明 細 書
消化管運動改善剤スクリーニング法
技術分野
[0001] 本発明は、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/ 又は治療薬、並びにそれらのスクリーニング方法及びツールなどに関する。
背景技術
[0002] セロトニン(serotonin ;以下、 5— HTと称する)は、バナナなどの果実や野菜、有 害植物などに多く含まれている。動物では生体内の 5— HTの 90%が胃腸管に存在 している。胃腸管の 5— HTは胃腸管粘膜のクロム親和細胞(enterochromaffin c ell ;以下、 EC細胞と称する)で生合成され、血中に入り全身へ運搬される。腸管に対 する化学刺激、機械刺激によって遊離された 5— HTは、標的細胞の 5— HT受容体 と結合して生理反応を引き起こす。消化管運動機能に関与する 5— HT受容体として は、 5— HT受容体 1、 5— HT受容体 2、 5— HT受容体 3、 5— HT受容体 4、 5— HT 受容体 7などが認められている。これらの受容体は胃腸管の神経細胞や平滑筋に発 現していることが明らかになつている。 EC細胞から遊離された 5— HTはこれらの 5— HT受容体を発現する神経細胞や平滑筋を介し、消化管運動機能をコントロールし ている。すなわち、 5— HTは胃腸管機能を調節するホルモンの一種であると考えら れている(非特許文献 1)。
[0003] EC細胞へ化学刺激や機械刺激を与えると、 5— HT遊離が促進し腸管運動が亢進 することは以前から知られている力 どのような分子メカニズムで、上記の EC細胞か らの 5— HT遊離促進が引き起こされるかはほとんど明らかにされていない。
[0004] 現在、消化器疾患領域の臨床現場では 5— HT受容体の活性をコントロールする 薬剤が使用されている。例えば、 5— HT受容体 3阻害薬は下痢型 IBSの治療や制 吐剤などに用いられ、 5— HT受容体 4活性化剤は便秘型 IBSや消化器機能不全症 の治療などに用いられている。また IBS患者の多くに食後の血中 5— HT量に異常が みられること力、ら、 5— HTが病態に関連していることが明らかになつている。しかしな がら、便秘型 IBSをはじめとする消化器疾患において患者の満足度の高い治療薬は
まだ多くない (非特許文献 1)。
[0005] TRP (Transient Receptor Potential)チャネルファミリーに含まれる TRPA1は 近年、温度感受性チャネルであることが報告され, TRPA1は、 17°C以下の温度で 活性化し、侵害性冷刺激によって活性化されることが報告された (非特許文献 2)。ま た低温だけでなぐマスタードなどの刺激物質によっても活性化するリガンド作動性ィ オンチャネルでもあることが明らかになった(非特許文献 3、特許文献 1)。
[0006] さらに TRPA1欠損マウスを用いた実験から、一次求心性侵害受容器を活性化させ て炎症性痛覚を引き起こすことが明らかになった (非特許文献 4)。これらの実験結果 力 TRPA1が外因性の刺激物質と内因性の疼痛誘発物質が炎症性疼痛を惹起す る時の伝達機構にお!/、て、重要な要素を担ってレ、ると考えられて!/、る。
[0007] 上記のように知覚神経などに関する TRPA1の機能は既に公知となっている力 消 化管における TRPA1の役割に関して研究報告は全くなぐ腸管における機能も不 明のままである。
特許文献 1:国際公開第 2005/089206号
非特許文献 1 : TEXTBOOK of Gastroenterolorogy, Fourth Edition, ISB N 0- 7817- 2861 -4
非特許文献 2 : Cell, Vol. 112, 819— 829 (2003)
非特許文献 3 : Nature, Vol. 427, 260— 265 (2004)
非特許文献 4 : Cell, Vol. 124, 1269- 1282 (2006)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の課題は、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防- 治療薬として有用な物質を得るためのスクリーニングツール及びスクリーニング方法、 並びに上記スクリーニングに使用することのできる手段を提供し、さらには、新規の消 化器疾患、及び/又は 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防 ·治療薬などを 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、 TRPA1が、 5— HTの産生.分泌を担う 5— HT遊離細胞で発現し、
この細胞からの 5— HT遊離を調節していること、より詳細には、 TRPA1の活性化に よりこのような細胞からの 5— HT遊離が特異的に促進されること、及び TRPA1の阻 害によりこのような細胞からの 5— HT遊離が特異的に抑制されることなどを見出した 。このような知見に基づき、本発明者らは、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節 し得る物質が 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患 (例、消化器疾患)の予防及び/ 又は治療薬として有用であり得ること、並びに 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患 の予防及び/又は治療薬を得るためには、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調 節し得る物質をスクリーニングすればよいことなどを着想し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、以下の発明などを提供する。
〔 1〕試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否かを評価するこ とを含む、 5— HT産生 '分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬のスクリー ユング方法。
〔2〕試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否かを評価するこ とを含む、消化器疾患の予防及び/又は治療薬のスクリーニング方法。
〔3〕以下の工程 (a)〜(c)を含む、上記〔1〕又は〔2〕のスクリーニング方法:
(a) TRPAlを発現している哺乳動物細胞に試験物質を接触させる工程;
(b) TRPA1の発現又はチャネル活性を分析する工程;及び
(c) TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を選択する工程。
〔4〕TRPA1を発現している哺乳動物細胞力 クロム親和細胞、瞵 /3細胞又は TRP A1発現ベクターで形質転換された細胞である、上記〔3〕のスクリーニング方法。 〔5〕TRPA1活性化剤又は TRPA1阻害剤を用いてスクリーニング方法が行われる、 上記〔 1〕〜〔4〕の!/、ずれかのスクリーニング方法。
〔6〕TRPA1の発現又はチャネル活性の調節力 TRPA1の発現又はチャネル活性 の促進である、上記〔1〕〜〔5〕の!/、ずれかのスクリーニング方法。
コ丁!^?八;!の発現又はチャネル活性の調節カ 丁!^?八;!の発現又はチャネル活性 の抑制である、上記〔1〕〜〔5〕のいずれかのスクリーニング方法。
〔8〕TRPA1の発現又はチャネル活性を促進し得る物質を選択することによる、便秘 型過敏性腸症候群、機能性胃腸症又は便秘症の予防又は治療薬のスクリーニング
方法である、上記〔3〕のスクリーニング方法。
〔9〕TRPA1の発現又はチャネル活性を抑制し得る物質を選択することによる、下痢 型過敏性腸症候群、下痢症又は嘔吐の予防又は治療薬のスクリーニング方法である 、上記〔3〕のスクリーニング方法。
〔10〕TRPA1発現ベクターで形質転換された細胞を含む、 5— HT産生 ·分泌異常 が関わる疾患の予防及び/又は治療薬のスクリーニングツール。
〔11〕TRPA1発現ベクターで形質転換された細胞を含む、消化器疾患の予防及び /又は治療薬のスクリーニングツール。
〔12〕消化器疾患が、過敏性腸症候群、機能性胃腸症、便秘症、下痢症又は嘔吐で ある、上記〔11〕のスクリーニングツール。
〔 13〕 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を含む、 5— HT産生 .分 泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬。
〔14〕TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を含む、消化器疾患の予 防及び/又は治療薬。
〔15〕TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質をスクリーニングし、スクリ 一ユングで得られた物質を製剤化することを含む、 5— HT産生'分泌異常が関わる 疾患の予防及び/又は治療薬の製造方法。
[16]以下の工程 (a)〜(d)を含む、上記〔15〕の製造方法:
(a) TRPAlを発現している哺乳動物細胞に試験物質を接触させる工程;
(b) TRPA1の発現又はチャネル活性を分析する工程;及び
(c) TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を選択する工程;
(d)工程 (c)で得られた物質を製剤化する工程。
〔17〕上記〔1〕又は〔2〕のスクリーニング方法で得ることができる物質を含む、 5— HT 産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬。
〔18〕上記〔1〕又は〔2〕のスクリーニング方法で得ることができる物質を予防及び/又 は治療の必要な患者に投与することを含む、 5— HT産生'分泌異常が関わる疾患の 予防及び/又は治療方法。
〔19〕 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬の製造におけ
る、上記〔1〕又は〔2〕のスクリーニング方法で得ることができる物質の使用。
〔20〕所定の薬効を示す試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る か否かを評価することを含む、所定の薬効を示し、かつ 5— HT遊離調節能を有さな V、物質のスクリーニング方法。
〔21〕以下の工程 (a)〜(c)を含む、上記〔20〕のスクリーニング方法:
(a) TRPA1を発現している哺乳動物細胞に、所定の薬効を示す試験物質を接触さ せる工程;
(b) TRPA1の発現又はチャネル活性を分析する工程;及び
(c) TRPA1の発現又はチャネル活性を調節しない、所定の薬効を示す物質を選択 する工程。
〔22〕所定の薬効を示し、かつ TRPA1の発現又はチャネル活性を調節しない物質を スクリーニングし、スクリーニングで得られた物質を製剤化することを含む、医薬の製 造方法。
〔23〕 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬のためのスクリ 一ユングツーノレとしての TRPA1の使用。
〔24〕消化器疾患の予防及び/又は治療薬のためのスクリーニングツールとしての T RPA1の使用。
発明の効果
[0011] 本発明のスクリーニングツール及びスクリーニング方法は、例えば、消化器疾患を 含む 5— HT産生'分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬、並びに所定の 薬効を示し、かつ 5— HT遊離調節能に起因する作用(例、消化器における副作用) が所望されない医薬の開発に有用であり得る。
本発明の医薬は、例えば、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾 患の予防及び/又は治療薬として、並びに所定の薬効を示し、かつ 5— HT遊離調 節能に起因する作用が所望されない医薬として有用であり得る。本発明はまた、この ような医薬の製造方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]90〃Μのァリルイソチオシァネート(A)、シンナムアルデヒド(B)、ァクロレイン(
C)をそれぞれ添加したときの細胞内 Ca2+濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は 細胞内 Ca2+濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。口は TRPA1発現 CHO— K1細胞、〇はコントロールの CHO— K1細胞を示す。
[図 2]ヒト各種組織での TRPAlmRNAの発現分布を示す。値はヒト G3PDH遺伝子 の発現量を 100%としたときの相対値を示す。
[図 3]ヒト十二指腸を用いて TRPA1遺伝子の in situハイブリダィゼーシヨン染色を 行った結果を示す。アンチセンスプローブを用いた検討では、ヒト十二指腸の上皮に ある一部の細胞に強い発色が見出された (左図;矢印)。一方、センスプローブを用 いた検討では、染色は見られなかった (右図)。
[図 4]ヒト十二指腸を用いて TRPA1遺伝子の in situハイブリダィゼーシヨン染色を 行ったのち、同一の切片をさらにセロトニンに対する抗体で免疫染色した結果を示す
。 TRPA1とセロトニンを同時に発現している細胞は矢印で指し示す。
[図 5]RIN14B細胞にァリルイソチォシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを それぞれ添加したときのセロトニンの遊離量を測定した結果を示す。これらはそれぞ れは濃度依存的に RIN14B細胞からのセロトニンの遊離を促進した。
[図 6]RIN14B細胞に TRPA1の siRNAを導入したときのセロトニンの遊離量を測定 した結果を示す。 TRPA1の # 971siRNAは RIN14B細胞からのシンナムアルデヒ ド誘導性のセロトニン遊離を抑制した(平均土 SD)。 細胞を処理したときのセロトニンの遊離量を測定した結果を示す。ァリルイソチオシァ ネート、シンナムアルデヒドともに EC細胞からのセロトニンの遊離を促進した。
[図 8-1]ストレインゲージフォーストランスデューサ一法によるィヌ消化管運動の測定 結果を示す。ァリルイソチオシァネートは投与直後に胃の運動を亢進し (黒矢印)、 G MCを誘発した(白抜き矢印)。投与タイミングは破線で示す。
[図 8-2]ストレインゲージフォーストランスデューサ一法によるィヌ消化管運動の測定 結果を示す。 Vehicleは投与直後に胃の運動を抑制し (黒矢印)、 GMCも誘発しなか つた(白抜き矢印)。投与タイミングは破線で示す。
園 9]消化管水分分泌測定実験におけるァリルイソチオシァネートの作用の測定結果
を示す。 Vehicle群に対してァリルイソチオシァネートは濃度依存的に水分分泌亢進 作用を示した。 (N = 6、平均土 SE) *:pく 0.01 vsSaline group (Dunnett's test)
[図 10]口ペラミド誘発便秘モデルにおけるァリルイソチオシァネートの作用の測定結 果を示す。 Vehicle群に対してァリルイソチオシァネートは濃度依存的にビーズの排 出時間を短縮した。 (N = 6、平均土 SE) #:pく 0.05 vsコントロール (Student' s t-test)、 *:Pく 0.05 vs Vehicle (Dunnett s test)
発明を実施するための最良の形態
[0013] 1.スクリーニングツーノレ
本発明は、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/ 又は治療薬のスクリーニングツールを提供する。本発明のスクリーニングツールとして は、例えば、ポリペプチド型スクリーニングツール、細胞型スクリーニングツールが挙 げられる。
[0014] (1)ポリペプチド型スクリーニングツール
本発明のスクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例え ば、以下の(i)〜(iii)が挙げられる:
(i)哺乳動物 TRPA1と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii) (a)哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列を含み、し力、も、 TRPA1活性化剤により活 性化され、陽イオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、(b) 哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列における 1〜; 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/ 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、し力、も、 TRPA1活性化剤により活性化され、陽 イオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド [以下、ポリペプチド(a)から なるツール用ポリペプチド及びポリペプチド(b)力 なるツール用ポリペプチドを併せ て、機能的等価改変ツール用ポリペプチドと称する] ;又は
(iii)哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列との同一性が 80%以上であるアミノ酸配列から なり、し力、も、 TRPA1活性化剤により活性化され、陽イオン透過型のイオンチャネル 活性を示すポリペプチド(以下、同一ツール用ポリペプチドと称する)。
以下、本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるこれら の各種ポリペプチドを、総称して、スクリーニングツール用ポリペプチド又は TRPA1 (
ポリペプチド)と称する。
[0015] 本明細書中で用いられる場合、「TRPA1活性化剤により活性化され、陽イオン透 過型のイオンチャネル活性を示す」とは、対象となるポリペプチドを発現させた細胞、 または天然に発現する細胞を、 TRPA1活性化剤による刺激又は無刺激で、それぞ れの細胞の電流応答値又はカルシウム流入量又はその他の陽イオン流入量を比較 した場合に、刺激した細胞の電流応答値又はカルシウム流入量又はその他の陽ィォ ン流入量が、無刺激の細胞の電流応答値又はカルシウム流入量又はその他の陽ィ オン流入量よりも高いことを意味する。例えば、カルシウム流入量の比較は、実施例 4 、 5又は 13に記載の方法に従って確認することができる。カルシウム流入量の上昇の 程度としては、それぞれを無刺激の細胞でのカルシウム流入量と有意差検定を行な つた際に、 P値が 0. 05以下であることが好ましぐ P値が 0. 01以下であること力 Sより 好ましい。
[0016] 本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、セシウム、ナトリウム、及びマグネ シゥムイオン透過型のイオンチャネル活性も示すものがより好ましい。
[0017] 本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる、哺乳動物 T RPA1のアミノ酸配列からなる各ポリペプチドとしては、例えば、ヒト、マウス、及びラッ ト由来の TRPA1 (例、それぞれ配列番号 2、 4、 6)が挙げられる。 TRPA1は、ヒトと マウスとの間では、 79. 7%のアミノ酸配列同一性、 80. 7%のヌクレオチド配列同一 性を有し、ヒトとラットとの間では、 79· 6%のアミノ酸配列同一性、 79· 9%のヌクレオ チド配列同一性を有し、マウスとラットとの間では、 96. 6%のアミノ酸配列同一性、 9 4. 3%のヌクレオチド配列同一性を有する。本発明では、特に、ヒト由来の TRPA1 ( 例、配列番号 2)が好ましい。
[0018] また、 TRPA1のアミノ酸配列および TRPA1を活性化するリガンドに関する情報は 、各種文献から得ることが出来るが、いずれも、 EC細胞からの 5— HT放出や消化管 運動に関与することは、開示も示唆もない。
[0019] 本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価 改変ツール用ポリペプチドとして、(a)哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列の 1又は複数 の箇所において、全体として 1〜; 10個はり好ましくは 1〜7個、更に好ましくは 1〜5
個、特に好ましくは 1又は 2個)のアミノ酸が欠失、置換、揷入、及び/又は付加され たアミノ酸配列からなり、しかも、 TRPA1活性化剤により活性化され、陽イオン透過 型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、(b)哺乳動物 TRPA1のアミ ノ酸配列を含み、し力、も、 TRPA1活性化剤により活性化され、陽イオン透過型のィォ ンチャネル活性を示すポリペプチドが好ましい。
[0020] また、哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列を含み、し力、も、 TRPA1活性化剤により活 性化され、陽イオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチドとして、例えば、 哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列からなるポリペプチドの N末端及び/又は C末端に 、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド (すなわち、融合ポリペプチド)も、 T RPA1活性化剤により活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を 示す限り、含まれる。
[0021] 前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確 認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、 FLA Gェピトープ、へキサーヒスチジン'タグ、へマグルチニン.タグ、又は mycェピトープ などを挙げること力 Sできる。
[0022] 本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる同一ツール 用ポリペプチドは、哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列との同一性力 80%以上であり 、 90%以上であるものが好ましぐ 95%以上であるものがより好ましぐ 98%以上で あるものが更に好ましぐ 99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものが特 に好ましい。本明細書における前記「同一性」の程度は、 MegAlign (DNASTAR社 )を用いた ClustalV法により決定される。
[0023] (2)細胞型スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリ一ユングツールとして用レ、ることのできる細胞(以下、スクリ一 ユングツール用細胞と称する)は、細胞型スクリーニングツールとして用いる際に前記 スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではな ぐ外来遺伝子で形質転換することにより、人為的に前記ポリペプチドを発現させた 形質転換細胞であることもできるし、又は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発 現している天然の細胞又はその細胞株(例、 RIN14B細胞)であることもできる。スクリ
一ユングツール用細胞は、当該細胞を含む組織の形態でも提供され得る。
[0024] 本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツー ル用細胞としては、 TRPA1遺伝子が導入された形質転換細胞が好ましい。このよう な細胞としては、例えば、以下の(i)〜(iii)が挙げられる:
(i)哺乳動物 TRPA1のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している形質転換細 胞;
(ii)機能的等価改変ツール用ポリペプチドを発現している形質転換細胞;又は
(iii)同一ツール用ポリペプチドを発現して!/、る形質転換細胞。
[0025] 好ましくは、 TRPA1を発現している哺乳動物細胞は、 5— HT遊離細胞であり得る 。本明細書中で用いられる場合、「5— HT遊離細胞」とは、 TRPA1を介した制御機 構を通じて 5— HTを遊離し得る細胞をいい、例えば、 EC細胞 (例、胃腸管粘膜、肺 、皮膚、勝臓等の組織由来の EC細胞)、瞵 /3細胞等の内分泌細胞が挙げられる。細 胞としては、正常細胞、癌細胞が挙げられる。
[0026] 本発明における上記(1)及び(2)のスクリーニングツールは、消化器疾患を含む 5
HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬のスクリーニングに有 用であり得る。このような疾患としては、消化器疾患及び非消化器疾患が挙げられる 。消化器疾患としては、例えば、過敏性腸症候群 (例、便秘型過敏性腸症候群、下 痢型過敏性腸症候群)、機能性胃腸症、便秘症、下痢症、嘔吐)が挙げられる。非消 化器疾患としては、例えば、摂食障害 (例、過食症、拒食症)、疼痛、偏頭痛、睡眠障 害 (例、不眠症)、精神障害 (例、鬱病、不安障害、統合失調症)、血液凝固障害 (例 、血小板凝集機能不全、血栓、肺血栓塞栓症)、カルシノイド腫瘍が挙げられる。
[0027] 本発明のスクリーニングツールの製造は、公知の方法(例えば、 Molecular Cloni ng— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 198 9、 WO02/052000,又は WO02/053730)に従って fiうことカできる。
[0028] 本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、 スクリーニングツール用ポリヌクレオチドと称する)の製造方法は、特に限定されるもの ではないが、例えば、(a)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた方法、(b)常法の遺 伝子工学的手法 (すなわち、 cDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から、所
望の cDNAを含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は (c)化学合成法 などを挙げること力 Sできる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
[0029] PCRを用いた方法 [前記製造方法(a) ]では、例えば、以下の手順により、本発明 のスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。
[0030] すなわち、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドを産生する能力を有する 細胞(例えば、ヒト、マウス、又はラット細胞)又は組織から mRNAを抽出する。次いで 、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、前記ポリぺ プチドに相当する mRNAの全長を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセット、ある いは、その一部の mRNA領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセットを作成 する。反応条件 (例えば、変性温度又は変性剤添加条件など)を適切に調整して、逆 転写酵素 ポリメラーゼ連鎖反応 (RT— PCR)を行なうことにより、本発明のスクリー ユングツール用ポリペプチドをコードする全長 cDNA又はその一部を得ることができ
[0031] また、前記ポリペプチドを産生する能力を有する細胞(例えば、ヒト、マウス、又はラ ット細胞)又は組織から調製した mRNAから、逆転写酵素を用いて作製した cDNA、 あるいは、市販のヒト、マウス、若しくはラット細胞又は組織由来の cDNAを铸型として 、 PCRを実施することによつても、前記ポリペプチドをコードする全長 cDNA又はその 一] ¾を得ること力できる。
[0032] なお、得られたこれらの全長 cDNA又はその一部は、適当な発現ベクターに組み 込むことにより、宿主細胞で発現させ、前記ポリペプチドを製造することができる。
[0033] 常法の遺伝子工学的手法を用いる方法 [前記製造方法 (b) ]では、例えば、以下の 手順により、本発明のスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを製造することができる
〇
[0034] まず、前記の PCRを用いた方法で調製した mRNAを铸型として、逆転写酵素を用 いて 1本鎖 cDNAを合成した後、この 1本鎖 cDNAから 2本鎖 cDNAを合成する。
[0035] 次に、前記 2本鎖 cDNAを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌(例えば、 D H5 α株、 HB101株、又は JM109株)に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイ クリン、アンピシリン、又はカナマイシンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選
択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、 Hanaha nの方法(Hanahan, D. J. , Mol. Biol. , 166, 557— 580, 1983)により実施す ること力 Sできる。また、市販のコンビテント細胞を使用することもできる。なお、ベクター としては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
[0036] このようにして得られる形質転換株から、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択 する方法としては、例えば、(1)合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダィ ゼーシヨンによるスクリーニング法、又は(2) PCRにより作製したプローブを用いるハ イブリダィゼーシヨンによるスクリーニング法を採用することができる。
[0037] 得られた目的の形質転換株より本発明のスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを 採取する方法は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、細胞よりブラ スミド DNAに相当する画分を分離し、得られたプラスミド DNAから cDNA領域を切り 出すことにより fiなうことができる。
[0038] 化学合成法を用いた方法 [前記製造方法 (c) ]では、例えば、化学合成法によって 製造した DNA断片を結合することによって、本発明のスクリーニングツール用ポリヌ クレオチドを製造することができる。各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 Oligo 1000 M DNA Synthesizer (Beckman社製)、又は 394 DNA/RNA Synthesize r (Applied Biosystems社製)など]を用いて合成することができる。
[0039] これまで述べた種々の方法により得られる DNAの配列決定は、例えば、マキサム ギルバートの化学修飾法(Maxam, A. M.及び Gilbert, W. , Methods in E nzymology, 65, 499 559, 1980)ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法(Messin g, J.及び Vieira, J. , Gene, 19, 269— 276, 1982)等により fiなうことカできる。
[0040] 単離された本発明のスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを、適当なベクターに 再び組込むことにより、宿主細胞 (真核生物及び原核生物の各宿主細胞を含む)を 形質転換させ、本発明の細胞又はスクリーニングツール用細胞を得ることができる。 また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入 することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可 能である。
[0041] 例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ
、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞である COS細胞(Gluzman, Y. , Ce 11, 23, 175 - 182, 1981)、チャイニーズ'ノ、ムスター卵巣細胞(CHO)のジヒドロ葉 酸レダクターゼ欠損株(Urlaub, G.及び Chasin, L. A. , Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 77, 4216 -4220, 1980)、ヒト月台児腎臓由来 HEK293細胞、又は前記 H EK293細胞にェプスタイン'バーウィルスの EBNA—1遺伝子を導入した 293— EB NA細胞(Invitrogen社)等を挙げること力 Sできる。
[0042] 脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しょうとするポリヌクレオチドの上 流に位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、ポリアデュル化部位、及び転写 終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有して いること力 Sできる。前記発現ベクターの例としては、例えば、 SV40の初期プロモータ 一を有する pSV2dhfr (Subramani, S .ら, Mol. Cell. Biol. , 1 , 854— 864, 19 81)、ヒトの延長因子プロモーターを有する pEF— BOS (Mizushima, S.及び Nag ata, S. , Nucleic Acids Res. , 18, 5322, 1990)、又 (まサイトメガロウイノレスフ。 口モーターを有する pCEP4 (Invitrogen社)等を挙げること力 Sできる。
[0043] 宿主細胞として COS細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、 SV40複製起点 を有し、 COS細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写 終結シグナル、及び RNAスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 p ME18S (Maruyama, K.及び Takebe, Y. , Med. Immunol. , 20, 27— 32, 1 990) , pEF -BOS (Mizushima, S.及び Nagata, S. , Nucleic Acids Res. , 18 , 5322, 1990)、又は pCDM8 (Seed, B. , Nature, 329, 840— 842, 1987) 等を挙げること力 Sでさる。
[0044] 前記発現ベクターは、例えば、 DEAE—デキストラン法(Luthman, H.及び Mag 画 son, G. , Nucleic Acids Res. , 11 , 1295— 1308, 1983)、リン酸カルシ ゥム— DNA共沈殿法(Graham, F. L.及び van der Ed, A. J. , Virology, 52 , 456— 457, 1973)、市販のトランスフエクシヨン試薬(例えば、 FuGENE™ 6 Tr ansfection Reagent; Roche Diagnostics社^ Dを用レ、7"こ方法、めるい(ま、 気 ノ ノレス穿孑し法(Neumann, E.ら, EMBO J. , 1 , 841— 845, 1982)等により、 C OS細胞に取り込ませることができる。
[0045] また、宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、本発明のスクリーニングツール 用ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、 G418耐性マーカーとして機能する n eo遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、 pRSVneo (Sambrook, J.ら, Molecular Cloning— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La DO ratory, NY, 1989)又は pSV2— neo (Southern, P. J.及び Berg, P. , J. Mol. Appl. Genet. , 1 , 327— 341 , 1982)等を共トランスフエタトし、 G418而ォ性のコロ ニーを選択することにより、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産 生する形質転換細胞を得ることができる。
[0046] また、宿主細胞として 293— EBNA細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、 ェプスタイン'バーウィルスの複製起点を有し、 293— EBNA細胞で自己増殖が可 能な pCEP4 (Invitrogen社)などを用いることができる。
[0047] 形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により、細胞膜に貫通 した状態で、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養 に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培 地を適宜選択することができる。例えば、 COS細胞の場合には、例えば、 RPMI- 1 640培地又はダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等の培地に、必要に応じて牛 胎仔血清 (FBS)等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、 293 EBNA細胞の場合には、牛胎仔血清(FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ 改変イーグル培地(DMEM)等の培地に G418を加えた培地を使用することができ
[0048] 形質転換体を培養することにより生産される本発明のスクリーニングツール用ポリぺ プチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知 の分離操作法により、分離精製すること力できる。具体的には、前記ポリペプチドを含 む細胞又は細胞膜画分を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過 、各種液体クロマトグラフィー [例えば、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸 着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー
、又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等]、若しくは透析法、又はこれらの組合 せ等により、前記ポリペプチドを精製することができる。
[0049] 本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、マーカー配歹 IJとインフレームで融 合して発現させることにより、前記ポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易に なる。前記マーカー配列としては、例えば、 FLAGェピトープ、へキサ一ヒスチジン' タグ、へマグルチニン'タグ、又は mycェピトープなどを挙げることができる。また、マ 一力一配列と前記ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ(例えば、ェンテロキナーゼ、 ファクター Xa、又はトロンビンなど)が認識する特異的なアミノ酸配列を揷入すること により、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能で ある。
[0050] 2.スクリーニング方法
本発明は、試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否力、を評 価することを含むスクリーニング方法を提供する。
[0051] 本発明のスクリーニング方法は、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物 質を選択することを特徴とする、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる 疾患の予防及び/又は治療薬のスクリーニング方法 (スクリーニング方法 I)、並びに TRPA1の発現又はチャネル活性を調節しない物質を選択することを特徴とする、 5 HT遊離調節能を有さない物質のスクリーニング方法 (スクリーニング方法 II)に大 另リでさる。
以下、それぞれのスクリーニング方法を詳述する。
[0052] 2. 1. TRPA1の 拝,ヌはチャネル ffi†^言周節し得ろ ^ 巽 すろこ^^樹教 す るスクリーニング方法
本発明は、試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否力、を評 価し、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を選択することを含むスク リーユング方法 (スクリーニング方法 を提供する。
[0053] スクリーニング方法 Iに供される試験物質は、特に限定されるものではないが、例え ば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビ ナトリアノレ 'ケミストリー技休亍(Terrett, N. K.ら, Tetrahedron, 51 , 8135— 8137 , 1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージ'ディスプレイ法(Felici, F. ら, J. Mol. Biol. , 222, 301— 310, 1991)などを応用して作成されたランダム 'ぺ
プチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天 然成分 (例えば、培養上清又は組織抽出物)などもスクリーニングの試験物質として 用いること力 Sできる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物( ペプチドを含む)、例えば、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレイ ンを化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を用いることができる
〇
[0054] 詳細には、本発明のスクリーニング方法 Iは、以下の工程(a)〜(c)を含む:
(a)本発明のスクリーニングツール (例、スクリーニングツール用細胞)に試験物質を 接触させる工程;
(b) TRPAlの発現又はチャネル活性を分析(測定、検出)する工程;及び
(c) TRPAlの発現又はチャネル活性を促進又は抑制し得る物質を選択する工程。
[0055] TRPA1の発現は、例えば、 TRPA1を発現している哺乳動物細胞(即ち、スクリー ユングツール用細胞)において、後述の方法を用いることにより分析できる。
[0056] TRPA1の発現はまた、 TRPA1転写調節領域についてレポーターアツセィを可能 とする細胞を用いて分析できる。 TRPA1転写調節領域についてレポーターアツセィ を可能とする細胞は、 TRPA1転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレ ポーター遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された細胞であり得る。 TRPA1転 写調節領域は、 TRPA1の発現を制御し得る領域である限り特に限定されな!/、が、 例えば、転写開始点から上流約 2kbpまでの領域、ある!/、は該領域の塩基配列にお いて 1以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ標的遺 伝子の転写を制御する能力を有する領域などを挙げることができる。レポーター遺伝 子としては、例えば GFP (緑色蛍光タンパク質)遺伝子、 GUS ( /3—ダルク口ニダ一 ゼ)遺伝子、 LUC (ルシフェラーゼ)遺伝子、 CAT (クロラムフエニコルァセチルトラン スフエラーゼ)遺伝子等が挙げられる。
[0057] 本明細書中で用いられる場合、「チャネルの活性を促進する物質」とは、「チヤネノレ を活性化する物質」と同義であり、試験物質を接触させることにより、イオンチャネル を活性化する物質をいい、 TRPA1活性化剤のように直接チャネルを活性化する物 質、及び、直接チャネルを活性化する物質の活性化を促進する物質の両方を含む。
TRPA1活性化剤共存下で上記工程を行うことにより、 TRPA1活性化剤による TRP A1の活性化を促進する物質のスクリーニングができ、 TRPA1活性化剤による前記 ポリペプチドの活性化を促進する物質のスクリーニング方法も上記スクリーニング方 法に含まれる。 TRPA1活性化剤としては、例えば、ァリルイソチオシァネート、シンナ ムアルデヒド、ァクロレインが挙げられる。
[0058] 本明細書中で用いられる場合、「チャネルの活性を抑制する物質」とは、「チャネル を阻害する物質」と同義であり、試験物質を接触させることにより、イオンチャネルの 活性化を抑制する物質を!/、い、 TRPA1阻害剤のようにチャネル活性を阻害する物 質、及び、直接チャネルを阻害する物質の活性を増加させる物質の両方を含む。 TR PA1阻害剤共存下で上記工程を行うことにより、 TRPA1阻害剤による TRPA1の不 活性化を促進する物質のスクリーニングができ、 TRPA1阻害剤による前記ポリぺプ チドの不活性化を増加させる物質のスクリーニング方法も上記スクリーニング方法に 含まれる。 TRPA1阻害剤としては、例えば、ルテニウムレッドが挙げられる。
[0059] 本発明のスクリーニング方法におけるチャネル活性の分析は、種々の様式で行わ れ得る。このような様式としては、例えば、(a)パッチクランプ(patch— clamp)法の 利用、(b)放射性同位元素イオンの流入の利用、(c)細胞内 Ca2+検出色素の利用 が挙げられる。各スクリーニング方法について以下に説明する。
[0060] (a)のパッチクランプ法を利用してスクリーニングする場合には、例えば、ホールセ
cell patch― clamp) ϊ¾ (Hille , B. , Ionic Channels oi Excitable Membranes, 2nd d. , 1992, ¾mauer Associateslnc. , M A)を用いて、細胞における全細胞電流を分析 (好ましくは測定)することにより、チヤ ネルを活性化させるか否かを分析することができる。
[0061] より具体的には、本発明のスクリーニングツール用細胞をホールセルパッチクランプ 法により膜電位固定し、前記細胞の全細胞電流を測定する。この場合、細胞外液とし ては、 149mmol/L— NaCl、 5mmol/L— KC1、 2mmol/L— CaCl、 0. 8mmo
2
1/L-MgCl、及び 10mmol/L— HEPES— Na (pH7. 4)を含む溶液を使用し、
2
細胞内液としては、 147mmol/L— CsCl、 4. 5mmol/L— EGTA、及び 9mmol /L-HEPES -K (pH7. 2)を含む溶液などを用いることができる。続いて、細胞外
液又は細胞内液に試験物質を添加した場合の電流変化を測定することで、本発明 ポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドのチャネルを活性化する物質 をスクリーニングすることができる。例えば、試験物質を添加した場合に、前記チヤネ ルの活性化刺激の際に生じる全細胞電流の変化が強くなれば、前記試験物質は、 前記チャネルを活性化する物質であると判定することができる。チャネルを活性化す る物質としては、例えば、実施例に記載されるような TRPA1活性化剤と同程度の細 胞電流変化を生じさせるものを選択することが好ましい。
[0062] (b)の放射性同位元素イオンの流入を利用してスクリーニングする場合には、 Ca2+ イオンの各放射性同位元素を指標としてチャネル活性を分析 (好ましくは測定)する ことができる [Sidney P. Colowick及び Nathan O. Kaplan, Methods in EN ZYMOLOGY, 88 (1) , 1982, Academic Press社, 346— 347]。この分析方法 は、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドが Ca2+イオンを透過させるとの知 見に基づくものである。
[0063] 本発明のスクリーニングツール用細胞において、試験物質により前記細胞の細胞 内へ流入する放射活性、あるいは、細胞外に残存する放射活性の量を分析すること により、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドのチャネルを活性化させるか否 かを分析することができる。
[0064] 具体的には、例えば、 Ca2+イオンの放射性同位元素である45 Ca2+を用いて測定す ること力 Sできる。 45Ca2+を反応液中に入れておいた状態で、試験物質が前記チヤネ ルを活性化させると、放射性同位体元素が細胞内へ流入することから、細胞外液中 の放射活性 (すなわち、細胞外液に残存した放射活性)、あるいは、細胞内に流入し た放射性同位元素の放射活性をチャネル活性化の指標とすることができる(黒木登 志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細 胞実験法」、 1995年、羊土社)。チャネルを活性化する物質としては、例えば、実施 例に記載されるような TRPA1活性化剤と同程度に細胞内へ Ca2+を流入させるもの 、具体的には EC 力 OO mol/L以下のものを選択するのが好ましい。
50
[0065] (c)の細胞内 Ca2+検出色素を利用してスクリーニングする場合には、細胞内 Ca2+ 検出色素として、例えば、 Fluo3— AMなどを用いることができる。細胞内 Ca2+検出
色素は、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドのイオンチャネルの開口に伴 う細胞内 Ca2+濃度の変化を光学的に分析 (好ましくは測定)することが可能である( ェ藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、 1996年、羊土 社)。これらの色素を用いることによって前記チャネルの活性を測定することができる 。前記チャネル発現細胞において、試験物質不在下と比較して、試験物質存在下で 細胞内 Ca2+検出色素が変化することにより、前記チャネルを活性化する物質である と判定すること力できる。本方法は、特に限定されるものではないが、例えば、本発明 のスクリ一ユングツール用細胞に細胞内 Ca2+検出色素を取り込ませた後、試験物質 による前記細胞における細胞内 Ca2+検出色素の量変化を光学的に測定することに より前記チャネルを活性化させるか否かを分析することができる。
[0066] より具体的には、試験物質を添加した場合に、試験物質不在下の場合と比較して、 細胞内に流入する Ca2+量が増加すれば、前記試験物質は、チャネルを活性化する 物質であると判定することができる。本方法は,実施例 3、 4、 5、 13に記載の条件で 実施することが好ましぐチャネルを活性化する物質としては、例えば、実施例に記載 されるような TRPA1活性化剤と同程度に細胞内 Ca2+検出色素の量変化を促すもの 、具体的には実施例 4の条件で EC 力 mol/L以下のものを選択するのが好
50
ましい。またチャネルを不活性化する物質としては、例えば、実施例に記載されるよう な TRPA1阻害剤と同程度に細胞内 Ca2+検出色素の量変化を促すもの、具体的に は実施例 5の条件で EC 力 00 mol/L以下のものを選択するのが好ましい。
50
[0067] また、前記(a)、 (b)、又は(c)のスクリーニング方法において、前記チャネルを直接 活性化しないものについても、前記試験物質を投与後に更に前記チャネルを 100% 活性化しない濃度の TRPA1活性化剤を、例えば 1 μ mol/Lの TRPAl活性化剤を 投与した時、前記試験物質を投与してレ、な!/、ときよりも強!/、活性を示すものにっレ、て は、前記チャネルの活性を促進するものと判定することができる。上記のように、 TRP A1活性化剤共存下で上記スクリーニングを行うことにより、 TRPA1活性化剤による 本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドの活性化を促進させる化合物をスクリ 一ユングすることができる。活性化を促進する物質としては、 TRPA1活性化剤による 活性を有意に促進させるもの、具体的には EC 力 mol/L以下のものを選択
することが好ましい。
[0068] また阻害剤のスクリーニング方法も同様に、前記(a)、(b)、又は(c)のスクリーニン グ方法において、前記チャネルを直接不活性化しないものについても、前記試験物 質を投与後に更に前記チャネルを完全に不活性化しない濃度の TRPA1阻害剤を、 例えば 100nmol/Lの TRPA1阻害剤を投与した時、前記試験物質を投与していな V、ときよりも強い阻害活性を示すものにつ!/、ては、前記チャネルの活性を不活性化 するものと判定すること力 Sできる。上記のように、 TRPA1阻害剤共存下で上記スクリ 一ユングを行うことにより、 TRPA1阻害剤による本発明のスクリーニングツール用ポリ ペプチドの不活性化を増加させる化合物をスクリーニングすることができる。不活性 化を促進する物質としては、 TRPA1阻害剤による阻害活性を有意に促進させるもの 、具体的には EC 力 100〃 mol/L以下のものを選択することが好ましい。
50
[0069] また、セシウム、ナトリウム、又はマグネシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を 示すスクリーニング用ポリペプチドを用いる場合は、(b)と同様に Ca2+の替わりに、セ シゥム、ナトリウム、又はマグネシウムの放射性同位元素を指標として用いることも可 能である。具体的には、 Sidney P. Colowick及び Nathan O. Kaplan, Method s in ENZYMOLOGY, 88 (1) , 1982, Academic Press社, 346— 347に記 載の方法を参考に行なうことができる。この分析方法は、本発明のスクリーニング用ポ リプペチドがセシウムイオン、ナトリウムイオン、及びマグネシウムイオンを透過させる との知見に基づくものである。
[0070] 本発明のスクリーニング方法 Iは、上述したような、消化器疾患を含む 5— HT産生- 分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬の開発に有用であり得る。例えば 、 TRPA1の発現又はチャネル活性を促進し得る物質は、消化器疾患のうち便秘型 過敏性腸症候群、機能性胃腸症又は便秘症の予防又は治療薬として、並びに非消 化器疾患のうち過食症、不眠症、鬱病、不安障害、偏頭痛、血小板凝集機能不全の 予防 ·治療薬として有用であり得る。一方、 TRPA1の発現又はチャネル活性を抑制 し得る物質は、例えば、消化器疾患のうち下痢型過敏性腸症候群、下痢症又は嘔吐 の予防又は治療薬として、並びに非消化器疾患のうち拒食症、疼痛、統合失調症、 カルシノイド腫瘍、血栓、肺血栓塞栓症の予防'治療薬として有用であり得る。
[0071] 本発明のスクリーニング方法 Iとしてはまた、以下の工程(a)〜(c)を含む、 TRPA1 に結合する物質を選択することを含むスクリーニング方法が挙げられる:
(a)本発明のポリペプチド型スクリーニングツールに試験物質を接触させる工程;
(b)前記試験物質の前記スクリーニングツールへの結合を分析する工程;及び
(c)前記スクリーニングツールへ結合する物質を選択する工程。
[0072] 本発明のスクリーニング方法 Iは、前記工程 (a)〜(c)に加え、さらに工程 (d)として 、選択された物質が 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬 として有効であるか否力、を確認する工程、あるいは、選択された物質が消化管疾患 の予防及び/又は治療薬として有効であるか否かを確認する工程を含んでもよい。 この確認工程は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いること により実施すること力できる。例えば、後述の実施例 19〜22に記載されるような、動 物を用いた腸管運動測定試験、排便量の測定、便性状の測定、摘出腸管を用いた 収縮の測定、腸管水分分泌量の測定などが挙げられる。
[0073] 2. 2. TRPA1の ヌはチャネル ffi†牛 周節しない ^ 巽 すろこ 》樹教 す るスクリーニング方法
本発明は、試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否力、を評 価し、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節しない物質を選択することを含むスク リーユング方法 (スクリーニング方法 π)を提供する。
[0074] スクリーニング方法 IIに供される試験物質は、所定の薬効を示すもの(例、薬物、生 理活性物質)である限り特に限定されるものではなぐ例えば、上述した試験物質を 用いること力 Sできる。本発明のスクリーニング方法 IIにおける TRPA1の発現又はチヤ ネル活性の分析は、スクリーニング方法 Iと同様にして行うことができる。本発明のスク リーユング方法 Πは、所定の薬効を示し、かつ 5— HT遊離調節能に起因する作用( 例、消化器における副作用)が所望されない医薬 (例、副作用が低減した医薬)の開 発に有用であり得る。
[0075] 3. 医薬
本発明は、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドの発現又はチャネル活性 を調節し得る物質を含む、医薬組成物、例えば、消化器疾患を含む 5— HT産生 '分
泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療薬を提供する。
[0076] 本発明はまた、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現又はチャネル活性を調 節し得る物質を投与することを含む、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関 わる疾患用の予防及び/又は治療方法、並びに医薬組成物の製造のための本発 明のスクリーニングツール用ポリペプチドの発現又はチャネル活性を調節し得る物質 の使用を提供する。
[0077] 本発明はさらに、試験物質が TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得るか否 力、を評価し、評価された物質を製剤化することを含む、医薬組成物の製造方法、並 びに当該製造方法により得られる医薬組成物を提供する。
[0078] 一実施形態では、本発明の製造方法は、 TRPA1の発現又はチャネル活性を調節 し得る物質をスクリーニングし、スクリーニングで得られた物質を製剤化することを含 む、消化器疾患を含む 5— HT産生 ·分泌異常が関わる疾患の予防及び/又は治療 薬の製造方法 (製造方法 I)であり得る。
[0079] より詳細には、本発明の製造方法 Iは、以下の工程 (a)〜(d)を含み得る:
(a)本発明のスクリーニングツールに試験物質を接触させる工程;
(b) TRPA1の発現又はチャネル活性を分析する工程;及び
(c) TRPA1の発現又はチャネル活性を調節し得る物質を選択する工程;
(d)工程 (c)で得られた物質を製剤化する工程。
[0080] 別の実施形態では、本発明の製造方法は、所定の薬効を示し、かつ TRPA1の発 現又はチャネル活性を調節しない物質をスクリーニングし、スクリーニングで得られた 物質を製剤化することを含む、医薬組成物の製造方法 (製造方法 Π)であり得る。
[0081] より詳細には、本発明の製造方法 IIは、以下の工程 (a)〜(d)を含み得る:
(a)本発明のスクリーニングツールに、所定の薬効を示す試験物質を接触させる工程
(b) TRPA1の発現又はチャネル活性を分析する工程;及び
(c) TRPA1の発現又はチャネル活性を調節しない、所定の薬効を示す物質を選択 する工程;
(d)工程 (c)で得られた物質を製剤化する工程。
[0082] 本発明の製造方法 I及び製造方法 IIにおける工程 (a)〜(c)は、本発明のスクリー ユング方法と同様にして行うことができる。
[0083] 本発明の製造方法における上記工程 (a)〜(c)で選択される物質 [例えば、 DNA 、タンパク質 (抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物]は、そ の種類に応じて、当該技術分野において通常用いられる薬理学上許容される担体、 賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として製剤化することが できる。
[0084] 投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口 用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮 投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で 消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好まし!/、。
[0085] 経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、少なくと も一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロー ス、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビュルピロリドン、又はメタケイ酸ァ ノレミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不 活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しく は溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃 溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
[0086] 経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又は エリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製 水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添カロ 剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる
〇
[0087] 非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、 又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、 例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液 剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ ール、植物油(例えば、ォリーブ油)、アルコール類(例えば、エタノール)、又はポリソ
ルベート 80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安 定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物 は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によつ て無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水 又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
[0088] 投与量は、有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮し て、適宜決定することができる。
[0089] 例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人(体重 60kgとして)において 、 1曰につき約 0· ;!〜 lOOmg、好ましくは 0· ;!〜 50mgである。非経口投与の場合、 注射斉 IJの形で (ま、 1曰 ίこっき 0. 01~50mg,好ましく (ま 0. 01〜; !Omgである。
実施例
[0090] 以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
[0091] 実施例 1 :ヒト由来 TRPA1の単離及び発現ベクターの構築
ヒト脳 mRNA(Clontech社) lOngを DNァーゼ処理を行なった後、逆転写ーポリメ ラーゼ連鎖反応(RT— PCR)用キット(SUPERSCRIPT First - Strand Synthe sis System for RT— PCR; Invitrogen社)を用いて逆転写させ、第一鎖(first strand) cDNAを合成した。この第一鎖 cDNAを铸型とし、 Taq DNAポリメラーゼ( LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート(Hot Start)法に よる PCRを行なった。前記 PCRは、センスプライマーとして配列番号 7、アンチセンス プライマーとして配列番号 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて 実施し、最初に 98°C (1分間)で熱変性を行なった後、 98°C (15秒間) /56°C (30秒 間) /72°C (5分間)からなるサイクルを 35回繰り返した。その結果、約 3· 3kbpの D NA断片が増幅された。
この DNA断片を、クローニングキット(TOPO XL PCR Cloning Kit ; Invitro gen社)を用いて、 pCR—TOPOベクターにクローニングした。得られたプラスミド DN Aを制限酵素 Kpnl及び Hindlllで消化した後、プラスミド pcDNA3. 1 (+ ) (Invitro gen社)を用いてクローユングした。なお、前記プラスミド pcDNA3. 1 (+ )は、サイトメ
ガロウィルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞にタンパク質を発現さ せるために使用することができる。
得られたクローンの塩基配列を、ジデォキシターミネータ一法により、 DNAシーク ェンサ一(ABI3700 DNA Sequencer; Applied Biosystems社)を用いて解析 したところ、配列番号 1で表される塩基配列が得られた。またこれらの配列をアミノ酸 配列に翻訳すると配列番号 2で表されるアミノ酸配列が得られた。
[0092] 実施例 2:タンパク晳の動物細胞での発現
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの TRPA1チャネル活性を 検出するために、前記実施例 1で得られた発現ベクターを、動物細胞にトランスフエク シヨンすることにより、前記タンパク質を発現させた。実施例 1で得られた発現ベクター と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE又は LIPOFECTAMINE2000 ; Invitr ogen社)を用いて、ヒト胎児腎臓由来の HEK293細胞および CHO— K1細胞の形 質転換を行ない、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を 誘導した。
前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(黒木 登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養 細胞実験法」、 1995年、羊土社)に従って、実施した。
[0093] 列 3 : FLIPRによろ細朐内カルシウム濃度の油 I定
上記実施例 2のトランスフエクシヨン操作にて一過性に TRPA1を発現した CHO— K1細胞に各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動を FL IPR (Molecular Device)を用レ、て測定した。
FLIPRにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施し た。まず、細胞に蛍光色素 Fluo3— AM (DOJIN)を添加するため、あるいは FLIPR アツセィを行う直前に細胞を洗浄するためのアツセィバッファーを作成した。 HBSS (I nvitrogen) 1000mlに 1M HEPES (pH7. 4) (Invitrogen) 20mlを加えた溶液( 以下、 HBSS/HEPES溶液)に、プロべネシド(Sigma) 710mgを IN NaOH 5 mlに溶解後さらに HBSS/HEPES溶液 5mlを加え混合した溶液 10mlを添加した 溶液をアツセィバッファ一とした。次に Fluo3— AM 50 i g¾22 iu l DMSO (DOJI
N)に溶解し、さらに等量の 20%プルロン酸(Molecular Probes)を加え混合後、 1 05 1の牛胎児血清を添加した 10. 6mlのアツセィバッファーに加え、蛍光色素溶液 を調製した。トランスフエクシヨン処理を施した CHO— K1細胞の培地を除き、直ちに 蛍光色素溶液を 1穴あたり 100 ずつ分注後、 CO培養器にて 1時間培養し、細胞
2
に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアツセィバッファーを用いて洗 浄した後、 FLIPRにセットした。また、 TRPA1を発現する CHO— K1細胞に添加す る試験サンプルはアツセィバッファーを用いて調製し、同時に FLIPRにセットした。以 上の前処置を施した後、 FLIPRにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム 濃度の変動を測定した。
その結果、ァリルイソチオシァネート(和光純薬)、シンナムアルデヒド(和光純薬)、 ァクロレイン(Sigma)等を加えたときに、ヒト TRPA1を発現する CHO— K1細胞が特 異的に応答(細胞内カルシウム濃度の上昇)することが分力、つた。一方、これらの化 合物は、配列番号 2で示されるポリペプチドを発現していない CHO— K1細胞(ネガ ティブ ·コントロール細胞)を用いた検討では、いずれも蛍光強度の上昇は検出され なかった。すなわち、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインが、 ヒト TRPA1活性化剤であることが確認できた(図 1)。
実施例 4 :TRPA1活件化剤のスクリーニング
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物(活性 化剤)のスクリーニングを行なった。活性化の指標として、カルシウム感受性蛍光試薬 を用いた細胞内へのカルシウム流入の検出を行ない、具体的には実施例 3に記載の 方法を用いた。スクリーニングの基準として、 EC 力 OO ^ mol/L以下のものをヒッ
50
卜とした。
さまざまな化合物を検討した結果、蛍光強度の上昇が検出されるものとして、ァリル イソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインが見出された。各化合物の配 列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する活性化は、それぞれ E C 力 7. 1 a mol/L, 22. 5 mol/L、及び 7. 0 mol/Lであった。
50
これらの結果から、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化し、細胞内へカルシ
ゥムを流入させる作用を持つことがわかった。
[0095] 実施例 5 :TRPA1阻害剤のスクリーニング
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを阻害する化合物(阻害剤 )のスクリーニングを行なった。阻害活性の測定には、カルシウム感受性蛍光試薬を 用いた細胞内へのカルシウム流入の検出を行ない、具体的には実施例 3に記載の 方法を改変して用いた。スクリーニングの基準として、 IC 力 OO ^ mol/L以下のも
50
のをヒットとした。阻害剤測定用に 30 Mのさまざまな化合物(反応時の終濃度で 10 M)をプレートに分注し、同時に FLIPRにセットした。以上の前処置を施した後、 F LIPRにてシンナムアルデヒド添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定し阻害 作用の検討を行った。蛍光強度の上昇を阻害する化合物として、ルテニウムレッドが 見出された。ルテニウムレッドの配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプ チドに対する阻害活性は、 IC が 2· 2 mol/Lであった。
50
[0096] m:ヒト組 での ^拝 ¾ネ斤
ヒト組織における TRPA1遺伝子の発現を、シークェンスディテクター(PRISM790 0 ; Applied Biosystems社)を用いたリアルタイム PCRで解析した。リアルタイム PC Rを行うことで、 mRNA中に含まれる目的遺伝子を定量化して測定することができる ヒト各種組織由来の polyA+RNA (クロンテック社) 1 μ gからランダムプライマーを用 いて逆転写反応した。逆転写酵素 SuperScriptII (GIBCO BRL社)を使用し、添 付のプロトコールにしたがって反応させ得られた cDNAを実験に用いた。この第一鎖 cDNAを铸型として、蛍光試薬(SYBR Green PCR Core Reagents Kit ;Ap plied Biosystems社)を用いて、 PCRを行なった。前記 PCRは、センスプライマー として配列番号 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセ ンスプライマーとして配列番号 10で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用 いて実施し、最初に 95°C (10分間)で熱変性を行なった後、 95°C (15秒間) /59°C (1分間)からなるサイクルを 45回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号 1 で表される塩基配列からなる遺伝子に特異的な配列である。
ヒトの各種組織での mRNAの発現分布を図 2に示す。胃、小腸、大腸、膀胱などに
て高い発現が検出された。このことから、配列番号 1で表される塩基配列からなる mR NAは、胃、小腸、大腸などの消化器組織で発現していることが明らかになり、胃、小 腸、大腸などの消化器組織で配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチ ドが機能していることが明らかになった。
[0097] 実施例 7:マウス組織での発現解析
マウス組織からの RNAの調製は以下のようにして行った。 C57BL6マウス(雄性、 8 週齢)を断頭、脱血した後、ハサミで切除し、脳、胃、小腸、大腸を摘出した。これらの 組織を氷冷した生理食塩水にて洗浄したのち、 Isogen (二ツボンジーン社)を加えて ホモジナイズし、マニュアルにしたがって totalRNAを調製した。抽出した RNA 1 μ gは Superscript II (Invitrogen社)のマニュアルに従ってランダムプライマーを用 いて first strand cDNAを合成後、 TE 200 1に溶解した。
[0098] 実施例 8:マウス組織での発現解析(リアルタイム PCR)
マウス組織における TRPA1遺伝子の発現を、シークェンスディテクター(PRISM7 900 ; Applied Biosystems社)を用いたリアルタイム PCRで解析した。前記実施例 7より得られたマウス組織の first strand cDNAを铸型として、蛍光試薬(SYBR Green PCR Core Reagents Kit ; Applied Biosystems社)を用レヽ飞、 PCR を行なった。前記 PCRは、センスプライマーとして配列番号 11で表される塩基配列 力もなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号 12で表 される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に 95°C (10分間)で 熱変性を行なった後、 95°C (15秒間) /59°C (1分間)からなるサイクルを 45回繰り 返した。それぞれのプライマーは、配列番号 3で表される塩基配列からなる遺伝子に 特異的な配列である。またこれらの塩基配列を翻訳すると配列番号 4で表されるアミ ノ酸配列となる。
その結果、標準のマウス /3ァクチン遺伝子の発現量を 100%として、マウスの胃、 空月昜、大月昜 ίこおレヽて (ま、それぞれ、 0. 037%, 0. 084%, 0. 094%OTRPA1 m RNAの発現が見られ、一方、全脳における発現量は、 0. 014%であった。このこと から、配列番号 3で表される塩基配列からなる TRPA1 mRNAは、消化器組織で発 現していることが明らかになり、また配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリぺ
プチドが機能していることが明らかになった。
実施例 9:ラット組織での発現解析
(1)ラット組織
ラット組織からの RNAの調製は以下のようにして行った。ウィスターラット(雄性、 8 週齢)を断頭、脱血した後、ハサミで切除し、脳、小腸、大腸を摘出した。これらの組 織を氷冷した生理食塩水にて洗浄し、小腸と大腸はスライドガラスを用いて粘膜層と 平滑筋層に分離した。これらの組織サンプルに Isogen (二ツボンジーン社)を加えて ホモジナイズし、マニュアルにしたがって totalRNAを調製した。抽出した RNA 1 μ gは Superscript II (Invitrogen社)のマニュアルに従ってランダムプライマーを用 いて first strand cDNAを合成後、 TE 200 1に溶解した。
(2)培養細胞および培地
RIN14B細胞(ラット勝臓由来内分泌細胞株)は ATCCから購入した。 RIN14B細 胞は、特に記載が無い限り 10% 牛胎児血清(Invitrogen)を含む RPMI1640培 地(Invitrogen)を用レ、て培養した。 RIN 14B細胞は 10 % FC Sを含む RPMI 1640 培地(Invitrogen社)でプレコンフルェントになるまで培養し、遺伝子発現解析など 実験に使用した。
(3)ラット小腸 EC細胞の単離
ウィスターラット(雄性、 8週齢)を断頭、脱血した後、ハサミで切除し開腹させ、小腸 を摘出した。摘出した小腸の管腔内を生理食塩水にて洗浄し、約 20mLの Buffer A (70mM NaCl、 5mM KC1、 20mM NaHCO、 0· 5mM NaH2P〇4、 50m
3
M HEPES (pH7. 2)、 l lmM グルコース、 3mM
EDTA、 0. 5% BSA、 0. 05mM ジチオスレイト一ノレ、 lmg/mL N- acetyl — L— cysteine)を注入したのち、両端をとじて、 37°Cで保温した HBSS内にて 10 分間静置した。その後、小腸管腔内の Buffer Aを捨て、再び約 20mLの Buffer Aを注入し、 37°Cで保温した HBSS内にて 10分間静置した。再び小腸管腔内の Bu ffer Aを捨て、新しい Buffer Aを注入し、 37°Cで保温した HBSS内にて 20分間 静置した後、管腔内容物を回収した。この操作を合計 3回繰り返し、すべての管腔内 容物をひとつにまとめ、小腸粘膜上皮細胞サンプルとした。
次にカウンターフロー遠心エルトリエーシヨン法(CCE)を用いて、 EC細胞画分の 調製を行った。 CCEの装置(BECKMAN、JE— 5· 0)はローター速度を 2000rpm に固定し、 CCE用のバッファーには 1 %胎仔牛血清、 1 %グルコース、 ImMジチォ スレイトール、 ImM EDTAをふくむ PBSを用いた。小腸粘膜上皮細胞サンプルを CCE装置に注入し、 21mL/minで流出してくる細胞を回収したのち、 Percoll液(d = 1. 132g/mL、 Pharmacia)を用いた密度勾配遠心法にてさらに精製した。なお 、 10倍濃度の HBSSに対して、 9倍量の Percoll液を加えそれを 100%Percoll液と した。 100%Percollを 1倍濃度 HBSSで希釈して、 60%Percoll液、 30%Percoll 液、 20%Percoll液をそれぞれ調製し、遠心管に重層した。さらにその上に CCE精 製したサンプルを重層し、 l lOOrpmで 10分間遠心した。 60%Percoll液と 30%Per coll液の界面に集まった細胞を回収し、 PBSで洗浄したものを EC細胞画分とした。 この EC細胞画分はマーカー遺伝子である TPH1、クロモグラニン A、シナプトフイジ ン、 VMAT1の遺伝子発現量をリアルタイム PCR法にて測定し、小腸粘膜上皮細胞 サンプルに対し、マーカー遺伝子の発現が 20倍以上高いことが確認できたサンプル をその後の実験に使用した(表 1)。
前記操作は、エルトリエーターシステム添付のプロトコール、及び公知の方法(右田 俊介編、「免疫実験操作法 2」、 1995年、南江堂)に従って、実施した。
(4) RNAの抽出および cDNA合成
RIN14B細胞および、ラットの EC細胞画分は、細胞を単離し細胞数を測定した後 , RNeasy mini KIT (QIAGEN社)のマニュアルに従って total RNAを抽出精 製した。抽出した RNA 1 gは Superscript II (Invitrogen社)のマニュアルに 従ってランダムを用いて first strand cDNAを合成後、 TE 200〃 1に溶解した。 実施例 10:ラット組織での発現解析(リアルタイム PCR)
ラット組織とラット EC細胞画分および RIN14B細胞における TRPA1遺伝子の発現 を、シークェンスディテクター(PRISM7900 ; Applied Biosystems社)を用いたリ アルタイム PCRで解析した。前記実施例より得られたラット組織とラット EC細胞およ び RIN14B細胞由来の first strand cDNAを铸型として、蛍光試薬(SYBR Gre en PCR Core Reagents Kit ; Applied Biosvstems社)を用いて、 PCRを行
なった。前記 PCRは、センスプライマーとして配列番号 13で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号 14で表される 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に 95°C (10分間)で熱変 性を行なった後、 95°C (15秒間) /59°C (1分間)からなるサイクルを 45回繰り返した 。それぞれのプライマーは、配列番号 5で表される塩基配列からなる遺伝子に特異的 な配列である。またこれらの配列をアミノ酸配列に翻訳すると配列番号 6で表されるァ ミノ酸配列となる。
その結果、標準のラット G3PDH遺伝子の発現量を 100%として、ラットの大腸粘膜 、小腸粘膜においては、それぞれ、 0. 79%、 0. 85%の TRPA1 mRNAの発現が 見られ、一方、脳における発現量は、 0· 11 %であった。このことから、 TRPA1は、ラ ットの腸管において高発現し、機能していることが明らかになった。また、小腸 EC細 胞では他の EC細胞のマーカー遺伝子と同様に、 TRPAlmRNAの高い発現量が 検出され、 TRPA1が EC細胞に発現していることが明らかとなった(表 1)。さらに RIN 14B細胞は EC細胞のマーカー遺伝子、および TRPA1遺伝子の発現が EC細胞と 同等カ^れ以上であり、 RIN14B細胞が EC細胞と非常に良く似た性質を持つことが 明らかになった (表 2)。
[表 1] ラット小腸 E C細胞画分の T R P A l m R N Aおよび E C細胞のマーカー遺伝子 の発現量 ^ratio (% of小腸粘膜組織)
小腸粘膜組織 EC細胞画分
TPH1 100 7310. 5
クロモグラニン A 100 7837. 2
VMAT 1 100 3777. 6
Synaptophysin 100 2288. 4
TRPA1 100 1626. 7 値はラット小腸粘膜組織での各遺伝子の発現量を 1 0 0 %としたときの相対値 を示す。 [表 2]
消化器内分泌細胞由来 R I N I 4 B細胞株の T R P A l m R NAおよび E C細胞 のマーカー遺伝子の発現量
(ratio) TPH1 chromograninA VMAT1 svnaptophysin i RPAI 小據 EG铀胞画分 ϊοαδ ϊΌο.ο ― 100.0 ιοο.ο ιοο.ο
RIN14B 917.4 72646.8 3442.6 98.8 159.7 値はラット Ε C細胞画分での各遺伝子の発現量を 1 0 0 %としたときの相対値 を示す。 実¾例 11 :ヒト組織での発現解析 (in situ ノ、イブリダィゼーシヨン 免疮組織化学 染色)
ヒト EC細胞における TRPA1の発現を確認するために、ヒト十二指腸を用いて in si tuハイブリダィゼーシヨン染色を行なった。
パラフィン包埋を行ったヒト十二指腸組織(CYTOMYX社)を 6 H mの厚さで薄切 し、 in situハイブリダィゼーシヨン染色用のサンプルとした。
実施例 1で得られたプラスミド pcDNA— humanTRPAlを鎊型として、イン 'ビトロ( in vitro)転写法によるジゴキシゲニン標識 RNAアンチセンスプローブを作成した。 なお、ジゴキシゲニン標識には巿販試薬(DIG RNA Labeling Mix ;ロシュ社)を 用いて、添付のプロトコールに従って実施した。また、ネガティブコントロールとして、 同様の方法を用いて、ジゴキシゲニン標識 RNAセンスプローブも作成した。プロ一 ブの配列は配列番号 1で表されるヒト TRPA1遺伝子配列の第 2870番目〜第 3360 番目の塩基配列と同じ領域のものを用いた。
上記で得られたサンプル及びプローブを用いて、 in situハイブリダィゼーシヨン染 色を実施した。抗体には、アルカリフォスファターゼ標識した抗ジコキシゲニン抗体( ロシュ社)、発色基質には NBTZBCI (5—ブロモ— 4—クロロー 3—インドィルリン酸 とニトロブルーテトラゾリゥム塩との混合液)を使用し、発色後、ケノレネヒトロートにより 核染色を行なった。
その結果、アンチセンスプローブを用いた検討では、ヒト十二指腸の上皮にある一 部の細胞に特異的に強い発色が見出された。なお、センスプローブを用いた検討で は、染色は見られなかった。これらの結果から、配列番号 1で表される塩基配列から なるヒト TRPA1遺伝子は、ヒトにおいても腸管腺窩にある細胞において発現している ことが明らかになった(図 3)。
[0104] 実施例 12:ヒト組織での発現解析(in situノヽイブリダィゼーシヨン Z免疫組織化学 i
実施例 11で見られた TRPA1の発現部位が EC細胞かどうか確認するために、ヒト 十二指腸を用いて in situハイブリダィゼーシヨン染色を行なったのち、セロトニンに 対する抗体で免疫染色を行った。
実施例 11と同様の方法でヒト十二指腸の in situハイブリダィゼーシヨンを行って T RPA1の染色を行ったのち、一次抗体として、抗セロトニン抗体(Sigma)を用いて反 応を行った。さらに二次抗体としてビォチン化した抗ゥサギ IgG抗体を用いて反応さ せたのち、発色基質に DABを用いて発色反応を行った。その結果、 TRPA1の発現 がみられたヒト十二指腸の上皮細胞はセロトニン抗体による発色も見出された。これら の結果から、配列番号 1で表される塩基配列からなる TRPA1遺伝子は、ヒト十二指 腸のセロトニンを発現する上皮細胞、すなわち EC細胞で発現していることが明らか になった(図 4)。
[0105] 実施例 13 :カルシウム感 件泶光試薬を用いた RIN14B細朐におけるチャネル活 个牛の
実施例 10で TRPA1の発現を確認した RIN14B細胞(5 X 104細胞)をカルシウム 感受性蛍光試薬(Fluo3— AM; DOJINDO社)存在下、 37°Cで 1時間インキュベー トすることにより、カルシウム感受性蛍光試薬を細胞内に取り込ませた後、生理食塩 水で洗浄して、細胞に取り込まれな力、つたカルシウム感受性蛍光試薬を取り除いた。 得られた細胞に、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを添加 した生理食塩水を加え、経時的に細胞が発する蛍光を測定した。上記の測定は、自 動蛍光検出装置(FLIPR ; Molecular Device社)を用いた。ァリルイソチオシァネ ート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを添加しない生理食塩水を用いて、同様の操 作を実施した。またルテニウムレッドを同時に添加しカルシウムの細胞内への流入が 阻害されるかどうか測定した。
その結果、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを添加した R IN14B細胞では、添加直後から蛍光強度の上昇が検出された。一方、ァリルイソチ オシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを添加しない生理食塩水を用いた検
討では、いずれも蛍光は検出されなかった。これは、ァリルイソチオシァネート、シン ナムアルデヒド、ァクロレインにより、 TRPA1が活性化し、細胞内へカルシウムを流入 させたことを示している。さらに、 RIN14B細胞に様々な濃度のァリルイソチオシァネ ート、シンナムアルデヒド、ァクロレインを添加したときの細胞内 Ca2+濃度の変化を調 ベたところ、これらは、濃度依存的に細胞内へカルシウムを流入させることが明らかに なった。
またルテニウムレッドを添加することで、ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒ ド、ァクロレインにより蛍光強度の上昇が阻害された(30 ,1 Mのルテニウムレッドは、 ァリルイソチオシァネートによる活性化を 90. 9%阻害)。
実施例 14 :RIN14Bからのセロトニン分泌の測定
TRPA1がセロトニン放出に関与しているかどうか調べるため、 TRPA1活性化剤に よる RIN14Bからのセロトニン分泌促進の測定を行った。
シャーレ内で培養した RIN14B細胞を、 ImMの EDTAを含む PBSを用いてはが した後、 96ゥエルプレートに撒いて 2日間培養した。培地は RPMI1640 (インビトロゲ ン社)に 10%ゥシ胎児血清(ICN社)、 100U/mlペニシリン、 100 g/mlストレプ トマイシンを添加したものを用いた。細胞を 0. 1 %83八と10〃^1フルォキセチン(丁 OCRIS社)を添加した Hanks ' Balanced Salt Solutions (HBSS、 Invitrogen) で 1回洗浄した後、上記の HBSSで希釈 '調製した TRPA1活性化剤を、 RIN14B細 胞に添加し、 37°C5%CO条件下で 20分間培養した。培養後、細胞の上清を回収
2
し、凍結保存した。上清中のセロトニン含量の測定は市販のセロトニンィムノアッセィ キット(ベックマン社)で測定した。
その結果、図 5に示す通り、 RIN14B細胞を用いた細胞内カルシウムイオン流入ァ ッセィにおいて顕著な活性を示したァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァ クロレインによりセロトニン分泌の促進が認められた。一方、ァクロレイン(30〃 M)と 同時にルテニウムレッドで処理した場合には、ルテニウムレッドは、ァクロレイン誘導 性のセロトニン分泌を濃度依存的に抑制し(30 M ルテニウムレッドで、 73. 0%阻 害)、また、シンナムアルデヒド(30 M)と同時にルテニウムレッド(30 M)で処理 した場合には、ルテニウムレッドは、シンナムアルデヒド誘導性のセロトニン分泌を完
全に抑制した。以上の結果から、 TRPA1が RIN14B細胞からのセロトニン分泌促進 作用に関与してレ、ることが明らかになつた。
[0107] 実施例 15 :ラット TRPA1の配列に特異的な siRNA導入によるラット TRPA1遺伝子 の発現抑制
RIN14B細胞を 60mmシャーレに 6xl05個まいて 1日培養した。 siRNA設計シス テム siDirect (RNAi社)によりデザインしたラット TRPAlに対する種々の配列の siR NA(lOnM)を开$質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロゲン社)を 用いて RIN14B細胞に導入後さらに 2日培養し、ラット TRPA1遺伝子の発現量を測 定した。ラット TRPA1遺伝子の発現量の検出は実施例 10の方法にて行った。その 結果、 RIN14B細胞に対し、ラット TRPA1特異的な siRNAである # 971 (センス鎖 は配列番号: 15、アンチセンス鎖は配列番号: 16)を添加することによりラット TRPA 1発現量の低下が認められた。このことから # 971がラット TRPA1の遺伝子発現を特 異的に抑制させることが分かった。
[0108] 実施例 16: siRNA導入 RIN14Bにおける、ァリルイソチオシァネートによる細朐内力 ルシ ム ^ 牛の 力
実施例 15において TRPA1特異的 siRNAである # 971がラット TRPA1の発現を 顕著に抑制させることを確認済である。実施例 15の方法に基づき # 971を導入させ た RIN14B細胞における細胞内カルシウム流入活性について検討した。実施例 13 の方法に従いァリルイソチオシァネートの細胞内カルシウム流入活性について調べ た結果、 # 971導入 RIN14Bではァリルイソチオシァネート(300 M)による細胞内 カルシウム流入活性が 67. 3%抑制された。一方、ランダム配列 siRNAであるネガテ イブコントロール siRNAを導入した RIN14Bでは上記活性化剤による細胞内カル シゥム流入活性が保持されていることが示された。この結果からも、 TRPA1力 ァリ ルイソチオシァネートによる細胞内カルシウム流入活性に関与していることが確認さ れ 。
[0109] 実施例 17: siRNA導入 RIN14Bにおける、シンナムアルデヒドによるセロトニン分泌
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実施例 16にお!/、て TRPA1特異的 siRNAである # 971がラット TRPA1の発現を
顕著に抑制させ、細胞内カルシウム流入も抑制することを確認済である。そこで実施 例 15の方法に基づき # 971を導入させた RIN14B細胞におけるセロトニン分泌上昇 活性について検討した。実施例 14の方法によりシンナムアルデヒドによるセロトニン 分泌上昇活性について調べた結果、図 6に示す通り、 # 971導入 RIN14Bではシン ナムアルデヒドによるセロトニン分泌上昇活性が抑制された。一方、ランダム配列 siR NAであるネガティブコントロール siRNAを導入した RIN14Bでは上記活性化剤に よるセロトニン分泌促進活性が保持されていることが示された。この結果から、 TRPA 1力 S、セロトニン分泌促進に関与していることが証明された。
[0110] 実施例 18 :ラット EC細胞からのセロトニン分泌の測定
実施例 9 (3)で示した方法で調製した EC細胞を上記の実施例 14を改変した方 法にて、セロトニンの分泌活性を測定した。調製したラット EC細胞画分を 0. 1 %BSA を添加した Hanks ' Balanced Salt Solutions (HBSS、 Invitrogen)で 1回洗浄 した後、上記の HBSSで希釈.調製した TRPA1活性化剤を添加し、 37°C5%CO
2 条件下で 45分間培養した。培養後、細胞の上清を回収し、凍結保存した。
上清中のセロトニン含量は市販のセロトニンィムノアッセィキット(ベックマン社)で測 定した。その結果、図 7に示す通り、ラット EC細胞においても RIN14Bと同様に、ァリ ノレイソチオシァネート、シンナムアルデヒドにより有意なセロトニン分泌促進活性が認 められた。以上の結果から、 TRPA1が RIN14B細胞だけでなぐ EC細胞からのセロ トニン分泌促進作用を担っていることが証明された。
[0111] 実施例 19 :モルモット摘出腸管の収縮活性の測定
モルモット(Hartley系、雄、体重 300— 400g)をエーテル麻酔下にて、頸動脈切 断により放血致死させた。回腸を摘出し、末端の約 15cmを除いた残りの部分より、 長さ 1. 5cmに切断した腸管の長軸方向に平行に切り込みを入れ、平面状の標本を 作製した。この標本の両端をセルフインで挟み、 95% O - 5% CO混合ガスを通
2 2
気した 37°Cのクレフ、、ス ί夜(118mM NaCl、 4. 7mM KC1、 2. 5mM CaCl、 1. 2
2 mM MgSO、 1. 2mM KH P〇、 l lmM D— glucose、 20mM NaHCO ) 1
4 2 4 3
Omlを含むマグヌス槽に糸を介して懸垂した。標本に lgの負荷をかけ、 15分間隔で ノ ッファーを交換し、約 60分間放置して張力を安定させた。ァゴニスト刺激に対する
張力の変化を等尺的に測定して、レコーダー上に記録した。アセチルコリンの 10_5 Mを投与して回腸標本の収縮を惹起させ収縮が最高に達した後、バスを 3回洗浄す ることによってアセチルコリンを洗い流した。この操作を 10分間隔で繰り返し、惹起さ れる収縮が 2回連続して一定になって力 試験物質を投与した。アセチルコリンと試 験物質による収縮力を比較することによって試験物質の効果を評価した。一標本に ぉレ、て、試験物質一濃度のみの検討を行った。
(1)ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒド、ァクロレインにおいて、それぞれ 1 0〃 M、 30 ^ M、 100 ^ M、 300 μ Μの 4濃度を単回投与にて検討した。その結果、 ァリルイソチオシァネート、シンナムアルデヒドについては 100 ^ Μ以上において、ま たァクロレインについては 10〃 Μ以上において、収縮作用が確認された(表 3)。以 上の結果から、 TRPA1活性化剤によって、腸収収収管の収縮が惹起されることが示された 縮縮縮 [表 3] ァリルイソチオシァネート、 シンナムアルデヒ ド、 ァクロレインによる用 的収縮作用 マグヌス (モルモット回腸)
― 作用 EC5Q ( /i M)†
ァリルイソチオシナネ—ト 129. 0
シンナムアルデヒ ド 88. 3
ァクロレイン 70. 3
(卞 3 0 0 μ Μにおける収縮反応を 1 0 0 %として算出。 )
(2)TRPA1阻害剤(ルテニウムレッド)による拮抗実験
ァリルイソチオシァネート(300 ,1 M)刺激収縮に対する TRPA1受容体阻害剤ルテ ニゥムレッド(30 M)の阻害作用を検討した。同一個体から得た異なる 2本の標本 においてそれぞれ、 vehicleまたはルテニウムレッド(30 M)を 15分間適用し、その 後ァリルイソチオシァネート(300 M)刺激による収縮を測定した。その結果、ルテ ニゥムレッド適用標本においては vehicle適用標本と比較してァリルイソチオシァネ ート刺激収縮が約 84%抑制された。以上の結果から、ァリルイソチオシァネートは T
RPA1受容体を介して腸管収縮を惹起する可能性が示唆された。
[0114] (3)セロトニン受容体拮抗薬による阻害実験
ァリルイソチオシァネート(300 M)刺激収縮に対する各種セロトニン受容体拮抗 薬の阻害作用を検討した。セロトニン受容体拮抗薬には、 5— HT1、 2受容体拮抗薬 としてマレイン酸ピゾチフェン(10 H M)、 5— HT2受容体拮抗薬として酒石酸ケタン セリン(0. Ι , Μ) , 5— ΗΤ3受容体拮抗薬として塩酸ラモセトロン(0· 3 ^ Μ)、 5— ΗΤ4受容体拮抗薬として GR113808 (0. 3 M)をそれぞれ使用した。同一個体か ら得た異なる標本において、 vehicleまたは各種セロトニン拮抗薬を 15分間適用し、 その後ァリルイソチオシァネート(300 M)刺激による収縮を測定した。その結果、 マレイン酸ピゾチフェンおよび塩酸ラモセトロン適用標本においては vehicle適用標 本と比較してァリルイソチオシァネート刺激収縮がそれぞれ約 44%および約 74%抑 制された。以上の結果から、ァリルイソチオシァネート刺激によってセロトニンが遊離 され、 5— HT1受容体や 5— HT3受容体のようなセロトニン受容体を介した収縮を惹 起することが示された。
また、ァクロレイン(300 M)刺激収縮に対する各種セロトニン受容体拮抗薬の阻 害作用についても同様に検討した。その結果、マレイン酸ピゾチフェンおよび塩酸ラ モセトロン適用標本においては vehicle適用標本と比較してァリルイソチオシァネート 刺激収縮がそれぞれ約 74%および約 84%抑制された。以上の結果から、ァクロレイ ン刺激によってセロトニンが遊離され、 5— HT1受容体や 5— HT3受容体のようなセ ロトニン受容体を介した収縮を惹起することが示された。
以上の実施例から得られた結果から、 TRPA1は消化管で高い発現を示し、中でも 特に腸管の EC細胞において高い発現をしていることが明らかになった。さらに化合 物スクリーニングの実施より得られた TRPA1活性化剤と阻害剤を用いて鋭意研究を 行った結果、 TRPA1の活性化が腸管の EC細胞からのセロトニン遊離を引き起こし ていること、そして遊離したセロトニンを介して腸管の収縮を引き起こしていることが明 らかになつた。次に、以下の実施例では、 in vivoでも TRPA1活性化剤が消化管運 動の亢進作用を有するかを検証した。
[0115] 実施例 20:ィヌ消化管運動亢進作用の測定
消化管運動の測定はストレインゲージフォーストランスデューサ一法により行った。
24時間絶食したィヌ(ビーグル犬、雄、 11— 13kg)にペントバルビタールナトリウム 麻酔下で,ストレインゲージフォーストランスデューサー(F—12IS ,スターメディカル 社,東京)を幽門から口側へ 5cmの部位(胃前提部)と Treiz靭帯から肛門側へ 20c mの部分(空腸),回盲口より肛門側へ 10cmの部位(近位結腸)と肛門から口側へ 1 0cmの部位 (遠位結腸)の計 4箇所に輪状筋方向の収縮が観察できるように縫着した 。術後 1週間以上回復させた後,実験を行った。消化管運動の測定はテレメータシス テム(DAT— 80RA,スターメディカル社)を用いて行った。ァリルイソチオシァネート は、 17時間以上絶食した動物の消化管運動を測定し規則的な IMC (Inter digesti ve migrating motor complex)の発現を確認した後, 胃で phase— III様の消化管 運動が測定された約 20分後に経口投与した。その結果、図 8—1に示されるように、 ァリルイソチオシァネート(1 , 1 Omg/kg)は投与後 10分以内に結腸の GMC (Giant migrating contraction)を誘発したことから、 TRPA1活性化剤であるァリルイソチ オシァネートは消化管運動を亢進し、排便を誘発することが示唆された。一方で、図 8 - 2に示されるように、 vehicle群では GMCの誘発は観察されなかった。
[0116] 5— HTは消化管からの水分分泌を亢進することが知られているので、 TRPA1の 活性化剤が腸管の EC細胞を介して 5— HTを分泌するのであれば消化管の水分分 泌を亢進することが推測される。そこで TRPA1活性化剤が消化管の水分分泌亢進 作用をもっかどうか実際に検証した。
[0117] 実 列 21 :マウス腸管水分分泌 i隹作用の測定
ー晚絶食したマウス(ddy、雄、 35— 42g、 SLC社)をペントバルビタール (50 mg /kg i. p. )で麻酔後,開腹し,盲腸近部の回腸組織約 2cmの両端を糸で縛り、回 腸ループを作成した。 salineあるいは TRPA1活性化剤であるァリルイソチオシァネ ート(10, 100, 1 , 000 g)をそのノレープ内に 100 し投与した。投与後,腸管を元 の位置に戻し、腹筋および皮膚を縫合した。処置 6時間後,頸椎脱臼によりマウスを 屠殺後、回腸ループを摘出し、内容物重量を測定した。その結果、ァリルイソチオシ ァネートは用量依存的に腸管からの水分分泌を亢進し, 1 , 000 ^ g投与群では有意 な水分分泌亢進作用が認められた(図 9)。
[0118] 実施例 22;マウス便秘モデルによるァリルイソチオシァネートの評価
11 ォピオイド受容体ァゴニストである口ペラミドは腸管にお!/、て痙攣性の収縮を惹 起し腸管輸送能の遅延を引き起こすことから、この実験系は便秘型過敏性腸症候群 の実験モデルと考えられている。そこで TRPA1の活性化剤であるァリルイソチソシァ ネートがこの便秘モデルにおいて有効かどうか検討を行った。
マウス(ddY、雄、 5週齢、 SLC社)を実験前日夕方より絶食し、実験当日、測定用 ケージに 1時間以上馴化させたのち、口ペラミド 0. 3mg/kgを皮下投与した。その 30 分後に TRPA1ァゴニストであるァリルイソチオシァネート 0· 0;!〜 lmg/kgを経口投 与し、その直後マウスにエーテル麻酔をかけ、直径 3mmのガラスビーズを肛門から 2 cmまで挿入した。マウスを測定用ケージに戻し、覚醒からガラスビーズが排出される までの時間を測定した。その結果、図 10に示すように、口ペラミド投与群 (Vehicle群 )では、口ペラミド非投与群(コントロール群)と比較してビーズ排出時間の遅延がみと められた。そして、 TRPA1ァゴニストであるァリルイソチオシァネートは用量依存的に 口ペラミドによるビーズ排出時間の遅延を改善した。以上の結果より、 TRPA1活性化 剤は便秘型過敏性腸症候群に対して有効性を示すことが示唆された。
[0119] 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。
本出願は、 日本で出願された特願 2006-275837 (出願日:平成 18年 10月 6日) を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである 。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載さ れた内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明 細書に組み込まれるものである。