WO2008029668A1

WO2008029668A1 - Procédé de détermination d'activité inhibitrice sur la méthylation d'adn

Info

Publication number: WO2008029668A1
Application number: PCT/JP2007/066624
Authority: WO
Inventors: Yoshifumi Yamada; Kazuhito Gohda
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2007-08-28
Publication date: 2008-03-13
Also published as: JP2009278867A

Description

明細書

DN Aメチル化阻害作用の判定方法

技術分野

[0001] 本発明は、 DNA (デォキシリボ核酸）のメチル化を検出する方法に係り、より詳細には、種々の生体関連物質及びその他の物質が DNAのメチル化を阻害する作用（D NAメチル化阻害作用）を有するか否か判定する方法に係る。

背景技術

[0002] DNAの塩基配列により決定される遺伝子の発現の制御機構をクロマチンの動的変動から解明しょうとする研究分野（ェピジエネテイクス）に於いて、 DNAのメチル化の有無が遺伝子発現のスィッチの一つになっているであろう、ということが明らかになつてきた。現在までの研究によれば、（哺乳類の） DNAのプロモーター領域の塩基配歹 IJに於いて、シトシン（C)ーグァニン（G)の配列のうちの Cがメチル化されると、クロマチンが凝縮し、これにより、その近傍の遺伝子の発現スィッチがオフ（発現が停止される）となり、逆に、メチル化された DNAが脱メチル化されると、遺伝子の発現スイツチがオンとなり、遺伝子の発現が開始されるという機構が考えられている。かかる DN Aのメチル化による遺伝子発現の制御機構は、例えば、 pi 6などのがん抑制遺伝子に於いても観察されており、 pi 6の例では、 pi 6遺伝子の上流の配列が正常細胞では非メチル化されているので、 pi 6遺伝子が発現され、細胞のがん化が抑制される力がん細胞では、 pl6遺伝子の上流の配列がメチル化され、 pl6遺伝子の発現のスィッチがオフになっていることが報告されている。そこで、がん治療などの医療分野では、細胞のがん化に係る遺伝子の DNAのメチル化又は脱メチル化を人為的に操作又は制御することによってがんを予防又は治療する新薬の開発が試みられている。例えば、メチル化された pl6などのがん抑制遺伝子を脱メチル化することによって正常に発現させ、これにより、細胞を正常な状態へ戻すがん治療薬などが期待されている。

[0003] 上記の如き遺伝子発現機構や DNAのメチル化に関する研究に於いて、 DNAのメチル化の検出は、一般的には、 DNAの PCRによる増幅、 DNAの適当な化学処理、電気泳動法などを用いて行われている。例えば、特許文献 1は、 DNAを亜硫酸水素ナトリウムで化学処理してメチル化されていないシトシンをゥラシルに変換した後、その DNAを、シトシンを含む領域を認識する制限酵素で処理し、しかる後、電気泳動により、 DNAの長さで分離するという方法を開示している。この場合、メチル化されたシトシンは、亜硫酸水素ナトリウム処理でゥラシルに変換されないので、メチル化されたシトシンを含む DNAは、制限酵素により切断され、長さが短くなり、電気泳動法により、検出されることになる。また、特許文献 2では、亜硫酸水素ナトリウム処理されメチル化されてレ、な!/、シトシンがゥラシルに置換された DNAに、シトシンを含む領域を認識するプライマーを添加して PCRを行うことにより、メチル化されたシトシンを含む DNAのみを増幅して、 DNAのメチル化を検出するという方法が開示されている。特許文献 1 :特表 2006— 500901公報

特許文献 2：特表 2005— 508885公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 上記の DNAのメチル化の制御による新薬の開発の過程や DNAのメチル化が係る遺伝子発現機構の探求の過程に於いては、 DNAのメチル化を阻害する作用を有する物質 (DNAメチル化阻害剤）が用いられることがある。新薬の開発に於いては、 D NAメチル化阻害剤そのもの力正常な細胞に於いて発現されるべき遺伝子の塩基のメチル化を阻止する薬剤の主成分として利用され得る。また、遺伝子発現機構に於ける DNAメチル化の役割を探求する場合には、 DNAメチル化阻害剤は、実験に於いて DNAのメチル化を人為的に操作するための試薬として用いることができる。従って、新規な DNAメチル化阻害剤がより多く見出されれば、それだけ、新薬の開発や遺伝子発現機構の解明の可能性が大きくなることが期待される。

[0005] 新規な DNAメチル化阻害剤を見出すためには、或る物質が DNAメチル化阻害作用を有しているか否かを判別し又は確認する必要がある。し力もながら、従来の技術に於いて、或る物質の DNAメチル化阻害作用の有無を比較的簡便に判定する方法、或いは、 DNAメチル化阻害剤のスクリーニングをするための方法は確立されていない。或る物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定は、その物質の存在下でメチル化酵素処理された DNA中に於いてメチル化された部位を検出することにより為される力上記に例示した従前の DNAのメチル化部位の検出方法は、そもそも、 D NAのメチル化のパターンの判別、即ち、 DNA中のどの塩基がメチル化されている力、を詳細に検出するための方法であり、処理過程に時間と労力を要するともに、多量の試料を要するので、或る物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定や種々の被検物質に於ける DNAメチル化阻害剤のスクリーニングの方法には適していない。従つて、もし比較的簡便に且迅速に、任意の物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定を行えることができるようになれば、新規な DNAメチル化阻害剤を見出すことが、従前に比してより容易になるであろう。また、力、かる新規な方法に於いては、多量の試料を要しな!/、ことが好まし!/、。

[0006] 力、くして、本発明の一つの目的は、多量の試料を要せず、比較的簡便に且迅速に、任意の物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定する方法を提供することであ

[0007] また、本発明のもう一つの目的は、 DNAメチル化阻害作用の有無の判定する方法に於いて有利に用いられる DNAのメチル化を検出する方法を提供することである。課題を解決するための手段

[0008] 本発明によれば、上記の課題を解決する新規な DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法が提供される。本発明の方法は、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DNAである試験 DNAと、 DNAのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、 DNAメチル化酵素とを混合する過程と、その後、試験 DNAに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれ力、を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験 DNAの蛍光強度を測定する過程と、測定された蛍光強度に基づいて試験 DNA力 Sメチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程とを含み、試験 DNAが切断されたか否かにより被検物質が D NAのメチル化を阻害する阻害物質であるか否力、を判定することを特徴する。なお、力、かる構成に於いて、一つの態様として、典型的には、メチル化感受性作用物質は、非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断するメチル化感受性作用物質であり、蛍光強度に基づいて試験 DNA力 Sメチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程に於!/、て、試験 DNAが切断されたと判定された場合に、被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であると判定するようになっていてよい。また、メチル化感受性作用物質は、後に例示される如き、公知のメチル化感受性制限酵素（非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断する制限酵素）であってよく、二種類以上のメチル化感受性作用物質又は制限酵素が同時に用いられてもよレ、。

上記の本発明の構成によれば、まず、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有する試験 DNAが予め準備される。本発明の場合、検査されるべき対象は、 DNAメチル化阻害作用を有して!/、る力、もしれな!/、被検物質であるから、使用される DNAは、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有していれば、任意のものでよいことは理解されるべきである。そして、力、かる試験 DNAと、被検物質と、 DNAメチル化酵素とを混合すると、もし被検物質が DNAメチル化阻害作用を有していなければ、 DNA メチル化酵素により試験 DNAのメチル化されることとなる力 S、被検物質が DNAメチル化阻害作用を有してレ、れば、メチル化部位がメチル化されて!/、な!/、状態（非メチル化状態）で保存されることとなる。従って、その後、試験 DNAに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させると、被検物質が DNAメチル化阻害物質であれば、試験 DNA力 Sメチル化部位を含む制限酵素認識部位で切断され、被検物質が DNAメチル化阻害物質でなければ、メチル化部位がメチル化されているので、試験 DNAが切断されないこととなる。（或いは、試験 DNAにメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させれば、被検物質が DNAメチル化阻害物質であるとき、試験 DNA力 Sメチル化部位を含む制限酵素認識部位で切断されず、被検物質が DNAメチル化阻害物質でないときには、メチル化部位がメチル化されているので、試験 DNAが切断される。）かくして、被検物質が DNA メチル化阻害物質であるか否かは、本発明に於いては、試験 DNAがメチル化感受性作用物質により切断されたか否力、を検出するだけで決定できることとなる。 [0010] メチル化感受性作用物質により試験 DNAが切断されたか否かは、本発明では、上記の構成から理解される如ぐ試験 DNAに蛍光標識を予め付加しておき、メチル化感受性作用物質による処理後に測定された試験 DNAの (蛍光標識の）蛍光強度に基づいて決定される。当業者にとって理解される如ぐ或るタンパク質や DNAなどの分子に蛍光標識を付加しておけば、その分子の構造、大きさ、運動の変化が蛍光標識の蛍光強度に基づいて検出できる。本発明の場合、メチル化感受性作用物質による処理により、試験 DNAが切断されると、即ち、試験 DNAの構造が変化すると、蛍光標識が付加された DNA分子の大きさが変化し、或いは、分子の運動状態が変化するので、かかる試験 DNAの構造の変化が DNAに付加された蛍光標識の蛍光強度の種々の挙動の変化に反映される。従って、メチル化感受性作用物質による処理後の試験 DNAの蛍光強度の測定から、試験 DNAが切断されたか否かが比較的容易に特定でき、これにより、被検物質が DNAメチル化阻害物質であつたか否かが判定でさることとなる。

[0011] より具体的には、上記の本発明のいくつかの態様に於いては、蛍光強度の測定に基づいて、メチル化感受性作用物質を作用させる過程の前後の蛍光標識が付加された部位を有する DNAの大きさの変化を検出することにより、メチル化感受性作用物質処理後の試験 DNAの切断の有無が判定されるようになっていてよい。また、試験 DNAは、メチル化部位と蛍光標識の付加された部位との距離がその試験 DNAの長さの半分以下となるよう調製され、メチル化感受性作用物質処理後に試験 DNAが切断された場合に、蛍光標識の付加された DNAの長さの変化又はそれによる DNA 分子のブラウン運動の変化が大きく捉えられるようになつていてもよい。更にまた、試験 DNAに二つ以上の蛍光標識を付加することにより、それら二つの蛍光強度の測定に基づいて、試験 DNAの切断に伴って試験 DNA上の蛍光標識が別々の DNA の断片に分かれることを検出するなどして、試験 DNAの切断の有無を捉えるようになつていてもよい。

[0012] メチル化感受性作用物質による蛍光標識された試験 DNAの切断の有無を検出する蛍光強度の測定方法は、具体的には、蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法など、蛍光標識された分子の大きさの変化に伴う分子運動の変化を検出できる任意の蛍光測定方法であってよい。また、試験 DNAに二種類以上の蛍光標識を付加させた場合には、後で詳細に説明される如ぐ蛍光相互相関分光法を用いて試験 DNAの切断の有無を測定するようになっていてもよい。なお、上記以外の試験 DNAの構造の変化又は大きさの変化を検出できる任意の蛍光測定分析技術が、本発明に於いて採用されてよいことは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属する

[0013] ところで、上記の本発明の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DNAである試験 DNAを用いて、一連の反応を施した後、メチル化感受性作用物質による試験 DNAの切断の有無を試験 DNAの蛍光測定に基づ!/、て決定すると!/、う特徴は、或る酵素が DNAメチル化活性を有しているか否かを検出することにも適用できる。従って、本発明の別の態様によれば、酵素の DNAメチル化活性を検出する方法であって、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加されたニ本鎖 DNAである試験 DNAと、 DNAメチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、その後、試験 DNAに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験 DNAの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づいて試験 DNAがメチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程とを含み、試験 DNAが切断されたか否かによって被検酵素力 ¾ΝΑをメチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、 DNAメチル化酵素を被検酵素に置き換え、 DNAメチル化阻害作用を有するか否かが判定される被検物質を混合しない点に於いて、前記の D NAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法と異なるだけであることは理解されるべきである。

[0014] また、上記の本発明の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける特徴は、或るタンパク質等の物質が DNAを脱メチル化する酵素活性を有してレ、るか否かを検出することにも適用できる。従って、本発明の別の態様によれば、酵素の脱 DNAメチル化活性を検出する方法であって、メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DNAである試験 DNA と、 DNA脱メチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、その後、試験 DNAに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれ力、を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験 DNAの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づ!/、て試験 D NA力 Sメチル化感受性作用物質により切断されたか否力、を判定する過程とを含み、試験 DNAが切断されたか否かによって被検酵素が DNAを脱メチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、試験 DN Aが予めメチル化され、 DNAメチル化酵素を被検酵素に置き換え、 DNAメチル化阻害作用を有するか否かが判定される被検物質を混合しない点に於いて、前記の D NAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法と異なるだけであることは理解されるべきである。

更に、上記の本発明の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける特徴は、 DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法にも適用できる。従って、本発明の更に別の態様によれば、 DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DNAである試験 DNAと、 DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、 DNA脱メチル化酵素とを混合する過程と、その後、試験 DNAに非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれ力、を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験 DNAの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づいて試験 DNAが前記メチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程とを含み、試験 DNAが切断されたか否かによって被検物質が DNA の脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否力、を判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、前記の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法とは、試験 DNAが予めメチル化され、 DNAメチル化酵素を DNA脱メチル化酵素に置き換えた点が異なる。

発明の効果

[0016] 本発明の方法は、上記の説明から理解されるように、従前の DNAのメチル化バターンを詳細に特定するため DNAのメチル化の検出方法とは異なり、被検物質に対する DNAメチル化阻害作用（又は、酵素の DNAメチル化活性、酵素の DNA脱メチル化活性若しくは DNA脱メチル化阻害作用）を有するか否かを判定することを目的とした方法なので、試験 DNAのメチル化の有無の検出に当たり、従前の DNAのメチル化検出方法で行われる如き、シトシンをゥラシルに置換する亜硫酸水素ナトリウム処理、 PCRによる DNAの増幅、 DNAをその長さによって分画する電気泳動法などを用いていない。従って、本発明の方法によれば、従前の DNAのメチル化検出方法に比して、高濃度若しくは多量の試料を必要とせず、簡便に且迅速に、 DNAのメチル化の有無の検出が行われる。また、特に、本発明の一連の過程に於いて、メチル化状態の DNAと非メチル化状態の DNAとの見分けるための測定が蛍光測定であるので、試料量を従前の方法に比して大幅に低減することができる点で非常に有利である。更に、蛍光測定の際、前記の如き蛍光相関分光分析等に用いられる共焦点光学顕微鏡の光学系を備えた装置を用いれば、試料量は、より一層低減することが可能となる。

[0017] 試料量を従前に比して低減できるということは、新薬の開発や遺伝子発現機構の研究の分野に於いて、非常に有利であることは理解されるべきである。新薬の開発や遺伝子発現機構の研究の現場に於いて使用される試薬又は物質は、しばしば、高価であったり、或いは稀少であるために、大量に入手することが困難である場合がある。また、或る被検物質が DNAメチル化阻害作用を有しているか否かを判定する前に、即ち、その物質が DNAメチル化阻害剤として利用可能であるか否かを決定する前に大量に入手又は調製することは、経済的でない。そのような少量しか手に入らない物質又は有用であるか不明な物質について、 DNAメチル化阻害作用の有無を判定しようとする場合に、本発明の方法は、少量の試料でも検査ができるので、極めて有効である (もし大量の試料が必要だとすれば、試料が足りないことで、検査自体が実施不可能となる場合もある。）。また、本発明は、試料が少量でよぐ試験 DNAを準備しておけば、その後の一連の過程が比較的迅速に且簡便であることから、多種の被検物質について、 DNAメチル化阻害作用のスクリーニングをする場合にも適用できる。

[0018] 更に、特記すべきことは、本発明の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法は、上記に述べた如ぐ若干の修正をするだけで、酵素の DNAメチル化活性を検出する方法、酵素の DNA脱メチル化活性を検出する方法及び DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に応用することができ、 DNAメチル化阻害剤の場合と同様、多種の被検物質について、 DNAメチル化活性の有無、 DNA脱メチル化活性の有無、 DNA脱メチル化阻害作用の有無のスクリーニングも簡便に且迅速に、又、多量の試料を要せずに、任意の酵素の DNAメチル化活性や物質の脱メチル化阻害作用を検出することができる点である。これらの活性や阻害作用を検出することも、上記の DNAのメチル化の制御による新薬の開発の過程や DNAのメチル化又は脱メチル化が係る遺伝子発現機構の探求の過程に於いて非常に有用である。この点に関し、現在のところ、実際の細胞内で、メチル化された DNAの脱メチル化をする DNA脱メチル化酵素が存在は確認されて!/、な!/、 (従って、脱メチル化阻害剤も確認されていない。）。本発明によれば、脱メチル化活性のスクリーニングは、簡便に且迅速に実施できるので、もし DNA脱メチル化酵素が存在するのであれば、本発明の方法により、容易に発見できるかもしれない。そして、もし DNA脱メチル化酵素が発見されれば、メチル化された DNAを脱メチル化する新規な薬剤として利用できる力、もしれない。

[0019] 本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]図 1は、本発明の方法の好ましい実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式にて示したものである。

[図 2]図 2は、図 1の実施形態の処理過程中に於ける DNA分子の構造の変化を模式的に表したものである。

[図 3]図 3は、実施例 1に於ける試料の蛍光相関分光法により得られた蛍光強度の自己相関関数値を表すグラフ図である。

[図 4]図 4は、実施例 2に於ける試料の蛍光相互相関分光法により得られた蛍光標識 alexa647と TAMRAの蛍光強度の相互相関関数値を表すグラフ図である。（A)は、被検試料についての結果であり、（B)は、対照試料についての結果である。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。

[0022] 図 1は、本発明の DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法の好ましい実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式で表したものであり、図 2は、図 1 の処理に於いて想定される分子の状態の変化を模式的に示したものである。これらの図を参照して、本発明の方法の実施を開始する当たり、予め、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有する二本鎖 DNAである試験 DNAが準備される。試験 DN Aの長さは、合成のコスト及び検出の容易さ力も 10〜； !OOmerが好ましぐ 20力も 40 merが更に好ましい。メチル化部位は、 5'—シトシン（C)—グァニン（G)—3'の塩基配列のうちの Cであり、図 2 (A)に例示されている如ぐ二本鎖 DNAに於いて、 Cは、 Gに結合しているので、 5' C G— 3'の塩基配列に対向する塩基配列は、 3'— G — C— 5 'である。メチル化酵素の存在下（阻害作用がなければ)では、双方の DNA 鎖の 5'—C— G— 3'の C塩基がメチル化されることが知られている。

[0023] また、試験 DNAには、少なくとも一つの蛍光標識として蛍光色素が付加されている。蛍光色素としては、この分野で通常使われる任意の蛍光色素、例えば、 TAMRA(c arboxymethylrhodamine)、 TMR tetramethylrhoaamine八 Alexa64 、 Rhodamine ree n、 Alexa488などであってよいが、これらに限定されない。なお、試験 DNAに一つの蛍光色素を付加する場合には、試験 DNAは、蛍光標識部位とメチル化部位との距離が DNA全長の半分よりも短くなるよう調製されて!/、ることが好ましレ、。後でより詳細に説明される如ぐ試験 DNAが被検物質 (メチル化阻害作用の有無が検査される物質）の存在下でメチル化酵素により処理され、更に、メチル化感受性作用物質により処理された後、試験 DNAがメチル化部位で切断されているか否かを判断する際、試験 DNAに一つの蛍光色素を付加する場合には、蛍光色素が付加して!/、る DNA分子の運動状態の変化が（蛍光測定に基づいて)観察される。試験 DNAが切断されると、一方の DNA断片にのみ蛍光色素が付加された状態となるところ、蛍光標識部位とメチル化部位との距離が DNA全長の半分よりも短ければ、試験 DNAが切断された場合とそうでな!/、場合との蛍光色素が付加して!/、る DNA分子の長さの差が大きくなり、従って、蛍光強度測定により検出される DNA分子の運動状態の変化が大きくなるので、 DNAの切断の有無がより感度良く検出可能となる。また、試験 DNAは、複数種類の蛍光色素により蛍光標識されていてもよい。メチル化切断部位を挟んで異なる種類の標識で DNA鎖を修飾すると、後述の如ぐ蛍光相互相関分光法での計測が可能となり、 1種類の蛍光標識の場合よりも、試験 DNAの切断の有無が感度良く検出することが出来る。

[0024] 試験 DNAは、上記条件を満たす生物由来の DNAでもよいが、人工的に合成した DNAは、生物由来のものより安定性が高ぐ安価で大量生産ができるので、継続的に、多種類の被検物質のスクリーニングに適している。試験 DNAは、本実施形態の方法を実施する度に調製するのではなぐ一度に量産した後、変性しない態様にて保存し、本実施形態の方法を実施する際に必要量ずつ使用するようにされてよい。

[0025] 力、くして、本実施形態の方法の初めの過程に於いて、試験 DNAと被検物質とがまず混合され (ステップ 1)、しかる後に DNAメチル化酵素（及び酵素反応のための基質）が添加される (ステップ 2)。 DNAメチル化酵素は、 CpGメチラーゼ、 Dnmtl, Dnm t3a， Dnmt3b, Damメチラーゼ、 Dcmメチラーゼなどが用いられてよい。なお、当業者にとつて理解される如ぐ以降の物質の混合操作は、特に断らない限り、水溶液中に物質を溶解した状態で行う。その後、 DNAのメチル化反応が進行するよう混合液は、例えば、 37°C、 1時間程度、インキュベーションされる。また、ステップ 2の DNAメチル化酵素の添加に先立って、 37°C、 30分程度、水溶液をインキュベーションして、溶液の温度を酵素反応をさせるべき温度に合わせておくことが好ましい。水溶液の組成、反応過程の温度、反応時間等の条件は、目的の酵素反応等が適当に進行するよう通常使用される条件が選択されてよい。

[0026] ステップ 3の反応過程に於いては、図 2 (B)に示されている如ぐ被検物質がメチル化阻害作用を有していなければ、塩基配列 C Gの C力 Sメチル化され（同図右）、被検物質がメチル化阻害作用を有していれば、塩基配列 C Gの Cがメチル化されな V、まま (非メチル化状態：同図左）となる。

[0027] メチル化酵素処理の後、次いで、水溶液にメチル化感受性作用物質が添加され（ステップ ₄)、試験 DNAのメチル化部位、塩基配列 C G、を含む制限酵素認識部位に於ける切断が進行するよう水溶液力例えば、 37°C、 1時間にてインキュベーションされる（ステップ 5)。ここで、メチル化感受性作用物質が、メチル化されていないメチル化部位を切断するものであれば、被検物質がメチル化阻害作用を有する場合、メチル化されていない試験 DNAを切断し、 DNAを断片化するが（図 2 (C)左）、被検物質がメチル化阻害作用を有していない場合、試験 DNAを切断しないので、従って、試験 DNAの長さは保存されることとなる。（同図右）。

[0028] そのようなメチル化感受性作用物質は、典型的には、メチル化感受性制限酵素であり、例としては、 Aat II、Acc I、Acc II、 Aci I、 Afa I、 Afl II、 Alu I、 Aorl3H I、 A or51H Apa I、 ApaL I、 Ava I、 Ava II、 Bal I、 BamH I、 Ban II、 Bbe I、 Ben I、 Bgl I、Bgl II、 Bin I、 BmeTl lO I、 BmgT120 I、 Bpul l02 I、 BspT104 I、 BspT107 I、Bspl286 I、Bspl407 I、 BssH II、 BspD I、 BstP I、 BstU I、 BstX I、 Bstl l07 I、 CfrlO I、 Cfrl3 I、 Cla I、 Cpo I、 Dra I、 Eae I、 Eag I、 Eaml l05 I、 Eco065 I、 EcoO109 I、 EcoR I、 EcoR V、 EcoT14 I、 EcoT22 I、 Eco52 I、 Eco81 I、 Fba I、 Fok I、 Fse I、 Hae II、 Hae III、 Hap II、 Hha I、 Hinc II、 Hind III、 Hinf I、 Hinl I 、 Hpa II、 HpyCH4 IV、 as I、 pn I、 Mbo I、 Mbo II、 Mil I、 Mlu I、 Msp I、 Mun I、 Mva I、 Nae I、 NegM IV、 Nco I、 Nde I、 Nhe I、 Not I、 Nru I、 Nsb I、 PmaC I、 PshA I、 PshB I、 Pspl406 I、 Pst I、 Pvu I、 Pvu II、 Sac I、 Sac II、 Sal I、 Sea I、 Sfi I、 Sma I、 Smi I、 SnaB I、 Spe I、 Sph I、 Sse8387 I、 Ssp I、 Stu I、 Taq I、 Tthl l l I、Van91 I, Vpa l lB I、 Xba I、 Xho I、 Xsp Iなどが挙げられる。また、メチル化感受性制限酵素としては、上記のうち、好ましくは、塩基配列 CCGG、 CCGC 、 GCGC、 ACGT、 CGGCCG、 GCCGGC、 GGCGCC、 CCCGGG、 CGCG、 AT CGTA、 TTCGAA、 GTCGAG又は CTCGAGを選択的に切断するメチル化感受性制限酵素が用いられ、更に好ましくは、 Hpall (C ' CGG) , Acil (C ' CGC) , HinPII ( G 'CGC)、 HpyCH4IV(A 'CGT)、 EagI (C 'GGCCG)、 NegMIV(G 'CCGGC)、 Kas I (G ' GCGCC)、 Smal (CCC ' GGG)、 BstUI (CG ' CG)、 BspDI (AT ' CGTA)、 BstB I (TT ' CGAA)、 Sail (G 'TCGAG)及び Xhol (C 'TCGAG)等のメチル化感受性制限酵素が用いられてよい。なお、括弧内のに」は、酵素の切断部位を示している。

[0029] なお、ステップ 4 5のメチル化感受性作用物質又は制限酵素による処理は、酵素反応ではなぐ化学的にメチル化された状態のメチル化部位を切断し、非メチル化状態のメチル化部位を切断しな!/、メチル化感受性作用物質によって行ってもよ!/、。この場合は、メチル化された試験 DNAは切断され、断片化されるが、メチル化されていない試験 DNAは切断されず、従って、試験 DNAの長さは保存されることとなる。（図 2 (C)の場合の逆）

[0030] 力べして、メチル化感受性作用物質又は制限酵素による処理が終了すると、次いで、水溶液の蛍光強度測定が行われる（ステップ 6)。蛍光強度測定としては、上記の説明から理解される如ぐ蛍光標識された試験 DNA又はその断片の分子の構造の変化又は運動状態の変化を検出できる任意の測定 ·分光分析方法が選択されてよい。

[0031] 試験 DNAに一つの蛍光標識が付加されている場合、試験 DNAが切断されると、蛍光標識の付加されて!/、る DNA分子の長さが短くなる。短くなつた蛍光標識の付加されている DNA分子は、短くなる前の DNA分子よりも早いブラウン運動をする。そこで、この場合には、蛍光標識の付加されている DNA分子のブラウン運動の速さの変化を検出することのできる蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法などを有利に用いること力 Sできる。

[0032] 蛍光相関分光法では、微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する分子の移動（並進ブラウン運動）の速さが観測される。分子の並進ブラウン運動の速さは、測定された蛍光強度の時間を変数とした自己相関関数の形状に反映される（以下の実施例に於ける測定結果を参照）。分子の並進ブラウン運動の速さの指標としては、測定開始時から自己相関関数の値が半分になるまでの時間の長さ（並進拡散時間）が用いられる。分子の移動は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、並進拡散時間が短くなる。本発明の場合、試験 DNAが切断されると、蛍光標識の付加されている DNA分子の長さが短くなり、従って、並進拡散時間が短くなるので、このこと力、ら、試験 DNAの切断の有無が判定される。なお、試験 DNAが切断されていない状態の並進拡散時間は、予め、 DNAが切断されていないことが分かっている対照試料、或いは、メチル化感受性作用物質を添加する前の試験 DNAにより測定されて!/、てよ!/ヽ

[0033] 蛍光偏光解消法では、この分野に於いて知られている如ぐ分子の回転ブラウン運動（自転）の速さが観測される。分子の回転ブラウン運動の速さは、測定された蛍光の縦偏光と横偏光の強度の割合又は偏光度に反映される。分子の回転は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、偏光度が小さくなる。本発明の場合、試験 DNA が切断されると、蛍光標識の付加されている DNA分子の長さが短くなり、従って、回転ブラウン運動が速くなり、偏光度が下がるので、このことから、試験 DNAの切断の有無が判定される。なお、試験 DNAが切断されていない状態の偏光度は、予め、 D NAが切断されていないことが分かっている対照試料、或いは、メチル化感受性作用物質を添加する前の試験 DNAにより測定されて!/、てよ!/、。

[0034] なお、既に述べた如ぐ試験 DNAは、好ましくは、蛍光標識部位とメチル化部位との距離が DNA全長の半分よりも短くなるよう構成されているので、試験 DNAが切断されて!/、る場合とそうでな!/、場合の蛍光標識された DNA分子の長さの差が大きくなつている。力、かる長さの差により、上記の蛍光強度測定に於いて、分子の運動状態の差が感度よく検出でさるようになることは理角早されるべさである。

[0035] 試験 DNAに二種類の蛍光標識がメチル化部位を挟んで付加されている場合、試験 DNAが切断されると、二つの蛍光標識の付加されて!/、る DNA分子が分離することとなる。従って、試験 DNAの切断の有無は、二つの蛍光標識の挙動が独立であるか相関があるかを検出することにより判定することができる。そこで、この場合には、蛍光相互相関分光法を有利に用いることができる。

[0036] 蛍光相互相関分光法では、この分野に於いて知られている如ぐ二つの発光波長の異なる蛍光標識が微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する際に、各々の標識の蛍光強度の変化から二つの蛍光標識の運動に相関があるか否力、を判定すること力 Sできる。もし蛍光標識が一つの担体（分子）に存在する場合には、二つの蛍光強度の変化が一体的に変化するが、蛍光標識が別々の担体に存在する場合には、二つの蛍光強度の変化は、独立に変化することとなる。蛍光標識が一つの担体に乗っているか否かは、二つの蛍光強度の相互相関関数から判定することができる。本発明の場合、試験 DNAが切断されれば、二つの標識は別々に運動することとなり、試験 DNAが切断されずに二つの標識が一体的に運動する場合に比して相互相関関数の値が顕著な低くなるので、力、かる相互相関関数の顕著な差により、試験 DN Aの切断の有無が判定される

[0037] 力、くして、上記の如き、蛍光測定に基づいて試験 DNAの切断の有無が判定されると、被検物質のメチル化阻害作用の有無が判定される（ステップ 7— 9)。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験 DN Aの切断が検出された場合、被検物質のメチル化阻害作用が有りと判定され、試験 DNAの切断が検出されない場合、被検物質のメチル化阻害作用が無しと判定される。また、メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験 DNAの切断が検出された場合、被検物質のメチル化阻害作用が無しと判定され、試験 DNAの切断が検出されない場合、被検物質のメチル化阻害作用が有りと判定される。

[0038] ところで、上記の実施形態の一連の過程は、或る酵素について、 DNAのメチル化活性があるか否かを判定するためにも用いることができる。その場合、ステップ 1のメチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験 DNAの混合は行われず、ステップ 2のメチル化酵素を添加する際、 DNAのメチル化活性があるか否かを判定されるべき被検酵素が添加される。一連の処理の後、試験 DNAの切断の有無が判定されると、 DNAのメチル化活性の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験 DNAの切断が検出された場合、被検酵素のメチル化活性が無しと判定され、試験 DNAの切断が検出されない場合、被検酵素のメチル化活性が有りと判定される（メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。 )

[0039] また、予めメチル化された試験 DNAを用いれば、上記の実施形態の一連の過程は、任意のタンパク質等の物質の脱メチル化酵素活性の検査にも用いることができる。その場合、まず、試験 DNAとしては、メチル化部位がメチル化されている DNAが使用される。そして、ステップ 1のメチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験 DNAの混合は行われず、ステップ 2のメチル化酵素を添加するのに代えて、 D NAの脱メチル化活性があるか否かを判定されるべき被検酵素が添加される。一連の処理の後、試験 DNAの切断の有無が判定されると、 DNAの脱メチル化活性の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験 DNAの切断が検出された場合、被検酵素の脱メチル化活性が有りと判定され、試験 DNAの切断が検出されない場合、被検酵素の脱メチル化活性が無しと判定される (メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。）。

[0040] 更に、上記の実施形態の図 1の一連の過程は、或る物質について、 DNAの脱メチル化酵素の脱メチル化作用を阻害する作用があるか否かを判定するためにも用いること力 Sできる。その場合、試験 DNAとしては、メチル化部位がメチル化されている DN Aが使用される。そして、脱メチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験 D NAの混合の後、ステップ 2に於いて、脱メチル化酵素が添加される。一連の処理の後、試験 DNAの切断の有無が判定されると、被検物質の脱メチル化阻害作用の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験 DNAの切断が検出された場合、被検物質の脱メチル化阻害作用が無しと判定され、試験 DNAの切断が検出されない場合、被検物質の脱メチル化阻害作用が有りと判定される（メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。）。

[0041] 上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するあのではな!/、ことは理角早されるべさである。

[0042] 実施例 1

1つの蛍光標識が付加された試験 DNAを用いた DNAメチル化阻害物晳のメチル化阳.害作用の判定

1つの蛍光標識が付加された試験 DNAを用いて、上記の処理過程に従って、被検物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定を行った。 [0043] 試験 DNAの調製ダミン）にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（レ、ずれもシグマジエノシスより入手）を会合させ二本鎖 DNAである試験 DNAを調製した。

オリゴヌクレオチド

5 ' GCCATGTACCCTCGACACAA3 '

蛍光標識オリゴヌクレオチド

5 ' (TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC3 '

なお、下線を付した CG力 Sメチル化部位である。

会合の手順は、以下の通りである。オリゴヌクレオチド、蛍光標識オリゴヌクレオチドをそれぞれ TEバッファ (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl)で希釈し 50 mMとした。次いで、オリゴヌクレオチド 10 1、蛍光標識オリゴヌクレオチド 10 1、 TEバッファ 80 1を混ぜ、 95°Cで 10分間反応させた後、ゆっくり冷却してオリゴヌクレオチドを会合させ二本鎖 DNAを生成した。この反応液にェキソヌクレアーゼ (タカラバイオより入手 )を添加して、 37°Cで反応させることにより未反応のオリゴヌクレオチドを分解した後、 MERmaid SPIN kit(QBioGene，USAより入手)で精製することにより試験 DNAの純度を高め、高感度の解析が出来るようにした。会合させた状態の試験 DNAの塩基配列は、以下の通りである。

(TAMRA) TTGTGTCGAGGGTACATGGC

AACACAGCTCCCATGTACCG

(下線部がメチル化部位）

[0044] 試験 DNAのメチル化（ステップ 1 3)

試験 DNAに、被検物質として（DNAメチル化阻害作用があることが知られている） 5-ァザデォキシシチジン（Sigma Aldrich)を混合した。また対照試料として、 DNAメチル化阻害作用のない Microcin SF608を試験 DNAに混合したものを調製した。手順は、以下の通りである。試験 DNAを反応バッファ（50mM NaCl,10mMTris-HCl,l OmM MgCl ,lmM dithiothreitol)に溶解し、 DNA濃度が 5nMとなるようにした。被検試料には、 5-ァザデォキシシを、対照試料には、 Microcin SF608を、それぞれ 1 μ Mとなるよう加えて、それぞれ 37°Cにて 30分、インキュベーションを行った。

[0045] しかる後に、これらの試料に DNAメチル化酵素である CpGメチラーゼ (New Englan d Biolabsより入手)を 20U加え、その基質となる S-アデノシルメチォニン（Sigma Aldr ichより入手）を濃度が 160 となるよう加えた。かかる試料は、次いで、 37°Cで 1時間インキュベーションを行い、酵素の DNAのメチル化反応を促進させた。

[0046] メチル化感¾性制限酵素による非メチル化部位の切断 (ステップ 4 5)

力、くして、 DNAメチル化酵素処理を施した被検試料と対照試料を、メチル化されて V、な!/、DNAを切断し、メチル化された DNAを切断しな!/、メチル化感受性制限酵素にて処理した。手順は、以下の通りである。被検試料と対照試料を、 ΙΟηΜとなるように、反応バッファ（50mM NaCl,10mM Tris- HCl，10mM MgCl ,lmM dithiothreito 1)に溶解し、これに、メチル化感受性制限酵素 Acd (タカラバイオ） 5Uを加え、 37°C にて 1時間、インキュベーションした。

[0047] 上記のメチル化感受性制限酵素処理により、被検試料 (メチル化阻害作用有り）に於いては、試験 DNAは、非メチル化状態にあると考えられるので、メチル化部位で切断されることとなる。

[0048] 带木目法によろ f 油 1 (ステップ 6)

メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料及びメチル化感受性制限酵素処理していない被検試料について、共焦点顕微鏡の光学系を備えた 1分子蛍光分析システム MF20 (ォリンパス）を用いて、蛍光相関分光法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験 DNA濃度が InMになるよう希釈し、計測時間を 1試料につき、 15秒（5秒 X 3回）とした。

[0049] 図 3は、蛍光相関分光法により、制限酵素処理していない被検試料（曲線 A)と、 Mi crocin SF608を添加した対照試料（曲線 B)と、 5_ァザデォキシシチジン添加の被検試料（曲線 C)から得られた自己相関曲線をそれぞれ示している。同図を参照して、理解される如ぐ制限酵素処理していない被検試料と Microcin SF608を添加した対照試料の自己相関曲線の形状は、概ね一致するが、 5-ァザデォキシシチジン添カロの被検試料の自己相関曲線の形状は、他の試料の自己相関曲線に比べ左にシフトしていること力 Sわ力、る。各試料の並進拡散時間は、以下の通りであった。制限酵素処理してレ、な!/、被検試料 853 秒

Microcin SF608を添加した対照試料 840〃秒

5-ァザデォキシシチジン添加の被検試料 476 秒

既に述べた如ぐ蛍光標識の付加された DNA分子が小さくなると、分子の移動速度が速くなることから、自己相関曲線は速く低減し、並進拡散時間は短くなる。従って、上記の結果は、 5-ァザデォキシシチジン添加の被検試料に於いて、 DNAが切断されていることを示している。即ち、 5-ァザデォキシシチジンの存在下では、メチル化酵素の DNAのメチル化が阻害されたことを示す。力、くして、本発明の蛍光相関分光法を採用した方法により、被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。

[0050] 带 ^ 角肖 ¾によろ f 油 I (ステップ 6)

メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料及びメチル化感受性制限酵素処理していない被検試料について、 1分子蛍光分析システム MF20 (ォリンパス）を用いて、蛍光偏光解消法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験 DNA濃度が InMになるよう希釈し、計測時間を 1試料につき、 3秒（1秒 X 3回）とした。測定値は、 mP値 (縦偏光と横偏光の強度の差分を縦偏光と横偏光の和で割った値の 1000倍に相当する）である。

[0051] 各試料の mP値は、以下の通りであった。

制限酵素処理していない被検試料 283

Microcin SF608を添加した対照試料 279

5-ァザデォキシシチジン添加の被検試料 124

既に述べた如ぐ蛍光標識の付加された DNA分子が小さくなると、分子の回転ブラゥン運動が速くなることから、 mP値は低減する。従って、上記の結果は、 5-ァザデォキシシチジン添加の被検試料に於!/、て、 DNAが切断されて!/、ることを示して!/、る。即ち、 5-ァザデォキシシチジンの存在下では、 DNAが非メチル化状態にあり、メチル化酵素の DNAのメチル化が阻害されたことを示す。力、くして、本発明の蛍光偏光解消法を採用した方法によっても、被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。 [0052] 実施例 2

2つの発光波長の異なる蛍光標識が付加された試験 DNAを用いた DNAメチル化阻害物晳のメチル化阻害作用の判定

2つの発光波長の異なる蛍光標識が付加された試験 DNAを用いて、上記の処理過程に従って、被検物質の DNAメチル化阻害作用の有無の判定を行った。

[0053] 試験 DNAの調製

以下の塩基配列を有する TAMRA (カルボキシテトラメチルローダミン）にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（シグマジエノシスより入手）と Alexa647にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（日本バイオサービスより入手)を会合させ二本鎖 DNAである試験 DNAを調製した。

蛍光標識オリゴヌクレオチド

5 ' (alexa647)GCCATGTACCCTCGACACAA3 '

蛍光標識オリゴヌクレオチド

5 ' (TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC3 '

なお、下線を付した CG力 Sメチル化部位である。

会合の手順は、実施例 1と同様である。会合させた状態の試験 DNAの塩基配列は、以下の通りである。

(TAMRA) TTGTGTCGAGGGTACATGGC

AACACAGCTCCCATGTACCG(alexa647)

(下線部がメチル化部位）

[0054] 以後の試験 DNAのメチル化 (ステップ 1 3)とメチル化感受性制限酵素による非メチル化部位の切断 (ステップ 4 5)は、実施例 1と同様とした。

[0055] ffilffi 去による f 彻 1 (ステップ 6)

メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料につ!/、て、 1分子蛍光分析システム MF20 (ォリンパス）を用いて、蛍光相互相関分光法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験 DNA濃度が 0. InMになるよう希釈し、計測時間を 1試料につき、 15秒（5秒 X 3回）とした。

[0056] 図 4 (A)、 (B)は、それぞれ、 5-ァザデォキシシチジン添加の被検試料、 Microcin SF608を添加した対照試料から得られた蛍光相互相関分光法による alexa647と TAM RAの蛍光強度の相互相関関数を示している。相互相関関数は、二つの蛍光強度の時間変化に相関がない場合には 1となる。被検試料と対照試料との相互相関曲線の形状を比較して、対照試料は、相関値が 1より大きいのに対し、被検試料は、相関値が略 1に推移した。従って、被検試料では、 alexa647と TAMRAの運動には相関が独立したものであり、対照試料では、 alexa647と TAMRAの運動に或る程度の相関が在り、 alexa647と TAMRAが同一の担体に乗っていることが示唆される。即ち、前者では、試験 DNAが切断され、 alexa647と TAMRAとが互いに独立に運動し、後者では、試験 DNAが切断されずに保存されて!/、ることとなる。今回の実験系ではメチル化されていない DNAが切断されるので、被検試料では、 5-ァザデォキシシチジンにより、メチル化酵素の DNAのメチル化が阻害されたことを示す。力、くして、本発明の蛍光相互相関分光法を採用した方法により、被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。

上記の実施例の結果は、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DNAである試験 DNAを用いて、一連の反応を施した後、メチル化感受性作用物質による試験 DNAの切断の有無を試験 DNAの蛍光測定に基づいて決定することができ、これにより、或る酵素がメチル化活性若しくは脱メチル化活性を有しているか否力、、又は或る物質が酵素のメチル化若しくは脱メチル化の阻害作用を有しているか否かを判定することができることを示している。また、上記実施例に於いて特記されるべきことは、被検試料の DNA濃度が 0. 1乃至 InMというごく微量でよぐ検出に要する時間も 3— 15秒と非常に短時間で計測が可能である点である。上記の方法によれば、多数の被検物質について、各被検物質が DNAメチル化阻害剤であるか否かのスクリーニングを容易に行うことができる。同様に、 DNA メチル化酵素若しくは DNA脱メチル化酵素のスクリーニング又は DNA脱メチル化阻害剤のスクリーニングも容易に行うことができる。

Claims

請求の範囲

[1] DNAのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、

メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DN Aである試験 DNAと、 DNAのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、 DNAメチル化酵素とを混合する過程と、

その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれ力、を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験 DNAに作用させる過程と、

前記メチル化感受性制限酵素を作用させた試験 DNAの蛍光強度を測定する過程と、

前記蛍光強度に基づいて前記試験 DNAが前記メチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程とを含み、

前記試験 DNAが切断されたか否かにより前記被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であるか否力、を判定することを特徴とする方法。

[2] 請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質が、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断するメチル化感受性作用物質であり、前記蛍光強度に基づいて前記試験 DNAが前記メチル化感受性作用物質により切断されたか否かを判定する過程に於レ、て、前記試験 DNAが切断されたと判定された場合に、前記被検物質が DNAのメチル化を阻害する阻害物質であると判定することを特徴とする方法。

[3] 請求項 1の方法であって、前記試験 DNAに、少なくとも二種類の蛍光標識が付加されて!/ヽることを特徴とする方法。

[4] 請求項 1の方法であって、前記試験 DNAに於いて前記メチル化部位と前記蛍光標識の付加された部位との距離が前記試験 DNAの長さの半分以下であることを特徴とする方法。

[5] 請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質力 Aat II、Acc I、 Acc I

I、Aci I 、Afa I 、 Afl II、 Alu I、 Aorl3H I、 Aor51H I、 Apa I、 ApaL I、 Ava I、 Ava II、Bal I、 BamH I、 Ban II、 Bbe I、 Ben I、 Bgl I、 Bgl II、 Bin I、 BmeTl lO I 、 BmgT120 I、 Bpul l02 I、 BspT104 I、 BspT107 I、 Bspl286 I、 Bspl407 I、 BssH II、BspD I、BstP I、BstU I、 BstX I、 Bstl l07 I、 CfrlO I、 Cfrl3 I、 Cla I、 Cpo I、 Dra I、 Eae I、 Eag I、 Eaml l05 I、 Eco065 I、 EcoO109 I、 EcoR I、 EcoR V、 E coT14 I、 EcoT22 I、 Eco52 I、 Eco81 I、 Fba I、 Fok I、 Fse I、 Hae II、 Hae ΙΠ、 H ap II、 Hha I、 Hinc II、 Hind III、 Hinf I、 Hinl I、 Hpa II、 HpyCH4 IV、 as I、 p n I、 Mbo I、 Mbo II、 Mil I、 Mlu I、 Msp I、 Mun I、 Mva I、 Nae I、 NegM IV、 Nco I、 Nde I、 Nhe I、 Not I、 Nru I、 Nsb I、 PmaC I、 PshA I、 PshB I、 Pspl406 I、 P st I、 Pvu I、 Pvu II、 Sac I、 Sac II、 Sal I、 Sea I、 Sfi I、 Sma I、 Smi I、 SnaB I、 Sp e I、 Sph I、 Sse8387 I、 Ssp I、 Stu I、 Taq I、 Tthl l l I、 Van91 I, Vpa l lB I、 Xb a I、Xho I、Xsp Iから成る群から選択されたメチル化感受性作用物質であることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、メチル化感受性作用物質がメチル化感受性制限酵素であることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質が、 CCGG、 CCGC、 GC GC、 ACGT、 CGGCCG、 GCCGGC、 GGCGCC、 CCCGGG、 CGCG、 ATCGT A、 TTCGAA、 GTCGAG、及び CTCGAGからなる群から選択された認識配列を切断する制限酵素であることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、前記蛍光強度に基づいて前記試験 DNAが前記メチル化感受性作用物質により切断されたか否力、を判定する過程に於レ、て、前記メチル化感受性作用物質を作用させる過程の前後の蛍光標識が付加された部位を有する D NAの大きさの変化が決定されることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験 DNA の蛍光強度を測定する過程に於いて、前記蛍光強度の測定が蛍光相関分光法により行われることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験 DNA の蛍光強度を測定する過程に於いて、前記蛍光強度の測定が蛍光相互相関分光法により行われることを特徴とする方法。

請求項 1の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験 DNA の蛍光強度を測定する過程に於!/、て、前記蛍光強度の測定が蛍光偏光解消法により行われることを特徴とする方法。

[12] 酵素の DNAメチル化活性を検出する方法であって、

メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖 DN Aである試験 DNAと、 DNAメチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、

前記試験 DNAが切断されたか否かによって前記被検酵素が DNAをメチル化する活性と有しているか否力、を判定することを特徴とする方法。

[13] 酵素の DNA脱メチル化活性を検出する方法であって、

メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加されたニ本鎖 DNAである試験 DNAと、 DNA脱メチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、

前記試験 DNAが切断されたか否かによって前記被検酵素が DNAを脱メチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法。 DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、

メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加されたニ本鎖 DNAである試験 DNAと、 DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、 DNA脱メチル化酵素とを混合する過程と、その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれ力、を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験 DNAに作用させる過程と、

前記試験 DNAが切断されたか否かによって前記被検物質が DNAの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かを判定することを特徴とする方法。