WO2008013276A1 - Agent thérapeutique pour mésothéliome malin - Google Patents

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WO2008013276A1
WO2008013276A1 PCT/JP2007/064798 JP2007064798W WO2008013276A1 WO 2008013276 A1 WO2008013276 A1 WO 2008013276A1 JP 2007064798 W JP2007064798 W JP 2007064798W WO 2008013276 A1 WO2008013276 A1 WO 2008013276A1
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mesothelioma
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virus
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Katsuhito Takahashi
Hisako Yamamura
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Definitions

  • the present invention relates to the treatment of mesothelioma, particularly malignant mesothelioma.
  • mesothelioma particularly malignant mesothelioma.
  • it relates to a mesothelioma of a herpes simplex virus mutant that grows targeting a force luponin gene, particularly for use in treating malignant mesothelioma, and to such a virus mutant.
  • Non-patent literature l Kanazawa N. et al. Jpn. J. Clin. Oncol. 36, 254-257, 2006
  • Non-Patent Document 2 Sterman, D.H. et al. Clin. Cancer Res. 11, 7444-7453, 2005
  • Non-Patent Document 3 Mukherjee, S. et al. Cancer Gene Ther. 7, 663-670, 2000
  • Non-Patent Document 4 Harrison, L.H. et al. Ann. Thorac. Surg. 70, 407-411, 2000
  • Non-Patent Document 5 Adusumilli, P.S. et al. Cancer Biol. Ther. 5, 48-53, 2006
  • An object of the present invention is to provide an effective therapeutic agent for mesothelioma, particularly malignant mesothelioma.
  • the force luponin protein which is the best of smooth muscle cells, is also expressed in human malignant mesothelioma cells.
  • the rabbit antibody polyclonal antibody prepared against the synthetic peptide in the carboxyl terminal region of force luponin does not stain reactive mesothelial cells that are non-tumor tissue, but selectively stains malignant mesothelioma cells in the tumor site. It revealed that. Subsequently, the inventors have dl2.
  • CALPf A RR which is a variant of the force luponin targeted oncolytic HSV-1, dl2.
  • CALP A RR (PCT / JP02 / 13683 “cell-specific expression and replication vector”). Power S We found that human malignant mesothelioma cultured cells can be efficiently destroyed. Furthermore, dl2. CALPf A RR In the experimental treatment evaluation system in which malignant mesothelioma culture cells established from human surgical specimens were transplanted into the SCID mouse intrathoracic and subcutaneously in the back, the volume of the tumor was significantly reduced. The invention has been completed.
  • CALP A RR is known to destroy human sarcoma cells by targeting force luponin (PCT / JP02 / 13683 title of invention: “cell-specific expression and replication vector”).
  • PCT / JP02 / 13683 title of invention “cell-specific expression and replication vector”.
  • the present invention provides:
  • a mesothelioma therapeutic agent comprising a herpes simplex virus F-type mutant that grows by targeting a powerful luponin gene;
  • a mesothelioma treatment cell characterized by infecting a mesothelioma cell removed from a patient with a simple herpesvirus F-type mutant that grows with the target of the force luponin gene. Production method;
  • a method for treating mesothelioma comprising administering to a mesothelioma patient a F-type mutant of simple herpesvirus that grows by targeting a powerful luponin gene;
  • a method for treating mesothelioma comprising administering the cell for treating mesothelioma according to (9) to a mesothelioma patient;
  • a therapeutic agent for mesothelioma particularly a therapeutic agent for sarcoma-type malignant mesothelioma, which has been considered to have no therapeutic method at all, is provided.
  • FIG. 1 shows immunohistochemistry of human malignant mesothelioma surgical specimen showing the expression of force luponin protein selective for malignant mesothelioma using a force luponin polyclonal antibody (brown This is an image.
  • A is reactive mesothelioma
  • B is sarcoma-type malignant mesothelioma: Case 1
  • C is sarcoma-type malignant mesothelioma: Case 2.
  • Case 1 is more strongly expressed than normal vascular smooth muscle cells.
  • Case 2 is uniformly expressed in tumor cells.
  • the antibody is the force of human hi-powered luponin. Noreboxil-terminal 18 peptide Rabbit antiserum was prepared and the IgG fraction was purified using a Protein A Sepharose column (Amersham Biosciences).
  • FIG. 2 shows an image 42 hours after the treatment of Vero cells with a cell suspension infected with HSV-1 mutant dl2.
  • CALPf A RR The part enclosed in a circle in the panel (A) before separation is characterized by the formation of a cytolytic plaque. Dl 2.
  • the plaques of CALP A RR the cell membrane is fused and the syncytium-forming plaque is formed.
  • the circle in panel (B) after separation indicates that the mutant clone of that part is completely aspirated.
  • panel (C) of Vero cell infection experiment (1) shows that the entire cell suspension was infected with 6.0 X 10 5 cells / well (6-well plate) of Vero cells and 42 hours later. It is an observed image.
  • panel (D) of Vero cell infection experiment (2) was obtained by infecting Vero cells cultured in FALCON T150 bottle with cell suspension 61 obtained from infection experiment (1). It is a 24-hour statue.
  • Figure 3 shows that subconfluent monolayer cultures of malignant mesothelioma cells were infected with dl2.
  • FIG. 4 shows that subconfluent monolayer cultures of human malignant mesothelioma cells and human leiomyosarcoma cells were infected with dl2.
  • Fig.5 shows the virus replication analysis of dl2.
  • CALPf A RR showing ganciclovir sensitivity.
  • FIG. 6 is a diagram of real-time in vivo imaging showing the therapeutic effect of d 12.
  • CALPf A RR in SCID mice transplanted subcutaneously on the back of human malignant mesothelioma culture cells.
  • Panelore A is a SCID mouse injected with virus buffer only
  • panel B is a SCID mouse injected with dl2.CALP f A RR
  • node C is a transplanted human malignant mesothelial in another SCI D mouse injected with dl2.CALPf A RR. It looks like a tumor.
  • 1 indicates the tumor on the untreated side
  • 2 (arrow) indicates the tumor on the side injected with virus buffer or dl2.
  • CALPf A RR and the circle indicates the position of each tumor and the background. Indicates the location where chemiluminescence was detected. Virus buffer or dl2. CALPf A RR was injected directly into the tumor 3 times every 5 days. Malignant mesothelioma culture cells established from human surgical specimens were previously labeled with the luciferase gene.
  • FIG. 7 shows the expression of LacZ gene (blue! /, Color development) and prominent antitumor effect in human malignant mesothelioma transplanted subcutaneously in the back of SCID mice, indicating the proliferation of dl2.
  • CALPf ⁇ RR It is a figure which shows reduction of a tumor diameter. The two on the left show tumors injected with virus buffer only, and the two on the right show tumors injected with d12.
  • FIG. 8 shows the antitumor effect of dl2.
  • CAL Pf A RR on human malignant mesothelioma cells transplanted into the SCID mouse thoracic cavity.
  • Panel A shows the appearance of human malignant mesothelioma transplanted into the thoracic cavity of mice injected with virus buffer alone
  • Nonole B shows the appearance of transplanted human malignant mesothelioma in animals injected with dl2.
  • CALPf A RR Viral buffer or dl 2.
  • CALPf A RR was injected directly into the thoracic cavity once. dl2.
  • CALPf A RR injection showed a marked antitumor effect.
  • FIG. 9 shows in vivo imaging of a luciferase-labeled tumor showing the antitumor effect of d 12.
  • CALPf A RR in a SCID mouse intraperitoneal orthotopic transplantation model of human peritoneal malignant mesothelioma. The upper row shows the results of control mice injected with virus buffer, and the lower row shows the results of mice injected with dl2.
  • CALPf A RR shows in vivo imaging of a luciferase-labeled tumor showing the antitumor effect of d 12.
  • FIG. 10 shows a photon count of a luciferase-labeled tumor in a treatment experiment using dl 2.
  • CALPf A RR in a SCID mouse intraperitoneal orthotopic transplantation model of human peritoneal malignant mesothelioma. Arrows indicate the time of virus injection.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for mesothelioma comprising a herpes simplex virus F-type mutant that grows by targeting a force luponin gene.
  • the herpes simplex virus mutant used in the present invention may be an HSV-1 mutant or an HSV-2 mutant, as long as it grows with the target of the powerful ruponin gene.
  • it is a variant of HSV-1.
  • the herpesvirus variants used in the present invention have acquired the ability to fuse cells (referred to herein as “F-type” variants).
  • F-type mutants the infected cells are characterized by forming syncytia.
  • Syncytium formation occurs when the virus enters the cell and then causes fusion with adjacent non-infected cells by the action of the viral membrane protein expressed on the cell membrane surface of the infected cell (fosion from within: infection is essential).
  • the cytopathic effect of violinless infection is stronger in the case of forming a cell fusion plaque than in a lysis plaque.
  • the F-type mutant of the present invention specifically acts on human mesothelioma cultured cells, particularly human malignant mesothelioma cells, and efficiently destroys them.
  • the F-type mutant of the present invention can be propagated targeting the force luponin gene, not only mesothelioma. Can efficiently destroy tumors that express a powerful luponin gene such as leiomyosarcoma
  • the F-type mutant used in the present invention is obtained by modifying a gene that may be naturally obtained from a simple herpesvirus that grows by targeting a force luponin gene. It may be a thing.
  • a known genetic engineering method can be used to obtain a simple herpesvirus that grows with the target of the strong luponin gene. An example of how to do this will be explained later.
  • a known gene manipulation method can be used to obtain a herpes simplex virus force or other F type mutant.
  • An example of such a method is a method of creating a mutation on a gene selected from gB, gK, gL, UL20 and UL24 genes at the HSV-1 locus.
  • the herpes simplex virus type F mutant preferably used in the present invention is derived from the virus dl2.
  • C ALP A RR is characterized by the formation of lytic plaques, and the F type variant of dl2.
  • CALP A R R is characterized by the formation of syncytia by infected cells (see above).
  • the herpes simplex virus F type mutant particularly preferably used in the present invention is a mutant generated by natural mutation from dl2.
  • CALP A RR One of the mutants produced by natural mutation from dl2.
  • CALP ⁇ RR is referred to herein as “dl2.
  • CALPf ⁇ RR strain a simple herpesvirus F-type variant that grows with a target of a powerful luponin gene” is referred to as “F-type variant” or “the present invention”.
  • F-type variant a simple herpesvirus F-type variant that grows with a target of a powerful luponin gene
  • the mutant virus as a malignant mesothelioma therapeutic agent of the present invention described above is unique in specific cells such as malignant mesothelioma that expresses force luponin. Cells from inside by replicating and proliferating while expressing viral genes I think that.
  • the mechanism of tumor cell destruction is as follows: 1) direct cell lysis and fusion by virus growth, 2) apoptosis of virus-infected cells, 3) induction of anti-tumor immunity by cytotoxic T lymphocytes in individuals, Etc. are considered.
  • the mutant virus of the present invention does not damage normal cells, and particularly has an endogenous thymidine kinase gene, and therefore can suppress the growth of the virus at a desired time after the tumor treatment.
  • the transcription initiation regulatory region of human calponin gene expressed specifically in smooth muscle cells and malignant mesothelioma cells (if the translation start point is +1, 333 bp from 260 to +73) (Yamamu ra H. et al. Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001) upstream of 444 bp human 4F2 heavy chain transcription enhancer (Mol. Cell Biol. 9, 2588-2597, 1989), then transcription factor essential for initiation of viral replication Enhanced Green Fluorescent Protein gene (US Pat. No. 5625048) via the internal Ribosomal Entry Site (IRES) (US Pat. No.
  • ICP4 4,937,190 downstream of ICP4 ( «4) gene encoding It is possible to link various foreign genes such as the description. Malignant mesothelioma that actively proliferates while expressing the force luponin gene by homologous recombination with the gene locus essential for viral DNA replication, preferably the ribonucleotide reductase gene locus (ICP6, UL36). ICP4 can be selectively expressed in specific proliferating cells such as cells to induce viral growth. In order to monitor virus growth, a marker gene such as LacZ may be inserted into the virus of the present invention.
  • a LacZ marker gene may be inserted upstream of the 4F2 heavy chain transcription enhancer during homologous recombination with ICP6! /. Expression of the LacZ gene is controlled by the endogenous promoter of the ICP6 gene (see gene construction of virus dl2. CALP ⁇ RR disclosed in PCT / JP02 / 13683).
  • the promoter of the human calponin gene used in the present invention is preferably one that controls the expression of a gene encoding a hi-force lponin or a basic-force lponin protein (hereinafter referred to as force lponin).
  • the force luponin was found as a troponin-like actin-binding protein mainly present in mammalian smooth muscle cells (Takahashi. Et al. Hypertension 1 1, 620-626, 1998), and its expression is expressed in smooth muscle cells and various in adults. Specific to sarcoma cells (Takahashi. & Yamamura H. Adv. Biophys. 37, 91-111, 2003).
  • the present inventor is a human lupus mesothelioma surgical sample and a malignant mesothelioma culture cell established from the surgical sample, and is a force luponin and also a force luponin-like protein specific to smooth muscle cells. It was found that SM22 expression was observed. In particular, the expression of the force luponin gene was not observed in normal mesothelial cells or reactive mesothelial cells, but was found in almost all sarcoma-type malignant mesothelioma cells. It was considered to be an excellent marker for targeting sarcoma-type malignant mesothelioma for which there is no effective treatment.
  • the promoter sequence of the gene (Yamamura HJ Biochem. 122, 157-167, 1997) encoding the above-mentioned human calponin or strength luponin-like protein (for example, SM22) can be used.
  • Figure 1 shows the expression of force luponin protein in tumor cells of patients with sarcoma-type malignant mesothelioma.
  • a promoter that targets mesothelioma cells that can be used is not limited to the above-mentioned force luponin gene or SM22 gene (Singhal, S. et al.). al. Clin. Cancer Res. 9, 3080-3097, 2003, Table 2)
  • SM22 gene a promoter that targets mesothelioma cells
  • epithelial malignant mesothelioma cells 94% of Singhal et al. cases are epithelial or epithelial +
  • epithelial malignant mesothelioma can be targeted.
  • Lactate dehydrogenase-A (LDH-A) 0.00001
  • VDAC Voltage-dependent anion channel
  • VDAC Voltage-depeudeiit anion channel
  • a therapeutic agent for mesothelioma comprising a herpes simplex virus F-type variant that grows by targeting the force luponin gene of the present invention is pleural mesothelioma, peritoneal mesothelioma, pericardial mesothelioma It is effective against all mesotheliomas such as tumors.
  • the therapeutic agent for mesothelioma containing the F-type mutant of the present invention is effective not only for benign mesothelioma but also for malignant mesothelioma.
  • the therapeutic agent of the present invention is revolutionary in that it is particularly effective for the treatment of malignant mesothelioma.
  • the therapeutic agent for mesothelioma of the present invention can be made into various dosage forms according to the mode of treatment, but is generally a liquid dosage form for injection or infusion.
  • a liquid dosage form can be produced by dissolving or suspending the virus in an aqueous carrier such as water, physiological saline, dextrose solution, Ringer's solution, or a buffer solution such as a phosphate buffer.
  • the therapeutic agent for mesothelioma of the present invention may be administered by intravenous injection or infusion of infusion solution directly into the affected area. These administration methods' routes can be appropriately selected by a doctor according to factors such as the condition of the patient and the nature of the mesothelioma (focal site, localized or diffuse).
  • the amount of virus to be administered and the number of doses can also be appropriately selected by the doctor depending on factors such as the patient's condition and the nature of the mesothelioma.
  • a dosage form of the therapeutic agent for malignant mesothelioma of the present invention it can be directly injected into a primary tumor site or an expected metastatic site. Local administration such as local injection into the thoracic cavity and intraperitoneal cavity and intravascular administration to tumor-feeding blood vessels can also be performed. Alternatively, it can be administered by intravenous injection or infusion. In administering the therapeutic agent for malignant mesothelioma of the present invention, it is possible to take a dosage form in combination with a needle technique, a catheter technique, a surgical operation or the like of radiofrequency ablation therapy.
  • the affected part may be exposed by surgery, and the virus of the present invention may be injected or dropped or mixed with a gel-like substrate and brought into contact therewith.
  • the virus of the present invention may be in a free state, for example, carried on a biocompatible or biodegradable carrier.
  • a biocompatible or biodegradable carrier may be suitable for delivery to affected areas such as the pleura and peritoneum and lesions.
  • Such a carrier can be appropriately selected by a doctor according to the condition of the patient, the nature of the mesothelioma, and the like.
  • one or more antitumor substances may be used in combination.
  • an antitumor substance used in combination with the virus of the present invention examples include, but are not limited to, anticancer agents, BCG and other vaccines that act to activate innate immunity, angiogenesis inhibitors, molecular targeted drugs, radiation, heavy particle beams, and the like.
  • the combination means that the virus of the present invention and the antitumor substance may be mixed in the same mesothelioma therapeutic agent, and the treatment including the antimesogenic substance containing the virus of the present invention and the antitumor substance.
  • the agent or treatment may be administered separately or in combination.
  • the method and route of administration of the virus of the present invention are not limited to those described above, and can be appropriately selected and determined by a doctor.
  • the dosage of the therapeutic agent for malignant mesothelioma of the present invention varies depending on the patient's age, sex, symptom, stage, administration route, frequency of administration, and dosage form.
  • a range of about lxlO 6 to lxl0 8 PFU (plaque forming units) is appropriate for the Winores calorie value. Since the therapeutic agent for malignant mesothelioma of the present invention targets and destroys malignant mesothelioma cells that express and proliferate strong luponin, it is considered to have low toxicity and high safety for normal cells.
  • the therapeutic agent for malignant mesothelioma of the present invention has an endogenous thymidine kinase gene, the ability to suppress the growth of the virus using a commercially available acyclovir or paracyclovir after treatment is highly safe. it is conceivable that. Furthermore, because thymidine kinase activity can be detected and measured in vivo by Positron Emission Tomography using FIAU, a 125 ⁇ -labeled uracil derivative (Bennet J. et al. Nature Med. 7, 859-863, 2001), which helps to further improve safety.
  • the present invention provides a simple herpesvirus F-type variant that grows by targeting a force luponin gene in cells taken from the patient or a patient's relatives, ie, the present invention.
  • the present invention relates to a method for producing cells for treating mesothelioma, characterized by infecting a virus.
  • the present invention also relates to a cell for treating mesothelioma obtainable by such a method.
  • the cells that infect the violets of the present invention are those of the patient himself, preferably cells collected from the patient's mesothelioma.
  • the cells may be collected from malignant mesothelioma force.
  • a preferred virus of the present invention for use in cell infection is dl 2.
  • CALPf A RR strain.
  • the method for infecting cells with the virus of the present invention may be a known method.
  • the mesothelioma cells cultured in a sterile petri dish and the virus of the present invention can be There are methods such as incubating the cells at a certain ratio, and the doctor can select them appropriately according to factors such as the condition of the patient and the nature of the mesothelioma. Cells thus infected with the virus of the present invention are also within the scope of the present invention.
  • the patient's mesothelioma By returning the cells infected with the virus of the present invention to the body of the patient, preferably the mesothelioma site, the patient's mesothelioma, particularly malignant mesothelioma, can be treated.
  • Cells infected with the virus of the present invention can be directly injected into the affected area through the skin, or can be administered by intravenous injection or infusion. Alternatively, the affected area may be exposed by surgery, and cells infected with the virus of the present invention may be injected or dropped into contact therewith.
  • the present invention relates to an F-type mutant of a simple herpesvirus that specifically propagates to a force luponin gene, particularly a dl2.
  • CALPf A RR strain.
  • Such mutants are novel and are effective in the treatment of mesothelioma, especially malignant mesothelioma.
  • the force and the mutant can be used for the treatment of leiomyosarcoma.
  • the present invention provides a patient with mesothelioma, wherein a simple herpesvirus F-type mutant that grows by targeting a force luponin gene is administered to the patient.
  • the present invention relates to a method for treating mesothelioma.
  • a preferred variant for use in the above treatment methods is dl2.
  • the above treatment methods are particularly effective in the treatment of malignant mesothelioma.
  • the present invention also provides a method for treating mesothelioma, which comprises administering to a mesothelioma patient a cell for treating mesothelioma obtainable by the above method.
  • a preferable cell for treating mesothelioma used in the above-mentioned treatment method is obtained using dl2.
  • the above treatment method is particularly effective for the treatment of malignant mesothelioma!
  • the present invention uses a simple herpesvirus F-type variant that grows targeting a force luponin gene in the manufacture of a medicament for the treatment of mesothelioma in a patient.
  • a preferred variant for the above use is dl 2.
  • CALPf A RR strain.
  • the present invention relates to a herpes simplex virus F-type mutant, preferably dl 2.
  • CALPf which grows by targeting a powerful luponin gene in the manufacture of a therapeutic agent for malignant mesothelioma.
  • RR strains A simple herpesvirus F-type variant that grows targeting a force luponin gene in the manufacture of a medicament for the treatment of mesothelioma in a patient.
  • a preferred variant for the above use is dl 2.
  • CALPf A RR strain.
  • CALPf which grows by targeting a powerful luponin gene in the manufacture of a therapeutic agent for malignant mesothelioma.
  • the present invention relates to the use of a cell for treating mesothelioma, which can be obtained by the above method, in the manufacture of a medicament for treating mesothelioma.
  • Preferred remedy and mesothelioma treatment cells used for the above use are those obtained using dl2.
  • the above use is particularly suitable for the manufacture of a medicament for the treatment of malignant mesothelioma.
  • the Vero cells cultured in FALCON T150 bottle were infected with 6 ⁇ 1 of the cell suspension obtained from the infection experiment (1), and then separated in a 24-hour image. I could assured that all the plaques formed by the virus were syncytial plaques.
  • CALPf ARR Infected with CALP A RR and dl2.
  • CALPf A RR Such infected cells are incubated at 37 ° C 1 After incubating for a time, the cells were cultured in the medium containing 1% FBS and 11.3 g / ml human IgG (Jackson ImmunoResearch Lab.). 48 hours after infection, X-Gal staining was performed and the number and area of plaques / well were evaluated. The results are shown in Figure 3. dl2.
  • CALPf ARR showed stronger cytotoxic activity against cultured human malignant mesothelioma cells compared to dl2.
  • CALP A RR blue color of X-Gal staining indicates viral growth and cytotoxicity area). Show)
  • the virus mutant of the present invention acts not only on mesothelioma but also on tumors that express force luponin such as leiomyosarcoma and can suppress these tumors.
  • CALPf A RR is more safe because it is more sensitive to ganciclovir than ICR6-deleted HSV-1 mutant hrR3, which is highly sensitive to ganciclovir.
  • the HSV-1 mutant dl2.
  • CALP lacking the endogenous thymidine kinase gene was completely insensitive to ganciclovir.
  • the luciferase gene was transfected into human malignant mesothelioma cells, and the clone with the highest chemiluminescence intensity and growth rate was selected. From the cloned cells, the 45 mm square tumor mass of mesothelioma from the colonized back of the back of the SCID mouse was transformed into a 6-week-old female severe hybrid immunodeficient mouse (SCID mouse) (Japan SLC) (Supplied). The tumor grew to a diameter of about 6 to 7 mm (50-70 mm 3 ) 30 days after transplantation into SCID mice. l X10 7 pfu / mouse dl2.
  • CALPf A RR has a remarkable antitumor effect by direct injection into human malignant mesothelioma cells transplanted subcutaneously in the back.
  • a firefly-derived luciferase gene pGL4.13 (Promega) was introduced into human peritoneal malignant mesothelioma cultured cells, and a luciferase-labeled human peritoneal malignant mesothelioma clone cell line was obtained using in vitro imaging method.
  • a luciferase-labeled human peritoneal malignant mesothelioma clone cell line was obtained using in vitro imaging method.
  • an intraperitoneal model of luciferase-labeled human peritoneal malignant mesothelioma was prepared in SCID mice (manufactured by Claire Japan). In vivo imaging was performed on days 6, 20, 32 and 39 after intraperitoneal tumor implantation. Under jet ether anesthesia, 3.75 mg / kg of luciferin was administered intraperitoneally.
  • Nembutal 25 mg / kg was intraperitoneally administered 3 minutes after intraperitoneal administration of luciferin, and imaging was started 10 minutes later using NightOW L S (Berthold).
  • dl2. CALPf A RR virus was directly administered intraperitoneally.
  • the luminescence intensity increased with tumor growth on the 11th day after the first virus buffer administration.
  • the luminescence intensity decreased on the 11th and 18th days after the first virus administration, and a clear antitumor effect by the virus administration was observed (Fig. 9). ).
  • the change in photon count before and after virus administration was compared, it was significantly decreased in the dl2.
  • CALPf A RR virus administration group confirming the antitumor effect of the virus (Fig. 10). There was no significant difference in the photon count between the control group before virus administration and the dl2.CALPDRR virus group.
  • the photon count immediately before tumor removal was 1.98 times higher in the control group than in the dl2.
  • CALPf A RR virus group The weight of the removed intraperitoneal tumor was dl 2 in the control group. It was 2.1 times higher than the CALPfARR virus administration group. Based on the above, the photon count well reflected the intraperitoneal tumor volume in mice. These results confirm the therapeutic effect of dl2.
  • CALPfARR virus in this orthotopic transplantation model confirm the therapeutic effect of dl2.
  • the present invention can be used in the field of therapeutic agents for malignant mesothelioma.

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Description

明 細 書
悪性中皮腫治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、中皮腫、特に悪性中皮腫の治療に関する。詳細には、力ルポニン遺伝 子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの変異体の中皮腫、特に悪性中皮腫を 治療するための使用、ならびにそのようなウィルス変異体に関する。
背景技術
[0002] アスベストに起因する悪性中皮腫の発生は、近年、先進諸国において増加の一途 をたどっている。我が国においても 1973年の腹膜悪性中皮腫の報告以来増え続け 、 2004年度の死亡者数は 2002年度比で約 2倍の 970人に達している。厚生労働省 の 2003年の資料によると、アスベストへの暴露開始から中皮腫発生までの期間は 1 1〜54年（中央値 38· 6年）であり、我が国においてアスベストが最も多く消費された 時期が 1970〜； 1990年であることから、 2030年まで中皮腫患者は増え続けると予測 されている。我が国の 2025〜2030年の中皮腫による死亡者数は上限予測で年間 1 0000人を超えると見られており、これは現在の乳がんの死亡者数に匹敵する。した がって、悪性中皮腫に対する治療法の開発は目下の全世界的な課題である。
[0003] 悪性中皮腫の治療には、胸膜肺全摘術などの外科的治療、シスブラチン、ァリムタ などを用いた化学療法及び放射線療法を組み合わせた集学的治療法が試みられて いる力 予後は極めて不良で 2年生存率は 20〜30%にとどまる。大阪府内における 1975〜2001年のがん登録による調査（非特許文献 1参照）でも、男性の 5年生存率 は 5%、生存期間の中央値は 6ヶ月にも満たないという結果である。特に、病理組織 分類で全体の 40%を占める肉腫型及び二相性（上皮型 +肉腫型）中皮腫には外科 的切除以外に有効な治療法がなぐ新治療法の開発が切望されている。
[0004] ウィルスベクターを含む遺伝子導入技術の進歩とともに、遺伝子治療という新しい 治療分野が確立されようとしている。これまで、悪性中皮腫に対して試みられてきた 遺伝子治療には大きく分けて 4通りある。第 1は、自殺遺伝子と呼ばれる単純へルぺ スウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV—tk)とアデノウイルスベクターを用いるも ので、 21例の悪性胸膜中皮腫患者に対する第湘臨床試験が米国で実施されたが 、 2例が 5年以上生存したのみであった（非特許文献 2参照）。第 2は、免疫遺伝子治 療である。インターロイキン 2を天然痘ウィルスベクターを用いて胸膜中皮腫の 6例の 患者の胸腔内に投与する第 I相臨床試験が米国で実施されたが、治療効果は認めら れなかった（非特許文献 3参照）。第 3は、 HSV— tk遺伝子をレトロウイルスを用いて 遺伝子導入した増殖能のない卵巣がん細胞を胸腔内に投与し、その後ガンシクロビ ルで卵巣がん細胞を死滅させることによって中皮腫細胞に対する免疫応答をも誘導 する方法であるが、治療効果については報告されていない（非特許文献 4参照）。第 4は、 γ 34. 5などの病原性にかかわる遺伝子を取り除いた増殖型、弱毒化 HSV— 1を用いる方法である力 まだ基礎実験の段階であり、中皮腫細胞への選択性をもた ない (非特許文献 5参照)。
非特許文献 l : Kanazawa N. et al. Jpn. J. Clin. Oncol. 36， 254-257， 2006
非特許文献 2 : Sterman, D.H. et al. Clin. Cancer Res. 11， 7444-7453， 2005
非特許文献 3 : Mukherjee, S. et al. Cancer Gene Ther. 7， 663-670， 2000
非特許文献 4 : Harrison, L.H. et al. Ann. Thorac. Surg. 70， 407-411， 2000
非特許文献 5 : Adusumilli， P.S. et al. Cancer Biol. Ther. 5， 48-53， 2006
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、中皮腫、特に悪性中皮腫の有効な治療剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題の解決のため鋭意努力を重ねた結果、平滑筋細胞のマ 一力一である力ルポニン蛋白がヒト悪性中皮腫細胞にも発現していることを見出した 。特に、力ルポニンのカルボキシル末端領域の合成ペプチドに対して作成したゥサギ ポリクローナル抗体が非腫瘍組織である反応性中皮細胞は染色せず、腫瘍部にある 悪性中皮腫細胞を選択的に染色することを明らかにした。続いて、本発明者らは、力 ルポニン標的化腫瘍溶解性 HSV—1、 dl2. CALP A RR (PCT/JP02/13683「 細胞特異的発現複製ベクター」）の変異体である dl2. CALPf A RR力 Sヒト悪性中皮 腫培養細胞を効率よく破壊することを見出した。さらには dl2. CALPf A RRを個体 内に投与することにより、ヒト手術標本から樹立した悪性中皮腫培養細胞を SCIDマ ウス胸腔内および背部皮下に移植した実験的治療評価系において腫瘍体積が著し く減少することを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0007] dl2. CALP A RRは、力ルポニンを標的にヒト肉腫細胞を破壊することが知られて いる（PCT/JP02/13683 発明の名称：「細胞特異的発現複製ベクター」）。しか しながら、そこには今回の発明のような知見は記載も示唆もされていない。
[0008] すなわち、本発明は、
(1)力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体 を含む、中皮腫の治療剤；
(2)該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、（1)記載の治療剤；
(3)該変異体が dl2. CALPf A RR株である、請求項 2記載の治療剤；
(4)中皮腫が悪性のものである、（1)ないし（3)のいずれかに記載の治療剤；
(5)患者から取り出された中皮腫細胞に、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単 純へルぺスウィルスの Fタイプ変異体を感染させることを特徴とする、中皮腫治療用 細胞の製造方法；
(6)該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、（5)記載の方法；
(7)該変異体が dl 2· CALPf Δ RR株である（6)記載の方法；
(8)中皮腫が悪性のものである、 (5)な!/、し（7)の!/、ずれかに記載の方法；
(9) (5)な!/、し (8)の!/、ずれかに記載の方法により得ることのできる中皮腫治療用 細胞；
(10)力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異 体を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法；
(11)該変異体が dl 2. CALP A RR株に由来するものである、（10)記載の方法；
(12)該変異体が dl 2. CALPf A RR株である、（11)記載の方法；
(13)中皮腫が悪性のものである、（10)ないし（12)のいずれかに記載の方法；
(14) (9)記載の中皮腫治療用細胞を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中 皮腫の治療方法；
(15)中皮腫治療用の医薬の製造のための、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する 単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体の使用；
(16)該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、（15)記載の使用；
(17)該変異体が dl2. CALPf A RR株である、（16)記載の使用；
(18)中皮腫が悪性のものである、（15)ないし（17)のいずれかに記載の使用；
(19)中皮腫治療用の医薬の製造のための、（9)記載の中皮腫治療用細胞の使用
(20)力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異 体；
(21) dl2. C ALP A RR株に由来するものである、（20)記載の変異体；
(22) dl2. CALPf A RR株である、（21)記載の変異体
を提供するものである。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、中皮腫の治療剤、とりわけこれまで全く治療法がないと考えられ ていた肉腫型悪性中皮腫に対する治療剤が提供される。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、悪性中皮腫に選択的な力ルポニンタンパクの発現を示すヒト悪性中皮 腫手術標本の力ルポニンポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学を示す (茶色に 染まった部分)像である。 Aは反応性中皮、 Bは肉腫型悪性中皮腫:症例 1、 Cは肉 腫型悪性中皮腫:症例 2である。症例 1では正常な血管平滑筋細胞よりも強く発現し ている。症例 2では腫瘍細胞に均一に発現している。抗体は、ヒト hi力ルポニンの力 ノレボキシル末端の 18ペプチド Leu281 - Gly-Asp - Pro -Ala -Ala - His— As n— His— His— Ala— His— Asn— Tyr— Tyr— Asn— Ser— Ala297に対するゥサ ギ抗血清を作製し、 Protein Aセファロースカラム（Amersham Biosciences)を用いて IgG分画を精製した。
[図 2]図 2は、 HSV— 1変異体 dl2. CALPf A RRに感染した細胞懸濁液で Vero細 胞を処理してから 42時間経過後の像を示す。分離前のパネル (A)中の円で囲んだ 部分は細胞溶解型のプラークを形成することを特徴とする dl 2. CALP A RRのプラ ークの内、細胞膜が融合し合胞体形成型のプラークを特徴とする変異体の単一クロ ーンを示す。分離後のパネル (B)中の円は、その部分の変異体クローンが完全にチ ップで吸引されていることを示す。分離後 Vero細胞への感染実験（1)のパネル（C) は、細胞懸濁液の全量を 6. 0 X 105cells/well (6— wellプレート）の Vero細胞に 感染させ、 42時間後に観察した像である。分離後 Vero細胞への感染実験（2)のパ ネル（D)は、 FALCON社製 T150ボトルで培養した Vero細胞に感染実験（1)から 得た細胞懸濁液 6 1を感染させた後、 24時間の像である。
[図 3]図 3は、悪性中皮腫細胞のサブコンフルェント単層培養に dl2. CALP A RR及 び dl2. CALPf A RRを、 MOI0. 1および 1. 0で感染させ、感染の 48時間後、 X—
Gal染色しプラーク/ wellの数および面積を評価した結果を示す像である。
[図 4]図 4は、ヒト悪性中皮腫細胞及びヒト平滑筋肉腫細胞のサブコンフルェント単層 培養に dl2. CALPf A RRを、 ΜΟΙ0· 01および 0. 1で感染させ、 22時間後に ICP
4タンパク質発現のィムノブロット分析をした結果を示す像である。
[図 5]図 5は、 dl2. CALPf A RRのガンシクロビル感受性を示すウィルス複製分析の
[図 6]図 6は、ヒト悪性中皮腫培養細胞を背部皮下に移植した SCIDマウスにおける d 12. CALPf A RRの治療効果を示すリアルタイムインビボイメージングの図である。 パネノレ Aはウィルスバッファーのみを注入した SCIDマウス、パネル Bは dl2. CALP f A RRを注入した SCIDマウス、ノ ネル Cは dl2. CALPf A RRを注入した別の SCI Dマウスにおける移植ヒト悪性中皮腫の様子である。図中、 1は処置をしなかった側の 腫瘍を示し、 2 (矢印）はウィルスバッファーまたは dl2. CALPf A RRを注入した側 の腫瘍を示し、円はそれぞれの腫瘍の位置と、バックグラウンドの化学発光を検出し た場所を示す。ウィルスバッファーまたは dl2. CALPf A RRを 5日おきに 3回腫瘍内 に直接注入した。ヒト手術標本から樹立した悪性中皮腫培養細胞をあらかじめルシフ エフエラーゼ遺伝子で標識した。
[図 7]図 7は、 SCIDマウス背部皮下に移植したヒト悪性中皮腫における dl2. CALPf Δ RRの増殖を示す LacZ遺伝子の発現 (青!/、発色）と顕著な抗腫瘍効果を示す腫 瘍径の縮小を示す図である。左の 2つはウィルスバッファーのみを注入した腫瘍、右 の 2つは d 12. CALPf Δ RRを注入した腫瘍を示す。 [図 8]図 8は、 SCIDマウス胸腔内に移植したヒト悪性中皮種細胞に対する dl2. CAL Pf A RRの抗腫瘍効果を示す図である。パネル Aはウィルスバッファーのみを注入し たマウスの胸腔内移植ヒト悪性中皮種の様子を、ノ ネノレ Bは dl2. CALPf A RRを注 入した動物における移植ヒト悪性中皮種の様子を示す。ウィルスバッファーまたは dl 2. CALPf A RRを 1回胸腔内に直接注入した。 dl2. CALPf A RRの注入により、 顕著な抗腫瘍効果が認められた。
[図 9]図 9は、ヒト腹膜悪性中皮腫の SCIDマウス腹腔内正所性移植モデルにおける d 12. CALPf A RRの抗腫瘍効果を示す、ルシフェラーゼ標識腫瘍のインビボイメー ジングを示す。上段はウィルスバッファーを注入した対照マウスの結果を示し、下段 は dl2. CALPf A RR注入マウスの結果を示す。
[図 10]図 10は、ヒト腹膜悪性中皮腫の SCIDマウス腹腔内正所性移植モデルにて dl 2. CALPf A RRを用いた治療実験におけるルシフェラーゼ標識腫瘍のフオトンカウ ントを示す図である。矢印はウィルス注入時点を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 1の態様において、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺス ウィルスの Fタイプの変異体を含む、中皮腫の治療剤に関するものである。本発明に 使用する単純へルぺスウィルスの変異体は力ルポニン遺伝子を標的に増殖するもの であれば、 HSV— 1の変異体であってもよぐ HSV— 2の変異体であってもよいが、 好ましくは HSV—1の変異体である。加えて、本発明に使用されるへルぺスウィルス の変異体は、細胞を融合させる能力を獲得したものである（本明細書では「Fタイプ」 の変異体と称する）。 Fタイプの変異体の場合、感染細胞が合胞体を形成することを 特徴とする。合胞体形成は、ウィルスが細胞に侵入した後、感染細胞の細胞膜表面 に発現したウィルスの膜タンパク質の働きによって、隣接した非感染細胞との融合を 起こすことによる（fosion from within :感染が必須な細胞融合）と考えられており、ウイ ノレス感染による細胞変性効果は細胞融合型プラークを形成する場合の方が溶解型 プラークよりも強力である。本発明の Fタイプの変異体はヒト中皮腫培養細胞、特にヒ ト悪性中皮腫細胞に特異的に作用して、これを効率よく破壊する。さらに、本発明の Fタイプの変異体は力ルポニン遺伝子を標的に増殖できるので、中皮腫のみならず 平滑筋肉腫などの力ルポニン遺伝子を発現する腫瘍を効率よく破壊することができる
〇
[0012] 本発明に用いる Fタイプの変異体は、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へ ルぺスウィルスから自然発生的に得られるものであってもよぐ遺伝子を改変して得ら れるものであってもよい。力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルス を得るには公知の遺伝子操作法を用いることができる。力、かる方法の例を後で説明 する。また、単純へルぺスウィルス力、ら Fタイプの変異体を得るにも公知の遺伝子操 作法を用いることができる。かかる方法の例としては、 HSV— 1遺伝子座の gB、 gK、 gL、 UL20および UL24遺伝子から選択される遺伝子の上に変異を作製する方法な どが挙げられる。
[0013] 本発明において好ましく用いられる単純へルぺスウィルスの Fタイプ変異体は、 PC T/JP02/13683に開示されたウィルス dl2. CALP A RRに由来するものであり、 自然変異により生じた変異体であってもよぐ公知の方法により遺伝子を改変（例え ば、 HSV—1遺伝子座の gB、 gK、 gL、 UL20および UL24遺伝子から選択される 遺伝子の上に変異を作製）して得られた変異体であってもよい。親株ウィルス dl2. C ALP A RRは溶解型のプラークを形成することにより特徴づけられ、 dl2. CALP A R Rの Fタイプ変異体は感染細胞が合胞体を形成することにより特徴づけられる（上記 参照）。本発明にお!/、て特に好ましく用いられる単純へルぺスウィルスの Fタイプ変 異体は、 dl2. CALP A RRから自然変異により生じた変異体である。 dl2. CALP Δ RRから自然変異により生じた変異体の 1つを、本明細書において「dl2. CALPf Δ RR株」と称する。なお、本明細書において、「力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単 純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体」を「Fタイプの変異体」または「本発明のウイ ノレス」と ^称すること力 Sある。
[0014] dl2. CALPf A RR株は 2005年 9月 12日に取得され、それ以降、発明者らの研究 室にて維持 '管理されている。
[0015] 特定の理論に拘泥するわけではないが、上で説明した本発明の悪性中皮腫治療 剤としての変異ウィルスは、力ルポニンを発現する悪性中皮腫等の特定の細胞で特 異的にウィルス遺伝子を発現しつつ複製 ·増殖することによって細胞を内部から破壊 すると考えられる。その腫瘍細胞破壊のメカニズムは、 1)ウィルスの増殖による直接 的な細胞溶解及び融合作用、 2)ウィルス感染細胞のアポトーシス、 3)個体内では、 細胞傷害性 Tリンパ球による抗腫瘍免疫の誘導、等が考えられる。本発明の変異ウイ ルスは、正常細胞には損傷を与えず、特に内在性のチミジンキナーゼ遺伝子をもつ ため、その腫瘍治療後の所望の時期にウィルスの増殖を抑制することができる。
[0016] 本発明のウィルスの中皮腫細胞標的化等の具体的使用態様について説明する。
例えば、平滑筋細胞及び悪性中皮腫細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子 の転写開始制御領域 (翻訳開始点を + 1とすると― 260〜 + 73の 333bp) (Yamamu ra H. et al. Cancer Res. 61， 3969-3977， 2001)の上流に 444bpのヒト 4F2重鎖転写 ェンハンサー（Mol. Cell Biol. 9， 2588-2597， 1989)を連結した後、ウィルス複製の開 始に必須の転写因子をコードする ICP4 ( « 4)遺伝子の上流に連結し、その下流に I nternal Ribosomal Entry Site (IRES) (米国特許第 4937190号明細書）を介して En hanced Green Fluorescent Protein遺伝子（米国特許第 5625048号明細書）等種々 の外来遺伝子を連結することが可能である。これをウィルス DNAの複製に必須の遺 伝子座、好ましくはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子座 (ICP6, UL36)と相同組換え することによって、力ルポニン遺伝子を発現しつつ活発に増殖する悪性中皮腫細胞 等の特定の増殖細胞で選択的に ICP4を発現させ、ウィルス増殖を誘導することがで きる。ウィルス増殖をモユタ一するために、本発明のウィルスに LacZなどの標識遺伝 子を揷入してもよい。例えば、 ICP6との相同組換え時に 4F2重鎖転写ェンハンサー の上流に LacZ標識遺伝子を揷入してもよ!/、。 LacZ遺伝子の発現は ICP6遺伝子の 内在性プロモーターで制御される（PCT/JP02/13683に開示されたウィルス dl 2 . CALP Δ RRの遺伝子構築を参照）。
[0017] 本発明において使用されるヒトカルポニン遺伝子のプロモーターは、 hi力ルポニン または塩基性力ルポニンタンパク（以下力ルポニンと呼ぶ）をコードする遺伝子の発 現を制御するものが好ましい。力ルポニンは、主に哺乳動物平滑筋細胞に存在する トロポニン様ァクチン結合タンパクとして発見され (Takahashi . et al. Hypertension 1 1， 620-626， 1998)、その発現は成体では平滑筋細胞や種々の肉腫細胞に特異的で ある（Takahashi . & Yamamura H. Adv. Biophys. 37， 91-111， 2003)。しかしながら 最近、本発明者は、ヒト悪性中皮腫手術標本及び手術標本から樹立された悪性中皮 腫培養細胞にぉレ、て、力ルポニン及び同じく平滑筋細胞特異的な力ルポニン様タン パクである SM22の発現が認められることを見出した。とりわけ力ルポニン遺伝子の 発現は、正常中皮細胞や反応性中皮細胞には認められず、ほとんどすべての肉腫 型悪性中皮腫細胞に認められたことから、悪性中皮腫細胞、とりわけ現在有効な治 療手段のない肉腫型悪性中皮腫を標的化するのに優れたマーカーであると考えら れた。それゆえ本発明においては、上記のヒトカルポニンまたはき力ルポニン様タン パク（例えば SM22)をコードする遺伝子 (Yamamura H. J. Biochem. 122， 157-167， 1 997)のプロモーター配列を利用することができる。図 1に、肉腫型悪性中皮腫患者の 腫瘍細胞における力ルポニンタンパクの発現を示す。
[0018] さらに、本発明において、用いることができる中皮腫細胞を標的化するプロモータ 一は上記力ルポニン遺伝子や SM22遺伝子に限定されるものではなぐ Singhal S.ら の報告（Singhal, S. et al. Clin. Cancer Res. 9， 3080-3097， 2003， Table2)にある正常 中皮細胞に比して主として上皮型悪性中皮腫細胞（Singhalらの症例の 94%は上皮 型または上皮型 +肉腫型の二相性）で発現が上昇している遺伝子群のプロモーター を用いる場合は、上皮型悪性中皮腫を標的化することができる。力ルポニン遺伝子 力 中皮腫細胞や平滑筋肉腫細胞以外では、増殖していない正常平滑筋細胞に発 現するごとく、当該遺伝子の正常細胞における発現が増殖していない細胞に限定さ れること力 S特に好ましい。 Singhalらの報告から引用した悪性中皮腫細胞で発現が上 昇する遺伝子群のリストを表 1に示す。
[0019] [表 1]
正常中皮細胞に比して主として上皮型悪性中皮腫細胞で発現が増加している遺伝 子群 （Singhal, S. et al. Clin. Cancer Res. 9， 3080-3097, 2003からの引用）
Figure imgf000011_0001
差替え用紙（規則 26) T601 17 α-spectnn 0.00177
AA888148 Tubulin β2 0.00155
AA634103 Thymosin β4 0.00028
AA677534 Laminin 0.00326
Figure imgf000012_0001
4 2669
23 597 n i ¾鹩離 Is
Metabolic pathways
AA676466 Argininosucciuate synthetase 0.03367
R158I4 Malate dehydrogenase 0.00152
AA664284 Ubiquinol- cytochrome c reductase 0.00013
H16958 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 0.00077
H05914 Lactate dehydrogenase-A (LDH-A) 0.00001
AA447774 Cytochrome c 1 0.00282
N93053 Cytochrome c oxidase 0.00089
R12802 Ubiquiaol-cytochrome c reductase core protein 11 0.00255
AA455235 Aldehyde dehydrogenase 6 0.00990
AA599187 Phosphoglycerate kinase 1 0.001 10
AA775241 Aldolase A
Figure imgf000013_0001
0.00082
Genes with potential therapeutii c and prognostic implications
AA598676 Reticulocaibin 2 12.74 0.00041
AA629897 Laminin receptor (67kD) 1 1.56 0.00181
AA458861 Death associated protein 10.94 0.00000
AA485353 Gaiectin-3 bindiag protein 10.38 0.00026
AA 156461 Pituitary tumor-transforming (PTT) interacting protein 9.46 0.00004
H99170 Calreticulin (precursor) 6.69 0.00162
T66814 Voltage-dependent anion channel (VDAC) 2 6.56 0.00046
AA044059 Voltage-depeudeiit anion channel (VDAC) 1 5.99 0.00025
AA 158991 Lung resistance related protein (major vault protein) 5.54 0.00001
AA394136 PCTAIRE 3 5.42 0.00095
W56266 Miiogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAPKKK 8) 5.28 0.01 120
[0020] 本発明の力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの 変異体を含む中皮腫の治療剤は、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫などのあ らゆる中皮腫に対して有効である。本発明の Fタイプの変異体を含む中皮腫の治療 剤は、良性中皮腫のみならず悪性中皮腫に対しても有効である。本発明の治療剤は 特に悪性中皮腫の治療に有効であるという点で画期的なものである。
[0021] 本発明の中皮腫の治療剤は治療の態様に応じて種々の剤形とすることができるが 、注射用や点滴用の液体剤形とするのが一般的である。ウィルスを水性担体、例え ば水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、リンゲル液、あるいはリン酸緩衝液などの緩衝液 などに溶解または懸濁することにより、液体剤形を製造することができる。本発明の中 皮腫治療剤を患部に直接注射してもよぐ静脈注射または輸液の点滴により投与し てもよい。これらの投与方法'経路は、患者の状態、中皮腫の性質 (病巣部位、局限 性かびまん性か等）などの因子に応じて適宜医師が選択することができる。投与すベ きウィルスの量や投与回数なども、患者の状態、中皮腫の性質などの因子に応じて 適宜医師が選択することができる。
[0022] 本発明の悪性中皮腫治療剤の投与形態としては、腫瘍の原発巣に対して、または 、予想転移部位に対して直接注射することができる。胸腔内および腹腔内への局所 注射、腫瘍栄養血管への血管内投与等の局所投与を行うこともできる。あるいは静 脈注射または輸液により投与することもできる。本発明の悪性中皮腫治療剤の投与 にあたっては、ラジオ波焼灼療法の穿針技術、カテーテル技術、外科的手術等と組 み合わせた投与形態をとることもできる。さらには外科手術により患部を露出させて、 そこへ本発明のウィルスを注射または滴下またはゲル状の基質に混ぜて接触させて もよい。本発明の中皮腫治療剤において、本発明のウィルスは遊離の状態であって もよく、例えば、生体適合性または生分解性の担体に担持されていてもよい。これら の担体は胸膜や腹膜などの患部や病巣へのデリバリーに適したものであってもよい。 かかる担体は、患者の状態、中皮腫の性質等に応じて医師が適宜選択できるもので ある。
[0023] 本発明の中皮腫治療剤において、本発明のウィルスのほかに、 1種またはそれ以 上の抗腫瘍物質を併用してもよい。本発明のウィルスと併用される抗腫瘍物質として は、抗がん剤、 BCG等の自然免疫を賦活する作用のあるワクチン、血管新生抑制剤 、分子標的薬、放射線、重粒子線等が挙げられるがこれらに限らない。ここで、併用と は、同じ中皮腫治療剤中に本発明のウィルスと抗腫瘍物質が混合されていてもよぐ 本発明のウィルスを含む中皮腫治療剤と、抗腫瘍物質を含む治療剤または治療法と を別個に投与または併用してもよい。
[0024] 本発明のウィルスの投与方法や投与経路は上で述べたものに限定されず、医師が 適宜選択し決定することができるものである。
[0025] 本発明の悪性中皮腫治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、病期、投与経 路、投与回数、剤形によって異なる力 一般に、成人では 1回あたり HSV—1ウイノレ スのカ価にして、約 lxlO6〜； lxl08PFU (プラーク形成単位）の範囲が適当である。 本発明の悪性中皮腫治療剤は、力ルポニンを発現し増殖する悪性中皮腫細胞を標 的化して破壊するため、正常細胞に対する毒性が低く安全性が高いと考えられる。ま た、本発明の悪性中皮腫治療剤は内在性のチミジンキナーゼ遺伝子をもっため、治 療後に市販のァシクロビルゃパラシクロビルを用いてウィルスの増殖を抑制すること 力 sできること力 、安全性が高いと考えられる。さらに、 125ιで標識したゥラシル誘導体 である FIAUを用いて Positron Emission Tomographyによりチミジンキナーゼ活性を 生体内で検出.測定することができるため（Bennet J. et al. Nature Med. 7， 859-863， 2001)、さらなる安全性の向上に役立つ。
[0026] 本発明はもう 1つの態様において、患者本人あるいは患者の血縁者から取り出され た細胞に、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプ変 異体、すなわち本発明のウィルスを感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞 の製造方法に関するものである。さらに本発明はもう 1つの態様において、このような 方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞にも関する。好ましくは、本発明のウイ ノレスを感染させる細胞は、患者本人のものであり、好ましくは患者の中皮腫から採取 された細胞である。また、細胞は悪性中皮腫力 採取されたものであってもよい。細 胞の感染に使用する本発明のウィルスで好ましいものは dl 2. CALPf A RR株であ る。細胞に本発明のウィルスを感染させる方法は公知の方法であってよい。例えば、 滅菌シャーレに培養した中皮腫細胞と本発明のウィルスを、細胞数とウィルス粒子の 数を一定の比率にしてインキュベートするなどの方法があり、患者の状態、中皮腫の 性質などの因子に応じて医師が適宜選択することができる。このようにして本発明の ウィルスに感染させた細胞もまた、本発明の範囲内である。本発明のウィルスを感染 させた細胞を、患者の体内、好ましくは中皮腫部位に戻すことにより、患者の中皮腫 、特に悪性中皮腫を治療することができる。本発明のウィルスに感染した細胞を、皮 膚を通して患部に直接注射することができ、あるいは静脈注射または輸液により投与 すること力 Sできる。あるいは外科手術により患部を露出させて、そこへ本発明のウィル スに感染した細胞を注射または滴下して接触させてもよい。
[0027] 上記のごとく本発明のウィルスを感染させた細胞を用いて患者の中皮腫を治療す る際に他の中皮腫治療を併用してもよい。
[0028] 本発明は、さらにもう 1つの態様において、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単 純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体、特に dl2. CALPf A RR株に関するもので ある。かかる変異体は新規であり、中皮腫、特に悪性中皮腫の治療に効果を発揮す る。また、力、かる変異体は平滑筋肉腫の治療にも用いることができる。
[0029] 本発明は、さらにもう 1つの態様において、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単 純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体を中皮腫患者に投与することを特徴とする、 患者における中皮腫の治療方法に関する。上記治療方法に用いられる好ましい変 異体は dl2. CALPf A RR株である。上記治療方法は特に悪性中皮腫の治療にお いて効果的である。
[0030] さらに本発明は、上記方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞を中皮腫患者 に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法も提供する。上記治療方法に用い られる好ましい中皮腫治療用細胞は dl2. CALPf A RR株を用いて得られるもので ある。上記治療方法は特に悪性中皮腫の治療にお!/、て効果的である。
[0031] 本発明は、さらにもう 1つの態様において、患者における中皮腫の治療用医薬の製 造における、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの 変異体の使用に関する。上記使用において好ましい変異体は dl 2. CALPf A RR株 である。本発明は特に、悪性中皮腫の治療剤の製造における、力ルポニン遺伝子を 標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体、好ましくは dl 2. CALPf A RR株の使用に関する。
[0032] さらに本発明は、中皮腫の治療用医薬の製造における、上記方法により得ることの できる中皮腫治療用細胞の使用にも関する。上記使用に用いられる好ましレ、中皮腫 治療用細胞は dl2. CALPf A RR株を用いて得られるものである。上記使用は特に 悪性中皮腫の治療用医薬の製造に好適である。
[0033] 以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明する力 実施例は単 なる例示説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
実施例 1
[0034] A.インビト口での悪性中皮腫培養細胞傷害分析及びウィルス複製分析
1.合胞体形成型 HSV— 1変異体、 dl2. CALPf A RRの分離
Vero細胞に、溶解型のプラークを形成する dl2. CALP A RRを感染させたところ 、合胞体型プラークを形成する変異体ウィルスを見出し、これを GILSON社製ピぺッ トマン P200のチップを用いて細胞ごと吸引分離し、 100 1のコールドウィルスバッフ ァー（150mMの NaClを含む 20mMの Tris— HCl ; pH7. 5)に懸濁し、凍結保存し た。
[0035] 上記 100 1の細胞懸濁液の全量を 6. 0 105じ6113/ 611 (6— 611プレート）の¥ ero細胞に感染させ、 42時間後に観察した像が図 2の感染実験（1)である。 6 -well プレート 1—well分の感染細胞力、ら培養液を除去し、 1. 5mlの GIBCO/BRL社製 無血清培地 VP— SFMで細胞懸濁液を作製し、 3000回転 5分間の遠心後の上清を 20000回転で 45分間の遠心し、その沈殿分画を 20 μ 1のコールドウィルスバッファ 一に懸濁し、— 80°Cに凍結保存した。図 2の感染実験（2)は、 FALCON社製 T150 ボトルで培養した Vero細胞に感染実験（1)から得た細胞懸濁液 6 μ 1を感染させた 後、 24時間の像で、分離したウィルスが形成するすべてのプラークが合胞体型のプ ラークであることを確言忍し得た。
[0036] 2.ヒト悪性中皮腫培養細胞の傷害分析
1 %の熱不活性 FBS/PBS中で、感染多重度（ΜΟΙ)が 0. ；!〜 1. Opfu/cellで、 6ゥエル組織培養プレート中の悪性中皮腫細胞のサブコンフルェント単層培養に dl
2. CALP A RR及び dl2. CALPf A RRを感染させた。かかる感染細胞を 37°Cで 1 時間インキュベートし、その後、 1 %の FBSと 11. 3〃 g/mlのヒト IgG (Jackson Immu noResearch Lab.社製）を含む前記培地で培養した。感染の 48時間後、 X— Gal染色 しプラーク/ wellの数および面積を評価した。結果を図 3に示す。 dl2. CALPf A R Rは、 dl2. CALP A RRに比べて、ヒト悪性中皮腫培養細胞に対しより強力な細胞 傷害活性を示した (X— Gal染色の青色はウィルスの増殖と細胞傷害の領域を示す）
〇
[0037] ICP4タンパク質発現のィムノブロット分析のため、ヒト悪性中皮腫培養細胞およびヒ ト平滑筋肉腫培養細胞に、感染多重度（MOI)が 0. 01-0. 1となるように dl2. CA LPf A RRをそれぞれ感染させ、 22時間培養したのち細胞抽出液を回収した。同量 のタンパク質を 9%の SDS— PAGEゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Bio- Rad社製）に移した。 5%のスキムミルク (DIFCO Laboratories社製)を用いて、膜を室 温で 2時間ブロッキングし、その後、抗 ICP4抗体（Goodwin Institute for Cancer Rese arch社製、希釈率 1： 500)を用いて、 4°Cでー晚インキュベートした。結果を図 4に示 す。悪性中皮腫細胞および平滑筋肉腫細胞でともに MOIに応じて、ウィルスの増殖 を示す ICP4タンパク質の発現が認められた。この結果から、本発明のウィルス変異 体は中皮腫のみならず平滑筋肉腫などの力ルポニン発現腫瘍にも作用して、これら の腫瘍を抑制しうることが示された。
[0038] 3. dl2. CALPf A RRのガンシクロビル感受性を示すウィルス複製分析
24wellの培養プレートに 5 X 104cells/wellの SK— LMS— 1ヒト平滑筋肉腫培 養細胞株を培養し、 dl2. CALPf A RR、 dl2. CALP、 hrR3ウィルスを MOI0. 01 で感染させた後、 1 %FBS/DMEMにガンシクロビルを種々の濃度に添加して 26 時間培養した。 10%ホルマリン PBSで細胞を固定した後、 X— Gal染色しプラーク数 を計測した。結果を図 5に示す。 dl2. CALPf A RRは、ガンシクロビルに高感受性 の ICP6欠失 HSV— 1変異体 hrR3よりも高いガンシクロビル感受性を示すことから、 安全性が高い。内在性のチミジンキナーゼ遺伝子を欠失する HSV— 1変異体 dl2. CALPは全くガンシクロビル感受性がなかった。
[0039] B.インビボでの処理及び免疫組織化学的分析
1.ヒト悪性中皮腫細胞の皮下移植モデルに対する dl2. CALPf A RR3回腫瘍内 投与による治療効果の検討
ヒト悪性中皮腫細胞にルシフェラーゼ遺伝子をトランスフエクシヨンし、最も化学発光 強度と増殖速度が高いクローンを選別した。クローン化した細胞中、 SCIDマウス背 部皮下に定着したものから、中皮腫の 4 5mm角の腫瘍塊を、 6週齢の雌の重症複 合型免疫不全マウス（SCIDマウス） (日本 SLC社製）の背部皮下に移植した。腫瘍 は、 SCIDマウスに移植後 30日で直径 6から 7mm程度（50— 70mm3)に成長した。 l X 107pfu/マウスの dl2. CALPf A RRを含む 50〃1 (マウス 1匹あたり）のウィルス 懸濁液（n = 3)、あるいは同量のウィルスバッファー（n = 3)を、 30Gの注射針を用い て腫瘍内に 5日間隔で合計 3回注入した。 1回目のウィルス注入後 11日目に腹腔内 にルシフェリン（Sigma Chemicals社製）を注入し、リアルタイムインビボイメージングシ ステム（Berthold社製）を用いて、背部皮下の腫瘍細胞からの化学発光（total photon count)を高感度 CCDカメラで計測した。リアルタイムインビボイメージングの結果を 図 6に示す。対照（ウィルスバッファー注入腫瘍）はフォトカウント 2· 79xl07、治療群
(dl2. CALPf A RR注入腫瘍）はフォトカウント 3· 84χ106で、治療群は対照の 13· 7%にフォトカウントが減少した。これらの結果より、背部皮下に移植したヒト悪性中皮 種細胞への直接注入により、 dl 2. CALPf A RRは顕著な抗腫瘍効果を有すること カゎカゝつた。
[0040] 組織学的研究のため、 dl2. CALPf A RR注入後所定の時間に皮下腫瘍を取り出 し、 2%のパラホルムアルデヒド、 0. 5%のグルタルアルデヒドを用いて、 ImMの Mg C1を含む PBSで、 4°Cでー晚固定した。続いて、 X—gal (lmg/ml)、 5mMの K F
2 3 e (CN )、 5mMの K Fe (CN )及び ImMの MgClを PBS中に含む基質溶液に、該
6 4 6 2
腫瘍を 37°Cで 3時間浸し、その後、 3%の DMSOを含む PBSで洗浄した。結果を図 7に示す。 dl2. CALPf A RRを注入した悪性中皮腫では、ウィルスの増殖を示す L acZ遺伝子の発現と顕著な抗腫瘍効果が認められた。
[0041] 2.ヒト悪性中皮腫細胞の胸腔内移植モデルに対する dl2. CALPf A RRの 2回胸腔 内投与による治療効果の検討
悪性中皮腫細胞（1 X 107cells/マウス）を 6週齢の雌の SCIDマウスの胸腔内に 注入して、胸腔内悪性中皮腫モデルを作製した。 SCIDマウスに移植後 2週目に 1 X 107pfu/マウスの dl 2. CALPf Δ RRを含む 50 μ 1 (マウス 1匹あたり）のウィルス懸 濁液（η = 3)あるいは同量のウィルスバッファー（η = 3)、 30Gを用いて胸腔内に 1週 間隔で合計 2回注入した。 1回目の注入後 19日目に解剖し治療効果を評価した。結 果を図 8に示す。 dl2. CALPf A RRは SCIDマウス胸腔内に移植したヒト悪性中皮 種細胞に対し顕著な抗腫瘍効果を示した。
[0042] 3.ヒト腹膜悪性中皮腫の SCIDマウス腹腔内正所性移植モデルに対する dl2. CA LPf A RRの 3回腹腔内投与による治療効果の検討
ヒト腹膜悪性中皮腫培養細胞にホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子 pGL4. 13 (Pr omega社製）を導入し、インビトロイメージング法を用いてルシフェラーゼ標識ヒト腹膜 悪性中皮腫クローン細胞株を得た。この細胞株を用いて SCIDマウス（日本クレア社 製）においてルシフェラーゼ標識ヒト腹膜悪性中皮腫の腹腔内モデルを作製した。腫 瘍腹腔内移植後 6、 20、 32および 39日目にインビボイメージングを行った。ジェチ ルエーテル麻酔下で、ルシフェリン 3. 75mg/kgを腹腔内投与した。ルシフェリン腹 腔内投与から 3分後にネンブタール 25mg/kgを腹腔内投与し、 10分後に NightOW LS (Berthold社)を用いてイメージングを開始した。腫瘍腹腔内移植後 21、 27および 33日目に、 dl2. CALPf A RRウィルスを腹腔内に直接投与した。 dl2. CALPf Δ RRウィルスをウィルスバッファーで 1 · O X lC/pfu/lOO Lに希釈したものをマウス 1匹あたり 100 Lずつ腹腔内にジェチルエーテル麻酔下で投与した (n = 5)。対照 群にはウィルスバッファーを 1匹あたり 100 しずつ腹腔内に直接投与した (n = 5)。
[0043] 対照群では、 1回目のウィルスバッファー投与後 11日目には腫瘍の増大に伴って 発光強度が増大していた。一方、 dl2. CALPf A RRウィルス投与群では、 1回目の ウィルス投与後 11日目と 18日目の発光強度は低下しており、ウィルス投与による明 らかな抗腫瘍効果が認められた（図 9)。ウィルス投与前後のフオトンカウントの変化を 比較すると、 dl2. CALPf A RRウィルス投与群で有意に低下しており、ウィルスによ る抗腫瘍効果が確認された（図 10)。なお、ウィルス投与前のコントロール群と dl2. CALPDRRウィルス群のフォトンカウントに有意な差は認められなかった。また、腫瘍 摘出直前のフオトンカウントは、コントロール群の方が dl2. CALPf A RRウィルス群 に比べて 1. 98倍高力、つた。また、摘出した腹腔内腫瘍の重量は対照群の方が dl 2 . CALPfARRウィルス投与群に比べて 2· 1倍高かった。以上より、フオトンカウント はマウスの腹腔内腫瘍体積をよく反映していた。これらの結果より、本正所性移植モ デノレにおける dl2. CALPfARRウィルスによる治療効果が確認された。
産業上の利用可能性
本発明は、悪性中皮腫の治療薬の分野等に利用されうる。

Claims

請求の範囲
[I] 力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体を含 む、中皮腫の治療剤。
[2] 該変異体が dl 2. CALP A RR株に由来するものである、請求項 1記載の治療剤。
[3] 該変異体が dl2. CALPf A RR株である、請求項 2記載の治療剤。
[4] 中皮腫が悪性のものである、請求項 1ないし 3のいずれか 1項記載の治療剤。
[5] 患者から取り出された中皮腫細胞に、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へ ルぺスウィルスの Fタイプ変異体を感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞 の製造方法。
[6] 該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、請求項 5記載の方法。
[7] 該変異体が dl 2. CALPf A RR株である請求項 6記載の方法。
[8] 中皮腫が悪性のものである、請求項 5ないし 7のいずれ力、 1項記載の方法。
[9] 請求項 5ないし 8のいずれ力、 1項記載の方法により得ることのできる中皮腫治療用 細胞。
[10] 力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体を中 皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法。
[I I] 該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、請求項 10記載の方法。
[12] 該変異体が dl2. CALPf A RR株である、請求項 11記載の方法。
[13] 中皮腫が悪性のものである、請求項 10ないし 12のいずれ力、 1項記載の方法。
[14] 請求項 9記載の中皮腫治療用細胞を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中 皮腫の治療方法。
[15] 中皮腫治療用の医薬の製造のための、力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純 ヘルぺスウィルスの Fタイプの変異体の使用。
[16] 該変異体が dl2. CALP A RR株に由来するものである、請求項 15記載の使用。
[17] 該変異体が dl2. CALPf A RR株である、請求項 16記載の使用。
[18] 中皮腫が悪性のものである、請求項 15ないし 17のいずれ力、 1項記載の使用。
[19] 中皮腫治療用の医薬の製造のための、請求項 9記載の中皮腫治療用細胞の使用
[20] 力ルポニン遺伝子を標的に増殖する単純へルぺスウィルスの Fタイプの変異体。
[21] dl2. CALPARR株に由来するものである、請求項 20記載の変異体。
[22] dl2. CALPf ARR株である、請求項 21記載の変異体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011118819A1 (ja) * 2010-03-25 2011-09-29 Suzuki Shinsuke サービビンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクターによる造血器腫瘍の遺伝子治療
WO2020109389A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Innovative Molecules Gmbh Helicase primase inhibitors for treating cancer in a combination therapy with oncolytic viruses

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003057888A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Japan Science And Technology Agency Vecteur d'expression/replication de cellule specifique

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728379A (en) * 1994-06-23 1998-03-17 Georgetown University Tumor- or cell-specific herpes simplex virus replication

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003057888A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Japan Science And Technology Agency Vecteur d'expression/replication de cellule specifique

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SINGHAL S. ET AL.: "Gene expression profiling of malignant mesothelioma", CLIN. CANCER RES., vol. 9, 1 August 2003 (2003-08-01), pages 3080 - 3097, XP003020708 *
TAKAHASHI K. AND YAMAMURA H.: "Studies and perspectives of calponin in smooth muscle regulation and cancer gene therapy", ADV. BIOPHYS., vol. 37, 2003, pages 91 - 111, XP003020709 *
YAMAMURA H. ET AL.: "Identification of the transcriptional regulatory sequences of human calponin promotes and their use in targeting a conditionally replicating Herpes vector to malignant human soft tissue and bone tumors", CANCER RES., vol. 61, 15 May 2001 (2001-05-15), pages 3969 - 3977, XP002967010 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011118819A1 (ja) * 2010-03-25 2011-09-29 Suzuki Shinsuke サービビンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクターによる造血器腫瘍の遺伝子治療
JP2011201813A (ja) * 2010-03-25 2011-10-13 Kagoshima Univ サービビンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクターによる造血器腫瘍の遺伝子治療
WO2020109389A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Innovative Molecules Gmbh Helicase primase inhibitors for treating cancer in a combination therapy with oncolytic viruses

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