WO2008004691A1 - appareil pour concevoir des amorces d'amplification d'acides nucléiques, programme pour concevoir des amorces et appareil de serveur pour concevoir des amorces - Google Patents

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WO2008004691A1
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WO
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primer
sites
sequence
amplified
complementarity
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Application number
PCT/JP2007/063632
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Inventor
Yusuke Nakamura
Ryu Konoshita
Koretsugu Ogata
Original Assignee
Shimadzu Corporation
Riken
Toppan Printing Co., Ltd.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection

Definitions

  • the present invention relates to a primer for nucleic acid amplification, an apparatus for primer design, a primer design program, and a primer for design primer, and a server for design primer.
  • the present invention relates to a computing device, a program, and a server device for designing a primer to be used in a reaction for amplifying a necessary base sequence from ⁇ 53 ⁇ 4 ⁇ target nucleic acid.
  • Multiplex PCR Polymerase Chain Reaction
  • SP Single salt polymorphism
  • multiplex PCR is a useful technique for efficiently amplifying small amounts of DA extracted from blood and typing many SNPs.
  • the design of a primer used in multiplex PCR is performed as follows.
  • the primer is selected from the score indicating the bacterial temperature Tm of the primer, the GC content, the length of the base sequence, the specificity of the base sequence, the hairpin structure, and the difficulty of forming the primer dimer. To do.
  • the base sequence specificity, hairpin structure and primer The highest score indicating the ftii property of the primer calculated from the difficulty of forming dimers is called P Dahl, the second highest is called g3 ⁇ 4, P, 2 and the nth is called P 1n .
  • Non-Patent Document Promega Corporation, Performer: Douglas R. Stow, Ph. In D. (Douglas R. Storts, Ph.D.), rp
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-300894
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-99438 ⁇
  • Non-Patent Document 1 by Rachlin J, Ding C, Cantor G, and Kasif S, in the design of multiplex PCR assays for SNP genotyping Computational tradeoffs in multiplex PCR assay design for SNP genotyping x BMC Genomics, 25 July 2005, Volume 6, p. 102
  • Non-Patent Document 2 Promega Corporation, speaker: Douglas R. Storts, Ph. D. (Douglas R. Storts, Ph.D.), 20th International Biochemistry ⁇ Bioindustry Seminar ⁇ Quantitative multiplex amplification using PlexorTM qPCR and qRT-PCR System, June 23, 2006
  • Primers are usually set of two nucleic acids having different nucleotide sequences, for example, primer one P x is 2 It is expressed.
  • ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4pa (i, j) is expressed as a function for determining complementarity between base sequences i and j, in order to confirm the complementarity between primer ⁇ P X for target X and primer P y for target Y Needs to examine all primer combinations, ie, pa fexF, ⁇ , ⁇ ), pa ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ⁇ pa Cp ⁇ , ⁇ ⁇ and 1 ⁇ ⁇ 3 ( ⁇ , ⁇ ).
  • the complementarity score (ie, according to the above function) previously set upper limit value pa ⁇ calculated value). among the calculated value by the function obtained for the primer P "and primer P 21 (score complementarity), teeth If the displacement or force is exceeded, it means that ⁇ ,, or P 2 , must be replaced with the second ⁇ .
  • the first priority ⁇ (P
  • the first Complementarity scores are calculated for all combinations selected from the two, and the primer that produced a complementarity score exceeding pa ⁇ is removed from ⁇ .
  • the primer HS i is selected from the highest priority. Repeat the above operation to create primer candidate combinations for all targets. Make sure the score is below pa ⁇ .
  • the primer combinations obtained in this way are unlikely to form primer-dimers between primers of different targets, and can be used in multiplex PCR.
  • multiplex PCR is a useful technique for typing a large number of SNPs.
  • much of that success is due to the design of the primer used for amplification.
  • the above-described conventional technique checks the sequence of other primers at the time of primer 1510 to prevent simultaneous selection of primers having complementary sequences, thereby preventing the amplification reaction of the target nucleic acid. It is efficient.
  • the number of primers decreases as the reaction proceeds, and conversely, the number of nucleic acids increases. 3 ⁇ 4J is proportional to the power n of Ii2 when n is the number of cycles in the amplification reaction. Then, in the initial S g of the reaction, the number of amplified nuclei ⁇ ⁇ , which was not a problem because it was small, became a problem as the number increased. In other words, if the base sequence of the amplified nucleic acid is unintentionally the same as that of another primer, the primer and the amplified nucleic acid are bound to inhibit the amplification reaction. It will be. This will be described with a specific example. 0.
  • the 200bp molecular weight is calculated as 6.60X10.
  • a primer for amplifying another site "p 21F has a sequence complementary to x society unintentionally, so p 21F binds in the middle of x civilization As a result, it is shorter than the original amplification products x beginnerand [x injection], and other amplification products ⁇ , and [ ⁇ ,] (similarly, [ ⁇ trou'] is a sequence complementary to ⁇ dress'. In this case, the target amplification product cannot be obtained sufficiently, the probability that the two primers have unintentionally complementary sequences, the primer, and the amplification product. It must also be noted that there is a difference in the probability that a nucleic acid is unintentionally complementary. For example, the probability that a sequence complementary to a sequence from the 3 'end of the nucleus is included in the nuclear transversion sequence of size k [mer] is expressed by the following equation.
  • an object of the present invention is to provide an appropriate primer that does not generate an undesired nucleic acid fragment by binding to an unintentional location in a primer reaction.
  • the present inventors have found that the object of the present invention can be achieved by examining the complementarity between a primer for amplifying a specific site and an amplification product generated at a site other than the i-specific site.
  • the headline and the present invention were completed.
  • the present invention includes the following inventions. That is, the present invention relates to a primer 3 ⁇ 4i-10 apparatus (the following [1]
  • Primer for example, for the first amplification sites, ⁇ ", ⁇ 12, ⁇ ⁇ ⁇ , refers to, respectively its ⁇ 1 ⁇ . Similarly, for the m-th amplification sites, P m1. P ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ Refers to each of P.
  • the term “primer” means a pair of a fore primer and a reno primer unless otherwise specified.
  • P may be a primer pair of forward primer p vinegar F and lease primer p 11R .
  • primer HSffi group has a plurality of primers ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ,,, ⁇ 12 , ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 1 ⁇
  • the m-th amplification site XJ Primer HSffiP m ,, P ⁇ .
  • the amplification product is X ,,, [ ⁇ réelle], 1 ⁇ 2, [1 ⁇ 2], ⁇ ⁇ , ⁇ 1 ⁇ . [ ⁇ 1 ⁇ ].
  • [ ⁇ ⁇ ] indicates a nucleic acid complementary to ⁇ resort
  • [1 ⁇ 2] indicates a nucleic acid complementary to
  • [] indicates a nucleic acid complementary to
  • the amplification product group is a group consisting of a plurality of amplification products X ", [x supply], 1 ⁇ 2, [1 ⁇ 2], ⁇ ⁇ ⁇ , x ln , and [x ln ].
  • the m-th amplification site refers to a group consisting of a plurality of amplification products) g, [xj, [xj, ⁇ ,, and [xj].
  • the following [1] to [5] relate to the primer ⁇ 10 apparatus.
  • An apparatus for designing a series of primers for amplifying a plurality of sites in a nucleic acid
  • the sequences of the candidate primers for one of the two sites and the two By calculating and complementing the sequence of the previous ⁇ ⁇ ⁇ product sequence obtained at the other site,
  • a processing unit for determining a series of primers for amplifying the plurality of sites
  • (I I I) A primer group consisting of a plurality of MIS primers H ⁇ li, and a group of primers corresponding to each of a plurality of sites to be amplified,
  • An amplification product group consisting of a plurality of Ml ⁇ -wide products, and each of the plurality of MIB amplification products can be obtained by an amplification reaction using the candidate primer at each of the sites to be previously 15 ⁇ wide. Data of amplification products that can be created,
  • a storage unit for storing at least
  • the processing command input at the input unit (I) further includes a selection command B for selecting the primer group,
  • ⁇ 5 processing executed in the processing unit (II) is performed in response to the ilKl command B, and at least the sequence of the nucleic acid to be amplified, 1f ⁇ of the site to be amplified in the nucleic acid, and the primer ⁇ ⁇ ⁇ Further comprising selecting a ⁇ blima group based on the parameters;
  • the parameters of the primer B are as follows: msrn. GC content, base length, amplification product length, specificity of the base sequence to the target site, and complementarity or primer molecule between a pair of primer molecules for one site
  • the processing instruction input at the I5 input unit (I) further includes a calculation instruction C for calculating the previous 15 ⁇ width product,
  • the processing executed in the IB processing section (II) receives the self-calculation instruction C, and at least from the nucleic acid sequence to be amplified and the sequence of! SB primer at each of the plurality of sites to be amplified by amplification ⁇ . Further including calculating the amplification product that can be obtained,
  • II I In the I5 storage unit (I I I), at least a nucleic acid sequence to be amplified by IB is further added.
  • the primer isi ten device.
  • the above [4] is particularly directed to a mode in which the primer system of the present invention also calculates an amplification product from the primer H ⁇ .
  • the processing command input at the ⁇ input unit (I) further includes a calculation command D for calculating the complementarity between the B primers,
  • the processing executed in the it processing unit (II) receives the calculation command D, and when IB arbitrarily selects two parts from a plurality of parts to be amplified, one of two parts of IB
  • the method further includes calculating the complementarity between the sequence of the primer ⁇ ⁇ ⁇ for the site and the sequence of the primer HSffi for the other of the two sites.
  • a primer design program for causing a computer to perform a process of determining a series of primers for amplifying a plurality of sequences in a nucleic acid
  • a primer group consisting of a plurality of primers, and data of a primer group corresponding to each of a plurality of sites to be amplified
  • An amplification product group consisting of a plurality of amplification products, wherein each of the plurality of amplification products can be obtained by an amplification reaction using the primer candidate at each site to be amplified by ffilB.
  • a calculation instruction A for calculating the complementarity between the B primer and the width product, IB when selecting two sites from a plurality of sites to be amplified, one of the two sites is selected.
  • the sequence of the primer HS i for the site of A series of primers for amplifying the plurality of sites is obtained by performing a process including calculating and scoring the complementarity with the sequence of the 53 ⁇ 4 wide product obtained at the other site.
  • «Primer design program that allows a computer to perform processing to determine from multiple primer groups.
  • the above [6] assumes that when a primer for amplifying a plurality of nucleic acid sites is used by a computer, the process of complementing the primer and the amplification product is performed.
  • the primer is the ISI program.
  • the program includes a program that can be executed directly by a computer and a program that can be executed by installing it on a hard disk or the like.
  • selection instruction B to select the I5 primer HS * i group at least the sequence of the nucleic acid to be amplified, 1f3 ⁇ 4 of the site to be amplified in the MB nucleic acid, and the primer ⁇ 10 parameter, the iiB primer [6]
  • Primer 3 ⁇ 4 10 parameters are ascending, GC content, base length, amplification product length, specificity of the base sequence to the target site, and complementarity or primer between a pair of primer molecules for one site
  • B By receiving a calculation instruction C for calculating ⁇ ⁇ product, B can be obtained by amplification reaction from at least the nucleic acid sequence to be amplified and the sequence of the above-mentioned primer HS at each of a plurality of sites to be amplified.
  • a receiving unit for receiving a processing command including a calculation command A for calculating the complementarity between the primer candidate and the amplification product
  • the sequence of the primer for one of the two sites and the other of the two sites are obtained.
  • a processing unit for determining a series of primers for amplifying a plurality of MB sites from the plurality of Blimmer candidate groups
  • a group of amplification products composed of a plurality of amplification products each of the plurality of amplification products can be obtained by an amplification reaction using a primer HS3 ⁇ 4 at each of the sites to be tested.
  • VI I I a transmission unit for transmitting the iiB-series of primers determined by the reading processing unit to another computer;
  • the device accesses a primer for amplifying a plurality of sites of nucleic acid via a network when a computer in which the primer program of the IB * invention is not introduced is used.
  • It is a server device that is a primer iSIH-bar device that performs processing to verify the complementarity between the primer HSffi and the amplification product. Real light
  • the term “other computers via the network” includes terminals and other server devices.
  • the processing command received by the receiving unit (V) further includes a selection command B for selecting the WIB primer HSffi group,
  • the liiia process executed in the IB processing unit (VI) receives the extraction instruction B, and at least the sequence of the nucleic acid to be amplified, information on the site to be amplified in the nucleic acid, and the primer 3 ⁇ 4
  • ⁇ storage unit (VI I) at least the sequence of the nucleic acid to be ffilBl ⁇ g, the site to be amplified in fliB nucleic acid ⁇ f3 ⁇ 4, and ⁇ primer 3 ⁇ 4
  • IS primer! 51 + 10 parameters include m ⁇ .GC content, base length, amplification product length, specificity of base sequence to target site, and complementarity between primer molecules of primer pair for one site or
  • the processing command received at the receiving unit (V) further includes a calculation command C for calculating the iiBlg width product
  • the processing executed in the processing section (VI) is obtained by amplification from at least the nucleic acid sequence to be amplified and the sequence of primer i3 ⁇ 4S in each of a plurality of sites to be amplified in response to a calculation command C. Further comprising calculating an amplification product capable of
  • ⁇ storage unit (VI I) at least a nucleic acid sequence to be subjected to at least the above-mentioned width is further provided, [1
  • the above [14] is particularly directed to a form in which the primer 1 / displacement of the present invention performs a process of calculating an amplification product from the primer.
  • the ⁇ processing command received by the ⁇ receiving unit (V) further includes a calculation command D for calculating the complementarity between the primers HSffi,
  • the ilB processing executed in response to the self-calculation instruction D is as follows:
  • the method further comprises calculating complementarity between the sequence of the primer HSIf for one of the sites and the sequence of the primer HSIi for the other of the two sites. [1 1] to [1 4]
  • the primer iSlttl "— / destruction described in the above [1 5], in particular, the primer lSi ⁇ "»" —no arrangement of the present invention is used to verify the complementarity between primers.
  • the primer in the nuclear reaction, can be used as an appropriate primer without causing the primer to be unintentionally bound to an undesired nucleic acid fragment.
  • Primer design program and primer — / arrangement can be provided.
  • the primer obtained by the present invention is not only complementary to the sequence of primers, but also complementarity of the sequence of the nucleic acid obtained by the amplification reaction and the sequence of the primer, and is complementary in the reaction solution. Considered to be high and no combination. For this reason, it is possible to obtain a desired amplification product efficiently.
  • Fig. 6 is a diagram showing 3 ⁇ 4 ⁇ to be taken into consideration by using the main translation and applying the primer ⁇ ⁇ .
  • Fig. 7 The main primer "is a primer using the isi program"
  • Figure 13 shows part of the information contained in the output file as a result of calculation of complementarity between primers and amplification products.
  • Figure 141 USS ⁇ J shows the result of PCR using IS! Primer, and shows the result: iCR3 ⁇ 4 ⁇ .
  • the primer 3 ⁇ 410 apparatus, primer design program, and primer istHi "-bar apparatus of the present invention are characterized by calculating the complementarity between the primer ⁇ and the amplification product.
  • the Blimmer TM device of the present invention is a device for designing a series of primers for amplifying a plurality of sites in a nucleic acid, and comprises an input unit (1), a processing unit (II), a storage unit (III ). And output section
  • FIG. 3 is a block diagram showing the overall configuration of the primer apparatus of the present invention.
  • the input unit (I) is for inputting processing instructions and the like.
  • a reprimer required for 1/10, a 1f3 ⁇ 4 of a primer group, a 1f3 ⁇ 4 of an amplification product group, or the like may be input.
  • ) at least processes a processing command. This is the interface to give to.
  • the input unit (I) includes a keyboard / mouse and other interfaces / interfaces with other programs such as interface circuits and interface programs, and interfaces with other computers.
  • the processing instruction includes at least a calculation instruction A for performing processing for calculating the complementarity between the primer HSffi and the amplification product, and causes the processing unit (II) described later to execute the processing.
  • processing instructions include a selection instruction B for performing a process for selecting a primer group, a calculation instruction C for performing a process for calculating an amplification product, and the complementarity between candidate primers. And further includes a calculation instruction D for performing the processing, which causes the processing unit (II) described later to execute the processing.
  • the processing unit (I I) refers to a processing instruction, that is, one that executes at least the calculation instruction A, and includes C PU and the like.
  • the processing unit (I I) receives the calculation instruction A and calculates the complementarity between the amplification product and the primer.
  • the processing unit (II) When calculating the complementarity between the amplification product and primer H ⁇ , when two sites are arbitrarily selected from a plurality of sites to be amplified, the primer sequence for one of the two sites and the other Complementarity with the sequence of the amplification product at the site is calculated.
  • the processing unit (II) also receives a selection command B as a processing command, and separately selects a plurality of sites to be amplified. Processing to select the primer Hg3 ⁇ 4 can be performed.
  • the processing unit (II) When processing for obtaining the sequence of the amplification product is also performed using the primer arrangement of the present invention, the processing unit (II) also receives a calculation command C as a processing command, and all the primers included in the primer group for all the sites to be amplified. A process for obtaining the sequence of the amplification product generated by the candidate can be performed.
  • the processing unit (II) When the processing for calculating complementarity between the candidate blimmers is also performed by the Blimmer device of the present invention, the processing unit (II) also receives a calculation command D as a processing command, and 2 When one site is selected arbitrarily, it is possible to perform a process of calculating the complementarity between two site candidate blima. This allows the optimal set of primers to amplify multiple sites to be determined from the primer group. 1-3. Memory>
  • the storage unit (III) contains the primer group data, the product group data, the complementation calculation result calculated by the processing unit (II), and the optimal series of probing data determined by the processing unit (II). This is used to store the data of the rider, and includes main storage devices such as RAM and auxiliary storage devices such as hard disks.
  • the data to be memorized ⁇ If ⁇ may be read from an external database or the like, or may be obtained by the primer of the present invention. When read from an external database, the data to be stored may be read from a removable medium such as a CD-ROM via a drive, or from a server computer via a network. May be downloaded
  • a primer group in this specification.
  • the data of the primer HS3 ⁇ 4 group refers to data on a plurality of primers HSIi per site to be amplified.
  • the primer contains the above-mentioned primer 3 ⁇ 410 parameter. Based on the primer ⁇ 10 1 ⁇ , each site to be amplified can be selected separately.
  • the data of the primer HSffi group includes at least a plurality of primer complements for each site to be amplified, and can further include ⁇ t3 ⁇ 4 of the priority order of each primer HSf.
  • 1f3 ⁇ 4 of the primer H3 ⁇ 4M includes at least the primer arrangement, and can further include 1f3 ⁇ 4 of the size of the primer 1.
  • a priority order that more preferably satisfies the above-mentioned primer ten parameters can be set to a higher priority order.
  • the data of the amplification product group may include at least 1f3 ⁇ 4 of a plurality of amplification products per site to be amplified, and may further include a priority order of the primers Hl3 ⁇ 4i corresponding to the amplification products.
  • the product of the amplification product includes at least the sequence 1f3 ⁇ 4 of the amplification product, and can further include the size of the sequence of the amplification product.
  • the amplification product means an amplification product that is theoretically generated when the primer HS i is used for the amplification reaction. Complementary results)
  • any result may be used as long as it includes a score capable of evaluating complementarity.
  • the method of taking the score can be appropriately determined by those skilled in the art, and is not particularly limited. For example, the length of the base that matches in the sequence between the nucleic acids to be compared, or the sequence between the nucleic acids to be compared The amount corresponding to the proportion of bases matched in can be scored.
  • a score by local alignment based on complementarity (hereinafter sometimes referred to as “score”) and the length of the sequence subjected to alignment (hereinafter sometimes referred to as “length”) (Hereinafter, sometimes referred to as ratio), in other words, the value obtained by dividing score by length is particularly preferably used as an index for complementarity evaluation (complementarity index).
  • complementarity index a larger length and a smaller score indicate a lower complementarity. Therefore, the ratio shown as the ratio of score to length indicates that the smaller the value, the lower the complementarity of the two sequences of interest.
  • the ratio value which is the preferred complementation score of the present invention, is a value calculated by calculating the complementarity between the primer HSif and the amplification product, in particular, amplification of multiple sites using the primer H3 ⁇ 4i is actually performed.
  • the present inventors have found that there is a good correlation with the amount of amplification product generated when the above is performed, and this is a highly reliable value.
  • the primer having the best complementation evaluation in the primer HS3 ⁇ 4 group is the primer with ftil. As determined.
  • a series of data of a primer is data on the set of primers Hlffi as described above, which is determined from all the sites to be amplified, and includes at least sequence information.
  • the storage unit (I I I) may include the following information in addition to the above data.
  • the difficulty of the site to be amplified includes at least the position shift of the site to be amplified, and may further include the sequence of the site to be amplified and the size of the sequence.
  • the primer isi parameter may be included, which is a parameter that the primer should satisfy in the limit.
  • Primer 1SI 10 parameters include SJt, GC content, base length, amplification product length, specificity of the base sequence to the target site, and complementarity between a pair of primer molecules for one site (ie primer It is a parameter that indicates the ease of dimer formation) or complementarity within the primer molecule (ie, the hairpin structure formation). Also, the priority of these parameters may be included. Furthermore, all combinations ⁇ f3 ⁇ 4 for selecting two from the sites to be amplified may be included. For the two sites combined in each combination, the processing unit (II) calculates the complementarity between the primer H3 ⁇ 4 «for amplifying one site and the amplification product that can be generated at the other site. It can be broken.
  • calculation of complementarity between the primer HSffi for one part and the primer for the other part may be performed by the processing unit (II).
  • the storage unit (III) may include flag information for identifying the primer ⁇ ) ⁇ while the calculation in the processing unit (II) is performed.
  • Each of the above-mentioned data lf3 ⁇ 4 may be stored in the storage unit (M i), for example, in an arrangement as shown in FIG.
  • the output section (IV) is for outputting at least the optimum series of determined primers, and includes a display.
  • Optimal primer output forms include the output of the primer array itself and the output of a data file containing the primer sequences. Output is a concept that includes not only displaying and printing, but also giving data to other programs and devices.
  • primer HgM group data can include the priority order of each primer, along with the array 1f3 ⁇ 4 of a plurality of primer HSMs.
  • the amplification product group data can include 1 t3 ⁇ 4 of the amplification product sequence and 1 ⁇ of the priority order of the primer corresponding to the amplification product.
  • the primer HS3 ⁇ 4 group data and the amplification product group data stored in the storage unit (III) are sent to the processing unit (II), and primer conversion is performed. And the complementarity between amplification products is calculated. Complementary calculation results are stored in the storage unit (III).
  • the process of calculating complementarity between Blima HSffi can be performed.
  • the selection unit ⁇ ⁇ ⁇ is also received as a processing command from the input unit (I), so that the processing unit (II) ) Call up at least the sequence of the nucleic acid to be amplified, the 1f3 ⁇ 4 of the site to be amplified in the IB nucleic acid, and the primer ⁇ parameter, and select multiple primer HSIs separately for each of the multiple sites to be amplified Processing can be performed.
  • the data of the selected primer is stored in the storage unit (III).
  • the processing unit (II) calls at least the nucleic acid sequence to be amplified and the primer HSIf sequence from the storage unit (III) to calculate the amplification product.
  • the power to do The obtained amplification product data is stored in the storage section (III).
  • the processing unit (II) receives the calculation command D as a processing command from the input unit (I), so that the processing unit (II) From III), at least 1 ⁇ of the primer HS3 ⁇ 4 can be called to calculate the complementarity between the primers HSi. Complementary calculation results are stored in the storage unit (III).
  • the processing section (II) when calculation of the complementation between the primer HSffi and the amplification product is completed, completes the processing for the primer 3 ⁇ 410, and the primers with the highest priority at each amplification site, It can be determined as an optimal set of primers.
  • the calculated complementation result and the determined series of primer data are stored in the storage unit (III).
  • the data of a series of primers stored in the storage unit (111) is output to the output unit (IV).
  • the primer apparatus When the processing unit in FIG. 3 is realized by using an arithmetic processing CPU CPU, the primer apparatus according to the present invention is realized as a normal computer.
  • a keyboard is used as an input unit, a display force ⁇ an output unit, a main device 1f3 ⁇ 4 device such as a RAM, and an auxiliary device 113 ⁇ 4 device such as a hard disk.
  • the hardware configuration of the primer 10 of the present invention is shown in FIG.
  • the CPU 1 includes a RAM 2, a keyboard 3, a display 4, and a hard disk 5.
  • the memory disk has areas such as a primer design program storage unit 6, a data storage unit 7, and an operating system (OS) storage unit 8, which store a primer design program, data, and OS, respectively.
  • OS operating system
  • each of the data ⁇ information listed in the memory section above is listed in the data memory section 7 in FIG. More specifically, for example, as shown in FIG. 5, the data storage unit selects a region 11 and a combination of selecting two sites from the amplification sites for each of the plurality of amplification sites. The following region 12 can be provided.
  • Each of the information regions 11 about the amplification site can have a region 13 of the sequence 1f3 ⁇ 4 to be an amplification target and a region 14 of the primer HSiilt ⁇ that can amplify the amplification target.
  • the region 13 can have a region having difficulty in base sequence serving as an amplification target, and a region having a size 1f3 ⁇ 4 of the sequence serving as the amplification target.
  • Each of the regions 14 is a region of a candidate for a primer on the forward side (hereinafter referred to as a forward primer) and a candidate for a primer on the reverse side (hereinafter referred to as a reverse primer). 18 and a region 19 of 1f3 ⁇ 4 of the amplification product that can be generated by the primer.
  • the area 18 includes a region of sequence information of the forward primer, a region of difficult sequence of the reverse primer, a region of difficult position of the forward primer, a region of position of the reverse primer, and a region of size information of the sequence of the forward primer. , And reverse primer sequences can be difficult.
  • the region 19 can have a region where the amplification product can be difficult to sequence by a primer and a region whose size of the amplification product is small.
  • the combination difficulty region 1 2 for selecting two sites from the amplification sites is the M1f3 ⁇ 4 region 15 of the combined region, the 1 ⁇ region 16 of the priority change flag in the region, and the complementary in the combination It can have a region 17 of sex calculation results.
  • the region 17 includes a region 21 for calculating the complementarity between the primer and the amplification product at the combined site, and a region 20 for the calculated complementation of the primer at the combined site. Can have.
  • the Blimmer design program is a program for causing a computer to perform a process of determining a series of primers for amplifying a plurality of sequences in a nucleic acid.
  • the primer design program of the present invention is preferably used after being introduced into the primer apparatus and primer apparatus of the present invention.
  • the primer design program of the present invention measures the complementarity between the primer candidate and the amplification product.
  • the data of the primer HS3 ⁇ 4 group and the data of the amplification product group are given. Details and other lf3 ⁇ 4 'data that can be given are as described above in 1-3. Storage section of the overall configuration of the primer ist.
  • Complementarity between the primer and amplification product is calculated by receiving calculation instruction A. Specifically, when two parts are arbitrarily selected from a plurality of parts to be amplified by receiving calculation instruction A, the sequence of primer H ⁇ i for one of the two parts, and 2 A process of calculating complementarity with the sequence of the amplification product obtained at the other of the two sites is performed.
  • the calculation result that is, the calculated complementation score
  • the priority of the primer HSffi Rewritten if the calculation result (that is, the calculated complementation score) does not satisfy the predetermined complementarity score.
  • Complementarity calculation can be repeated while rewriting the priority of primer H ⁇ a so that the complementarity score condition is satisfied in all combinations of primer H ⁇ S and amplification product.
  • a process for selecting the blima HSffi and a process for obtaining the amplification product can be performed.
  • the process for calculating the complementarity between the primer H3 ⁇ 4 and the amplification product may be appropriately performed together with other processes for verifying the complementarity between the nucleic acid species in the amplification reaction solution.
  • a calculation process for complementation between the primer HSf and the amplification product and a calculation process for complementation between primers may be performed.
  • either the calculation process of the complementarity between the primer H ⁇ f and the amplification product or the calculation process of the complementarity between the primers H3 ⁇ 4S may be performed first.
  • the process of selecting the primer HgiS is performed by receiving selection command B. Specifically, upon receiving the selection instruction B, the primer is based on at least the sequence of the nucleic acid to be amplified, the difficulty of the site to be amplified in the 1B nucleic acid, and the primer parameters. A group is elected.
  • the process of obtaining the amplification product is performed by receiving calculation instruction C.
  • the amplification product that can be obtained by amplification reaction from at least the nucleic acid sequence to be amplified and the sequence of the MIS primer H ⁇ ffi at each of a plurality of sites to be amplified by receiving the calculation instruction C. Is calculated.
  • Computation of complementarity between candidate candidates is performed by receiving calculation instruction D. Specifically, when two sites are arbitrarily selected from a plurality of sites to be amplified by receiving calculation instruction D, the sequence of primer Hgffi for one of the two sites and two sites Complementarity with the candidate sequencer for the other site is calculated.
  • the primers with the highest priority at each amplification site can be determined as a series of * 1 primers.
  • FIG. 6 the program of the present invention will be described with reference to a flowchart showing an example of the primer method using the program of the present invention.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of a primer method using the program of the present invention.
  • Flowchart 1 includes an input process S 11, a primer Hgffi selection process S 12, a complementarity calculation process S 1 3 between primers, a complementation calculation process S 1 5 between a primer and an amplification product, and an output process Including S 1 7.
  • S11 the sequence of the nucleic acid to be amplified, the difficulty of the site to be amplified, and the ply Ma IS!
  • Ten parameter power ⁇ input As shown in FIG. 6, it is assumed that m amplification sites (target ⁇ ,, X 2 , ⁇ ⁇ ) ⁇ ⁇ are amplified.
  • calculation instruction A calculation instruction A, selection instruction B, calculation instruction C, and calculation instruction D are input.
  • selection instruction B in response to selection instruction B, a primer is separately selected for each of the m amplification sites (target X 2 , ⁇ ,,) from the DA base sequence to be amplified.
  • the k-th primer Ht for the m-th target is P m1 , P rt , ⁇ ⁇ .
  • S 1, 3—S 14 receives calculation instruction D and checks whether primers at different targets have complementary nucleotide sequences at unintended locations.
  • the amplification product that can be generated by the amplification reaction using the primer candidate and the primer H3 ⁇ 4lt are complementary to each other in an unintended location. Do not have, find out.
  • the score indicating the complementarity of the sequences of the first primer Hgffi is calculated for all combinations that select two sites from the amplification part ⁇ iX ,, X 2 ,. To do. In other words, the first primer of each target primer H3 ⁇ 4lt.
  • a score indicating the complementarity of the sequence is calculated.
  • the amplification unit ⁇ ,, ⁇ 2, ⁇ ⁇ ⁇ , from X, and in combination of selecting the chi 2 when examining the complementarity between primers ⁇ f, pa (p 11F, p 21F ).
  • pa (p l1F , p 21R ), pa (p réelle R , p 21F ), and LfJpa ⁇ iR, p 21R ) are calculated to calculate the complementarity score.
  • 3 ⁇ 4pa (i, j) is expressed as a function for determining the complementarity between the base sequences i and j.
  • the complementarity score upper limit pa ⁇ is determined in advance. If the calculated value exceeds the upper limit, the priority is rewritten by replacing the primer candidate with the second ⁇ . Then, for the replaced, the complementation score is calculated, verified, and the priority of the primer H3 ⁇ 4 i is rewritten according to ⁇ in the same manner as described above. In this way, the calculation of the complementarity score and the rewriting of the priority order of the primer complement are repeated.
  • step S 14 it is determined whether all the combinations of amplification sites satisfy the condition that is less than or equal to the calculated value of the complementation score. If the 13 ⁇ 43 ⁇ 4 case is satisfied (Y es), the process proceeds to step S 15. If the condition is not satisfied (N o), return to S 1 2. In this case, in the selection of the primer HS i of S 1 2, select a primer ⁇ having a lower priority, select a primer H3 ⁇ 43 ⁇ 4 by changing the condition of the primer 3 ⁇ 4
  • each score is calculated to indicate the complementarity with the amplification product generated by the first primer candidate at the site
  • the score is first generated when the selected primer candidate is used in the nucleic acid amplification reaction.
  • the method for calculating the amplification product is not particularly limited, and is appropriately determined by those skilled in the art, for example, obtaining the amplification product from the nucleic acid sequence to be amplified and the position of the site to be amplified.
  • the complementation score is calculated, for example, m amplification units ⁇ 4 ⁇ ,, X 2 , ⁇ ⁇ ⁇ , to X, and X 2
  • the complementation score is calculated for the next combination of nucleic acid species.
  • sequence of the amplification product generated by the nucleic acid amplification reaction from the first primer ⁇ ⁇ ,,, (forward primer ⁇ P réelle f and reverse primer p 11R ) of target X is represented by x gag and [xschreib]
  • ⁇ 21 and [ ⁇ 21 ] are the sequences of amplification products generated from the first primer complement P 21 (forward primer p 21F and reverse primer ⁇ P 2 m) of target X 2 by the nuclear width reaction.
  • the score indicating complementation is calculated by pa (p, ) F , x 21 ), pa (p réelle F , [x 21 ]), pa ( p 11R , x 21 ), and l pa (p 11R , [x 2 ⁇ ]).
  • the calculation of the score indicating complementarity is pa (p 21F , x supplement), pa (p 21F , [ ⁇ chronological]) 3 ⁇ 4 pa (p 21R , ⁇ "), and U3 ⁇ 4) a (p 21R , [ ⁇ subject]) can be calculated.
  • the complementarity score between the amplification product and the primer HgM That is, the upper limit value pa ⁇ roduot of the calculated value by the above function is determined, and the calculated value by the above function indicating the complementarity between the amplification product and the primer is
  • the priority order is rewritten by replacing the primer HSii or the width product with the second letter. For the replaced, the complementation score is calculated, verified, and the priority is rewritten as necessary. In this way, the calculation of the complementarity score and the rewriting of the priority order are repeated.
  • the calculated complementation scores for all amplification site combinations are to decide. If the condition is satisfied (Y es), the process proceeds to S 17. If the conditions are not met (N o), return to S 1 2 . In this case, the method of selecting the primer HS in S 12 is changed, and steps S 12 to S 16 are performed until the conditions in S 16 are satisfied.
  • the score of the combination of candidate primers is less than or equal to pa ⁇ for all amplification sites, and the score of the combination of the candidate primer and the generated nucleic acid is FtJS primer is determined, and in S 17, the ftig primer is output. 4 1 2.
  • FIG. 8 is a flowchart showing another example of the primer design method using the program of the present invention. Another example of a flowchart is shown.
  • Flowchart 2 includes an input step S 2 01, a soot product step S 2 0 2, a complementarity step between primers S 2 0 7, a complementation step between primer and amplification product S 2 0 8, And an output step S 2 1 3.
  • the process for determining whether the complementarity score condition is satisfied and the process for rewriting the priority order of the primer after the complementarity calculation is described in more detail.
  • Other processes such as complementarity calculation are the same as those in the flowchart 1 above.
  • the sequence of the nucleic acid to be amplified, information on the site to be increased, and primer H ⁇ data are input.
  • the input can be performed in the file format in which the data is added.
  • m amplification sites target X 2 ,... ⁇
  • the wrinkles of the sites to be amplified are as shown in Fig. 5 above.
  • Primer data shows these amplification sites
  • calculation instruction ⁇ calculation instruction C
  • calculation instruction D calculation instruction D
  • S 202 upon receiving a calculation instruction C, an amplification product is calculated from the nucleic acid sequence to be amplified and the difficulty of the site to be amplified.
  • the calculated amplification product data is shown in FIG. 5 in the region 19 of the amplification product 1f3 ⁇ 4 in the region 14 of the primer HS 1f3 ⁇ 4.
  • the upper limit value of the complementation score between the primer candidates and the upper limit value of the complementation score between the primer HSii and the amplification product are set.
  • the user may input the upper limit value, but in this example, a value may be written in advance.
  • all the primer change flags in each candidate primer are set to TRUE.
  • the candidate primer whose flag is RUE, after branching of S206, which will be described later, performs calculation of the complementary score between the candidate primers and the complementary score between the primer H3 ⁇ 4f and the amplification product. In the first state, since all the primer candidates are calculated, all flags are set to TRUE as an initial state.
  • S205 calculation of complementation score between primer candidates and calculation between primer HSi and amplification product are executed for all combinations that select two sites from amplification sites in the subsequent process. Order. For example, as shown in FIG. 5, the combination 1 in the combination 12 area 12 is performed in S206 to S209, and the combination 2 is processed in S206 to S209. For these combinations, the processes of S206 to S209 are repeated. Note that this calculation is performed for the blister HSt that is flagged as TRUE and the amplification products that can be generated by it. In S 206, it is determined whether or not the primer change flag power is RUE. here, Primer HSIS change flag has not been calculated yet.
  • TRUE TRUE for the primer in the amplification site combination and liFALSE for the primer in the already calculated amplification site combination.
  • the flag 1f3 ⁇ 4 is stored in the fg change flag area 16 in the combination information area 12 shown in FIG. If primer ⁇ change flag force ⁇ RUE, the complementarity is calculated for the combination of the parts. If the primer change flag force is FALSE, the calculation target part is moved to the next part combination without repeating the same calculation for that part combination.
  • the complementarity score between the primers H ⁇ ffi is calculated.
  • the calculation result is stored in the region 20 of the calculation result of complementarity between the primer candidates in the region 17 of the complementation calculation result shown in FIG.
  • the calculation result of pa (p 11F , p 21F ) is 1 ⁇ Forward x 2 "Forward, the calculation result of pa (p llF , p 21R ) is 1" Forward x 2 "everse, pa (p 1tR , p 2 , F ) is 1 ⁇ Reverse x 2 ⁇ Forward, pa (p ] 1R , p 21R ) is
  • the complementation score between the primer and the amplified product is calculated.
  • the calculation result is stored in the region 21 of the calculation result of the complementarity between the candidate primer and the amplification product in the region 17 of the complementation calculation result shown in FIG.
  • the calculation result of pa (p 1F , x 21 ) and D3 ⁇ 4) a (p 11F , [x 2 ,]) is forward x 2-Product
  • a (p, 1R , [x 21 ]) are calculated as 1 "everse x 2" Product
  • a (p 21F , [x soil ]) Is 2-Forward x 1 -Product.
  • the primer Hg3 ⁇ 4 change flag in the combination already calculated in S 2 0 7 and S 2 0 8 is changed to FALSE.
  • the calculation value of the complementation score obtained in S 2 0 7 or S 2 0 8 exceeds the upper limit set in S 2 0 3, and S 2 0 Branches when the calculated value of the complementarity score obtained in 7 and S 2 0 8 does not exceed the upper limit set in S 2 0 3 above. If the calculated value exceeds the upper limit, go to S 2 1 1, otherwise go to S 2 1 3.
  • the calculation results of S 2 0 7 and S 2 0 8 are less than the upper limit value of the complementarity score set in S 2 0 3 for all combinations selected from the two amplification sites.
  • the primer that satisfies the above conditions and has the highest priority can be determined and output as the primer used in the amplification reaction. At this time, for example, the output can be performed in a file format in which the determined primer sequence power is included.
  • Primer of the present invention iSitii "-no-displacement is a primer for amplifying multiple sites of nucleic acid Is a device that can communicate over a network when it is used by another computer, and performs processing to verify the complementarity between the primer HSffi and the amplification product. It is the first place.
  • Other computers via the network include devices and other server devices. Examples of networks include the Internet and LAN.
  • the server device of the present invention includes a receiving unit (V) for communication, a transmitting unit (VI 11), and a processing unit (VI) and a storage unit (VII) in the same manner as the primer unit 10 of the above IB * invention.
  • FIG. 9 shows an example of a system using the primer 3 ⁇ 4 ⁇ »-bar according to an embodiment of the present invention.
  • the semiconductor device 30 and the devices 31, 32, 33 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ force, ', Connected via the Internet, the server / device 30 is recorded with the primer 3 ⁇ 4
  • a browsing program for browsing web sites is recorded in '.
  • Terminal devices 3 1, 32, 33 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ can access the server device 30 and perform a primer fgf Terminals 31, 32 and 33 have the same hardware configuration as the primer unit 10 of the present invention except that they have a receiving unit and a transmitting unit for communication.
  • the memory unit of the primer HI "-/ destruction of the present invention is a user or The each group to which the user belongs, are provided a series of data area as shown in ia Figure 5. These areas are MSIJed by user identifiers and groove identifiers, respectively.
  • Figure 10 shows an example of the method of using the Blimmer Mercer /, 5! ⁇ ⁇ It is a flowchart.
  • primer processing is performed in S 3 0 5.
  • the processing performed in S 3 0 5 is as shown in FIG. 7 and FIG.
  • the server device of the present invention waits until a connection request is made from the client to the server in S 3 0 1.
  • the input screen is transmitted to the client.
  • the server of the present invention has the function of an awakening server and is transmitted in HTML format by TCP / IP.
  • the client side displays the input screen with a web browser and performs the following inputs.
  • it waits for the information power ⁇ input necessary for the design of the primer from the client.
  • the client side for example, inputs the base sequence in the most common FASTA format.
  • S 3 0 it is determined whether the input information is correct. If the input is correct (YES), go to S 3 0 5, and if wrong (No), go to S 3 0 9. In S3 09, a screen indicating that the input is incorrect is sent to the client.
  • S 3 06 it is determined whether or not the primer 151 ⁇ is successful. If the prior design is successful (YES), proceed to S 3 0 7, if (No) proceed to S 3 1 0. In S 3 1 0, a screen indicating that 1SI 10 has failed is sent to the client.
  • primer is sometimes simply referred to as “primer”.
  • primers for multiplex PCR were added using the primer design program of the present invention. Multiplex PCR was actually performed using each of the primer judged most preferable by the program of the present invention and a primer having a lower priority. Then, under the condition that the primers did not bind to each other by mistake, the ability of the PCR product to bind to other primers was verified to affect the efficiency of PCR. The verification was performed in a multiplex PCR system that amplifies two single nucleotide polymorphism (S P) sites. The outline from primer 1510 to verification is as follows.
  • primers were selected independently using single PCR primer design software.
  • the base sequence "NT_022184” was obtained from the SNP database. Two SNPs contained in this nucleotide sequence were used as amplification targets. The “refSNP ID” of these SNPs is “rs3770799” and “rs3770797”, respectively. In this example, only the 20 kbp nucleotide sequence was extracted from the nucleotide sequence “NT-0222184” and input to the primer design software. As primer 1510 software, use the single PCR primer design software "pr imer 3" (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3—code.html). Shit.
  • One candidate was selected from each of the above, and a score indicating complementarity at the 3 'end between the primers (a 3' end oral calorie score) was calculated.
  • Figure 12 shows a part of the information included in the output file as a result of calculation of complementarity between primers.
  • primer P 1A forward bra one more "[rho, '& reverse primer one” p, w ") for the primers P a (forward plies Ma one for X 2 " P2AF "& Reverse Primer "PMR") Indicates the part of the character string written about the calculation result of complementarity.
  • the 1 ⁇ indicates the two primer sequences for calculating the alignment score 4 1, 3 'end ⁇ f3 ⁇ 44 2 indicating local low force realignment score, local alignment score 4 3, length of alignment target sequence 4 4, and location of bases matching two sequences Including information 4 5
  • each primer is a primer for X, ⁇ P 1A ("P 1AF "&" ⁇ 1 ⁇ ? ") And OP 1B (" p 1BF "&
  • P2BF-CCCAATCCTCCCTCCATTTA (SEQ ID NO: 5)
  • PIBF TCCTGGAGAGCAGAGTGGAT (SEQ ID NO : 7)
  • PIBR GGGGTCCCTGGACTACACTT (SEQ ID NO : 8)
  • PIBF TCCTGGAGAGCAGAGTGGAT (SEQ ID NO : 7)
  • P2BF CCCAATCCTCCCTCCATTTA (SEQ ID NO : 3 ⁇ 45)
  • the complementarity between the amplification product and the primer was calculated.
  • the sequence of the amplification product obtained when the nuclear width was measured using the primer was determined.
  • it can be determined from the template sequence and the position of the primer. Alternatively, it can be obtained using software such as e-PCR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutiIs/e-pcr/). The sequence of amplification products determined using this software is shown below.
  • Figure 13 shows a part of the information contained in the output file as a result of calculation of complementarity between the primer and the amplification product.
  • Figure 13 shows the character string of the part written in the output file for the calculation result of complementarity by combination [5] ( P1A -P2A_product).
  • the difficulty is 1 tf3 ⁇ 45 3 indicating that the primer sequence of the primer sequence 51 for calculating the alignment score and the amplification product sequence 52, 3 'is the highest score of the alignment, the oral calibration score of 5 4,
  • the length of the target sequence is 55, and information 56 indicating the location of the base that matches the two sequences is included.
  • Table 2 shows the relationship between the primer obtained in 3> and the amplification product (combination [5] ⁇ [8 ]) Complementarity calculation results, total local alignment score (total score), total length of sequences subject to alignment (total length). And their ratio (ratio: total score / total length x 100).
  • Combinations [5] to [8] is a combination of primer I This 3 ⁇ 4 in the reaction system to obtain an amplification product containing the X 2 as an amplified product and the amplification product.
  • Table 3 shows the total score (total score) in the calculation of complementarity between the primer obtained in ⁇ 3> and the amplification product (combination [9] to [: 1 2]). ), The total length (total length) of the sequences subjected to alignment, and the ratio (ratio: total score / total length ⁇ 100).
  • Combination [9 :! ⁇ [12] is a combination of a primer and an amplification product present in a reaction system that obtains an amplification product containing as an amplification product.
  • the amplification amount of the PCR product was measured using an invader reaction.
  • the multiplex PCR connexion By the multiplex PCR connexion, "the amplification products containing, X 2:” '83770799.
  • Amplification products containing Rs2770797 is obtained these SNP ( ⁇ U3 ⁇ 4) are detected by the respective in-base over da reaction Therefore, in the invader reaction, use two probes that correspond to the two PCR products to be measured and have fluorescent substances with different wavelengths attached.
  • the amount of two PCR products can be measured at the same time, and as the Invader reaction proceeds, the fluorescence of each PCR product increases, but the increase depends on the amount of amplification of the gl * PCR product.
  • the slope of the amplification curve is determined by the combination of primers used and the complementarity index between the primers (ie, obtained in Table 1 above). Ratio value), the combination of primer-amplified products in the reaction system, the complementarity index between the primer-amplified products (ie, the ratio value obtained in Table 2 above), and the like.
  • the slope of the amplification curve is determined by the combination of primers used and the complementarity index between the primers (ie, obtained in Table 1 above). Ratio value), the combination of primer-amplified products obtained in the reaction system, the complementarity index between the primer-amplified products (that is, the ratio value obtained in Table 3 above), and the like.
  • the slope of the amplification curve does not correlate with the complementarity index between primers, but the complement between primer-amplified products. It can be seen that the sex index shows good relations. That is, it can be seen that the amount of amplification can be evaluated by determining the complementary index (ratio value) between the amplification products of the primers.
  • the primer of complementarity index between primers, and the complementarity index between primers and amplification products (combined to be good overall, ie, P 1A "P2B) X, which efficiently synthesize both amplification products comprising amplified product ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 2 including, therefore, can be evaluated as a bra timer in a flat Ft®.

Description

明 細 書 核雖 Φϊ用プライマ一 ¾1 置、 プライマー ¾1十プログラム、及びプライマ一誕 一ノ 置
技術分野
本発明は、核酸増幅用プライマー ¾1十装置、 プライマー設計プログラム、 及びプライマ 一 一ノ壤置 (De ice for Designing Primer, Program for Designing Primer, and Server for Designing Primer) に関する。本発明は、 <5¾ίί対象核酸の中から必要な塩基配 列を増幅する反応に使用するプライマ一を設計するための計算装置、 プログラム、及びサ ーバ装置に関する。
背景技術
2つ liLhの核酸を同時に増幅する反応として， マルチプレックス PCR (Polymerase Chain Reaction, ポリメラーゼ連鎖反応）が知られている。マルチプレックス PCRを利用して一塩 基多型（S P)のタイピングをおこなう技術として、特許文献：特開 2002— 30089 4号公報「一塩基多型タイピング方法」 などがある。 同技術で示されるように， マルチプ レックス PCRは の血液から抽出される少量の D Aを効率よく増幅し，多数の SNPをタィピ ングするのに有用な技術である。 マルチプレックス PCRにおいて使用するブラィマ一の設計は、例えば以下のようにして行 われる。
はじめに、増幅の対象となる DNAの塩基配列から増幅部位（ターゲット）に対応するブラ イマ HSffiを選び出す。増幅対^ D Aの塩基配列からプライマ を選び出す手法として は、例えば、 特許文献：特開 2 0 0 3— 9 9 4 3 8号公報「コンピュータを利用して 対象核 基配列から ft®なオリゴ核酸配列の を IS!十するためのコンピュータソフト ウェアプログラム及びその方法 Jなどがある。以下に、増幅対剥 Aの塩基配列からプライ マー候補を選び出す手法の例を、 図 1を参照して説明する。 増幅の対象となる D Aの塩基配列から 1つめの増幅部位（ターゲット） X,に対応するブラ イマ HS¾を選び出す。
このとき、 プライマ は、 プライマーの菌温度 Tm、 GC含量、塩基配列の長さ、塩 基配列の特異性、 ヘアピン構造及びプライマ一ダイマーの形成のしにくさをあらわすスコ ァから選び出されるものとする。
Tm、 GG含量、及び塩基配列の長さが、 あらかじめ定めた範囲内に収まっている、 ターゲ ット X,に対応する n個のプライマ のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びブラ イマ一ダイマーの形成のしにくさから算出した、 プライマ の ftii性を示すスコアが 最も高いものを P„、 2番目に高し g¾を P,2、 そして n番目の を P1nと呼ぶことにする。
2つめのターゲット X2に対応する n個のプライマ HS¾P21, P22.■■■ . P も、上記と同 様に選び出す。
すべてのターゲッ卜について同様の操作を繰り返し、 m番目のターゲット) Uこ対応する k 個のプライマ HgffiPm1, P^, ■ ■ · . を選び出す。 次に、選び出されたブラィマ HS の中から反応に «Sなブラィマーの組み合わせを選 び出すために、異なるターゲッ卜のプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列 を持っていないか調べる。 プライマ一同士の相補性を調べることについて記載した文献と して、 非特許文献： Rachl i n J, Di ng C, Cantor C, Kas if S.； Computationa l tradeoffs i n multiplex PCR assay design for SNP genotyping; BMC Genomics; 2005 Jul 25;6: 102が 挙げられる。 一方、第 20回国際生化学';^生物学会議バイオインダストリ一セミナ一 （200 6年 6月 23日） における、 非特許文献：プロメガ株式会社、演者：ダグラス · R ·スト ーッ， Ph. D. (Douglas R. Storts, Ph.D.) 、 rp|exor™ qPCR and qRT"PCR Systemによる 定量的マルチプレックス増幅」 においては、 プライマー ¾|十の際、他のアンプリコンへの ミスプライミングを予め排除することが開示されたが、 その具体的なアルゴリズムは開示 されていない。 [特許文献 1] 特開 2002— 300894号公報
[特許文献 2] 特開 2003— 99438^報
[非特許文献 1] ラクリン · J (RachlinJ), デイング■ C (DingC)、 カンター■ C (Cantor G)、及びカシフ■ S (Kasif S) 著、 S N Pゲノタイピングのためのマルチプレ ックス P C Rァッセィ設計におけるコンピュテーショナルトレ一ドオフ （Computational tradeoffs in multiplex PCR assay design for SNP genotyping)x Γヒ—ェム■シ— ゲノミクス （BMC Genomics)」、 2005年 7月 25日、第 6巻、 p. 102
[非特許文献 2] プロメガ株式会社、演者：ダグラス■ R■ストーッ， Ph. D. (Douglas R. Storts, Ph.D.)、第 20回国際生化学■分子生物学会議バイオインダストリ一セミナ ―、 PlexorTM qPCR and qRT-PCR Systemによる定量的マルチプレックス増幅、 2006年 6月 23曰
発明の開示
発明の目的
プライマー同士の相補性は、 以下のようにして調べることができる プライマーは通常塩基配列の異なる 2つの核酸の組であり、例えば、 プライマ一 Pxは、 2
Figure imgf000006_0001
であらわされる。 そして、 閏 ¾¾pa (i , j)を塩基配列 iと jの相補性を求める関数として表現した場合、ターゲット Xに対するプライマ ~PXと、タ ーゲット Yに対するプライマー Pyとの相補性を確かめるためには、プライマーのすべての組 み合わせ、 すなわち pa fexF, ρ,ρ) , pa (ρ,ρ, ρ^ pa Cp^, ρ^ 及 1^ρ3 (ρ , ρ )を調べる必要 がある。 具体的には、 プライマ" Ρ„ (すなわち核 ¾p„F及 U¾)„R) と、 プライマ" P2, (すなわち核 酸 P2,F及び P21R) との相補性を調べるために、 pa (p11F, p21F) , pa (p11F, p21R) , pa (pl1R, p21F) , 及び pa (p ， p21R)を求める。 一方で、 あらかじめ、 相補性のスコア （すなわち上記関数に よる計算値） の上限値 pa^を定めておく。 プライマー P„とプライマー P21とについて求めた 上記関数による計算値 （相補性のスコア） のうち、 し、ずれか力 を超えていた場合は、 Ρ,,か P2,を 2番目の^に置き換える必要があるということになる。 どちらを置き換えるか は， 他のプライマーとの組み合わせによつて計算された相補性のスコアをもとに決めれば よい。 まずは、選び出した各ターゲットのプライマ H ^のうち優先順位が 1番目の錢 (P„ , P21, ■ ■ ·， Pml) を、相補性を検証するための対象とし、 当該 1番目の の中から 2 つを選び出すすべての組み合わせについて、相補性スコアを計算する。計算の結果、 pa^ を超える相補性スコアを生じたプライマ一を、觸からはずす。優先順位が 1番目のブラ イマ一が^ iからはずされた後は、 当該タ一ゲッ卜における 2番目のプライマ カ湘 補性を «するための対象となる。 このように、 プライマ HS iは、優先順位の高いもの から廳こ觸をはずされていく。 上記の操作を繰り返し， すべてのターゲットについて， プライマー候補の組み合わせの スコアが pa^以下になるようにする。 このようにして求められたプライマーの組み合わせ は， 異なるターゲッ卜のプライマー同士がプライマ一ダイマ一を形成する可能性が低く、 マルチプレックス PCRで使用可能なプライマーとなる。 既に述べたように、 マルチプレックス PCRは、 多数の SNPをタイピングするのに有用な技 術である。 しかし、 その成否の多くは、増幅で用いるプライマ一の設計に因っている。上 述の従来技術で Ιδϊ十されたブラィマーは、 実際に増幅反応を行っても増幅されなし、場合が 数多くあった。 その理由は次の通りである。 上述した従来技術は、 プライマ一 151十の際に他のプライマーの配列を検査して、相補的 な配列を持つプライマーが同時に選出されるのを防ぎ、 このことによって、 目的の核酸の 増幅反応を効率よく行うものである。 ところ力 増 反応においては、 反応が進むにつれ てプライマーの数は減少し、逆に核酸の数が増加していく。 その ¾J は、増幅反応のサイ クル数を nとしたとき、 的な で Ii2の n乗に比例する。すると、反応の初期 S gで は数が少なしゝために問題にならなかった増幅核 Λ《、 その数の増加とともに問題になって くる。すなわち、増幅された核酸の塩基配列の中に、意図せずして他のプライマーと同じ 塩基配列があった場合、 当該プライマーと当該増幅された核酸とで結合してしまい、増幅 反応を阻害することになる。 このことを、具体的な例で説明する。 0. 16ng/uLの陽 8uLについて、 20箇所の増幅部位を マルチプレックス PCRで増幅するとする。 D Aの大きさ力《3Gbpであるとき、 量は約 9. 90 10"であるから、増幅前の D Aの量は次式で求められる。
(0. 16 X KT9) x 8. 0÷ (9. 90 x 10")=1. 29 x 1(r2, [mol]
—方、 プライマー 20組 （合計 40種類） が 1. 25uMの濃度で 0. 83uL使用されるとすると、 プ ライマーの合計量は、 (1.25x10 (0.83x10^)=1.04x10-,2[mol]
となる。この時点では、 DNA量はプライマー量に比べて圧倒的に少ないため、プライマーが 意図しなしゝ場所で DNAに結合するリスクは考慮する必要はなく、プライマー同士が意図しな し、場所で結合するリスクのほうが圧倒的に高い。 次に、 マルチプレックス PCR反応によって増幅された結果、 200bpの核 ¾20種類力《合計で 50ng生成されるとすると、 その合計の数は、
(50 x10^)÷(6.60x104)=7.58x10—'3 [mo I ]
となる。 ここでは、 200bpの分子量を 6.60X10として計算している。
このように、マルチプレックス PCRの結果、増幅された核酸は反応前のプライマー量とほ ぼ同程度まで増え、 その一方でプライマーは核酸が増えた分だけ数が減ることになる。 そ の結果、 プライマー同士が意図しなしゝ場所で結合するリスクは低くなリ、逆にプライマー と増幅された核酸が意図しない場所で結合するリスクカ <なる。 図 2に、 プライマーと増幅された核酸が意図しなし、場所で結合した例を示す。本来ブラ イマ ~p11Fと p2,Fから、増幅産物として x„及び [x„] (ここで、 [x„]は x„に相補的な配列） が 生成されるはずである。 しカゝしな力《ら、別の部位を増幅するためのプライマ" p21Fの一部に 、意図せず x„に相補的な配列があるため、 p21Fが x„途中に結合してしまう。その結果、本来 の増幅産物 x„及び [x„]よりも短し、別の増幅産物 χ, 及び [χ, ] (同様に、 [χ„' ]は χ„' に相補的な配列） を多く作ってしまうことになる。すると、 目的の増幅産物を十分得るこ とができない。 また、 2つのプライマーが意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率と、プライマ一と増 幅産物である核酸とが意図せずに相補的な配列を持つ確率との違いにも注目しなければな らない。 例えば核 の 3'末端側から a個の配列と相補的な配列が、大きさ k [mer]の核翻の配列の 中に含まれている確率は、次式であらわされる。
(1/4) a (k-a+1) 2つのプライマーが意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率、 すなわち、 プライマ一 A の 3' ^側配列 （a=5とする。） と相補的な配列がプライマー B (k=20とする。） の中に含ま れている確率は、 以下のように求められる。
(1/4) 5 x (20-5+1)=1. 6[ ] —方、 プライマ一と増幅産物である核酸とが意図せずに相補的な配列を持つ確率、 すな わち、 プライマ一 Αの 3' 側配列 （a=5とする。） と相補的な配列が、増幅された核翻 （ k=260とする。） の中に含まれている確率は、 以下のように求められる、
(1/4)5 x (260-5+1 ) =25. 0[%]
この結果は、 2つのプライマ一が意図せずに互いに相補的な配列を持つ確率よリも 16倍高 しゝことを示している。 それだけでなく、 この確率は、増幅産物が大きくなればなるほと くなる。 つまり、プライマーの 1SI十の際に、 PCR反応によって増幅される核酸の配列とプライマー との配列の相補性を していなければ、 反応の後半になるに従って増幅反応を阻害する 核酸が増加することになる。 その結果、 目的の核酸が十分得られなしゝだけでなく、 プライ マーの意図しない場所への結合によつて不所望な核酸の断片が多数増幅されることになる
そこで本発明の目的は、核 幅反応において、 プライマ一力《意図しなしゝ場所へ結合す ることによって不所望な核酸の断片を生じることがない、適切なプライマーを ϊδϊ十するこ とができるプライマー ϊδϊ十装置、 プライマ一151十プログラム、及びプライマ一 ISI†^—バ 装置を することにある。 発明の概要
本発明者らは、 ある特定の部位を増幅するためのプライマーと、 i己特定の部位以外の 部位において生成する増幅産物との相補性を調べることによって、上記本発明の目的が達 成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、 以下の発明を含む。すなわち、本発明は、 プライマー ¾i十装置 （下記 [ 1 ]
〜 [ 5])、 プライマー ¾1十プログラム （下記 [ 6；！ 〜 [ 1 0])、 プライマ一 ーノ 置 （下記 [ 1 1；！ 〜 [ 1 5]) を含む。下記 [ 1：！ 〜 [ 1 5] における、 「プライマ HHi
」、 「プライマー^群」、 r増畐産物」、及び r増幅産物群」 について、 以下に概説する。 本発明において、複数の増幅すべき部位を、 χ,, χ2, ■ ■ ■ , ) とする場合に、 プライマ 一設計のために考慮される核酸種を図 6に示している。
プライマ は、例えば 1番目の増幅部位 については、 Ρ„， Ρ12, ■ ■ ■， Ρ1πのそれ ぞれをいう。 同様に、 m番目の増幅部位 については、 Pm1. P^, ■ ■ ■■ P のそれぞれを いう。 なお、本発明において、 プライマーと記載する場合、 特に断りの無いかぎり、 フォヮ一 ドプライマ一とリノく一スプライマ一の対であることを意味する。従って、例えばプライマ HS¾ P„は、フォワードプライマ一 p„Fとリ 'ースブラィマー p11Rとのプライマー対を意味 する。 プライマ HSffi群は、例えば 1番目の増幅部位 X,については、複数のプライマ Η¾Μ Ρ,, , Ρ12， ■ ■ ■及び Ρ1ηからなる群をいう。 同様に、 m番目の増幅部位 XJこっし、ては、複数の プライマ HSffiPm,, P^. ■ · ■ , 及び^からなる群をいう。 増幅産物は、例えば 1番目の増幅部位 X,については、 X,,, [χ„] , ½, [½]， ■ ■ · , χ1η . [χ1η]のそれぞれをいう。同様に、 m番目の増幅部位) こついては、 [xj， ½. [xj
[xjのそれぞれをいう。 ここで、例えば [χυ]は、 χ„に相補的な核酸、 [½] は に相補的な核酸、 [ ]は) に相補的な核酸であることを示す。以下、他の核酸につ いても同様である。 なお、本明細書において、 特に断りの無し、限り、 プライマ H^iから得られる増幅産物 とは、 プライマ H^iを用しゝた増幅反応を行った場合に理論上生成する増幅産物をいう。 従って、例えば χ„及び [χ„]は、 プライマー Ρ„ (すなわちプライマー対 p11F及び p11R) を用 し、て増幅反応を行った場合に、 理論上生成する劇 ϊ産物である。 増幅産物群は、例えば 1番目の増幅部位 X,については、複数の増幅産物 X", [x„] , ½ , [½]， ■ ■ · , xln, 及び [xln]からなる群をいう。 同様に、 m番目の増幅部位) こついて は、複数の増幅産物) g， [xj , [xj , ■ ■ ■， ， 及び [xjからなる群をいう。 下記 [ 1 ] ~ [ 5] は、 プライマー Ιδϊ十装置に関する。
[ 1 ]
核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマーを設計するための装置であって、
(I )プライマー と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Αを含む処理命 令を入力するための入力部と；
( I I )前記計算命令 Aを受けて、
複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについ て、前記 2つの部位のうち一方の部位についての前記プライマー候補の配列と、前記 2つ のうち他方の部位において得られる前 ΪΒ^Φϊ産物の配列との相補性を計算しスコァ化する ことを含む処理を行うことによつて、
前記複数の部位を増幅するための一連のプライマ一を決定するための処理部と；
(I I I)複数の MISプライマ H^liからなるプライマ一抜群であって、 IB複数の増幅 すべき部位のそれぞれに対応するプライマ 群のデータと、
複数の Ml ^幅産物からなる増幅産物群であって、 MIB複数の増幅産物のそれぞ れは、 前 15 ^幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応に よって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
IB処理部によつて計算された WIS相補性の結果と、
MIB処理部によって決定された IS—連のプライマ一と、
を少なくとも格納するための記憶部と；
(IV) βίίϊΒ処理部によって決定された 連のプライマーを出力するための出力部と； を備える、 プライマー ¾1十装置。 すなわち、 上記 [ 1 ] は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマー設計において 、 プライマ Η ^と増幅産物との相補性を検証することを特徴とする、 プライマー ¾f十装 置である。
[ 2]
前記入力部（I)で入力される前記処理命令は、前記プライマ 群を選出させるため の選出命令 Bをさらに含み、
処理部 （I I) において実行される Ι5処理は、 ilKl出命令 Bを受けて、 少なくと も増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の 1f^、 及びプライマー Ιδϊ十 ノ《ラメータに基づいて、 ΪΒブラィマ 群を選出することをさらに含み、
ΙΞ記憶部 (I I I)には、少なくとも βίίΙΞϋ幅対象となる核酸の配列、 ris核酸中の増幅 すべき部位の難、及び プライマー Ιδί十パラメータがさらに格納される、 [ 1 3に ΪΒ« のプライマ一 isi十装置。
[ 3]
Bプライマ一ΐδΐ十パラメータが、 msrn. G C含量、塩基長、増幅産物長、塩基配 列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位に対するプライマ一対のプライマー分子間に おける相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、 [ 2 ]に記載のブラィマー I ^十 装置。 すなわち、上記 [ 2] 及び [ 3] は、特に、本発明のプライマー IStt装置が、 プライマ
H^iの選出も行う形態に向けられる。
[4]
I5入力部（I)において入力される前記処理命令は、前 15^幅産物を計算させるための 計算命令 Cをさらに含み、
IB処理部 (I I ) において実行される前記処理は、前言己計算命令 Cを受けて、前記複数 の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び !SBプライマー の配列から、増幅∞によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含 み、
I5記憶部 (I I I ) には、 少なくとも IB増幅対象の核酸配列がさらに される、 [ 1
] ~ [3] のし、ずれかに ΙΒ«のプライマー isi十装置。 すなわち、上記 [4] は、特に、 本発明のプライマ一¾!十装置が、 プライマ H ^から 増幅産物を計算することも行う形態に向けられる。 [ 5]
βίίϊΕ入力部（I)において入力される 処理命令は、 Bプライマ 同士の相補性 を計算させるための計算命令 Dをさらに含み、
it己処理部 (I I ) において実行される前記処理は、前記計算命令 Dを受けて、 IB複数 の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、 IB 2つの部位のうち一方の 部位についてのプライマ Η^ϋの配列と、前記 2つの部位のうち他方の部位についてのプ ライマ HSffiの配列との相補性を計算することをさらに含む、 [ 1 ] ~ [4]のいずれかに 記載のプライマー誕十装置。 すなわち、上記 [ 5] は、特に、本発明のプライマー ¾|十装置が、 プライマ一候補同士 の相補性を することも行う形態に向けられる。 下記 [6：! 〜 [ 1 0] は、 プライマ一¾!十プログラムに関する。
[6]
核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理を、 コンビユー タに行わせるための、 プライマー設計プログラムであって、
複数のプライマ からなるプライマ一抜群であって、複数の増幅すべき部位のそ れぞれに対応するプライマ 群のデータと、
複数の増幅産物からなる増幅産物群であって、 llH複数の増幅産物のそれぞれは、 ffilB 増幅すべき部位のそれぞれにおいて、前記プライマー候補を用いた増幅反応によって得る ことができるものである増幅産物群のデータと、
が少なくとも与えられることにより、
Bプライマ と ^幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Aを受けて、 IB複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて 、前記 2つの部位のうち一方の部位についての前記プライマ HS iの配列と、 つの うち他方の部位において得られる ΜΪ5¾幅産物の配列との相補性を計算しスコァ化するこ とを実行することを含む工程を行うことによって、前記複数の部位を増幅するための一連 のプライマーを、 «複数のプライマー 群から決定するための処理をコンピュータに 行わせるための、 プライマー設計プログラム。 すなわち、上記 [6] は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマーをコンビユー タによって 十する際に、 プライマ と増幅産物との相補性を^ BEする処理を実行さ せることを^とする、 プライマー ISI十プログラムである。本明細書において、 プログラ ムとは、 コンピュータによって直接実行可能なものと、 ハードディスクなどにインスト一 ルすることによって実行可能となるものとを含む。
[ 7 ]
I5プライマ HS*i群を選出させるための選出命令 Bを受けることにより、 少なくとも 増幅対象となる核酸の配列、 MB核酸中の増幅すべき部位の 1f¾、 及びプライマー ϊδϊ十パ ラメータに基づいて iiBブラィマ HSM群を選出することを実行することを含む工程がさ らに行われる、 [ 6] に ΪΒ«のプライマー設計プログラム。
[ 8]
プライマ一 ¾|十パラメータが、醒 as、 G C含量、塩基長、増幅産物長、塩基配 列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位に対するプライマ一対のプライマー分子間に おける相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、 [ 7 ]に記載のプライマー ¾1十 プログラム。 すなわち、上記 [7 ] 及び [ 8] は、特に、本発明のプライマ一 IS!十プログラムが、 プ ライマ の選出を行う処理も実行する形態に向けられる。 [9]
ΙΒϋΦ畐産物を計算させるための計算命令 Cを受けることによリ、 B複数の増幅すベ き部位それぞれにおいて、 少なくとも増幅対象の核酸配列及び前記ブラィマ HS の配列 から増幅反応によつて得ることができる増幅産物を計算することを実行することを含むェ 程がさらに行われる、 [ 6] ~ [ 8] のいずれかに記載のプライマ一¾|十プログラム。 すなわち、上記 [9] は、特に、本発明のプライマー 151十プログラムが、 プライマ 補から増幅産物を計算する処理も実行する形態に向けられる。
[ 1 0]
Bプライマ HSffi同士の相補性を計算させるための計算命令 Dを受けることによリ、 IB複数の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、 MI32つの部位のう ち一方の部位についてのプライマー候補の配列と、前記 2つの部位のうち他方の部位につ し、てのブラィマ Ηδϋの配列との相補性を計算することを実行することを含む工程がさら に行われる、 [ 6] ~ [9] のしゝずれかに記載のプライマー ¾|十プログラム。 すなわち、上記 [ 1 0] は、特に、本発明のプライマー設計プログラムが、 プライマー 同士の相補性を検証する処理も実行する形態に向けられる。 下記 [ 1 1 ] ~ [ 1 5] は、 プライマ一 isit f "—バ装置に関する。
[ 1 1 ]
ネットワークを介して他のコンピュータと通信可能な、核酸中の複数の部位を増幅する ための一連のブラィマーを設計するためのサー Z 置であって、
(V) 他のコンピュータから送信されてくる、 プライマー候補と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Aを含む処理 命令を受信するための受信部と；
(VI ) 前記計算命令 Aを受けて、
複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについ て、前記 2つの部位のうち一方の部位についての前記プライマ一 の配列と、前記 2つ のうち他方の部位において得られる ΜϊΒϋ幅産物の配列との相補性を計算しスコァ化する ことを含む処理を行うことによって、
MB複数の部位を増幅するための一連のブライマ一を、前記複数のブラィマー候 補群から決定するための処理部と；
(VI I )複数の前記プライマ HS¾からなるプライマ "抜群であって、 IB複数の増幅 すべき部位のそれぞれに対応するプライマー^群のデータと、
複数の前記増幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞ れは、 Β^Ψϊすべき部位のそれぞれにおいて、 ΙΒプライマ HS¾を用いた増幅反応に よって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
ΪΒ処理部によって計算された iiB相補性の結果と、
IB処理部によって決定された IS—連のプライマ一と、
を格納するための記憶部と；
(VI I I) 読処理部によって決定された iiB—連のプライマーを、他のコンピュータに 送信するための送信部と；
を備える、 プライマー 151†^—壤置。 すなわち、 上記 [ 1 1 ] は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマ一を、上 IB* 発明のプライマー プログラムが導入されていないコンピュータによって ϊδβ十する際に ネッ卜ワークを介してアクセスするサーバ装置であって、 プライマ HSffiと増幅産物との 相補性を検証する処理を行うことを機とする、 プライマー iSIH—バ装置である。本明 細書において、 ネットワークを介した他のコンピュータとは、 端^置及び他のサーバ装 置を含む。
[12]
受信部 (V)におし、て受信される前記処理命令は、 WIBプライマ HSffi群を選出させ るための選出命令 Bをさらに含み、
IB処理部 （VI)において実行される liiia処理は、 Β 出命令 Bを受けて、 少なくと も増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、 及びプライマー ¾|十 パラメータに基づいて、 ΙΒプライマ HSM群を選出することをさらに含み、
ΑίίϊΒ記憶部 (VI I )には、少なくとも ffilBl^g対象となる核酸の配列、 fliB核酸中の増幅 すべき部位の†f¾、及び ΙΒプライマー ¾|十パラメータがさらに棚される、 [11]に記 載のプライマー IStHi "—バ装置。
[13]
ISプライマー !51十パラメータが、 m^ . GC含量、塩基長、増幅産物長、塩基配 列の目的部位への特異性、 及び、 1つの部位に対するプライマー対のプライマ一分子間に おける相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、 [12]に記載のプライマー設 tH— /锴置。 すなわち、上記 [12] 及び [13] は、特に、本発明のプライマー ISIHI"—/ 置が
、 プライマ HS¾の選出を行う処理も行う形態に向けられる。
[14]
前記受信部（V)において受信される ήίΠΒ処理命令は、 iiBlg幅産物を計算させるための 計算命令 Cをさらに含み、 前記処理部 （VI) において実行される前記処理は、 計算命令 Cを受けて、嫌己複数 の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び プライマ一 i¾Sの配列から、増幅 によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含 み、
ΙίίϊΒ記憶部 （VI I ) には、 少なくとも前言 幅対象の核酸配列がさらに欄される、 [ 1
1 ] 〜 ！：1 3] のし、ずれかに言 e«のプライマー isiH—/壊置。 すなわち、上記 [ 1 4] は、特に、本発明のプライマー 一/壊置が、 プライマー から増幅産物を計算する処理を行う形態に向けられる。
[ 1 5]
ίϋϊΒ受信部 (V)において受信される ΙΞ処理命令は、プライマ HSffi同士の相補性を計 算させるための計算命令 Dをさらに含み、
処理部 (VI) におし、て実行される ilB処理は、廳己計算命令 Dを受けて、 ΙΒ複数 の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、 ΒίΙΙΒ 2つの部位のうち一方の 部位についてのプライマ HSIfの配列と、前記 2つの部位のうち他方の部位についてのプ ライマ HSIiの配列との相補性を計算することをさらに含む、 [ 1 1 ] ~ [ 1 4]のしゝずれ かに記載のプライマ一 iSlttl"—/壊置。 すなわち、 上記 [ 1 5] は、特に、本発明のプライマ一 lSi†" »"—ノ壤置が、 プライマー 同士の相補性を検証する処理も行う形態に向けられる。 上記 [ 1 ] 〜 [ 1 5] において、最も適したプライマーをプライマ Ht i群から決定す るための相補性のスコア化においては、 【（口一カルァライメントのスコア) (ァライメン 卜の対象となった配列の長さ) }を相補性指数として用い、当該相補性指数の小さい核酸同 士ほど、相補性が低いと判断することが好ましい。
本発明によると、 核 ¾ϋ幅反応において、 プライマ一が意図しなしゝ場所へ結合すること によって不所望な核酸の断片を生じることがない、適切なプライマーを isi十することがで きるプライマー 置、 プライマー設計プログラム、 及びプライマー —/壤置を 提供することができる。本発明によって ¾1十されたプライマ一は、 プライマー同士の配列 の相補性だけでなく、増 >ΐϊ反応によって得られる核酸の配列とプライマーの配列の相補性 を加味し、 反応液中に相補性の高し、組み合わせがないように考慮されている。 このため、 所望の増幅産物を効率よく得ること力《できる。
図面の簡単な説明
図 1 プライマ こおいて される;!^ aを示した図である。
図 21 プライマ" istta (こおしゝて起こる milにっし I¾P月した図である。
図 3 本 ¾B月のプライマ ϋ¾»7)^«»$σ> "^を示 "ΠΙである。
図 4| 図 3 置を、 CPUを用しゝて魏した ϋ^<7)ハ一ドゥエ 7¾¾7 "^を^ T^lである 図 5 本翻のプライマ H "プログラムを用し、たプライマ" ISi機置の ΙΒ»における タ 1Μ®7)Η5¾である。
図 6 本翻を用し、たプライマ ~ίδϊおおこおし、て考慮される ¾ ^^を示した図である。 図 7 ^本翻のプライマ" isi十プログラムを用いたプライマ^ I十方 における処 理フ口"^ャ一トである。
図 81 本翻のプライマー IS!十プログラムを用いたプライマ" IS!十: ¾5¾( te(DH ^におけ る知理フ口 ヤートである。 図 9 本 / を用いたシステム (7)^W誠を示" miである。
図 1 OI 本翻 0 h"ノ 置を用いたプライマ" ISi十: ¾¾ H5¾における觸フロ→ャ 一卜である。
図 11 こおけるプライマ"^†¾ (こおいて考慮された^^を示した図である。 図 121 プライマ一間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含まれる 1f¾の
—部を示す。
図 13 プライマー及び増幅産物間の相補性の計算の結果、出力されたファイルに含 まれる情報の一部を示す。
図 141 USS^Jにおいて IS!十されたプライマーを用し PCRを行つナ 、得られナ： iCR¾ 髓を 症し を示す。
図 151 ITOHこおいて IS!十されたプライマ一を用し vCPCR^i†っナ d¾¾、得られ； iCR¾ 滅を啶しナ を示す。
I： λΛ¾Ρ
II Μ
III :ΪΒ»
IV：出 Λ¾
1： CPU
2: RAM
3:JF—ボード
4:ディスプレイ
5:ハードディスク
6：プログラ ΛΙ»
7 タ tatsp
8： OSiatSP ：
：
：タ *ット ¾^ι»ε
：プライマ
：プライマ
： フラグ «^ή^
：
：フォヮ一ドプライマ Hl¾&びリバースプライマ Η^¾$ή« ：
：
：プライマ一及 ま ： 驢
、 32、及 U33： ί¾^Β
：ァライメント計算すべき 2つのプライマ"!^ ij
： 3' 末 7)ローカルァライメントスコアであることを示 ：口一カリレアライメントスコア
：ァライメン卜の対象となった の長さ
：マッチする を示 1 1^
： ：ァライメント言十筹:すべきプライマー i^iJ
： ：ァライメン卜言十算すべ^ 1<ϊ¾1¾ΙΗ^
： ： 3' «のローカルァライメン卜スコアであるこ ：とを示 l^
：ローカリレアライメン卜スコア
：ァライメン卜の 像となった i^Uの長さ
：マッチする^) ϋΒίを示 "TM^ 発明を実施するための形態
本発明のプライマー ¾1十装置、 プライマー設計プログラム、 及びプライマー istHi"—バ 装置は、 プライマー^と増幅産物との相補性を計算することに特徴を有するものである
< 1 . プライマ一 isi十装置の全体構成〉
本発明のブラィマー ίδΐ十装置は、 核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマ 一を設計するための装置であって、入力部（1 )、処理部 (I I) ,記憶部 (I I I).及び出力部
(IV) を含む。 図 3は、本発明のプライマー 置の全体構成を示すブロック図である
< 1一 1 . 入力部 >
入力部（I )は、処理命令などを入力するためのものである。また、場合によリプライマ 一 ¾1十に必要な ¾¾、 プライマ 群の 1f¾、増幅産物群の 1f¾などを入力しても良い より具体的には、入力部（| )は、少なくとも処理命令を処理部に与えるためのインタ一 フェイスをいう。入力部（I ) としては、キーボード、マウスなどの、人間とのインターフ ェイスとなるデ/くイスと、 インタ一フェイス回路、 インタ一フェイスプログラムなど、他 のプログラムや他のコンピュータなどとのインターフェイスとなる手段とが含まれる。 処理命令は、少なくとも、 プライマ HSffiと増幅産物との相補性を計算させる処理を行 うための計算命令 Aを含み、後述の処理部 (I I ) に当該処理を実行させるものである。 ま た、 処理命令は、 プライマ 群を選出させる処理を行うための選出命令 B、増幅産物 を計算させる処理を行うための計算命令 C、 及びプライマー候補同士の相補性を計算させ る処理を行うための計算命令 Dをさらに含むことができ、後述の処理部 （I I ) に当該処理 を実行させるものである。
< 1 - 2. 処理部 >
処理部 (I I) において処理命令を実行する工程の詳細については、後の 1—4. プライ マ一¾1十プログラムにおし、て述べる。 処理部 （I I) は、処理命令すなわち少なくとも計算命令 Aを実行するものをいい、 C P Uなどが含まれる。処理部 (I I ) は、計算命令 Aを受けることにより、 増幅産物とプライ マ との相補性計算を行う。
増幅産物とプライマ H ^との相補性計算を行う際は、増幅すべき複数の部位から 2つ の部位を任意に選択した場合の、 2つの部位のうち一方の部位に対するプライマ の 配列と、他方の部位における増幅産物の配列との相補性を計算する。 プライマ Hgffiを選出する処理も本発明のプライマー ¾1十装置にて行う場合は、処理部 (I I ) は、 処理命令として選出命令 Bも受け、増幅すべき複数の部位それぞれについて别 々に、複数のプライマ Hg¾を選出する処理を行うことができる。 増幅産物の配列を求める処理も本発明のプライマー 置にて行う場合は、処理部 （ I I) は、処理命令として計算命令 Cも受け、増幅すべき部位すべてについて、 プライマー 群に含まれるすべてのプライマー候補によって生成される増幅産物の配列を求める処 理を行うことができる。 ブラィマー候補同士の相補性を計算する処理も本発明のブラィマー 装置にて行う場 合は、処理部 （I I ) は、処理命令として計算命令 Dも受け、増幅すべき複数の部位から 2 つの部位を任意に選択した場合の、 2つの部位のブラィマー候補同士の相補性を計算する 処理を行うことができる。 このことによって、複数の部位を増幅するための最適な一連のプライマーを、 プライマ 群から決定することができる。 ぐ 1—3. 記憶部 >
記憶部（I I I ) は、 プライマ 群のデータ、増 産物群のデータ、処理部（I I ) によ つて計算された相補性の計算結果、 及び処理部 (I I ) によって決定された最適な一連のプ ライマーのデータなどを格納するためのものをいい、 R AMなどの主記慎装置及びハード ディスクなどの補助記憶装置が含まれる。 記憶すべきデータ■ If^は、外部データベースなどから読み込まれるものであっても良 いし、 本発明のプライマー Ιδί十装置によって得られるものであっても良い。外部データべ —スなどから読み込まれる場合は、記憶すべきデータ は、例えば、 C D— R OMな どのリムーバブルメディアから、 ドライブを介して読み込まれるものであってもよいし、 ネットワークを通じて、サーバコンピュータからダウンロードされるものであっても良い
(プライマ HSM群のデータ）
本発明においては、複数の増幅すべき部位のうち、特定の一の増幅すべき部位に対して 複数のプライマ HS¾のデータを用いる。特定の一の増幅すべき部位を増幅することがで きる異なる複数のプライマ Hl¾tを、本明細書ではプライマ 群と 15»する。
従って、 プライマ HS¾群のデータとは、増幅すべき部位 1箇所につき複数のプライマ HSIiに関するデータをいう。 プライマ は、 上述のプライマー ¾1十パラメータを含 むプライマー ΐδϊ十 1 ^に基づいて、増幅すべき部位ごとに別個に選出することができるも のである。 プライマ HSffi群のデータとしては、増幅すべき部位 1箇所につき複数のプライマ 補の を少なくとも含み、 さらに、各々のプライマ HS fの優先順位の†t¾を含むこと ができる。 プライマ H¾Mの 1f¾としては、具体的には、少なくともプライマー の配 列 を含み、 さらに、 プライマ の位置 1^ゃ大きさの 1f¾を含むことができる。 プライマ Ηδ¾の優先順位においては、前記プライマー 十パラメータをよリ好ましく満 たすものをより優先順位カ いものとすることができる。
(増 産物群のデータ）
増幅産物群のデータは、増幅すべき部位 1箇所につき複数の増幅産物の 1f¾を少なくと も含み、 さらに、 当該増幅産物に対応するプライマ Hl¾iの優先順位の†»¾を含むことが できる。増幅産物の髓としては、具体的には、少なくとも増幅産物の配列 1f¾を含み、 さらに、増幅産物の配列の大きさを含むことができる。
なお、増幅産物とは、 プライマ HS iを増幅反応に用いた場合に理論上生成する増幅産 物のことをいう。 湘補性の結果）
相補性の結果としては、相補性を評価することができるスコアを含むものであればどの ようなものでも良い。 スコアの取り方は、 当業者によって適宜決定することができるため 、 特に限定されないが、例えば、比較対象となる核酸間における配列においてマッチする 塩基の長さ、或いは、 比較対象となる核酸間における配列においてマッチする塩基の割合 に相当する量などをスコアとしてとることができる。 本発明では、相補性に基づくローカルァライメントによるスコア （以下、 score と IB« する場合がある） と、ァライメントの対象となった配列の長さ （以下、 lengthと |Β«する 場合がある）との比 (以下、 ratioと ΪΕ«する場合がある）、言し、換えれば、 scoreを length で割った値を、相補性評価のための指数 （相補性指数） として用いることが特に好ましい 。 ここで、 lengthがよリ大きく且つ scoreがよリ小さいことは、相補性が低いことを表す 。従って、 lengthに対する scoreの割合として示される ratioは、 その値が小さいほど、 対象となる 2つの配列の相補性が低いことを表す。本発明の好ましし湘補性スコアである ratio値は、 特に、 プライマ HSifと増幅産物間の相補性計算によって算出される値であ る場合、 当該プライマ H¾iを用いた複数部位の増幅を実際に行ったときに生成する増幅 産物の量と良しゝ相関を示すことが本発明者らによって見出されており、 大変信頼性の高い 値である。
(ftj產な一連のブラィマ一のデータ）
処理部 （I I) において、増幅すべき部位それぞれについて、少なくともプライマ Hlffi と増幅産物との組み合わせ全てについて相補性が評価された結果、 プライマ HS¾群中最 も相補性の評価が良いプライマ が ftilなプライマ として決定される。
従って、 な一連のプライマ一のデータは、全ての増幅すべき部位からそれぞれ決定 された、上記のようなプライマ Hlffiのセットについてのデータであり、 少なくとも配列 情報を含むものである。
(その他の讎）
記憶部 (I I I) には、上記のデータ以外に、 以下の情報が含まれていてよい。
例えば、増幅対象となる核酸の配列、 及び複数の増幅すべき部位の情報が含まれてよい 。増幅すべき部位の難としては、 少なくとも増幅すべき部位の位置翻を含み、 さらに 、増幅すべき部位の配列や当該配列の大きさなどを含むことができる。 また、 プライマ一が «氐限満たすべきパラメータである、 プライマー isi十パラメータが 含まれてよい。 プライマ一1SI十パラメータとしては、 SJt、 G C含量、 塩基長、増幅 産物長、塩基配列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位に対するプライマ一対のブラ イマ一分子間における相補性 （すなわちプライマーダイマーの形成しやすさ） 又はプライ マー分子内における相補性 （すなわちヘアピン構造の形成のしゃすさ） などを表すパラメ 一タカ《含まれる。 また、 これらパラメータの優先順位も含まれていて良い。 さらに、増幅すべき部位から 2つを選ぶ全ての組み合わせの†f¾が含まれていてよい。 それぞれの組み合わせにおいて組み合わせられた 2つの部位について、 一方の部位を増幅 するためのブラィマ H¾«と、他方の部位で生成しうる増幅産物との相補性の計算が、処 理部 （I I) で行われうる。 さらに、 当該 2つの部位について、一方の部位に対するプライ マ HSffiと、他方の部位に対するプライマ との相補性の計算が、 処理部 (I I) で行 われても良い。 さらに記憶部 (I I I) には、上記のデータ■ 1f¾以外に、処理部 (I I) における計算が行 われている間にプライマー^を識別するためのフラグの情^)《含まれていても良い。 上述した各データ■ lf¾は、例えば後述の図 5に示すような配置で記憶部 (M i )に ¾¾¾ されてよい。
< 1 - 4. 出力部 >
出力部 （IV) は、 少なくとも決定された最適な一連のプライマ一を出力するためのもの をいい、 ディスプレイなどが含まれる。最適なプライマーの出力の形態としては、 プライ マー酉己列そのものの出力、 及びプライマー配列を含むデータファイルの出力が含まれる。 出力とは、 表示、 印刷だけでなく、 データとして他のプログラムや装置に与える場合も含 む概念である。
<2. プライマー 15!十装置の動作概要〉
本発明のプライマー識十装置の動作概要の一例を以下に IB«する。 なお、 処理部 (II) において処理命令を実行する工程の詳細については、 後の 1—4. プライマー ϊδϊ十プログ ラムにおいて述べる。 記憶部 (III)に、 プライマ HgM群データ、 及び増幅産物群データが欄されている。 プライマ HSf群データには、複数のプライマ HSMの配列 1f¾とともに、各々のプライ マ の優先順位の髓を含むことができる。増幅産物群のデータには、増幅産物の配 列 1t¾とともに、 当該増幅産物に対応するプライマ の優先順位の 1 ^を含むことが できる。 入力部 （I) に処理命令として計算命令 Aが入力されると、記憶部 (III) に欄された プライマ HS¾群データ、及び増幅産物群データが、処理部 (II) に送られ、 プライマー 翻と増幅産物との相補性の計算が行われる。相補性の計算結果は、記憶部 (III)に される。 本発明のプライマ一 isi十装置においては、上記のプライマ Ηδϋと増幅産物との相補性 の計算以外に、プライマー候補を選出する工程、増幅産物の配列を求める工程、及び/又は
、 ブラィマ HSffi同士の相補性を計算する工程を行うことができる。 プライマ HSiを選出する工程を本発明のプライマー ϊδϊ十装置にて行う場合は、 入力部 (I) から処理命令として選出命令 Βも受けることにより、処理部 (II) は、 記憶部 （III ) から、 少なくとも増幅対象となる核酸の配列、 IB核酸中の増幅すべき部位の 1f¾、及 びプライマー ϊδϊ十パラメータを呼び出し、増幅すべき複数の部位それぞれについて別々に 、複数のプライマ HSIを選出する処理を行うことができる。選出されたプライマ のデータは、記憶部 (III) に格納される。 増幅産物の配列を求める工程を本発明のプライマー isft^置にて行う場合は、入力部（I
)から処理命令として計算命令 Cも受けることにより、処理部（II)は、記憶部 (III)か ら、 少なくとも増幅対象となる核酸の配列とプライマ HSIf配列とを呼び出し、増幅産物 を計算する処理を行うこと力《できる。求められた増幅産物のデータは、記憶部 (III)に格 納される。 ブラィマー候補同士の相補性を計算する工程を本発明のブラィマー 置にて行う場 合は、 入力部 （I)から処理命令として計算命令 Dも受けることにより、 処理部 (II) は、 記憶部 (III)から、少なくともプライマ HS¾の 1 ^を呼び出し、プライマ HSi同士の 相補性を計算することができる。相補性の計算結果は、記憶部 (III) に棚される。 処理部 （II) は、 プライマ HSffiと増幅産物との相補性の計算を含む、 プライマ一 ¾1十 のための全ての処理が終了した際、各増幅部位において優先順位がもつとも高いプライマ —同士を、最適な一連のプライマ一として決定することができる。計算された相補性の結 果及び決定された一連のプライマーのデータは、記憶部 (III)に格納される。記憶部 (111 ) に された «Sな一連のプライマーのデータは、 出力部 （IV) に出力される。
<3. /、一ドウエア構成 >
図 3の処理部を、 中 算処蝶置 CPUを用し、て実現した場合、本発明のプライマー ¾|十装置は、ノ一ソナルコンピュータとして実現される。 この場合、他の構成要素として は、 キーボードが入力部として、 ディスプレイ力《出力部として、 R AMなどの主記 1f¾置 及びハードディスクなどの補助記 11¾置が記憶部として実現される。 本発明のプライマ一 十装置のハードウェア構成を図 4に示す。 図 4において、 C P U 1には、 R AM 2、キーボード 3、 ディスプレイ 4、 及びハードディスク 5が ¾¾¾されて いる。ノ、ードディスクには、 プライマ一設計プログラム記憶部 6、 データ記憶部 7、 及び オペレーティングシステム （O S) 記憶部 8などの領域があり、 それぞれ、 プライマ一設 計プログラム、 データ、 O Sが記憶されている。 プライマー IS!十プログラムが起動される と、 当該プログラム力《ハードディスク 5から RAM 2にロードされた後、 C P U 1に送ら れて計算などの処理が行われ、 その結果が R AM 2に書き戻される。 この一連の動作によ リ、 本発明の機能が奏されるようになつている。 前述の 1一 3. 記憶部で挙げたそれぞれのデータ■情報は、 図 4におけるデータ記憶部 7に欄されている。 より詳しくは、例えば図 5に示すように、 データ記憶部は、複数の 増幅部位それぞれにっし、ての «¾Λ欄される領域 1 1、及び、 それら増幅部位から 2つ の部位を選び出す組み合わせの ¾¾カ される領域 1 2を有することができる。 増幅部位についての情報の領域 1 1のそれぞれは、増幅ターゲットとなる配列 1f¾の領 域 1 3、及び、 当該増幅ターゲットを増幅することができるプライマ HSiilt^の領域 1 4を有することができる。 当該領域 1 3は、増幅ターゲットとなる塩基配列難の領域、 及び当該増幅タ一ゲットとなる配列の大きさ 1f¾の領域を有することができる。 当該領域 1 4のそれぞれは、フォワード（Forward)側のプライマ一候補（以下、フォワードプライ マーと記載する）及びリバース （Reverse)側のプライマー候補（以下、 リバースプライマ 一と記載する） の職の領域 1 8、及び、 当該当該プライマ によって生成しうる増 幅産物の 1f¾の領域 1 9を有することができる。 当該領域 1 8は、 フォワードプライマ一の配列情報の領域、 リバースプライマーの配列 難の領域、 フォワードプライマーの位置難の領域、 リバースプライマーの位置職の 領域、 フォワードプライマ一の配列の大きさ情報の領域、 及びリバースプライマ一の配列 の大きさ難の領域を有することができる。 当該領域 1 9は、 プライマ によって生 成しうる增幅産物の配列難の領域、及び、 当該増幅産物の配列の大きさ髓の領域を有 することができる。 増幅部位から 2つの部位を選び出す組み合わせの難の領域 1 2は、組み合わせられた 部位の M1f¾の領域 1 5、 当該部位における優先順位の変更フラグの 1 ^の領域 1 6、 及び、 当該組み合わせにおける相補性の計算結果の領域 1 7を有することができる。 当該領域 1 7は、 当該組み合わせられた部位におけるプライマ と増幅産物との相 補性の計算結果の領域 2 1、及び、 当該組み合わせられた部位におけるプライマ 同 士の相補性の計算結果の領域 2 0を有することができる。
< 4. プライマー設計プログラム >
本発明の一実施形態であるブラィマー設計プログラムは、核酸中の複数の配列を増幅す るための一連のプライマーを決定する処理を、 コンピュータに行わせるためのプログラム である。本発明のプライマー設計プログラムは、本発明のプライマー 置及びプライ マ一 ¾ΙΗ» "—バ装置に導入されて好ましく用いられる。 本発明のプライマー設計プログラムにより、 プライマー候補と増幅産物との相補性を計 算する処理が少なくとも行われる。 プライマ と増幅産物との相補性計算に際し、 プ ライマ HS¾群のデータ、及び増幅産物群のデータが与えられる。 これら驗 'データの 詳細、 及び、 その他与えられうる lf¾ 'データについては、 上記 1 . プライマ一 ist十装置 の全体構成の 1 - 3. 記憶部において述べたとおりである。 プライマ と増幅産物との相補性の計算は、 計算命令 Aを受けることによって行わ れる。具体的には、計算命令 Aを受けることにより、複数の増幅すべき部位から 2つの部 位を任意に選択した場合の、 2つの部位のうち一方の部位に対するプライマ H^iの配列 と、 2つの部位のうち他方の部位において得られる増幅産物の配列との相補性を計算する 処理とが行われる。 プライマ HHfと増幅産物との相補性の計算の際には、計算結果 （す なわち算出された相補性スコア） が、 あらかじめ定めた相補性スコアの条件を満たさない 場合、 プライマ HSffiの優先順位が書き換えられる。 プライマ H^Sと増幅産物との組み 合わせ全てにおいて、相補性スコアの条件を満たすように、 プライマ H^aの優先順位を 書き換えながら相補性計算を繰り返すことができる。 ブラィマ Htffiと増幅産物との相補性を計算する処理の前には、 ブラィマ HSffiを選出 する処理と、増幅産物を求める処理とを行うことができる。 また、 プライマ H¾¾と増幅 産物との相補性を計算する処理は、適宜、増幅反応液中に する核酸種同士の相補性を 検証するための他の処理とともに行われてよい。例えば、 プライマー候補を選出する処理 工程が行われた後、 プライマ HS fと増幅産物との相補性の計算処理と、 プライマ 同士の相補性の計算処理とが行われて良い。 この場合、 プライマ H^fと増幅産物との相 補性の計算処理と、 プライマ H¾S同士の相補性の計算処理とは、 どちらが先に行われて もよい。 プライマ HgiSを選出する処理は、選出命令 Bを受けることによって行われる。具体的 には、 選出命令 Bを受けることにより、少なくとも増幅対象となる核酸の配列、 1B核酸 中の増幅すべき部位の難、 及びプライマ一¾1十パラメータに基づいて、 プライマ 群が選出される。 増幅産物を求める処理は、計算命令 Cを受けることによって行われる。具体的には、記 計算命令 Cを受けることにより、複数の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増 幅対象の核酸配列及び MISプライマ H^ffiの配列から、増幅反応によって得ることができ る増幅産物が計算される。 ブラィマー候補同士の相補性の計算を行う処理は、計算命令 Dを受けることによって行 われる。具体的には、計算命令 Dを受けることにより、複数の増幅すべき部位から 2つの 部位を任意に選択する場合の、 2つの部位のうち一方の部位についてのプライマ Hgffiの 配列と、 2つの部位のうち他方の部位についてのブラィマー候補の配列との相補性が計算 される。 プライマ一 1SI十のための全ての処理が終了した際、各増幅部位において優先順位がもつ とも高いプライマ一同士を、 *®な一連のプライマ一として決定することができる。 以下、 図 6を参照し、本発明のプログラムを用いたプライマー ¾|十方法の例を示すフロ —チャートを挙げて、 本発明のプログラムについて説明する。
< 4 - 1 . 処理フローチャート 1 >
図 7は、 本発明のプログラムを用いたプライマー ¾1十方法の一例を示すフローチャート である。 当該フローチャート 1は、 入力工程 S 1 1、 プライマ Hgffi選出工程 S 1 2、 プ ライマ一間の相補性計算工程 S 1 3、 プライマー及び増幅産物間の相補性計算工程 S 1 5 、及び、 出力工程 S 1 7を含む。 S 1 1においては、 増幅対象となる核酸の配列、増幅すべき部位の難、 及び、 プライ マ一IS!十パラメータ力《入力される。ここでは、図 6に示すように、 m箇所の増幅部位（ター ゲット Χ,, X2, ■ ■ ■ , )ϋ を増幅するものとする。 さらに S 1 1においては、 計算命令 A 、選出命令 B、計算命令 C、 及び計算命令 Dが入力される。 S 1 2においては、選出命令 Bを受け、 増幅の対象となる D Aの塩基配列から、 m箇所の 増幅部位 （ターゲットお X2， ■ · · , ） それぞれについて、别々にプライマ を選 び出す。 ここでは、 m番目のターゲット) こ対する k個のプライマ Ht を Pm1, Prt, ■ ■ · . とする。 S 1、 3— S 1 4においては、計算命令 Dを受け、異なるターゲッ卜におけるプライマー 同士が、意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。
S 1 5 -S 1 6においては、計算命令 C及び Aを受け、 プライマー候補を用いた増幅反 応によって生成しうる増幅産物とプライマ H¾ltとが、意図しなしゝ場所で相補的な塩基配 列を持っていなし、か調べる。 まず S 1 3において、 の増幅部 <iX,， X2, · · ·， から 2つの部位を選び出すすべて の組み合わせにおいて、 1番目のプライマ Hgffi同士の配列の相補性を示すスコアをそれ ぞれ計算する。言しゝ換えれば、各ターゲットのプライマ H¾ltのうち、 1番目のプライマ
HSffiPn. P21，■ ■ ■， Pm,の中から 2つを選び出すすべての組み合わせについて、配列の 相補性を示すスコアをそれぞれ計算する。具体的には、上記背景技術において述べたとお リである。すなわち、例えば、 の増幅部 ίίΧ,, Χ2, ■ ■ ■ , から X,と χ2とを選び出す組 み合わせにおいて、プライマー^ f間の相補性を調べる場合は、 pa (p11F， p21F) . pa (pl1F, p21R) , pa (p„R, p21F) , 及 LfJpa ^iR, p21R)を求めることによって、相補性スコアを算出する。 ここ では、 閏! ¾pa (i, j)を、塩基配列 iと jの相補性を求める関数として表現している。一方で 、 あらかじめ、相補性スコア上限値 pa^を定めておく。 そして、相補性スコアの計算値が
Figure imgf000036_0001
当該計算値が、 当該上限を超える場合は、 プライマー候 補を 2番目の^に置き換えることによって優先順位の書き換えを行う。 そして、置き換 えられた について、 上記と同様に相補性スコアの計算、 検証、 及び^に応じプライ マ H¾ iの優先順位の書き換えを行う。 このように、相補性スコアの算出とプライマ 補の優先順位の書き換えとを繰リ返す。
S 1 4において、すべての増幅部位の組み合わせにおいて、相補性スコアの計算値力 以下となる条件を満たしているかどうか、判断する。 当 1¾¾件を満たしていれば （Y e s )、 S 1 5の工程に進む。 当該条件を満たしていなければ （N o )、 S 1 2に戻る。 この場 合、 S 1 2のプライマ HS i選出において、 より優先順位の低いプライマー^を選出す るか、 プライマ一¾|十パラメータの条件を変えてプライマ H¾¾を選出するか、 或いは、 プライマ H ^選出方法自体を変更してプライマー^を選出するか、 などの方法を行い 、 S 1 4における条件が満たされるまで、 S 1 2〜S 1 4の工程を行う。 S 1 5においては、 πΗ固の増幅部位 Χ,, Χ2. ■ ■ ■ , Χ„から 2つの部位を選び出すすべての 組み合わせにおいて、 一方の増幅部位における 1番目のプライマ Η ^と、他方の増幅部 位における 1番目のプライマー候補によって生成する増幅産物との相補性を示すスコアを それぞれ計算する。 S 1 5においては、 まず、選出されたプライマー候補を核酸増幅反応に用いた場合に生 成しうる増幅産物を計算する。増幅産物の計算の方法としては特に限定されず、 当業者に よって適宜行われる。例えば、増幅対象となる核酸の配列と増幅すべき部位の位置 と から増幅産物を求めることができる。 次に、相補性スコアの計算を行う。例えば、 m個の増幅部 {4Χ,, X2, ■ ■ · , から X，と X2 とを選び出す組み合わせにおいて、 プライマ H^fと増幅産物の相補性を調べる場合は、 次の核酸種の組み合わせにつしゝて相補性を示すスコアを計算する。
ここで、ターゲット X,の 1番目のプライマ ΗΙ^Ρ,, (フォワードプライマ ~P„f及びリバ一 スプライマー p11R)から核酸増幅反応によって生成する増幅産物の配列を x„及び [x„]とし、 ターゲット X2の 1番目のプライマ 補 P21 (フォワードプライマ一 p21F及びリバースプライ マ ~P2m)から核 幅反応によって生成する増幅産物の配列を χ21及び [χ21]とする。 プライマ HSMP21による増幅産物と、 プライマ との相補性については、相補性 を示すスコアの算出は、 pa(p,)F, x21)、 pa(p„F, [x21])、 pa(p11R, x21)、 及 l pa(p11R, [x2〗])の 計算によって行うことができる。
また、 プライマ HS¾P„による増幅産物と、 プライマ ~P2,との相補性については、相補 性を示すスコアの計算は、 pa(p21F, x„)、 pa(p21F, [χ„]) ¾ pa(p21R, χ")、 及 U¾)a(p21R， [χ„]) の算出によって行うことができる。 —方で、 あらかじめ、増幅産物とプライマ HgMとの間の相補性スコア （すなわち上記 関数による計算値） の上限値 pa^roduotを定めておく。そして、増幅産物とプライマ との間の相補性を示す上記関数による計算値が、
Figure imgf000037_0001
証する。 当歸算値が、 当該上限値を超える場合は、 プライマ HSii又 Ιίϋ幅産物を 2番 目の^に置き換えることによって優先順位の書き換えを行う。 そして、置き換えられた について、 上記と同様に相補性スコアの計算、検証、及び必要に応じ優先順位の書き 換えを行う。 このように、相補性スコアの算出と優先順位の書き換えとを繰り返す。
S 1 6において、 すべての増幅部位の組み合わせについて、 相補性スコアの計算値が
Figure imgf000037_0002
判断する。 当該条件を満たしてし、れば (Y e s ) , S 1 7の工程に進む。 当該条件を満たしていなければ （N o )、 S 1 2に戻る 。 この場合、 S 1 2におけるプライマ HS 選出方法を変え、 S 1 6における条件が満た されるまで、 S 1 2〜S 1 6の工程を行う。 上述の工程によって、 すべての増幅部位について、 プライマー候補どうしの組み合わせ のスコアが pa ^以下であり、 プライマー候補と生成される核酸の組み合わせのスコアが
Figure imgf000038_0001
、 ftJSなプ ライマ一として決定され、 S 1 7において、 当該 ftigなプライマ一が出力される。 ぐ 4一 2. 処理フローチヤ一卜 2 >
図 8は、 本発明のプログラムを用いたプライマ一設計方法の他の一例を示すフローチヤ —トである。 フローチャートの他の一例を示す。 当該フローチャート 2は、 入力工程 S 2 0 1、聯畐産物計 程 S 2 0 2、 プライマ一間の相補性計 程 S 2 0 7、 プライマー 及び増幅産物間の相補性計算工程 S 2 0 8、及び、 出力工程 S 2 1 3を含む。 当該フロー チャート 2についての下記説明においては、相補性計算後、相補性スコアの条件を満たす かどうかの判断、 及びプライマ一の優先順位を書き換えるプロセスについて、 より詳しく 述べる。 その他、 相補性計算を行うプロセスなどについては、 上記フローチャート 1にお ける例と同様である。
S 2 0 1においては、増幅対象となる核酸の配列、増 ΦΪすべき部位の情報、及びプライ マ H ^データが入力される。 このとき、例えば、 これら†f¾ 'データカ嗜き込まれたフ アイル形式で入力を行うことができる。 m箇所の増幅部位 （ターゲットお X2， · · ■. ^ ) を増幅するものとすると、 増幅すべき部位の體は、前述の図 5に示す、増幅部 情 報〜増幅部 ©Uf^の領域 1 1に格納される。 プライマ データは、 これら増幅部位
If^の領域 1 4に ί&ίήされる。 さらに S 2 0 1においては、計算命令 Α、計算命令 C、及 び計算命令 Dが入力される。 S 202においては、計算命令 Cを受け、増幅対象となる核酸の配列及び増幅すべき部 位の難から、増幅産物が計算される。計算された増幅産物のデータは、 図 5に示す、 プ ライマ HS 1f¾の領域 14における増幅産物の 1f¾の領域 19に欄される。
S 203においては、 プライマー候補同士間の相補性スコアの上限値、及び、 プライマ HSii及び増幅産物間の相補性スコァの上限値の設定を行う。ユーザが当該上限値を入力 してもよし、が、 この例においては、 あらかじめ値が書き込まれていてよい。 S 204においては、各プライマ一候補におけるプライマ 変更フラグを、すべて TRUEにする。 このフラグが RUEであるプライマ一候補は、後述の S 206の分岐後、 ブラ ィマー候補同士間の相補性スコァ、 及びブラィマ H¾f及び増幅産物間の相補性スコァの 計算を実行することになる。一番初めの状態では、 全てのプライマー候補について計算を するため、 初期状態として、 全てのフラグを TRUEにする。
S 205においては、 その後の工程において、増幅部位から 2箇所を選び出す全ての組 み合わせについて、 プライマ一候補同士間の相補性スコアの計算と、 プライマ HSi及び 増幅産物間の計算とを実行することを命令する。例えば、 図 5に示す、組み合わせ體の 領域 12に された組み合わせ 1について、 S206〜S209の処 ¾b《行われ、組み 合わせ 2について、 S 206~S 209の処理が行われる、 というように、 全ての組み合 わせについて、 S206~S209の処理が繰り返し行われる。 なお当 ¾|十算は、 TRUEの フラグが付されているブラィマ HSt及びそれによつて生成しうる増幅産物のうち、 もつ とも優先順位カ いものについて行われる。 S 206においては、 プライマ 変更フラグ力订 RUEかどうかを判断する。 ここで、 プライマ HSIS変更フラグとしては、計算がまだ行われていなしゝ増幅部位の組み合わせに おけるプライマ に対しては TRUEが付され、すでに計算済みの増幅部位の組み合わせ におけるプライマ に対して liFALSEが付されるものとする。フラグ 1f¾は、図 5に示 す、組み合わせ情報の領域 1 2における fg 変更フラグの領域 1 6に格納されている。 プ ライマー ^変更フラグ力订 RUEであれば、 その部位の組み合わせについて相補性の計算を 行う。プライマ 変更フラグ力FALSEであれば、その部位の組み合わせについては同じ 計算を繰リ返さずに、計算対象部位を次の部位の組み合わせに移す。
S 2 0 7においては、 プライマ H^ffi同士間の相補性スコアを計算する。計算結果は、 図 5に示す、相補性計算結果の領域 1 7における、 プライマ一候補同士の相補性の計算結 果の領域 2 0に格納される。例えば、 増幅部位 と X2とを選ぶ組み合わせにおいては、 pa (p11F, p21F)の計算結果は 1~Forward x 2"Forward、 pa (pllF, p21R)の計算結果は 1"Forward x 2" everse、 pa (p1tR, p2,F)の計算結果は 1~Reverse x 2~Forward、 pa (p]1R, p21R)の計算結果は
1 - Reverse x 2-Reverseの各領域に格納される。
S 2 0 8においては、 プライマ 及び増幅産物間の相補性スコアを計算する。計算 結果は、 図 5に示す、相補性計算結果の領域 1 7における、 プライマー候補と増幅産物と の相補性の計算結果の領域 2 1に格納される。例えば、 増幅部 と X2とを選ぶ組み合わ せにおいては、 pa (pl1F, x21)及 D¾)a (p11F， [x2,])の計算結果は forward x 2-Product, pa (p11R, x21)及 U¾)a (p，1R, [x21])の計算結果は 1" everse x 2"Product、 pa (p21F, x„)及 U¾)a (p21F, [x„]) の計算結果は 2-Forward x 1 -Product . pa (p21R, x„)及び pa (p21R, [x„])の計算結果は
2- Reverse x 1-Productの各領域に格納される。
S 2 0 9においては、上記 S 2 0 7及び S 2 0 8で計算済みとなった組み合わせにおけ るプライマ Hg¾変更フラグを FALSEに変える。 S 2 1 0においては、上記 S 2 0 7又は S 2 0 8で得られた相補性スコアの計算値が、 上記 S 2 0 3において設定した上限値を超えているものと、 上記 S 2 0 7及び S 2 0 8で 得られた相補性スコアの計算値が、 上記 S 2 0 3において設定した上限値を超えていない ものとで分岐する。 当歸算値が当該上限値を超えている場合は、 S 2 1 1へ、 そうでな し、場合は、 S 2 1 3へ進む。
S 2 1 1においては、上記 S 2 0 7又は S 2 0 8で得られた相補性スコアの計算値が、 上記 S 2 0 3において した上限値を超えたプライマ を、相補性の計算の対^)、 らはずすために、計算すべきプライマ Η ^を、次の優先順位のプライマ Η¾Μへ書き換 える。
S 2 1 2においては、上記 S 2 1 1で優先順位が^ ±げられたプライマ H¾tを含む組 み合わせについて、再び上記 S 2 0 7及び S 2 0 8の計算を行う必要があるため、 当該計 算を行うべき当該組み合わせのプライマー候補のフラグを、 全て TRUEに書き換える。 その 後、再び S 2 0 5へ戻る。
S 2 1 3においては、増幅部位から 2箇所を選ぷ全ての組み合わせにおいて、 上記 S 2 0 7及び S 2 0 8の計算結果が、 S 2 0 3で設定された相補性スコアの上限値以下の条件 を満たし、 且つ優先順位の最も高いプライマ を、増幅反応に用いるプライマーとし て決定し、 出力することができる。 このとき、例えば、決定されたプライマーの配列力墙 き込まれたファイレ形式で出力を行うことができる。
< 5 プライマー ¾t†^ーバ装置〉
本発明のプライマー iSitii"—ノ壊置は、核酸の複数の部位を増幅するためのプライマー を、他のコンピュータによって ¾|十する際に、 ネットワークを介して通信することができ るサ一/ 置であって、 プライマ HSffiと増幅産物との相補性を検証する処理を行うこと を とするサ一/ 置である。 ネットワークを介した他のコンピュータには、 端^置 及び他のサーバ装置力《含まれる。 ネットワークとしては、 インタ一ネットや LANなどが 挙げられる。本発明のサーバ装置は、通信のための受信部（V)、送信部（VI 11)、及び、上 IB*発明のプライマ一 ¾1十装置と同様に処理部 (VI)及び記憶部 (VII)を有するものであ リ、 受信部 （v)、送信部 （VIII) を備える以外は上記本発明のプライマ一 isi十装置と同様 の/ \-ドウ Iァ構成を有する （図示せず)。 本発明の一実施形態であるプライマー ¾ΙΗ» "—バによるシステムの例を図 9に示す。 こ の例においては、 サ一ノ 置 30と端 置 31、 32、 33■ ■ ■力、'、 インターネット を介して接続されている。サ一/ 置は、 30は、本発明のプライマー ¾|十プログラムが 記録されており、 ウェブサーバとして機能するものである。端 置 31、 32、 33 - ■ 'には、 ウェブサイ卜を閲覧するための閲覧プログラムが記録されている。端末装置 3 1、 32、 33■ ■ ■は、サーバ装置 30にアクセスすることにより、 プライマ一 fgf十を 行うことができる。端 置 31、 32、 33■ ■ ■も、通信のための受信部及び送信部 を有することを除いては、 本発明のプライマ一 ¾1十装置と同様のノ\—ドウエア構成を有す る。 本発明のプライマ一 HI "—/壊置の記憶部は、 ユーザ或いはユーザの属するグループ ごとに、 ia図 5に示したような一連のデータ領域を設けている。 これら領域は、 それぞ れユーザ識別子やグルーブ識別子などによって MSIJされている。
<5-1. 処理フローチャート >
図 10に、本発明のブラィマーサー/、5!†^置を用しゝたブラィマー Ιδϊ十方法の一例を示 すフローチャートである。 当該フローチャートにおいては、 S 3 0 5でプライマー |¾|十処 理が行われる。 S 3 0 5で行われる処理は、 図 7及び図 8で示したとおりである。 本発明のサーバ装置は、 S 3 0 1において、 クライアン卜からサーバに接続の要求があ るまで待つ。 S 3 0 2において、 クライアントに入力画面を送信する。 ここでは、例とし て、本発明のサーバに醒サーバの機能を持たせて、 TCP/IPによって HTML形式で送信するこ とを想定する。一方、 クライアント側はウェブブラウザによって入力画面を表示し、 以下 の入力等を行う。 S 3 0 3においては、 クライアントからのプライマ一の設計に必要な情報力《入力される のを待つ。一方、クライアント側は、例えば塩基配列を入力する場合は、最も一般的な FASTA 形式で入力する。
S 3 0 4においては、入力された情報が正しいかどうかを判定する。入力された が 正しければ (YES)、 S 3 0 5に進み、間違ってしゝれば（No)、 S 3 0 9に進む。 S 3 0 9に おいては、 入力が間違っていることを示す画面をクライアン卜に送信する。
S 3 0 5においては、入力された情報をもとに， プライマ一の設計を行う。 このアルゴ リズムは、 図 7及び図 8と同様である。
S 3 0 6においては、 プライマ一151†が成功であるかどうかを判定する。 プライアー設 計が成功であれば（YES)、 S 3 0 7に進み、 であれば（No)、 S 3 1 0に進む。 S 3 1 0においては、 1SI十に失敗したことを示す画面をクライアン卜に送信する。
S 3 0 7においては、設計した結果及びそれを表示する画面をクライアン卜に送信する 。 S 3 0 8においては、クライアン卜からの 力《切断さ; ΙΧ^は *YESに進み、終了する。な お、 このタイミングに限らず、 し、つでもクライアン卜から^が切断さ; fx iば同様に終了 処理をおこなって終了することができる。
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限され るものではない。 なお、 以下において、 プライマ を単にプライマ一と IB«すること がある。
以下の実施例では、本発明のプライマー設計プログラムを用いて、マルチプレックス PCR 用のプライマ一を mi十した。本発明のプログラムによって最も好ましい判断されたプライ マ一と、 それより優先順位の低いプライマーとをそれぞれ用いて、 実際にマルチプレック ス PCRを行った。 そして、 プライマ一同士が誤って結合しなしゝ条件下で、 PCR産物と他のプ ライマーとの結合力PCRの効率に及ぼす を検証した。検証は、 2箇所の一塩基多型（S P )部位を増幅するマルチプレックス PCRの系で行った。プライマー 151十から検証までの概略 は、 以下のとおりである。
< 1 > 2箇所目の SNP部位について、 シングル PCR用のプライマー設計ソフトウェアで、 プ ライマ を独立に選び出した。
< 2 >各プライマー間の相補性を計算し、誤って結合する可能性の低いプライマ一の組み 合わせを選び出した。
< 3 >上記く 2 >で選んだプライマ一の組み合わせについて、 PCR産物とプライマ一の相 補性を計算した。
< 4 >上記 < 2 >で選んだプライマーの組み合わせで、 マルチプレックス PCRを行った。
< 5 >上記く 4 >の PCR産物の増幅量を測定した。 < 6 >上記 < 3 >の相補性計算結果とく 5 >の測定結果とを]^し、 PCR産物-プライマ 一間の相補性と PCR産物の増幅量の間に相関があるか調べた。
以下、 く 1 >〜く 6 >の手順について、 図 1 1を参照して詳しく述べる。 なお、 本実施 例では、 マイクロソフト社ウィンドウズのコマンドプロンプトを使用した。
< 1 > 2箇所の SNP部位それぞれについてのプライマ Hl¾fの選出
SNPのデータベースの中から、 塩基配列 "NT_022184"を取得した。 この塩基配列に含まれ る 2つの SNPを増幅タ一ゲットにした。 これら SNPの" refSNP ID"はそれぞれ" rs3770799"及 び" rs3770797"である。本実施例においては、塩基配列" NT— 022184"の中から 20kbpの塩基配 列だけを取り出し、 プライマー設計ソフトに入力した。 プライマー 151十ソフトウェアとし ては、 シングル PCRのプラ イ マー設計ソ フ トウ エ ア "pr imer 3" ( http://frodo. wi . mit. edu/pr imer3/pr imer3— code. html ) を用しゝた。
(なお、 "NT_022184"のすベての塩基配列をプライマ一設計ソフ卜に入力することもでき る。 ただしその場合は、塩基配列の大きさが膨大であることから、 プライマ HSffi選択に 多くの時間を費やすことになる。）
このようにして、 それぞれの SNP部位のプライマ を ¾3Ϊに選び出した。 く 2 >プライマ一間の相補性の計算
上記 < 1 >におけるプライマー選出で用いた" pr imer 3 "に付属のソフ卜ウェア" DPAL"を 使用し、増幅ターゲットである SNP :' 33770799"及び X2:"rs2770797 "に対するプライマ H^t群の中から 1つずつ候補を選び出し、プライマー間の 3'末端での相補性を示すスコァ (3'末端の口一カルァライメントスコア） を計算した。 なお、 "DPAL"は、 口一カルァライ メン卜ならびにグローバルァライメントのスコアを計算するソフトウエアで、実行時に、 3'末端固定かそうでなし、かを選ぶことができる。 プライマー間の相補性の計算の結果、 出力されたファイルに含まれる情報の一部を図 1 2に示す。図 1 2には、当該出力ファイル中の、 X,に対するプライマー P1A (フォワードブラ イマ一 "ρ, ' &リバースプライマ一" p,w")と、 X2に対するプライマー Pa (フォワードプライ マ一" P2AF" &リバースプライマ一 "PMR")との相補性の計算結果について書かれた部分の文字 列を示す。 当該 1 ^は、 ァライメントスコアを計算する 2つのプライマー配列 4 1、 3'末 端のロー力レアライメントスコアであることを示す†f¾4 2、 ローカルァライメントスコ ァ 4 3、 ァライメントの対象となった配列の長さ 4 4、及び、 2つの配列でマッチする塩 基の場所を示す情報 4 5を含む。 結果として、次の 4組のプライマ一の組み合わせを選び出した。 これらの組み合わせに おいて、それぞれのプライマーは、 X,に対するプライマ ~P1A ("P1AF" & "ρ1Λ?")及 OP1B("p1BF" &
"P1BR")と、 X2に対するプライマ一 PaC'PaF" & "P2AR")及び P2B ("P2ff" & "Ρ∞")とからなる群か ら選ばれる。 組み合わせ [ 1 ] (Ρ,Α-ΡΖΑ)：
/, ,/ .
PlAF - CCCAAGAGGCAAGCAGTTAG 翻番号 υ
PlAR - GGAAGTCTTGGAGGTTGCTG (配列番号 2)
P2AF - TTGTTTCCTTCCCTGGCATA 翻番号 3)
P2A ■ TGCTGTTTTTGCTGTTCTGG (配列番号 4)
組み合わせ [ 2 ] (Ρ,Α-Ρ»)：
PlAF · CCCAAGAGGCAAGCAGTTAG (配列番号 1 )
PlAR - GGAAGTCTTGGAGGTTGCTG 翻番号 2)
P2BF - CCCAATCCTCCCTCCATTTA (配列番^ 5)
,, ,, ·
POT ■ TGAGCTTTGCAAGGATGTTG (配列番^ 6) 組み合わせ [ 3 ]
Figure imgf000047_0001
：
"PIBF" : TCCTGGAGAGCAGAGTGGAT (配列番号 7)
"PIBR" : GGGGTCCCTGGACTACACTT (配列番号 8)
P2AF - TT6TTTCCTTCCCTGGCATA (配列番号 3)
/, ,/ ·
P2AR · TGCTGTTTTTGCTGTTCTGG (配列番号 4) 組み合わせ [4]
Figure imgf000047_0002
：
"PIBF" : TCCTGGAGAGCAGAGTGGAT (配列番号 7)
"PIBR" : GGGGTCCCTGGACTACACTT 画番号 8)
"P2BF" : CCCAATCCTCCCTCCATTTA (配列番¾5)
,' // ·
P2BR - TGAGCTTTGCAAGGATGTTG (配列番 )
< 3 >増幅産物とプライマーとの相補性の計算
上記 < 2 >で挙げたプライマ一の組み合わせのそれぞれについて、増幅産物とプライマ —との相補性の計算を行った。 当該プライマーを用いて核 幅を行ったときに得られる 増幅産物の配列を求めた。増幅産物の配列を求める方法としては、 テンプレートの配列と プ ラ イ マ 一 の 位 置 か ら 求 め る こ と が で き る 。 或 い は 、 e-PCR (http： //www. ncbi . nlm. nih. gov/sut i I s/e-pcr/)のようなソフトウェアを使用して求 めることも可能である。 当該ソフトウェアを使用して求めた増幅産物の配列を以下に示す
X,に対するプライマー こよる増幅産物 "PI A_product"：
CCCAAGAGGGMGCAGTTAGAAAATGCCACTAGTGATCCAGATAAAGGACATAAACCCATGCTGTTTTTAAAATGCTGTT GCTTCCATTTCTTTGCAAGTTAAATGCAAAAGCAACTGTTTTTATGCTACTATATTCATGCAGGCATTTTTCTGATGTAG CTAATTGTTCCAATGTAAATGTTGTAAGTTGTACACATATTTGTTCTATACAAAATTTACTGTGTAATTTTTAAGATACT 丌 TTGATATTATTTACCTACATTTTATGAGAAGTGTGAAMGTTMGATGMGAGTATGCGTATTTTCAGCCTAAGTTTG TATAATTGTACCATGAGTTTGGAGMGATTMCATAAGATTTAGCAAATGAAAATGCTGTTACTTGGAGAGGTGATTATT GCTTCCCACTGACTCTTCGGGCCA∞TGCCACTGCCTTGGTGCA(^TGCGMCTAGAAGATGGCATACGCTTCCTGGA GAGCAGAGTGGATCCCATGTGCCAGCCAGGCCCCCAAAAACTTCTCCAAAGAGTTTTCCACTCCGTTTCTAGGAAACAAT TCTACTTTCTTTCTCCCAGCAACCTCCAAGACTTCC (配列番^ 9)
X2に対するブラィマ ~f こよる増幅産物" P2A_product"：
TTGTTTCCTTGCCTGGGATAAGTATGTATTGAAAGTGTCAAAATGAGTCCTTATCTGGAAACTTTTGTGAGAGAAAACCA GTAGGMCAATGTATAAAGAGGATATAGATTTATAAAAATTCACCAAAATCTGAMGACGAAGAAATGGGCCMGATCCC GAAGGCCCATTTACMCATCCTTGCAAAGCTCAGAAAACGAAAATTCAAGCCAAGGATCCTTCCATCCACCTCTAAATM CTCCACATCCTCATT(XJMTGCATGCTGGTTCTGTGAGCT GGT(X;CTGTT GCTTTTGTTTACTCATTTATGAAATG GAAATMTMCMTMTACCTTCTTTATAGAGTTGTTGTGAAGGTTACATGGMTMTCCATGGAAGTACCTAGGAAAGT GGTGAGGAAATATGAATATTGAAAAAAGTATTGGGTATAATTCCTAAAAATAAAAAGGATAGAATAATATTTTAGACAGA ACTCXXJA GAGAMTAACCACACCTTTCTACTTTTCTCCAGAACAGCAAAAACAGCA (配列番号 10)
X,に対するプライマ" Ρ,Βによる増幅産物 "P1B_product"：
TCCTGGAGAGCAGAGTGGATCCGATGTGCCAGCCAGGCCCCCAAAAAGTTCTGGAAAGAGnTTCCACTCCGTTTGTAGG AAACAATTCTACTTTCTTTCTCCCAGCMCCTCCAA6AGTTCCTAGMTTCTTTGTAGTGAAAAGGGAGTATTTTTTTCC TAAACAACTTATGTTGATTTGTMCCAGTCTACAATGTCATGAAGCATAGTAAAAAGCGTGTGGTGGGACCTCTATGGCG GCTGAGTCAAAGGAGTGAGATGGATTGTTACAGGATGACTAATTMGGGGAMGGCTTCGTGAAMGGMGTGAAGGCCT GAGTGACTTGATGGTTCCTTCCCCTGGAATTTTATAGAGGAAATTTAAATCAGTAMCAGATTTGAGGAGTCAAGATAAA
■ATTTTACCAGGCCCCAAGGGGCAGAAGAMGGAAACCAAGGGAATGGTCATCMGAAATACATATAGTTTCATCCA GTGGTTCTCAAAGTGTAGTCCAGGGACCCC (配列番号 11 ) X2に対するブラィマ一 Paによる増幅産物〃 P2B_product"：
CCCMTCCTCCCTCCATTTAATCTACCATTTCCAAGTTTGAAATAAAGAATCCAAGTGTTCAAATTCAAAGTGMGAACT GGTGAAAATTCTGMTGTGAAGTTATTTTGTAATTGATTCATCGATTTCCCACTACGTCTTTAGGAAGGAGTTAATAGTG CTATAAAATGCCCCCTCTGAGGATGGMTTTTTGATAGGAGCCCATTTGTGAGGAGGGAMTGATTMGCATTACAGTAT TTAGTTTATTGTTGCCCTGAGTAGTGACAMTGCCAMGTAATGTGGGMGGACGGAGGMGAGGGTATTGAATAGACAG GTTCMCACGAGTATTTACGCTGAGMTACTCAGCAGTGCCTCGTGGTTGTTTCCTTCCCTGGGATMGTATGTATTGAA AGTGTGAAAATCAGTCCTTATCTGGAMCTTTTCTGAGAGAAAACCAGTAGCMCMTGTATAAACAGGATATAGATTTA TAAAAATTGACCAAMTCTGAAAGACG GAMTGGGCCMGATCCCCAAGGCCCATTTACMCATCCTTGCAAAGCTGA
(配列 12) 次に、 く 2 >と同様の手順で、 プライマー及び増幅産物それぞれの中から 1つずつ配列 を選び出し、 プライマ一と増幅産物との 3' 5| ^固定の口一カルァライメントスコアを求め た。 ここでは、 プライマーの 3'末端を固定した場合のスコアのみ力《分かればよ <、 増幅産 物の 3'末端固定のスコアまで求める必要はない。
相補性の計算を行ったプライマーと増幅産物との組み合わせは以下のとおりである。 組み合わせ [ 5] (Ρ,Α- -P2A_product)
組み合わせ [ 6 ] (Ρ,Α- -P2B_product)
組み合わせ [7 ] (Ρ,Β- — P2A_product)
組み合わせ [ 8] (Ρ,Β- -P2B_product)
組み合わせ [9 ] (pa- -P1A_product)
組み合わせ [ 1 0] (P2B-P1A_product)
組み合わせ [ 1 1 ] (P2A-P1B_product)
組み合わせ [ 1 2] (Pffi-P1B_product) プライマ一と増幅産物との間の相補性の計算の結果、 出力されたファィルに含まれる情 報の一部を図 1 3に示す。 図 1 3には、 当該出力ファイル中の、組み合わせ [ 5 ] (P1A- P2A_product)による相補性の計算結果について書かれた部分の文字列を示す。当該難は 、 ァライメントスコアを計算するプライマー配列 5 1及び増幅産物配列 5 2、 3' の口 一力ルァライメントスコアであることを示す1 tf¾5 3、 口一カルァライメントスコア 5 4 、 ァライメントの対象となった配列の長さ 5 5、 及び、 2つの配列でマッチする塩基の場 所を示す情報 5 6を含む。 さらに、 < 2 >で得られたプライマ一間 （組み合わせ [ 1 ] 〜 [4]) の相補性、 及び、 く 3 >で得られたプライマーと増幅産物との間（組み合わせ [ 5：！ 〜 [ 1 2])の相補性に ついての計算結果から、 必要なデータを抜き出してまとめたものを下記表 1、 2及び 3に 示す。 下記表 1は、く 2 >で得られたプライマー間（組み合わせ [ 1 ] 〜 [4])の相補性の計 算結果における、 口一カルァライメントスコアの合計 （total score) , ァライメントの対 象となった配列の長さの合計（total length)、及びそれらの比（ratio: total score / total length x 100) を示す。 表 1
Figure imgf000050_0001
下記表 2は、 く 3 >で得られたプライマーと増幅産物との間 （組み合わせ [ 5] ~ [ 8 ]) の相補性の計算結果における、 ローカルァライメントスコアの合計（total score)、ァ ライメン卜の対象となった配列の長さの合計 （total length). 及びそれらの比 （ratio: total score / total length x 100) を示す。 なお、組み合わせ [5] ~ [8] は、増幅 産物として X2を含む増幅産物を得る反応系中 Iこ ¾するプライマー及び増幅産物の組み合 わせである。 表 2
Figure imgf000051_0001
下記表 3は、 < 3 >で得られたプライマ一と増幅産物との間 （組み合わせ [9] 〜 [： 1 2]) の相補性の計算結果における、 口一カルァライメン卜スコアの合計 (total score) 、ァライメン卜の対象となった配列の長さの合計 (total length)、及びそれらの比（ratio: total score / total length x 100) を示す。 なお、組み合わせ [9：！ 〜 [12] は、増 幅産物として を含む増幅産物を得る反応系中に存在するブラィマー及び増幅産物の組み 合わせである。 表 3
primer - PCR product
total score total length ratio
[ 9 ] Pa with P1A _product 38 58 65.5
[10] Pa with P1A_product 31 63 49.2
[11] Pa with P1B_product 35 56 62.5
[12] PJB with P1B_product 31 65 47.7 ここで、既に述べたように、 "score"はローカルァライメントのスコアであり、 " length" はァライメントの対象となった配列の長さであることから、 より木きい l ength、 及びより 小さい scoreは、相補性の低さを表す。従って、 l engthに対する scoreの割合として示され る ratioは、その値が小さいほど、対象となる 2つの配列の相補 ¾Λ《低いことを表す。これ は、すなわちプライマーの条件として好ましいことを示すといえる。 このことを、次のく 4 >で実証した。
< 4 > 選出したプライマーを用いることによる増幅量の検証
lt5< 2 >で選び出した組み合わせ [ 1 ] ~ [4 ] の 4通りの組み合わせによるプライ マーをそれぞれ用いることにより、 4通りのマルチプレックス PCRをおこなった。マルチプ レックス PCRは、 3 0サイクル行った。
P C R産物の増幅量は、インべーダ反応を利用して測定した。マルチプレックス PCRによ つて、 :' 83770799"を含む増幅産物と、 X2: "rs2770797"含む増幅産物とが得られる。 こ れら SNP ( 及 U¾) がそれぞれインべーダ反応によって検出されるため、 それぞれの増幅 産物の量を調べることができる。 インべーダ反応においては、測定すべき 2つの PCR産物に対応し、かつ波長の異なる蛍光 物質が付された 2つのプローブを使用することによって、 2つの PCR産物量が同時に測定で きるようにした。ィンベーダ反応が進むにつれて、それぞれの PCR産物において蛍光 が 上昇するが、その上昇 ¾gl*PCR産物の増幅量に応じて変化する。すなわち、増幅量が多い 場合は蛍光 ¾gの上昇 が速ぐ、 逆に増幅量が少ない場合は傾向 の上昇が遅くなる 。このようにして PCR産物量を測定した結果を図 1 4及び図 1 5のグラフに示す。それぞれ の曲線から、 図に言 B«のプライマ一一増幅産物の組み合わせが含まれる反応系によって得 られた増幅産物の量を知ることができる。 さらに、 これらグラフにおける増幅曲線の傾きを最小二乗法で計算した。 この計算結果 を、 以下の表 4 ( a ) 及び （b ) に示す。
表 4 ( a ) においては、 SNP X2を含む増幅産物を得るための反応系に関して、増幅曲線 の傾きを、使用したプライマ一の組み合わせ、 当該プライマー間の相補性指数 （すなわち 上記表 1で得られた ratio値)、 反応系中に するプライマ一一増幅産物間の組み合わせ 、当該プライマ一一増幅産物間の相補性指数（すなわち上記表 2で得られた ratio値）など とともに示す。
表 4 ( b ) においては、 SNP X,を含む増幅産物を得るための反応系に関して、 増幅曲線 の傾きを、使用したプライマ一の組み合わせ、 当該プライマー間の相補性指数 （すなわち 上記表 1で得られた ratio値)、 反応系中に? ¾するプライマ一一増幅産物間の組み合わせ 、当該プライマ一一増幅産物間の相補性指数（すなわち上記表 3で得られた ratio値）など とともに示す。
Ξ 表
Figure imgf000054_0001
( a )
>；； π
系中に る 麵中に る
プライマ" 0 m インべ"^ こより i¾
：； プライマ" "FB OT
激 na プライマー
ffilifB謝 (ratio) 細される SNP 一 ^ プライマー - rnn
¾ϋΒ^¾ (ratio)
[1] P1A-P2A 31.4 P2A_praduct χ2 [ 5】 P1A— P2A_product 44.8 0.0422
[2] P1A - P2B 44.6 P2B_praduct X2 [ 6】P1A— P2B_product 45.3 0.0353
[3]「1B— P2A 30.3 P2AjDroduct X2 [ 7】P1B— P2A_product 50.8 0.0218
50 P2B_praduct X2 [ 8 ] PiB-P2B_product 55 0.0154
表 4 (b) N3 系中に?^る JSS系中に i¾ る
プライマ ~<7) プライマ- ^の インべ
騸翻 一ダ~¾こより
プライマ一 - プライマー -慟蒲
ift ^^S (ratio) される SNP j)
識 (raSo)
31.4 P1A_praduct Χι [ 9】P2A— P1A_praduct 65.5 0.0015
[2] PiA-P2B 44.6 PIAjDroduct Χι [10] P2B— P1A_praduct 49.2 0.0166
30.3 P1B_product Xi [11] P2A-P1B _product 62.5 0.0019
50 PIBjDroduct Xi [12】P2B— P1B_product 47.7 0.0138
上記表 4 ( a ) 及び （b ) がそれぞれ示すように、 増幅曲線の傾きは、 プライマ一間の 相補性指数とは相関を示しているとはいえないが、 プライマ一一増幅産物間の相補性指数 とは良し湘関を示していることがわかる。すなわち、 プライマ一一増幅産物間の相補性指 数 （ratio値） を求めることによって、増幅量を評価することができることがわかる。 以上より、 プライマ一間の相補性指数と、 プライマ一一増幅産物間の相補性指数と力《総 合的に良好である、 [ 2 ] の組み合わせ （すなわち P1A"P2B) のプライマーが、 SNP X,を含む 増幅産物及 ϋ¾ΝΡ Χ2を含む増幅産物の両方を効率よく合成しており、従って、 ft®なブラ イマ一であると評価することができる。
このように、複数の増幅ターゲットを効率よく合成することは、従来のようにプライマ 一間の相補性の判定のみを行うよリも、 プライマ一一増幅産物間の相補性の判定をさらに 行うことが大きく^していることが証明された。
上 においては、本翻の麵における具 な形態につし、て示したが、本翻は、 これらに H¾されることなく他のいろいろな形態で H»ることができる。 このため、上記実 翻はあらゆる点で よる例示に過ぎず、 l¾¾的に鍵してはならない。 さらに、請求の画 の に属する ¾は、すべて本 ¾B月の ¾H内である。

Claims

1 . 核酸中の複数の部位を増幅するための一連のプライマ一を設計するための装置で あって、
( I )プライマ HgMと増幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Aを含む処理命 令を入力するための入力部と； 請 (I ! ) 前記計算命令 Aを受けて、
の
複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについ 範
て、前記 2つの部位のうち一方の部位についての IB囲プライマ の配列と、 つ のうち他方の部位において得られる ffilHii幅産物の配列との相補性を計算しスコァ化する ことを含む処理を行うことによって、
己複数の部位を増幅するための一連のブラィマーを決定するための処理部と；
(I I I )複数の前記プライマ からなるプライマ一抜群であって、 己複数の増幅 すべき部位のそれぞれに対応するプライマ HS¾群のデータと、
複数の ΙΒϋ幅産物からなる増幅産物群であって、 複数の増幅産物のそれぞ れは、 llBi 幅すべき部位のそれぞれにおいて、 Bプライマ を用いた増幅反応に よって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
己処理部によって計算された ΪΒ相補性の結果と、
fliii己処理部によって決定された ffilS—連のプライマ一と、
を少なくとも格納するための記憶部と；
(IV)前記処理部によって決定された前記一連のプライマ一を出力するための出力部と； を備える、 プライマ一 ¾1十装置。
2. ΙΐίϊΒ入力部（I )で入力される前記処理命令は、 riBプライマ HHi群を選出させ るための選出命令 Bをさらに含み、 Mie処理部 (I I) において実行される MIB処理は、前 ΙΒϋ出命令 Βを受けて、 少なくと も増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の情報、及びプライマー ¾1十 パラメータに基づいて、 プライマ HSffi群を選出することをさらに含み、
B記憶部 (I I I)には、少なくとも前言 B±曽幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅 すべき部位の it¾、及び misプライマ一 ist十パラメータがさらに欄される、請求の麵 第 1項に記載のプライマー ΙδΙ十装置。
3. ¾51己プライマ一 ¾1十パラメータが、菌温度、 G C含量、塩基長、 増幅産物長、 塩基配列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位についてのプライマー対のプライマー 分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第 2項に 記載のプライマー ¾|十装置。
4. 前記入力部（I)において入力される前記処理命令は、前 iEl¾幅産物を計算させる ための計算命令 cをさらに含み、
IB処理部 (I I) において実行される ίΒ処理は、 MIS計算命令 Cを受けて、 IB複数 の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び ISプライマー i^jfの配列から、増幅 によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含 み、
iiB記憶部 (i n)には、少なくとも fiirte^幅対象の核酸配列がさらに欄される、請求 の範囲第 1項に記載のブラィマー 置。
5. 前記入力部（I)において入力される前記処理命令は、前記プライマー候補同士の 相補性を計算させるための計算命令 Dをさらに含み、
1B処理部 (I I) において実行される前記処理は、 HB計算命令 Dを受けて、 複数 の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、前記 2つの部位のうち一方の 部位についてのプライマ Hgffiの配列と、前記 2つの部位のうち他方の部位についてのプ ラィマ の配列との相補性を計算することをさらに含む、請求の範囲第 1項に ΪΒ«の プライマー ¾1十装置。
6. 核酸中の複数の配列を増幅するための一連のプライマーを決定する処理を、 コン ピュータに行わせるための、 プライマー設計プログラムであって、
複数のプライマー からなるプライマ一^ I群であって、複数の増幅すべき部位のそ れぞれに対応するプライマ 群のデータと、
複数の増幅産物からなる増幅産物群であって、 MIS複数の増幅産物のそれぞれは、 ΒίΠΗ 増幅すべき部位のそれぞれにおいて、 ffif己プライマ Η^ΫΙを用いた増幅反応によって得る ことができるものである増幅産物群のデータと、
が少なくとも与えられることにより、
ISプライマ HS tと iBig幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Αを受けて、 βίίϊΒ複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについて、 ΗΪΪΪΒ 2つの部位のうち一方の部位についての Bブラィマ HS fの配列と、 ΐϊϊ己 2つのう ち他方の部位において得られる Βί^ϊ産物の配列との相補性を計算しスコア化すること を実行することを含む工程を行うことによって、 ΙΒ複数の部位を増幅するための一連の プライマーを、前記複数のプライマ 群から決定するための処理をコンピュータに行 わせるための、 プライマー設計プログラム。
7. 前記プライマ Hg¾群を選出させるための選出命令 Βを受けることにより、 少な くとも増幅対象となる核酸の配列、 I3核酸中の増幅すべき部位の 、 及びプライマー iSH†/《ラメータに基づいて Bブラィマ HS*S群を選出することを実行することを含むェ 程がさらに行われる、請求の範囲第 6項に記載のプライマー設計プログラム。
8. Bプライマ一 ¾l十ノ ラメータか 温度、 G C含量、塩基長、増幅産物長、 塩基配列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位についてのプライマー対のプライマー 分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第 7項に 記載のプライマー設計プログラム。
9. Βϋ幅産物を計算させるための計算命令 Cを受けることによリ、 ¾ij|B複数の増 幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び itsプライマ Htii の配列から増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することを実行することを 含む工程がさらに行われる、 請求の範囲第 6項に記載のプライマ一誕十プログラム。
1 0. 前記プライマ 同士の相補性を計算させるための計算命令 Dを受けること により、 B複数の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、 i己 2つの 部位のうち一方の部位についてのブラィマ H®aの配列と、前記 2つの部位のうち他方の 部位につしゝてのプライマ H^iの配列との相補性を計算することを実行することを含むェ 程がさらに行われる、請求の範困第 6項に iB«のプライマー 151十プログラム。
1 1 . ネッ卜ワークを介して他のコンピュータと通信可能な、核酸中の複数の部位を 増幅するための一連のブラィマーを設計するためのサーノ装置であって、
(V) 他のコンピュータから送信されてくる、
プライマ と増幅産物との相補性を計算させるための計算命令 Αを含む処理 命令を受信するための受信部と；
(VI )前記計算命令 Aを受けて、
複数の増幅すべき部位から 2つの部位を選択する場合の全ての組み合わせについ て、 ήίΠ52つの部位のうち一方の部位についての前記プライマ HS¾の配列と、 つ のうち他方の部位におしゝて得られる jlSlg幅産物の配列との相補性を計算しスコァ化する ことを含む処理を行うことによって、
HB複数の部位を増幅するための一連のプライマーを、 fliilB複数のプライマ 補群から決定するための処理部と；
(VI I)複数の Bプライマ からなるプライマ一抜群であって、 MIB複数の増幅 すべき部位のそれぞれに対応するプライマ 群のデータと、
複数の前 ΙΒϋ幅産物からなる増幅産物群であって、前記複数の増幅産物のそれぞ れは、 Β^Φ畐すべき部位のそれぞれにおいて、 ΙΒプライマ HSffiを用いた増幅反応に よって得ることができるものである増幅産物群のデータと、
flit己処理部によって計算された前記相補性の結果と、
MB処理部によって決定された 連のプライマーと、
を格納するための記憶部と；
(VI I I) B処理部によって決定された fj|5—連のプライマーを、他のコンピュータに 送信するための送信部と；
を備える、 プライマー識 ーバ装置。
1 2. ΪΒ受信部 (V)におし、て受信される麵己処理命令は、 ¾ίίΙ5プライマ 群を 選出させるための選出命令 Βをさらに含み、
B処理部 (VI) において実行される it己処理は、 MiSi出命令 Bを受けて、 少なくと も増幅対象となる核酸の配列、前記核酸中の増幅すべき部位の lf¾、及びプライマ一 ϊδϊ十 パラメータに基づいて、 Bプライマ HSil群を選出することをさらに含み、
IB記憶部 (VI I)には、少なくとも ilB^幅対象となる核酸の配列、 IB核酸中の増幅 すべき部位の龍、 及び ISプライマ一1SI十パラメータがさらに欄される、請求の範囲 第 1 1項に記載のプライマ一設計サーバ装置。
1 3. 読ブラィマ一 ¾1十メ《ラメータが、融解 SJt、 G C含量、塩基長、増幅産物長、 塩基配列の目的部位への特異性、及び、 1つの部位についてのプライマー対のプライマー 分子間における相補性又はプライマー分子内における相補性を含む、請求の範囲第 1 2項 に ΪΒ«のブラィマ一 ΙδΙΗί·—/く装置。
1 4. S受信部 (V)において受信される IB処理命令は、 Bi^幅産物を計算させ るための計算命令 Cをさらに含み、
読処理部 (VI) において実行される ίίΠΕ処理は、 計算命令 Cを受けて、 ΜΙΒ複数 の増幅すべき部位それぞれにおいて、少なくとも増幅対象の核酸配列及び ΪΒプライマー igffiの配列から、増幅反応によって得ることができる増幅産物を計算することをさらに含 み、
IS記憶部（VI I)には、少なくとも ΙΞϋ幅対象の核酸配列がさらに欄される、請求 の範囲第 1 1項に記載のブラィマー MH —/《装置。
1 5. ¾5¾受信部 (V)において受信される B処理命令は、プライマ HSffi同士の相 補性を計算させるための計算命令 Dをさらに含み、
己処理部 (VI ) におし、て実行される 処理は、 B計算命令 Dを受けて、 HB複数 の増幅すべき部位から 2つの部位を任意に選択する場合の、 ilB 2つの部位のうち一方の 部位についてのプライマー^ iの配列と、前記 2つの部位のうち他方の部位についてのプ ラィマ H ^の配列との相補性を計算することをさらに含む、請求の範囲第 1 1項に ie« のプライマー設計サーバ装置。
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