KR102075637B1

KR102075637B1 - Pr26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102075637B1
Application number: KR1020170148265A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 박대영; 신우리; 안지영
Original assignee: 주식회사 에이치피바이오
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2020-02-10
Also published as: KR20190052521A

Abstract

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 의한 DNA 앱타머는 천연 항균성 펩타이드인 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 DNA 앱타머는 PR26 펩타이드를 활용한 천연유래 항균성 소재 개발에 사용될 수 있으며, 기존에 널리 사용되고 있던 화학합성 항균물질의 여러 부작용들을 보완하여 보다 안전한 천연유래 항균성 소재 개발이 가능할 것으로 기대된다.

Description

PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도 {DNA Aptamer Specifically Binding to PR26 Peptide and Its Use}

최근 국내에는 구제역(foot and mouth disease; FMD), 고병원성 조류인플루엔자(high pathogenic avian influenza; HPAI) 등 악성 가축전염병 주기적인 발생과 상재성 가축질병들의 상시 발생으로 인한 경제적 피해가 막대한 실정이다. 이들 가축질병의 발생은 국내 축산업의 생산성을 저하시켜 축산농가의 경제적 손실을 초래할 뿐만 아니라 국내 축산업의 국제 경쟁력을 약화시켜 축산업의 존립기반을 위협하고 있다. 또한 배합사료 첨가용 항생제의 사용 금지에 따른 가축의 성장 부진과 세균성 질병 발생의 증가와 예상되므로, 가축전염병에 대한 종합적인 조기예방 및 제어대책이 국내 축산업 분야의 현실적인 문제로 대두되고 있다. 다제내성균과 같은 항생제 내성균주의 출현으로 인하여 축산분야에서의 항생제 사용이 엄격하게 규제되고 있으며, 특히 가축의 성장촉진 목적으로 사용되어오던 배합사료 첨가용 항생제의 사용이 2011년 7월부터는 국내에서도 완전히 사용이 금지될 예정이다. 또한, 식품의약품안전청이 2005년 4월부터 7개월간 조사한 ‘식품 중 식중독균 항생제 내성 모니터링’ 결과에 따르면, 육류에서 검출된 대장균이 항생제에 92.5%의 내성률을 보이는 등 식품산업에서도 항생제 내성균 문제가 큰 문제점으로 대두되고 있다.

현재 국내에는 가축전염병을 예방치유할 수 있는 여러 종류의 예방약, 항생제대체제, 면역증강제, 생균제, 미네랄제제 등이 개발되어 시판되고 있으나, 그 효능과 사용지침에 대한 연구결과는 거의 전무한 상태이다. 따라서, 새로운 개발 물질들의 효능 및 안전성을 과학적이며 객관적으로 평가할 수 있는 효능평가기법의 개발이 필요한 상황이다. 최근 성장촉진용 항생제를 대체할 수 있는 여러 범주의 천연제제가 개발되고 있는데, 이를 비항생제 성장촉진제 또는 성장촉진용 천연물질이라고 한다. 이러한 비항생제 성장촉진제는 기존의 성장촉진용 항생제에 비하여 세균의 내성을 유발하지 않고, 축산물(육류, 우유, 계란)에 항생제 잔류 문제가 발생되지 않는 장점이 있을 뿐만 아니라 건강한 장내미생물총의 신속한 발달, 소화기능의 안정화와 설사병 감소, 성장촉진과 사료효율 개선, 면역자극과 빠른 성숙, 폐사율 감소와 이윤 증대 등 다양한 유용효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다.

현재 의학 및 식품분야에서 주목받고 있는 항미생물 펩타이드(Anti-microbial peptide; AMP)는 포유동물, 어류, 곤충 등을 포함한 다양한 생물체에서 생성된 천연항생물질로써 유전적 제어가 가능하고 내재성면역(innate immunity)을 통한 생체방어에 중요한 역할을 한다. 또한 외부물질에 의해 유발될 수 있는 부작용의 가능성이 적어 항생제 내성균 문제의 해결책 중 하나로 주목받고 있다. 항균성 펩타이드는 천연 항균 특성 및 숙주의 면역 반응을 조절하는 능력으로 인해 약제로서의 가능성을 인정받아 수년 전부터 상당한 주목을 받아왔다. 이러한 소위 숙주 방어 펩타이드 (HDP)는 모든 종류의 생물에 넓게 편재되어 있으며 세균, 곰팡이 및 바이러스 감염에 대한 첫 번째 방어선 역할을 수행한다. 대부분의 숙주 방어 펩타이드는 친수성 잔기와 소수성 잔기를 모두 가지는 양친 매성이며 양전하를 띄고 대부분은 소수성 잔기로 구성되어 있다. 분자적 성질과 구조적 형태에 따라 HDP는 크게 cathelicidins과 defensins 두부류로 나눌 수 있다. 그 중 Defensin은 28-42개의 아미노산으로 구성되는데 포유동물에서는 50개 이상의 defensin이 알려져 있다. 사람에서는 6개의 α-defensin, 3개의 β-defensin이 발견되었고, 세균, 진균, 일부 바이러스를 파괴하거나 또는 불활하 시키는 효과를 가지고 있으며 선천 면역과 후천면역과 관련하여 외부 감염에 대한 방어 시스템에 기여한다. 적막 상피세포나 호중구, NK cell, CTL과 같은 세포에서 분비된다. Cathelicidins은 두번째로 중요한 antibicrobial molecule인데 호중구의 과립속에 있는 친구들이 바로 cathelicidins 이다. 사람과 마우스에서 단 하나의 cathelicidin 유전자를 가지고 있으며 이에 반해 돼지, 소, 말 등과 같은 동물에서는 여러 개의 유전자가 있다. 포유류 중 돼지는 다른 포유류에 비해 매우 높은 cathelicidins 보유량을 가지고 있다. 1차 아미노산 조성을 기준으로 하여, 돼지 cathelicidins은 선형 proline-rich cathelicidins (PR26, prophenin 1, 2)와 disulfide가 풍부한 protegrins 1-5, arginine/histidine-rich 골수 이형군으로 분류된다. 그 외에 Lysosome은 세균의 세포벽의 구성성분인 N-acetyl muraminic acid와 N-acetyl glucosamie의 결합을 cleave하는 작용을 함으로써 peptidoglycan을 파괴하는 것으로 알려져 있다. 항체가 체내에 없거나 효소 활성이 잘 이루어지지 않을 때는 세균의 표면에 달라붙어서 식세포 작용을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 돼지 유래 항균성 펩타이드 중 PR26 펩타이드를 활용한 천연 항균 소재 개발을 위해 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하고자 하였다.

PR26은 원래 돼지 소장으로부터 분리되었지만, 많은 후속 연구를 통해 PR26이 돼지 소장 뿐 만 아니라 골수와 호중구에서도 발현된다는 것이 입증되었다. PR26 펩타이드는 초기에 발현된 형태에서 번역 후 변형 과정을 거처 N 말단 부분이 절단되고 성숙한 형태의 형태를 갖추게 된다. 이 성숙한 PR26 펩타이드는 다제 내성을 포함하여 광범위한 박테리아에 대해 항균적 활성을 나타낼 수 있다. 다른 proline-rich 펩타이드들과 마찬가지로, PR26은 membrane perturbation에 의한 세포 용해를 촉진 할뿐 아니라 membrane을 가로 지르며 DNA와 단백질 합성과 같은 세포의 다양한 생명활동들을 방해한다. PR26은 항균성 외에도 호중구의 이동을 유도하고, 세포사멸과정을 억제하여 대식세포의 생존력을 조절하며, 저산소 상태의 내피 세포에서 항세포사멸 인자로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이외에도 PR26 펩타이드는 조직 내 혈관 신생의 조절, 상처 회복의 촉진 및 손상된 조직의 염증 예방과 같은 다양한 생명활동에서 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근 많은 연구를 통해 확인되고 보고되었다. 본 발명에서는 PR26 펩타이드와 결합하는 DNA 앱타머를 제작하고, 이를 이용한 PR26의 검출 기술 개발에 응용하고자 하였다.

본 발명에서 활용하고자 하는 앱타머 (aptamer)는 짧은 길이의 올리고머(oligomer)로서, 안정한 구조를 형성하여 표적 물질에 높은 결합력과 특이성을 가지고 결합하는 특징을 가지고 있다. 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체에 비해 안정성이 높으며, 화학적 합성을 통해 제작할 수 있기 때문에 경제성 또한 높은 장점을 지니고 있다. 또한, 항체와 달리개발에 동물 실험이 필요하지 않을 뿐만 아니라 크기의 변화 및 소수성 변화를 통해 약물동력학적 성질을 쉽게 변형할 수 있으며 인체에서 면역반응 및 거부반응을 일으키지 않는다는 장점을 가지고 있어 표적 물질의 검출 및 질환 진단 기술개발은 물론 다양한 질병에 대한 치료제개발에서도 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 특허에서는 상기한 바와 같이 각종 산업 및 의학 분야에서 높은 잠재성을 보이는 앱타머를 활용하여 기존의 항체 기반의 기술을 대체하고자 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연 항균성 펩타이드로 알려진 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과, PR26 펩타이드를 표적으로 하여 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였으며, 선별한 DNA 앱타머를 활용하여 새로운 항균성 조성물을 제시함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머, 상기 앱타머를 포함하는 PR26 검출용 조성물 및 키트, 상기 앱타머를 이용한 시료 중 PR26 펩타이드의 검출 방법, 및 상기 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균성 조성물을 제공하고자 한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정한 3차 구조를 형성하며 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체로, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 동등한 의미로 사용될 수 있다. 상기 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 분자를 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 단일가닥 핵산으로 존재할 수 있다. 상기 앱타머는 3차 구조를 형성하여 PR26 펩타이드에 결합할 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 앱타머가 PR26 펩타이드 이외의 다른 유기화학물질에 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 PR26 펩타이드와 다른 유기화학물질의 구별을 가능하게 하는 것을 의미 한다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 광학적 신호, 전기화학적 신호, 방사성 동위원소에 의한 신호, 효소에 의한 신호, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 신호를 발생시키는 물질은 형광 물질 또는 인광 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, 또는 Cy5.5일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인(6-FAM), 5-테트라클로로-플루오레세인 포스포라미디트(TET), 헥사클로로-플루오레세인(HEX), 및 4,5-디클로로-디메톡시-플루오레세인(JOE)이 포함될 수 있다. 또한, 상기 광학적 신호는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍에 의해 발생되는 것일 수 있다. 상기 FRET 쌍으로서 당해 분야에 알려진 물질이 이용될 수 있다. 상기 전기화학적 신호를 발생시키는 물질은 메틸렌 블루일 수 있다. 상기 방사성 동위원소는 C¹⁴, I¹²⁵, P³², 또는 S³⁵일 수 있다. 상기 효소는 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 시토그롬 P450, 또는 글루코스 옥시다제일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다. 상기 특정 부위는 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 일부일 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머에 있어서, 상기 앱타머는 뉴클레오타이드의 당 (sugar) 2번 탄소의 수산화기 (-OH)가 수소원자 (-H), 불소원자 (-F), 아미노기 (-NH2), 또는 메톡시기 (-CH3)로 치환될 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함하는 PR26 펩타이드 검출용 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 HPLC, LC/MS, 또는 GC/MS와 같은 기기를 이용한 검출 또는 항체를 이용한 검출에 앞서, 시료 중 PR26 펩타이드의 유무를 신속하게 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 반응 완충액을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 키트는 시료 중 BDE-47을 검출하는 방법이 기재되어 있는 설명서를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 키트는 기판에 고정화된 앱타머를 포함할 수 있다. 용어 "기판"은 상기 앱타머가 고정화될 수 있는 고체 지지체를 의미한다. 상기 기판은 비드(bead), 막(membrane), 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate), 또는 칩(chip)일 수 있다. 상기 앱타머는 예를 들면, 자성비드에 고정화된 것일 수 있다. 이 경우, PR26 펩타이드와 특이적으로 결합된 앱타머는 자석을 이용하여 분리될 수 있다. 상기 앱타머는 상기 기판에 직접 또는 링커에 의해 공유적으로 결합될 수 있다. 상기 앱타머는 공유적으로 결합가능한 관능기를 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 카르복실기, 히드록시기, 또는 아민기일 수 있다. 상기 앱타머는 예를 들면, 비오틴화된 것일 수 있다. 비오틴화된 앱타머는 기판에 코팅된 스트렙트아비딘에 의해 고정화될 수 있다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 시료 중 PR26 펩타이드의 검출 방법을 제공하고자 한다. 상기 방법은:

(A) 시료와 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 접촉시키는 단계; 및

(B) PR26 펩타이드와 상기 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 PR26 펩타이드의 검출 방법에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하기는, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 PR26 펩타이드의 검출 방법에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 앱타머의 특정 부위에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 PR26 펩타이드의 검출 방법에 있어서, 상기 시료와 상기 앱타머 간의 접촉은 적절한 반응 조건, 예를 들면, 염의 조성 및 pH 하에서 일어날 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이와 같은 반응 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 적절한 pH는 예를 들면, 5 내지 8.5, 6 내지 8, 또는 7 내지 8일 수 있다. 반응 온도는 예를 들면, 15 내지 50℃, 20 내지 45℃, 또는 30 내지 40℃일 수 있다. 상기 앱타머는 전술된 조성물 또는 키트의 형태로 제공되는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 기판에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 기판은 비드, 막, 마이크로타이터 플레이트, 또는 칩일 수 있다.

본 발명에 따른 PR26 펩타이드의 검출 방법에 있어서, 상기 PR26 펩타이드와 상기 앱타머의 결합 여부는 상기 앱타머가 연결된 센서를 통해 확인될 수 있다. 이를 위해 당해 분야에 알려져 있는 센서가 이용될 수 있다. 상기 결합 여부는 결합에 의해 발생하는 신호를 측정함으로써 확인될 수 있다. 상기 신호는 광학적 신호, 전기화학적 신호, 효소에 의한 신호, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합 여부는, 예를 들면, PR26 펩타이드와 결합된 앱타머의 구조 변화에 의해 유발되는 광학적 신호의 변화 또는 전기화학적 신호의 변화를 검출함으로써 확인할 수 있다. 또는, 상기 앱타머가 고정된 지지체와 PR26 펩타이드 간의 응집 혹은 반발력의 차이를 측정함으로써 결합 여부를 확인할 수 있다. 상기 방법에 의해 PR26 펩타이드의 존재가 확인된 시료는 당해 분야에 알려진 분석 방법을 통해 추가로 분석될 수 있다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균성 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 항균성 조성물에 있어서, 상기 항균성 조성물은 그람 음성균, 그람 양성균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 그람 음성균은 대장균 속(Escherichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 렙토스피라 속(Leptospira sp.), 리케치아 속(Rickettsia sp.) 또는 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 리스테리아 속(Listeria sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 또는 바실러스 속(Bacillus sp.)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항생제는 아미노글리코사이드 계열 (아미노글리코사이드, 겐타마이신, 네오마이신 등), 페니실린 계열 (앰피실린 등), 술폰아미드 계열, 베타-락탐 계열 (베타-락탐, 아목시실린/클라불란산 등), 클로람페니콜 계열, 에리트로마이신 계열, 플로르페니콜 계열, 포스포마이신 계열, 카나마이신 계열, 린코마이신 계열, 메티실린 계열, 퀴놀론 계열, 스트렙토마이신 계열, 테트라사이클린 계열, 트리메소프림 계열 또는 반코마이신 계열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항균성 조성물에 있어서, 상기 항균성 조성물은 항생제, 항균용 화장료 조성물, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 생물 농약 또는 항균용 의약외품 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

(1) 항생제

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하고자 한다.

상기 항생제는 임상 투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 즉, 본 발명의 항균성 조성물은 실제의 비경구의 여러가 지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항균성 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

(2) 항균용 화장료 조성물

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 화장료 조성물은 상기 PR26 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

(3) 항균용 식품 첨가제

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제를 제공하고자 한다.

상기 식품 첨가제는 상기 PR26 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

(4) 항균용 사료 첨가제

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 첨가제를 제공하고자 한다.

상기 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 PR26 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 PR26 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.

(5) 항균용 방부 조성물

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 방부 조성물을 제공하고자 한다.

상기 방부 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

(6) 항균용 생물 농약

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 생물 농약을 제공하고자 한다.

(7) 항균용 의약외품 첨가물

일 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 유효성분으로 포함하는 항균용 의약외품 첨가물을 제공한다.

본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 항균 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 의약외품 조성물은 이에 상기 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.

본 발명은 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 천연 항균성 펩타이드인 PR26 펩타이드에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 PR26 펩타이드를 활용한 천연유래 항균성 소재 개발에 사용될 수 있으며, 기존에 널리 사용되고 있던 화학합성 항균물질의 여러 부작용들을 보완하여 보다 안전한 천연유래 항균성 소재 개발이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 PCR을 통한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭 후 전기 영동을 통한 DNA 크기 결과를 나타낸다.
도 2는 나노드랍을 이용하여 SELEX의 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3는 PR26 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군을 DNA mfold 프로그램을 이용하여 이미지화한 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1. DNA 앱타머의 제작

1-1. Primer 및 DNA 앱타머 풀의 합성

PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위한 랜덤 주형 DNA를 확보하기 위하여, 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATA CCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이를 100bp로 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 바이오니어 (Bioneer, Korea)로부터 합성하였다 [정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' . 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'].

1-2. PCR 기법을 통한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 μM 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 구성하였다. PCR과정의 반응 조건은 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 반응산물을 4㎕ 취하여, 2% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 100bp 증폭 산물을 확인한 뒤, PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하여 증류수 50 ㎕에 회수하였다 (도 1 참고).

1-3. 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (Denaturation)하였다. 상기한 PCR 기법과 PCR 정제 기트를 이용한 PCR 산물 정제를 통해 확보한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각하여 ssDNA를 제작하였다.

1-4. ssDNA의 선별 및 회수

가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴 (Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 primer를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시 예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.

실시예 2. Ni - NTA Agarose resin 기반 SELEX 기법을 이용한 PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별

2-1. SELEX에 이용되는 각 용액의 조성

SELEX에 이용한 각 용액은 Ni-NTA Agarose (Qiagen, USA)를 이용하였으며, 조성은 다음과 같았다. 즉, 1 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.9): 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 5mM imidazole, 2 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.9): 300mM NaCl, 40mM Tris-HCl, 10mM imidazple, 2mM MgCl2, 세척 용액 (pH 7.9): 500mM NaCl, 60mM imidazole, 20mM Tris-HCl, DNA 앱타머 용출 용액 (pH 7.9): 300mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 250mM imidazole.

2-2. SELEX에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작

상기 실시예 1-4를 통하여 제작 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.

2-3. Ni-NTA agarose resin을 이용한 PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

히스티딘 융합 PR26 펩타이드 5 ㎕ (63.88 pmol)를 1 X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 상기 실시예 3-2에서 획득한 ssDNA 앱타머 풀 (638.8 pmol)과 1:10 비율로 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. Ni-NTA agarose 정제 키트를 활성화하기 위하여 Ni-NTA agarose 200 ㎕에 1 X 앱타머 선별용액 200 ㎕을 넣고 4℃에서 30분 동안 교반하며 반응시켜 활성화시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 히스티딘 융합 PR26 펩타이드와 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 활성화된 Ni-NTA agarose와 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응 시켰다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 세척용액 1 ㎖을 넣어 세척하는 과정을 5회 반복하여 히스티딘 융합 PR26 펩타이드와 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. Ni-NTA agarose로부터 히스티딘 융합 PR26 펩타이드와 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 200 ㎕를 넣어 4℃에서 1시간동안 교반하며 반응시켰으며, 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. 히스티딘 융합 PR26 펩타이드 과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 히스티딘 융합 PR26 펩타이드을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, 히스티딘 융합 PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하기 위하여 PCI 법을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트 (pH 4.5)와 3배부피의 100% 에탄올을 첨가하여 70℃에서 1시간 이상 반응시켰고, 반응 액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.

2-4. 비특이적 DNA 앱타머 제거를 위한 네가티브 선별 (Negative selection)

PR26 펩타이드이 아닌 히스티딘 잔기와 아가로스 (agarose)에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 3회와 5회 사이에 PR26 펩타이드 없이 히스티딘 아미노산만 고정되어 있는 Ni-NTA agarose에 DNA 앱타머 용액을 결합하는 네가티브 선별 (negative selection)을 진행하였다. 1 X 앱타머 선별 용액을 이용하여 활성화된 Ni-NTA agarose에 히스티딘을 고정 시킨 후, 상온에서 냉각시켜 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀을 반응시켰으며, Ni-NTA agarose와 히스티딘에 결합하지 않은 상층의 ssDNA 앱타머 용액을 5회 SELEX에 이용하였다. 이후 실시예 2-3과 같은 방법으로 SELEX를 총 9회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 PR26 펩타이드와 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 3. 나노드랍을 이용한 각 라운드의 친화성 테스트

SELEX를 9회까지 수행한 뒤, SELSEX의 추가 진행 여부 및 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA의 농도를 나노 드랍(Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드랍을 이용하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 7 라운드에서 회수된 ssDNA 농도가 715.6 ng/㎕로 가장 높았으며, 8 라운드의 농도는 295.1 ng/㎕로 7 라운드보다 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후 PR26 펩타이드와 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 7 라운드인 것을 확인할 수 있었다(도 2 참고).

실시예 4. PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 확보하기 위한 최적 라운드의 T-벡터 클로닝

나노 드랍을 통하여 PR26 펩타이드와 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 7 라운드의 ssDNA 앱타머 풀로부터 ssDNA 앱타머 후보군의 서열을 확보하기 위하여 7 라운드의 T-벡터 클로닝을 수행하였다. 이를 위하여 7 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'를 이용한 PCR을 수행하였다. PCR을 통하여 확보한 dsDNA는 솔젠트사의 T-블런트 PCR 클로닝 키트를 이용하여 T-벡터 클로닝을 수행하였다. T-벡터 클로닝은 T-블런트 벡터 (10 ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 4㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 1㎕는 100㎕의 DH5α 형질전환 세포 (competent cell)와 섞은 후 얼음에서 10분 동안 반응시켰으며, 반응액을 42℃에서 30초 동안 열 충격 (heat shock)을 가한 후 얼음에서 2분 동안 반응시켰다. 반응액에 900㎕의 SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal (50 ㎍/㎖), IPTG(5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 도말하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 64개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 확인하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 비정상적이거나 중복되지 않는 PR26 펩타이드 결합 ssDNA 앱타머 서열 23개를 확보할 수 있었다. 아래 표 1은 SELEX를 통해 확보한 PR26 펩타이드 결합 ssDNA 앱타머 후보군 23개에 대한 서열에 대한 정보이다.

실시예 5. PR26 펩타이드 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화하였다(도 3a, 3b 3c 참고).

< 실험예 >

실험예 1. SPR을 이용한 PR26 펩타이드와 PR26 결합 DNA 앱타머 후보군 간의 친화도 정량

1-1. PR26 펩타이드와 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위한 PR26 펩타이드 코팅 센서 칩 제작

PR26 펩타이드와 상기 실시예 5에서 획득한 PR26 결합 ssDNA 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위하여, SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. PR26 펩타이드와 PR26 결합 ssDNA 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)를 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy-succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시키기 위하여 0.1 M Nhydroxysuccinimide(NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주었다. NHS-에스테르로 활성화된 센서 칩 CM5 표면에 PR26 펩타이드을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 PR26 펩타이드을 1/20로 희석하여 센서 칩에 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 3회 처리하여 칩 표면을 PR26 펩타이드로 코팅하였다. 이후 PR26 펩타이드이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성화 시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득, 정량하였다.

1-2. PR26 펩타이드 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

PR26 펩타이드와 가장 높은 친화력을 가지는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 PR26 펩타이드 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000 nM의 농도로 녹여 준비하였다. 준비한 PR26 결합 ssDNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1), PR26 펩타이드이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000nM)의 PR26 펩타이드 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 PR26 펩타이드와 이에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 PR26 펩타이드와 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K _d , dissociation constant) 수득 결과 PR26 펩타이드 결합 ssDNA 앱타머 후보군 중 PR26-8 앱타머의 해리상수가 1.95 X 10^-14 M으로 표적 펩타이드인 PR26에 대해 가장 높은 친화력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (표 2 참고).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to PR26 Peptide and Its Use} <130> DP-2017-0106 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-1 <400> 1 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttgcaggc gcgcgatgtt 60 tttcacagat tccagccgag ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-2 <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcttctcca ttccatgcag 60 gtcttttatt tcctttatgg cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 3 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-3 <400> 3 tggtaatacg actcactata gggagatatc agctattcaa tttaatgtag ctatttgctt 60 atactgtcat gcgagtgaag atagtaagtg caatct 96 <210> 4 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-4 <400> 4 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcttgactg ggctgtatca 60 tccacccatt gctcttgtct cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-5 <400> 5 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttgtggtgc atgctttccg 60 catcggaggt ttgttttggc ccgagatagt aagtgcaatc t 101 <210> 6 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-6 <400> 6 tgtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcggatcgc cacctatcct 60 cgcttcttta attattcctc gagatagtaa gtgcaatct 99 <210> 7 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-7 <400> 7 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttggtccct tcagcattgg 60 acttccatgc gctcacccca cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 8 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-8 <400> 8 ttggtaatac gctcactata gggagataca gcttattcaa ttgcatcacc ctcggttcca 60 ctctttggtt tttagtgggt tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 9 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-9 <400> 9 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttctctctcc atccgggtcg 60 gtatctctgt cgaaactgtg ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-10 <400> 10 cttggtaacg actcactata gggagatacc agcttatcaa tttcatgctt tactgtgtcc 60 catggatcat cgagatgcct ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 11 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-11 <400> 11 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttagagata tctattcgca 60 atgcaattat cctcactcct cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 12 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-12 <400> 12 ggtaatacga ctcactatag ggggatacca gcttattcaa ttttgcggtt gtgctaagta 60 tttctatgcg ttcgctggtc tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 13 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-13 <400> 13 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttcaccagc ttcttggttc 60 gtggagtgcg tatattgcgt agagatagta agtgcaatct 100 <210> 14 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-14 <400> 14 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttgctcacc gttacatcac 60 gggggccggc gggcttgtct tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 15 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-15 <400> 15 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttggcttca ttcctactgc 60 cataaatagt catctggtgt ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-16 <400> 16 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttagtaatgg ggggtcccct 60 ttcgagatac tcttacggtt cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 17 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-17 <400> 17 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttggaacctt ttcctcccac 60 gcacgctgga tctctgcttc tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 18 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-18 <400> 18 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttggtgaa attttccttc 60 gttcccactc gaactacagc tcgagatagt aagtgcaatc t 101 <210> 19 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-19 <400> 19 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgtagttcg tctattgtgg 60 cggggctatg tccgtcggcg agatagtaag tgcaatct 98 <210> 20 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-20 <400> 20 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttctcgcgcg ttaattgcgg 60 acctatccgt actgccgtct cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-21 <400> 21 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgtcgagtc gttagagcag 60 tacgttcatg ctttgggcgc tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-22 <400> 22 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgcatctgc tgcaaagacg 60 tcgcctcgcc gttcggactt ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR26-23 <400> 23 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcgggctct tcccttattc 60 ccgcaacacg gcaccacgat cgagatagta agtgcaatct 100

Claims

PR26　펩타이드에 특이적으로 결합하는 서열번호 8의 뉴클레오티드로 이루어진 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)의 방법으로 선별되는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 앱타머는 당(sugar) 2번 탄소의 수산화기가 수소원자, 불소원자, 아미노기, 또는 메톡시기로 치환된 것을 특징으로 하는 앱타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 포함하는 PR26　펩타이드 검출용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 포함하는 PR26　펩타이드 검출용 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 이용한 시료 중 PR26　펩타이드의 검출 방법으로, 상기 방법은:
(A) 시료와 PR26　펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(B) PR26　펩타이드와 상기 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 또는 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 첨가제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 생물 농약.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 및 PR26　펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 의약외품 조성물.