WO2008038726A1

WO2008038726A1 - Procédé de détermination de procyanidine oligomérique (opc)

Info

Publication number: WO2008038726A1
Application number: PCT/JP2007/068842
Authority: WO
Inventors: Takashi Tanaka
Original assignee: Arysta Lifescience Corporation; Nagasaki University
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2008-04-03
Also published as: JP5097996B2; JPWO2008038726A1

Description

明細書

オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の測定方法

技術分野

[0001] 本発明は、天然物、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、及びその他の分析試料中に含まれるオリゴメリックプロシア二ジン（フラバンー3 オールの n + 2重合体の混合物 (nは整数) )の含有量及び重合度を定量的かつ簡便に測定する方法に関する

〇

背景技術

[0002] オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)は、ブドウ（赤ワイン）、ピーナッツ皮、松樹皮等に含まれて!/、る事が知られて!/、る天然植物由来の化学成分である。その有用性は様々な文献中で示唆されており、例えば抗酸化作用、末梢循環改善作用、コラーゲンの再生と合成の促進（非特許文献 1)などの作用が知られている。

[0003] オリゴメリックプロシア二ジン (OPC)は、重合体であり、様々な重合度が混在する混合物として植物体内に存在する。その生物活性を測定又は定義するためには、混合物としての総重量と重合度を定量的に測定することが不可欠である。

従来知られているオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の定量的測定法は、質量分析検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（LC MS)による方法が一般的であつた (特許文献 1並びに非特許文献 2乃至 5)。

但しこの方法は質量スペクトル検出器を使用し、異性体を含む重合度の異なるオリゴマーを標準物質として使用することなどから、簡易さ'迅速さに欠け、かつそれが主に適用される食品、化粧品、医薬部外品などが比較的安価な製品用途であることを考えると経済性にも欠けるものであった。また、質量分析では、分子量の大きなものほど検出感度が低いため定量性にも問題がある。

[0004] 一方、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の総重量を対象試料の加水分解によつて算出する方法が提案されている（特許文献 2)。また、この特許文献では、重合度については高速液体クロマトグラフィーによるピーク面積比で算出する方法が採られている。しかし、黒大豆皮エキス等、分析の対象となる試料は、通常、オリゴメリックプロシア二ジン (OPC)以外の成分を含む。また、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)自体も重合度の異なる成分の混合物であるばかりか、多数の構造異性体が存在する。このため、この特許文献に記載の方法では、他の成分に由来するピークとの重なりが問題と成り得る。また、オリゴメリックプロシアュジン (OPC)の炭素—炭素結合の回転異性体等によるピークのブロード化が起こる。この結果この分析方法では、正確な定量が困難である。

加えて、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)は、重合度により体内への吸収や組織への親和性が異なり、その生体作用を特徴付けるためには、重合度の分布が重要な情報と成り得るものの、従来の分析方法には、簡易に重合度の分布を測定できるものが存在しなかった。

特許文献 1 :特表 2003— 527418

特許文献 2：特許公開 2006— 38763

特許文献 3：特許公開 2002— 128689

非特許文献 l :「OPC IN PRACTICEJ , Bert Schwitters, 1997,フレグランスジャーナル社

非特許文献 2 : 1995、 Clin. Chim. Acta. 235, 207— 219

非特許文献 3 : 2004，ジャパンフードサイエンス， 403、 1月号、 40— 45

非特許文献 4 : 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem. , 67, (5) , 1140 - 1142 非特許文献 5 : 2003, J. Agric. Food Chem. , 51 , 7513— 7521

非特許文献 6 : Tanaka, T. ； Takahashi, R. ； Kouno, I. ； Nonaka, G. Chemica

1 Evidence for the De― astringency (Insolubilization of Tannins) of P ersimmon Fruit. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1994, 3013— 3022. 非特許文献 7 : Zhang, Y. —J. ； Nagao, T. ； Tanaka, T, ； Yang, C. — R. ; Oka be, H. ； Kouno, I. Antiproliferative Activity of the Main Constituent s from Phyllanthus emblica. Biol. Pharm. Bull. 2004, 27, 251— 255. 発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0005] 本発明は、黒大豆種皮等に由来する試料中のオリゴメリックプロシア二ジン (OPC) の総含有量、平均重合度又は重合度の分布を、簡便かつ経済的に、しかも比較的高い正確性をもって定量的に分析可能な方法を提供することを目的とする。

本発明の方法は、単離されたオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)又は OPCを含んだ黒大豆種皮エキスを用いて製造加工された食品、化粧品、又は医薬部外品中の

OPCを定量的に分析可能である。さらに、その他の植物に由来する OPCも同様の方法で分析が可能である。

[0006] なお、最近の研究により、安価で栽培が容易な黒大豆皮に高い含有量でオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)が存在することが確認され、現時点で抽出法を含めてもつとも経済性が高い OPCを得ることができると考えられる。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者等は、上記の課題を解決するために種々研究の結果、

(a)様々なポリフエノールを含む黒大豆皮エキス等の試料から、カラムクロマトグラフィーを用い移動層である溶媒を適切に切換えることにより、配糖体であるアントシァニンの分画に続いて、それぞれ、モノマー（ェピカテキン）、ダイマー、トリマー、テトラー (およびそれ以上の重合体を含む）を主に含む各分画を、簡易な一連の操作で得られることを明らかにした。

(b)次に、アントシァニンの分画を排除し、他の各分画をチオール分解に供することで、各分画で n+ 2重合体（nは 0、 1、 2、 3、 4、 5等の整数であり、通常 10以下である ) 1個から n+ 1個のチォエーテルと 1個のェピカテキンとが生じ、このチォエーテルとェピカテキンとのモル比が、各分画に存在する重合体の平均重合度に対応することを見出した。この分解物のモル比に基づく平均重合度は、異性体の存在による誤差を完全に回避できるものである。そして、最終的には、得られた各分画の OPCの平均重合度と含有量から試料 (例えば、黒大豆皮エキス）中のオリゴメリックプロシア二ジン (OPC)の含有量、平均重合度、及びおおよその重合度分布を求めることができるものである。

発明の効果

[0008] 本発明の方法は、単離されたオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)、または OPCを含有する黒大豆種皮抽出物を用いて製造加工された食品、化粧品、又は医薬部外品中における OPCの総含有量及び平均重合度等を定量的に分析可能とする。さらに、その他の植物に由来する OPCも同様に分析可能である。すなわち、食品等におけるオリゴメリックプロシア二ジン (OPC)の含有量及び平均重合度等を、質量スぺクトル検出器を用いずに簡易かつ経済的な方法で定量可能とする。

[0009] 本発明の方法によれば、天然の植物由来による抽出物及びその加工品から、混在する他の様々なポリフエノール化合物やモノマーの影響を避け、また、異性体の存在による誤差を回避しながら、オリゴメリックプロシア二ジン (OPC)を定量ができる。また、本発明によれば、オリゴメリックプロシア二ジン (OPC)の重合度プロファイルを分析可能であり、由来する天然植物についてオリゴメリックプロシア二ジン (OPC)の重合度分布による特徴付けが可能となる。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]本発明のカラムクロマトグラフィーを用いる工程の一例を示す模式図である。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 1.分析試料

本発明の方法が対象とする主な試料は、天然の黒大豆種皮及びその粗抽出物、並びにそれらを加工若しくは利用して製造される食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品である。

また、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)を含有する事が既知または予想される天然の植物及びその粗抽出物、並びにそれらを加工若しくは利用して製造される食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品を試料とすることもできる。

本特許請求が対象とするオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)は、一般的には次の構造式で示される化合物である。

[化 1] oligomeric procyanidin (OPC)

後で示されるように、テトラマーより重合度が高い OPCは、黒大豆皮エキス等の試料においては相対的に含有量が少ない。また、このような高重合度の OPCは、生体への吸収及び活性も低いと見られる。このため、後述するラムクロマトグラフィーによる分画工程においては、テトラマーより重合度が高い OPCを個別に扱わず、同一の分画として抽出することも実用上好ましい。もちろん、必要に応じてテトラマーより重合度が高!/ヽ OPCを個別に分画してもよ!/ヽ。

また分析試料中に混在し得るカテキン ·プロシア二ジン類の異性体としては、主として次の化合物が挙げられる。

[化 2]

分析試料に多く含まれる、カテキン'プロシア二ジン類似外のフラボノイド類は配糖体であるアントシァニンであり、その大部分は以下に示すシァニジン 3—グノレコシドと見られる（特許文献 3)。

[化 3]

[0014] 2.オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)を含むポリフエノールのカラムクロマトグラフィ一によろ分 ¾

本発明の方法では、まずカラムクロマトグラフィーにより様々なポリフエノールを含む黒大豆皮エキス等の分析試料を分画する。

より具体的には、移動層である溶媒を目的とする溶出物に応じて選択し切換えることにより、配糖体であるアントシァニンに続いて、モノマー（ェピカテキン）、ダイマー、トリマー、テトラマー（およびそれ以上の重合体を含む）を主に含有する分画を得る。

[0015] 例えば、図 1に示すように、分析対象試料を、適切に選択したカラムに付し、まずトリフルォロ酢酸 (TFA) O. 5%を加えて酸性化した 100%エタノールを用いてアントシァニン分画を溶離し、次に、順に 100%エタノール、 90%エタノール、 80%エタノールを用いて、それぞれモノマー（ェピカテキン）、ダイマー、トリマーを主に含有する分画を溶離し、最後に 50%アセトンを用いてテトラマー（およびそれ以上の重合体を含む）を主に含有する分画を溶離する。

このような分配平衡を利用して選択的な吸収'脱着により目的物質の分離を行うためには、デキストラン系またはシリカゲル系カラムを利用することが好ましい。中でも上記の溶離溶媒の選択に対して順相系となる、化学的処理で架橋度を上げ強度を高めたデキストランで構成されるカラムが好ましぐ特に SephadexLH— 20カラムが好ましい。

[0016] TF Aを含む溶媒は最初の分画のみに（カラム容量の 1/2を）用いる事により、プロシァニジンの分解を抑える事ができる。逆に TFAを使用しないと、以後の分画の採取時にアントシァニンが少しずつ溶出されてしまう。

上記各分画を抽出する溶媒については、分子量と構造を考慮して種々検討したところ、 100%エタノーノレ、 90%エタノール、 80%エタノール、及び 50%アセトン力最も効率的に目的とする物質を各分画で溶離できることを見出したものである。

[0017] 3.オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)を含む分画のチオール分解

本発明の方法では、次に、前述した工程により得られた分画をチオール分解反応に供し、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)に由来するェピカテキンとェピカテキンチォエーテルを生じさせる。

すなわち、オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の化学的特徴の 1つは、カテキン分子が炭素炭素結合してオリゴマーを形成していることである力、結合様式の異なる様々な異性体が存在し、またユニット間結合の回転障害により単一成分でもピークの複雑化が起こり、すべての OPCを高速液体クロマトグラフィーで標準品と比較定量するのは困難である。

[0018] そこで本発明では、 2 スルファニルエタノールを用いたチオール分解（非特許文献 6乃び 7)を応用して、下記反応式に示すようにして、オリゴメリックプロシア二ジン（ OPC)を構成するカテキンの n + 2重合体の混合物（nは、 0、 1、 2、 3、 4等の整数）から、 1つの力テキン単量体と n+ 1個のカテキンーチォエーテルを得ている。

[化 4]

[0019] チオール分解反応の条件は、種々の条件を採用し得、ここでは、本発明の好ましい実施の形態における反応条件の一例を以下に示す。

すなわち、試料を 10mg/mLになるように 60%EtOHに溶解し、その 200 μ Lを 8 00 Lの ME試薬（2— mercaptoethanol 2. 5mL, ethanol 27. 5mL. H O 1

2

6ml、濃塩酸を 25倍に希釈した HC1 4mL : total 50mL)と混合して、 60— 70°C で 4時間加熱し、反応液をろ過する。

[0020] また、チオール分解前後の力テキン単量体およびカテキンーチォエーテルの含有量も、種々の方法及び条件で測定でき、例えば、必要に応じて各分画を濃縮した後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)でェピカテキン（モノマー）及びェピカテキンメチルエーテルの標品を用いて容易に定量することができる。

[0021] 各分画のェピカテキン（モノマー）及びェピカテキンメチルエーテルの含有量を分析するための高速液体クロマトグラフィーの条件も種々の条件を選択することができる力好適な具体例としては、カラム： Cosmosil 5C ARII (4 X 250mm)、検出

18

器: JASCO photodiode array detector MD— 910、溶出液： 50mMリン酸緩衝液に溶解した 4〜30%ァセトニトリル溶液（39分間）、次に 50mMリン酸緩衝液に溶解した 75%ァセトニトリル溶液（15分間）、速度： 0. 8mL/分、温度： 35°C、の条件を挙げること力 Sでさる。

[0022] なお、後述する表 1に示す通り、アントシァニン分画（1)およびモノマー分画（2)には通常 OPCは含まれない。また、ダイマー分画（3)に含まれるェピカテキン (モノマ一）は通常極めて少なぐトリマー分画（4)以降の分画にはェピカテキン (モノマー）は含まれない。

従って、本発明においては、通常、ダイマー分画（3)、トリマー分画 (4)、及びテトラマー以上の分画（5) (テトラマー以上を個別の分画として分取した場合はその分画）につ!/、て、チオール分解後に生じるェピカテキン（モノマー）及びェピカテキンメチルエーテルの含有量を測定すればよい。また、ダイマー分画（3)にチオール分解前に存在するェピカテキン (モノマー）を考慮する必要がある場合には、同様の HPLCによる方法や吸光度法で、チオール分解前のダイマー分画（3)等の分画につ!/、てェピカテキン (モノマー）を測定し、その分を差し引けばよ!/、。 [0023] 4.オリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の含有量及び平均集合度の算出

本発明の方法においては、次に、得られた各分画のェピカテキンとェピカテキンチォエーテルの含有量から、試料中の OPCの総重量及び/又は平均重合度を算出する。

ここで、上記チオール分解工程の前後において各分画に含まれるポリフエノール成分を以下に示す。

[表 1] 表 1 黒大豆皮エキスのアントシァニン、カ于キン一プロシア二ジン分画

* Cy- 3-G :シァニジン 3—グノレコシド（アントシァニン）

* EC :分解により生じたェピカテキン (モノマー）

* 元々存在していたェピカテキン（モノマー）

* PCB2 :プロシア二ジン B2 (ダイマー）

* PCC1 :プロシア二ジン C1 (トリマー）

* EC— ME :ェピカテキンメチルエーテル

[0024] 前記反応式から明らかなように、チオール分解により生じた各分画中のカテキン単量体及びカテキンーチォエーテルの総重量 (メチルエーテル分を除く）は、そのまま、各分画中に存在していたオリゴメリックプロシア二ジン（OPC)の総重量に対応するまた、上記表 1より明らかなように、アントシァニン分画（1)およびモノマー分画（2) には通常 OPCは含まれず、ダイマー分画（3)、トリマー分画 (4)、及びテトラマー以上の分画（5)に総ての OPCが含まれる。

従って、チオール分解後のダイマー分画（3)以降の分画におけるェピカテキン (モノマー）及びェピカテキンメチルエーテルの含有量の合計（メチルエーテル分を除く）は、チオール分解前にそれぞれの分画に存在していたオリゴメリックプロシア二ジン（ OPC)の総重量に対応し、それらの総和は、元の試料中に存在していたオリゴメリツクプロシア二ジン（OPC)の総重量に対応する。

[0025] そこで、本発明においては、下記式（1)及び（2)に従って、試料中に n + 2重合体の混合物（nは 0、 1、 2、 3、 4、 5等の整数）として存在する OPCの含有量 (g)を算出する。

<式（1) >

各分画中の OPCの含有量 (g) = X+ (Y X 290. 27/366. 39) · · · (1)

[式中、 Xは各分画中のェピカテキン (分子量： 290. 27)の含有量 (g)を表し、 Yは各分画中のェピカテキンチォエーテル（分子量： 366. 39)の含有量 (g)を表す] <式（2) >

試料中の OPCの含有量 (g) =式（1)の各分画（アントシァニン分画及びモノマー分画を除く）中の OPC含有量の総和 (g). . (2)

[0026] なお、チオール分解前にダイマー分画（3)等に含まれるェピカテキン (モノマー）を考慮する場合には、前記のような高速液体クロマトグラフィーや吸光度法でチオール分解前に分画に含まれるェピカテキン (モノマー）の含有量 (mol)を測定しておき、チオール分解後の含有量 (mol)から差し引けばよ!/、。

[0027] 本発明の方法においては、さらに、チオール分解により生じた各分画中のカテキン単量体（ェピカテキン）とカテキンーチォエーテルのモル数から試料中の OPCの平均重合度を算出することができる。

[0028] すなわち、前記反応式及び表 1から明らかなように、チオール分解により生じた各分画中の力テキン単量体（ェピカテキン）とカテキンーチォエーテノレとのモノレ比は、各分画中に存在していた OPCの平均重合度に対応する。より具体的には、理論上、チオール分解によりダイマー 1モルからェピカテキン（モノマー）とェピカテキンメチルェ一テルとが 1モルずつ生じ、トリマー 1モルからェピカテキン（モノマー） 1モルとェピカテキンメチルエーテル 2モルが生じ、テトラマー 1モルからェピカテキン（モノマー） 1モルとェピカテキンメチルエーテル 3モルが生じる。

[0029] 従って、下記式 (4)に従ってチオール分解により生じた各分画中のェピカテキン (必要に応じてチオール分解後に各分画中に存在するェピカテキンの含有量からチォール分解前に存在するェピカテキンの含有量を引く）とェピカテキンチォエーテルとのモル比から、各分画中に存在していた OPCの平均重合度を算出することができる

〇

<式（4) >

各分画（アントシァニン分画及びモノマー分画を除く）の OPCの平均重合度 ={各分画中のェピカテキンチォエーテルの含有量 (g)/366. 39}/{各分画中のェピカテキンの含有量 (g)/290. 27) }+ 1 · · · (4)

[0030] また、上記式 (4)で算出した各分画中に存在していた OPCの平均重合度の平均は

、元の試料中に n+ 2重合体の混合物（nは 0、 1、 2、 3、 4、 5等の整数）として存在する OPCの平均重合度を意味する。

[0031] 従って、下記式（3)により、元の試料中に存在する OPCの平均重合度を算出すること力 Sでさる。

<式（3) >

試料中の OPCの平均重合度 ={各分画（アントシァニン分画及びモノマー分画を除く )中のェピカテキンチォエーテルの含有量の総和 (g)/366. 39}/{各分画（アントシァニン分画及びモノマー分画を除く）中のェピカテキンの含有量の総和 (g)/290. 2 7) }+ 1 · · · (3)

[0032] 本発明においては、前記式（2)から求められる各分画中の OPCの含有量 (g)と、前記下記式 (4)に従って算出される各分画中の OPCの平均重合度から、前記試料のオリゴメリックプロシア二ジンの重合度分布を求めることができ、対象試料にっレ、てォリゴメリックプロシア二ジン (OPC)の重合度分布による特徴付けを可能とする。

Claims

請求の範囲 [1] 試料中に含まれる、オリゴメリックプロシア二ジン（以下 OPCという）の総含有量および/又は平均重合度を定量する方法であって、固定相として順相デキストラン系カラムを用い、流動相として酸性化エタノール、濃度勾配を付けたエタノール及びアセトンを用いるカラムクロマトグラフィーに、該試料を供して、各流動相による溶離液を採取し、次レ、で得られた各分画をチオール分解に供した後、生じたェピカテキン及びェピカテキンチォエーテルの各分画における含有量を測定し、得られた各分画のェピカテキンとェピカテキンチォエーテルの含有量から、下記式

(1)乃至（3)に従って、該試料中の OPCの総重量及び/又は平均重合度を算出する、方法。

<式 1〉

各分画中の OPCの含有量 (g) = X+ (Y X 290. 27/366. 39) · · · (1)

[式中、 Xは各分画中のェピカテキン (分子量： 290. 27)の含有量 (g)を表し、 Yは各分画中のェピカテキンチォエーテル（分子量： 366. 39)の含有量 (g)を表す] <式 2〉

<式 3〉

[2] 前記式（2)から求められる各分画中の OPCの含有量 (g)と、下記式 (4)に従って算出される各分画中の OPCの平均重合度から、前記試料のオリゴメリックプロシアニジンの重合度分布を求める、請求項 1に記載の方法。

<式 4〉

[3] 前記固定相として、 Sephadex LH— 20を用いる、請求項 1又は 2に記載の方法。

[4] 前記流動相として、それぞれ 0. 5%トリフルォロ酢酸で酸性化した 100%エタノール、 100%エタノール、 90%エタノール、 80%エタノール及び 50%アセトンを用いる

、請求項 1から 3の何れか 1項に記載の方法。

[5] 前記チオール分解を、各分画を 60%エタノールに溶解し、 ME試薬と混合して 60

70°Cで 4時間加熱して行う、請求項 1から 4の何れか 1項に記載の方法。

[6] 前記試料が、ブドウ、ピーナッツ皮、松樹皮及び黒大豆種皮を含む天然物、或いはオリゴメリックプロシア二ジン (OPC)を含有する、飲食物、医薬品又は化粧品である、請求項 1から 5の何れか 1項に記載の方法。