JPWO2008013276A1 - 悪性中皮腫治療剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、悪性中皮腫の有効な治療剤を提供する。詳細には、本発明は、カルポニン標的化腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）の変異体、好ましくはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株を含む、中皮腫の治療剤を提供する。さらに本発明は、患者から取り出された中皮腫細胞に、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体、好ましくはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株を感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞の製造方法を提供する。上記方法により得られる細胞；およびカルポニン標的化腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）の変異体、好ましくはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株が提供される。

Description

本発明は、中皮腫、特に悪性中皮腫の治療に関する。詳細には、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスの変異体の中皮腫、特に悪性中皮腫を治療するための使用、ならびにそのようなウイルス変異体に関する。

アスベストに起因する悪性中皮腫の発生は、近年、先進諸国において増加の一途をたどっている。我が国においても１９７３年の腹膜悪性中皮腫の報告以来増え続け、２００４年度の死亡者数は２００２年度比で約２倍の９７０人に達している。厚生労働省の２００３年の資料によると、アスベストへの暴露開始から中皮腫発生までの期間は１１〜５４年（中央値３８．６年）であり、我が国においてアスベストが最も多く消費された時期が１９７０〜１９９０年であることから、２０３０年まで中皮腫患者は増え続けると予測されている。我が国の２０２５〜２０３０年の中皮腫による死亡者数は上限予測で年間１００００人を超えると見られており、これは現在の乳がんの死亡者数に匹敵する。したがって、悪性中皮腫に対する治療法の開発は目下の全世界的な課題である。

悪性中皮腫の治療には、胸膜肺全摘術などの外科的治療、シスプラチン、アリムタなどを用いた化学療法及び放射線療法を組み合わせた集学的治療法が試みられているが、予後は極めて不良で２年生存率は２０〜３０％にとどまる。大阪府内における１９７５〜２００１年のがん登録による調査（非特許文献１参照）でも、男性の５年生存率は５％、生存期間の中央値は６ヶ月にも満たないという結果である。特に、病理組織分類で全体の４０％を占める肉腫型及び二相性（上皮型＋肉腫型）中皮腫には外科的切除以外に有効な治療法がなく、新治療法の開発が切望されている。

ウイルスベクターを含む遺伝子導入技術の進歩とともに、遺伝子治療という新しい治療分野が確立されようとしている。これまで、悪性中皮腫に対して試みられてきた遺伝子治療には大きく分けて４通りある。第１は、自殺遺伝子と呼ばれる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）とアデノウイルスベクターを用いるもので、２１例の悪性胸膜中皮腫患者に対する第Ｉ相臨床試験が米国で実施されたが、２例が５年以上生存したのみであった（非特許文献２参照）。第２は、免疫遺伝子治療である。インターロイキン２を天然痘ウイルスベクターを用いて胸膜中皮腫の６例の患者の胸腔内に投与する第Ｉ相臨床試験が米国で実施されたが、治療効果は認められなかった（非特許文献３参照）。第３は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をレトロウイルスを用いて遺伝子導入した増殖能のない卵巣がん細胞を胸腔内に投与し、その後ガンシクロビルで卵巣がん細胞を死滅させることによって中皮腫細胞に対する免疫応答をも誘導する方法であるが、治療効果については報告されていない（非特許文献４参照）。第４は、γ３４．５などの病原性にかかわる遺伝子を取り除いた増殖型、弱毒化ＨＳＶ−１を用いる方法であるが、まだ基礎実験の段階であり、中皮腫細胞への選択性をもたない（非特許文献５参照）。
Kanazawa N. et al. Jpn. J. Clin. Oncol. 36, 254-257, 2006 Sterman, D.H. et al. Clin. Cancer Res. 11, 7444-7453, 2005 Mukherjee, S. et al. Cancer Gene Ther. 7, 663-670, 2000 Harrison, L.H. et al. Ann. Thorac. Surg. 70, 407-411, 2000 Adusumilli, P.S. et al. Cancer Biol. Ther. 5, 48-53, 2006

本発明は、中皮腫、特に悪性中皮腫の有効な治療剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題の解決のため鋭意努力を重ねた結果、平滑筋細胞のマーカーであるカルポニン蛋白がヒト悪性中皮腫細胞にも発現していることを見出した。特に、カルポニンのカルボキシル末端領域の合成ペプチドに対して作成したウサギポリクローナル抗体が非腫瘍組織である反応性中皮細胞は染色せず、腫瘍部にある悪性中皮腫細胞を選択的に染色することを明らかにした。続いて、本発明者らは、カルポニン標的化腫瘍溶解性ＨＳＶ−１、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ（ＰＣＴ／ＪＰ０２／１３６８３「細胞特異的発現複製ベクター」）の変異体であるｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲがヒト悪性中皮腫培養細胞を効率よく破壊することを見出した。さらにはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを個体内に投与することにより、ヒト手術標本から樹立した悪性中皮腫培養細胞をＳＣＩＤマウス胸腔内および背部皮下に移植した実験的治療評価系において腫瘍体積が著しく減少することを見出し、本発明を完成させるに至った。

ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲは、カルポニンを標的にヒト肉腫細胞を破壊することが知られている（ＰＣＴ／ＪＰ０２／１３６８３ 発明の名称：「細胞特異的発現複製ベクター」）。しかしながら、そこには今回の発明のような知見は記載も示唆もされていない。

すなわち、本発明は、
（１）カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を含む、中皮腫の治療剤；
（２）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、（１）記載の治療剤；
（３）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、請求項２記載の治療剤；
（４）中皮腫が悪性のものである、（１）ないし（３）のいずれかに記載の治療剤；
（５）患者から取り出された中皮腫細胞に、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体を感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞の製造方法；
（６）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、（５）記載の方法；
（７）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である（６）記載の方法；
（８）中皮腫が悪性のものである、（５）ないし（７）のいずれかに記載の方法；
（９）（５）ないし（８）のいずれかに記載の方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞；
（１０）カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法；
（１１）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、（１０）記載の方法；
（１２）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、（１１）記載の方法；
（１３）中皮腫が悪性のものである、（１０）ないし（１２）のいずれかに記載の方法；
（１４）（９）記載の中皮腫治療用細胞を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法；
（１５）中皮腫治療用の医薬の製造のための、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体の使用；
（１６）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、（１５）記載の使用；
（１７）該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、（１６）記載の使用；
（１８）中皮腫が悪性のものである、（１５）ないし（１７）のいずれかに記載の使用；
（１９）中皮腫治療用の医薬の製造のための、（９）記載の中皮腫治療用細胞の使用；
（２０）カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体；
（２１）ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、（２０）記載の変異体；
（２２）ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、（２１）記載の変異体
を提供するものである。

本発明によれば、中皮腫の治療剤、とりわけこれまで全く治療法がないと考えられていた肉腫型悪性中皮腫に対する治療剤が提供される。

図１は、悪性中皮腫に選択的なカルポニンタンパクの発現を示すヒト悪性中皮腫手術標本のカルポニンポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学を示す（茶色に染まった部分）像である。Ａは反応性中皮、Ｂは肉腫型悪性中皮腫：症例１、Ｃは肉腫型悪性中皮腫：症例２である。症例１では正常な血管平滑筋細胞よりも強く発現している。症例２では腫瘍細胞に均一に発現している。抗体は、ヒトｈ１カルポニンのカルボキシル末端の１８ペプチドＬｅｕ２８１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ２９７に対するウサギ抗血清を作製し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラム（Amersham Biosciences）を用いてＩｇＧ分画を精製した。 図２は、ＨＳＶ−１変異体ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲに感染した細胞懸濁液でＶｅｒｏ細胞を処理してから４２時間経過後の像を示す。分離前のパネル（Ａ）中の円で囲んだ部分は細胞溶解型のプラークを形成することを特徴とするｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲのプラークの内、細胞膜が融合し合胞体形成型のプラークを特徴とする変異体の単一クローンを示す。分離後のパネル（Ｂ）中の円は、その部分の変異体クローンが完全にチップで吸引されていることを示す。分離後Ｖｅｒｏ細胞への感染実験（１）のパネル（Ｃ）は、細胞懸濁液の全量を６．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６−ｗｅｌｌプレート）のＶｅｒｏ細胞に感染させ、４２時間後に観察した像である。分離後Ｖｅｒｏ細胞への感染実験（２）のパネル（Ｄ）は、ＦＡＬＣＯＮ社製Ｔ１５０ボトルで培養したＶｅｒｏ細胞に感染実験（１）から得た細胞懸濁液６μｌを感染させた後、２４時間の像である。 図３は、悪性中皮腫細胞のサブコンフルエント単層培養にｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ及びｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを、ＭＯＩ０．１および１．０で感染させ、感染の４８時間後、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク／ｗｅｌｌの数および面積を評価した結果を示す像である。 図４は、ヒト悪性中皮腫細胞及びヒト平滑筋肉腫細胞のサブコンフルエント単層培養にｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを、ＭＯＩ０．０１および０．１で感染させ、２２時間後にＩＣＰ４タンパク質発現のイムノブロット分析をした結果を示す像である。 図５は、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲのガンシクロビル感受性を示すウイルス複製分析の結果を示すグラフである。 図６は、ヒト悪性中皮腫培養細胞を背部皮下に移植したＳＣＩＤマウスにおけるｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの治療効果を示すリアルタイムインビボイメージングの図である。パネルＡはウイルスバッファーのみを注入したＳＣＩＤマウス、パネルＢはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入したＳＣＩＤマウス、パネルＣはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入した別のＳＣＩＤマウスにおける移植ヒト悪性中皮腫の様子である。図中、１は処置をしなかった側の腫瘍を示し、２（矢印）はウイルスバッファーまたはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入した側の腫瘍を示し、円はそれぞれの腫瘍の位置と、バックグラウンドの化学発光を検出した場所を示す。ウイルスバッファーまたはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを５日おきに３回腫瘍内に直接注入した。ヒト手術標本から樹立した悪性中皮腫培養細胞をあらかじめルシフェフェラーゼ遺伝子で標識した。 図７は、ＳＣＩＤマウス背部皮下に移植したヒト悪性中皮腫におけるｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの増殖を示すＬａｃＺ遺伝子の発現（青い発色）と顕著な抗腫瘍効果を示す腫瘍径の縮小を示す図である。左の２つはウイルスバッファーのみを注入した腫瘍、右の２つはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入した腫瘍を示す。 図８は、ＳＣＩＤマウス胸腔内に移植したヒト悪性中皮種細胞に対するｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの抗腫瘍効果を示す図である。パネルＡはウイルスバッファーのみを注入したマウスの胸腔内移植ヒト悪性中皮種の様子を、パネルＢはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入した動物における移植ヒト悪性中皮種の様子を示す。ウイルスバッファーまたはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを１回胸腔内に直接注入した。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの注入により、顕著な抗腫瘍効果が認められた。 図９は、ヒト腹膜悪性中皮腫のＳＣＩＤマウス腹腔内正所性移植モデルにおけるｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの抗腫瘍効果を示す、ルシフェラーゼ標識腫瘍のインビボイメージングを示す。上段はウイルスバッファーを注入した対照マウスの結果を示し、下段はｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ注入マウスの結果を示す。 図１０は、ヒト腹膜悪性中皮腫のＳＣＩＤマウス腹腔内正所性移植モデルにてｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを用いた治療実験におけるルシフェラーゼ標識腫瘍のフォトンカウントを示す図である。矢印はウイルス注入時点を示す。

本発明は、１の態様において、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を含む、中皮腫の治療剤に関するものである。本発明に使用する単純ヘルペスウイルスの変異体はカルポニン遺伝子を標的に増殖するものであれば、ＨＳＶ−１の変異体であってもよく、ＨＳＶ−２の変異体であってもよいが、好ましくはＨＳＶ−１の変異体である。加えて、本発明に使用されるヘルペスウイルスの変異体は、細胞を融合させる能力を獲得したものである（本明細書では「Ｆタイプ」の変異体と称する）。Ｆタイプの変異体の場合、感染細胞が合胞体を形成することを特徴とする。合胞体形成は、ウイルスが細胞に侵入した後、感染細胞の細胞膜表面に発現したウイルスの膜タンパク質の働きによって、隣接した非感染細胞との融合を起こすことによる（fusion from within：感染が必須な細胞融合）と考えられており、ウイルス感染による細胞変性効果は細胞融合型プラークを形成する場合の方が溶解型プラークよりも強力である。本発明のＦタイプの変異体はヒト中皮腫培養細胞、特にヒト悪性中皮腫細胞に特異的に作用して、これを効率よく破壊する。さらに、本発明のＦタイプの変異体はカルポニン遺伝子を標的に増殖できるので、中皮腫のみならず平滑筋肉腫などのカルポニン遺伝子を発現する腫瘍を効率よく破壊することができる。

本発明に用いるＦタイプの変異体は、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスから自然発生的に得られるものであってもよく、遺伝子を改変して得られるものであってもよい。カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスを得るには公知の遺伝子操作法を用いることができる。かかる方法の例を後で説明する。また、単純ヘルペスウイルスからＦタイプの変異体を得るにも公知の遺伝子操作法を用いることができる。かかる方法の例としては、ＨＳＶ−１遺伝子座のｇＢ、ｇＫ、ｇＬ、ＵＬ２０およびＵＬ２４遺伝子から選択される遺伝子の上に変異を作製する方法などが挙げられる。

本発明において好ましく用いられる単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体は、ＰＣＴ／ＪＰ０２／１３６８３に開示されたウイルスｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲに由来するものであり、自然変異により生じた変異体であってもよく、公知の方法により遺伝子を改変（例えば、ＨＳＶ−１遺伝子座のｇＢ、ｇＫ、ｇＬ、ＵＬ２０およびＵＬ２４遺伝子から選択される遺伝子の上に変異を作製）して得られた変異体であってもよい。親株ウイルスｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲは溶解型のプラークを形成することにより特徴づけられ、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲのＦタイプ変異体は感染細胞が合胞体を形成することにより特徴づけられる（上記参照）。本発明において特に好ましく用いられる単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体は、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲから自然変異により生じた変異体である。ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲから自然変異により生じた変異体の１つを、本明細書において「ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株」と称する。なお、本明細書において、「カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体」を「Ｆタイプの変異体」または「本発明のウイルス」と総称することがある。

ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株は２００５年９月１２日に取得され、それ以降、発明者らの研究室にて維持・管理されている。

特定の理論に拘泥するわけではないが、上で説明した本発明の悪性中皮腫治療剤としての変異ウイルスは、カルポニンを発現する悪性中皮腫等の特定の細胞で特異的にウイルス遺伝子を発現しつつ複製・増殖することによって細胞を内部から破壊すると考えられる。その腫瘍細胞破壊のメカニズムは、１）ウイルスの増殖による直接的な細胞溶解及び融合作用、２）ウイルス感染細胞のアポトーシス、３）個体内では、細胞傷害性Tリンパ球による抗腫瘍免疫の誘導、等が考えられる。本発明の変異ウイルスは、正常細胞には損傷を与えず、特に内在性のチミジンキナーゼ遺伝子をもつため、その腫瘍治療後の所望の時期にウイルスの増殖を抑制することができる。

本発明のウイルスの中皮腫細胞標的化等の具体的使用態様について説明する。例えば、平滑筋細胞及び悪性中皮腫細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子の転写開始制御領域（翻訳開始点を＋１とすると−２６０〜＋７３の３３３ｂｐ）（Yamamura H. et al. Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001）の上流に４４４ｂｐのヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（Mol. Cell Biol. 9, 2588-2597, 1989）を連結した後、ウイルス複製の開始に必須の転写因子をコードするＩＣＰ４（α４）遺伝子の上流に連結し、その下流にInternal Ribosomal Entry Site （ＩＲＥＳ）（米国特許第４９３７１９０号明細書）を介してEnhanced Green Fluorescent Protein遺伝子（米国特許第５６２５０４８号明細書）等種々の外来遺伝子を連結することが可能である。これをウイルスＤＮＡの複製に必須の遺伝子座、好ましくはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子座（ＩＣＰ６，ＵＬ３６）と相同組換えすることによって、カルポニン遺伝子を発現しつつ活発に増殖する悪性中皮腫細胞等の特定の増殖細胞で選択的にＩＣＰ４を発現させ、ウイルス増殖を誘導することができる。ウイルス増殖をモニターするために、本発明のウイルスにＬａｃＺなどの標識遺伝子を挿入してもよい。例えば、ＩＣＰ６との相同組換え時に４Ｆ２重鎖転写エンハンサーの上流にＬａｃＺ標識遺伝子を挿入してもよい。ＬａｃＺ遺伝子の発現はＩＣＰ６遺伝子の内在性プロモーターで制御される（ＰＣＴ／ＪＰ０２／１３６８３に開示されたウイルスｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲの遺伝子構築を参照）。

本発明において使用されるヒトカルポニン遺伝子のプロモーターは、ｈ１カルポニンまたは塩基性カルポニンタンパク（以下カルポニンと呼ぶ）をコードする遺伝子の発現を制御するものが好ましい。カルポニンは、主に哺乳動物平滑筋細胞に存在するトロポニン様アクチン結合タンパクとして発見され(Takahashi K. et al. Hypertension 11, 620-626, 1998)、その発現は成体では平滑筋細胞や種々の肉腫細胞に特異的である（Takahashi K. & Yamamura H. Adv. Biophys. 37, 91-111, 2003）。しかしながら最近、本発明者は、ヒト悪性中皮腫手術標本及び手術標本から樹立された悪性中皮腫培養細胞において、カルポニン及び同じく平滑筋細胞特異的なカルポニン様タンパクであるＳＭ２２の発現が認められることを見出した。とりわけカルポニン遺伝子の発現は、正常中皮細胞や反応性中皮細胞には認められず、ほとんどすべての肉腫型悪性中皮腫細胞に認められたことから、悪性中皮腫細胞、とりわけ現在有効な治療手段のない肉腫型悪性中皮腫を標的化するのに優れたマーカーであると考えられた。それゆえ本発明においては、上記のヒトカルポニンまたはきカルポニン様タンパク（例えばＳＭ２２）をコードする遺伝子(Yamamura H. J. Biochem. 122, 157-167, 1997)のプロモーター配列を利用することができる。図１に、肉腫型悪性中皮腫患者の腫瘍細胞におけるカルポニンタンパクの発現を示す。

さらに、本発明において、用いることができる中皮腫細胞を標的化するプロモーターは上記カルポニン遺伝子やＳＭ２２遺伝子に限定されるものではなく、Singhal S.らの報告（Singhal, S. et al. Clin. Cancer Res. 9, 3080-3097, 2003, Table2）にある正常中皮細胞に比して主として上皮型悪性中皮腫細胞（Singhalらの症例の９４％は上皮型または上皮型＋肉腫型の二相性）で発現が上昇している遺伝子群のプロモーターを用いる場合は、上皮型悪性中皮腫を標的化することができる。カルポニン遺伝子が、中皮腫細胞や平滑筋肉腫細胞以外では、増殖していない正常平滑筋細胞に発現するごとく、当該遺伝子の正常細胞における発現が増殖していない細胞に限定されることが特に好ましい。Singhal らの報告から引用した悪性中皮腫細胞で発現が上昇する遺伝子群のリストを表１に示す。

本発明のカルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を含む中皮腫の治療剤は、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫などのあらゆる中皮腫に対して有効である。本発明のＦタイプの変異体を含む中皮腫の治療剤は、良性中皮腫のみならず悪性中皮腫に対しても有効である。本発明の治療剤は特に悪性中皮腫の治療に有効であるという点で画期的なものである。

本発明の中皮腫の治療剤は治療の態様に応じて種々の剤形とすることができるが、注射用や点滴用の液体剤形とするのが一般的である。ウイルスを水性担体、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、リンゲル液、あるいはリン酸緩衝液などの緩衝液などに溶解または懸濁することにより、液体剤形を製造することができる。本発明の中皮腫治療剤を患部に直接注射してもよく、静脈注射または輸液の点滴により投与してもよい。これらの投与方法・経路は、患者の状態、中皮腫の性質（病巣部位、局限性かびまん性か等）などの因子に応じて適宜医師が選択することができる。投与すべきウイルスの量や投与回数なども、患者の状態、中皮腫の性質などの因子に応じて適宜医師が選択することができる。

本発明の悪性中皮腫治療剤の投与形態としては、腫瘍の原発巣に対して、または、予想転移部位に対して直接注射することができる。胸腔内および腹腔内への局所注射、腫瘍栄養血管への血管内投与等の局所投与を行うこともできる。あるいは静脈注射または輸液により投与することもできる。本発明の悪性中皮腫治療剤の投与にあたっては、ラジオ波焼灼療法の穿針技術、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。さらには外科手術により患部を露出させて、そこへ本発明のウイルスを注射または滴下またはゲル状の基質に混ぜて接触させてもよい。本発明の中皮腫治療剤において、本発明のウイルスは遊離の状態であってもよく、例えば、生体適合性または生分解性の担体に担持されていてもよい。これらの担体は胸膜や腹膜などの患部や病巣へのデリバリーに適したものであってもよい。かかる担体は、患者の状態、中皮腫の性質等に応じて医師が適宜選択できるものである。

本発明の中皮腫治療剤において、本発明のウイルスのほかに、１種またはそれ以上の抗腫瘍物質を併用してもよい。本発明のウイルスと併用される抗腫瘍物質としては、抗がん剤、ＢＣＧ等の自然免疫を賦活する作用のあるワクチン、血管新生抑制剤、分子標的薬、放射線、重粒子線等が挙げられるがこれらに限らない。ここで、併用とは、同じ中皮腫治療剤中に本発明のウイルスと抗腫瘍物質が混合されていてもよく、本発明のウイルスを含む中皮腫治療剤と、抗腫瘍物質を含む治療剤または治療法とを別個に投与または併用してもよい。

本発明のウイルスの投与方法や投与経路は上で述べたものに限定されず、医師が適宜選択し決定することができるものである。

本発明の悪性中皮腫治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、病期、投与経路、投与回数、剤形によって異なるが、一般に、成人では１回あたりＨＳＶ−１ウイルスの力価にして、約１ｘ１０^６〜１ｘ１０^８ＰＦＵ（プラーク形成単位）の範囲が適当である。本発明の悪性中皮腫治療剤は、カルポニンを発現し増殖する悪性中皮腫細胞を標的化して破壊するため、正常細胞に対する毒性が低く安全性が高いと考えられる。また、本発明の悪性中皮腫治療剤は内在性のチミジンキナーゼ遺伝子をもつため、治療後に市販のアシクロビルやパラシクロビルを用いてウイルスの増殖を抑制することができることから、安全性が高いと考えられる。さらに、^１２５Ｉで標識したウラシル誘導体であるＦＩＡＵを用いてPositron Emission Tomographyによりチミジンキナーゼ活性を生体内で検出・測定することができるため（Bennet J. et al. Nature Med. 7, 859-863,2001）、さらなる安全性の向上に役立つ。

本発明はもう１つの態様において、患者本人あるいは患者の血縁者から取り出された細胞に、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体、すなわち本発明のウイルスを感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞の製造方法に関するものである。さらに本発明はもう１つの態様において、このような方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞にも関する。好ましくは、本発明のウイルスを感染させる細胞は、患者本人のものであり、好ましくは患者の中皮腫から採取された細胞である。また、細胞は悪性中皮腫から採取されたものであってもよい。細胞の感染に使用する本発明のウイルスで好ましいものはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である。細胞に本発明のウイルスを感染させる方法は公知の方法であってよい。例えば、滅菌シャーレに培養した中皮腫細胞と本発明のウイルスを、細胞数とウイルス粒子の数を一定の比率にしてインキュベートするなどの方法があり、患者の状態、中皮腫の性質などの因子に応じて医師が適宜選択することができる。このようにして本発明のウイルスに感染させた細胞もまた、本発明の範囲内である。本発明のウイルスを感染させた細胞を、患者の体内、好ましくは中皮腫部位に戻すことにより、患者の中皮腫、特に悪性中皮腫を治療することができる。本発明のウイルスに感染した細胞を、皮膚を通して患部に直接注射することができ、あるいは静脈注射または輸液により投与することができる。あるいは外科手術により患部を露出させて、そこへ本発明のウイルスに感染した細胞を注射または滴下して接触させてもよい。

上記のごとく本発明のウイルスを感染させた細胞を用いて患者の中皮腫を治療する際に他の中皮腫治療を併用してもよい。

本発明は、さらにもう１つの態様において、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体、特にｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株に関するものである。かかる変異体は新規であり、中皮腫、特に悪性中皮腫の治療に効果を発揮する。また、かかる変異体は平滑筋肉腫の治療にも用いることができる。

本発明は、さらにもう１つの態様において、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を中皮腫患者に投与することを特徴とする、患者における中皮腫の治療方法に関する。上記治療方法に用いられる好ましい変異体はｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である。上記治療方法は特に悪性中皮腫の治療において効果的である。

さらに本発明は、上記方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法も提供する。上記治療方法に用いられる好ましい中皮腫治療用細胞はｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株を用いて得られるものである。上記治療方法は特に悪性中皮腫の治療において効果的である。

本発明は、さらにもう１つの態様において、患者における中皮腫の治療用医薬の製造における、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体の使用に関する。上記使用において好ましい変異体はｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である。本発明は特に、悪性中皮腫の治療剤の製造における、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体、好ましくはｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株の使用に関する。

さらに本発明は、中皮腫の治療用医薬の製造における、上記方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞の使用にも関する。上記使用に用いられる好ましい中皮腫治療用細胞はｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株を用いて得られるものである。上記使用は特に悪性中皮腫の治療用医薬の製造に好適である。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は単なる例示説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。

Ａ．インビトロでの悪性中皮腫培養細胞傷害分析及びウイルス複製分析
１．合胞体形成型ＨＳＶ−１変異体、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの分離
Ｖｅｒｏ細胞に、溶解型のプラークを形成するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲを感染させたところ、合胞体型プラークを形成する変異体ウイルスを見出し、これをＧＩＬＳＯＮ社製ピペットマンＰ２００のチップを用いて細胞ごと吸引分離し、１００μｌのコールドウイルスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に懸濁し、凍結保存した。

上記１００μｌの細胞懸濁液の全量を６．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６−ｗｅｌｌプレート）のＶｅｒｏ細胞に感染させ、４２時間後に観察した像が図２の感染実験（１）である。６−ｗｅｌｌプレート１−ｗｅｌｌ分の感染細胞から培養液を除去し、１．５ｍｌのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製無血清培地ＶＰ−ＳＦＭで細胞懸濁液を作製し、３０００回転５分間の遠心後の上清を２００００回転で４５分間の遠心し、その沈殿分画を２０μｌのコールドウイルスバッファーに懸濁し、−８０℃に凍結保存した。図２の感染実験（２）は、ＦＡＬＣＯＮ社製Ｔ１５０ボトルで培養したＶｅｒｏ細胞に感染実験（１）から得た細胞懸濁液６μｌを感染させた後、２４時間の像で、分離したウイルスが形成するすべてのプラークが合胞体型のプラークであることを確認し得た。

２．ヒト悪性中皮腫培養細胞の傷害分析
１％の熱不活性ＦＢＳ／ＰＢＳ中で、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１〜１．０ｐｆｕ／ｃｅｌｌで、６ウエル組織培養プレート中の悪性中皮腫細胞のサブコンフルエント単層培養にｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ及びｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを感染させた。かかる感染細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１％のＦＢＳと１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）を含む前記培地で培養した。感染の４８時間後、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク／ｗｅｌｌの数および面積を評価した。結果を図３に示す。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲは、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲに比べて、ヒト悪性中皮腫培養細胞に対しより強力な細胞傷害活性を示した（Ｘ−Ｇａｌ染色の青色はウイルスの増殖と細胞傷害の領域を示す）。

ＩＣＰ４タンパク質発現のイムノブロット分析のため、ヒト悪性中皮腫培養細胞およびヒト平滑筋肉腫培養細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１〜０．１となるようにｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲをそれぞれ感染させ、２２時間培養したのち細胞抽出液を回収した。同量のタンパク質を９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Bio-Rad社製）に移した。５％のスキムミルク（DIFCO Laboratories社製）を用いて、膜を室温で２時間ブロッキングし、その後、抗ＩＣＰ４抗体（Goodwin Institute for Cancer Research社製、希釈率１：５００）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。結果を図４に示す。悪性中皮腫細胞および平滑筋肉腫細胞でともにＭＯＩに応じて、ウイルスの増殖を示すＩＣＰ４タンパク質の発現が認められた。この結果から、本発明のウイルス変異体は中皮腫のみならず平滑筋肉腫などのカルポニン発現腫瘍にも作用して、これらの腫瘍を抑制しうることが示された。

３．ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲのガンシクロビル感受性を示すウイルス複製分析
２４ｗｅｌｌの培養プレートに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＳＫ−ＬＭＳ−１ヒト平滑筋肉腫培養細胞株を培養し、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ、ｄ１２．ＣＡＬＰ、ｈｒＲ３ウイルスをＭＯＩ０．０１で感染させた後、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭにガンシクロビルを種々の濃度に添加して２６時間培養した。１０％ホルマリンＰＢＳで細胞を固定した後、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク数を計測した。結果を図５に示す。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲは、ガンシクロビルに高感受性のＩＣＰ６欠失ＨＳＶ−１変異体ｈｒＲ３よりも高いガンシクロビル感受性を示すことから、安全性が高い。内在性のチミジンキナーゼ遺伝子を欠失するＨＳＶ−１変異体ｄ１２．ＣＡＬＰは全くガンシクロビル感受性がなかった。

Ｂ．インビボでの処理及び免疫組織化学的分析
１．ヒト悪性中皮腫細胞の皮下移植モデルに対するｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ３回腫瘍内投与による治療効果の検討
ヒト悪性中皮腫細胞にルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクションし、最も化学発光強度と増殖速度が高いクローンを選別した。クローン化した細胞中、ＳＣＩＤマウス背部皮下に定着したものから、中皮腫の４−５ｍｍ角の腫瘍塊を、６週齢の雌の重症複合型免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に移植した。腫瘍は、ＳＣＩＤマウスに移植後３０日で直径６から７ｍｍ程度（５０−７０ｍｍ^３）に成長した。１×１０^７ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを含む５０μｌ（マウス１匹あたり）のウイルス懸濁液（ｎ＝３）、あるいは同量のウイルスバッファー（ｎ＝３）を、３０Ｇの注射針を用いて腫瘍内に５日間隔で合計３回注入した。１回目のウイルス注入後１１日目に腹腔内にルシフェリン（Sigma Chemicals社製）を注入し、リアルタイムインビボイメージングシステム（Berthold社製）を用いて、背部皮下の腫瘍細胞からの化学発光（total photon count）を高感度ＣＣＤカメラで計測した。リアルタイムインビボイメージングの結果を図６に示す。対照（ウイルスバッファー注入腫瘍）はフォトカウント２．７９ｘ１０^７、治療群（ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ注入腫瘍）はフォトカウント３．８４ｘ１０^６で、治療群は対照の１３．７％にフォトカウントが減少した。これらの結果より、背部皮下に移植したヒト悪性中皮種細胞への直接注入により、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲは顕著な抗腫瘍効果を有することがわかった。

組織学的研究のため、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ注入後所定の時間に皮下腫瘍を取り出し、２％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒドを用いて、１ｍＭのＭｇＣｌ_２を含むＰＢＳで、４℃で一晩固定した。続いて、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、５ｍＭのＫ_３Ｆｅ（ＣＮ_６）、５ｍＭのＫ₄Ｆｅ（ＣＮ_６）及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２をＰＢＳ中に含む基質溶液に、該腫瘍を３７℃で３時間浸し、その後、３％のＤＭＳＯを含むＰＢＳで洗浄した。結果を図７に示す。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを注入した悪性中皮腫では、ウイルスの増殖を示すＬａｃＺ遺伝子の発現と顕著な抗腫瘍効果が認められた。

２．ヒト悪性中皮腫細胞の胸腔内移植モデルに対するｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの２回胸腔内投与による治療効果の検討
悪性中皮腫細胞（１×１０^７ｃｅｌｌｓ／マウス）を６週齢の雌のＳＣＩＤマウスの胸腔内に注入して、胸腔内悪性中皮腫モデルを作製した。ＳＣＩＤマウスに移植後２週目に１×１０^７ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲを含む５０μｌ（マウス１匹あたり）のウイルス懸濁液（ｎ＝３）あるいは同量のウィルスバッファー（ｎ＝３）、３０Ｇを用いて胸腔内に１週間隔で合計２回注入した。１回目の注入後１９日目に解剖し治療効果を評価した。結果を図８に示す。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲはＳＣＩＤマウス胸腔内に移植したヒト悪性中皮種細胞に対し顕著な抗腫瘍効果を示した。

３．ヒト腹膜悪性中皮腫のＳＣＩＤマウス腹腔内正所性移植モデルに対するｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲの３回腹腔内投与による治療効果の検討
ヒト腹膜悪性中皮腫培養細胞にホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子ｐＧＬ４．１３（Promega社製）を導入し、インビトロイメージング法を用いてルシフェラーゼ標識ヒト腹膜悪性中皮腫クローン細胞株を得た。この細胞株を用いてＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）においてルシフェラーゼ標識ヒト腹膜悪性中皮腫の腹腔内モデルを作製した。腫瘍腹腔内移植後６、２０、３２および３９日目にインビボイメージングを行った。ジエチルエーテル麻酔下で、ルシフェリン３．７５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。ルシフェリン腹腔内投与から３分後にネンブタール２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、１０分後にNightOWLs（Berthold社）を用いてイメージングを開始した。腫瘍腹腔内移植後２１、２７および３３日目に、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルスを腹腔内に直接投与した。ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルスをウイルスバッファーで１．０×１０^７ｐｆｕ／１００μＬに希釈したものをマウス１匹あたり１００μＬずつ腹腔内にジエチルエーテル麻酔下で投与した（ｎ＝５）。対照群にはウイルスバッファーを１匹あたり１００μＬずつ腹腔内に直接投与した（ｎ＝５）。

対照群では、１回目のウイルスバッファー投与後１１日目には腫瘍の増大に伴って発光強度が増大していた。一方、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルス投与群では、１回目のウイルス投与後１１日目と１８日目の発光強度は低下しており、ウイルス投与による明らかな抗腫瘍効果が認められた（図９）。ウイルス投与前後のフォトンカウントの変化を比較すると、ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルス投与群で有意に低下しており、ウイルスによる抗腫瘍効果が確認された（図１０）。なお、ウイルス投与前のコントロール群とｄ１２．ＣＡＬＰＤＲＲウイルス群のフォトンカウントに有意な差は認められなかった。また、腫瘍摘出直前のフォトンカウントは、コントロール群の方がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルス群に比べて１．９８倍高かった。また、摘出した腹腔内腫瘍の重量は対照群の方がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルス投与群に比べて２．１倍高かった。以上より、フォトンカウントはマウスの腹腔内腫瘍体積をよく反映していた。これらの結果より、本正所性移植モデルにおけるｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲウイルスによる治療効果が確認された。

本発明は、悪性中皮腫の治療薬の分野等に利用されうる。

Claims (22)

1. カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を含む、中皮腫の治療剤。
2. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、請求項１記載の治療剤。
3. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、請求項２記載の治療剤。
4. 中皮腫が悪性のものである、請求項１ないし３のいずれか１項記載の治療剤。
5. 患者から取り出された中皮腫細胞に、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプ変異体を感染させることを特徴とする、中皮腫治療用細胞の製造方法。
6. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、請求項５記載の方法。
7. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である請求項６記載の方法。
8. 中皮腫が悪性のものである、請求項５ないし７のいずれか１項記載の方法。
9. 請求項５ないし８のいずれか１項記載の方法により得ることのできる中皮腫治療用細胞。
10. カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法。
11. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、請求項１０記載の方法。
12. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、請求項１１記載の方法。
13. 中皮腫が悪性のものである、請求項１０ないし１２のいずれか１項記載の方法。
14. 請求項９記載の中皮腫治療用細胞を中皮腫患者に投与することを特徴とする、中皮腫の治療方法。
15. 中皮腫治療用の医薬の製造のための、カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体の使用。
16. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、請求項１５記載の使用。
17. 該変異体がｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、請求項１６記載の使用。
18. 中皮腫が悪性のものである、請求項１５ないし１７のいずれか１項記載の使用。
19. 中皮腫治療用の医薬の製造のための、請求項９記載の中皮腫治療用細胞の使用。
20. カルポニン遺伝子を標的に増殖する単純ヘルペスウイルスのＦタイプの変異体。
21. ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ株に由来するものである、請求項２０記載の変異体。
22. ｄ１２．ＣＡＬＰｆΔＲＲ株である、請求項２１記載の変異体。

Images