WO2008023469A1 - Procédé d'identification d'un facteur transcriptionnel induisant la production d'une substance physiologiquement active issue de monascus et son utilisation - Google Patents

Procédé d'identification d'un facteur transcriptionnel induisant la production d'une substance physiologiquement active issue de monascus et son utilisation Download PDF

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WO2008023469A1
WO2008023469A1 PCT/JP2007/054061 JP2007054061W WO2008023469A1 WO 2008023469 A1 WO2008023469 A1 WO 2008023469A1 JP 2007054061 W JP2007054061 W JP 2007054061W WO 2008023469 A1 WO2008023469 A1 WO 2008023469A1
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WO
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gene
citrinin
ctnr
biosynthesis
seq
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Application number
PCT/JP2007/054061
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takuya Nihira
Hiroshi Kinoshita
Original Assignee
Osaka University
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Publication date
Application filed by Osaka University filed Critical Osaka University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi

Definitions

  • the present invention relates to a transcription factor that induces expression of a citrinin biosynthesis system gene derived from a filamentous fungus, a gene that encodes the same, and a method for regulating citrinin biosynthesis of a filamentous fungus using the transcription factor.
  • Filamentous fungi have a variety of secondary metabolic abilities, and thus are regarded as promising biological resources for new physiologically active substances.
  • the secondary metabolism of filamentous fungi depends on the growth environment, it is necessary to determine the optimum production conditions for the target compound for each strain. Therefore, a great deal of labor is required for industrial use of filamentous fungi.
  • Monascus purpureus belonging to the genus Monascus is a filamentous fungus that is useful for producing fermented foods and producing pigments that are natural coloring agents.
  • Monascus purpleus also produces citrinin, a mold venom. Therefore, for further industrial effective utilization of Monascus prupreus, it is essential to elucidate the citrinin biosynthesis mechanism and production control mechanism that have yet to be elucidated.
  • Citrinin is a physiologically active substance having antibacterial activity against gram-positive bacteria. This biosynthesis is presumed to be performed from a plurality of biosynthetic enzyme groups including polyketide synthase. Therefore, if the citrinin biosynthetic genes are identified and their operation methods are established, the desired production regulation can be performed.
  • citrinin is a polyketide compound and is known to adversely affect the kidneys and liver by animal experiments. Aspergillus and Penicillium have been confirmed to produce citrinin only in Monascus! The toxicity of cytolinin is low compared to the mold toxin aflatoxin. However, contamination of citrinin to products produced using these citrinin-producing organisms in the factory is a problem.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-321176
  • Non-Patent Document 1 Applied and Environmental Microbiology, July 2005, p. 3453-3457 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a transcription factor capable of comprehensively controlling transcription of a plurality of genes in a citrinin biosynthesis system and a method for using the same.
  • Another object of the present invention is to elucidate the citrinin biosynthesis mechanism and the production control mechanism, and to identify a citrinin biosynthesis gene group presumed to exist as a gene cluster.
  • the regulatory factor has a 2Cys6 zinc finger motif and was presumed to be a transcription factor. Therefore, when the regulatory factor was destroyed in Monascus prupreus, citrinin production was greatly reduced, and the amount of transcription of four genes (orf 3-5 and pksCT) belonging to the cluster was reduced. Moreover, when the regulatory factor was reintroduced and expressed in the disrupted strain of the regulatory factor, citrinin production and gene transcription were restored. From the above, it was found that the above-mentioned regulatory factor is a transcription factor that positively regulates citrinin production through the activity of the citrinin biosynthesis gene cluster. Hereinafter, this control factor is referred to as ctnR.
  • citnR and Monascus prupreus-derived citrinin biosynthetic gene cluster were introduced into Aspergillus oryzae, which does not have citrinin biosynthetic ability, and the culture supernatant was analyzed. confirmed.
  • the present invention provides a gene comprising a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a cDNA sequence that is a coding region of ctnR.
  • the present invention also provides a genomic DNA represented by SEQ ID NO: 3 comprising an intron in the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of SEQ ID NO: 3 contains an intron but begins with a start codon and ends with a stop codon.
  • a gene containing a region corresponding to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is also included in the scope of the present invention.
  • the present invention is noblyzed under stringent conditions with a polynucleotide having a sequence ability complementary to the polynucleotide having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 1, and induces citrinin biosynthesis gene expression.
  • a gene comprising a polynucleotide encoding a transcription factor is provided.
  • stringent and non-hybridization conditions mean that only specific hybridization occurs and non-specific hybridization and non-hybridization do not occur. , Such conditions. Such conditions include 0.7 to 1.
  • Hybridization at 65 ° C in the presence of Omol / 1 sodium chloride, 0.1 to 2 fold concentration of SSC solution composition of 1 fold concentration of SSC solution is 150 mmol Zl salt (Including sodium chloride, 15 mmol Zl sodium citrate), and conditions including washing at 65 ° C.
  • the present invention includes a nucleotide sequence in which one or several bases or base pairs are deleted, substituted or added in the polynucleotide having the nucleotide sequence ability shown in SEQ ID NO: 1, and citrinin Also included are genes containing polynucleotides that encode transcription factors that induce biosynthetic gene expression. “Deletion, substitution or addition of one or several bases or base pairs” means that substitution, deletion, insertion, and Z or addition can be performed by a known mutagenesis method such as site-directed mutagenesis. Means that a number of bases are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • the present invention also encodes a transcription factor that exhibits 60% or more homology at the nucleotide level with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and induces citrinin biosynthesis gene expression. Also included are genes comprising polynucleotides. The homology is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more. Sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444-2448) or BLASTN search.
  • the present invention also includes a gene encoding the following protein (a) or (e):
  • amino acids are deleted, substituted or added refers to a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis.
  • Substitution, deletion, insertion, and Z or addition means that as many amino acids as can be substituted, deletion, insertion, and Z or addition.
  • the “mutation” mentioned here may be a mutation artificially introduced by a known method for producing a mutant protein, or may be a naturally occurring mutation. Such a mutation may be used.
  • the gene provided by the present invention is derived from Monascus fungus, which is preferably derived from a filamentous fungus having citrinin producing ability!
  • the present invention provides the following protein (a) or (b):
  • the present invention further includes the following protein (f):
  • homology is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, 80% or more, 90% or more.
  • sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444- 2448) or BLASTP search.
  • the present invention also provides a protein encoded by the gene of the present invention.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene of the present invention.
  • the present invention further provides a host cell comprising the gene of the present invention or the recombinant vector of the present invention.
  • the host cell into which the gene or the recombinant vector is introduced is preferably a filamentous fungal cell having a citrine biosynthesis pathway. Examples of the vector carrying the gene according to the present invention include pAG (Biotechnology Letters 2006 28: 115-120).
  • filamentous fungi used as host cells examples include Monascus fungi, Monascus' Plepreus and Monascus' Pyrosus, Pericillium 'Penicilliu citrinum, and Pericillium * Penidicilli viridicatum. It is done.
  • the host cell is preferably a Monascus mold, and Monascus Purpleus is particularly preferred! /.
  • the present invention further provides a method for inhibiting citrinin biosynthesis in a filamentous fungus having a citrinin biosynthesis pathway, the method comprising inhibiting the expression of the gene of the present invention. Examples of the method for inhibiting gene expression include RNAi and gene disruption.
  • gene expression is inhibited by homologous recombination known in the art.
  • filamentous fungi in this method include Monascus plepreus and Monascus pylorius, Penicilliu citrin um, Penicilliu viridicatum, etc., preferably It is a Monascus genus mold, and Monascus purpleus is particularly preferable.
  • the present invention provides citrinin biosynthesis including a step of introducing the gene of the present invention into a filamentous fungus having a citrinin biosynthesis pathway that is inhibited by inhibiting expression of the gene of the present invention.
  • a method for restoring the ability to synthesize citrinin in the inhibited filamentous fungus are the same as described above.
  • Examples of the gene introduction method include a protoplast-PEG method, an electopore position method, an agrobacterium method, and the like.
  • the present invention also provides a method for promoting citrinin biosynthesis in a filamentous fungus having a citrinin biosynthesis pathway, comprising the steps of introducing the gene of the present invention and overexpressing the gene.
  • a method for promoting citrinin biosynthesis in a filamentous fungus having a citrinin biosynthesis pathway comprising the steps of introducing the gene of the present invention and overexpressing the gene.
  • Preferred methods for introducing filamentous fungi and genes are the same as described above.
  • the step of overexpressing the gene of the present invention can be achieved, for example, by linking a constitutive promoter upstream of the gene to be introduced, or by linking to an inducible promoter and inducing the promoter.
  • the present invention also provides a gene of the present invention for a filamentous fungus that does not have a citrinin biosynthesis pathway.
  • a gene consisting of a base sequence in which one or several bases or base pairs are deleted, substituted or added in the polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encoding ctnR of the present invention Together with a polynucleotide capable of causing citrinin production in the filamentous fungus when introduced into a filamentous fungus that does not have a citrinin biosynthetic pathway;
  • a filamentous fungus that exhibits 60% or more homology at the nucleotide level with the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and does not have a citrinin biosynthetic pathway together with the gene encoding ctnR of the present invention A polynucleotide capable of causing citrinin production in the filamentous fungus when introduced into.
  • a "citrinin biosynthesis gene cluster” is a double-stranded DNA containing a group of genes involved in citrinin biosynthesis, one of which is a transcription factor (ct nR) identified by the present invention. This refers to a gene cluster of approximately 25 kb that encodes oxidoreductase (Ord) and polyketindindase (pksCT), and the other strand encodes oxygenase (Oxg) and transporter (Tra) (see FIG. 7). Wanna).
  • Polynucleotide strengths (d), (g) and (h) above When introduced into a filamentous fungus that does not have a citrinin biosynthetic pathway together with the gene encoding ctnR, it can cause citrinin production in the filamentous fungus. Whether or not it is a “polynucleotide” can be confirmed as described in the Examples. Specifically, whether or not a polynucleotide is a gene cluster is determined by combining the polynucleotide with a gene encoding ctnR of the present invention with a filamentous fungus having no ability to produce citrinin, for example, Aspergillus oryzae. By co-introducing, it can be determined by confirming whether or not the bacterium acquires the ability to produce citrinin and secretes citrinin outside the cell.
  • the present invention provides a plurality of novel residues involved in citrinin biosynthesis by cloning multiple genes in the vicinity of the pksCT gene encoding citrinin polyketide synthase. Provide an evangelist.
  • the present invention also provides a positive transcription factor essential for control of citrinin biosynthesis in the upstream region of pksCT. By inactivating this positive transcription factor, a filamentous strain having a very low ability to produce citrinin can be produced.
  • the present invention shows that a citrinin biosynthetic gene cluster is formed around a plurality of gene forces / ksCT genes. The existence of a citrinin biosynthesis gene cluster has not yet been reported, and the present invention contributes to elucidation of the citrinin biosynthesis mechanism.
  • FIG. 1 is a restriction map of the cloned fragment. 5.0-kb Xbal (l) -Xbal (
  • ctnB (orf4)
  • ctnC (orf 5) represent the identified genes encoding the dehydrogenase, regulator, oxygenase, oxidoreductase, and transporter homologs, respectively.
  • pksCT represents the citrinin polyketide synthase gene. Thick arrows indicate position and direction.
  • FIG. 2 shows a transcriptional analysis of a putative citrinin biosynthesis gene.
  • A RT-PCR was performed on RNA samples from which the mycelial strength recovered from the MC liquid medium after the indicated culture period was also extracted.
  • B Northern blot analysis of the pksCT gene. Amplified fragments by RT-PCR using primers, pksCT-F (SEQ ID NO: 19) and pksCT-R (SEQ ID NO: 20) were used as probes.
  • W wild type strain
  • D ctnR-disrupted strain
  • E ctnR-complemented ctnR-broken strain
  • f 1 dehydrogenase
  • f 2 regulatory factor (ctnR)
  • f 3 oxygenase
  • pksCT citrinin polyketide synthase
  • pksCT citrinin polyketide synthase
  • f 5 transporter
  • FIG. 3 shows the gene structure of ctnR.
  • the arrows indicate the transcription start and stop sites.
  • the underlined sequence is the presumed polyadenylation site.
  • the thick arrow indicates a 2,006 bp ctnR genomic DNA (SEQ ID NO: 3) encoding a 576-amino acid protein (SEQ ID NO: 2).
  • Each intron is indicated by a white square and the size of the intron is shown above it.
  • the leftmost rectangle shows the position of the Zn (II) 2Cys6 DNA binding motif.
  • the large bold letters in the N-terminal DNA binding motif sequence are Zn (II) 2Cys6 DN A cysteine residue that constitutes the A-binding motif.
  • FIG. 4 shows orf2-disruption by double crossover via homologous recombination in (A), and (B) PCR of orf2-disrupted strain (left side) and Southern blot (right side). Show the analysis.
  • the orf2 gene was disrupted by insertion of the hygromycin resistance gene from pReg-dis (open arrow, Hyg ".
  • the small arrows indicate the PCR primers used for PCR analysis, dis F (SEQ ID NO: 23) and dis R (SEQ ID NO: A part of the hygromycin resistant gene was used as a probe for Southern blot analysis (arrows pointing to both sides under Hyg)
  • W wild type strain
  • D ctnR-disrupted strain.
  • FIG. 5 is a phenotypic analysis of ctnR-disrupted strains and ctnR-complemented-ctnR-disrupted strains.
  • A Growth in liquid medium. Growth was expressed by the dry weight of the mycelium. Wild-type strain (decree), ctnR-disrupted strain (country), and ctnR-complement-ctnR-disrupted strain ( ⁇ ).
  • B Pigment production. The dye was extracted from the dried mycelium with 70% ethanol and the absorbance (OD) at 500 nm was measured for the ethanol extract. Wild type strain ( ⁇ ), ctnR-destroyed strain (garden).
  • FIG. 6 shows complementation of ctnR-disrupted strains with intact ctnR.
  • A Scheme for construction of complementation vector p AG-reg. In pTRPpregt, a ctnR gene expression cassette flanked by trpC promoter and terminator was constructed by replacing the hygromycin resistance gene in pCSN44 with ctnR. The cassette was transferred from pENTR-TRPpregt to pAG by Gateway system, and as a result, vector pAG-reg having AurA 1 "as a selection marker was obtained.
  • B Southern blot analysis of ctnR-complement strain.
  • a small band indicates that there is a pAG-reg integrated into the genome, in addition to the pAG-reg that exists autonomously E4 was selected for phenotypic analysis
  • P is pAG as a positive control -reg
  • W is field Living strains
  • E1-E4 ctnR-complement-ctnR-disrupted strain
  • D is ctnR-disrupted strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing a citrinin biosynthesis gene cluster.
  • ctnR represents a transcription factor according to the present invention
  • Oxg represents oxygenase
  • Ord represents oxidoreductase
  • pksCT represents polyketide synthase
  • Tra represents a transporter.
  • ctnR positively regulates the transcription of genes in the gene cluster
  • pksCT is involved in the synthesis of the polyketide backbone
  • oxygenase and oxidoreductase modify the polyketide backbone by acid reduction
  • a transporter is generated It is thought to be involved in the excretion of citrinin outside the cells.
  • FIG. 8 shows the results of Southern blot analysis confirming the introduction of the Monascus pulpleus-derived citrine biosynthetic gene cluster into Aspergillus oryzae.
  • Aspergillus oryzae strain in which the gene cluster was successfully introduced, a strong band was confirmed at this position by Southern plot analysis using the region indicated by the solid line above the oxidoreductase as a probe (lanes 4 and 6). They are called CT1 and CT3, respectively).
  • Fig. 9 shows the results of HPLC showing production of citrinin in Aspergillus oryzae CT1 and CT3 into which the citrinin biosynthetic gene cluster derived from Monascus purpleus was introduced, and in the control strain. CT1 and CT3! Even so, there was no significant increase in citrinin production compared to the control strain.
  • FIG. 10 shows the construction of a transformant in which the transcription factor ctnR gene is further introduced into the Aspergillus oryzae CT3 strain into which the citrinin biosynthetic gene cluster derived from Monascus purupreus has been introduced.
  • FIG. 11 shows CT3 + ctnR5 strain, one of the transformants in which the transcription factor ctnR gene is further introduced into Aspergillus oryzae CT3 into which the citrinin biosynthetic gene cluster derived from Monascus prupreus was introduced
  • FIG. 4 is a diagram showing that citrinin is produced about 500 times as much as CT3 strain.
  • Fig. 12 shows the control strain, ct nR strain into which only ctnR was introduced, CT strain into which only the citrinin biosynthesis gene cluster was introduced, and both the citrinin biosynthesis gene cluster and ctnR from Aspergillus oryzae. It is a figure which shows the transcriptional activity of each gene involved in citrinin biosynthesis in the CT + ctnR strain.
  • the present invention provides a gene encoding a transcription factor that promotes citrinin biosynthetic enzyme expression.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a genomic DNA obtained from Monascus purpureus and was sequenced by the present inventors. Specifically, a region adjacent to the pksCT gene encoding citrinin polyketide synthase was cloned from Monascus purpleus.
  • ORFs orfl, orf2 (referred to as ctnR in FIG. 1), orf3 (referred to as ctnA in FIG. 1), and orf4 (referred to as ctnB in FIG. 1)
  • ORFs orfl, orf2 (referred to as ctnR in FIG. 1)
  • orf3 referred to as ctnA in FIG. 1
  • orf4 referred to as ctnB in FIG. 1
  • orfl, orf2, orf3, orf4, and orf5 are dehydrogenase (Dehy), regulator (ctnR), oxygenase (Oxg), oxidoreductase (Ord: this is sometimes called Oxr), And the transporter (Tra) homologue (see Figure 1 and Figure 7).
  • RT-PCR analysis revealed that all of these ORFs except for orfl encoding dehydrogenase were transcribed together with the pksCT gene under citrinin production conditions. It was suggested that orf2, orf3, orf4, and orf5), which encode regulatory factors, oxygenase, oxidoreductase, and transporter, respectively, are involved in citrin biosynthesis. As a result of the destruction of orf 2 (ctnR), transcription of pksCT and orf 5 decreased dramatically, and a clear decrease was also observed in orf 3, and a decrease in transcription was confirmed although orf 4 was also low ( Figure 2A), citrinin production decreased to 0.0016% of the wild type strain.
  • the ctnR coding region of the present invention is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a gene including a portion corresponding to this portion is also included in the present invention.
  • the polynucleotide having the nucleotide sequence ability shown in SEQ ID NO: 3 can be obtained as a genomic library ability prepared by a conventionally known method.
  • the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was confirmed to be a transcription factor coding region that positively controls the expression of citrinin biosynthesis gene.
  • the transcription factor is a protein containing a typical Zn (II) 2Cys6 DNA binding motif at the N-terminus.
  • the present invention also includes a gene encoding a protein functionally equivalent to a protein acting as a transcription factor having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein functionally equivalent to a protein acting as a transcription factor means a biological function equivalent to the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, ie, expression of a citrinin biosynthesis gene. Refers to a protein having a function of regulating.
  • citrinin biosynthetic genes include citrinin polyketide synthase (pksCT) gene and orf3, orf4 and orf5 corresponding to oxygenase, oxidoreductase, and transporter.
  • the number of mutations in the bases of the DNA constituting the gene included in the present invention is typically within 100 amino acids, preferably within 50 amino acids, more preferably within 20 amino acids, and even more preferably 10 amino acids at the amino acid level. (For example, within 5 amino acids, within 3 amino acids).
  • the method for obtaining the gene of the present invention is not particularly limited, and a general method is employed.
  • the gene may be excised from a genomic DNA or cDNA library of an organism having the gene with an appropriate restriction enzyme and purified.
  • the gene encoding the transcription factor of the present invention may be genomic DNA, cDNA, or chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. Genomic DNA, for example, extracts genomic DNA from the target biological force, creates a genomic library (plasmids, phages, cosmids, BAC, PAC, etc. can be used as vectors), and uses the protein of the present invention.
  • Genomic DNA can be prepared by colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared on the basis of the encoded genomic DNA (SEQ ID NO: 3).
  • Genomic DNA can also be prepared by preparing a primer specific to genomic DNA (SEQ ID NO: 3) encoding the transcription factor of the present invention and performing PCR using this primer.
  • a cDNA library is prepared by synthesizing cDNA based on mRNA extracted from the target biological force, and inserting it into a vector such as ⁇ ZAP.
  • the probe prepared based on SEQ ID NO: 1 can be prepared by using a probe-hybridization or plaque hybridization, or by performing PCR. is there.
  • Examples of the organism having the gene of the present invention include filamentous fungi having the ability to produce citrine, such as Monascus pulpleus and Monascus pylosus, which are molds of the genus Monascus, and Pecyllium citrinum. be able to.
  • the gene of interest can be more reliably isolated by using a high citrinin productivity, Monascus spp., Particularly preferably Monascus purpureaus.
  • the DNA encoding the transcription factor of the present invention can be used for mass production of citrinin, for example, by activating the expression of a citrinin biosynthesis gene. Further, for example, by inhibiting the expression of the transcription factor, molecular breeding of filamentous fungi that do not produce citrinin is also possible.
  • the transcription factor of the present invention has a Zn (II) 2Cys6 DNA binding motif, it was considered to be a Zn (II) 2Cys6 type transcription factor.
  • the transcription factor of the present invention is a transcription factor that activates gene expression in the citrinin biosynthesis system.
  • a base sequence having homology to the base sequence of the polynucleotide of the present invention is used. You only need to search the database.
  • the base sequence homology search by BLASTN which is a commonly used V, homology search algorithm, can be suitably used!
  • a hybridization method using a conventionally known DNA library can also be used. Specifically, a process for preparing a target filamentous fungal genomic library or cDNA library using an appropriate cloning vector, and a hybrid by using at least a part of the polynucleotide of the present invention as a probe. And a step of detecting a positive fragment of the probe from the library.
  • the gene of the present invention is also useful as a probe.
  • the region used for the probe preferably contains a sequence specific to the target gene.
  • the length of the polynucleotide used as the probe is preferably lOObp or more.
  • a method well known to those skilled in the art for preparing a gene encoding a protein functionally equivalent to the transcription factor having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes a hybrida. Technology (Southern, EM Journal of Molecular Biology, 98, May 03 (1975)) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK et al. Science, 230, 1350 -1354 (1985), Saiki, RK et al. Science, 239,487-491 (1988)).
  • PCR polymerase chain reaction
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions refer to conditions in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions include: 0.7 to 1. Hybridization at 65 ° C in the presence of OmolZl sodium chloride, 0.1 to 2 fold concentration of SSC solution (1 fold concentration of SSC solution) The composition includes 150 mmol Zl sodium chloride, 15 mmol Zl sodium citrate), conditions including washing at 65 ° C, and the like. If conditions with higher stringency are used, genes with higher homology can be efficiently isolated.
  • the thus isolated gene is presumed to have high homology with the amino acid sequence of the protein of the present invention (SEQ ID NO: 2) at the amino acid level encoded by the gene.
  • High homology refers to sequence identity of at least 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more (eg, 90% or more) in the entire amino acid sequence. Sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444-2448) or BLASTP search.
  • a gene having a function as a transcription factor can be examined, for example, by gel shift assay generally performed by those skilled in the art. Specifically, it can be performed by the following method. First, the test DNA is incorporated into a vector so as to produce a fusion protein with GST, for example, although the gene product is not limited thereto, and the fusion protein from the vector is expressed. The expression product is purified using GST as a target and mixed with a labeled DNA probe containing a Zn (II) 2Cys6 motif-binding DNA sequence. This mixed solution is analyzed by electrophoresis using a non-denaturing acrylamide gel. The binding activity can be evaluated from the position of the detected band on the gel.
  • gel shift assay generally performed by those skilled in the art. Specifically, it can be performed by the following method. First, the test DNA is incorporated into a vector so as to produce a fusion protein with GST, for example, although the gene product is not limited thereto, and the fusion protein from the vector is expressed.
  • a gene has the ability to encode a protein having a function of activating expression of a citrinin biosynthesis gene can be examined by, for example, a reporter assay. Specifically, it can be performed by the following method. First, a vector is constructed in which a reporter gene is linked downstream of one promoter of a citrinin biosynthesis enzyme. Evaluation of the transcriptional activity of the test DNA gene product by introducing the vector and a vector that expresses the gene product of the test DNA into a reporter assay cell and measuring the activity of the reporter gene product I do. Examples of promoters that can be used in the reporter assembly include promoters upstream of the above orf5 and pksCT.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected. Reporter genes generally used by those skilled in the art for various types of assay systems can be used.
  • a suitable reporter gene includes, for example, the j8-darc mouth-dase (GUS) gene.
  • the ability of a gene to encode a protein having a function as a transcription factor can be determined using a Southwestern method or a yeast one-hybrid method well known to those skilled in the art.
  • the protein of the present invention is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 encoded by the gene of the present invention, or one or several amino acids are deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein consisting of an added amino acid sequence and acting as a transcription factor for inducing citrinin biosynthesis gene expression or a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 at 60% or more homology at the amino acid level It is a protein that exhibits sex and acts as a transcription factor that induces citrinin biosynthesis system gene expression.
  • the protein of the present invention may contain an additional sequence such as known HA or Flag at the end in order to easily purify or detect the protein, and is a fusion protein. Also good. It may also be subjected to various modifications such as N-glycosylamine.
  • a recombinant vector according to the present invention incorporates the gene or gene fragment of the present invention.
  • the vector is introduced into a host so that it can be expressed by a known transformation method, so that the gene or gene fragment incorporated in the host can be expressed to obtain the protein according to the present invention.
  • the protein according to the present invention May be obtained by recombinant production, or may be isolated and purified from filamentous fungi, and its origin is not particularly limited.
  • the gene encoding the protein of the present invention is usually inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate host cell, and the transformed host cell is cultured. And purify the expressed protein.
  • the recombinant protein can be expressed as a fusion protein with another protein for the purpose of facilitating purification or the like. For example, a method for preparing a fusion protein with maltose binding protein using E.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for the expression of a recombinant protein.
  • fungal cells such as Escherichia coli and yeast, various animal and plant cells, insect cells and the like can be used.
  • Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce a vector into a host cell. For example, for introduction into E.
  • the recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or its culture supernatant by methods known to those skilled in the art. When recombinant protein is expressed as a fusion protein with maltose binding protein, etc., it is possible to easily purify the facility.
  • an antibody that binds to the protein can be prepared.
  • a polyclonal antibody can be prepared by immunizing a immunized animal such as a rabbit with the purified protein of the present invention or a peptide thereof, collecting blood after a certain period, and removing the blood. is there.
  • a monoclonal antibody is obtained by fusing an antibody-producing cell of an animal immunized with the protein or peptide of the present invention and a bone tumor cell, isolating a hybridoma that produces the target antibody, and obtaining the antibody from the hybridoma.
  • the antibody thus obtained is the tag of the present invention. It can be used for protein purification and detection.
  • the present invention includes antibodies that bind to the proteins of the present invention.
  • These proteins act as transcription factors involved in the control of citrinin biosynthesis, and are very useful in themselves. Furthermore, it is possible to modify the citrinin biosynthesis system using these proteins and the genes encoding these proteins.
  • a gene encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate vector, if desired, and introduced into a target host cell.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing the gene of the present invention or a recombinant vector containing the gene of the present invention. More specifically, the transformant of the present invention is one into which a gene encoding a transcription factor according to the present invention has been introduced.
  • a gene or a recombinant vector has been introduced means that a gene incorporated into the vector as desired in the host can be expressed by, for example, the action of a promoter, using a known genetic engineering technique.
  • the transformant of the present invention can be obtained by directly introducing the gene of the present invention or a vector incorporating the gene of the present invention into a host.
  • the host is not particularly limited, and examples thereof include prokaryotes such as Escherichia coli, fungi such as filamentous fungi and yeast, plants and animals.
  • the gene incorporated into the vector is derived from Monascus purpureaus, which is a type of filamentous fungus, the host is more preferably the Monascus fungus, which is preferred by the filamentous fungus, Monascus prupreus is particularly preferred.
  • the transformation may be transient, preferably the gene of the present invention is stably incorporated.
  • the gene of the present invention is used by linking to a downstream region of a promoter that can be expressed in a host cell, such as a trpC promoter derived from Aspergillus nidulans, an amyB promoter derived from Aspergillus oryzae.
  • a promoter that can be expressed in a host cell
  • a host cell such as a trpC promoter derived from Aspergillus nidulans, an amyB promoter derived from Aspergillus oryzae.
  • a method for producing a transformant containing the transformed host cell specifically, for example, a polyethylene glycol method, an electo-poration method, a method using an agrobacterium, a particle gun method, etc.
  • a method for producing a transformant is a method of regenerating an organism by introducing a gene into a protoplast using polyethylene glycol (Datta, SK (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp6 -74), electric nanos [the method of gene transfer to this protoplast and regeneration of organisms (Toki et al (1992) Plant Physiol.
  • the vector of the present invention is a constitutive promoter for expressing a conventionally known gene, for example, an Aspergillus bisdurans-derived trpC promoter, or an expression-inducible promoter, for example, It preferably contains an amyB promoter from Aspergillus oryzae and a drug resistance gene that facilitates selection of transformants, such as a hygromycin resistance gene.
  • homologous recombination When producing a transformant in which the expression of the gene of the present invention is suppressed, homologous recombination well known to those skilled in the art may be used as described in the Examples. Homologous recombination refers to a homologous region existing on both sides of a missing or fragmented site in order to create a gene that lacks or is fragmented by insertion of a marker gene or the like. ⁇ ⁇ ⁇ Gene disruption method using genetic recombination reaction.
  • RNAi can be used to suppress gene expression.
  • the sequence used for RNA i need not be completely identical to the sequence of the target gene (in the present invention, the ctnR gene), but it is at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98%. It has the above sequence identity (for example, 99% or more). Sequence identity can be determined using the search described above.
  • the transcription factor ctnR of the present invention for example, by homologous recombination in a filamentous fungus having citrinin-producing ability, the ability to produce citrinin is greatly inhibited.
  • the filamentous fungus can be obtained without producing.
  • the ctnR gene is incorporated into a vector containing a promoter that overexpresses ctnR (eg, amyB promoter derived from Aspergillus oryzae) and introduced into a filamentous fungus, for example.
  • a promoter that overexpresses ctnR eg, amyB promoter derived from Aspergillus oryzae
  • a citrinin biosynthetic enzyme eg, pksCT
  • the filamentous fungi include Monascus sp. Plepreus and Monascus sp. Pylosus, and P. citrusum, and preferably Monascus sp., Particularly preferably Monascus sp.
  • Citriyun cattle No synthetic route 3 ⁇ 4 Citriyun cattle needles to filamentous fungi.
  • the "gene cluster" constituting the citrinin biosynthetic pathway is a force that is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or
  • a gene consisting of a base sequence in which one or several bases or base pairs are deleted, substituted or added in the polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encoding ctnR of the present invention Together with a polynucleotide capable of causing citrinin production in the filamentous fungus when introduced into a filamentous fungus that does not have a citrinin biosynthetic pathway;
  • a filamentous fungus that exhibits 60% or more homology at the nucleotide level with the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and does not have a citrinin biosynthetic pathway together with the gene encoding ctnR of the present invention A polynucleotide capable of causing citrinin production in the filamentous fungus;
  • the filamentous fungus acquires the citrinin biosynthesis capability.
  • the heterogeneous filamentous fungi that do not have such a citrinin biosynthetic pathway include Aspergillus-Durance and Aspergillus oryzae, and preferably Aspergillus oryzae.
  • the co-gene introduction can be achieved by a conventionally known method, for example, protoplast-PEG method, electrovolution method.
  • Examples of the vector used for cogene introduction include pNR10 for introduction of ctnR and cosSC for introduction of a citrinin biosynthesis gene cluster.
  • the promoter used for cogene introduction is exemplified by the trpC promoter derived from Aspergillus nidulans.
  • a 21-kbp flanking region of pksCT encoding citrinin polyketide synthase was cloned from Monascus purpureus.
  • ORFs orfl, orf2, orf3, and orf4 were identified in the 5'-adjacent region adjacent to pksCT, and one ORF (orf5) was identified in the adjacent region. orfl, orf2, orf3, orf4, and orf5 encoded dehydrogenase, regulator, oxygenase, oxidoreductase, and transporter homologs, respectively.
  • RT-PCR analysis revealed that all of these ORFs except for orhydrogen encoding dehydrogenase were transcribed with the pksCT gene under citrinin production conditions. These four genes ( It was suggested that orf 2, orf3, orf4 and orf5) are involved in citrinin biosynthesis. orf2 (2,006 bp, with 4 introns (SEQ ID NO: 3)) encodes a 576-amino acid protein containing a typical Zn (II) 2Cys6 DNA binding motif at the N-terminus, and ctnR and I decided to call it.
  • Regulators with the Zn (II) 2Cys6 motif form one of the largest classes of transcription factors in filamentous fungi and are typically exemplified by GAL 4 from Saccharomyces cerevisiae As a positive transcription factor (Todd, RB, and A. Andrianopoulos. 1997. Evolution of a fungal regulatory gene family: the Zn (II) 2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388 —405).
  • a number of Zn (II) 2Cys6 regulators have been identified in fungi and are characterized as regulators for primary metabolism, secondary metabolism, drug resistance, or meiosis. The regulator is a Zn (II) 2Cys6 DNA binding motif (CX CX CX CX C, C;
  • the present inventors cloned a plurality of genes near pksCT encoding citrinin polyketide synthase to obtain a plurality of novel genes involved in citrinin biosynthesis.
  • the present inventors succeeded in obtaining a positive transcription factor essential for the control of citrinin biosynthesis in the upstream region of pksCT, and created a strain with extremely low citrinin production ability due to the inactivation of this positive transcription factor. Prove that you can.
  • the present invention shows the possibility that a plurality of genes form a citrinin biosynthesis gene cluster around the pksCT gene. The existence of a citrinin biosynthesis gene cluster has not been reported so far, and the present invention contributes to elucidation of the citrinin biosynthesis mechanism.
  • NBRC30873 a wild type strain of Monascus purpureus (Monascus purpureus), is a monascus culture (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l), NH H PO (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l), NH H PO (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l), NH H PO (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l), NH H PO (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l), NH H PO (MC) solid medium (glucose (50 g / l), polypeptone (7.5 g / l),
  • E. coli XLIO-Gold® Ultracompe tent Cells (Stratageneata La Jolla ⁇ CA USA) and Library Efficiency® DB3.1 Competent Cells (Invitrogen, Carlsbad, CA USA) for genetic manipulation in E. coli. -Used as a host.
  • the primers used are shown in Table 1.
  • the 2.0-kb Sphl-Xbal fragment and the 2.0-kb Sall-Hindlll fragment were treated with T4 DNA polymerase and pCSN44 [Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/)l (S taben. C, B. Jensen, M. Singer, J. Pollock, M. Schechtman, J. Kinsey, and E. Selke r. 1989.Use of a bacterial hygromycin B resistance gene as a dominant selectable m arker in Neurospora crassa transformation Fungal. Genet. Newsl. 36: 79-81) was inserted into the blunt-ended Xhol and EcoRV sites, respectively.
  • the construct contains a hygromycin-B-resistant gene as a selectable marker, and a 2.0-kb Sph to Xbal fragment and a 2.0-kb Sall-Hindlll fragment are located on both sides of the construct. I decided to call it.
  • pTRPpt was linearized by digestion with Clal * and Bam HI * and ligated into a 2.4-kb ApaLI * -NdeI * fragment containing the regulator gene (pTRPpregt).
  • the vector is the trpC promoter in pUC19 And a terminator.
  • a 3.4-kb HindIII * -SmaI * fragment containing the regulator gene sandwiched between the trpC promoter and terminator was isolated from pTRPpregt and inserted into the EcoRI * site in pENTR11 (Invitrogen) (pENTR-TRPpregt).
  • pENTR-TRPp regt and aureobasidin AurA 1 "as a selective marker conferring Affif properties to Monascus purpleus pAG (Shimizu T., H. Kinoshita, and T. Nihira. 20 05. Development of transformation system in Monascus purpureus Using the autonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett, in pres s.), a vector pAG-r eg was constructed through a recombination reaction by the Gateway system (Invitrogen) (FIG. 6A).
  • f c ORF and amino acid sequences were deduced by sequence analysis.
  • c aa represents the number of amino acid residues.
  • the orf2 gene located upstream of the pksCT gene showed significant similarity to members of the Zn (II) 2Cys6 binuclear cluster DNA-binding protein (Todd, RB, and A. Andrian opoulos. 1997. Evolution of a lungal regulatory gene family: the Zn (II) 2 binuclear cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388-405).
  • the potent Zn (II) 2Cys6 protein generally acts as a positive transcription factor for other members of the biosynthetic gene cluster when the regulator gene is located within a cluster of secondary metabolites (Abe, Y ., C. Ono, M. Hosobuchi, and H. Yoshikawa. 2002.
  • the start codon, stop codon, and polyadrei cocoon site were located at 126 nt, 2,005 nt, and 2,048 nt downstream of tss, respectively.
  • the presence of four introns was presumed to be typical splicing sites (5 and GT-AG-3 ').
  • the nucleotide sequence of the coding region of the ctnR gene is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the ctnR protein is SEQ ID NO: 2
  • the genomic ctnR gene including the intron The leotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3, respectively.
  • RT-PCR followed by sequencing confirmed that the introns were located at nts 238-296, 571-622, 1131-1206, and 1696-1783 starting from t ss ( Figure 3) (DDBJ Registration number AB243687).
  • the orf 2-disrupted strain ie, the ctnR disrupted strain
  • the orf2-destructed strain citrinin production decreased dramatically during the culture period (citrinin per flask was less than 100 ng).
  • citrinin production by the wild type strain proceeded well (citrinin per flask was 1930 ⁇ g on day 10 of culture). This suggests that the orf 2 gene product is essential for the effective production of citrinin. That is, it was revealed that citrinin production in Monascus can be remarkably suppressed by disruption of the ctnR gene.
  • a transcription analysis revealed a correlation between the orf2 gene and citrinin production.
  • Northern blot analysis for the pksCT gene shows that the pks CT transcript in orf 2-disrupted strains is dramatically reduced ( Figure 2-B), indicating that the orf2 gene product is responsible for citrinin biosynthesis. Clearly shown to be involved.
  • orf2 gene product (ctnR) is positive transcription for pksCT, orf 3, orf 4 and orf 5
  • ctnR orf2 gene product
  • the ctnR-complementing strain showed a slight decrease in growth.
  • the ctnR-complementing strain recovered citrinin production.
  • the degree of citrinin production was slightly lower than that of the wild type strain (the ctnR-complemented strain was 1649 ⁇ g / flasco on the 10th day of culture, and the wild type strain was 1930 g / flask on the 10th day of culture).
  • Proteins encoded by ORFs other than orf2 are oxygenase (orf3), oxidoreductase (orf4), and transporter (orf5).
  • oxygenase and oxidoreductase corresponds to the proposed pathway of citrinin biosynthesis ( Figure 7).
  • the putative transporter (or f 5) is a homologue of the FLU1 protein of Candida albicans ( Calabrese, D., J. Bille, and D. Sanglard. 2000.
  • a novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans conferring res istance to fluconazole. Microbiology. 146: 2743—2754.). This suggests that orf5 acts as a transporter to prevent intracellular accumulation of schidinin.
  • the present inventors have found for the first time the existence of a citrinin biosynthetic gene cluster containing a gene encoding a positive transcription factor in a citrinin-producing bacterium.
  • the present inventors tried to construct a heterologous gene expression system in a filamentous fungus in order to enable production of physiologically active substances' gene analysis and mass production of useful substances.
  • the Aspergillus oryzae NS4 strain was used as the host, and the citrinin biosynthetic gene group derived from Monascus purpureus was used as the heterologous gene group.
  • M. purpureus genomic DNA was partially digested with Sau3AI, and fragments having a length of 20 kb to 50 kb were separated and collected by agarose gel electrophoresis. After ligation of the obtained DNA fragment to the BamHI site of Supercosl cosmid vector (Stratagene), Gigapack III XL package Parsing was performed using Zinguecttract (Stratagene). From the obtained 4000 colonies, positive clones were selected by colony hybridization using a part of 430 bp pksCT amplified by KS and LC5 primers as a probe. Whether the resulting positive clone contains the entire citrinin biosynthesis gene cluster pks CT, orf!
  • Escherichia coli-Aspergillus' shuttle cosmid An26 (Fungal Genetics Stock Center, Kans as City, Missouri) was cleaved with Smal and Xbal to remove the hygromycin metagene, and Pstl treatment and T4 DNA polymerase treatment were performed from pUSC. 3.
  • CossC was constructed by incorporating the sC gene that imparts 25 kp sulfate utilization.
  • Supercos CT-1 was partially digested with Bam HI, fragments 20 kb to 50 kb in length were separated by agarose gel electrophoresis, ligated to the BamHI site of CossC, and packaged using Gigapack III XL packaging eta Stratagene (Stratagene). Performed. Obtained by the method described above. The cosmid was confirmed to contain the entire length of the citrinin biosynthesis cluster. As shown in FIG.
  • the obtained cosmids were derived from the Monascus purpureus citrinin biosynthetic gene cluster, ie ctnR (orf2), oxygenase (orf3), oxidoreductase (orf4), pksCT (Citrinin polyketide synthase), transporter (or f5), and using this cosmid, the region containing 21917 bp (SEQ ID NO: 4) is used to identify the region containing Astrigillus oryzae NS4 It was introduced into the strain, and gene introduction was confirmed by simply amplifying 430 bp of pksCT with KS and LC5 primers.
  • citrinin biosynthetic gene cluster 1 was inserted into the cosmid and introduced into the strain according to the protoplast 1 PEG transformation method using pyracyamine resistance of Takara Bio Inc., but sC or sCD (CD + 0.8% NaCl) was used.
  • the lower panel of FIG. 8 shows the results of a Southern blot showing the presence of gene clusters in transformed Aspergillus oryzae NS4 strains.
  • Southern blot analysis was essentially performed by Sambrook et al. (Sambrook J., EF Fritsch, and T. Maniati s. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.) It went according to the method of. Specifically, genomic DNA (20 ⁇ g) was digested with restriction enzyme Sac II and separated by 1.0% agarose gel electrophoresis, and then Hybond N + membrane (Amersham Biosciences Corp. 800 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08855 USA).
  • the probe is indicated by a solid line (small solid line above oxidoreductase) on the schematic diagram of the gene cluster in FIG.
  • Probes O dimethylsulfoxide some primers OXD-ife and OXD-r amplified fragment by Random Primer DNA Labeling Kit Ver reductase 2 (Takara Bio, Otsu, Japan ) using a. - by [ ⁇ 32 P] dCTP Labeled ones were used.
  • Emission wavelength 500 nm
  • excitation wavelength 330 nm
  • citrinin biosynthetic genes whose transcripts were examined were dehydrogenase (Dehy), ctnR (Reg), oxygenase (Oxg), oxidoreductase (Oxr: also called Ord), pksCT and transporter (Tra). Actin was used as a standard.
  • Lane 1 is the control strain
  • lanes 2 and 3 are the ctnR strain
  • lane 4 is the CT strain
  • lanes 5 and 6 are the amounts of the transcript from the CT3 + ctnR strain.
  • transcripts of genes involved in citrinin biosynthesis In contrast, ctnR transcripts were observed in the ctnR strain.
  • CT strain transcription of all citrin biosynthetic genes except for the dehydrogenase located upstream of ctnR was slightly detected.
  • CT3 + ctnR strain transcription of all citrinin biosynthesis genes was strongly induced. This indicates that ctnR is a transcription factor that positively induces transcription of the citrinin biosynthesis gene.
  • citrinin synthesis gene group derived from M. pu rpureus was introduced into Aspergillus oryzae as a model of a heterogeneous gene group expression system, and citrinin production was confirmed.
  • citrinin production was up to 500 times higher than that of CT3 strain by further introducing ctnR into Aspergillus oryzae into which the biosynthetic gene cluster was introduced.
  • the present inventors introduced Aspergillus oryzae into Aspergillus oryzae, which has no ability to produce citrinin, by introducing multiple ctnR genes in addition to the citrinin biosynthesis gene cluster. Succeeded in building a citrinin biosynthesis system. Furthermore, it was clarified that expression of all genes in the citrinin biosynthetic cluster was regulated by ctnR by using a powerful system.
  • the present invention provides a plurality of novel genes involved in citrinin biosynthesis.
  • the present invention also provides a positive transcription factor essential for the control of citrinin biosynthesis in the upstream region of pksCT. By inactivating this positive transcription factor, a filamentous strain having a very low citrinin-producing ability can be prepared.

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Description

モナスカス由来生理活性物質生産誘導転写因子の同定およびその利用 技術分野
[0001] 本発明は、糸状菌由来のシトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子、そ れをコードする遺伝子およびそれを用いて糸状菌のシトリニン生合成を調節する方 法に関する。
背景技術
[0002] 糸状菌は多様な二次代謝能を有することから、新規生理活性物質の有望な生物資 源とみなされている。しかし、糸状菌の二次代謝は生育環境に依存するため、菌株ご とに目的化合物の生産最適条件を決定する必要がある。したがって、糸状菌の工業 的利用には多大な労力を要する。
[0003] 遺伝子工学的手法による糸状菌由来遺伝子の簡便な発現系の構築が望まれてい る。というのは力かる系により、糸状菌における生理活性物質生合成機能の迅速な遺 伝子解析、さらには有用物質の大量生産が可能となるためである。しかし糸状菌の 二次代謝合成遺伝子はクラスタ一として存在することが多いため、活性を有する物質 の生産には、目的の遺伝子クラスター全体を宿主に導入する必要がある。そのため 遺伝子工学的手法を用いた糸状菌由来遺伝子の発現系の開発はあまり進んでいな い。
[0004] モナスカス属カビに属するモナスカス'プルプレウス (Monascus purpureus)は、発酵 食品の製造、天然着色料である色素の生産のために有用な糸状菌である。しかし、 モナスカス ·プルプレウスはカビ毒であるシトリニンも生産する。したがって、モナスカ ス 'プルプレウスのさらなる工業的有効利用には、これまで未解明のシトリニン生合成 機構および生産制御機構を明らかにすることが必須である。
[0005] シトリニンはグラム陽性細菌への抗菌活性を有する生理活性物質である。この生合 成はポリケタイドシンターゼを含む複数の生合成酵素群より行われると推測される。し たがって、シトリニン生合成遺伝子群を同定し、それらの操作方法が確立すれば、所 望の生産調節を行うことが可能となる。 [0006] 一方、シトリニンはポリケタイドィ匕合物であり、動物実験により腎臓や肝臓に悪影響 を与えることが知られている。モナスカス (Monascus)だけでなぐァスペルギルス (Aspe rgillus)やぺニシリウム (Penicillium)にお!/、てもシトリニンの生産が確認されて!、る。シト リニンの毒性はカビ毒であるアフラトキシンと比較すると低い。しかし、巿場にでている これらのシトリニン生産生物を用いて生産された製品へのシトリニンのコンタミネーショ ンが問題となっている。
[0007] モナスカスにおいて、シトリニンを含む二次代謝産物に関する培養工学的研究は 多数行われていたが、分子生物学的研究についてはあまり報告されていない。本発 明者らは遺伝子工学的手法を用いてシトリニン生合成関連遺伝子の解析を行うため に、シトリニンがポリケタイドィ匕合物であることから、モナスカスゲノムに対するポリケタ イド生合成遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、本発明者らはシトリ-ン生合 成に必須のポリケタイドシンターゼ（以下、 pksCTと称する）の同定に成功している（ 特許文献 1および非特許文献 1参照)。しかし pksCT遺伝子は全長が約 lOkbpから なり、遺伝子操作が困難であった。
[0008] 現在のところ、 pksCT遺伝子の単離には成功しており、モナスカスにおけるシトリ- ン生合成遺伝子群は、 pksCT遺伝子の周辺領域に存在して ヽる可能性があるが、 その単離、同定は未だに成功していない。
特許文献 1 :特開 2004— 321176号公報
非特許文献 1 : Applied and Environmental Microbiology, July 2005, p.3453- 3457 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、シトリニン生合成系の複数の遺伝子の転写を包括的に制御することが 出来る転写因子およびその利用方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、シトリニン生合成機構および生産制御機構の解明、および遺伝子 クラスタ一として存在すると推測されるシトリニン生合成遺伝子群の同定を行うことを 目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、ポリケタイドシンターゼ pksCTの周辺領域において、シトリ-ン生合 成遺伝子クラスターを形成すると推定される、 5っの0!^ (0 〜0 £5)を見いだした 。これらの 5つの ORFに対して相同性検索を行った結果、それぞれ、デヒドロゲナー ゼ、制御因子、ォキシゲナーゼ、ォキシドレダクターゼ、およびトランスポーターと高 い相同性を示した。本発明は、これらの ORF群力 ¾ksCTと共にシトリニン生産に関 与していることを明らかにした。
[0011] 特に上記制御因子は、 2Cys6ジンクフィンガーモチーフを有しており、転写因子で あることが推定された。そこでモナスカス'プルプレウスにおいて該制御因子を破壊し たところ、シトリニン生産が大幅に減少し、上記クラスターに属する 4つの遺伝子 (orf 3〜5および pksCT)の転写量が減少した。また上記制御因子の破壊株に上記制御 因子を再導入して発現させたところ、シトリニン生産および遺伝子転写が回復した。 以上のことから、上記制御因子がシトリニン生合成遺伝子クラスターの活性ィ匕を介し てシトリニン生産を正に調節している転写因子であることが判明した。以下、この制御 因子を ctnRと称する。
[0012] さらに、 ctnRとモナスカス'プルプレウス由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターを 、シトリニン生合成能を有さないァスペルギルス'オリザェ (Aspergillus oryzae)に導入 し、培養上清を解析したところ、シトリニンの生産が確認された。
[0013] 本発明は、配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子 を提供する。配列番号 1に示される配列は、 ctnRのコード領域力 なる cDNAの配 列である。また、本発明は、配列番号 1に示される配列にイントロンを含めた配列番号 3に示されるゲノム DNAも提供する。配列番号 3の配列はイントロンを含むが、開始コ ドンで始まり、終止コドンで終わるものである。さら〖こ、配列番号 1または配列番号 3に 相当する領域を含む遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
[0014] また、本発明は、配列番号 1に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的 な配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、 シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを 含む遺伝子を提供する。なお、本明細書および請求の範囲においてストリンジェント なノ、イブリダィゼーシヨン条件とは、特異的なハイブリダィゼーシヨンのみが起こり、非 特異的なノ、イブリダィゼーシヨンが起きな 、ような条件を 、う。このような条件としては 、 0. 7〜1. Omol/1の塩化ナトリウム存在下、 65°Cでのハイブリダィゼーシヨン、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmolZl塩ィ匕ナトリウ ム、 15mmolZlクェン酸ナトリウムよりなる）、 65°Cでの洗浄を含む条件をあげること ができる。
[0015] また、本発明には、配列番号 1に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドにおい て 1もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列から なり、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌク レオチドを含む遺伝子も含まれる。「1もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換 もしくは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により置換、 欠失、挿入、及び Zまたは付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、及び Z または付加されることを意味する。
[0016] 本発明にはまた、配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとヌクレ ォチドレベルで 60%以上の相同性を示し、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を 誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子も含まれる。相同性は 好ましくは 60%以上、さらに好ましくは、 70%以上、 80%以上、 90%以上である。配 列の同一'性は、 FASTA検索 (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Aca d. Sci. USA. 85:2444-2448)や BLASTN検索により決定することができる。
[0017] 本発明にはまた、以下の（a)または (e)のタンパク質をコードする遺伝子：
(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力 なるタンパク質、
(e)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置 換もしくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を 誘導する転写因子として作用するタンパク質、
も含まれる。
[0018] 本明細書および請求の範囲において、「1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もし くは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法によ り置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿 入、及び Zまたは付加されることを意味する。また、ここにいう「変異」は、公知の変異 タンパク質作製法により人為的に導入された変異であてもよいし、天然に存在する同 様の変異であってもよい。
[0019] 本発明によって提供される上記遺伝子は、シトリニン生産能を有する糸状菌由来で あるのが好ましぐモナスカス属カビ由来であるのがさらに好まし!/、。
[0020] 本発明は、以下の（a)または (b)のタンパク質を提供する：
(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力 なるタンパク質、
(b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置 換もしくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を 誘導する転写因子として作用するタンパク質。
ここで、「1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加」とは上記と同意である
[0021] さらに本発明には、以下の（f)のタンパク質も含まれる：
(f)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力もなるタンパク質とアミノ酸レベルで 60%以 上の相同性を示し、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として 作用するタンパク質。
ここで、相同性は好ましくは 60%以上、さらに好ましくは、 70%以上、 80%以上、 9 0%以上である。配列の同一性は上記のように、 FASTA検索（Pearson W.R. and D.J . Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444- 2448)や BLASTP検索により決 定することができる。
[0022] 本発明はまた、本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
[0023] 本発明はまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを提供する。さらに本発明 は、本発明の遺伝子または本発明の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。該 遺伝子または該組換えベクターを導入される宿主細胞は好ましくは、シトリ-ン生合 成経路を有する糸状菌の細胞である。本発明による遺伝子を担持するベクターとし ては、 pAG (Biotechnology Letters 2006 28:115- 120)などが挙げられる。また、宿主 細胞として用いられる糸状菌としては、モナスカス属カビであるモナスカス'プルプレ ウスおよびモナスカス'ピロサス、ぺ-シリウム 'シトリナム（Penicilliu citrinum)、ぺ -シ リウム*ピリディカータム（Penicilliu viridicatum)、などが挙げられる。宿主細胞は、好 ましくはモナスカス属カビであり、なかでもモナスカス ·プルプレウスが好まし！/、。 [0024] 本発明は更に、シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、本発明の遺伝子 の発現を阻害する工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を阻害する方法 を提供する。遺伝子の発現の阻害方法としては、 RNAi、遺伝子破壊などが挙げら れるが、好ましくは遺伝子発現の阻害は、当該技術分野で公知の相同的組換えによ り行う。この方法において好ましい糸状菌としては、モナスカス属カビであるモナスカ ス ·プルプレウスおよびモナスカス ·ピロサス、ぺ-シリウム ·シトリナム（Penicilliu citrin um)、ぺ -シリウム 'ピリディカータム（Penicilliu viridicatum)などが挙げられ、好ましく はモナスカス属カビであり、特にモナスカス ·プルプレウスが好ましい。
[0025] 本発明は、本発明の遺伝子の発現を阻害することによってシトリニン生合成を阻害 されたシトリニン生合成経路を有する糸状菌に、本発明の遺伝子を導入する工程を 含む、シトリニン生合成を阻害された該糸状菌においてシトリニン合成能を回復させ る方法を提供する。遺伝子の発現の阻害方法、好ましい糸状菌の例は上記と同様で ある。遺伝子の導入方法としては、プロトプラスト— PEG法、エレクト口ポレーシヨン法 、ァグロバタテリゥム法などが挙げられる。
[0026] さらに本発明は、シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、本発明の遺伝子 を導入する工程および該遺伝子を過剰発現させる工程を含む、該糸状菌におけるシ トリニン生合成を促進する方法も提供する。好ましい糸状菌、遺伝子の導入方法は 上記と同様である。本発明の遺伝子を過剰発現させる工程は、例えば、導入する遺 伝子の上流に構成的プロモーターを連結することにより、あるいは誘導可能プロモー ターに連結し、プロモーターに誘導をかけることにより達成される。
[0027] 本発明はまた、シトリニン生合成経路を有さない糸状菌に対して、本発明の遺伝子
(即ち、 ctnRをコードする遺伝子）、および、以下の（c)、（d)、（g)、および (h)から選 択されるポリヌクレオチド配列を有するシトリニン生合成遺伝子クラスターを導入する ことにより、該糸状菌においてシトリ-ンを産生させる方法を提供する；
(c)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチド；
(d)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な配列力 なる ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、本発明の ctnR をコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、 該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
(g)配列番号 4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1もしくは数個 の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発 明の ctnRをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入 されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
(h)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで 6 0%以上の相同性を示し、かつ、本発明の ctnRをコードする遺伝子と共にシトリニン 生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引 き起こすことができるポリヌクレオチド。
[0028] ここで、シトリニン生合成経路を有さない糸状菌としては、ァスペルギルス'オリザェ 、ァスペルギルス. -ドュランスが挙げられ、好ましくは、ァスペルギルス.オリザェであ る。
[0029] 「シトリニン生合成遺伝子クラスター」は、シトリニン生合成に関与する遺伝子の群を 含む二本鎖 DNAであり、その一方の鎖が、本発明によって同定された転写因子 (ct nR)、ォキシドレダクターゼ（Ord)、およびポリケタインドシンターゼ（pksCT)をコード し、その他方の鎖がォキシゲナーゼ（Oxg)およびトランスポーター（Tra)をコードす る約 25kbの遺伝子クラスターをいう（図 7を参照されたい)。上記 (d)、 （g)および (h) のポリヌクレオチド力 「ctnRをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さ ない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができ るポリヌクレオチド」であるか否かは、実施例に記載のようにして確認することが出来る 。具体的には、あるポリヌクレオチドが当該遺伝子クラスターである力否かは、該ポリ ヌクレオチドを、本発明の ctnRをコードする遺伝子とともに、シトリニン生産能を有さ ない糸状菌、例えば、ァスペルギルス ·オリザェに共導入することにより、該菌がシトリ ニン生産能を獲得し、菌体外にシトリニンを分泌するかどうかを確認することにより、 判定することが出来る。
発明の効果
[0030] 本発明は、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードする pksCT遺伝子の近傍の複 数の遺伝子をクローユングすることにより、シトリニン生合成に関与する複数の新規遺 伝子を提供する。本発明はまた、 pksCTの上流領域におけるシトリニン生合成の制 御に必須な正の転写因子を提供する。この正の転写因子を不活性ィ匕することにより シトリニン生産能が非常に低い糸状菌株を作成することができる。さらに、本発明は、 複数の遺伝子力 ¾ksCT遺伝子の周囲にシトリニン生合成遺伝子クラスターを形成し て 、ることを示す。シトリニン生合成遺伝子クラスターの存在は 、ままで報告されてお らず、本発明はシトリニン生合成機構の解明に寄与するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、クローニングされた断片の制限酵素地図である。 5.0-kb Xbal (l)-Xbal (
2)、 4.1-kb Sail Hindlll (2)、 2.6-kb EcoRI (l)-EcoRI (2)、および 2.7- kb Hindlll- Xbal (1)断片をコロニーハイブリダィゼーシヨンにより得た。 orfl、 ctnR (orf2)、 ctnA(orf
3)、 ctnB (orf4)、および ctnC (orf 5)は、デヒドロゲナーゼ、制御因子、ォキシゲナ ーゼ、ォキシドレダクターゼ、およびトランスポーターのホモログをそれぞれコードする 、同定された遺伝子を示す。 pksCTは、シトリニンポリケタイドシンターゼ遺伝子を示 す。太い矢印は位置と方向を示す。
[図 2]図 2は、推定シトリニン生合成遺伝子の転写分析を示す。 (A) RT- PCRを、示さ れた培養期間後に MC液体培地から回収した菌糸体力も抽出した RNAサンプルに 対して行った。（B) pksCT遺伝子のノザンブロット分析を示す。プライマー、 pksCT— F (配列番号 19)および pksCT—R (配列番号 20)を用いた RT-PCRによる増幅断片 をプローブとして用いた。 W：野生型株、 D : ctnR-破壊株、 E: ctnR-補完 ctnR-破 壊株； orf 1 :デヒドロゲナーゼ、 orf 2 :制御因子（ctnR)、 orf 3 :ォキシゲナーゼ、 orf 4 :ォキシドレダクターゼ、 pksCT:シトリニンポリケタイドシンターゼ、 orf 5 :トランスポ 一ター、 act:ァクチン。
[図 3]図 3は、 ctnRの遺伝子構造を示す。 ctnRの 5'および 3'末端の配列において、 矢印は転写開始および終止部位を示す。下線で示す配列は推定ポリアデニルイ匕部 位である。太い矢印は、 576-アミノ酸タンパク質（配列番号 2)をコードする 2,006 bpの ctnRゲノム DNA (配列番号 3)を示す。各イントロンは白抜き四角で示し、その上部に イントロンの大きさを示す。左端の長方形は、 Zn(II)2Cys6 DNA結合モチーフの位置 を示す。 N-末端の DNA結合モチーフの配列において大きい太字は Zn(II)2Cys6 DN A結合モチーフを構成するシスティン残基である。
[図 4]図 4は、（A)において相同組換えを介する二重乗換え（double crossover)による orf2-破壊を示し、（B)において orf2-破壊株の PCR (左側)およびサザンブロット (右側 )分析を示す。 orf2遺伝子を pReg- disからのハイグロマイシン耐性遺伝子（白抜き矢 印、 Hyg"の挿入によって破壊した。小さい矢印は PCR分析に用いた PCRプライマー 、 dis F (配列番号 23)および dis R (配列番号 24)を示す。ハイグロマイシン耐性遺伝 子の一部をサザンブロット分析のためのプローブとして用いた (Hygの下の両側に向 いた矢印)。 W:野生型株、 D : ctnR-破壊株。
[図 5]図 5は、 ctnR-破壊株および ctnR-補完- ctnR-破壊株の表現型分析である。 ( A)液体培地中での成長。成長は菌糸体の乾燥重量によって表した。野生型株（令）、 ctnR-破壊株（國）、および ctnR-補完 -ctnR-破壊株（▲)。 (B)色素生産。色素は 乾燥菌糸体から 70%エタノールにより抽出し、 500 nmにおける吸光度 (OD)をエタノー ル抽出液について測定した。野生型株（♦)、 ctnR-破壊株（園）。（C)野生型株（♦) 、 ctnR-破壊株（國)および ctnR-補完- ctnR-破壊株（▲)の間のシトリニン生産の比 較。菌糸体および菌糸体-非含有ろ液の両方におけるシトリニン含量を HPLCおよび ELISAで測定し、その和を示す。力かる実験は少なくとも 3回独立して行った。
[図 6]図 6は、インタタトな ctnRによる ctnR-破壊株の補完を示す。（A)補完ベクター p AG-regの構築のためのスキーム。 pTRPpregtにおいて、 trpCプロモーターおよびタ 一ミネ一ターに挟まれている ctnR遺伝子の発現カセットを、 pCSN44におけるハイグ ロマイシン耐性遺伝子を ctnRと置換することにより構築した。 Gateway systemによつ てカセットを pENTR-TRPpregtから pAGに移し、その結果、選択マーカーとして AurA1" を有するベクター pAG-regを得た。 (B) ctnR-補完株のサザンブロット分析。 ctnR遺 伝子の一部をプローブとして用いた (ctnRの上の両方に向いた矢印)。 Bgll-消化によ り、 pAG-reg-由来の ctnRを含む株はいずれも 1.3-kbのバンドを示す。 Sail-消化によ り、 pAG-reg-由来の ctnRを含む株はいずれも 2.2-kbのバンドを示す。一方野生型 株は 3.0- kbのバンドを示す。株 E1および E2における 2.2- kbpよりも小さいバンドは、 自 律的に存在する pAG-regにカ卩えて、ゲノムに組み込まれた pAG-regが存在することを 示す。 E4が表現型分析について選択された。 Pは陽性対照としての pAG-reg、 Wは野 生型株、 E1〜E4は、 ctnR-補完- ctnR-破壊株、 Dは ctnR-破壊株。
[図 7]図 7は、シトリニン生合成遺伝子クラスターを示す図である。図中、 ctnRは、本 発明による転写因子、 Oxgはォキシゲナーゼ、 Ordはォキシドレダクターゼ、 pksCT はポリケタイドシンターゼ、 Traはトランスポーターを示す。 ctnRは、遺伝子クラスター 内の遺伝子の転写を正に制御し、 pksCTはポリケタイド骨格の合成に関与し、ォキシ ゲナーゼおよびォキシドレダクターゼは、該ポリケタイド骨格を酸ィ匕還元により修飾し 、トランスポーターは生じたシトリニンの菌体外への排出に関与すると考えられる。
[図 8]図 8は、ァスペルギルス'オリザェへの、モナスカス'プルプレウス由来のシトリ- ン生合成遺伝子クラスターの導入を確認するサザンブロット分析の結果を示す。遺伝 子クラスターの導入が成功したァスペルギルス ·オリザェ株においては、ォキシドレダ クターゼの上に実線で示す領域をプローブとして用いたサザンプロット分析により、当 該位置に強 、バンドが確認された（レーン 4および 6、それぞれ CT1および CT3と称 される）。
[図 9]図 9は、モナスカス ·プルプレウス由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが導 入されたァスペルギルス ·オリザェ CT1および CT3、およびコントロール株における シトリニンの生産を示す HPLCの結果を示す。 CT1および CT3の!
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ヽても 、コントロール株と比較して顕著なシトリニン生産の上昇はみられな力つた。
[図 10]図 10は、モナスカス'プルプレウス由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが 導入されたァスペルギルス ·オリザェ CT3株に、さらに転写因子 ctnR遺伝子を導入 した形質転換体の作成を示す。
[図 11]図 11は、モナスカス ·プルプレウス由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターが 導入されたァスペルギルス ·オリザェ CT3に、さらに転写因子 ctnR遺伝子を導入し た形質転換体の一つである CT3 + ctnR5株は、 CT3株と比較して約 500倍のシトリ ニンを生産することを示す図である。
[図 12]図 12は、ァスペルギルス'オリザェの、コントロール株、 ctnRのみを導入した ct nR株、シトリニン生合成遺伝子クラスターのみを導入した CT株およびシトリニン生合 成遺伝子クラスターと ctnRとの両方を導入した CT+ctnR株における、シトリニン生 合成に関与する各遺伝子の転写活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0032] 以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の遣伝子
本発明は、シトリニン生合成酵素発現を促す転写因子をコードする遺伝子を提供 する。
配列番号 3に示す塩基配列は、モナスカス'プルプレウス（Monascus purpureus)か ら得られたゲノム DNAであり、本願発明者らによって配列決定されたものである。具体 的にはモナスカス ·プルプレウスから、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードする pk sCT遺伝子の隣接領域をクローユングした。 pksCTに近接する 5'-隣接領域にぉ ヽ て 4つの ORF(orfl、 orf2 (図 1において ctnRと称する）、 orf3 (図 1において ctnAと 称する）、および orf4 (図 1において ctnBと称する)）、 3'-隣接領域において 1つの O RF (orf5 (図 1において ctnCと称する)）が同定された。 orfl、 orf2、 orf3、 orf4、お よび orf5はそれぞれ、デヒドロゲナーゼ（Dehy)、制御因子（ctnR)、ォキシゲナ一 ゼ (Oxg)、ォキシドレダクターゼ (Ord:これは Oxrと称される場合もある）、およびトラ ンスポーター（Tra)のホモログに対応するものであった（図 1および図 7を参照）。
[0033] RT-PCR分析により、デヒドロゲナーゼをコードする orflをのぞくこれら ORFのすベ てが、シトリニン生産条件下で pksCT遺伝子とともに転写されていることが明ら力とな り、これら 4つの遺伝子 (それぞれ制御因子、ォキシゲナーゼ、ォキシドレダクターゼ、 およびトランスポーターをコードする orf2、 orf3、 orf4および orf5)がシトリ-ン生合 成に関与していることが示唆された。 orf 2 (ctnR)を破壊した結果、 pksCTおよび orf 5の転写が劇的に低下し、 orf 3においても明確な低下が観察され、また、 orf 4も程度 は低いが転写の低下が確認され（図 2A)、シトリニン生産は野生型株の 0.0016%まで 低下した。インタタトな ctnRを有するプラスミドを ctnR-破壊株に導入したところ、転 写およびシトリニン生産の両方が回復し、 ctnRがシトリニン生合成の主要な正の転写 因子であることが示された。
[0034] 本発明の ctnRのコード領域は、配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチ ドであるが、この部分に相当する部分が含まれる遺伝子も本発明に含まれる。また、 配列番号 1に示すコード領域にイントロンの配列を加えたゲノム DNA配列を配列番 号 3に示す。配列番号 3に示す塩基配列力 なるポリヌクレオチドは、シトリニンを生 産するモナスカス ·プルプレウスカ 従来公知の方法によって調製したゲノムライブラ リー力 得ることが出来る。
[0035] 配列番号 1に示す塩基配列力 なるポリヌクレオチドは、シトリニン生合成系遺伝子 発現を正に制御する転写因子のコード領域であると確認された。該転写因子は、 N- 末端に典型的な Zn(II)2Cys6 DNA結合モチーフを含むタンパク質である。これまで にシトリニン生合成系を包括的に制御する転写因子は全く知られておらず、本発明 の転写因子の利用によって、シトリニン生合成系の遺伝子の包括的誘導が可能とな る。
[0036] 本発明はまた、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する転写因子として作用するタ ンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ここで「転写因 子として作用するタンパク質と機能的に同等なタンパク質」とは、配列番号 2に示すァ ミノ酸配列を有するタンパク質と同等の生物学的機能、即ちシトリニン生合成系遺伝 子の発現を調節する機能を有するタンパク質を指す。シトリニン生合成系遺伝子とし ては、シトリニンポリケタイドシンターゼ (pksCT)遺伝子および、ォキシゲナーゼ、ォ キシドレダクターゼ、およびトランスポーターに対応する、 orf3、 orf4および orf5が挙 げられる。
[0037] 本発明の遺伝子には、例えば、配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは 数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列力もなるタ ンパク質をコードする変異体、誘導体、アレルバリアントおよびホモログが含まれる。
[0038] アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする遺伝子を調製するための当業者 によく知られた方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発 (site-directed muta genesis)法（Kramer, W. & Fritz, H. -J. Methods in Enzymology, 154: 350-367(1987)) が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が 変異することは、 自然界においても生じ得る。このように天然型の本発明の転写因子 (配列番号 2)を構成するアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失 もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても、天 然型の転写因子 (配列番号 2)と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本 発明の遺伝子に含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタン パク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合 (縮重変異)もあり、このような縮重変異体 も本発明の遺伝子に含まれる。本発明に含まれる遺伝子を構成する DNAの塩基の 変異数は、アミノ酸レベルにおいて、典型的には、 100アミノ酸以内、好ましくは 50アミ ノ酸以内、さらに好ましくは 20アミノ酸以内、さらに好ましくは 10アミノ酸以内（例えば、 5アミノ酸以内、 3アミノ酸以内）である。
[0039] 本発明の遺伝子を獲得する方法は特に限定されるものではなぐ一般的な方法が 採用される。例えば、該遺伝子を、それを有する生物のゲノム DNA、 cDNAライブラリ 一などから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。本発明の転写因子をコー ドする遺伝子は、ゲノム DNA、 cDNA、化学合成 DNAであってよい。ゲノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノム D NAは、例えば、対象生物力もゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターと しては、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる）を作成し、本発 明のタンパク質をコードするゲノム DNA (配列番号 3)を基に調製したプローブを用い てコロニーハイブリダィゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことに より調製することが可能である。また、ゲノム DNAは、本発明の転写因子をコードする ゲノム DNA (配列番号 3)に特異的なプライマーを作成し、これを利用した PCRを行う ことによって調製することも可會である。
[0040] 本発明の転写因子をコードする cDNAは、例えば、対象生物力も抽出した mRNAを 基に cDNAを合成し、これを λ ZAP等のベクターに挿入して cDNAライブラリーを作成 し、上記と同様に配列番号 1に基づ!/、て調製したプローブを用 、てコ口-一ハイプリ ダイゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、また、 PCRを 行うことにより調製することが可能である。
[0041] なお、本発明の遺伝子を有する生物としては、シトリ-ン産生能を有する糸状菌、 例えば、モナスカス属カビであるモナスカス ·プルプレウスおよびモナスカス ·ピロサス 、ならびに、ぺ-シリウム'シトリナムなどを挙げることができる。これらの中でも特に、 シトリニン生産性の高 、モナスカス属カビ、特に好ましくはモナスカス ·プルプレウスを 用いれば、より確実に目的の遺伝子を単離することができる。 [0042] 本発明の転写因子をコードする DNAは、例えば、シトリニン生合成系遺伝子の発現 を活性ィ匕することにより、シトリニンの大量生産に利用することができる。また、例えば 、該転写因子の発現を阻害することにより、シトリニンを作らない糸状菌の分子育種も 可能となる。
[0043] 本発明の転写因子は、 Zn(II)2Cys6 DNA結合モチーフを有するため、 Zn(II)2Cys6 型の転写因子であると考えられた。実際、モナスカス'プルプレウスにおいて、配列番 号 3に示す塩基配列を相同組換えにより破壊したところ、シトリニン生合成系遺伝子 の転写が顕著に阻害された。したがって、本発明の転写因子は、シトリニン生合成系 の遺伝子発現を活性ィ匕する転写因子である。
[0044] 次に本発明の転写因子の獲得方法について説明する。
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている糸状菌から本発 明の転写因子を獲得する場合には、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に対して 相同性のある塩基配列をデータベース中力 検索すればよい。例えば、汎用されて V、る相同性検索アルゴリズムである BLASTNによる塩基配列の相同性検索を好適に 用!/、ることができる。
[0045] また、ゲノムがデータベース化されていない糸状菌の場合には、例えば、従来公知 の DNAライブラリーを用いたハイブリダィゼーシヨン法を用いることもできる。具体的に は、適切なクローユングベクターを使用して対象となる糸状菌力 ゲノムライブラリー 又は cDNAライブラリーを調製する工程と、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部 をプローブとして用いてハイブリダィゼーシヨンを行 ヽ、ライブラリーから上記プローブ にポジティブの断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、 本発明の遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、 目的と する遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用さ れるポリヌクレオチドの長さは、 lOObp以上が好ましい。
[0046] より具体的には、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する転写因子と機能的に同等 なタンパク質をコードする遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法として は、ハイブリダィゼーシヨン技術（Southern, E.M. Journal of Molecular Biology, 98, 5 03(1975))やポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術（Saiki, R. K. et al. Science, 230, 1350 -1354(1985)、 Saiki, R. K. et al. Science, 239,487- 491(1988))を利用する方法が挙げ られる。このようにハイブリダィゼーシヨン技術や PCR技術により単離しうる本発明の転 写因子と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた本発明の遺伝子 に含まれる。
[0047] 本発明の遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジヱントな条件下でハイブ リダィゼーシヨン反応を行う。本発明にお 、てストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン 条件とは、特異的なハイブリダィゼーシヨンのみが起こり、非特異的なハイブリダィゼ ーシヨンが起きないような条件をいう。このような条件としては、 0. 7〜1. OmolZlの 塩化ナトリウム存在下、 65°Cでのハイブリダィゼーシヨン、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶 液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmolZl塩化ナトリウム、 15mmolZlクェン 酸ナトリウムよりなる）、 65°Cでの洗浄を含む条件などを指す。よりストリンジエンシー の高い条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の効率的な単離が可能となる。こう して単離された遺伝子は、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、本発明のタン パク質のアミノ酸配列 (配列番号 2)と高 、相同性を有すると推測される。高 、相同性 とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも 60%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに 好ましくは 80%以上 (例えば、 90%以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は 、 FASTA検索（Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 8 5:2444-2448)や BLASTP検索により決定することができる。
[0048] ある遺伝子が転写因子としての機能を有するタンパク質をコードする力否かは、例 えば当業者により一般的に行われているゲルシフトアツセィによって調べることができ る。具体的には、次のような方法で行うことができる。まず被検 DNAを、その遺伝子産 物が例えばこれに限定されないが、 GSTとの融合タンパク質を生成するようにべクタ 一へ組み込み、該ベクターからの融合タンパク質を発現させる。発現産物を GSTを指 標に精製し、 Zn(II)2Cys6モチーフ結合 DNA配列を含む標識した DNAプローブと混 合する。この混合液を、非変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により解析を行う 。検出されたゲル上のバンドの位置から、結合活性を評価することができる。
[0049] また、ある遺伝子がシトリニン生合成系遺伝子の発現を活性化する機能を有するタ ンパク質をコードする力否かは、例えばレポーターアツセィにより調べることができる。 具体的には、次のような方法で行うことができる。まず、シトリニン生合成系酵素の 1つ のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結させたベクターを構築する。該べク ターと、被検 DNAの遺伝子産物を発現するベクターとをレポーターアツセィ用の細胞 へ導入し、レポーター遺伝子産物の活性を測定することにより、被検 DNA遺伝子産 物の転写活性の評価を行う。該レポーターアツセィに使用することができるプロモー ターとしては、例えば上記の orf5、 pksCTの上流のプロモーターを挙げることができ る。レポーター遺伝子としては、その発現を検出し得るものであれば特に制限はなぐ 当業者が一般的に各種アツセィ系に使用するレポーター遺伝子を用いることができ る。好適なレポーター遺伝子としては、例えば、 j8 -ダルク口-ダーゼ (GUS)遺伝子を 挙げることができる。
[0050] その他にも遺伝子が転写因子としての機能を有するタンパク質をコードする力否か は、当業者に周知のサウスウェスタン法、酵母ワンハイブリッド法などを用いて判定す ることが出来る。
[0051] 本 明のタンパク皙
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によってコードされる配列番号 2に示され るアミノ酸配列力 なるタンパク質あるいは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列にお いて 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質 、もしくは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで 6 0%以上の相同性を示し、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を誘導する転写因 子として作用するタンパク質である。
[0052] また、本発明のタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公 知の HAや Flag等の付加配列を末端に含ませてもよ ヽし、融合タンパク質であっても よい。また、 N-グリコシルイ匕などの各種修飾を受けていてもよい。
[0053] 本発明による組換えベクターは、本発明の遺伝子または遺伝子断片が組み込まれ たものである。該ベクターは、公知の形質転換方法によって宿主に発現可能に導入 されること〖こよって、当該宿主にぉ 、て組み込まれた遺伝子または遺伝子断片を発 現させて本発明によるタンパク質を得ることが出来る。なお、本発明によるタンパク質 は組換え産生により得られたものでもよいし、糸状菌から単離、精製したものでもよく 、その起源は特に限定されない。
[0054] 組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする 遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形 質転換宿主細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質 は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現 させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との 融合タンパク質として調製する方法（米国 New England BioLabs社発売のベクター pM ALシリーズ)、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質として調 製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクター pGEXシリーズ）、ヒスチ ジンタグを付加して調製する方法 (Novagen社の pETシリーズ)などを利用することが 可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特 に制限はなぐ例えば、大腸菌、酵母等の真菌細胞、種々の動植物細胞、昆虫細胞 などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の 種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムィ オンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, 53, 1 58-162(1970)、 Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, 166, 557- 580(1983))を用 いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞また はその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である 。組み換えタンパク質をマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現 させた場合には、容易にァフィユティー精製を行うことが可能である。
[0055] 得られた組換えタンパク質を用いることにより、これに結合する抗体を調製すること ができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質またはその一 部のペプチドをゥサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血 ぺぃを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、 本発明のタンパク質またはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞と を融合させ、 目的とする抗体を産生するハイブリドーマを単離し、該ハイブリドーマか ら抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタ ンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタン パク質に結合する抗体が含まれる。
[0056] これらのタンパク質は、シトリニン生合成の制御に関与する転写因子として作用する ものであり、それ自体非常に有用なものである。さらに、これらのタンパク質およびこ れらタンパク質をコードする遺伝子を用いて、シトリニン生合成系の改変を行うことが 出来る。
[0057] 形皙転椽体
本発明の遺伝子を発現する形質転換体を作製するためには、本発明のタンパク質 をコードする遺伝子を所望により適当なベクターに挿入して、これを対象の宿主細胞 に導入する。
[0058] 本発明の形質転換体は、本発明の遺伝子または本発明の遺伝子を含む組換えべ クタ一が導入されたものである。より具体的に言えば、本発明の形質転換体は、本発 明による転写因子をコードする遺伝子が導入されたものである。ここで、「遺伝子また は組換えベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法により、宿主内に所 望によりベクター内に組み込まれた遺伝子が例えばプロモーターの作用により、発現 可能に導入されることを意味する。
[0059] 本発明の形質転換体は、本発明の遺伝子を直接、あるいは本発明の遺伝子が組 み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定 されるものではないが、例えば、大腸菌などの原核生物、糸状菌、酵母などの真菌、 あるいは、植物、動物などを挙げることができる。し力しながら、上記ベクターに組み 込まれた遺伝子が、糸状菌の一種であるモナスカス ·プルプレウス由来のものである ことから、上記宿主としては、糸状菌が好ましぐモナスカス属カビがより好ましく、モ ナスカス'プルプレウスが特に好ましい。なお、形質転換は一過性でもよいが、好まし くは安定に本発明の遺伝子が組み込まれるものである。
[0060] 本発明の遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーター、例えば、ァスペルギ ルス .ニドュランス由来 trpCプロモーター、ァスペルギルス ·オリザェ由来 amyBプロ モーター等の下流域に連結して使用する。なお、シトリニン生合成遺伝子群 (本発明 において、発現の促進あるいは発現の抑制を図る対象となる遺伝子）の発現を促進 するためには本発明の遺伝子をセンス方向にプロモーターに連結する。
[0061] 上記形質転換宿主細胞を含む形質転換体を作製する方法としては、具体的には、 例えば、ポリエチレングリコール法、エレクト口ポーレーシヨン法、ァグロバタテリゥムを 介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができ る。例えば、形質転換体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプ ロトプラストへ遺伝子導入し、生物体を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene T ransfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp6り— 74)、電気ノヽノレス【こ りプ ロトプラストへ遺伝子導入し、生物体を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physi ol. 100, 1503-1507)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、生物体 を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957- 962.)およびァグロ バタテリゥムを介して遺伝子を導入し、生物体を再生させる方法 (Hiei et al. (1994) PI ant J. 6: 271-282.)などを挙げることができる力 特に限定されるものではない。また、 上記形質転換方法は、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択されることが好まし い。
[0062] 本発明にお 、て使用することができるベクターとしては、従来力 細菌、真菌などの 形質転換に使用されているベクター、例えば、 pET3d、 pCSN44等を挙げることが できる。そして、本発明のベクターは、本発明の遺伝子またはその断片の他に、従来 公知の遺伝子を発現させるための構成的プロモーター、例えば、ァスペルギルス '二 ドュランス由来 trpCプロモーター、または発現誘導性プロモーター、例えば、ァスぺ ルギルス ·オリザェ由来 amyBプロモーター、そして形質転換体の選抜を容易にする 薬剤耐性遺伝子、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを含んでいるのが好まし い。
[0063] 転写因子 ctnRの発現の阻害によるシトリニン生産の阻害、 ctnRの導入によるシトリ ニン生産の回復、 ctnRの導入によるシトリニン生産の促進
本発明の遺伝子の発現が抑制された形質転換体を作製する場合には、実施例に 記載のように当業者に周知の相同的組換えを用いればよい。相同的組換えとは、欠 損もしくはマーカー遺伝子等の挿入により機能必須部位を欠落もしくは分断された遺 伝子を作成するために、欠落もしくは分断部位の両側に存在する相同な領域による 遺伝子組み換え反応を利用した遺伝子破壊法を ヽぅ。
[0064] 遺伝子発現の抑制には、相同的組換えの他に、 RNAi法を用いることができる。 RNA iに用いる配列は、標的遺伝子 (本発明にお 、ては ctnR遺伝子）の配列と完全に同 一である必要はないが、少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98%以上 (例えば、 99%以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記し た検索を利用して決定することができる。
[0065] 本発明の転写因子 ctnRを、例えば、シトリニン生産能を有する糸状菌において、 例えば相同的組換えにより破壊することにより、シトリニン生産能が非常に阻害されて V、る力、あるいはまったくシトリニンを生産しな 、糸状菌を得ることができる。
[0066] さらに、上記のように ctnRが破壊された糸状菌に、本発明の ctnRをコードする遺 伝子を導入することにより、 ctnRが破壊された糸状菌におけるシトリニン生産能が回 復する。
[0067] さらに、 ctnR遺伝子を、 ctnRが過剰発現するようなプロモーター（例えば、ァスぺ ルギルス'オリザェ由来 amyBプロモーターなど）を含むベクターに組み込んで、例え ば糸状菌に導入することにより、 ctnRが過剰発現するとともに、 ctnRによって転写制 御されるシトリニン生合成系の酵素 (例えば pksCT)を大量生産することができ、それ ゆえ該糸状菌におけるシトリニン生合成が促進される。
[0068] 本発明の ctnRの破壊によるシトリニン生合成の阻害、 ctnRの再導入によるシトリ- ン生合成の回復、および ctnRの過剰発現によるシトリニン生合成の促進において用 いられる、シトリニン生合成経路を有する糸状菌としては、モナスカス属カビであるモ ナスカス ·プルプレウスおよびモナスカス ·ピロサス、ならびにぺ-シリウム ·シトリナム が挙げられ、好ましくはモナスカス属カビ、特に好ましくはモナスカス ·プルプレウスで ある。
[0069] シトリユン牛.合成経路を有さない ¾糠糸状菌に針するシトリユン牛. 能の付与
本発明による転写因子である、 ctnRをコードする遺伝子と、シトリニン生合成経路 を構成する遺伝子クラスター（図 7参照）をシトリニン生合成経路を有さない異種糸状 菌に共導入することにより、該異種糸状菌はシトリニン生産能を獲得することが出来る [0070] シトリニン生合成経路を構成する「遺伝子クラスター」とは配列番号 4に示される塩 基配列からなるポリヌクレオチドである力、あるいは、
(d)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な配列力 なる ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、本発明の ctnR をコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、 該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
(g)配列番号 4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1もしくは数個 の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発 明の ctnRをコードする遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入 されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド；
(h)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで 6 0%以上の相同性を示し、かつ、本発明の ctnRをコードする遺伝子と共にシトリニン 生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該糸状菌におけるシトリニン生産を引 き起こすことができるポリヌクレオチド；
のいずれかである。
[0071] ctnR遺伝子とかかる遺伝子クラスターを共に、シトリニン生合成経路を有さない異 種糸状菌に導入することにより、該糸状菌はシトリニン生合成能力を獲得する。かか るシトリニン生合成経路を有さない異種糸状菌としては、ァスペルギルス · -ドュランス 、ァスペルギルス ·オリザェが挙げられ、好ましくは、ァスペルギルス ·オリザェ (Asperg lllus oryzae)である。
[0072] 共遺伝子導入は、従来公知の方法、例えば、プロトプラスト一 PEG法、エレクトロボ レーシヨン法、によって達成できる。
[0073] 共遺伝子導入に用いるベクターとしては、例えば、 ctnRの導入には pNR10、シトリ ニン生合成遺伝子クラスターの導入には cosSCが例示される。
[0074] 共遺伝子導入に用いるプロモーターは、例えば、ァスペルギルス'ニドュランス由来 trpCプロモーターが例示される。
[0075] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。 実施例
[0076] [実施例の概略]
モナスカス.プルプレウス（Monascus purpureus)から、シトリニンポリケタイドシンター ゼをコードする pksCTの隣接領域 21-kbpをクローユングした。 pksCTに近接する 5'- 隣接領域において 4つの ORF(orfl、 orf2、 orf3、および orf4)、 3し隣接領域におい て 1つの ORF (orf5)が同定された。 orfl、 orf2、 orf3、 orf4、および orf5はそれぞ れ、デヒドロゲナーゼ、制御因子、ォキシゲナーゼ、ォキシドレダクターゼ、およびトラ ンスポーターのホモログをコードするものであった。
[0077] RT-PCR分析により、デヒドロゲナーゼをコードする orflをのぞくこれら ORFのすベ てが、シトリニン生産条件下で pksCT遺伝子とともに転写されていることが明ら力とな り、これら 4つの遺伝子（orf 2、 orf3、 orf4および orf5)がシトリニン生合成に関与して いることが示唆された。 orf2 (2,006 bpであり、 4つのイントロンを有する（配列番号 3)) は N-末端に典型的な Zn(II)2Cys6 DNA結合モチーフを含む 576-アミノ酸のタンパク 質をコードしており、 ctnRと称することとした。 ctnRを破壊した結果、 pksCTおよび 推定シトリニン生合成遺伝子の 1つ (orf5)の転写が劇的に低下し、シトリニン生産は 野生型株の 0.0016%まで低下した。また、 orf3の転写も在る程度低下し、 orf4の転写 も程度は低 ヽが低下した。インタタトな ctnRを有するプラスミドを ctnR-破壊株に導 入したところ、転写およびシトリニン生産の両方が回復し、 ctnRがシトリニン生合成の 主要な正の転写因子であることが示された。
[0078] Zn(II)2Cys6モチーフを有する制御因子は、糸状菌における転写因子のもっとも大 きなクラスの一つを形成し、通常、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae)由来の GAL 4によって例証されているように、正の転写因子として作用する (Todd, R. B., and A. Andrianopoulos. 1997. Evolution of a fungal regulatory gene family: the Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388—405)。多数の Zn(II )2Cys6制御因子が真菌において同定されており、一次代謝、二次代謝、薬剤耐性、 または減数分裂についての制御因子であるとして特徴づけられている。かかる制御 因子はその N末端の Zn(II)2Cys6 DNA結合モチーフ（CX CX CX CX CX C、 C;シス
2 6 6 2 6 ティン残基、 X；アミノ酸)により標的遺伝子のプロモーター領域における特異的結合 部位 (CGGN CCG、 N;ヌクレオチド)に結合する。糸状菌における二次代謝産物に
6-11
関する以前の研究により、いくつかの遺伝子クラスターがこのタイプの制御因子遺伝 子を含み、該制御因子が生合成クラスターにおける複数の遺伝子を同調発現させて いることが明らかになつている (Walton, J. D. 2000. Horizontal gene transfer and the evolution of secondary metabolite gene clusters in fungi: An hypothesis. Fungal en et. Biol. 30: 167171)。
[0079] 本発明者らは、シトリニンポリケタイドシンターゼをコードする pksCTの近傍の複数 の遺伝子をクローユングし、シトリニン生合成に関与する複数の新規遺伝子を得た。 本発明者らは pksCTの上流領域におけるシトリニン生合成の制御に必須な正の転 写因子の獲得に成功し、この正の転写因子の不活性ィ匕により非常にシトリニン生産 能が低い株を作成できることを証明した。さらに、本発明は、複数の遺伝子が pksCT 遺伝子の周囲にシトリニン生合成遺伝子クラスターを形成している可能性を示す。シ トリニン生合成遺伝子クラスターの存在はいままで報告されておらず、本発明はシトリ ニン生合成機構の解明に寄与するものである。
[0080] [材料および方法]
株、培養条件および形質転換
モナスカス 'プルプレウス（Monascus purpureus)野生型株である NBRC30873は、モ ナスカス培養 (MC)固体培地（グルコース (50 g/l)、ポリペプトン（7.5 g/l)、 NH H PO (
4 2 4
2.0 g/l)、 MgSO 7H O (0.5 g/l)、 CaCl 2H O (0.1 g/l)、 KNO (2.0 g/l)、および寒天 (
4 2 2 2 3
20.0 g/1)からなる）のプレート (2%寒天)で 28°Cで 7-10日間培養した。液体培養のため に、菌糸体マット (約 1 cm2の四角片)を寒天プレートから取り出し、 500-ml三角フラス コ中の 100 mlの MC液体培地に接種し、 120 spmで往復振盪しながら 28°Cでインキュ ペートした。モナスカス'プルプレウスの形質転換は、 Shimizu et al. (Shimizu T.， H. K inoshita, S. Ishihara, K. Sakai, S. Nagai, and T. Nihira. 2005. Polyketide synthase ge ne responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. Appl. Environ. Micr obiol. 71: 3453- 3457および Shimizu T.， H. Kinoshita, and T. Nihira. 2005. Develop ment of transformation system in Monascus purpureus using an autonomous replicati on vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett, in press)に 載の ように行った。
大腸菌における遺伝子操作のために、大腸菌 XLIO-Gold (登録商標） Ultracompe tent Cells (Stratageneゝ La Jollaゝ CA USA)および Library Efficiency (登録商標） DB3. 1 Competent Cells (Invitrogen、 Carlsbad, CA USA)をクロー-ング用宿主として用い た。
[0081] コロニーハイブリダィゼーシヨン
サザンブロット分析により、 4つの断片、即ち、 5.0- kb Xbal (1)- Xbal (2)、 4.1- kb Sail -Hindlll (2)、 2.6— kb EcoRI (1)— EcoRI (2)、および 2.7— kb Hindlll (1)— Xbal (1)が、プ ローブとしての 750- bp EcoRI (3)- EcoRV、 820- bp Sail - Sacl (2)、 960- bp Xbal (l)-Ec oRI (2)、および 1.6-kb EcoRI (l)-SacI (1)断片、にそれぞれハイブリダィズすることが 示された（図 1参照)。モナスカスゲノム DNAを各制限酵素で消化し、 1%ァガロースゲ ルで電気泳動した。次いで、対応する領域を抽出し、 pUC19のマルチクローニンダサ イトにサブクロー-ングし、個々の部分ゲノムライブラリーを構築した。各ライブラリー から、 2000コロニーを選択した。陽性クローンを各プローブを用いたコロニーハイブリ ダイゼーシヨンにより同定した。
[0082] 配列分析
クロー-ングした DNA断片を DNAの両鎖について配列決定し、 DDBJホモロジ一 サーチシステムの BlastXプログラムにより分析した (httD：〃 www.ddbi.nig.ac.iD/E- mail /homology- i.htmlL
[0083] RT-PCR
全 RNAを RNeasy (登録商標） Mini Kit (Qiagen K. 、 Tokyo, Japan)を用いて抽出し 、 DNaselで処理して混入しているゲノム DNAを除いた。 cDNAを Superscript™ III RNa se H Reverse Transcriptase (Invitrogen) 用 ヽて合成した。 Pし！？反 J ^、にお ヽ飞、増 幅条件は、 25サイクルの、変性 (95°C30秒)、アニーリング (55°C30秒)、および伸長（72 °C2分)、そして最後の 1回の伸長 (72°C4分)であった。用いたプライマーを表 1に示す
[0084] [表 1] 表 1 ：使用したプライマー 名称 配列 a (5'→3') 配列番号 act F GGAATTCTGCAGATTCTACAACGAACTCCG 5 act R GGAATTCTGCAGTCAGGGAGTTCATAGGAC 6 amp F GTAGATAACTACGATACGGG 7 amp R TATGTGGCGCGGTATTATCC 8 hph F GGGGTACCCTTCTGATCGAAAAGTTCGAC 9 hph R GGGGTACCCCTCTGATAGAGTTGGTCAAG 1 0 dehy F TAGCATCTACTCCAGCGTGA 1 1 dehy R TCGGGTAAAGATCTTTGTGC 1 2 reg F AAACTACGCTGTGACGGACA 1 3 reg R TAACTGCACCAGACGAAACG 1 4 oxg F TGCACCTCTACAGGGTTATT 1 5 oxg R TCTGCTCATCATATCTCCA 1 6 oxr F TAATGCTGCCATCTTCCAAG 1 7 oxr R ATACGCAACGAGCGAGACAT 1 8 pksCT F CCAGTGTGGCTATTCACC 1 9 pksCT R CCTAAGGACATTACTCTT 2 0 tra F TGACCATCTGGGTAACCTTC 2 1 tra R GAGATGAGTCGACGATGAAG 2 2 dis F ACACGGAAGAGATCCAAGCA 2 3 dis R AGAGATGAATCACACTCGCC 2 4 a 下線部は Ecomおよび Pstl 制限部位を示す サザンおよびノザンブロット分析 サザンおよびノザンブロット分析は実質的に Sambrook et al. (Sambrook J., E. F. Fr itsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.)の方法にした力 Sつて行つ た。サザンプロット分析については、ゲノム DNA (20 μ g)を制限酵素で一晩消化し、 1 .0%ァガロースゲル電気泳動によって分離し、 Hybond N+メンブレン (Amersham Bios ciences Corp. 800 Centennial Ave、 Piscataway、 NJ 08855 USA)にトランスファーした 。ノザンブロット分析については、全 RNA (8 μ g)を 1 %ァガロース-ホルムアルデヒド ゲルで分離した。プローブは Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 (Takara Bio、 Otsu、 Japan)を用いて [ a - 32P] dCTPにより標識した。
[0086] pReg-disベクターの構築
2.0-kb Sphl-Xbal断片および 2.0-kb Sall-Hindlll断片（図 4参照)を T4 DNAポリメ ラーゼで処理し、 pCSN44 [Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/)l (S taben. C, B. Jensen, M. Singer, J. Pollock, M. Schechtman, J. Kinsey, and E. Selke r. 1989. Use of a bacterial hygromycin B resistance gene as a dominant selectable m arker in Neurospora crassa transformation. Fungal. Genet. Newsl. 36:79-81)の平滑 末端 Xholおよび EcoRV部位にそれぞれ挿入した。該コンストラクトは、ハイグロマイ シン- B-耐性遺伝子を選択マーカーとして含んでおり、その両側に 2.0-kb Sphト Xbal 断片および 2.0-kb Sall-Hindlll断片が位置しており、このベクターを pReg-disと称す ることとした。
[0087] pAG-regベクターの構築
ベクター pAG-regの構築の際、いくつかの制限酵素部位を T4 DNAポリメラーゼで 処理した;かかる部位を図 6において星印 (*)で示す。 Sail消化の前に、ベクター PCS N44を BamHIによる部分的消化に供し、次いで T4 DNAポリメラーゼで処理した。 pCS N44由来の trpCプロモーター、ターミネータ一、およびハイグロマイシン而性遺伝子 を含む、 2.1-kb Sall-BamHI*断片を電気泳動後にァガロースゲル力も抽出し、ベクタ 一 pUC19の Sailおよび BamHI*部位に挿入した (pTRPpt)。 pTRPptを Clal*および Bam HI*での消化により直鎖化し、制御因子遺伝子を含む 2.4-kb ApaLI*-NdeI*断片に ラーゲーシヨンした（pTRPpregt)。該ベクターは、 pUC19における trpCプロモーター およびターミネータ一を有する。 trpCプロモーターおよびターミネータ一の間に挟ま れた制御因子遺伝子を含む 3.4-kb HindIII*-SmaI*断片を pTRPpregtから単離し、 p ENTR11 (Invitrogen)中の EcoRI*部位に挿入した (pENTR-TRPpregt)。 pENTR- TRPp regtおよびオーレォバシジン Affif性をモナスカス ·プルプレウスに付与する選択マー カーとして AurA1"を有するベクター pAG (Shimizu T.， H. Kinoshita, and T. Nihira. 20 05. Development of transformation system in Monascus purpureus using an autonom ous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett, in pres s.)を用いて、 Gateway system (Invitrogen)による組換え反応を介してベクター pAG- r egを構築した（図 6A)。
[0088] 色素およびシトリニン生産の分析
菌糸体および菌糸体非含有ろ液におけるシトリニンおよび色素の量を Shimizu et al . (Shimizu T., H. Kinoshita, S. Ishihara, K. Sakai, b. Nagai, and T. Nihira. 2005. Pol yketide synthase gene responsiole for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus. Appl. Environ. Microbiol. 71: 3453- 3457.および Shimizu T.， H. Kinoshita, and T. Ni hira. 2005. Development of transformation system in Monascus purpureus using an a utonomous replication vector with aureobasidin A resistance gene. Biotechnol. Lett, in press.)の記載にしたがって測定した。
[0089] [転写因子 ctnRおよびシトリニン生合成遺伝子クラスター同定]
モナスカス ·プルプレウスにおける pksCT-隣接領域のクロー-ングおよび配列分 析
シトリニン生合成における制御機構を調べるために、 pksCTを含む 21,917-bp断片 (配列番号 4)を 4ラウンドのゲノム歩行によってクローユングし、その配列を決定した（ 図 1) (DDBJ登録番号 AB243687)。配列分析およびデータベース検索により、この領 域は pksCTに加えて、 5つの推定 ORF(orfl、 2、 3、 4および 5)を含むことが明らかと なった。 orfl、 2、 3、 4および 5はそれぞれ、デヒドロゲナーゼ、制御因子、ォキシゲ ナーゼ、ォキシドレダクターゼおよびトランスポーターとの類似性を示す産物をコード するものであった (表 2)。表 2および図 1中、 ctnRは orf2、 ctnAは orf3、 ctnBは orf4 、 ctnCは orf5にそれぞれ対応する。 [0090] [表 2] 表 2 ：推定 ORFの配列分析 サ 1ズ アミノ酸レベル
^ 推定機能 a 相同タンパク質 生物 （bp) での類似性
(a. a.c) (%)
グリシンべタイン Slaphviococcus 150ο
orfl デヒ ドロゲナ一ゼ ァル亍'ヒ ド 37
デヒ ドロゲナ一ゼ xylosus 501
Nectria 1731
ctnR 転写; 性化因子 二核性 Zti転写因子 27
haematococca 576 ォキシドレダクターゼ Aspergmus 990
ctnA ォキシゲナ一ゼ 2DS— 1 ) 36
ォキシゲナーゼ
― fumig tus 329
Penicillium 942
ctnB ォキシドレダクタ一ゼ す 、ノ ' 26
レヌクタ— t
citrim'm 313 Candida 1566
ctnC トランスポーター ―、 ， 34
/fv―タ—
albicans 521
3コードされる各タンパク質の機能は S高の類似性を示すタンパク質の機能から推定した。
fcORFおよびァミノ酸配列は配列分析により推定した。 ca. a.はァミノ酸残基数を示す。
[0091] 5つの ORFの転写パターンを、シトリニン生産条件下で 2、 4、または 6日間培養され た菌糸体力も調製した RNAサンプルに対する RT- PCRにより調べた。以前に測定され たように、 pksCT遺伝子は、野生型株においてシトリニン生産が開始される時期であ る、培養の 2日目に転写されていた (図 2— A)。さらに、 4つのその他の候補遺伝子（ 制御因子をコードする orf2、ォキシゲナーゼをコードする orf3、ォキシドレダクターゼ をコードする orf4およびトランスポーターをコードする orf5)の転写産物は、 pksCT遺 伝子転写と同様のパターンで培養 2日目から検出されたのに対し、 orfl遺伝子の転 写は検出されなかった。
推定制御因子 ctnRの特徴付け
pksCT遺伝子の上流に位置する orf2遺伝子は、 Zn(II)2Cys6二核性クラスター D NA-結合タンパク質のメンバーと有意な類似性を示した (Todd, R. B., and A. Andrian opoulos. 1997. Evolution of a lungal regulatory gene family: the Zn(II)2し ysり binucle ar cluster DNA binding motif. Fungal Genet. Biol. 21: 388—405)。力力る Zn(II)2Cys6 タンパク質は、該制御因子遺伝子が二次代謝産物のクラスター内に位置する場合、 一般に生合成遺伝子クラスターのその他のメンバーに対する正の転写因子として作 用する (Abe, Y., C. Ono, M. Hosobuchi, and H. Yoshikawa. 2002. Functional analy sis of mlcR, a regulatory gene for ML- 236B (compactin) biosynthesis in Penicillium c itrinum. Mol. Genet. Genomics. 268: 352—361. ； Chang, P. K., K. C. Ehrlich, J. Yu, D. Bhatnagar, and T. E. Cleveland. 1995. Increased expression of Aspergillus parasi ticus aflR, encoding a sequence-specific DNA— Dinding protein, relieves nitrate inhibi tion of aflatoxin biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol.り 1: 2372- 2377および Ehrlich , K. C, B. G. Montalbano, and J. W. Cary. 1999. Binding of the C6— zinc cluster pr otein, AFLR, to the promoters of aflatoxin pathway biosynthesis genes in Aspergillu s parasiticus. Gene. 230: 249-257)。これにより、 orf2力 モナスカスにおけるシトリ- ン生合成を制御して ヽることが示唆される。 ctnR転写産物の詳細な構造を推測する ために、 5しおよび 3し RACEを 6日間培養した菌糸体からの mRNAに対して行った。 X bal (1)- Xbal (2)断片における Xbal (1)部位の 12ヌクレオチド (nt)下流の残基 Aを転 写開始部位 (tss)であると同定した。開始コドン、終止コドン、およびポリアデ-ルイ匕部 位（AATAAA)は、それぞれ tssの下流の 126 nt、 2,005 nt、および 2,048 ntに位置して いた。 4つのイントロンの存在は典型的なスプライシング部位（5し GT-AG-3')の存在 力 推定した。 ctnR遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を配列番号 1に、 ctnRタ ンパク質のアミノ酸配列を配列番号 2に、イントロンを含めたゲノム ctnR遺伝子のヌク レオチド配列を配列番号 3にそれぞれ示す。 RT-PCR,次いで配列決定により、それ らイントロンは tssから開始して、 nt 238〜296、 571〜622、 1131〜1206、および 1696〜 1783にあることが確認された (図 3) (DDBJ登録番号 AB243687)。
[0093] orf2の遺伝子破壊
orf 2のインビボでの機能を分析するために、ベクター pReg-dis (図 4— A)を用いる 相同組換えによって orf 2-破壊株を作成した。それによつて orf 2の、 DNA結合 Ζη(Π)2 Cys6モチーフを含む主要な部分が欠損した。そのため orf2-破壊株では標的遺伝 子の発現を活性ィ匕することが出来な力つた。 orf 2座位の組換えが正確であるかを、 P CRおよびサザンブロット分析により確認した (図 4 B)。
[0094] orf 2-破壊株 (即ち ctnR破壊株）は成長（図 5— A)または色素生産 (図 5— B)のい ずれについても野生型株との有意差を示さなカゝつた。しかし、培養期間中、 orf2-破 壊株のシトリニン生産 (図 5— C)は劇的に低下した (フラスコあたりのシトリニンは 100 ng 未満となった)。これとは対照的に、野生型株によるシトリニン生産は良好に進行した（ 培養 10日目にフラスコあたりのシトリニンは 1930 μ gであった)。これ〖こより、 orf 2遺伝 子産物はシトリニンの有効な生産に必須であることが示唆された。即ち、 ctnR遺伝子 破壊により、モナスカスにおけるシトリニン生産を著しく抑制できることが明らかになつ た。
[0095] 転写分析を行ったところ、 orf2遺伝子とシトリニン生産との相関関係が明らかにな つた。 pksCT遺伝子についてのノザンブロット分析により、 orf 2-破壊株における pks CT転写産物は劇的に低下していることが示され（図 2— B)、この結果は、 orf2遺伝 子産物がシトリニン生合成に関与することを明確に示した。
[0096] さらに、 pksCT遺伝子の周辺の遺伝子についての orf2-破壊株の RT-PCR分析に おいて、 orf 5遺伝子および orf 3遺伝子の転写産物は、 pksCTとともに低下し、 orf 4 の転写産物は程度は低いが低下した (図 2— A)。これらの結果は、アフラトキシン生 合成クラスターにおける AflRの場合と同様に (Ehrlich, K. C, B. G. Montalbano, and J . W. Cary. 1999. Binding of the Cり— zinc cluster protein, AFLR, to the promoters of aflatoxin pathway biosynthesis genes in Aspergillus parasiticus. Gene. 230: 249—257 )、 orf2遺伝子産物（ctnR)は、 pksCT、 orf 3, orf 4および orf 5に対する正の転写 因子として作用することを示唆し、 pksCTおよび orf3〜5のプロモーター領域におい て保存された配列は見いだされていないが、これはおそらぐこれら遺伝子のそれぞ れの上流領域における特異的結合部位に対する orf 2遺伝子産物（ctnR)の結合に よる。
[0097] ctnR-破壊株における ctnR遺伝子発現
ctnRがシトリニン生合成における正の転写因子として作用することを証明するため に、構成的 trpCプロモーターの制御下にある ctnRのインタタトな一つのコピーを、自 己複製ベクターによって ctnR-破壊株に導入した (図 6-A)。プラスミド上に単独のィ ンタタトな ctnRを含む形質転換体 (株： E3および E4、図 6— B)またはさらなる ctnRを ゲノムに組み込まれた形態として含む形質転換体 (株： E1および E2)を得、前者をさら なる分析に用いた。前者、即ち、 ctnR-破壊株に 1コピーの ctnRを有する株を、 ctn R-補完株と称する。
[0098] 野生型株と ctnR-破壊株との間で培養期間中成長における有意差は観察されなか つたが、 ctnR-補完株はわずかな成長の低下を示した。 ctnR-破壊株とは全く対照 的に、 ctnR-補完株ではシトリニン生産能が回復していた。ただしシトリニン生産の程 度は野生型株よりわずかに低力つた（ctnR-補完株は培養 10日目で 1649 μ g/フラ スコ、野生型株は培養 10日目で 1930 g/フラスコ)。
[0099] さらに、 ctnR-補完株において、 RT-PCRにより検出される、 orf5、 pksCT、および orf3遺伝子の転写レベルは野生型株に匹敵するものであった (図 2)。また、 ctnR— 補完株において orf4の転写の増加が観測された。これら結果により、 ctnRがモナス カス'プルプレウスにおけるシトリニン生合成の正の転写因子であることが結論される
[0100] orf2 (ctnR)以外の ORFによりコードされるタンパク質は、ォキシゲナーゼ（orf3)、 ォキシドレダクターゼ（orf4)、およびトランスポーター（orf5)である。ォキシゲナーゼ およびォキシドレダクターゼの存在は、シトリニン生合成の提案されている経路に対 応する (図 7)。シトリニン生合成においては、シトリニンポリケタイド骨格の形成後のい くつかの工程において酸ィ匕および還元が必須である。推定されるトランスポーター (or f 5)はカンジダ 'アルビカンス (Candida albicans)の FLU1タンパク質のホモログである（ Calabrese, D., J. Bille, and D. Sanglard. 2000. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLUl) conferring res istance to fluconazole. Microbiology. 146: 2743—2754.)。した力 Sつて、 orf5はシ卜ジニ ンの細胞内蓄積を妨げるためのトランスポーターとして作用していることが示唆される
[0101] 転写分析もまた、 orf3、 orf4および orf5の産物力 シトリニン生合成経路に寄与し ていることを示唆した。というのはそれらの転写産物がシトリニン生産条件下で検出さ れ、 ctnR-破壊力 ¾ksCT遺伝子と同様にこれらの orfの転写に影響して!/、たからであ る（図 2A)。これらの結果は、 pksCT、 ctnR、 orf3、 orf4および orf5がシトリ-ン生合 成遺伝子クラスターを形成すると!ヽぅ仮説を支持する。
[0102] 本発明者らは、シトリニン産生菌における正の転写因子をコードする遺伝子を含む シトリニン生合成遺伝子クラスターの存在を初めて見いだした。
[0103] 以上のデータから、図 7に示すように、モナスカスにおけるシトリニン生合成は、初期
Figure imgf000033_0001
、てポリケタイド骨格の形成のために pksCTが働き、次 、でォキシゲナー ゼ（Oxg)やォキシドレダクターゼ（Ord) t\、つた酸化還元酵素が作用してシトリニン が合成され、産生したシトリニンはトランスポーター (Tm)により菌体外へと排出される と結論される。そしてこれら生合成酵素群によるシトリニン生産を ctnRが正に調節し ていると考えられる。
[0104] [ァスペルギルス'オリザェ（Aspergillus oryzae)への ctnRおよびシトリ-ン生合成遺 伝子クラスターの導入]
次に、本発明者らは生理活性物質の生産'遺伝子解析、有用物質の大量生産を可 能とするため、糸状菌における異種遺伝子発現系の構築を試みた。この実施例にお いて、宿主としてはァスペルギルス'オリザェ（Aspergillus oryzae) NS4株を用い、異種 遺伝子群としては、モナスカス'プルプレウス（M.purpureus)由来のシトリニン生合成 遺伝子群を用いた。
[0105] M. purpureusゲノム DNAを Sau3AIで部分分解し、 20kb〜50kbの長さの断片をァ ガロースゲル電気泳動により分離、回収した。得られた DNA断片を Supercoslコスミ ドベクター（Stratagene)の BamHIサイトにライゲーシヨン後、 Gigapack III XLパッケ一 ジングェクストラクト（Stratagene)を用いてパーケージングを行った。得られた 4000個 のコロニーより、 KS、 LC5プライマーにより増幅した 430bpからなる pksCTの一部を プローブとしたコロニーハイブリダィゼーシヨンにより、ポジティブクローンを選択した。 得られたポジティブクローンがシトリニン生合成遺伝子クラスター全てを含むかを pks CT、 orf！〜 oriSそれぞれに特異的なプライマーを用いた PCRにより確認し、 Supercos CT-lクローンがクラスター全てを含んでいることを確認した。表 3において、 Dehy-f および- rはデヒドロゲナーゼ遺伝子、 Reg-1¾よび- rは ctnR遺伝子、 0xg-¾5よび r はォキシゲナーゼ遺伝子、 Oxd-l¾よび rはォキシドレダクターゼ遺伝子、 KSおよび L C5は pksCT遺伝子、 Tra-1¾よび rはトランスポーター遺伝子の存在をそれぞれ確認 するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。表にお!、て下線を付した配列は Kpn I部位を示す。
[表 3]
プライマー 配列（5'-3') 配列番号
Dehy - f GGGGTACCCTAGCATCTACTCCAGCGTGA 2 5
Dehy - r GGGGTACCCTCGGGTAAAGATCTTTGTGC 2 6
Reg - f GGGGTACCCAAACTACGCTGTGACGGACA 2 7
Reg - r GGGGTACCCTAACTGCACCAGACGAAACG 2 8
Oxg - f GGGGTACCCTGCACCTCTACAGGGTTCTT 2 9
Oxg - r GGGGTACCCTCTGCTCATCATATCTCCCA 3 0
Oxd - f GGGGTACCCTAATGCTGCCATCTTCCAAG 3 1
Oxd - r GGGGTACCCATACGCAACGAGCGAGACAT 3 2
KS G GGG TACC CCCA GTG TGGCT ATTC ACC 3 3
LC5 GGGGTACCCAAGAGTMTGTCCTTAGG 3 4
Tra - f GGGGTACCCTGACCATCTGGGTAACCTTC 3 5
Tra - r GGGGTACCCATACGCAACGAGCGAGACAT 3 6
大腸菌-ァスペルギルス'シャトルコスミド An26(Fungal Genetics Stock Center, Kans as City, Missouri)を Smal、 Xbalで切断することによりハイグロマイシン而性遺伝子を 取り除き、そこに pUSCから Pstl処理、 T4 DNA polymerase処理を行った 3. 25kpの硫 酸塩資化性を付与する sC遺伝子を組込み CossCを構築した。 Supercos CT-1を Bam HIにより部分分解し、 20kb〜50kbの長さの断片をァガロースゲル電気泳動により分 離し、 CossCの BamHIサイトにライゲーシヨンし、 Gigapack III XLパッケージングエタ ストラタト（Stratagene)を用いてパーケージングを行った。上述した方法により、得られ たコスミドが、シトリニン生合成クラスター全長を含んでいることを確認した。得られた コスミドは、図 8に示すように、モナスカス'プルプレウス（M.purpureus)由来の、シトリ ニン生合成遺伝子クラスター、即ち、 ctnR (orf2)、ォキシゲナーゼ (orf3)、ォキシド レダクターゼ（orf4)、 pksCT (シトリニンポリケタイドシンターゼ）、トランスポーター（or f5)を含んでおり、このコスミドを用いて 21917bp (配列番号 4)を含む領域を、シトリ ニン生合成経路を有さないァスペルギルス'オリザェ（Aspergillus oryzae) NS4株に導 入し、簡易的に KS、 LC5プライマーにより pksCTの一部 430bpを増幅させることによ り遺伝子の導入を確認した。シトリニン生合成遺伝子クラスタ一は、コスミドに挿入し、 菌株への導入はタカラバイオ社のピリチアミン耐性を利用したプロトプラスト一 PEG形 質転換法に基本的に従って行ったが選択培地には sCもしくは sCD (CD + 0.8% NaCl) を用いた。
[0107] 図 8の下パネルは、形質転換されたァスペルギルス.オリザェ（Aspergillus oryzae) N S4株における、遺伝子クラスターの存在を示すサザンブロットの結果を示す。サザン ブロット分析は実質的に Sambrook et al. (Sambrook J., E. F. Fritsch, and T. Maniati s. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.)の方法にしたがって行った。具体的には、ゲ ノム DNA (20 μ g)を制限酵素 Sac IIでー晚消化し、 1.0%ァガロースゲル電気泳動に よって分離し、 Hybond N+メンブレン (Amersham Biosciences Corp. 800 Centennial Ave, Piscataway、 NJ 08855 USA)にトランスファーした。プローブは、図 8の遺伝子ク ラスターの模式図の上に実線 (ォキシドレダクターゼの上にある小さい実線)で示す。 プローブはォキシドレダクターゼの一部をプライマー Oxd-ifeよび Oxd-rにより増幅し た断片を Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 (Takara Bio、 Otsu、 Japan)を用い て [ α - 32P] dCTPにより標識したものを用いた。
[0108] 図 8において遺伝子クラスターを含んだコスミドからのサンプル（レーン 1)では、約 1 5kbの強いバンドが観察され、一方、ァスペルギルス'オリザェ野生型株からのサン プル（レーン 2)および、コントロールとして用いたインサートとして遺伝子クラスターを 含まないコスミドを導入されたァスペルギルス'オリザェからのサンプル（レーン 3)で は、約 15kbの対応するバンドは観察されなカゝつた。遺伝子クラスターを含むコスミド を導入されたァスペルギルス'オリザェ形質転 CT1〜3 (それぞれレーン 4〜6) においては、 CT1および CT3において、遺伝子クラスターに対応するバンドが観察 された。したがって、次の実験においては形質転換が成功したァスペルギルス 'オリ ザェ形質転^ ttCTlおよび CT3を用いることとした。
[0109] 次いで、インサートを含まないコスミドのみを導入したコントロール株、およびシトリ- ン生合成遺伝子クラスター形質転換株 CT1および CT3を GMP培地 (2 %グルコース 、 2 %モルトェクストラタトおよび 0.1 %ポリペプトン）で 30°C、 160rpmで、 7日間培養 し、培養液を 0.20 /z mフィルター（DISMIC-13cp Cellulose Acetate, Advantec社）で濾 過し、それぞれの 500 μ 1の培養液を HPLCで分析した。 HPLC条件は以下の通りで めつに。
C18カラム（CAPCELL PAK C18 UG資生堂）
HPLCバッファー： 55% CH CN,45%水 (0.1% TFA)
3
発光波長： 500nm、励起波長： 330nm
流速： lml/分
[0110] 結果を図 9に示す。シトリニン生合成遺伝子クラスターを導入した CT1および CT3 によるシトリニン生産量は、遺伝子クラスターを含まな ヽコスミドを導入したコントロー ル株と比較して、顕著な差を示さな力つた。なお、以下の表に示すように、 100mlの培 養液中のシトリ-ン量を測定 (n=3)したところ、コントロールと比較して、 CT1および CT 3によるシトリニン生産量は高くなつていることが判明した。
[表 4]
100ml培養液中のシトリニン量 （ng)
コントローノレ C T 1 C T 3
155. 2 264. 4 306. 1
[0111] 先の実験により、シトリニン生合成遺伝子クラスターを導入したァスペルギルス'オリ ザェ形質転換株では、コントロールと比較して顕著なシトリニン生産量の上昇が達成 されなかったため、シトリニン生合成遺伝子の正の転写因子であることが示唆された c tnRを含むプラスミド pNR10+reg (trpCのプロモーターと、 trpCのターミネータ一の間 に ctnRをコードする遺伝子を含むプラスミド：図 10参照）を、遺伝子クラスター導入 株 CT3にさらに導入した。
[0112] CT3株における ctnRを含むプラスミド pNR10+regの導入を確認するために、 CT3 株 (遺伝子クラスターのみを導入)および CT3 + ctnR株 (遺伝子クラスターと ctnRの 両方を導入）からのサンプルを、プローブとして ctnRの一部を用いるサザンブロット 分析に供した。図 10に示すように、 CT3 + ctnR株（図中、形質転換体と示す）にお いては、 CT3株では観察されない、 pNR10+regに対応するバンドが検出された。また 、 CT3 + ctnR株では、 CT3における強いバンド（遺伝子クラスターに対応するバンド )に対応するバンドが検出された。このこと力ら、 CT3 + ctnR株においては、シトリ- ン生合成遺伝子クラスターと、 ctnRを含むプラスミドの両方が導入されて 、ることが 確認された。
[0113] 次に、 CT3 + ctnR株におけるシトリニン生産を上記と同様に HPLCにより測定した 。図 11に示すように、 CT3株ではほとんどシトリニン生産がみられないのに対し、 CT 3 + ctnR株においては、 8株の内、 2株（CT3 + ctnR4および CT3 + ctnR5)では、 顕著なシトリニン生産量の増大が確認された。特に、 CT3 + ctnR5株に注目すると、 CT3株と比較して約 500倍のシトリニン生産の増大が確認された。
[0114] CT3 + ctnR株におけるシトリニン生産の上昇の原因が ctnRの複数コピーの導入 による転写活性ィ匕に起因するのかを確認するために、コントロール株 (遺伝子クラスタ 一を含まな 、コスミドを導入した株）、 ctnR株（ctnRのみを導入した株）、 CT株（シト リニン生合成遺伝子クラスターのみを導入した株）および CT3 + ctnR株 (シトリニン 生合成遺伝子クラスターに加えてさらに ctnRを導入した株）における、シトリ-ン生合 成遺伝子の転写活性を pksCT、 orf！〜 orf5それぞれに特異的なプライマーを用い RT PCRにより測定した。転写量を調べたシトリニン生合成遺伝子は、デヒドロゲナー ゼ（Dehy)、 ctnR (Reg)、ォキシゲナーゼ（Oxg)、ォキシドレダクターゼ（Oxr： Ord とも称される）、 pksCTおよびトランスポーター (Tra)である。標準としてァクチンを用 いた。
[0115] 結果を図 12に示す。レーン 1は、コントロール株、レーン 2および 3は、 ctnR株、レ ーン 4は、 CT株、レーン 5および 6は、 CT3 + ctnR株からの転写産物の量をそれぞ れ示す。コントロール株においては、シトリニン生合成に関与する遺伝子の転写産物 はいずれも観察されな力つたのに対し、 ctnR株では、 ctnRの転写産物が観察され た。 CT株では、 ctnRよりも上流に位置するデヒドロゲナーゼを除ぐすべてのシトリ- ン生合成遺伝子の転写がわずかに検出された。 CT3 + ctnR株においては、すべて のシトリニン生合成遺伝子の転写が強く誘導されていた。これは、 ctnRが、シトリニン 生合成遺伝子の転写を正に誘導する転写因子であることを示す。
[0116] このこと力ら、シトリニン生合成活性を有さないァスペルギルス'オリザェに、モナス カス ·プルプレウス由来のシトリニン生合成遺伝子クラスターと、 ctnR遺伝子をともに 導入することにより、ァスペルギルス ·オリザェがシトリニン生産能を獲得すること、お よび、シトリニン生合成遺伝子クラスターを形成する各遺伝子が、転写因子 ctnRによ り正の制御を受けることが判明した。
[0117] 上記のように、異種遺伝子群発現系のモデルとしてモナスカス.プルプレウス（M.pu rpureus)由来のシトリニン合成遺伝子群をァスペルギルス ·オリザェ（Aspergillus oryz ae)に導入し、シトリニン生産を確認した。また、生合成遺伝子クラスターを導入したァ スペルギルス.オリザェに、 ctnRをさらに導入することによりシトリニン生産が CT3株と 比較して最大 500倍になることを見 、だした。
[0118] 以上から、本発明者らは、シトリニン生産能を有さないァスペルギルス ·オリザェ (As pergillus oryzae)に、シトリニン生合成遺伝子クラスターに加えて多重に ctnR遺伝子 を導入することにより、ァスペルギルス'オリザェを用いたシトリニン生合成系の構築 に成功した。さらに、力かる系を利用することによりシトリニン生合成クラスター内の全 ての遺伝子が ctnRにより発現調節されていることを明らかにした。
産業上の利用可能性
[0119] 本発明は、シトリニン生合成に関与する複数の新規遺伝子を提供する。本発明は また、 pksCTの上流領域におけるシトリニン生合成の制御に必須な正の転写因子を 提供する。この正の転写因子を不活性ィ匕することによりシトリニン生産能が非常に低 V、糸状菌株を作成することができる。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号 1に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドを含む遺伝子。
[2] 配列番号 1に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な配列力 なるポ リヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、シトリニン生合成 系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
[3] モナスカス属カビ由来である請求項 1または 2のいずれかの遺伝子。
[4] 請求項 1〜3の 、ずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
[5] 請求項 1〜3の!、ずれかの遺伝子または請求項 4の組換えベクターを含む宿主細 胞。
[6] 以下の（a)または (b)のタンパク質：
(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力 なるタンパク質、
(b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置 換もしくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつ、シトリニン生合成系遺伝子発現を 誘導する転写因子として作用するタンパク質。
[7] シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、請求項 1〜3のいずれかの遺伝子 の発現を阻害する工程を含む、該糸状菌におけるシトリニン生合成を阻害する方法。
[8] 遺伝子の発現の阻害を相同的組換えにより行う請求項 7の方法。
[9] 請求項 1〜3のいずれかの遺伝子の発現を阻害することによってシトリニン生合成を 阻害されたシトリニン生合成経路を有する糸状菌に、請求項 1〜3のいずれかの遺伝 子を導入する工程を含む、シトリニン生合成を阻害された該糸状菌においてシトリ- ン合成能を回復させる方法。
[10] シトリニン生合成経路を有する糸状菌において、請求項 1〜3のいずれかの遺伝子 を導入する工程および該遺伝子を過剰発現させる工程を含む、該糸状菌におけるシ トリニン生合成を促進する方法。
[II] シトリニン生合成経路を有する糸状菌がモナスカス属カビである、請求項 7〜 10の いずれかの方法。
[12] シトリニン生合成経路を有さない糸状菌に対して、請求項 1〜3のいずれかの遺伝 子、および、以下の（c)および (d)から選択されるポリヌクレオチド配列を有するシトリ ニン生合成遺伝子クラスターを導入することにより、該糸状菌においてシトリ-ンを産 生させる方法；
(c)配列番号 4に示される塩基配列力もなるポリヌクレオチド；
(d)配列番号 4に示される塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な配列力 なる ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、請求項 1〜3の いずれかの遺伝子と共にシトリニン生合成経路を有さない糸状菌に導入されると、該 糸状菌におけるシトリニン生産を引き起こすことができるポリヌクレオチド。
シトリニン生合成経路を有さない糸状菌が、ァスペルギルス ·オリザェである、請求 項 12の方法。
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