used for the production of the recombinant polypeptide can be added, such as addition of a His-tag.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced chemically and synthetically using amino acids modified with various protecting groups as raw materials.
  • Methods for organically synthesizing polypeptides without using genes or host cells are well known to those skilled in the art. For example, “5th edition, Experimental Chemistry Lecture 16 Synthesis of Organic Compounds IV” (by Saburo Aimoto et al., Edited by the Japan Society of Agricultural Sciences) etc. introduces various methods of chemical synthesis of polypeptides. It can be synthesized using any of these methods. It can also be synthesized using a commercial device generally called a peptide synthesizer.
  • the above-mentioned polypeptide can induce CD4 + T cells into Th cells by incubation of antigen-presenting cells and CD4 + T cells under appropriate conditions.
  • the present invention In vitro incubation of antigen-presenting cells expressing HLA class II molecules, CD4 + T cells, and the above-mentioned polypeptides results in Th and a specific for the above-mentioned polypeptides and ⁇ or MAGE-A4.
  • a method of inducing cells is also provided. Incubation produces IFN- ⁇ and IL-4 under conditions where it is preferable to add one or more of IFN- ⁇ , IL_12, or anti-IL_4 antibody in addition to IL-2. Can induce low Thl cells.
  • antigen-presenting cells that can be used in this method can be used as long as they express HLA class II molecules on their surfaces.
  • rod-like cells B cells, macrophages, Ability to include monocytes, non-proliferative transfectants, etc., but is not limited to these.
  • the above-mentioned polypeptide, antigen-presenting cells and CD4 + T cells may be incubated at the same time.
  • the polypeptide of the present invention and antigen-presenting cells may be incubated first, and then CD4 + T cells. It is also possible to incubate in the presence of.
  • various conditions for incubation of antigen-presenting cells expressing the HLA class II molecule on the cell surface with the peptide of the present invention and CD4 + T cells are as follows. Determined according to the general conditions for inducing mature Th cells specific to the antigen from CD4 + T cells, for example, the method described in Tim et al. Can do.
  • antigen-presenting cells and CD4 + T cells are collected from a patient and incubated with the polypeptide of the present invention to induce and culture A4 / Th cells in vitro. be able to. Returning A4 / Th cells induced by this method to the patient is expected to activate the patient's own immune system and regress tumor cells.
  • the polypeptide of the present invention can induce an antibody capable of specifically recognizing MAGE-A4 in the animal by administering it to an appropriate animal such as a rabbit.
  • an antibody capable of specifically recognizing MAGE-A4 in the animal by administering it to an appropriate animal such as a rabbit.
  • Such an antibody can specifically detect the presence of cells expressing MAGE-A4, that is, the presence of cancer cells, and can be used for efficient diagnosis of malignant neoplasm.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is specific to a tumor antigen and the tumor-specific antigen.
  • various excipients generally used for pharmaceutical preparations and other pharmaceutically active ingredients may be included as long as these effects are not inhibited.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is preferably in the form of a buffer solution or a liquid medium capable of stably holding a tumor antigen and Th cells specific for the tumor-specific antigen.
  • buffer solutions include neutral buffered saline or phosphate buffered saline.
  • the therapeutic agent for malignant neoplasm of the present invention is preferably in a form in which a tumor antigen and Th cells specific for the tumor-specific antigen are mixed, and U ⁇ is a tumor antigen and the tumor. It may be in the form of a so-called kit in which Th cells specific for a specific antigen are stored separately and can be mixed and administered at the time of use.
  • FIG. 1 We measured IFN- ⁇ production by A4 / Th cells when mixed peptides MIX1 to MIX9 were added to A4 / Th cells derived from humans with HLA genotype HLA-DRB1. It is a graph which shows a result.
  • FIG. 4a M38 when M38 is encapsulated in M38 / Thl cells induced by the method of Example 3.
  • 3 is a graph showing the results of measuring the production of IFN-y by / Th cells.
  • FIG. 4b M41 when M41 is placed on M41 / Thl cells induced by the method of Example 3.
  • 3 is a graph showing the results of measuring the production of IFN-y by / Th cells.
  • FIG. 5a A4 / Thl when M41 is added to A4 / Th cells induced by the method of Example 4. It is a graph which shows the result of having measured the production of IL-4 by a cell.
  • FIG. 5b is a graph showing the results of measuring the production of IFN- ⁇ by A4 / Thl cells when M41 was added to A4 / Th cells induced by the method of Example 4.
  • FIG. 6 is a graph showing the therapeutic effect of the present invention against malignant neoplasms expressing OVA as a virtual tumor antigen.
  • FIG. 7 is a photograph showing the therapeutic effect of the present invention against a malignant neoplasm expressing OVA as a virtual tumor antigen.
  • FIG. 8 is a graph showing the therapeutic effect of the present invention against a malignant neoplasm expressing an OVA class II peptide as a virtual tumor antigen.
  • Amplified products were cloned using TOPO TA cloning kit (INVITROGEN), and the base sequence of MAGE-A4 cDNA was confirmed by comparison with GenBank NM_001011550. After confirmation, a fragment is prepared using restriction enzyme B HI and Hindlll and incorporated into a commercially available expression vector plasmid pQE9 (QIAGEN) that has been opened using the same restriction enzyme to express MAGE-A4. An expression vector PQE9-MAGEA4 was prepared.
  • IPTG SIGMA
  • the cells were collected by centrifugation at 6000 rpm for 5 minutes, suspended in 10 ml of lOmM Tris-HCl buffer containing 300 mM NaCl and 20 mM imidazol, and then sonicated.
  • peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as PBMC) using the Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) multilayer method. Represent). PBMCs were cultured in serum-free AIM-V medium (Invitrogen) for 2 hours at 37 ° C in a 5% CO incubator.
  • Adherent cells are cultured in serum-free AIM-V medium containing 30 ng / ml GM-CSF and 30 ng / ml IL-3 (both purchased from PeproTech EC ltd, London, England). After 5 days, the culture medium was replaced with a new one having the same composition. Seven days after the start of the culture, treat with 2.5 mg / ml trypsin (Sigma), pipette and collect the adherent cells after detaching them from the culture vessel, and mDC as antigen-presenting cells (APC). Got. Furthermore, using MACS (purchased from Miltenyi Biotech), non-adherent cell force anti-CD4 antibody-adsorbing cells obtained when inducing mDC were isolated to obtain CD4 + T cells.
  • APC antigen-presenting cells
  • Antigen presentation was performed by incubating mycin C (MMC, Kyowa Hakko) for 45 minutes. Place CD4 + T cells (lxl0 6 / well) and antigen-presented mDC (lxl0 5 / well) in one well of a 24-well plate (BD Bioscience, CA) and share them in the culture medium 1000 ⁇ 1. Cultured. As the culture solution, AIM-V medium containing 5% normal human serum (provided by multiple volunteers) was used. Seven days after the start of co-culture, prepare mDC (1x10 5 / well) that had been antigen-presented in another well as described above, and re-stimulate by transferring CD4 + T cells that had been co-cultured for 7 days. became. Two days later, recombinant IL-2 was added to a final concentration of 10 U / ml. A4 / Th cells were established by culturing for 7 days in a% CO incubator.
  • M1 to M44 A total of 44 peptides (M1 to M44) were designed and chemically synthesized from the N-terminal to the C-terminal of MAGE-A4, with 20 amino acid residues having 7 amino acid overlapping sequences.
  • MIX9 Four types of peptide mixtures (MIX9) were prepared.
  • Example 1 2 the HLA genotype is HLA-DPB1 * 0201 and HLA-DPB1 * 0501 Example 1 1-5) except that PBMC was separated from peripheral blood of healthy individuals using the FicoU-Paque PLUS (GE Healthcare) overlay method and the selected peptide MIX was different. The same procedure was followed to confirm that M41 is a polypeptide with an epitope presented by an HLA class II molecule with the genotype HLA-DPB1 ( Figure 3).
  • Mitomycin C (MMC, Kyowa Hakko) was added and incubated for 45 minutes for antigen presentation.
  • IL-12 100 IU / ml Genetics Institute
  • CD4 + T cells lxlO 6 / well
  • antigen-presented mDC lxl0 5 / well
  • anti-IL-4 antibody 5 ⁇ g / ml BD Pharmingen
  • the culture medium used was AIM-V medium containing serum of 5% healthy type IV healthy human (provided by multiple volunteers).
  • the medium is 10% heat inactivated fetal bovine serum (FCS, Gibco BRL), 2 RPMI-1640 medium (Gibco BRL) (1 Os-RPMI) containing mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma), 10 mM HEPES, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin Using.
  • the cells were again divided into two wells, and the above spleen cells 2.5 ⁇ 10 6 ZmL 10s-RPMI medium were added, lOOU / mL IL-2, 20U / mL IL-12 , Ing / mL IFN- ⁇ , 5 ⁇ g / mL anti-IL-4 and 50 ⁇ g / mL OVA class II peptide (ISQAVHAAHAEINEAGR OVA323- 33 9) (gift from Fujiya), 37 ° C, 24 more in a 5% CO incubator
  • the cells were washed with lOs-RPMI medium and changed to 10s-RPMI medium containing 100U / mL IL-2, 20U / mL IL-12 and Ing / mL IFN- ⁇ .
  • 10s-RPMI medium containing 100U / mL IL-2, 20U / mL IL-12 and Ing / mL IFN- ⁇ .
  • the cells were cultured for 60 hours. Three days later, the cells were washed with lOs-RPMI medium and subcultured several times in lOs-RPMI medium containing 100 U / mL IL-2 to establish OVA-specific Thl cells (OVA / Thl cells).
  • OVA / Thl cells were labeled with CFSE, and the proliferation of OVA / Thl cells was confirmed using the fluorescence intensity of CFSE as an index.
  • the OVA / Thl cells were combined with OVA (Group 1). Active division in the tumor-affiliated lymph nodes was confirmed. Accumulation and activation of tumor cells in the tumor-affected lymph nodes was also confirmed. Furthermore, it was confirmed that the increase of regulatory T cells (Treg) in the lymph node of the tumor site was remarkably suppressed.
  • Reg regulatory T cells
  • OVA class I peptide SIINFEKL OV A257-264
  • OVA class II peptide IQAVHAAHAEINEAGR OVA323-339

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Description

明 細 書
悪性新生物治療剤。
技術分野
[0001] 本発明は、癌免疫療法に利用可能な、悪性新生物治療剤と、これに利用可能な抗 原性ポリペプチドに関する。
背景技術
[0002] 難治性の疾患である癌 (悪性新生物）に対する治療法の一つに、患者個体の持つ 免疫系を利用して癌細胞を退縮させる、いわゆる癌免疫療法が挙げられる。この方 法における重要な点は、如何にして免疫系に癌細胞を異物として認識させ、癌細胞 に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くか、である。
[0003] 抗腫瘍免疫に関与する重要な免疫細胞に、細胞表面蛋白質である CD8を発現して V、る細胞傷害性 (CD8+T細胞）と、細胞表面蛋白質である CD4を発現して 、る T細胞 (CD4+T細胞）とがある。 CD8+T細胞は、活性化された場合、 HLAクラス I分子に結合 する抗原を提示して ヽる細胞を溶解する T細胞である。 CD4+T細胞はサイト力インを 分泌する Th細胞であって、 HLAクラス II分子により抗原を提示するマクロファージおよ びあるいは榭状細胞などにより活性ィ匕され、 CD8+T細胞の誘導および維持のための ヘルパー機能を発揮する。また、 Th細胞は分泌するサイト力インの種類によって Thl 細胞 (IFN- γ等を産生する）、 Th2細胞 (IL-4等を産生する）及び ThO細胞 (サイトカイ ン産生能は低いか、あるいは IFN- γ , IL-4等を共に産生する)に分類されることが知 られており、各細胞の役割も解明されつつある。また CD4+T細胞は、 MHCクラス II分 子陰性腫瘍 (MHCクラス ΙΓ腫瘍）に対する間接的な機構によって、マクロファージの 活性化を介して、または MHCクラス Π陽性腫瘍に対する直接的な機構によって、エフ エタター機能を持つこともできる。
[0004] これまで、ヒトの癌免疫治療における T細胞の研究は、 CD8+HLAクラス I拘束性 CTL 応答 (CD8+ HLA class I restricted CTL response)の同定および誘導に、主に焦点が 絞られていた (特許文献 1)。 CD4+T細胞については、癌抗原の一つであるチロシナ ーゼとその CD4+T細胞に対するェピトープの同定が報告されている（特許文献 2)。 チロシナーゼは、メラノサイト系列の正常細胞および腫瘍細胞の中で発現され、 CD4 +メラノーマ反応性 T細胞の特異的標的として示された、 MHCクラス II分子に結合する 唯一のメラノーマ会合性組織特異的抗原である (非特許文献 1)。しかし、チロシナー ゼは限られた型の腫瘍でのみ発現する抗原であり、癌免疫治療における有望な癌抗 原であるとは言い難い。
[0005] 最近になって、 MAGEと称される、 CD8+T細胞によって認識される腫瘍特異抗原を コードしている遺伝子ファミリーが報告されている (非特許文献 2〜非特許文献 4、特 許文献 3、特許文献 4)。この MAGEファミリ一は、様々なタイプの腫瘍において発現さ れる約 12のメンバー力もなる。その内の一つである MAGE-A3に関する研究の結果、 ある一部のペプチド断片が HLAクラス I分子によって提示されること (特許文献 5)、ま た別のある一部のペプチド断片が HLAクラス II分子に結合する機能を有するペプチド (HLAクラス II結合性ペプチド)であることが示された (特許文献 6、特許文献 7)。
[0006] しかし、 MAGE-A3が HLAクラス II結合性ペプチドを含むことは示された力 患者が 適当な HLA分子を発現しな!、ために、 MAGE-A3ペプチドによるヘルパー T細胞の 活性化を含む治療が功を奏しない患者が多数存在する。したがって、 MHCクラス II分 子に結合し、かつ CD4+T細胞によって認識されるェピトープを含む、さらなる腫瘍関 連抗原を同定する必要がある。
[0007] MAGEファミリーの一つである MAGE-A4は、全 317アミノ酸残基からなる腫瘍特異 的抗原である（配列番号 3)。 MAGE-A4は多くのメラノーマおよび食道癌、頭頸部癌 、肺癌等の腫瘍組織型において高発現しているが、精巣および胎盤以外の正常細 胞では発現して 、な 、ことが知られて 、る（非特許文献 5)。
[0008] MAGE-A4の抗原性に関しては、 MAGE-A4の 143-151位のアミノ酸配列力 CD8+ T細胞に認識されるェピトープを提示することが報告されている（非特許文献 6)。また 、 MAGE-A4の機能については、ガンキリンとの結合性が報告されており（特許文献 8 )、 MAGE-A4の C末端部分に相当する 211〜317番目のアミノ酸に相当する部分がガ ンキリンとの結合性に関与していることが開示されている。ただし、同時に、 MAGE-A 4の 211番目のアミノ酸力 97残基までを含む C末端部分はガンキリンとの結合能を持 つて 、な 、とも報告されて！、る。 非特許文献 l :Topalian, S丄.ら、 1994年、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 91卷、第 946 1-9465頁
非特許文献 2 : Plaenら、 1994年、 Immunogenetics、第 40卷、第 360- 369頁
非特許文献 3 : Traversari 、 1992年、 Immunogeneticsゝ第 35卷、第 145頁
非特許文献 4: van der Bruggenら、 1991年、 Science,第 254卷、第 1643頁
非特許文献 5 : Duffour M.T.ら、 1999年、 Eur.J.Immunol.、第 29卷、第 3329-3337頁 非特許文献 6 :Yoshihiro, M.ら、 2005年、 Clin. Cancer Res.,第 121卷、第 5581- 5589 頁
特許文献 1： W095/19783号
特許文献2 :\^097/11669号
特許文献 3： PCT/US92/04354
特許文献 4：米国特許第 5,342,774号
特許文献 5：米国特許第 5,591,430号
特許文献 6：米国特許第 5,965,535号
特許文献 7： PCT/US99/21230
特許文献 8：特開 2004-123752号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、腫瘍抗原を利用して悪性新生物を治療する方法において有用な新た な治療剤と、該治療剤に利用可能な腫瘍抗原を提供するものである。
[0010] 本発明者らは、腫瘍抗原と、該腫瘍抗原に対して特異的な Th細胞とを含む治療剤 力 該腫瘍抗原を発現して ヽる悪性新生物を著しく退縮させる効果を有して ヽること を実験的に見いだし、さらに該腫瘍抗原として利用可能な新規な抗原性ペプチドを 特定し、下記の各発明を完成した。
[0011] (1)腫瘍抗原と該腫瘍抗原に対して特異的な Th細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
[0012] (2)腫瘍抗原が蛋白質である、（1)に記載の悪性新生物治療剤。
[0013] (3)腫瘍抗原が腫瘍抗原蛋白質の抗原性部分ペプチドである、（1)に記載の悪性新 生物治療剤。 [0014] (4)抗原性部分ペプチドが MHCクラス II分子に結合するペプチドである、（3)に記載 の悪性新生物治療剤。
[0015] (5)腫瘍抗原が MAGEファミリー蛋白質である、（2)に記載の悪性新生物治療剤。
[0016] (6)腫瘍抗原が MAGE-A4及び Z又はその抗原性部分ペプチドである、（5)に記載 の悪性新生物治療剤。
[0017] (7) MAGE-A4蛋白質の抗原性部分ペプチド力 下記の a)〜f)のいずれかのアミノ 酸配列からなり、かつ MAGE-A4に特異的な Th細胞にサイト力インを産生させる活性 を有するポリペプチドである、 (6)に記載の悪性新生物治療剤。
[0018] a)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列；
b)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に 任意のアミノ酸力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
c)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
d)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列。
[0019] e)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に任意のアミノ酸 力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
f)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに 1〜数個のアミノ酸残基が置換 したアミノ酸配列。
[0020] (8)下記の a)〜； f)の!、ずれかのアミノ酸配列からなり、かつ MAGE-A4に特異的な Th 細胞にサイト力インを産生させる活性を有するポリペプチド。
[0021] a)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列；
b)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に 任意のアミノ酸力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
c)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列； d)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列。
[0022] e)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に任意のアミノ酸 力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
f)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに 1〜数個のアミノ酸残基が置換 したアミノ酸配列。
[0023] (9) b)〜f)のアミノ酸配列力 なるポリペプチド力 配列番号 1又は配列番号 2に示さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するェピトープであって、 CD4+T細胞から MAGE-A4に特異的な Th細胞を誘導する当該ェピトープを有するポリペプチドである 、 (8)に記載のポリペプチド。
[0024] (10) (8)に記載のポリペプチドをコードする核酸。
[0025] (11) (10)に記載の核酸を含むベクター。
[0026] (12) (8)に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
[0027] (13) (8)に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分とする、悪性新生物 免疫治療用ワクチン。
[0028] (14) (8)に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞と CD4+T細胞 とをインビトロでインキュベーションする工程を含む、 MAGE-A4に特異的な Th細胞を 誘導する方法。 発明の効果
[0029] 本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原を当該腫瘍抗原に対して特異的な Th細 胞と組み合わせることで、 Th細胞に対してサイト力インの産生をより強く促すことがで きる。産生されたサイトカインは該腫瘍抗原を発現している悪性新生物に対して特異 的な抗腫瘍免疫反応を生体に惹起し、腫瘍を退縮させる。
[0030] また本発明のペプチドは、これを抗原提示細胞及び CD4+T細胞とインキュベーショ ンすることで、 MAGE-A4に特異的な Th細胞（以下、 A4/Th細胞と表す)を誘導し、ま たこの A4/Th細胞に対してサイト力インを産生させる活性を有して 、る。この A4/Th細 胞は MAGE-A4を発現して ヽる悪性新生物を特異的に攻撃するので、本発明のぺプ チドは本発明の一つである悪性新生物治療剤の成分として利用することができる。ま た本発明のポリペプチドは、構成アミノ酸残基数が少なぐ遺伝子組み換え手法に限 らず、有機合成的方法によって大量に製造することができるので、臨床研究あるいは 臨床応用において、安定的にかつ安価に供給され得る。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 本発明は、腫瘍抗原と該腫瘍抗原に対して特異的な Th細胞とを含む、悪性新生物 治療剤に関する。本発明の悪性新生物治療剤は、好ましくは、治療対象となる悪性 新生物を有する患者の腫瘍細胞で発現して!/ヽる腫瘍抗原と、当該患者から回収され る CD4+T細胞カも該腫瘍抗原によって誘導される、該腫瘍抗原に対して特異的な Th 細胞とを含む治療剤である。
[0032] 本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該腫瘍抗原に特異的な Th細胞を組み 合わせてなるという構成によって、腫瘍抗原又は該腫瘍抗原に特異的な Th細胞をそ れぞれ単独で患者に投与した場合に比べて、悪性新生物の退縮作用にお 、て顕著 な効果を奏する。
[0033] 腫瘍抗原に対して特異的な Th細胞とは、該腫瘍抗原によって特異的に刺激される ことによってサイト力インを産生する Th細胞であれば、 ThO細胞、 Thl細胞、 Th2細胞 のいずれであってもよいが、 Thl細胞であればなおよい。かかる腫瘍抗原に対して特 異的な Th細胞は、該腫瘍抗原、 HLAクラス II分子を発現している抗原提示細胞及び CD4+T細胞を適当な条件下でインキュベーションすることで、該 CD4+T細胞力 誘 導し、調製することができる。
[0034] 本発明の方法で利用可能な CD4+T細胞は、採取された血液力 一般的な方法、 例えば MACS (Miltenyi Biotech社)等を用いた方法で単離することができる。本発明 では、治療対象となる悪性新生物を有する患者から回収された CD4+T細胞の利用が 好ましい。
[0035] 本発明の方法で利用可能な抗原提示細胞は、表面に HLAクラス II分子を発現して いる細胞であればよぐ榭状細胞の他に B細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のト ランスフエクタント等を挙げることができる力 これらには限定されない。 [0036] インキュベーションは、腫瘍抗原と抗原提示細胞と CD4+T細胞とを同時にインキュ ベーシヨンしてもよぐあるいは腫瘍抗原と抗原提示細胞を先にインキュベーションし 、その後に CD4+T細胞を共存させてインキュベーションしても良い。インキュベーショ ンの条件は、 IL-2の存在下で、抗原提示細胞に所望の抗原を HLAクラス II分子を介 して提示させ、 CD4+T細胞から当該抗原に特異的な成熟した Th細胞を誘導するた めの一般的な方法、例えば Timら、（Immunology Today, 1996年、第 17卷、第 3号、第 138-146頁）に記載の方法に従えばよい。また、西村ら (J.Exp.Med 190卷 5号 617-6 27頁 1999年）の記載に基づいて、インキュベーションの諸条件を種々に変更すること によって、 CD4+T細胞から、 ThO細胞、 Thl細胞、又は Th2細胞のいずれかを特異的 に誘導することが可能である。 ThO細胞、 Thl細胞、又は Th2細胞が誘導されたことは 、腫瘍抗原で再刺激したときに産生される細胞毎のサイト力イン (例えば前述の Timら )を確認することで行うことができる。サイト力イン産生の確認は、 ELISA法その他の種 々の方法を利用することができる。
[0037] 本発明において利用される腫瘍抗原は、ポリペプチド、脂質、糖、あるいはこれらの 複合体であって、治療対象である悪性新生物細胞において特異的に発現している 力 あるいは正常細胞と比較して悪性新生物細胞に多量に存在している生体分子で あり、かつ、当該抗原に特異的な Th細胞を CD4+T細胞力も誘導し得る抗原性が抗原 提示細胞を介して提示されるものであればよい。好ましくは、腫瘍抗原は蛋白質であ る。腫瘍抗原蛋白質の例としては、チロシナーゼ、 CEA, MARTI, MAGEファミリー蛋 白質などを挙げることができる。
[0038] また、本来は腫瘍細胞にお!、て発現されることのな 、物質を、該腫瘍細胞に人為 的に特定の抗原性物質として発現させることができれば、これを腫瘍抗原として本発 明を適用することもできる。例えば、実施例において示すように、本来的には腫瘍細 胞が発現することのない特定の抗原性物質 (典型的には蛋白質)を発現するように腫 瘍細胞を形質転換させておき、ここに該抗原性物質を用いて誘導した特異的な Th細 胞と該抗原性物質を組み合わせて使用することで、当該特定の抗原性物質を発現し て 、る腫瘍細胞を退縮させることができる。
[0039] また、腫瘍抗原の一部分に相当する物質であっても、当該腫瘍抗原に特異的な Th 細胞を CD4+T細胞カゝら誘導し得る抗原性を、抗原提示細胞を介して提示させること のできる物質であれば、本発明における腫瘍抗原として利用することができる。例え ば、 MAGE- A4の 259〜278番目のアミノ酸配列（配列番号 1、以下 M38とする）と MAG E-A4の 280〜299番目のアミノ酸配列（配列番号 2、以下 M41とする）に相当する抗原 性ポリペプチドを、腫瘍抗原として利用することができる。
[0040] M38と M41は、 MAGE-A4と抗原提示細胞と CD+4T細胞とをインキュベーションする ことで CD+4T細胞力も誘導される A4/Th細胞に対して、サイト力インを産生させる活 性を有している。このことは、 M38と M41が A4/Th細胞によって認識されるェピトープ を有しており、さらに当該ェピトープカ MAGE-A4を取り込んだ抗原提示細胞の表 面に発現している MHCクラス II分子によって提示されるェピトープであることを意味す る。従って、 MAGE-A4、 M38及び Z又は M41と A4/Th細胞とを含む悪性新生物治療 剤は、本発明の一態様である。また、 MAGE-A4、 M38及び Z又は M41と抗原提示細 胞と CD4+T細胞とをインキュベーションすることで CD4+T細胞力 誘導される M38及 び Z又は M41に特異的な Th細胞とを含む悪性新生物治療剤も、本発明の一態様で ある。
[0041] さらに、 M38 (配列番号 1)と M41 (配列番号 2)の各ポリペプチドのアミノ酸配列に対 して、以下の b)〜； 0のような関係にあるアミノ酸配列力 なるポリペプチドも、本発明 の腫瘍抗原として利用することができる。
[0042] b)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に 任意のアミノ酸力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
c)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
d)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列。
[0043] e)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に任意のアミノ酸 力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
f)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに 1〜数個のアミノ酸残基が置換 したアミノ酸配列。
[0044] 上記の b)〜； f)のアミノ酸配列は、 M38又は M41に存在するェピトープを保持し、 A4 /Th細胞に対してサイト力インを産生させる活性を有する、ある 、は CD4+T細胞力も M AGE-A4、 M38及び Z又は M41に特異的な Th細胞を誘導するェピトープを有するポ リペプチドを構成するアミノ酸配列として規定したものである。
[0045] b)〜f)にお ヽて規定される置換、欠失あるいは付加されるアミノ酸残基の種類は、 先に示したポリペプチドの活性ないし機能を保持する範囲において特に制限はない 1S b)ならびに e)における 1〜数十個のアミノ酸の付加とは、 1〜50アミノ酸、好まし くは 1〜 30アミノ酸、さらに好ましくは 1〜 15アミノ酸の付加である。
[0046] M38は HLA- DRB1*0101及び HLA- DRB1*1405と!、う HLAの遺伝子型を有するヒト において、 M41は HLA- DPB1*0201及び HLA- DPB1*0501という HLAの遺伝子型を 有するヒトにおいて、それぞれ腫瘍抗原として同定されたポリペプチドであることから 、 M38とこれに基づく b)〜； 0のアミノ酸配列力 なるポリペプチドは、 HLAの遺伝子型 力 SHLA-DRB1であるヒトに対して特に有効なポリペプチドであると考えられる。また、 M 41とこれに基づく b)〜； f)のアミノ酸配列力もなるポリペプチドは、 HLAの遺伝子型が H LA-DPB1であるヒトに対して特に有効なポリペプチドであると考えられる。
[0047] 上記の各ポリペプチドは、いずれも本発明の悪性新生物治療剤の一成分として利 用可能な新規なポリペプチドであり、 CD4+T細胞カも該ポリペプチドに特異的な Th細 胞を誘導する活性及び Z又は力かる Th細胞又は A4/Th細胞にサイト力インを産生さ せる活性を有する。上記の各ポリペプチドにおける、該ポリペプチド又は MAGE-A4 に特異的な Th細胞にサイト力インを産生させる活性は、該 Th細胞を該ポリペプチドで 刺激し、産生されるサイト力インを種々の公知の方法で測定することで確認することが できる。例えば、インターフェロン γ (IFN- γ )の産生は、 BD Bioscience製その他の巿 販の ELISAキットを用いて、簡便に測定、確認することができる。
[0048] なお、本発明の一態様である前記の各ポリペプチドは、それらを構成するアミノ酸 配列を有する限り、例えば蛋白質の分離精製に有用なタグ配列として汎用されてい る His-Tagや、適当なリンカ一配列、 GFPの様なマーカー蛋白質のアミノ酸配列等を さらに付加したり、あるいはピオチンなどの標識ィ匕合物をポリペプチドに付加させたり することも可能である。従って、本発明の一多雨様であるポリペプチドを構成するアミ ノ酸配列に、それらのポリペプチドに特異的な Th細胞や A4/Th細胞にサイト力インを 産生させること、あるいは CD4+T細胞力 前記細胞を誘導すること以外の目的のため に利用される任意のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチドや、 本発明のポリペプチドに適当な標識ィ匕合物が付加されたポリペプチドであっても、該 細胞にサイト力インを産生させる活性あるいは CD4+T細胞力 特異的な Th細胞を誘 導するェピトープを有する限り、その様なポリペプチドは依然として本発明の範囲内 である。
[0049] 本発明のポリペプチドは、それらをコードする DNAに種々の公知の遺伝子組み換 え手法を適用することで、当該ポリペプチドを組み換え蛋白質として製造することが 可能である。典型的には、本発明のポリペプチドをコードする DNAを適当な DNA合成 機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えば Sambrookらの Molecular し ioning:A laboratory Manual、第 2版 (Cold Spring Harbor laboratory Press ^ 1989年 等）に紹介されて 、る種々の手法を適当に選択ある 、は組み合わせて本発明のポリ ペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現 ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、先に述べ たように、 His-tagの付加などの様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々 の操作を加えることが出来る。
[0050] また、本発明のポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化 学合成的に製造することも出来る。ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有 機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第 5版実験化学 講座 16有機化合物の合成 IV」（相本三郎ら著、 日本ィ匕学会編)などは、ポリペプチド の化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法 を用いても合成することが出来る。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される巿 販機器を用いて合成することもできる。
[0051] 上記のポリペプチドは、適当な条件下での抗原提示細胞と CD4+T細胞とのインキュ ベーシヨンにより、 CD4+T細胞を Th細胞に誘導することができる。この様に、本発明 は、 HLAクラス II分子を発現している抗原提示細胞と、 CD4+T細胞と、上記のポリべ プチドとをインビトロでインキュベーションして、上記のポリペプチド及び Ζ又は MAGE -A4に特異的な Th細胞を誘導する方法も提供する。インキュベーションにおいて、 IL -2に加えて、 IFN- γ、 IL_12、又は抗 IL_4抗体の 1以上を添加することが好ましぐか 力る条件において、 IFN- γを産生し、かつ IL-4の産生が低い Thl細胞を誘導すること ができる。
[0052] この方法で利用可能な抗原提示細胞は、前述と同様に、表面に HLAクラス II分子を 発現している細胞であれば利用可能であり、榭状細胞の他に B細胞、マクロファージ 、単球、非増殖性のトランスフエクタント等を挙げることができる力 これらには限定さ れない。また、インキュベーションは、上記のポリペプチドと抗原提示細胞と CD4+T細 胞とを同時にインキュベーションしてもよぐまた本発明のポリペプチドと抗原提示細 胞を先にインキュベーションし、その後 CD4+T細胞を共存させてインキュベーションし ても良い。また、本発明のペプチドと細胞表面に HLAクラス II分子を発現している抗 原提示細胞と CD4+T細胞とのインキュベーションの諸条件は、前述の通り、抗原提示 細胞に所望の抗原を HLAクラス II分子を介して提示させ、 CD4+T細胞から当該抗原 に特異的な成熟した Th細胞を誘導するための一般的な方法、例えば前記 Timらに 記載の方法におけるインキュベーションの条件に準じて定めることができる。
[0053] 本発明の方法によれば、患者から抗原提示細胞と CD4+T細胞を回収し、これらと本 発明のポリペプチドとをインキュベーションすることにより、 A4/Th細胞をインビトロで 誘導、培養することができる。この方法によって誘導された A4/Th細胞を患者に戻す ことによって、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞を退縮させることができるも のと期待される。
[0054] また本発明のポリペプチドは、これをゥサギ等の適当な動物に投与することで、 MA GE-A4を特異的に認識することのできる抗体を当該動物において誘導することがで きる。この様な抗体は、 MAGE-A4が発現している細胞の存在、すなわち癌細胞の存 在を特異的に検出することができ、効率的な悪性新生物の診断に利用することがで きる。
[0055] 本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的な Th細胞の他に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に 利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよい。特に、本発明 の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的な Th細胞を 安定に保持できる緩衝液あるいは液体培地の形態にあることが好ま ヽ。緩衝液の 非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水な どを挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラ ン、マン-トール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例 えば、 EDTAまたはダルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸ィ匕アルミニウム）、浸 透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤および/または保存剤などをさらに含んでいてもよい。 また本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該該腫瘍特異抗原に対して特異的 な Th細胞とが混合されて ヽる形態にあることが好ま Uヽが、腫瘍抗原と該該腫瘍特 異抗原に対して特異的な Th細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与するこ とのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。
図面の簡単な説明
[図 1]HLAの遺伝子型が HLA-DRB1であるヒトから誘導した A4/Th細胞に混合べプチ ド MIX1〜MIX9をそれぞれ加えたときの、 A4/Th細胞による IFN- γの産生を測定した 結果を示すグラフである。
[図 2]HLAの遺伝子型が HLA-DRB1であるヒトから誘導した A4/Th細胞にポリべプチ ド M36〜M40をそれぞれ加えたときの、 A4/Th細胞による IFN- γの産生を測定した結 果を示すグラフである。
[図 3]HLAの遺伝子型が HLA-DPB1であるヒトから誘導した A4/Th細胞に、混合ぺプ チド MIX9ならびにポリペプチド M41〜M44をそれぞれ加えたときの、 A4/Th細胞によ る IFN- γの産生を測定した結果を示すグラフである。
[図 4a]実施例 3の方法によって誘導された M38/Thl細胞に M38をカ卩えたときの、 M38
/Th細胞による IFN- yの産生を測定した結果を示すグラフである。
[図 4b]実施例 3の方法によって誘導された M41/Thl細胞に M41をカ卩えたときの、 M41
/Th細胞による IFN- yの産生を測定した結果を示すグラフである。
[図 5a]実施例 4の方法によって誘導された A4/Th細胞に M41を加えたときの A4/Thl 細胞による IL-4の産生を測定した結果を示すグラフである。
[図 5b]実施例 4の方法によって誘導された A4/Th細胞に M41をカ卩えたときの A4/Thl 細胞による IFN- γの産生を測定した結果を示すグラフである。
[図 6]OVAを仮想腫瘍抗原として発現している悪性新生物に対する本発明の治療効 果を示すグラフである。
[図 7]OVAを仮想腫瘍抗原として発現している悪性新生物に対する本発明の治療効 果を示す写真である。
[図 8]OVA class IIペプチドを仮想腫瘍抗原として発現している悪性新生物に対する 本発明の治療効果を示すグラフである。
[0057] 以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
実施例
[0058] <実施例 1 >M38の同定
1)組み換え MAGE-A4の調製
手術摘出腫瘍より RNAを ISOGEN (二ツボンジーン)を用いて抽出した後， SuperScriptl Iワンステップ RT- PCRシステム（INVITROGEN社）を用いてプライマー A4F(ggatccat gtcttctgagcagaagagゝ目 C列 ¾·号 4)、 A4R、aagctttcagactccctcttcctcctctaaゝ酉 C列 ¾·号 5) で増幅反応を行い MAGE-A4をコードしている cDNAを得た。増幅産物は TOPO TA クロー-ングキット（INVITROGEN社）を用いてクローユングし、 MAGE- A4 cDNA部分 の塩基配列を GenBank NM_001011550との比較により確認した。確認後、制限酵素 B ■HIと Hindlllとを用いてフラグメントを調製し、同じ制限酵素を用いて開環させた巿 販の発現ベクタープラスミド pQE9 (QIAGEN)に組み込んで、 MAGE-A4を発現するこ とのできる発現ベクター PQE9-MAGEA4を調製した。
[0059] 発現ベクター pQE9- MAGEA4を用いて大腸菌 BL- 21(DE3)codon plus(Stratagene社) を形質転換して得られた組み換え細胞を、 LB培地で OD = 1.0となるまで培養し、発 現誘導のために IPTG (SIGMA)を終濃度 ImMになるように添加、さらに 37°Cで 4時間 培養した。その後 6000rpml5分の遠心分離で菌体を回収し、 300mM NaCl、 20mM im idazolを含む lOmM Tris- HCl緩衝液 10mlに懸濁後、超音波破砕した。破砕菌体溶液 の上清を 15000rpml5分の遠心分離にて回収後、 0.45umフィルター (ザルトリウス)に通 し、平衡化した Ni Sepharose HP (Amersham Biosciences)を用いて pH濃度勾配法（p H8.0〜4.5)にて溶出し、 MAGE-A4を含む画分を 15%アクリルアミドゲルを用いた SDS- PAGEにて確認し、回収した。回収された画分に含まれる MAGE-A4を Amicon Ultra 1 0000カット（MILLIPORE)を用いて遠心濃縮し、同時に PBSへ緩衝液の置換を行い、 以下の実験に使用する組み換え MAGE-A4を得た。
[0060] 2)単球由来榭状細胞（mDC)の調製
HLAの遺伝子型が HLA-DRB1*0101及び HLA-DRB1*1405である健常人の末梢血 より、ファイコール (Ficoll-Paque PLUS; GE Healthcare)重層法を用いて peripheral bl ood mononuclear cell (以下 PBMCと表す）を分離した。 PBMCを血清不含 AIM-V培地 (Invitrogen)にて 2時間 37°C、 5%COインキュベーター内で培養した後、培地交換に
2
より非付着性細胞を取り除いた。 30 ng/mlの GM- CSFと 30 ng/mlの IL- 3 (どちらも Pepr oTech EC ltd, London, Englandより購入)を含む無血清 AIM- V培地で付着細胞を培 養し、 3日後と 5日後に培養液を同じ組成の新しいものに交換した。培養開始から 7日 後に 2.5mg/mlトリプシン（Sigma)にて処理し、ピペッティングして付着性の細胞を培養 容器より剥離後回収し、抗原提示細胞（antigen- presenting cell; APC)としての mDC を得た。さらに、 MACS (Miltenyi Biotechより購入)を使用して、 mDCを誘導する際に 得られた非付着性細胞力 抗 CD4抗体吸着性細胞を単離し、 CD4+T細胞を得た。
[0061] 3)組み換え MAGE-A4を用いた MAGE-A4特異的 Th細胞の榭立
2)で調製した mDC 1 X 106個 ZmL培地に終濃度が g/mlになるように組み換 え MAGE- A4を添カ卩し、 37°C、 5%COインキュベーター内で 2時間培養した後、マイト
2
マイシン C (MMC、協和発酵)をカ卩えて 45分間インキュベーションして、抗原提示処理 を行った。 24穴プレート (BD Bioscience, CA)の 1つの穴に、 CD4+T細胞 (lxl06/well)と 抗原提示処理した mDC(lxl05 /well)をカ卩え、培養液 1000 μ 1中で共培養した。培養 液は、 5%ΑΒ型健常人血清（複数のボランティアより供与)を含む AIM-V培地を用い た。共培養開始から 7日後、別のゥエルで前記と同様に抗原提示処理した mDC (1x10 5 /well)を用意し、 7日間共培養していた CD4+T細胞を移すことにより、再刺激をおこ なった。その 2日後、組み換え IL-2を最終濃度 10 U/mlになるように添加し、 37°C、 5 %COインキュベーター内で 7日間培養することにより、 A4/Th細胞を榭立した。
2
[0062] 4)ペプチドの合成
MAGE-A4の 1〜20番目のアミノ酸配列からなるペプチド、 7〜27番目のアミノ酸配 列からなるペプチド、 14〜34番目のアミノ酸配列からなるペプチドの様に、 C末端及 び Z又は N末端に 7アミノ酸のオーバーラップ配列を有する 20アミノ酸残基力 なるぺ プチドを、 MAGE-A4の N末端カゝら C末端に至るまで全 44種類 (M1〜M44とする）設計 し、それぞれ化学合成した。さらに、 M1〜M5のペプチド混合物、 M6〜M10のぺプチ ド混合物というように、 M1〜M40の順序で、 5種類のペプチドからなるペプチド混合物 を 8種類（MIX1〜MIX8)、及び M41〜M44の 4種類のペプチド混合物 1種類（MIX9) を調製した。
[0063] 5)ポリペプチドの同定
3)で調製した A4/Th細胞を 9等分し、 4)で調製した MIX1から MIX9を終濃度が 10 μ g/mlになるようにそれぞれ添カ卩し、 MMC処理した PBMCと共培養することにより再刺 激を行った。再刺激から 1週間後に、細胞を同濃度の混合ペプチドを含む新しい培 地に写す操作を 3〜4回繰り返した。また再刺激開始から 14日目以降は、 IL-2の最終 濃度を 20 U/mlにして培養を続けた。培養後、培養上清中に含まれる IFN- γを、 ELI SAキット（BD Bioscience, CA)を用いて測定した。
[0064] その結果、混合ペプチド MIX8による再刺激を行った A4/Th細胞にお!、て IFN- γの 産生が確認された（図 1)。さらに、 ΜΙΧ8に含まれる 5種類のポリペプチド（Μ36から Μ4 0までの 5種類）の中力 HLAクラス II分子によって提示されるェピトープを有するポリ ペプチドを特定するために、 ΜΙΧ8に含まれるペプチド Μ36〜Μ40をそれぞれ単独で 用いて PBMCを刺激し、培養上清中に含まれる IFN- γを ELISAキット（BD Bioscience 、 CA)を用いて測定した。その結果、 M38による再刺激が A4/Th細胞による IFN- γの 産生を促していることが確認され（図 2)、 M38力 遺伝子型が HLA-DRB1である HLA クラス II分子によって提示されるェピトープを有するポリペプチドであることが確認され た。
[0065] <実施例 2> M41の同定
実施例 1の 2)で HLAの遺伝子型が HLA- DPB1*0201及び HLA- DPB1*0501である 健常人の末梢血からファイコール（FicoU- Paque PLUS; GE Healthcare)重層法を用 いて PBMCを分離したこと、及び選択されたペプチド MIXが異なることの他は、実施例 1の 1)〜5)と同様の操作を行い、 M41が、遺伝子型が HLA-DPB1である HLAクラス II 分子によって提示されるェピトープを有するポリペプチドであることを確認した（図 3)
[0066] <実施例 3 >M38、 M41による A4/Thl細胞の誘導
実施例 1の 2)で調製した mDC1.5 X 105個/ mL培地に終濃度が 10 μ g/mlになるよ うに M38又は M41を添カ卩し、 37°C、 5%COインキュベーター内で 2時間培養した後、
2
マイトマイシン C (MMC、協和発酵)をカ卩えて 45分間インキュベーションして、抗原提 示処理を行った。 24穴プレート (BD Bioscience, CA)の 1つの穴に、 CD4+T細胞 (lxlO6 /well)と抗原提示処理した mDC(lxl05 /well)に IL- 12(100IU/ml Genetics Institute社 より供与)と抗 IL- 4抗体（5 μ g/ml BD Pharmingen社）を加え、培養液 1000 μ 1中で共 培養した。培養液は、 5%ΑΒ型健常人血清（複数のボランティアより供与)を含む AIM -V培地を用いた。共培養開始から 7日後、別のゥエルで前記と同様に抗原提示処理 した mDC (lxlO5 /well)を用意し、 7日間共培養していた CD4+T細胞を移すことにより 、再刺激をおこなった。その 2日後、組み換え IL-2を最終濃度 10 U/mlになるように 添加し、 37°C、 5%COインキュベーター内で 7日間培養し、 M38、 M41それぞれ力ら T
2
hi細胞（M38/Thl細胞、 M41/Thl細胞）を得た。
[0067] M38/Thl細胞、 M41/Thl細胞に対して、実施例 1の 1)で調製した組み換え MAGE- A4 50 g/mlをカ卩えたところ、いずれも IFN- γの産生が確認された。また、組み換え MAGE-A4に代えて Μ38又は M41 10〜20 μ g/mlをそれぞれ加えたところ、組み換え MAGE-A4の添カ卩と同様に IFN- γの産生が確認された（図 4a、図 4b)。
[0068] く実施例 4>M41による A4/Th細胞によるサイト力インの産生
実施例 2の方法を用い、 MAGE-A4組変ぇ蛋白質の代ゎりにM41を10 iu g/mlの濃 度でカ卩えた実験を行ったところ， IL-4および IFN- γの産生が確認された (図 5a、図 5b )
<実施例 5 >セルアジュバントによる腫瘍モデルの治療
以下の操作において、培地は、 10%熱不活性化ゥシ胎児血清 (FCS, Gibco BRL ), 2 mM L-グルタミン、 0.05 mM 2-メルカプトエタノ一ル (Sigma)、 10 mM HEPES、 100 U/ mLペニシリン、 100 μ g /mLストレプトマイシンを含む RPMI- 1640培地 (Gibco BRL) (1 Os-RPMI)を用いた。
[0069] 1)西村らの方法 (J.Exp.Med 190卷 5号 617-627頁 1999年）に従!、、 OT IIマウス（Un iversity of Melbourneの F.R. Carbon博士より供与）から単離した CD4+T細胞 5 X 105 個/ mL lOs-RPMI培地と、 C57BL/6マウスから回収しマイトマイシン C (MMC、協和発 酵)を加えて 45分間インキュベーション処理した脾臓細胞 2.5 X 106個 ZmL 10s-RPMI 培地とを、 100U/mL IL— 2、 20U/mL IL— 12、 Ing/mL IFN— γ、 5 μ g/mL anti— IL— 4及 び 5 g/mL OVA class IIペプチド (ISQAVHAAHAEINEAGR OVA323- 339) (不二 家社より贈与）を含む条件で、 12穴プレート (BD Bioscience, CA)を用い、 37°C、 5%C Oインキュベーター内で 48時間共培養した。
2
[0070] 共培養後、細胞を 2穴に分け、上記の脾臓細胞 2.5 X 106個 ZmL 10s-RPMI培地を 加え、 100U/mL IL- 2、 20U/mL IL- 12、 Ing/mL IFN- γ、 5 μ g/mL anti- IL- 4及び 5 μ g/mL OVA class IIペプチド (ISQAVHAAHAEINEAGR OVA323- 339) (不二家社 より贈与）を含む条件で、 37°C、 5%COインキュベーター内でさらに 48時間共培養し
2
た。
[0071] 2度目の共培養後、再び細胞を 2穴にわけ、上記の脾臓細胞 2.5 X 106個 ZmL 10s- RPMI培地をカ卩え、 lOOU/mL IL- 2、 20U/mL IL- 12、 Ing/mL IFN- γ、 5 μ g/mL anti - IL- 4及び 50 μ g/mL OVA class IIペプチド (ISQAVHAAHAEINEAGR OVA323- 33 9) (不二家社より贈与）を含む条件で、 37°C、 5%COインキュベーター内でさらに 24
2
時間共培養した。
[0072] 3度目の共培養後、細胞を lOs-RPMI培地で洗浄し、 100U/mL IL-2、 20U/mL IL-1 2、 Ing/mL IFN- γを含む 10s-RPMI培地に変更し、 5%COインキュベーター内でさ
2
らに 60時間培養した。 3日後、細胞を lOs-RPMI培地で洗浄し、 100U/mL IL-2を含む lOs-RPMI培地に数回継代し、 OVAに特異的な Thl細胞（OVA/Thl細胞）を榭立した
[0073] 2)仮想の腫瘍抗原として OVAを発現するマウス腫瘍細胞 (マウス MHCクラス ΙΓ腫瘍 株 EG- 7、 ATCC社より購入）を、 200 μ g/mL G418 (Sigma)を含む 10s- RPMI中で培養 した。培養後の細胞 2 X 106個を C57BL/6マウスに皮内接種し、腫瘍径が 7〜8mmに なったところで第 1群〜第 4群 (各群 n=5)に分け、第 1群に OVA/Thl細胞（2 X 107 個 Z匹）及び OVA (sigma社製、 200 gZ匹）を、第 2群に OVA (200 gZ匹）を、第 3 群に OVA/Thl細胞（2 X 107個 Z匹）を、第 4群にリン酸緩衝液を、それぞれ 2日置き に 3回、腫瘍所属リンパ節近傍に皮内接種し、経時的に腫瘍細胞を観察した。
[0074] その結果、第 1群において腫瘍増殖の著しい抑制が認められ、第 1群の約 60%の マウスで腫瘍の完全な退縮が認められた（図 6、図 7)。また、第 2回投与後に抗原特 異的 CTLの誘導を調べたところ、第 1群でのみ、腫瘍所属リンパ節及び腫瘍内にお いて高頻度の OVA— tetramer+CD8+CTL細胞の誘導が検出され、強い OVA特異的 細胞傷害活性を示した。
[0075] また、上記実験において OVA/Thl細胞を CFSEで標識し、 CFSEの蛍光強度を指標 として OVA/Thl細胞の増殖を確認したところ、 OVA/Thl細胞は OVAの併用（第 1群） によって腫瘍所属リンパ節において活発に分裂していることが確認された。また、榭 状細胞の腫瘍所属リンパ節への集積及び活性化も確認された。さらに腫瘍所属リン パ節における制御性 T細胞 (Treg)の増加が著しく抑制されて 、ることも確認された。
[0076] <実施例 6 >ペプチドを用いたセルアジュバントによる腫瘍モデルの治療
実施例 5の 2)で用いた OVA蛋白質に変えて、 OVA class Iペプチド (SIINFEKL OV A257- 264)と OVA class IIペプチド (ISQAVHAAHAEINEAGR OVA323- 339) (不二 家社より贈与)を用いて同様の実験を行った。すなわち第 1群〜第 4群 (各群 n=5)に 分け、第 1群に OVA/Thl細胞（2 X 107個 Z匹）及び OVA class Iと class IIペプチド（ 各 10 μ gZ匹）、第 2群に OVA/Thl細胞（2 X 107個 Z匹）及び OVA class Iペプチド (10 /z gZ匹）のみ、第 3群に OVA/Thl細胞（2 X 107個 Z匹）及び OVA class IIぺプ チド（10 /z g/匹）のみ、第 4群にリン酸緩衝液のみ、を、それぞれ 2日置きに 3回、腫 瘍所属リンパ節近傍に皮内接種し、経時的に腫瘍細胞を観察した。
[0077] その結果、第 1群および第 3群において腫瘍増殖の著しい抑制が認められた（図 8) 。このことにより OVA/Thl細胞と class IIペプチドの混合物による治療効果が確認され

Claims

請求の範囲
[1] 腫瘍抗原と該腫瘍抗原に対して特異的な Th細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
[2] 腫瘍抗原が蛋白質である、請求項 1に記載の悪性新生物治療剤。
[3] 腫瘍抗原が蛋白質の抗原性部分ペプチドである、請求項 1に記載の悪性新生物治 療剤。
[4] 抗原性部分ペプチドが MHCクラス II分子に結合するペプチドである、請求項 3に記載 の悪性新生物治療剤。
[5] 腫瘍抗原が MAGEファミリー蛋白質である、請求項 2に記載の悪性新生物治療剤。
[6] 腫瘍抗原が MAGE-A4及び Z又はその抗原性部分ペプチドである、請求項 5に記載 の悪性新生物治療剤。
[7] MAGE-A4蛋白質の抗原性部分ペプチド力 下記の a)〜f)の!、ずれかのアミノ酸配 列からなり、かつ MAGE-A4に特異的な Th細胞にサイト力インを産生させる活性を有 するポリペプチドである、請求項 6に記載の悪性新生物治療剤。
a)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列；
b)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に 任意のアミノ酸力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
c)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
d)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列。
e)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に任意のアミノ酸 力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
f)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに 1〜数個のアミノ酸残基が置換 したアミノ酸配列。
[8] 下記の a)〜f )の!、ずれかのアミノ酸配列からなり、かつ MAGE-A4に特異的な Th細 胞にサイト力インを産生させる活性を有するポリペプチド。 a)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列；
b)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に 任意のアミノ酸力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
c)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
d)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列。
e)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 1〜数個のアミノ酸残基が 置換及び Z又は欠失したアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に任意のアミノ酸 力 ^〜数十個付加されたアミノ酸配列；
f)配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端の 1〜5アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに 1〜数個のアミノ酸残基が置換 したアミノ酸配列。
[9] b)〜f)のアミノ酸配列力 なるポリペプチド力 配列番号 1又は配列番号 2に示される アミノ酸配列からなるポリペプチドが有するェピトープであって、 CD4+T細胞から MAG E-A4に特異的な Th細胞を誘導する当該ェピトープを有するポリペプチドである、請 求項 8に記載のポリペプチド。
[10] 請求項 8に記載のポリペプチドをコードする核酸。
[11] 請求項 10に記載の核酸を含むベクター。
[12] 請求項 8に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
[13] 請求項 8に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分とする、悪性新生物 免疫治療用ワクチン。
[14] 請求項 8に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞と CD4+T細胞と をインビトロでインキュベーションする工程を含む、 MAGE-A4に特異的な Th細胞を誘 導する方法。
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