WO2008018488A1

WO2008018488A1 - Agent antibactérien

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Publication number: WO2008018488A1
Application number: PCT/JP2007/065491
Authority: WO
Inventors: Toshiharu Ohba; Mariko Nishimura; Hiromu Ohnogi; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-08
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2009-02-09

Description

明細書

抗菌斉 lj

技術分野

[0001] 本発明は、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤あるいはァシタバ由来の新規な抗菌作用を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする核酸に関する。

背景技術

[0002] 医薬、食品又は食品添加物、化粧料、農薬、洗剤等の多くの分野で、種々の抗菌剤が使用されている。天然物由来の抗菌物質は人体や動物に対してより安全で、また環境に負担の少ない抗菌剤として期待されており、より有効な性質をもつ天然物由来の抗菌物質が望まれて!/、る。

[0003] ァシタパに豊富に含まれる 2種類の主要なカルコン類化合物（キサントアンゲロールと 4 ハイドロキシデリシン）は、枯草菌、セレウス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ルテウス菌に対する抗菌活性を有する事が知られている。（例えば、非特許文献 D o

[0004] 一方、抗菌タンパク質であるディフェンシンは、多数の生物種に存在しており、 α型

(ヒト）、 /3型 (ヒト）、 Θ型（サル）、サぺシン Α型（昆虫）、植物型などに分類される。特に植物体においてはアブラナ科の植物由来のものについて、遺伝子の核酸配列が決定され、その機能についての研究がなされている（例えば、非特許文献 2)。しかし、これまでにァシタパでディフェンシンが生産されて!/、ることを報告した例はな!/、。

[0005] 非特許文献 l : Foods & Food Ingredients Journal of Japan, No. 178, p. 52 - 60, 1998

非特許文献 2 :ィ匕学と生物、 Vol. 43、 No. 4、 p. 229— 234、 2005

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、生態系や環境に影響が少なく低コストで実用が可能な、植物の細胞及び/又は組織培養物を用いる、抗菌剤を提供することを目的とする。また本発明は、新規な抗菌作用をもつ蛋白質であるァシタパ由来のディフェンシンおよび該デイフェンシンをコードする核酸を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、先に、ァシタパの細胞及び/又は組織培養物の培養条件について鋭意検討したところ、最初の工程において、植物成長調節物質を含有する培地で培養することにより、ァシタパの初期培養物（カルス）を得ることができ、さらに次の工程において、その培養物を特定の条件下で培養することにより、カルコン類化合物を高効率で生産できることを見出した（特開 2007— 37535)。本発明者等はさらに検討した結果、当該方法により、期待される抗菌活性を大きく上回る抗菌活性を有するァシタパの培養物を得ることができることを見出した。さらに本発明者等は上記のァシタパの培養物におレ、て高効率で発現してレ、る、新規ァシタバ由来ディフェンシンおよびそれをコードする核酸を見出し、本発明を完成させた。

[0008] すなわち、本発明は、

[1]工程（1) :植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程

、及び

工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、

を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤；

[2]工程（ 1 )：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、及び

を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織の処理物；

[3]工程（ 1 )：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程

、及び

工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、を包含することを特徴とするァシタパ由来のディフェンシンの製造方法；

[4]下記（a)または (b)から選択されるポリペプチド、

(a)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、

(b)前記（a)のポリペプチドのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリぺプチドであって、前記（a)のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリぺプチド、；

[5] [4]のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤；

[6]下記 (c)〜（g)から選択される核酸、

(c)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、

(d)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、

(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、

(f)前記（e)の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチド力前記（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸、

(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチド力前記（e)の核酸によってコードされるポリぺプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、

に関する。

発明の効果

本発明により、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織培養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有する抗菌剤が得られる。これにより安価で安全な抗菌剤を提供する事ができる。また本発明により、抗菌作用を有する新規な蛋白質であるァシタバ由来のディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする核酸が提供される。該ディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする核酸は該ディフェンシンを高含有する抗菌剤の製造に非常に有用である。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]ァシタパの組織培養物の、アブラナ科黒スス病菌に対する抗菌活性を示す図である。

[図 2]ァシタパの組織培養物の、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す図である。

[図 3]ァシタパの組織培養物の、エンドゥ褐班病菌に対する抗菌活性を示す図である

[図 4]ァシタパの組織培養物の、トマト萎ちよう病菌に対する抗菌活性を示す図である

[図 5]ァシタバ由来のディフェンヘンン遺伝子に対するリアルタイム PCRの結果を示す図である。

[図 6]ァシタバディフェンシンの保存安定性を示す図である。

[図 7]ァシタバディフェンシンのプロテアーゼ耐性を示す図である。

[図 8]各種植物由来ディフェンシンポリペプチドのマルチシークェンスを示す図である発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下に、本発明について詳細に説明する。

[0012] ァシタパの細胞及び/又は組織培養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有する抗菌剤を製造するために用いるァシタパの細胞及び/又は組織の培養方法は、特開 2007— 37535に記載の方法と同様の方法を用いる事ができる。以下に詳細に説明する。なお本願明細書において、細胞及び/又は組織の培養物を単に培養物と称することがある。

[0013] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程工程（1)で培養される培養物としては、ァシタパの組織切片を植物成長調節物質を含有する培地で培養することにより誘導される初期培養物であるカルス、当該力ノレスを植物成長調節物質を含有する培地でさらに培養することにより得られる、増殖された培養細胞及び/又は組織、ァシタパの組織から分化した培養組織を植物成長調節物質を含有する培地で直接培養したもののいずれもが包含される。

[0014] ここで使用されるァシタパの組織はいずれの部位由来でもよぐ特に限定はないが、例えば根、茎、葉柄、葉又はこれらの混合物を使用することができ、カルスの誘導率を向上させる観点から、好適には、茎、葉柄、又はこれらの混合物を使用することができる。

[0015] 培養に使用するァシタパの組織は、通常は殺菌処理を施してから使用される。例えば、ァシタパの組織切片を 70%アルコールで消毒した後、次亜塩素酸ナトリウム溶液などで殺菌処理する。その後、無菌水で洗浄して、植物成長調節物質を含有する植物組織培養用の固形培地等に置床して、一定温度で培養することでカルス誘導が可能となる。

[0016] 植物成長調節物質としては、細胞分裂や細胞伸長、分化に関与するものであれば特に限定はないが、例えば、オーキシン類やサイトカイニン類が例示され、特にォーキシン類を必須成分として培地中に含有させることが好ましい。オーキシン類としては、例えば、 2, 4 ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4— D)、インドール酢酸（IAA)、インドール酪酸（IBA)、ナフタレン酢酸（NAA)、 2—ナフトキシ酢酸（NOA)等が例示され、早期にカルスを誘導する観点から、好適には 2, 4— Dが使用される。また、サイト力ィニン類を使用する場合は、力イネチン、 6—ベンジルァミノプリン (BA)、ゼァチン、イソペンテュルアデニン、 4—ベンジルァミノべンゾイミダゾーノレ、 N, N，一ジフエ二ノレ尿素系（例えば、 N—（2 クロロー 4 ピリジル） N' フエニル尿素等）等が例示され、カルスの誘導率を向上させる観点から、好適には力イネチン、 BA、ゼァチンが使用される。上記のオーキシン類やサイトカイニン類は、単独で又は 2種以上を混合して用いることができる。

[0017] 培地中の植物成長調節物質の総含有量としては、特に限定はないが、カルスの誘導串を向上させる観^ r、力、ら、 0. 001〜； 100mg/Lカ好まし <、 0. 005〜50mg/L 力り好ましぐ 0. 01〜； 10mg/Lがさらに好ましい。例えば、オーキシン類を培地に含有させる場合は、培地中のオーキシン類の含有量としては、好適には 0. 2〜； 10m g/L、より好適には 0. 2〜5mg/L、さらに好適には 0. 5〜2mg/Lが例示される。また、サイトカイニン類を培地に含有させる場合は、培地中のサイトカイニン類の含有量としては、好適には 0. 001〜； lmg/L、より好適には 0. 005—0. 5mg/L、さらに好適には 0. 01-0. 2mg/Lが例示される。これらの含有量については各種植物成長調節物質の発揮する植物成長調節活性に応じて、適宜設定することができ、活性の強い植物成長調節物質を含有させる場合は、含有量を減少させればよい。また、オーキシン類とサイトカイニン類の!/、ずれをも培地に含有させる場合のそれぞれの培地中の含有量は、例えば 2, 4— Dと力イネチンを使用する場合、それぞれ 0· 5〜 lmg/L, 0. 001~0. lmg/L力適である。

[0018] 培養に使用される基本培地としては、 MS (ムラシゲ&スターグ)培地や B5培地、ホワイト培地、 Nitsch&Nitsch培地、 SH培地、 LS培地、ヘラー培地の他、その他植物組織培養に用いられる公知の基本培地を用いることができる。

[0019] さらに、カルスの誘導率や増殖率を向上させる観点から、培地は上記の基本培地の組成以外にもショ糖、グルコース等の糖類を含有することが好ましい。培地中の糖類の含有量としては、特に限定はないが、例えば 1〜； 100g/L、好適には 5〜70g /L、より好適には 10〜40g/Lである。

[0020] また、培地の形態としては、液状、固形状のいずれでもよぐ固形状の培地を使用する場合、固形剤としては寒天やゲランガム等が使用され、特に限定はないが、恒温室にて静置培養により実施できる。液状培地を用いる場合は、回転振とう培養や振とう培養を行なうことが好ましレ、。

[0021] 誘導したカルスをさらに培養することにより培養物を得る場合は、一定期間で植継ぎ増殖させること力 Sできる。増殖用の培地はカルスを誘導した培地と同じ組成でもよく、また植物成長調節物質の種類を変更することもできる。変更する場合は、ォーキシン類に関しては、 2, 4— Dの培地中の含有量を 1とした場合、 IAAと IBAはそれぞれ 1から 10倍量の含有量に、 NAAは 1から 5倍量の含有量になるように変更することが望ましい。

[0022] 培養温度は、植物が低温で氷結しな!/、、高温で乾燥しな!/、、又は熱で枯死しな!/、ような温度範囲であれば特に限定はないが、例えば 22°Cから 28°Cが適しており、特に工程（1)の開始後早期にカルス誘導する場合には 25°Cから 28°Cが適している。また、安定して増殖させる場合には 22°Cから 25°Cが適して!/、る。

[0023] 培養日数については、特に限定はなぐ例えばカルスを誘導する場合には最低でも約 10日間培養することが好ましぐ好適には 10〜； 100日間、より好適には 10〜70 日間の培養が実施される。なお、長期間培養する場合は、培地の交換や新たな培地への継代などを適宜実施することができる。

[0024] 培養は、明所でも喑所でも!/、ずれで行ってもよ!/、が、一般的なカルス誘導を行なう場合は喑所で行なわれる。なお、本明細書において喑所とは、通常、植物組織培養で用いられる喑所条件と同義であり、完全喑所である必要はない。すなわち、観察等において通常の光条件に一時的に曝すことがあったとしても喑所とする。喑所条件の作り方としては、特に限定はないが、暗室にて培養室の明力、りを点灯しない方法や培養物の入った容器を遮光性の容器に封入する力、、もしくは容器をアルミホイル等により包む方法等が例示される。

[0025] 工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程

後述の実施例 3に記載のとおり、上記工程（1)で得られた培養物中には、ディフエンシンの含有量は少なぐディフェンシンを高含有するァシタパの細胞及び/又は組織培養物を得るためには、当該工程（2)の培養が必須となる。即ち、ディフェンシンを高含有するァシタパの細胞及び/又は組織培養物を得るためには、工程（1)で得られた培養物を、オーキシン類を含有しないか、あるいは、含有量が 0. 2mg/L未満である培地で培養すればよい。以降、本発明において、当該工程（2)を経て得られる培養物を単に本発明により得られるディフェンシンを高含有する培養物と称することがある。なお、ここで高含有とは、工程（1)で得られる培養物中のディフェンシン量よりも工程（2)で得られる培養物中のディフェンシン量が多いことを示し、好適には 2倍以上、より好適には 5倍以上であることを示す。ここで培養物中のディフェンシン量としては、培養物中のディフェンシンの量、もしくはディフェンシン遺伝子の発現量のレヽずれかを指標とすることができる。

[0026] 本発明により得られるディフェンシンを高含有する培養物とは、工程（1)で得られた培養物を、 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養することにより得られるディフェンシン含有培養物や、当該ディフェンシン含有培養物をさらに 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で増殖させることにより得られる培養物のいずれもが包含される。また、ディフェンシンを高含有するという特徴を有する限り、継代して系統化することもできる。

[0027] 工程（1)で得られた培養物を、オーキシン類を含有しない、あるいは、含有量が 0.

2mg/L未満である培地で数日間培養することで、ディフェンシンを高含有するァシタパの細胞及び/又は組織培養物を取得することができる。培地中のオーキシン類含有量としては、培養物中のディフェンシン含有量を高める観点から、 0. lmg/L未満、あるいはオーキシン類を含有しないことが好ましいが、培地に含有されるォーキシン類の種類に依存するオーキシン活性により、培地中のオーキシン類含有量は 0. 2mg/L未満の範囲内で適宜調整することができる。なお、オーキシン類の種類としては、前述の工程（1)で例示するオーキシン類が挙げられる。

[0028] また、工程（2)においては、オーキシン類以外の植物成長調節物質は、培地中に含有されない方が好ましい。すなわち、当該工程で使用される培地としては、 MS培地等の前述する基本培地そのものや、これらの基本培地にショ糖やグルコース等の糖類を添加したもの、又は植物成長調節物質以外の成分を添加したものが例示され

[0029] ディフェンシンを高発現する培養物は、培地の交換ゃ植継ぎ培養をすることでさらに増殖することができる。ここで使用される培地は上記と同じでも力、まわないし、 0. 2 mg/L未満のオーキシン類含有量の範囲内であれば、オーキシン類の種類を変更してもよい。また、工程（2)の培養当初からオーキシン類を含有しない培地を使用する場合は、植え継ぎや培地交換の際にもオーキシン類は含有しない方が良い。工程 (2)の培養期間としては、特に限定はないが、例えば、好適には 15日間以上、より好適には 20〜250日間、さらに好適には 80〜； 120日間が例示される。その他、培養中の光条件、基本培地や培養温度、培養時間、培地の形態等については、前述のェ程（1)と同様に行なうことができる。 [0030] 本発明により、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物、もしくはその処理物を有効成分とする抗菌剤が提供される。なお、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物中には、カルコン類化合物も高含有されている場合が多い。背景技術に記載の通り、カルコン類化合物は抗菌作用を有することが知られている。し力、しながら、実施例 1および 4にて試験された、上記の方法により得られる培養物の抗菌作用は、培養物中のカルコン類化合物に依存するものではなぐァシタパ由来の新規なタンパク質であるディフェンシンの高発現に依存するものである。つまり、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物は、培養物中に含まれるカルコン類化合物による抗菌作用からは明らかに予想できない程度の高い抗菌作用を有するものである。また、ァシタパ由来のカルコン類の、真菌類に対する抗菌作用はこれまで報告されておらず、本発明により初めて、ァシタパ由来成分による真菌類に対する抗菌作用が示される。

[0031] 本発明において、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物、もしくはその処理物を有効成分とする抗菌剤の組成や形状、有効成分の含有量としては、特に限定はなぐ当該抗菌剤の用途によって適宜設定される。

[0032] 本願明細書において処理物（以下、本発明の処理物と称することがある）としては、原料である上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物に対し何らかの加工を施したものであって抗菌作用を有するものであれば特に限定はないが、例えば抽出物、粉砕物、乾燥物、超音波処理物、搾汁液、破砕物、化学処理物、酵素処理物が例示され、特に好適には抽出物、粉砕物および乾燥物が例示される。なお、本発明の処理物としては、特に好適には、ディフェンシンが高含有された処理物を好適に使用することができ、当該処理物の抗菌作用としては、後述の実施例 1もしくは 4に記載された方法と同様の方法で確認することができる。なお、本発明の別の態様としては、前記の本発明の処理物も提供するものである。

[0033] 本発明において、抽出物とは原料培養物に対し抽出溶媒を用いて抽出操作を行う工程を経て得られる物質のことをいう。抽出条件は、得られる抽出物中にァシタパ由来のディフェンシンが高含有された抽出物であれば特に限定はなぐ公知の抽出方法により以下のように行うことができる。例えば原料をそのまま、あるいは粉砕、乾燥及び/又は細断した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式で抽出を行うことができる。抽出物を得る際の抽出溶媒としては、特に限定はないが、例えば、水、リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、あるいは Hepes緩衝液、グリセロール、グリコール類（エチレングリコーノレ、プロピレングリコール等）、アルコール類（エタノール、メタノーノレ、イソプロピルアルコール等）、ケトン類（アセトン、メチルェチルケトン等）、もしくは親水性の溶媒を挙げること力 Sでき、所望により単独で、もしくは適宜混合液として用いること力 Sできる。これらの溶媒には、必要に応じて KC1あるいは NaCl等の無機塩を含有させることができる。また溶媒の pHは抽出の効率を高める目的で適宜調整すればよい。また抽出されるタンパク質の安定性を増す目的で、必要に応じて 2価イオンあるいは EDTAなどのキレート剤、グリセロール、ショ糖等を添加してもよい。またプロテアーゼによる分解を防ぐ目的で、 PMSF等のプロテアーゼ阻害剤を加えてもよい。また抽出するタンノク質が不溶化する場合は、陽イオン性 ·陰イオン性 ·非イオン性あるいは両性の界面活性剤を添加する、あるいは水/ブタノールで抽出を行う等の手段を用いる事ができる。抽出溶媒としては、例えば、後述の実施例 4の緩衝液等が例示される。抽出時間については、特に限定はないが、例えば 30分〜 24時間が例示される。抽出温度についても、特に限定はないが、例えば 4〜25°Cが例示される。抽出物は必要に応じ、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過、分子ふるい等の処理を行うことができる。また、以上の抽出物を 2種以上含有させて使用することもできる。また、原料培養物から異なった抽出法で得られた抽出物を 2種以上含有させて使用することもできる。

[0034] また、本発明においては、本発明の抽出物を公知の方法で分画することによって得られる画分や、分画操作を複数回繰り返すことにより得られる画分についても本発明の抽出物に包含される。上記の分画手段としては、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー、が挙げられる。得られた画分の精製を、抗菌作用を指標としてさらに進めることにより、ァシタパのディフェンシンを単離することもできる。

[0035] 粉砕物としては、例えば上記のディフェンシンを高含有する培養物をそのまま、もしくは乾燥させ、粉砕機を使用して粉砕することで得られる粉状の粉砕物が例示される。また、凍結粉砕により得られる粉砕物であってもよい。

[0036] 乾燥物としては、例えば上記のディフェンシンを高含有する培養物をそのまま乾燥させたものや凍結乾燥物が例示される。

[0037] 破砕物とは、原料培養物を砕き壊したものであり、一般には粉砕物よりも組織片が大きぐ例えば、破砕機を使用することにより製造することができる。また、化学処理物とは、特に限定はないが、原料培養物を酸処理、アルカリ処理、酸化処理、還元処理等に供して得られた物をいい、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、クェン酸、酢酸等の無機酸や有機酸、又は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等の無機塩基や有機塩基を含む水溶液に原料培養物を浸漬することにより製造することができる。化学処理物には、前記のような化学処理を受けた培養物に由来するすべてのものを含む。酵素処理物とは、例えば、ぺクチナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ダルコシダーゼ等による酵素処理物、微生物による酵素反応物（例えば、発酵物）をいい、例えば、原料培養物に対して上記酵素を適当な緩衝液中で作用させることにより製造すること力 Sできる。酵素処理物には、前記のような酵素処理を受けた培養物に由来するすべてのものを含む。

[0038] また、本発明は、ァシタパ由来の新規なポリペプチドであるディフェンシン (以下、本発明のポリペプチドと称することがある）をも提供する。該ポリペプチドは下記（a)または (b)から選択される。

(b)前記（a)のポリペプチドのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリぺプチドであって、前記（a)のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリぺプチド、。

[0039] ここで同等な機能とは、例えば抗菌活性が例示され、後に述べる実施例 1もしくは 4 記載の方法を用いて確認することができる。本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは一般細菌、酵母類、カビ類、真菌類に対して抗菌活性を有する。

[0040] なお、配列表の配列番号 1〜24から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例 2に記載のとおり、いずれもァシタバ由来のディフェンシンである。すなわち、ァシタパには少なくとも本発明者らにより見出された 24種類のディフェンシが存在することが、今回明らかになった。これらのタンパク質と、それをコードする核酸の関係について下記表 1に示す。また後述するシグナルペプチドがどのアミノ酸残基の間で切断されるかを表 1に示す。表 1において、シグナルペプチドの切断位置（ 1)は Neutral networkを、（2)は Hidden Markov modelsをそれぞれ計算アルゴリズムとして用いたことを示す。

[表 1]

表 1

本発明のポリペプチドの具体的な例としては、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、配列表の配列番号;!〜 2 6から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能、例えば抗菌活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列に 1もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付カロ、揷入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたァミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。このような変異を有するポリペプチドとしては、例えば配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに 5 0%以上の同一性を有するポリペプチド、好ましくは 70%以上の同一性を有するポリペプチド、特に好ましくは 90%以上の同一性を有するポリペプチドが例示される。これらの変異を有するポリペプチドは、配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すものであって、作用する菌の種類が異なるもの等であっても本発明に包含される。

[0043] 特に本発明のポリペプチドはその N末端側にシグナルペプチドを有しており、植物体内ではこのシグナルペプチドが切断された、成熟したディフェンシンが存在すると予想される。シグナルペプチドの切断位置については表 1及び図 8に示すとおりである。なお、図 8は各種植物由来のディフェンシンのアミノ酸配列比較について示した図であり、 AkDEFlはァシタバディフェンシン (配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列）、 HaDEFはヒマヮリディフェンシン、 RsAFPlはダイコンディフェンシン、 Bn DEFはセィヨウアブラナディフェンシン、 BrDEFはチャイニーズキャベツディフェンシン、 MsDEFlはアルファルフアディフェンシン、 NaDlはハナタバコディフェンシン、 PhDlはペチュニアディフェンシンを示す。すなわち、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号 1〜24から選択されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。より具体的には、上記表 1に記載のシグナルペプチド切断位置から N末端側が欠失したポリペプチドが例示される。例えば、配列表の配列番号 25で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表の配列番号 1で表されるアミノ酸配列から、 N末端側のシグナルペプチド（27アミノ酸）が除去されたポリペプチドである。さらに配列表の配列番号 59で表される核酸配列は、当該ポリペプチドをコードする核酸である。

[0044] さらに図 8に示すとおり、ァシタバ由来のディフェンシンは、アミノ酸配列比較から、その他の植物由来のディフェンシンとは異なり、 N末端側に特異的な 14アミノ酸残基を有していることが本発明者らにより初めて明らかになった。さらにこのァシタパ由来のディフェンシンは、後述の実施例 6に記載のとおり、その他のディフェンシンと比較して保存安定性やプロテアーゼ耐性において優れており、従来知られている植物由来のディフェンシンと比較して極めて優れた効果を発揮するものであり、安定性の高い抗菌剤としての使用に極めて有用である。また、後述の実施例 5に記載のとおり、ァシタパ由来のディフェンシンに特異的な N末端側の 14アミノ酸を除去した場合、より強い抗菌活性が確認されている。なお、当該 14アミノ酸を除去したポリペプチドのアミノ酸配列については、配列表の配列番号 26に、また当該アミノ酸配列をコードする核酸配列は配列表の配列番号 60に示す。

[0045] また、本発明のポリペプチドはその活性には必須でな!/、ペプチド領域を有して!/、てもよい。例えば遺伝子工学的に本発明のポリペプチドを製造した場合、翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジンタグ、ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるタンパクが付加されたものであっても、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等の機能、例えば抗菌活性を示す限り本発明のポリペプチドに包含される。

[0046] 本発明のポリペプチドは、例えば、前述のディフェンシンを高含有する培養物もしくはそれらの処理物や、ァシタパの植物体から、公知の方法を組み合わせて製造することができる。すなわち、本発明は、前述のディフェンシンを高含有する培養物もしくはそれらの処理物を用いたァシタパ由来のディフェンシンの製造方法も提供される。当該ディフェンシンの製造方法としては、前述のディフェンシンを高含有する培養物力、らディフェンシンを採取する工程が包含される。ここで採取とは、精製や部分精製など、ァシタバディフェンシンを生成する目的で各種操作を行うことを意味する。例えば、細胞または組織の破砕処理物に対して有機溶媒 ·水による抽出操作を行い、さらに公知の化学的'物理的精製手段、すなわち硫安分画、イオン交換樹脂、各種クロマトグラフィー、ゲルろ過法、分画膜による分画法、溶媒分配法、電気泳動等の公知の方法を組み合わせて精製を行う事ができる。また、好適には後述の実施例 5に記載のように、遺伝子工学的手法により本発明のポリペプチドを製造することもできる。本発明のポリペプチドの抗菌活性は、後に述べる実施例 1または 3記載の方法を用いて確認することができ、精製純度の指標とする事ができる。 [0047] 本発明は、ァシタパ由来の、抗菌活性を有する新規なポリペプチドであるディフェンシンをコードする核酸 (以下、本発明の核酸と称することがある）を提供する。前記核酸としては、本発明を特に限定するものではないが、下記 (c)〜（g)のから選択され

(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、

(f)前記（e)の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、前記（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、

(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷入

、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸。

[0048] ここで、上記（d)記載の、「配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列に 1もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付カロ、揷入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたアミノ酸配列で示されるポリペプチド」とは、当該アミノ酸配列に 50%以上の同一性を有するポリペプチド、好ましくは 70%以上の同一性を有するポリペプチド、特に好ましくは 90%以上の同一性を有するポリペプチドが例示される。これらの変異を有するポリペプチドは、配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリぺプチドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すものであって、作用する菌の種類が異なるもの等であっても本発明に包含される。

[0049] また、前述するとおり、本発明のポリペプチドはシグナルペプチドを有することが予想されることから、本発明の核酸としては、この領域を含まないポリペプチドをコードする核酸、具体的には上記表 1に記載のシグナルペプチド切断位置で N末端側が除去されたポリペプチドをコードする核酸が例示される。

[0050] また「（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能」とは（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すものであって、作用する菌の種類が異なるもの等であっても本発明に包含される。

[0051] また上記（f)に記載のストリンジェントな条件としては、 1989年、コールド 'スプリング

.ハーバー.ラボラトリー発行、】· サムブルック (j. Sambrook)ら編集、モレキユラ一.クローニング：ァ.ラボラトリー.マニュアル第 2版（Molecular Cloning ： A L aboratory Manual 2nd ed. )等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば 0· 5% SDS、 5 Xデンノ、ルツ溶液、 0. 01 % 変性サケ精子 DNAを含む 6 X SSC中、プローブとともに 65°Cにて 12〜20時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダィズした核酸は、例えば 0. 5% SDSを含む 0. 1 X SSC 中、 37°Cで洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。

[0052] 本発明の核酸は、例えば下記のような手段により取得することができる。例えば、配列表の配列番号 27〜60の核酸配列情報をもとに特異的なプライマーを作成し、ァシタパの植物体すなわち葉、茎、根等、あるいは前述のディフェンシンを高含有するァシタパの培養物より作製された cDNAライブラリーを铸型にして PCRによりァシタバの cDNAを取得して本発明の核酸とすることができる。また、上記のァシタバのディフェンシンを高含有する培養物を用レ、て、特異的に多く発現して!/、る mRNAを公知の方法、例えば後述の実施例 2に記載の DNAビーズマイクロアレイを用いた方法で特定し、その情報をもとに cDNAをクローユングして本発明の核酸とすることができる。また、 DNA合成機を用いて本発明の核酸の全配列を合成することもできる。

[0053] 上記の工程で得られた本発明の核酸を組み込んだ発現ベクターで形質転換した適当な宿主、例えば大腸菌を培養して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。

[0054] 本発明のポリペプチドは、例えば前記のヒスチジンタグ、ダルタチオン S トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等を付加する目的で、発現ベクターをこのようなタグある!/、はタンパク質のコード領域を含むよう構築する事が有効である。これらのタグあるいはタンパク質と融合して発現した本発明のポリペプチドは、これらのタグあるいはタンパク質に特異的なァフィ二ティ担体を利用したクロマトグラフィー等により容易に精製すること力できる。またこれらのタグあるいはタンパク質は、融合部分を切断するプロテアーゼが認識する部位が揷入されるように発現ベクターを構築しておけば、融合部分を切断するプロテアーゼで処理して容易に除くことができる。また配列表の配列番号 1〜26から選択される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列には複数箇所のシスティン残基が存在していることから、公知の手段、例えば Chaperoni n GroE、 Corystein、 Protein Disulfide— isomerase (レヽずれ bタ刀フノイ '干土製)等の試薬を用いて正当な分子内のジスルフイド結合を構築しなおすこともできる。

[0055] またカラシナ由来のディフェンシンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組み換えイネが病害抵抗性を持つという報告があることから（非特許文献 2)、本発明の核酸を用いて、他の植物を形質転換し、該植物に病原菌への抵抗性を付与することができ

[0056] また、本発明により、本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤が提供される。本発明において、本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤の組成や形状、有効成分の含有量としては、特に限定はなぐ当該抗菌剤の用途によって適宜設定される。

[0057] 以下、ディフェンシンを高含有する培養物、もしくはその処理物を有効成分とする抗菌剤、ならびに本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤（以下、これらの抗菌剤をあわせて本発明の抗菌剤と称することがある）の用途について詳細に説明する。本発明の抗菌剤は、抗菌成分としてァシタパ由来のディフェンシンを含有する新規な抗菌剤である。

[0058] 本発明の抗菌剤は特に植物病原菌に対する防除剤として有効である。対象となる植物病原菌としては、糸状菌、細菌等、特に限定されるものではないが、例としてィネのいもち病菌、イネの紋枯病菌、イネの白葉枯病菌、アブラナ科植物のクロスス病菌、エンドゥ褐班病菌、トマト萎ちよう病菌などがあげられる。

[0059] 本発明の抗菌剤は、農薬、土壌の改良剤、農業資材あるいは肥料等の農業もしくは園芸用途に用いることができ、その形態や剤形は特に限定されるものではなぐ液剤、粒剤などに必要に応じて加工するのが望ましい。また使用の場所、環境、目的等にあわせて、本発明の抗菌剤が有効に抗菌作用を保持し作用する様に、例えば粒子径の制御、浮遊性の制御、ぬれの制御、混用活性成分の安定化、浸透移行性、残効性あるいは耐雨性の向上などの目的で、本発明の抗菌剤を液体、粉体あるいは粒体などの様々な剤形とする事ができる。また、展着剤、水和剤、または乳化剤などの添加剤を添加することができる。これらの添加剤は特に限定されるものではな!/、が、たとえば展着剤、水和剤、または乳化剤としては陰イオン (ァニオン)性界面活性剤、陰イオン (カチオン)性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン (ノユオン)性界面活性剤、あるいはパラフィンを組み合わせたもの等を用いることができる。

[0060] 本発明の抗菌剤を農薬、土壌の改良剤、農業資材あるいは肥料等の農業もしくは園芸用途に用いる場合には、本発明の抗菌剤の含有比率は特に限定されるものではないが、例えば上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物を抗菌剤として使用する場合、乾燥重量換算で 0. ；!〜 90重量％の間、望ましくは 5〜80 重量％の間の量を、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する場合は、 0. 001 〜； 10重量％、好ましくは 0. 005〜5重量％含有するものが例として挙げられる。

[0061] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する食品又は食品添加物（以下、本発明の食品又は食品添加物と称することがある）を提供する。なお、本発明の食品又は食品添加物において「含有」とは、含有、添加及び/又は希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品又は食品添加物中に本発明の抗菌剤が含まれるという態様を、「添加」とは食品又は食品添加物の原料に、本発明の抗菌剤を添加するという態様を、「希釈」とは本発明の抗菌剤に、食品又は食品添加物の原料を添加すると!/、う態様を表すものである。本発明の食品又は食品添加物は抗菌機能を有するため、例えば口腔内を清潔にする機能に優れてレ、る。

[0062] 本発明の食品としては、本発明の抗菌剤を含有する嗜好飲料 (青汁、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなど）、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネ一ズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など）、食肉加工品（ノヽム、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産製品（冷凍すりみ、力、まぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜'果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類 (チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類、ガム類、飴類など）、調味料 (しょうゆ、ソース、酢、みりんなど）、缶詰 ·瓶詰め ·袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば'うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麵類、即席カレー、インスタントコ一ヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体食品（スープなど）、香辛料類などの農産'林産加工品、畜産加工品、水産加工品など力 S挙げられる。特にァシタパの青汁に本発明の抗菌剤を添加することにより、ディフェンシンの含有量を向上させた青汁とすることができる。また本発明の食品又は食品添加物は、形状に限定はなぐタブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状で経口的に摂取可能な形状物をとることもできる。

[0063] 本発明の食品又は食品添加物中の本発明の抗菌剤の含有量は特に限定されず、その官能と抗菌活性の観点から適宜選択できるが、例えば、食品又は食品添加物中の本発明の抗菌剤の総含有量として、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物を抗菌剤として使用する場合、乾燥重量に換算して、好ましくは 0. 0 1重量％以上、より好ましくは 0· 05〜； 100重量％、さらに好ましくは 0. ；!〜 100重量 %、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する場合は、 0. 001〜； 10重量％、好ましくは 0. 005〜5重量％が好ましい。

[0064] また、本発明の抗菌剤は、機能性食品素材としても適しており、本発明の抗菌剤を含有する食品は、その抗菌作用力歯周病予防や口内環境を整えて、歯を丈夫にすることが期待されるため、そのような効果を有する旨の表示を付した機能性食品（例えば、特定保健用食品）として有用である。さらに本発明の食品添加物は、このような機能性食品の関与成分としても有用である。

[0065] 本発明の抗菌剤を有効成分とする食品添加物の一例として、公知の製剤化方法により、食品の変色 ·腐敗 ·酸化等を効果的に防止する食品の鮮度保持剤あるいは防腐剤を製造することができる。本発明の抗菌剤を有効成分とする食品の鮮度保持剤あるいは防腐剤は種々の食品 ·生鮮食品 ·加工食品等の味や鮮度の保持に極めて有用である。

[0066] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する化粧料 (以下、本発明の化粧料と称すること力 Sある）を提供する。本発明の化粧料の形態としては、例えば洗浄料、化粧水、クリーム類、おしろい類、洗顔剤、乳液類、軟膏、浴用石鹼、洗顔石鹼などの皮膚用製品、洗髪料、ローション、整髪料、パーマ用品、脱毛剤等の毛髪用製品、マニキュァ製品、歯磨き、うがい薬、口腔香料、洗口剤などの口中用製品、浴場剤、液体または固体の芳香製品、日焼け止め剤、しみ'ソバカス用剤、にきび用剤、パック料、脱臭剤、白髪染め等の特殊化粧料等があげられる。本発明の化粧料は本発明の抗菌剤を有効成分とするものであり、公知の化粧料用の原料、例えば陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン化セルロース、ポリサッカライド、合成セラミド、精製脂肪酸、高級アルコール、グリセリンゃポリエチレングリコールなどの多価アルコール、エステル油、ワックス、グリセリン脂肪酸エステルなどと組み合わせて製剤化すればょレ、。本発明の化粧料への本発明の抗菌剤の含有量は特に限定されるべきものではないが、例えば前記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物を抗菌剤として使用する場合、乾燥重量に換算して、好ましくは 0. 01重量％以上、より好ましくは 0. 05〜20重量％、さらに好ましくは 0. ；!〜 15重量％であり、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する場合は、 0. 005〜5重量％、好ましくは 0. 00；!〜 3重量％が好ましい。本発明の化粧料は、その抗菌作用により、アトピー性皮膚炎等の細菌性の皮膚炎の人が使用する化粧料として有用である。さらに本発明の化粧料はその抗菌作用により劣化しにくいという特徴を有する。

[0067] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する医薬品（以下、本発明の医薬品と称すること力 Sある）を提供する。本発明の医薬品は本発明の抗菌剤の有する抗菌活性を利用した医薬、例えば、水虫薬などの、感染症の治療のための医薬として有用である。また植物由来のディフェンシンにより、哺乳動物のカルシウムイオンチャンネルがブロックされているという幸告カあること力、ら（Plant Physiol. 135, p2055, 2004 年）、本発明の医薬品は高血圧の治療又は予防をおこなうこともできる。

[0068] 本発明の医薬の製造は、通常、本発明の抗菌剤を有効成分として薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすること力 Sできる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。

[0069] 医薬用担体は、医薬の投与形態および製剤形態に応じて選択することができる。

固体形状の経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすること力でき、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセノレロース、コーンスターチ、無機塩などの医薬用担体が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体形状の経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。

[0070] 一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製すること力 Sできる。また、前記有効成分を含む固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

[0071] 外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、口ーシヨン剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。

[0072] 上記のような各種製剤形態の医薬は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造すること力 Sできる。また、力、かる医薬における有効成分の含有量は、特に限定されるものではないが、例えば前記の方法で取得したディフェンシンを高含有する培養物を有効成分として使用する場合、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは乾燥重量換算で 1〜100重量％程度力 S、また本発明のポリぺプチドを有効成分として使用する場合は、 0. 001〜； 10重量％、好ましくは 0. 005-5 重量％であることが望まし!/、。

[0073] 本発明の医薬は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特に限定はなぐ例えば内用、外用および注射により投与することができる。本発明の治療剤又は予防剤を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。

[0074] 本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、例えば前記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物を有効成分として使用する場合、乾燥重量で成人 1日当り好ましくは 0. 5mg〜50g/kg体重、より好ましくは 5mg〜5g/kg 体重、さらに好ましくは 50mg〜500mg/kg体重であり、また本発明のポリペプチドを使用する場合、成人 1日当り好ましくは 1 μ g〜100mg/kg体重、より好ましくは 10 μ g〜； 10mg/kg体重、さらに好ましくは 100 μ g〜； lmg/kg体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

[0075] また、本発明の抗菌剤は、動物類 ·鳥類 ·魚類等の飼料の原料として使用することもできる。調製や製造につ!、ては公知の方法に従えばよ!/、。

[0076] また、本発明の抗菌剤は洗剤に添加して使用することもできる。ここで洗剤としては、特に限定はないが、衣類や布類の洗濯に使用される洗濯用洗剤、食器洗い用洗剤、台所、浴室、トイレ、ガラス、家具または車等の住宅用洗剤等が例示される。また、かかる洗剤における有効成分の含有量は、特に限定されるものではないが、例えば前記の方法で取得したディフェンシンを高含有する培養物を有効成分として使用する場合、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは乾燥重量換算で;!〜 7 0重量％程度が、また本発明のポリペプチドを有効成分として使用する場合は、 0. 0 0；!〜 10重量％、好ましくは 0. 005〜5重量％であることが望ましい。

[0077] また、本発明の別の態様として、本発明のポリペプチドを識別する抗体（以下、本発明の抗体と称すること力ある）も提供すること力できる。特に限定はないが、配列表の配列番号 1〜26記載のアミノ酸配列から選択される抗菌活性を有するポリペプチドに結合する抗体が好ましい。さらに好ましくは、配列表の配列番号 1、 25及び 26記載のアミノ酸配列のうちいずれ力、から選択されるポリペプチドに結合する抗体であつて、種々のディフェンシンポリペプチドを識別する抗体が挙げられる。特に、配列表の配列番号 25で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである AkDEFlに結合する力配列表の配列番号 26で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである AkD EF2に結合しない抗体、あるいは AkDEF2に結合する力 AkDEFlに結合しない抗体、さらに AkDEFl及び AkDEF2の両方に結合する抗体のいずれもが好適に使用できる。例えば、配列表の配列番号 25で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドである AkDEFlに結合する力 S、配列表の配列番号 26で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである AkDEF2に結合しない抗体としては、後述の実施例 3— (2) に記載の AD— Nが例示され、 AkDEFl及び AkDEF2の両方に結合する抗体としては、後述の実施例 3—（2)に記載の AD— M及び AD— Cが例示される。また、当該抗体は、ァシタパ由来ディフェンシンポリペプチドを識別する抗体であれば、ポリクローナル抗体であってもよぐモノクローナル抗体であってもよい。

[0078] また、当該抗体の調製方法は、上記性質を有する抗体を取得できる方法であれば特に限定はないが、例えば、前記のような、ァシタバ由来ディフェンシンポリペプチドを識別する抗体を調製する場合は、配列表の配列番号 1〜26記載のいずれかのァミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、当該ポリペプチドを動物に免疫する工程、前記免疫された動物から採血し、抗血清を調製する工程、前記抗血清から、（ィ) Ak DEF1ポリペプチドに結合し、 AkDEF2ポリペプチドに結合しないクローン、（口） Ak DEF2ポリペプチドに結合し、 AkDEFlポリペプチドに結合しないクローンあるいは、（ハ） AkDEFlポリペプチド及び AkDEF2ポリペプチドに結合するクローン、のいずれかを選択する工程、を実施することにより当該抗体を製造することができる。例えば、後述の実施例 3— (2)に記載のとおり、配列表の配列番号;!〜 26で表されるアミノ酸配列のうち適当な長さの部分ペプチドを合成し、ゥサギ等の動物に免疫して取得すること力 Sでさる。

[0079] さらに、配列表の配列番号;!〜 26記載のいずれかのアミノ酸配列を有するポリぺプチドを合成し、当該ポリペプチドで動物を免疫する工程、前記免疫された動物の細胞を用いてハイプリドーマを生産する工程、前記ハイプリドーマから、（ィ) AkDEFlポリペプチドに結合し、 AkDEF2ポリペプチドに結合しないクローン、（口） AkDEF2ポリペプチドに結合し、 AkDEFlポリペプチドに結合しないクローンあるいは、（ハ） AkD EF1ポリペプチド及び AkDEF2ポリペプチドに結合するクローン、のいずれかを選択する工程、前記選択されたクローンから細胞を増殖する工程、前記細胞の生産する抗体を単離する工程、を実施することにより当該抗体を製造することもできる。

[0080] 本発明の抗体は、ァシタパ抽出物、あるいはァシタパ組織培養物、あるいは本発明のポリペプチドをコードする核酸を導入した微生物、植物、動物から、本発明のポリぺプチドを精製する際に、樹脂のような固相に固定化することによって好適に使用できる。前記固相としては、例えば磁気ビーズを用いても良い。また、本発明の抗体は、金粒子のような化学物質あるいはアルカリフォスファターゼゃペルォキシダーゼのような酵素によって標識することにより、本発明のポリペプチドを産生する天然物、人工物のスクリーニングに使用できる。また、本発明のポリペプチドの発現あるいは部位特異的発現を検出するための抗体としても使用できる。さらに、 AkDEFlのプロテア一ゼ切断部位を当該プロテアーゼから保護することができる。従って、時期あるいは部位特異的にディフェンシン活性を発揮させたい対象に投与する際には、本発明の抗体をディフェンシンに結合させることで特定の時期あるいは部位にくるまではディフエンシン活性を抑え、その特定の時期あるいは部位にきた際に、熱処理等の処理により当該抗体を除去して、ディフェンシン活性型に変換させることにより、時期あるいは部位特異的に必要なディフェンシン活性を発現させることができる。

実施例

[0081] 以下に本発明を実施例をもって示すが、本発明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、遺伝子工学上の基本的な操作にっレ、てはサムブルック（Sambrook)ら、モレキュラー ·クローニング：ァ'ラボラトリー.マ二ユアノレ第 3版 (Molecular Cloning —A Laboratory Manual— )、コールドスプリングノヽーノーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor L aboratory Press) , 2001年に記載の方法によった。

[0082] 実施例 1 ァシタパ培養物の調製およびその抗菌活性の確認

ァシタパの培養細胞を寒天培地上に置き、真菌類に対する抗菌活性を調べた。

(1)ァシタパのカルス培養条件の検討

栽培 1 2年目のァシタパの葉、茎、葉柄、根を 70%アルコールで 5分間消毒した後、次亜塩素酸ナトリウム溶液 (有効塩素濃度約 2. 2%)に 10分間つけて殺菌処理した。その後、無菌水で洗浄して、カルス誘導に供する植物体の切片を作成した。切片は基本的にオーキシン類 lppm、サイトカイニン類 0. lppmを含む MS寒天培地（ショ糖 30g/L含有）に置床して、一定温度（22°Cまたは 25°Cまたは 28°C)で喑所で培養した。なお、オーキシン類（2, 4— D、 IAA、 IBA)、サイトカイニン類（力イネチン、 BA)を含有する各種培地について、下記表 2に示す。

[0083] [表 2] 表 2

培地名植物成長調節物質 (m g / 1 )

- 才ーキシン類サイトカイニン類

o

2， 4-D IAA IBA 力イネチン BA

1, 0 0. 1

MSAO. 2B 1. 0 0. 2

1. 0 0. 1

1 , 0 0. 1

[0084] 培養から 10〜60日目のカルスの形成率を測定した。その結果、早いもので培養 1 0日目よりカノレスの誘導が始まった。どの部位力、らもカノレスの誘導が可能である力 S、茎と葉柄が安定に誘導できた。培地は MSDO. 1K>MSB0. 1K = MSA0. 2B〉M SAO. IKの順に誘導に優れていた。つまり、いずれのオーキシン類でもカルスの誘導は可能である力同濃度では 2, 4— Dが適していることが明らかになった。

[0085] オーキシン類として 2, 4-D lmg/1存在下でのカルス誘導におけるサイトカイ二ンの種類と温度の組み合わせでカルス誘導を検討した結果、サイトカイニン類は BA ゃゼァチンが適していた。温度はいずれの温度でも誘導可能である力特に 25°Cから 28°Cが適している。但し、日数が経過すると 28°Cでは褐変化する傾向があるので、培養維持という意味では、 25°Cが適していた。

[0086] オーキシン類として 2, 4— Dの最適濃度を植物体組織部位との組み合わせでカルス誘導を検討した結果、 2, 4— D濃度は 0. 5〜5mg/Lのいずれでも誘導可能である力特に 0. 5〜lmg/Lが適当であった。部位は葉を除くすべての供試部位から誘導が可能であつたが、特に茎と葉柄が安定に誘導できた。

[0087] (2)ァシタパのカルスおよび組織の継代培養

(1)で誘導したカルスあるいは組織を、 MSD培地すなわち 2, 4— Dを lmg/1含有する MS寒天培地（ショ糖 30g/L含有）で 2週間あるいは 4週間の間隔をお!/、て継代培養を行った。（以後、この工程で得られた培養物を MSD培養物と称する。 )

[0088] (3)培地への移植培養

(2)で得られた MSD培養物を、 2, 4— Dを含有しない以外は MSD培地と同じ組成の培地（以後この培地を MS0と称する）に移植して、移植後から、光を照射しない条件で 25°Cで培養をおこなった。日数が 30日を越えたものは同じ培地に移植し継代培養した。（以後、この工程で得られた培養物を MS0培養物と称する。 )

[0089] (4)培養物の抗菌活性の測定

上記（2)および（3)で得られた MS0培養物の抗菌活性を測定した。以下の表 3に示す真菌類を、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NBRC)より分譲を受けて、 PDA培地上での成長を比較することにより培養物の抗菌活性を調べた。

[0090] [表 3]

表 3

菌株学名植物病原菌としての菌名番号

31226 Alternaria brassicicola アブラナ科黒スス病菌

7642 Ascochyta pisi エンドゥ褐班病菌

6531 Fusarium oxysporum r. sp. lycopersi ci トマト萎ちよう病菌

5279 Pyricularia oryzae イネいもち病菌

[0091] まず、真菌類の培養寒天ディスク（9mm)を、 PDA培地の中央に、切り出した寒天と入れ替えて設置した。その菌ディスクから同心円上に、 1. MS0培養物 2. MS0 培養物をオートクレーブしたもの（MS0培養物 +オートクレーブ）の 2点のサンプルを設置した。

[0092] 25°Cで、 5〜10日間培養し、各サンプル周辺でのコロニーの成長を観察した。抗菌活性物質を培地上に溶出しているサンプルの周辺ではコロニーは同心円状には広がらず、サンプルの周辺を避けるように成長する。表 3に示したそれぞれの菌について上記の試験を行い、コロニーが各サンプルに到達した時点のサンプルと中心を結んだコロニーの直径を測定することにより、抗菌活性の度合いを比較したグラフを図 1〜4に示す。いずれの真菌類を用いた試験でも、 MS 0培養物に抗菌活性が認められ、 MS0培養物 +オートクレーブは抗菌活性を全く示さなかった。各々の培養物について、カルコン類化合物（キサントアンゲローノレ（XA)と 4 ハイド口キシデリシン (4HD) )の含有を下記の方法で測定した。すなわち、培養組織を凍結乾燥後、乾燥物 50mgに対して lmlの 60%エタノール水溶液を加え、 30分間、室温で抽出を行つた。次に抽出液を逆相系カラム（ODS— 80TsQA;東ソ一社製）を用いて HPLC で定量分析した。その結果、 MS0培養物と MS0培養物 +オートクレーブにはいずれもカルコンが検出された。この結果より、 MS0培養物にはカルコン以外の抗菌活性を有する物質が存在することが示唆された。またカルコンが難水溶性であることから、上記の MS0培養物の抗菌活性は、寒天培地上に拡散し得る水溶性の抗菌物質に起因することが予想された。

[0093] 実施例 2 DNAマイクロビーズアレイ解析によるディフェンシン遺伝子の単離

DNAマイクロビーズアレイ解析により遺伝子の発現の状態を観察することにより、抗菌物質を生産して!/、る遺伝子あるいは抗菌活性物質の同定を試みた。

[0094] (1)試料の調製

実施例 1で得られた MSO培養物および MSD培養物からトリゾル試薬 (ギブコ社製) により全 RNAを抽出した。

[0095] (2)タグライブラリー作製

米国公開公報第 2004/0002104号記載のタグベクター pMBSlを BamHIおよび Bbsl〔いずれもニューイングランドバイオラブ（NEB)社製〕により消化したあと、ゥシ小腸アルカリホスファターゼ（CIAP、タカラバィォ社製）により脱リン酸処理を行つた。 MS0培養物由来の全 RNAlO ^ gを铸型とし、配列表の配列番号 61で示されるビォチン化プライマーを用いて 5'—メチル化 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを基質として M— MLV RTase (タカラバイオ社製）で逆転写反応を行い、続いて 5' —メチル化一 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを基質として RNaseH、 E. coli DNA ligase, E. coli DNA polymerase I (いずれもタカラバィォ社製）にて 2nd str and合成を行い、合成した二本鎖 cDNAを、フエノール処理、クロ口ホルム処理、エタノーノレ沈殿 ίこより精製し、 400 1の丁 E緩衝溶 ί夜 10mM Tris -HCl pH7. 5, 1 mM EDTA)に溶解した。 UR—20P (トミー精ェ社製）により 15秒間の超音波処理を 4回行った後、 CIAPにより脱リン酸処理を行った。この DNAをフエノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によって精製し、タカラ Blunting Kination Ligat ionキット（タカラバイオ社製）を用いて末端の平滑化とリン酸化を行った。ァガロースゲル電気泳動により DNAを分離し、 400— 600bpのゲノレブロックを切り出し、 QIAG EN gel purification Kit (キアゲン社製）により DNAを抽出した。この DNAを 1 mgのダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に、 25°Cで 30分間結合させ、 MPC (ダイナル社製）に 30秒間静置した後、上清を除去した。 lxBW緩衝液（10mM Tris— HCl pH7. 5, ImM EDTA,

2. OM NaCl)によりビーズの洗浄を行った後、内部に Sfa NI部位を持つァダプター DNAを添加し、 T4 DNA ligase (タカラバイオ社製）により、 16°C、一晩、ライゲーシヨン反応を行った。なお、アダプター DNAは、配列表の配列番号 62で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 63で示されるオリゴヌクレオチドをァニールさせたものである。アダプターが連結された DNAを含むアビジンビーズ懸濁液を铸型とし、 PCRを行った。 cDNAのポリ A側のプライマーには、 5'側に Sfa NI認識配列を揷入しておいた。 PCR産物の一部を Sfa NIで消化した後、ダイナビーズ M— 2 80ストレプトアビジン（ダイナル社製）に結合させ、回収した上清 DNAを、フエノール処理、クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製した。

この断片ィ匕 DNAと Brenner S.他 12名 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 年 vol. 97, pl665- 1670 の方法にて直鎖ィ匕した pMBS lを T4 DNA Ligas e (タカラバイオ社製）により連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロボレーシヨンにより Ε· coli TOP 10 (インビトロジェン社製）を形質転換した。クローン数 1 00万相当の培養物から QIAGEN Plasmid Midi Kit (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNAを精製し、タグライブラリーを得た。

(3)マイクロビーズの調製

(2)で得られたタグライブラリーを铸型にして、上記 Proc. Natl. Acad. Sci. USA

2000年 vol. 97、 pl665— 1670 記載の方法を一部改良し PCRを行った。 PC Rは 5'—メチル化 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを基質とし、プライマーには配列表の配列番号 64で示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号 65で示される FAMで標識したものと配列表の配列番号 65で示されるオリゴヌクレオチドをビォチン化したものを 9 : 1の比率で混合した混合オリゴヌクレオチドを用い、 Ex Taq Hot Start V ersion (タカラバイオ社製）にて反応した。その後上記 Proc. Natl. Acad. Sci. US A 2000年 vol. 97、 pl665— 1670 記載の方法に従い、制限酵素 Pad (NEB 社製）による消化及び T4 DNAポリメラーゼ（NEB社製）によるタグ部分の 1本鎖化を fiつた。

[0097] 1本鎖タグつき標的 DNA断片 150 gと、アンチタグが結合したマイクロビーズ 2· 7

X 10⁷個を混合し、 500〃1の 500mM NaCl、 10mM リン酸ナトリウム、 0. 01 % Tween 20、 3%デキストラン硫酸中で 69°C、 4日間ハイブリダィズさせた。マイクロビーズを 14· 3mM Tris— HCl (pH8)、 1. 43mM EDTA、 0· 02% Tween 2 0に続き、 lOmM Tris-HCl (pH7. 5)、 lOmM MgCl、 ImM Dithiothreitol

2

、 50mM NaCl, 0. 01 % Tween 20で洗浄した後、 T4 DNAリガーゼを作用させることによって標的 DNA断片とアンチタグの間に共有結合を形成させた。その後、 600 Gダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に 25°Cで 30分間結合させ、 MPC (ダイナル社製）に 1分間静置した後、上清を除去した。 10mM Tris— HCl (pH8)、 ImM EDTA、 0. 01 % Tween 20 lmLにて再懸濁し、 MPC (ダイナル社製）に静置した後、上清を除去するという洗浄操作を繰り返し、 1本鎖タグつき標的 DNA断片の載ったマイクロビーズのみを分離した。

分離したマイクロビーズを Spelで消化し、ダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）より切り出した。最後に、アルカリ処理による一本鎖化を行った。

[0098] (4)競合ハイブリダィゼージョン

MS0培養物、および MSD培養物由来の全 RNA各 lO ^ gを铸型とし、配列表の配列番号 61で示される T7プロモーター配列付きのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 M— MLV逆転写酵素（タカラバイオ社製）により cDNA合成を行った。この cD NAを铸型として、 T7 RNA polymease (タカラバイオ社製）により RNAを合成した。なお、 MSD培養物由来の cDNAには Fluorescein— dUTPを、 MS0培養物由来の cDNAには Cy5— dUTPを取り込ませ、 RNAプローブを得た。これらのプローブを、上記（3)で作製したマイクロビーズ 20万個につ!/、てハイブリダィゼーシヨンを行つた。 lxSSC/0. 1 % SDS、次レヽで、 0. lxSSC/0. l ⁰/₀SDS iこよる洗净を ί亍った後、 MoFloサイトメーター（ダコサイトメーシヨン社製）を用いて解析を行った。 MS0 培養物に特異的に発現量が上昇した遺伝子が結合したマイクロビーズを含む領域より、全マイクロビーズ数の 1 %相当をソートした。

[0099] (5)選択的クローニング

ソートされたビーズの一部、約 1200個相当を铸型とし、配列表の配列番号 66で示されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号 67で示されるオリゴヌクレオチドをブライマ一に用いて、 PCRにより、マイクロビーズ上の DNAを増幅した。 SfaNIで消化した後、 DNA断片を精製し、 pUC19を BsmBIをマルチクローニングサイトに持つように改変して作製したプラスミドベクター pMSLlを BamHI、 BsmBIで消化し直鎖化したものに、 Takara ligation kit Mighty Mix (タカラバイオ社製）を用いて連結した。得られたクローン、つまり、 MS0培養物に特異的に発現量が上昇した遺伝子断片を含むクローン約 1200個をシークェンス解析した。パラセルクラスタリングパッケ一ジ (パラセル社）によるクラスタリング解析を行った結果、上記クローンの配列は 86種類に分類された。 nrデータベースに対して BLAST検索を行った結果、 MS0培養物に特異的に発現している mRNAの約 6%という高い率でディフェンシン様の配列が大量に発現して!/、ることがわ力た。

[0100] (6)ァシタバ由来ディフェンシン遺伝子の全長の解析

ァシタパ由来ディフェンシンの候補配列を（5)のクラスタリングの結果より集めた。 4 9の候補配列があり、その配列をもとにアッセンブルし、 32種類の遺伝子配列を決定した。この cDNAの配列を配列番号 27〜58に示した。また、これらの配列がコードするアミノ酸の配列を配列番号 1〜24に示した。また SignallPプログラムによるシグナルペプチドの検索の結果、各々のペプチドの配列において、シグナルペプチドと推定される部分が推定された。これらの結果を、前述の表 1に示す。

[0101] 実施例 3 ァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量およびペプチド量の測定

( 1 )リアルタイム RT— PCRによるァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量の比較本発明のァシタバ培養物中のァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量を比較し、調べるためにリアルタイム PCRを行った。試料は、 MS0培養物、 MSD培養物、種子力、ら栽培して 1年たつたァシタパの葉、茎、芽、根元、根毛、主根を回収または採取して、液体窒素中で乳鉢にて破砕し、トリゾル試薬 (ギブコ社製）により全 RNAを抽出した後、 RNase free DNasel (タカラバイオ社製）によりゲノム DNAを除去した。逆転写反応およびリアルタイム PCRは、 SYBR RT-PCR Kit (Perfect Real Ti me) (タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。すなわち、全 R NAを鍀型とし、 Random hexamerをプライマーに用いた逆転写反応により一本鎖 cDNAを合成した。なお、 MS0培養物の全 RNAについては、検量線作成用として、段階希釈したものを用いた。次に、各試料から調製した一本鎖 cDNAを铸型とし、 S mart Cycler II System (Cepheid社製）によるリアルタイム PCRを行った。ァシタバ由来ディフェンシン遺伝子の増幅には、配列表の配列番号 68および 69記載の塩基配列を有するプライマーを用いた。コントロールのハウスキーピング遺伝子としたポリュビキチン遺伝子の増幅には、配列表の配列番号 70および 71記載の塩基配列を有するプライマーを用いた。上記プライマー対を用いてリアルタイム PCR実施後、得られた Ct値をそれぞれの検量線に代入し、初期铸型量を算出した。ポリュビキチンの発現量により、個体間の RNA量を補正した後、各試料におけるァシタパ由来ディフェンシン遺伝子の mRNAの相対量、すなわち MSD培養物におけるァシタバ由来ディフェンシン遺伝子の mRNAの発現量を 1とした場合の含量を算出した。その結果を図 5に示す。図 5中、縦軸は MSD培養物に対するァシタバ由来ディフェンシン遺伝子の発現量に対する相対倍率を示し、横軸は、試料の種類を示す。ァシタパの培養細胞および植物体の各組織間において、ァシタバ由来ディフェンシンの mRNA 量を比較したところ、 MS0培養物においては MSD培養物やその他の植物体組織に比較して、約 5〜200倍のァシタバ由来ディフェンシンの mRNAが発現していることカゎカゝつた。

(2)ウェスタンブロッテイングによるァシタバ由来ディフェンシンのペプチド量の測定本発明のァシタバ培養物中の抗菌ペプチドァシタバ由来ディフェンシンのペプチド含量を比較、調べるためにウェスタンブロッテイング解析を行った。試料は、 MS0培養物、 MSD培養物、種子から栽培して 1年たつたァシタパの葉、茎、芽、根元、根毛、主根から回収または採収し、液体窒素中ですりつぶした後に、抽出バッファーで抽出した。すなわち、約 25gの植物組織を液体窒素中で乳鉢にて破砕した後、約 50ml の緩衝液（10mM NaH PO 、 15mM Na HPO 、 lOOmM KCL 2mM EDT

2 4 2 4

Aになるように超純水に溶力、した）にカテキン類、カルコン類などのポリフエノール類の吸着を取り除くために 1 · 5% (w/v)の PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone)およびプロテアーゼ阻害剤として ImM PMSFを加えた抽出緩衝液を加えて 4°C、 2時間かくはんしながら抽出した。次に 7000g、 20分の遠心分離で上清を得た。これを粗タンパク液として、硫安分画に用いた。硫安分画は一般的な生化学の方法により行い試験用抽出液とした。抽出サンプルは、 BCA Protein Assayキット（PIERC E社製）で総タンパク量を定量した。抽出サンプルの一部を用いて SDS— PAGE後、トランスブロット SDセル (バイオラッド社製）を用いてウェスタンブロッテイングを行つた。ブロッテイングしたメンブレンは抗体によるディフェンシン検出のためにハイプリバック（コスモバイオ社製）にいれて反応に供した。 1次抗体として、配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の 3；!〜 45番に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチド N、配列番号 1に示すアミノ酸配列の 47〜58番に相当するアミノ酸配列からなる合成ぺプチド M、及び配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の 78〜87番に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチド Cを作製して、各合成ペプチド 2mgを抗原にしてゥサギ 1羽をそれぞれ免疫し、 51日後に採血して、ポリクローナル抗体 AD— N、 AD-M 及び AD— Cを作製した。なお、合成ペプチド M及び Cのアミノ酸配列は配列表の配列番号 1、 25及び 26に含まれる配列であり、合成ペプチド Nのアミノ酸配列は配列表の配列番号 1及び 25に含まれる力 S、配列表の配列番号 26には含まれない配列である。上記の 3種の 1次抗体でそれぞれ 1時間反応し、洗浄後、市販の抗ゥサギ HRP 標識 2次抗体（ザィムド社製）で 1時間反応、洗浄した。さらに、 TrueBlue Peroxida se Substrate (KPL社製）を用いて反応、発色することにより検出した。ァシタパの培養細胞において、ァシタパ由来ディフェンシンタンパク質を検出したところ、 MS0 培養物においては AD— N、 AD— M及び AD— Cのいずれの抗体でもァシタバ由来ディフェンシンタンパク質を検出できた力 S、 MSD培養物においては AD— N抗体で検出できず、 AD— M、 AD— C抗体で弱いながらも検出できた。植物体の組織からのサンプルについては、サンプル量を大量に使用することで、 AD— M、 AD— C抗体でァシタバ由来ディフェンシンタンパク質を検出できる力 S、茎および芽生えでは検出量が少なかった。また、 AD— N抗体で植物体組織中のァシタバ由来ディフェンシンタンパク質を検出したところ、種子でのみ検出できた。 [0103] 実施例 4 ァシタパ培養物からの粗タンパク抽出物の抗菌活性

実施例 3 (2)と同様にして、 MS0培養物および MSD培養物からペプチド溶液を調製した。すなわち、約 25gの植物組織を液体窒素中で乳鉢にて破砕した後、約 50ml の緩衝液（10mM NaH PO 、 15mM Na HPO、 lOOmM KCL 2mM EDT

2 4 2 4

Aになるように超純水に溶力、した）にカテキン類、カルコン類などのポリフエノール類の吸着を取り除くために 1 · 5% (w/v)の PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone)およびプロテアーゼ阻害剤として ImM PMSFを加えた抽出緩衝液を加えて 4°C、 2時間かくはんしながら抽出した。次に 7000g、 20分の遠心分離で上清を得た。これを粗タンパク液として、硫安分画に用いた。硫安分画は一般的な生化学の方法により行い、 30〜70%飽和画分を試験用抽出液とした。この抽出液を用いて、以下の方法で抗菌活性を調べた。表 3に示す各病原菌を PDA(Potato Dextrose Agar : DIFCO社製)培地に接種して、 25°Cで 8日間培養した。次にシャーレを無菌水で満たしスパチュラで擦り取るように菌体胞子を集めた。集めた胞子は綿布で濾した後、遠心分離（4000xg、 15分）により集めた。 2回洗浄した後、 1mlあたり 2X10⁷個の胞子になるように PDB (Potato Dextrose Broth)に懸濁し、濃度 20% (v/v)になる様にグリセロールを添加して一 80°Cにストックした。次に、このストック胞子液から、 96ゥエルのプレート（FALCON製）の各ゥエルに 2000個の胞子を入れ、上記のぺプチド溶液試料および PDBを加えて 25°Cで培養した。培養;!〜 2日後に胞子からの発芽と菌糸の伸長を顕微鏡下で観察することにより抗菌性を判断した。その結果、いずれの菌においても、 MS0培養物からの粗タンパク抽出物を添加した群では発芽菌糸が殆ど伸長しないのに対して、 MSD培養物からの粗タンパク抽出物を添加した群では若干の菌糸の伸長がみられた。以上より、 MS0培養物からの抽出物に特に強い抗菌活性が認められた。

[0104] 実施例 5 ァシタパ由来ディフェンシンの遺伝子工学的な製造

ァシタパ由来ディフェンシンを遺伝子工学的に製造するために、大腸菌内で、マルトース結合タンパク (MBP)との融合タンパク質として発現させることを試みた。

[0105] (1)プラスミドおよび形質転換体の作成

実施例 2にて得られたァシタバ由来ディフェンシンを含むクローンのうち、配列表の配列番号 41の核酸配列を有するクローン体 H338— U1L1— PCM— PI— H02を選択した。このクローン体のグリセロール保存溶液を铸型にして、配列番号 72および 7 3で示されるプライマーを用いた PCRにより、約 200bpの DNA断片を増幅した。この断片は配列番号 41で示されるァシタパ由来ディフェンシン遺伝子の塩基番号 107から 307の部分、すなわち配列表の配列番号 59で表される核酸配列を含む DNA断片である。 PCR産物を EcoRIおよび Pstlで消化した後、 pMALp— 2xベクター（NE B製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— AkDEFlを得た。このプラスミドを用いて Ε· coli Rossetta (Novagen社製）または Ε· coli BL21 (タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた菌株をそれぞれ pMBP—AkDEFl/Ros、 pMBP—AkDE F1/BL21と命名した。配列表の配列番号 41の塩基番号 107から 148の部分は、図 8に示すとおり、他の植物体由来のディフェンシン遺伝子配列と比較して、ァシタバ由来ディフェンシン遺伝子に特異的に存在すると予想される部分である。上記の部分を欠失させた部分遺伝子配列を取得する目的で、上記のクローンのグリセロール保存溶液を铸型にして、配列番号 73および 74で示されるプライマーを用いた PC Rにより、約 160bpの DNA断片を増幅した。この断片は配列番号 41で示されるァシタパ由来ディフェンシン遺伝子の塩基番号 149から 307の部分、すなわち配列表の配列番号 60で表される核酸配列を含む DNA断片である。この PCR産物を EcoRIおよび Pstlで消化した後、 pMALp2xベクター（NEB製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— AkDEF2を得た。このプラスミドを用いて Ε· coli Rossetta (Novagen社製）または E. coli BL21 (タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた菌株をそれぞれ pMBP— AkDEF2/Ros、 pMBP— AkDEFl/BL21と命名した。コントローノレとして用いる大根のディフェンシンである AFP2ペプチドをコードする DNA断片を下記の方法で得た。 Plant Geno— DNA— Template (Geno Technology社製）により、大根の葉からゲノム DNAを抽出した。 GenBankのァクセッションナンバー U18 556. 1の配列情報より、配列番号 75および 76で示されるプライマーを用いた PCR により、約 160bpの DNA断片を増幅した。 PCR産物を EcoRIおよび Pstlで消化した後、 pMAL— p2xベクター（NEB製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— RsAFP 2を得た。このプラスミドを用いて Ε· coli Rossetta (Novagen社製）または Ε· coli BL21 (タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた菌株をそれぞれ pMBP— RsAFP 2/Ros、 pMBP— RsAFP2/BL21と命名した。

[0106] (2)大腸菌における MBP融合タンパク質の発現

pMBP— AkDEF 1/BL21、 pMBP— AkDEF2/BL21および pMBP— RsAF P2/BL21を、 25〃 g/ml アンピシリンおよび 20〃 g/mlのクロラムフエ二コールを加えた LB培地 5mLで 37°C終夜培養した。培養液の一部は 25 g/ml アンピシリンおよび SO ^ g/ml クロラムフエ二コールを加えた LB培地 5mLに移し、培養液の OD600の値が 0. 4-0. 6になるまで 37°Cで培養した。培養液の OD値を確認後、終濃度が 0. 3mMになるようにイソプロピル 0 D チォガラタトピラノシド（IPTG )を添加し、 15°Cで 24時間の培養後に遠心でその菌体を回収した。

[0107] (3)発現タンパク質の精製

上記（2)で回収した菌体を、 0. 5mlのカラムバッファー（20mM Tris— HC1、 0. 2 M NaCl、 ImM EDTA、 ImM DTT pH7. 4)に再懸濁し、 PMSF (終濃度 1 mM)およびァプロチュン（終濃度 10mM)を添加し、 SONIFIER 250D (BRANS ON)で超音波破砕した。破砕した菌体は、 1500rpmで 4°Cで 10分間遠心し、その上清を精製に用いた。遠心後の沈殿は、 PreserveX—QML Polymeric Micelle s (QBI社製）を用いて可溶化後、アセトン沈殿を行い、 200 Lのカラムバッファーに再懸濁した。カラムバッファーで平衡化した Amylose Magnetic Beads (NEB社製） 0. 1mlに遠心回収した上清を添加し、 4°C、 60分間の転倒混和後、磁性スタンドを用いて上清を除去した。次いで、ビーズを 500〃 Lのカラムバッファ一にて 3回洗浄した。洗浄後のビーズに、 10mMマルトースを加えたカラムバッファー 50 しを加え、 4°C、 10分間転倒混和し、上清を回収した。

[0108] 実施例 3の（2)と同様の方法を用いてウェスタンブロッテイングを行った。 1次抗体としては抗 MBP抗体（NEB社製）または実施例 3の（2)で得られた抗ディフェンシンポリクローナル抗体 AD - Mを用レ、た。 pMBP—AkDEF 1 /BL21および pMBP— A kDEF2/BL21では、ァシタバ由来のディフェンシンポリペプチドと MBPタンパク質の融合タンパク質が発現していることを確認した。また、 pMBP— RsAFP2/BL21 では、抗 MBP抗体を用いた場合には検出される力抗ァシタパディフェンシンポリクローナル抗体では反応しない MBPタンパク質の融合タンパク質が発現していることを確認した。

[0109] pMBP— AkDEFl/BL21、 pMBP— AkDEF2/BL21および、 pMBP— RsA

100 1を100 8/1111 Ampicillinを含む 100mlの LB培地に接種し、 37°Cで 1晚振とう培養した。 60mlの前培養液を 3Lの同薬剤を含む LB培地に植え継ぎ、 37°C、 200rpm、通気量 2L/minで約 1. 5時間振とう培養した。 OD600力 . 7付近になった時点で、 15°Cで 30分間培養後、 0. 3 mMとなるように IPTGを添加し、さらに 15°Cで 22時間培養した。培養液を遠心分離により集菌後、— 80°Cで保存した。

[0110] 凍結した菌体を 200mM NaCl, ImM EDTA、及び ImM PMSFを含む 20m M Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液 70mlに懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離（20, 000 X g、 30分）により可溶性画分を得た。

[0111] 得られた 76mlの可溶性画分について、 200mM NaCl, ImM EDTAを含む 20 mM Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液で平衡化した 9mlの Amylose Resinカラムにァプライした。 45mlの上記緩衝液で 2回洗浄した後、 200mM NaCl、 ImM EDTA 及び lOmM maltoseを含む 20mM Tris— HCl (ρΗ7· 5)緩衝液 9mlを用いて 5 回溶出した。得られた各融合タンパク質の含まれる溶出画分を vivaspin20 (分画分子量 10, 000)で濃縮し、ミリ Q水に対して透析した。また、融合蛋白質 MBP— Ak DEF1には抗菌活性も認められた。

[0112] (4)発現蛋白質からの MBP除去と抗菌活性の測定

上記（3)の融合蛋白質 MBP— AkDEFl (9. 3mg/ml)、 MBP— AkDEF2 (6. 6mg/ml)または MBP— RsAFP2 (9. 2mg/ml)の各サンプル 400 1に 150 m M NaCl及び ImM CaClを含む 10mM Tris— HCl (ρΗ7· 5)緩衝液 1600〃1

2

ならびに FactorXaを 35U加え、 4°Cで 23時間反応させた。

[0113] 反応終了後、各々の反応液を 150mM NaClを含む 50mM Tris-HCl (pH7.

5)で平衡化した lmlの HiTrap Benzamidine FFカラムにアプライし、通過させた。 3mlの同緩衝液の洗浄画分とまとめた 5mlを 200mM NaCl及び ImM EDTA を含む 20mM Tris -HCl (pH7. 5)で平衡化した 7mlの Amylose Resin カラムにアプライした。次ぎに、上記緩衝液 7mlで 2回洗浄した後、 10mM Maltoseを含む上記緩衝液 7mlを用いて 3回溶出させた。

[0114] クロマト後の各々の Amylose Resin非吸着、洗浄画分をまとめて回収し、 vivaspi n6 (MWCO 3, 000)で濃縮後、ミリ Q水を添加、濃縮を繰り返し、 AkDEFl、 AkD EF2および RsAFP2のペプチド溶液を得た。得られた AkDEFl、 AkDEF2および RsAFP2ペプチド溶液の濃度、純度を定量するため、 SDS— PAGE解析を行った。電気泳動は、 15%アクリルアミドゲノレ/トリス—トリシン緩衝液を用いて行い、 CBB染色により解析を行った。目的タンパク質の定量は、濃度既知の BSAのバンドより検量線を求め算出した。純度は、レーン当たりの目的タンパク質の占める割合を算出した。得られた AkDEFl及び AkDEF2は、それぞれ配列表の配列番号 25及び 26で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

[0115] 実施例 3の（2)と同様の方法を用いてウェスタンブロッテイングを行った。 1次抗体としては実施例 3の（2)で得られた抗ディフェンシンポリクローナル抗体である AD— N 、 AD— M及び AD— Cをそれぞれ用いた。その結果、一次抗体として AD— M及び AD— Cを用いた場合は AkDEFl及び AkDEF2のいずれのポリペプチドも検出された力 AD— Nを用いた場合は AkDEFlのみ検出された。

[0116] 上記濃縮精製品を用いて、以下の方法で抗菌活性を調べた。まず表 2に示す各病原菌を PDA(Potato Dextrose Agar : DIFCO社製）培地に摂取して、 25°Cで 8 日間培養した。次にシャーレを無菌水で満たしスパチュラで擦り取るように菌体胞子を集めた。集めた胞子は綿布で濾した後、遠心分離 (4000 X g、 15分）により集めた。 2回洗浄した後、 1mlあたり 2 X 10⁷個の胞子になるように PDB (Potato Dextrose Broth)に懸濁し、濃度 20% (v/v)になる様にグリセロールを添加して 80°Cにストツクした。次に、このストック胞子液から、 96ゥエルのプレート（FALCON製）の各ゥエルに 2000個の胞子を入れ、上記のペプチド溶液試料および PDBを加えて 25°C で培養した（n = 3)。培養 1〜2日後に OD600を測定して n = 3の平均値を用いて増殖曲線を描いた。試料濃度と増殖曲線から求めた阻害曲線を描いて、 50%阻害を示す試料濃度を IC50として計算した結果、 Fusarium oxysporumに対する IC50 は、 AkDEFl力 g/ml、 AkDEF2および RsAFP2が 1 μ g/mlであり、非特許文献「JBC, 267, 15301 , 1992年」上、最も強い植物ディフェンシンである RsA FP2と同じレベルの抗菌活性があることが確認できた。

[0117] 実施例 6 明日葉ディフェンシンの安定性とプロテアーゼ耐性

(1)実施例 5で調製した AkDEFlまたは RsAFP2ペプチドのディフェンシンおよび抗菌ペプチドとして知られるプロチォニン (タカラバイオ社製）を約 5ヶ月凍結保存、数回の凍結融解を行ったサンプルを用意した。このサンプルを実施例 5と同様にして、 Fusarium oxysporumniに対する IC50を算出した。その結果を図 6に示す。即ち、図 6は、 5ヶ月間の保存安定性を示す図であり、縦軸は、保存前と比較した相対活性であり、横軸は、供試サンプルのペプチド名である。

[0118] 図 6に示したように、 AkDEFlペプチドは、大根のディフェンシン RsAFP2や抗菌ペプチドプロチォニンに比較して、保存安定性に優れ、むしろ抗菌活性が増大することが確認できた。

[0119] (3)さらに、実施例 5で調製した AkDEFl、 AkDEF2ペプチドまたは RsAFP2ディフェンシンおよび抗菌ペプチドとして知られるプロチォニン（タカラバイオ社製）を 150 g/mlになるように 2. 5mM DTTを含む 10mM リン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、プロテアーゼとしてキモトリブシンを 100 g/mlになるように加えた。また、未処理のコントロールとしてプロテアーゼを加えなレ、サンプルも調製した。このサンプルを 37°Cで 3時間反応したあとに、実施例 5と同様にして、 Fusarium oxysporumniに対する IC50を算出した。

[0120] (4)この結果を図 7に示す。即ち、図 7は、プロテアーゼ耐性を示す図であり、縦軸は、残存活性、つまり、プロテアーゼ未処理のコントロールと比較した相対活性であり、横軸は、供試サンプルのペプチド名である。

[0121] 図 7に示したように、明日葉のディフェンシン AkDEFl、 AkDEF2は、大根のディフェンシン RsAFP2や抗菌ペプチドプロチォニンに比較して、プロテアーゼに耐性であり、プロテアーゼ処理後も約 80%の残存活性があることが確認できた。

産業上の利用可能性

[0122] 本発明により、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織培養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有する抗菌剤が得られる。これにより安価で安全な抗菌剤を提供する事ができる。また本発明により、新規な抗菌作用をもつタンパク質であるァシタバ由来のディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする核酸を得る事ができる。該ディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする核酸は該ディフェンシンを高含有する抗菌剤の製造に非常に有用である。

配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: :61; ; Oligonucleotide used as a primer in a reverse transcription

SEQ ID NO: :62; ; Oligonucleotide used as an adaptor

SEQ ID NO: :63; ; Oligonucleotide used as an adaptor

SEQ ID NO: :64; ； PCR primer to amplify a cDNA library

SEQ ID NO: :65; ； PCR primer to amplify a cDNA library

SEQ ID NO: :66; ； PCR primer to amplify a cDNA library

SEQ ID NO: :67; ； PCR primer to amplify a cDNA library

SEQ ID NO: :68; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA

SEQ ID NO: :69; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA

SEQ ID NO: :70; ； PCR primer to amplify a polyubiquitin cDNA

SEQ ID NO: :71; ； PCR primer to amplify a polyubiquitin cDNA

SEQ ID NO: :72; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA

SEQ ID NO: :73; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA

SEQ ID NO: :74; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA

SEQ ID NO: :75; ； PCR primer to amplify a radish genomic DNA

SEQ ID NO: :76; ； PCR primer to amplify a radish genomic DNA

Claims

請求の範囲

[1] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、及び

工程（2)：工程（1 )で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、

を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。

[2] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、及び

を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織の処理物。

[3] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、及び

を包含することを特徴とするァシタパ由来のディフェンシンの製造方法。

[4] 下記（a)または (b)から選択されるポリペプチド、

[5] 請求項 4記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。

[6] 下記 (c)〜（g)から選択される核酸、

(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、

(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチド力前記（e)の核酸によってコードされるポリぺプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸。