KR20210067684A - 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 기술에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드 세트들의 모든 후보 조합의 다이머 생성 여부를 확인하는 종래의 방법과 달리, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성이 감소된 조합을 새로운 레퍼런스 조합으로 제공하며, 상기 새로운 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 다이머가 모두 제거된 조합을 제공함으로써, 복수의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 신속성 및 정확성을 가지고 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는 기술에 관한 것이다.
핵산 증폭 방법인 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형으로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki 등, (1985) Science 230, 1350-1354).
PCR-기반 기술들은 타겟 DNA 서열의 증폭뿐만 아니라 생물학 및 의학 연구 분야에서 과학적 응용 또는 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 역전사 효소 PCR(RT-PCR), 분별 디스플레이 PCR(DD-PCR), PCR에 의한 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), 임의적 프라이밍 PCR(AP-PCR), 멀티플렉스 PCR, SNP 지놈 타이핑, 및 PCR-기반 지놈 분석이 있다(McPherson and Moller, 2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY).
PCR-기반 기술 중 멀티플렉스 PCR은 하나의 튜브 내에서 복수의 올리고뉴클레오타이드 세트(전방향 및 역방향 프라이머, 및 프로브)의 조합을 이용하여 하나의 타겟 핵산분자 또는 복수의 타겟 핵산분자의 복수의 영역을 동시에 증폭 및 검출하는 것을 의미한다.
멀티플렉스 PCR을 위한 복수의 올리고뉴클레오타이드 세트의 조합을 제공하기 위해서는 특정 타겟 핵산분자의 복수의 핵산서열을 최대한의 커버리지로 검출할 수 있는 성능(performance)를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 디자인하여야 하고, 이러한 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀을 제공하여야 한다. 상기 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드(프라이머 및 프로브)는 Tm 값 및 뉴클레오타이드의 길이 등을 고려하여 디자인되고, 앰플리콘의 사이즈 및 다이머 형성을 고려하여 올리고뉴클레오타이드 세트가 제공된다.
이러한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하기 위해서는 복수의 올리고뉴클레오타이드 세트 사이에 간섭(interference)이 없는 것이 중요하며 이러한 간섭의 대표적인 현상이 다이머 형성이다. 올리고뉴클레오타이드 세트의 특성이 우수하여도, 서로 다른 타겟 핵산분자를 검출하기 위해서 디자인된 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머를 형성하면 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 제공될 수 없다.
멀티플렉스 PCR용 올리고뉴클레오타이드 세트의 후보 조합에서 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는데 있어, 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 규모가 크지 않은 경우에는 모든 후보 조합에서의 다이머 생성 여부를 확인하여, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공할 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 규모가 큼과 동시에 상기 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 개수가 많은 경우에는 모든 후보 조합에서의 다이머 생성 여부를 확인하는데 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 심지어 모든 후보 조합에서의 다이머 생성 여부를 확인하지 못하여, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하지 못하는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 멀티플렉스 PCR용 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 효율적으로 제공할 수 있는 기술의 개발 필요성을 인식하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 복수의 타겟 핵산분자를 증폭 및 검출하는데 이용되는 복수의 올리고뉴클레오타이드 세트(예컨대, 프라이머 쌍 및 프로브)를 효율적으로 조합할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 모든 후보 조합의 다이머 생성 여부를 확인하는 종래의 방법과 달리, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성이 감소된 조합을 새로운 레퍼런스 조합으로 제공하며, 상기 새로운 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 다이머가 모두 제거된 조합을 제공함으로써, 복수의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 신속성 및 정확성을 가지고 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는 데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
(b) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계:
(c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계;
(d) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계;
(e) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 및
(f) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하는 단계; 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 본 발명의 방법을 실시하는 과정들의 흐름도이다. 본 발명의 방법을 도 1를 참조하여 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀을 제공( 110 )
우선, 본 발명의 방법은 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 용어,“타겟 핵산분자”,“타겟 분자”또는“타겟 핵산”은 검출하고자 하는 유기체 내 뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 타겟 핵산분자는 일반적으로 특정 이름이 붙여져 있으며, 지놈 전체 및 지놈을 구성하는 모든 뉴클레오타이드 분자(예컨대, 유전자, 슈도유전자, 비-코딩 서열분자, 비해독 구역 및 지놈의 일부 구역)를 포함한다. 타겟 핵산분자는 예컨대, 상기 유기체의 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 타겟 핵산분자를 특정 핵산서열로 나타낸 것이다.
본 명세서에서 용어“유기체”는 하나의 속, 종, 아종, 서브타입, 지노타입, 시로타입, 스트레인, 분리종(isolate) 또는 재배종(cultivar)에 속한 유기체를 의미한다. 유기체는 예컨대, 원핵세포(예건대, Mycoplasma pneumoniae , Chlamydophila pneumoniae , Legionella pneumophila , Haemophilus influenzae , Streptococcus pneumoniae , Bordetella pertussis , Bordetella parapertussis , Neisseria meningitidis , Listeria monocytogenes , Streptococcus agalactiae , Campylobacter , Clostridium difficile , Clostridium perfringens, Salmonella, Escherichia coli , Shigella , Vibrio , Yersinia enterocolitica , Aeromonas , Chlamydia trachomatis , Neisseria gonorrhoeae , Trichomonas vaginalis , Mycoplasma hominis , Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum , Ureaplasma parvum , Mycobacterium tuberculosis), 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물), 바이러스 또는 비로이드를 포함한다. 상기 진핵세포 중 기생충(parasite)의 예는 Giardia lamblia , Entamoeba histolytica , Cryptosporidium , Blastocystis hominis , Dientamoeba fragilis , Cyclospora cayetanensis를 포함한다. 상기 바이러스의 예는 호흡기 질환을 유발하는 인플루엔자 A 바이러스(Flu A), 인플루엔자 B 바이러스(Flu B), 호흡 씬시티얼 바이러스 A(Respiratory syncytial virus A: RSV A), 호흡 씬시티얼 바이러스 B(Respiratory syncytial virus B: RSV B), 파라인플루엔자 바이러스 1(PIV 1), 파라인플루엔자 바이러스 2(PIV 2), 파라인플루엔자 바이러스 3(PIV 3), 파라인플루엔자 바이러스 4(PIV 4), 메타뉴모바이러스(MPV), 인간 엔테로바이러스(HEV), 인간 보카바이러스(HBoV), 인간 라이노바이러스(HRV), 코로나바이러스 및 아데노바이러스; 위장관 질환을 유발하는 유발하는 노로바이러스, 로타바이러스, 아데노바이러스, 아스트로바이러스 및 사포바이러스를 포함한다. 또한, 상기 바아러스의 예는 HPV(human papillomavirus), MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus), 댕기바이러스(Dengue virus), HSV(Herpes simplex virus), HHV(Human herpes virus), EMV(Epstein-Barr virus), VZV(Varicella zoster virus), CMV(Cytomegalovirus), HIV, 간염 바이러스 및 폴리오바이러스를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 타겟 핵산분자는 하나의 유기체 또는 복수의 유기체의 타겟 핵산분자이다. 본 발명에서 복수의 유기체는 최소 2종 이상의 유기체, 예를 들어 2 내지 20 종에서 선택되는 유기체이며, 상기 복수의 유기체는 모두 상이한 유기체, 일부 동일한 유기체, 또는 모두 동일한 유기체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드 세트의 풀”은 검출 대상인 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들을 포함하는 집단을 의미한다.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 구체적으로 상기 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고, 보다 구체적으로 프라이머 쌍 및/또는 프로브를 포함한다. 가장 구체적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나의 프라이머 쌍 및 하나의 프로브, 또는 둘 이상의 프라이머 쌍 및 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 동일한 유기체의 하나 이상의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용된다. 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대해 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 세트는 동일한 유기체의 하나의 타겟 핵산분자, 또는 둘 이상의 타겟 핵산분자들을 검출하는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성되는 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 혼성화에 있어 최대 효율을 위하여 특히 단일쇄이다. 구체적으로, 올리고뉴클레오타이드는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid: PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568 (1993)), 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid: LNA) (WO1999/014226), 가교 핵산(Bridged Nucleic Acid: BNA) (WO2005/021570), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다. 특히, 본 명세서에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어진 단일 가닥이다. 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 타겟 핵산 서열에 의존적으로 발생하는 절단 단편과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 구체적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “프라이머”는 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다.
프라이머의 길이는 예를 들어 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 상기 프라이머가 본 출원인에 의해 개발된 DPO 프라이머(참조: 미국 특허 제8092997호)인 경우에는, 상기 특허 문헌에 개시된 DPO 프라이머의 길이에 대한 설명은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어“프로브(probe)”는 타겟 핵산서열에 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 또한, 상기 프로브는 타겟 검출을 위한 신호를 발생시킬 수 있는 표지를 포함할 수 있다.
프로브의 길이는 예를 들어 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 상기 프로브가 태깅 프로브의 경우, 상기 길이에 대한 설명은 태깅 프로브의 타겟팅 부위에 적용된다. 태깅 프로브의 태깅 부위의 길이는 특별히 제한적이지 않으며, 예를 들어 7-48 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 7-30 뉴클레오타이드, 7-20 뉴클레오타이드, 10-48 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 12-48 뉴클레오타이드, 12-40 뉴클레오타이드, 12-30 뉴클레오타이드 또는 12-20 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 서열로 구성된 통상적인 프라이머 및 프로브 구조를 가질 수 있다. 또는, 상기 올리고뉴클레오타이드의 구조를 변형하여 독특한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드는 스콜피온 프라이머, 몰리큘러 비이컨 프로브, 선라이즈 프라이머, 하이비이컨 프로브, 태깅 프로브, DPO 프라이머 또는 프로브(WO 2006/095981), 및 PTO 프로브 (참조: WO 2012/096523)의 구조를 가질 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 통상적인(conventional) 프라이머 또는 프로브에 축퇴성 염기 및/또는 유니버셜 염기가 도입된 축퇴성 염기-포함 올리고뉴클레오타이드 및/또는 유니버셜 염기-포함 올리고뉴클레오타이드와 같은 변형 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “통상적인 프라이머”, “통상적인 프로브” 및 “통상적인 올리고뉴클레오타이드”는 축퇴성 염기 또는 비자연-염기가 도입되지 않은 일반적인 프라이머, 프로브 및 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 축퇴성 염기-포함 올리고뉴클레오타이드 또는 유니버셜 염기-포함 올리고뉴클레오타이드는 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 최소 95%는 비변형 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 통상적인 올리고뉴클레오타이드에 도입되는 축퇴성 염기 또는 유니버셜 염기의 개수의 범위는 구체적으로 7개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 또는 상기 통상적인 올리고뉴클레오타이드에 도입되는 축퇴성 염기 및/또는 유니버셜 염기의 사용 비율은 구체적으로 25% 이하, 20% 이하, 18% 이하, 16% 이하, 14% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 8% 이하 또는 6% 이하이다. 상기 축퇴성 염기 또는 유니버설 염기의 사용 비율은 축퇴성 염기 또는 유니버설 염기가 도입된 올리고뉴클레오타이드의 총 뉴클레오타이드 중에서 축퇴성 염기 또는 유니버설 염기의 비율을 나타낸다. 상기 축퇴성 염기는 당업계에 공지된 다음의 다양한 축퇴성 염기를 포함한다: R: A or G; Y: C or T; S: G or C; W: A or T; K: G or T; M: A or C; B: C or G or T; D: A or G or T; H: A or C or T; V: A or C or G; N: A or C or G or T. 상기 유니버설 염기는 당업계에 공지된 다음의 다양한 유니버설 염기를 포함한다: 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합. 보다 구체적으로, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 올리고뉴클레오타이드 세트는 소정의 정렬 기준에 따라 순위(rank)가 부여된다. 상기 순위는 올리고뉴클레오타이드 세트에 일련번호로 부여된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 올리고뉴클레오타이드 세트의 순위 부여는 다음의 소정의 정렬 기준 중 하나 이상의 기준에 대하여 랭킹화하여 실시된다:
(ⅰ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고,
(ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입된 축퇴성 염기 및/또는 유니버설 염기 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고,
(ⅲ) 타겟 핵산분자의 복수의 타겟 핵산서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 타겟-커버리지; 상기 타겟-커버리지가 클수록 우선순위가 높고,
(ⅳ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입되는 축퇴성 염기에 의해 생성되는 올리고뉴클레오타이드 패턴 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높다.
복수의 타겟 핵산분자 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 포함된 올리고뉴클레오타이드 세트들을 최소 1개(구체적으로, (i)번의 정렬 기준), 구체적으로 최소 2개, 보다 구체적으로 최소 3개, 보다 더 구체적으로 최소 4개의 정렬 기준에 대하여 랭킹화 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 최소 2개의 정렬 기준은 중요도(criticality)에 차이가 있으며, 상기 중요도를 고려한 상기 최소 2개의 정렬 기준에서의 순위에 따라 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 포함된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 순위를 배정한다. 예를 들어, 중요도가 가장 높은 정렬 기준에서 제1위 올리고뉴클레오타이드 세트가 복수개의 경우, 차순위 정렬 기준에서의 순위를 비교하여 가장 높은 순위를 갖는 올리고뉴클레오타이드 세트를 선정한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 정렬 기준들에 서로 다른 웨이트(weight)를 배정하고 각각의 정렬 기준에서의 값들(또는 값의 범위들)에 스코어를 배정하면, 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트의 총 스코어를 얻을 수 있다. 이 계산된 총 스코어를 고려하여, 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 포함된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 순위를 부여할 수 있다.
도 2는 8종의 유기체(organism 또는 analyte)의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트(oligonucleotide set; OS)의 풀을 보여주고 있다. 일 예로, 유기체 1(Analyte 1)의 올리고뉴클레오타이드 세트 1(OS.1)에는 3개의 전방향 프라이머, 3개의 프로브 및 4개의 역방향 프라이머로 구성되어 있음을 보여주며, 8종의 유기체의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에는 1 내지 N 까지 순위가 부여된 올리고뉴클레오타이드 세트들이 포함되어 있다.
단계 (b): 상기 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 다이머 생성 여부를 확인( 120 )
그 다음, 본 발명의 방법은 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인한다.
본 발명에 따르면, 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합의 첫 번째 후보로서 제 1 레퍼런스 조합을 제공한다. 상기 제 1 레퍼런스 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하여, 다이머가 생성되지 않음을 확인하면 제 1 레퍼런스 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용할 수 있다. 그러나, 상기 제 1 레퍼런스 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 최소 하나의 다이머가 생성된다면, 후술하는 방법에 따라 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공할 수 있다.
제 1 레퍼런스 조합은 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 임의적으로 선택되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합이며, 구체적으로 상기 제 1 레퍼런스 조합은 소정의 순위 합(rank sum)을 가지며, 보다 구체적으로 최소 순위 합을 가진다.
본 명세서에서 용어“순위 합(rank sum)”은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에 포함되는 각 올리고뉴클레오타이드 세트에 부여된 순위의 합을 의미한다. 구체적으로, 도 2에서 최소의 순위의 합을 가지는 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공한다고 하면, 8종의 유기체에 대하여 순위가 1인 올리고뉴클레오타이드 세트들로 이루어진, 즉 순위 합이 8인 [1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1] 조합이 제 1 레퍼런스 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 제 1 레퍼런스 조합을 제공한 다음, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 다이머 생성 여부의 확인은 다음의 기준 중 하나 이상의 기준을 만족하는지 여부를 확인한다: (ⅰ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 전체 뉴클레오타이드 비율이 소정의 값 (구체적으로, 20% 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%) 이상; 및 (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 연속적인 뉴클레오타이드 비율이 소정의 값 (구체적으로, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%) 이상.
예를 들어, 유기체 1에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 1과 유기체 2에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 2 사이에 다이머 생성 여부 확인은 5’to 3’의 올리고뉴클레오타이드 1과 3’to 5’올리고뉴클레오타이드 2 사이에 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 관여하는 뉴클레오타이드의 비율에 따라 결정된다. 상기 올리고뉴클레오타이드 1 및 올리고뉴클레오타이드 2가 모두 30 base를 포함하고 있는데, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 관여하는 불연속적인 뉴클레오타이드 6 base 그리고 연속적인 뉴클레오타이드 2 base가 있다고 한 경우, 상기 (ii)의 기준 (소정의 값 10% 이상)에 따르면 다이머가 생성된 것이 아니지만, 상기 (i)의 기준 (소정의 값 20% 이상)에 따르면, 상기 올리고뉴클레오타이드 1 및 올리고뉴클레오타이드 2 사이에는 다이머가 생성된 것이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 다이머 생성은 다이머 링크(dimer link; D-link) 및/또는 다이머 레벨(dimer level; D-level)로 나타내고, 상기 다이머 링크는 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 두 개의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에서 생성된 하나 이상의 다이머 쌍(dimer pair)을 나타내고 상기 하나 이상의 다이머 쌍은 하나의 다이머 링크로 고려되며, 상기 다이머 레벨은 상기 조합의 상기 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 생성되는 모든 다이머 링크를 제거하기 위해 치환이 필요한 올리고뉴클레오타이드 세트의 최소 개수 또는 상기 조합의 상기 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 생성되는 모든 다이머 링크를 제거하기 위해 필요한 최소 치환 횟수를 나타낸다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 5종의 유기체의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는 과정을 보여준다.
도 3에서, 최소 순위 합을 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합, 즉 [1, 1, 1, 1, 1] 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인한다. 그 결과, 유기체 1과 유기체 3, 유기체 1과 유기체 5, 그리고 유기체 2와 유기체 3에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머가 생성됨을 확인하였다. 한편, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드는 최소 3개 이상이므로, 예를 들어 유기체 1과 유기체 3에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 생성된 다이머 쌍의 개수는 최소 1개 이상 일 수 있으나, 이를 하나의 다이머 링크로 고려한다.
본 명세서에서 “다이머 링크의 개수”는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서의 다이머 링크의 총 개수(the total number of dimer links)를 나타내고, “개별 다이머 링크의 개수”는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합의 각 올리고뉴클레오타이드 세트에서 관여하는 다이머 링크의 개수를 타나낸다.
도 3의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 생성을 나타내는 다이머 링크(D-link)의 개수는 3이 되며, 상기 제 1 레퍼런스 조합의 각 올리고뉴클레오타이드 세트에서 관여하는 개별 다이머 링크의 개수는 유기체 1에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트에 대해서는 2, 유기체 2에 대해서는 1, 유기체 3에 대해서는 2, 유기체 4에 대해서는 0, 그리고 유기체 5에 대해서는 1개이다.
도 3의 제 1 레퍼런스 조합에서 유기체 1에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환할 경우, 유기체 1과 유기체 3, 그리고 유기체 1과 유기체 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 링크가 제거될 수 있고, 유기체 2 또는 유기체 3에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환할 경우, 유기체 2과 유기체 3에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 링크가 제거될 수 있으므로, 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 모든 다이머 링크를 제거하기 위해 치환이 필요한 올리고뉴클레오타이드 세트의 최소 개수 또는 제 1 레퍼런스 조합에서 모든 다이머 링크를 제거하기 위해 필요한 최소 치환 횟수는 2가 된다. 따라서, 도 3의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 생성 여부를 나타내는 다이머 레벨(D-level)은 2가 된다. 만약에 도 3의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성되지 않았다면, 다이머 링크의 개수, 개별 다이머 링크의 개수 및 다이머 레벨은 모두 0이 된다.
본 발명의 단계에서 설명한 “다이머 생성 여부의 확인”과 관련된 내용은 후술한 본 발명의 단계들에서도 동일하게 적용된다.
단계 (c): 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고, 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인( 130 )
그 다음, 본 발명의 방법은 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다.
본 발명의 특징 중 하나는 제 1 레퍼런스 조합에서 모든 올리고뉴클레오타이드 세트를 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하는 것이 아니라, 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 다이머 생성 여부 를 확인하는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 후보 조합의 수를 감소시켰다는 데 있다.
본 발명의 단계 (c)에서 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 제공된다. 구체적인 구현예에 따르면, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트는 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
상기 치환은 한 시점에 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 실시된다. 따라서, 본 발명의 단계 (c)에서 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이하다.
다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공한 다음, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인한다. 그 결과, 다이머가 생성되지 않았다면 상기 조합을 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용할 수 있다. 다만, 여전히 다이머가 생성되었다면 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다.
다이머 생성 여부의 확인 및 다이머 생성에 대한 내용은 상기 단계 (b)와 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부의 확인은 구체적으로 다이머 링크의 개수 및/또는 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다.
본 단계는 (i) 제 1 레퍼런스 조합으로부터 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 각각 제공하면서 상기 조합의 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인하거나, (ⅱ) 제 1 레퍼런스 조합으로부터 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 모두 제공한 다음, 상기 조합의 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인할 수 있다. 구체적으로는 상기 (i)의 방법으로 본 단계를 실시한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 치환은 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시된다. 보다 구체적으로, 상기 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트 까지의 순서는 (i) 개별 다이머 링크의 개수가 큰 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 작은 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서, 및 (ii) 개별 다이머 링크의 개수가 동일한 경우, 조합에서 앞에 위치한 올리고뉴클레오타이드 세트에서 뒤에 위치한 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서, 또는 많은 개수의 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 적은 개수의 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서이다.
도 3을 참조하여 설명하면, 상술한 바와 같이 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크(D-link)의 개수는 3, 다이머 레벨(D-level)은 2, 그리고 유기체 1 내지 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 개별 다이머 링크의 개수는 각각 2, 1, 2, 0 및 1이다. 제 1 레퍼런스 조합에서 개별 다이머 링크의 개수의 값이 크거나, 동일할 경우 앞에 있는 유기체에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트부터 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하기로 한다.
먼저, 유기체 1에 대한 1위의 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 2위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 1) [2, 1, 1, 1, 1] 조합을 제공하고 상기 1) 조합의 다이머 생성 여부(다이머 링크의 개수 2 및 다이머 레벨 2) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다. 그리고, 이러한 방법으로 유기체 3, 유기체 2 및 유기체 5에 대한 1위 올리고뉴클레오타이드 세트들을 각각 치환하여 조합을 제공하고 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다. 즉, 2) [1, 1, 2, 1, 1] 조합(D-level: 2, D-link: 3), 3) [1, 2, 1, 1, 1] 조합 (D-level: 2, D-link: 3), 및 4) [1, 1, 1, 1, 2] 조합 (D-level: 2, D-link: 4). 이렇게 제공된 상기 1) 내지 4)의 조합 중 1) 조합이 다이머 링크의 개수의 측면에서 다이머 생성이 감소되었다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머의 생성이 감소될 때 까지 실시된다. 예를 들어, 상기 1) 내지 4)의 조합을 모두 제공하는 것이 아니라 각 조합을 제공하면서 다이머 생성을 확인하여 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머의 생성이 감소되는 경우에는 더 이상의 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하지 않는다. 구체적으로, 상기 1) 조합의 다이머 링크의 개수가 제 1 레퍼런스 조합 보다 감소하였으므로, 상기 1) 조합만 제공하고 상기 2) 내지 4) 조합을 제공하지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 (c) 이후에, c-i) 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계; 또는 c-ii) 상기 단계 c-i)를 실시하고, 상기 단계 c-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 c-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 구현예는 제 1 레퍼런스 조합으로부터 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하였음에도, 다이머의 생성이 감소되지 않는 경우에는 후술하는 단계에서 제 2 레퍼런스 조합을 제공할 수 없으므로, 추가적인 치환 과정을 실시하는 것을 나타낸다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-i)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-i)의 치환은 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합들 중 어느 하나의 조합에서 다른 조합의 순서로 실시된다. 구체적으로, 상기 단계 (c)에서 제공되는 조합의 순으로 상기 단계 c-i)의 치환을 실시한다.
도 3에서 1) 내지 4) 조합이 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성(구체적으로, 다이머 레벨)이 감소되지 않았다면, 1) 내지 4) 조합을 제공한 순서로 상기 1) 내지 4) 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 다이머 생성 여부 및 다이머 감소 여부를 확인한다. 상기 1) 조합에서 유기체 1에 대한 2위의 올리고뉴클레오타이드 세트를 3위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 5)[3, 1, 1, 1, 1] 조합을 제공하고, 다이머 생성 여부(D-level: 2, D-link: 3) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다. 상기 5) 조합이 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소되지 않았으므로, 2) 조합에서 유기체 3에 대한 2위의 올리고뉴클레오타이드 세트를 3위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 6) [1, 1, 3, 1, 1] 조합을 제공하고, 다이머 생성 여부(D-level: 2, D-link: 2) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다. 그리고, 이러한 방법으로 3) 조합으로부터 7) [1, 3, 1, 1, 1] 조합, 그리고 4) 조합으로부터 8) [1, 1, 1, 1, 3] 조합을 각각 제공하고 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다.
여기에서, 상기 단계 c-i)의 치환을 다이머 생성이 감소될 때 까지 실시하고, 다이머 생성의 감소 기준을 다이머 레벨의 감소라고 한다면, 7) 조합까지 제공되며 8) 조합은 제공할 필요가 없다.
만약에, 5) 내지 8) 조합에서도 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성이 감소되지 않았다면, 상기 단계 c-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 c-i)를 반복한다.
단계 (d): 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합으로 제공( 140 )
이어, 본 발명의 방법은 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공한다.
본 발명의 다른 특징 중 하나는 제 1 레퍼런스 조합으로부터 제공될 수 있는 모든 조합을 치환 대상으로 하는 것이 아닌, 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 새로운 치환 대상(새로운 레퍼런스 조합)으로 제공하여 다이머 생성 여부를 확인할 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합의 수를 대폭 감축시켰다는 것이다.
구체적으로, 다이머 생성의 감소의 기준을 다이머 링크의 개수의 감소로 한다면, 도 3에서 1) 내지 4) 조합 중 제 1 레퍼런스 조합(D-level: 2, D-link: 3) 보다 다이머 링크의 개수가 감소된 1) [2, 1, 1, 1, 1] 조합(D-level: 2, D-link: 2)을 제 2 레퍼런스 조합으로 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단계 (c)의 치환을 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머의 생성이 감소될 때 까지 실시하는 경우, 다이머 링크의 개수가 감소된 1) 조합이 제공되고, 상기 1) 조합이 제 2 레퍼런스 조합으로 제공되며, 2) 내지 4) 조합은 제공되지 않는다.
택일적으로, 다이머 생성의 감소의 기준을 다이머 레벨의 감소로 한다면, 5) 내지 8) 조합 중 7) 조합이 제 2 레퍼런스 조합으로 제공된다.
보다 구체적으로, 상기 단계 c-i)의 치환을 다이머 생성이 감소이 될 때 까지 실시하는 경우, 7) 조합이 제 2 레퍼런스 조합으로 제공된다. 이 경우, 8) 조합은 제공할 필요가 없다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)의 다이머 생성의 감소는 소정의 값 이하로의 감소이다. 본 구현예는 상기 단계 (d)에서 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성이 감소될 뿐만 아니라, 그 다이머 생성의 감소의 수준이 소정의 값 이하로 감소한 경우에 제 2 레퍼런스 조합으로 제공될 수 있음을 나타낸다. 구체적으로 상기 소정의 값은 1 내지 8 중 선택될 수 있다.
예를 들어, 상기 소정의 값이 1이고, 상기 다이머 생성을 다이머 레벨로 나타내며, 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 3이고, 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합의 다이머 레벨이 2로 감소한 경우, 상기 단계 (c)에서 제공된 조합이 제 1 레퍼런스 조합에 비해 다이머 레벨은 감소하였지만 다이머 레벨이 1 이하로 감소하지 않았으므로, 제 2 레퍼런스 조합으로 제공될 수 없다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)는 다음의 단계이다:
c-1) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인하는 단계;
d-1) 상기 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1-1 레퍼런스 조합으로 제공하는 단계;
c-2) 상기 제 1-1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1-1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인하는 단계; 및
d-2) 상기 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1-1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합으로 제공하는 단계.
본 구현예는 다이머 생성의 감소 기준으로 다이머 레벨과 다이머 링크의 개수에 우선 순위를 부여하여, 먼저 제 1 레퍼런스 조합으로부터 치환하여 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 다이머 레벨이 감소된 경우 상기 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 1-1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 상기 제 1-1 레퍼런스 조합으로부터 치환하여 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 다이머 링크의 개수가 감소된 경우 상기 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합으로 제공하는 것을 나타낸다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c-1) 및 (c-2)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-1)은 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시되고, 상기 단계 c-2)는 상기 제 1-1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-1)의 치환은 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소될 때 까지 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-2)는 상기 제 1-1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소될 때 까지 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 c-1) 이후에, c-1-i) 상기 단계 c-1)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 c-1)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인하는 단계; 또는 c-1-ii) 상기 단계 c-1-i)를 실시하고, 상기 단계 c-1-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 c-1)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 c-1-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 구현예는 단계 c-1)에서 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨이 감소되는 조합이 없는 경우, 추가적인 치환 과정을 거치는 것을 나타낸다. 구체적으로, 단계 c-1)에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다(단계 c-1-i).
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-1-i)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-1-i)의 치환은 상기 단계 c-1)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합들 중 어느 하나의 조합에서 다른 조합의 순서로 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 c-2) 이후에, c-2-i) 상기 단계 c-2)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 c-2)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인하는 단계; 또는 c-2-ii) 상기 단계 c-2-i)를 실시하고, 상기 단계 c-2-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 c-2)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 c-2-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 구현예는 단계 c-2)에서 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수가 감소되는 조합이 없는 경우, 추가적인 치환 과정을 거치는 것을 나타낸다. 구체적으로, 단계 c-2)에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한다(단계 c-2-i).
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-2-i)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 c-2-i)의 치환은 상기 단계 c-2)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합들 중 어느 하나의 조합에서 다른 조합의 순서로 실시된다.
도 3 및 4를 참조하여, 제 1 레퍼런스 조합으로부터 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 다이머 레벨이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 1-1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 상기 제 1-1 레퍼런스 조합으로부터 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 다이머 링크가 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합으로 제공하는 과정을 설명하면 다음과 같다:
도 3에서, [1, 1, 1, 1, 1] 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 다이머 링크(D-link)의 개수는 3, 다이머 레벨(D-level)은 2, 그리고, 유기체 1 내지 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 개별 다이머 링크의 개수는 각각 2, 1, 2, 0 및 1이다.
우선, 제 1 레퍼런스 조합으로부터 다이머 레벨이 감소된 새로운 레퍼런스 조합인 제 1-1 레퍼런스 조합을 제공한다.
구체적으로, 제 1 레퍼런스 조합으로부터 개별 다이머 링크의 개수가 큰 순서로부터 치환을 하면, 유기체 1에 대한 1위의 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 2위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 1) [2, 1, 1, 1, 1] 조합을 제공하고 상기 1) 조합의 다이머 생성 여부(D-level: 2, D-link: 2) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다. 다이머 레벨이 감소되지 않았으므로, 다이머 레벨이 감소될 때 까지 유기체 3, 유기체 2 및 유기체 5에 대한 1위 올리고뉴클레오타이드 세트들을 각각 치환하여 조합을 제공하고 다이머 생성 여부 및 다이머 생성의 감소 여부를 확인한다: 즉, 2) [1, 1, 2, 1, 1] 조합 (D-level: 2, D-link: 3), 3) [1, 2, 1, 1, 1] 조합 (D-level: 2, D-link: 3), 및 4) [1, 1, 1, 1, 2] 조합 (D-level: 2, D-link: 4). 이렇게 제공된 상기 1) 내지 4)의 조합 중 다이머 레벨이 감소된 조합이 없으므로 추가적인 치환 과정을 거친다.
상기 1) 조합에서 4) 조합의 순서로, 상기 1) 조합에서 유기체 1에 대한 2위의 올리고뉴클레오타이드 세트를 3위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 5)[3, 1, 1, 1, 1] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부(D-level: 2, D-link: 3) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다. 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소되지 않았으므로, 2) 조합으로부터 6) [1, 1, 3, 1, 1] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부(D-level: 2, D-link: 2) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다. 다이머 레벨이 감소되지 않았으므로, 3) 조합으로부터 7) [1, 3, 1, 1, 1] 조합을 제공하고, 다이머 생성 여부(D-level: 1, D-link: 2) 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다. 그 결과, 7) [1, 3, 1, 1, 1] 조합은 다이머 레벨이 제 1 레퍼런스에 비하여 감소하였으므로, 상기 7) 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 1-1 레퍼런스 조합으로 제공한다. 새로운 레퍼런스 조합이 제공이 되면 8) [1, 1, 1, 1, 3] 조합의 제공 및 다이머 생성 여부를 확인하지 않는다.
그 다음, 제 1-1 레퍼런스 조합으로부터 다이머 링크의 개수가 감소된 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합을 제공한다.
도 4를 참조하여 설명하면, 제 1-1 레퍼런스 조합인 상기 7) [1, 3, 1, 1, 1] 조합(D-level: 1, D-link: 2, 개별 다이머 링크의 개수 2, 0, 1, 0, 1)에서 개별 다이머 링크의 개수가 큰 순서로 즉, 유기체 1, 3 및 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서로 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 다이머 생성 여부 및 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한다. 7) [1, 3, 1, 1, 1] 조합으로부터 9) [2, 3, 1, 1, 1] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부(D-level: 1, D-link: 2) 및 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한다. 그 결과, 9) 조합은 7) 조합에 비해 다이머 링크의 개수의 측면에서 개선되지 않았으므로, 7) 조합으로부터 10) [1, 3, 2, 1, 1] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부(D-level: 1, D-link: 1) 및 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한다. 그 결과, 다이머 링크의 개수의 측면에서 개선된 10) 조합을 새로운 레퍼런스 조합, 즉 제 2 레퍼런스 조합으로 제공한다.
본 발명의 다른 구현에에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)는 다음의 단계이다:
(c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계.
본 구현예는 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 생성 여부를 확인한 결과, 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 소정의 값 이하인 경우 또는 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 1인 경우에, 다이머 링크의 개수의 감소 기준으로 새로운 레퍼런스 조합을 제공하는 것을 나타낸다.
구체적으로, 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨의 소정의 값 이하를 2 이하로 설정한 경우, 도 3에서 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 2 이므로, 제 1 레퍼런스 조합으로부터 치환을 통해 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 다이머 레벨의 감소가 아닌 다이머 링크의 감소를 기준으로 새로운 레퍼런스 조합을 제공할 수 있다. 예를 들어, 1) 조합은 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수가 감소하였으므로, 1) 조합을 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합으로 제공할 수 있다. 이 경우, 2) 내지 8) 조합은 제공할 필요가 없다.
상기 다이머 레벨의 소정의 값은 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1이고, 보다 구체적으로 2 또는 1이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소될 때 까지 실시된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 (d) 이후에, d-i) 상기 단계 (d)의 제 2 레퍼런스 조합을 상기 단계 (c)의 제 1 레퍼런스 조합으로 고려하여, 상기 고려한 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소될 때까지, 상기 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 구현예는 제 1 레퍼런스 조합을 치환하여 다이머 생성이 감소되어 제 2 레퍼런스 조합이 제공되었으나, 상기 제 2 레퍼런스 조합으로부터 추가적으로 다이머 생성이 감소되는 경우에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 3이고, 상술한 단계 (c) 및 (d)를 수행한 결과, 다이머 레벨이 2인 조합이 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합으로 제공되는 경우, 상기 다이머 레벨이 2인 조합을 다시 제 1 레퍼런스 조합으로 고려하여 다이머 레벨이 2 미만으로 감소될 때까지 상술한 단계 (c) 및 (d)를 반복할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 단계 (c) 및 (d)가 상술한 c-1), d-1), c-2) 및 d-2) 단계인 경우에, 상기 방법은 상기 단계 d-1) 이후에, d-i) 상기 단계 d-1)의 제 1-1 레퍼런스 조합을 상기 단계 c-1)의 제 1 레퍼런스 조합으로 고려하여, 상기 고려한 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소될 때까지, 상기 단계 c-1) 및 d-1)를 반복하는 단계; 및/또는 상기 단계 d-2) 이후에, d-ⅱ) 상기 단계 d-2)의 제 2 레퍼런스 조합을 상기 단계 c-2)의 제 1-1 레퍼런스 조합으로 고려하여, 상기 고려한 제 1-1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크가 감소될 때까지, 상기 단계 c-2) 및 d-2)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
단계 (e): 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하여 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고, 다이머 생성 여부를 확인( 150 )
이어, 본 발명의 방법은 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인한다.
본 발명의 단계 (e)는 상술한 본 발명의 단계 (c)와 치환의 대상인 레퍼런스 조합이 상이하다. 구체적으로, 본 발명의 단계 (c)에서의 치환 대상은 제 1 레퍼런스 조합이나, 본 발명의 단계 (e)에서의 치환 대상은 제 1 레퍼런스 조합으로부터 다이머 생성이 감소되어 제공되는 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼런스 조합이다.
그리고, 본 발명의 단계 (c)는 단계 (d)와 관련하여 다이머 생성 여부를 확인하고 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 개선 여부를 확인한다. 상술한 단계 (c) 및 (d)와 관련하여, 본 발명의 단계 (c)에서 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합의 다이머 생성을 확인한 결과 다이머가 모두 제거된 조합의 경우, 단계 (d) 및 (e)를 실시할 필요 없이 단계 (f)에 의한 복수의 타겟 핵산분자를 검출하기 위한 조합으로 제공될 수 있다. 따라서, 단계 (d)에서 제 2 레퍼런스 조합으로 제공되는 조합은 상술한 단계 (c)에서 다이머 생성 여부를 확인한 결과, 다이머가 생성되었으나 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머의 생성이 감소된 조합을 나타낸다.
이에 반하여, 후술하는 본 발명의 단계 (f)와 관련하여 본 발명의 단계 (e)에서의 다이머 생성 여부 확인은 제 2 레퍼런스 조합으로부터 치환되어 제공되는 조합에서 다이머가 모두 생성되지 않았는지를 확인한다. 다이머 생성의 감소 기준을 통하여 새로운 레퍼런스 조합을 제공하는 것은 단계 (c) 및 (d)에서 실시하고, 단계 (e) 및 (f)에서는 복수의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용하는 조합을 제공한다. 만약, 단계 (e)에서도 다이머가 모두 제거되지 않는 경우에는, 제 2 레퍼런스 조합으로부터 추가적인 치환 과정을 거쳐 다이머가 모두 제거된 조합을 제공한다.
이러한 차이를 제외하고, 상술한 본 발명의 단계 (c)와 단계 (e)의 동일한 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 방지하기 위해서 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)에서, 상기 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트는 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)의 치환은 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시된다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)에서의 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트 까지의 순서는 (i) 개별 다이머 링크의 개수가 큰 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 작은 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서, 및 (ii) 개별 다이머 링크의 개수가 동일한 경우, 조합에서 앞에 위치한 올리고뉴클레오타이드 세트에서 뒤에 위치한 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서, 또는 많은 개수의 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 적은 개수의 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 순서이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)는 상기 제 2 레퍼런스 조합으로부터 다이머가 생성되지 않을 때 까지 실시된다.
도 4에서, 10)[1, 3, 2, 1, 1] 조합은 상기 단계 (d)에 의해 제공된 제 2 레퍼런스 조합이다. 상기 조합은 유기체 1과 유기체 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 링크를 가져, 다이머 레벨(D-level) 1 및 다이머 링크(D-link)의 개수 1을 가진다. 상기 새로운 레퍼런스 조합인 제 2 레퍼러스 조합에서 다이머 링크를 가지는 유기체 1에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위로 치환하여 11)[2, 3, 2, 1, 1] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부를 확인한 결과 다이머가 모두 제거되지 않아(D-level: 1, D-link: 1), 다이머 링크를 가지는 유기체 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위로 치환하여 12)[1, 3, 2, 1, 2] 조합을 제공하고 다이머 생성 여부를 확인한 결과 다이머가 생성되지 않음을 확인하였다. 따라서, 12) 조합을 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용하는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 (e) 이후에, e-i) 상기 단계 (e)에서 제공한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 (e)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 또는 e-ii) 상기 단계 e-i)를 실시하고, 상기 단계 e-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 (e)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 e-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 구현예는 제 2 레퍼런스 조합으로부터 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 다이머가 생성되지 않은 조합이 제공되지 않는 경우에, 추가적인 치환 과정을 실시하는 과정을 나타낸다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 e-i)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트이다.
본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 e-i)은 상기 단계 (e)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합들 중 어느 하나의 조합에서 다른 조합의 순서로 실시된다.
단계 (f): 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공( 160 )
마지막으로, 본 발명의 방법은 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공한다. 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
도 4에서, 제 2 레퍼런스 조합인 10) 조합으로부터 다이머 링크를 가지는 유기체 1 및 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위로 각각 치환하여 조합을 제공하고 다이머 생성 여부를 확인한 결과, 12)[1, 3, 2, 1, 2] 조합에서 다이머가 생성되지 않았으므로, 상기 12) 조합을 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용하는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 제공한다.
이러한 방법으로 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공할 수 있다.
기록매체, 장치 및 프로그램
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, (b) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; (c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계; (d) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계; (e) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 및 (f) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하는 단계; 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, (b) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; (c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계; (d) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계; (e) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 및 (f) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하는 단계; 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 본 발명의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 기록 매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램은 상술한 본 발명의 방법을 컴퓨터에서 실시할 수 있도록 한 것으로서, 이들 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
프로그램 지시들은, 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하도록 한다. 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 실행하는 프로그램 지시들은 다음의 지시를 포함할 수 있다: (ⅰ) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하도록 하는 지시; (ⅱ) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하도록 하는 지시; (ⅲ) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하도록 하는 지시; (ⅳ) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하도록 하는 지시; (ⅴ) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하도록 하는 지시; 및 (ⅵ) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공(예컨대, 출력장치에 디스플레이)하도록 하는 지시.
본 발명의 방법은 프로세서에서 실행되며, 상기 프로세서는 독립 실행형 컴퓨터(stand alone computer), 네트워크 부착 컴퓨터 또는 실시간 PCR 장치와 같은 데이터 수득 장치에 있는 프로세서일 수 있다.
컴퓨터 해독가능한 기록매체는 당업계에 공지된 다양한 저장 매체, 예컨대, CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 저장매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합은 다양한 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합은 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크 및 포터블 HDD와 같은 포터블 매체 상에 제공될 수 있다. 유사하게, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합은, 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는, 비록 소프트웨어 기록 매체(예컨대, 포터블 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD)로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM 또는 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하는 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 신호와 명령의 외부 및 내부 저장과 전달에 이용될 수 있다.
컴퓨터 프로세서는 하나의 프로세서가 상술한 퍼포먼스를 모두 하도록 구축될 수 있다. 택일적으로, 프로세서 유닛은 여러 개의 프로세서가 각각의 퍼포먼스를 실행하도록 구축할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 복수의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는데 있어, 종래에는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 모든 후보 조합의 다이머 생성 여부를 확인하였다. 이러한 종래의 방법은 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 규모가 작고 검출하고자 하는 타겟 핵산분자의 수가 적은 경우에 가능하나, 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 규모가 크고 검출하고자 하는 타겟 핵산분자의 수가 많은 경우에는 다이머 생성 여부를 확인하여 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는데 장시간 소요되거나 심지어 최적 조합을 제공할 수 없는 문제점이 있었다.
(b) 본 발명은 상술한 종래의 방법의 문제점을 해결하고자, 올리고뉴클레오타이드 세트의 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성이 감소된 조합을 새로운 레퍼런스 조합으로 제공하고 이로부터 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환하여 다이머가 모두 제거된 조합을 제공함으로써, 다이머 생성 여부를 확인하는 올리고뉴클레오타이드 세트 및 후보 조합을 대폭 감소 시켰다.
(c) 이로 인해, 본 발명은 복수의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 복수의 올리고뉴클레오타이드 세트 사이에 간섭(interference)이 없는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 신속성 및 정확성을 가지고 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 본 발명의 방법을 실시하는 과정들의 흐름도이다.
도 2는 8종의 유기체(organism 또는 analyte)의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트(oligonucleotide set; OS)의 풀을 보여주고 있다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 5종의 유기체의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는 과정을 보여준다.
도 2는 8종의 유기체(organism 또는 analyte)의 타겟 핵산분자를 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트(oligonucleotide set; OS)의 풀을 보여주고 있다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 5종의 유기체의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 제공하는 과정을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1:
뎅기
바이러스 항생제 내성 진단용
올리고뉴클레오타이드
세트들의 최적 조합의 제공
올리고뉴클레오타이드 세트들(Oligonucleotide sets; OSs) 사이에 다이머(dimer)가 없는 최적 조합을 제공하는 알고리즘을 한 번 수행하여, 뎅기 바이러스 항생제 내성 진단을 위해 유기체(Analyte) 4종을 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 최대 10개 까지 제공하고자 한다.
(1) 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 제공
유기체 4종을 각각을 검출하는데 이용할 수 있도록, 프라이머 및 프로브를 디자인하고 프라이머 쌍 및 프로브를 조합하여 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀을 상기 유기체 4종 각각에 대해여 제공하였다. 올리고뉴클레오타이드 세트는 유기체 1(analyte 1; A1)에 대해서 614개, 유기체 2(analyte 2; A2)에 대해서 952개, 유기체 3(analyte 3; A3)에 대해서 1493개, 유기체 4(analyte 4; A4)에 대해서 1012개, 그리고 내부 대조군(internal control; IC)에 대해서 100000개가 제공되었다. 상기 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 세트들은 하기 우선순위 항목 각각에 대하여 랭킹화하여 순위를 배정하였다: (ⅰ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고, (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입된 축퇴성 염기 및/또는 유니버설 염기 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고, (ⅲ) 타겟 핵산분자의 복수의 타겟 핵산서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 타겟-커버리지; 상기 타겟-커버리지가 클수록 우선순위가 높고, (ⅳ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입되는 축퇴성 염기에 의해 생성되는 올리고뉴클레오타이드 패턴 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높다. 상기 4개의 우선순위 항목은 중요도(criticality)에 차이가 있으며, (i)번 우선순위 항목이 중요도가 가장 높으며 이어 순서대로 (ⅳ)번까지 중요도가 배정되어 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 세트 각각은 하나의 이상의 프라이머 쌍 및 하나 이상의 프로브를 포함한다.
(2) 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 1의 제공
유기체 4종 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 최소 순위 합(rank sum)을 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공하였다. 그리고 상기 제 1 레퍼런스 조합에서의 다이머 생성 여부를 확인하였다. 그 결과, 상기 제 1 레퍼런스 조합에서는 다이머가 생성되지 않음을 확인하였고, 상기 제 1 레퍼런스 조합을 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 1로 선정하였다. 이어, 상기 최적 조합 1에 IC에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 순위 순으로 추가하여 다이머 생성여부를 확인하였다. 그 결과, 상기 최적 조합 1에 IC에 대한 제1위 올리고뉴클레오타이드 세트를 추가한 조합에 다이머가 생성되지 않음을 확인하였고, 상기 조합을 아래 표 1에 정리하였다. 상기 다이머 생성의 확인은 다음의 기준 중 하나 이상의 기준을 만족하는지 여부를 확인하였다: (ⅰ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 전체 뉴클레오타이드 비율이 40% 이상; 및 (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 연속적인 뉴클레오타이드 비율이 20% 이상.
| 검출대상 (Analyte) |
순위 | 타입 | 가닥 (Strand) |
시작 (Start) |
끝 (end) |
서열 (Sequence) |
| A1 | 1 | 프라이머 | 전방향 (Forward; F) |
837 | 877 | AGGATAGAGAAYATAAAAMATGAACAIIIIICAACATGGC |
| 1 | 프라이머 | F | 735 | 768 | CTCACAGGAARCCAACRTATIIIIIAGACGTGGA | |
| 1 | 프로브 | 역방향 (Reverse; R) |
944 | 970 | ACCATRGATGAGGCTGATCCTGATGGC | |
| 1 | 프로브 | R | 911 | 940 | ACCTCATATGATCCRTGRTAGGCCCATGT | |
| 1 | 프라이머 | R | 1036 | 1068 | CCTCTGTTGTCCAAAGGGTIIIIIGTCAGTCAT | |
| 1 | 프라이머 | R | 1005 | 1038 | CATRGCTATTTGTGTGACCAIIIIIATRACATCC | |
| A2 | 1 | 프라이머 | F | 63 | 110 | ACCGCGTGTCRACTGTRIIIIIGCTGACAAAG |
| 1 | 프라이머 | F | 39 | 76 | CAATATGCTGAAACGCGAGAGIIIIIGCGTGTCRA | |
| 1 | 프로브 | F | 122 | 144 | TGGAATGCTGCARGGACGMGG | |
| 1 | 프로브 | R | 155 | 176 | TGCCACMARGGCCATGAACAG | |
| 1 | 프로브 | R | 184 | 210 | TGCTGTTGGYGGGATTGTYAGGAAAC | |
| 1 | 프라이머 | R | 303 | 333 | GCDGTYCTGCGTCTCCTIIIIIAGATGTTCA | |
| 1 | 프라이머 | R | 334 | 369 | ATCRCTGTTGGAATCAGCAIIIIIATCAYGCCT | |
| 1 | 프라이머 | R | 271 | 306 | TTCARCATCCTTCCRATCTCTIIIIIGAACCCTCTC | |
| A3 | 1 | 프라이머 | F | 1358 | 1393 | TGATGGGYAAGAGAGAGAARAIIIIIGGAGAGTTTG |
| 1 | 프로브 | F | 1421 | 1444 | GGTACATGTGGTTRGGAGCYAGGT | |
| 1 | 프라이머 | R | 1595 | 1631 | TCYTCTGTTATTCTTGTRTCCCIIIIIGCTGTGTCAT | |
| A4 | 1 | 프라이머 | F | 33 | 66 | TTTCAATATGCTGAAACGCGIIIIIAACCGCGTA |
| 1 | 프라이머 | F | 35 | 67 | TCAATATGCTGAAACGCGMIIIIIACCGCGTMT | |
| 1 | 프로브 | F | 80 | 112 | GGTTGGTGAAGAGATTCTCRACHGGAC | |
| 1 | 프로브 | F | 121 | 146 | GGGAAAGGACCCTTACGGATGGTGYT | |
| 1 | 프라이머 | R | 169 | 199 | GAATCCCTGCTGTTGGYIIIIIGGAAAGRAC | |
| 1 | 프라이머 | R | 246 | 278 | ARCATGCGRCCTATCTCCTIIIIIAATCCAATC | |
| IC | 1 | 프라이머 | F | 302 | 335 | GCCTTTCTCATTCGTTGTCIIIIIGCTCCTACCT |
| 1 | 프로브 | F | 431 | 452 | CGTTGACGCTCCCTACGGGTGG | |
| 1 | 프라이머 | R | 477 | 507 | CCCCTCGATGCATGGCIIIIITTTGGGCCTT |
(3) 중복 올리고뉴클레오타이드 세트를 제거한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀의 제공
올리고뉴클레오타이드 세트의 최적 조합의 다양성 확보를 위해, 상기 (1)의 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에서 상기 (2)에서 제공된 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 일부 또는 전부와 동일한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 제거하였다. 만약, 동일한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 제거한 결과, 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 올리고뉴클레오타이드 세트가 존재하지 않는 경우에는 상기 (2)에서 제공된 조합에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 세트를 다시 이용하였다.
상기 (1)의 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에서, 상기 (2)에서 제공된 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들에 포함되는 올리고뉴클레오타이드와 50% 초과하여 동일한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 제거한 결과, 유기체 1에 대해서는 527개, 유기체 2에 대해서는 382개, 유기체 3에 대해서는 1,349개, 유기체 4에 대해서는 526개, 그리고 IC에 대해서는 92689로 올리고뉴클레오타이드 세트가 감소하였다.
(4) 올리고뉴클레오타이드 세트의 최적 조합 2의 제공
상기 (3)에서 제공된 유기체 1 내지 4 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 최소 순위 합(rank sum)을 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합으로 제공하고, 다이머 생성 여부를 확인하였다. 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환한 조합을 제공하고 다이머 생성 여부 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인하였다. 다이머 레벨이 감소된 조합이 없는 경우에는 상기 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트만을 치환한 조합을 제공하고 다이머 생성 여부 및 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인하였다. 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨이 감소하였다면, 추가적인 조합을 제공하지 않고, 다이머 레벨이 감소한 조합을 새로운 레퍼런스 조합(제 1-1 레퍼런스 조합)으로 제공하였다. 상기 새로운 레퍼런스 조합의 다이머 레벨이 소정의 값(D-level: 2) 이하인 경우에는 다이머 링크의 개수의 감소를 새로운 레퍼런스 조합의 제공 기준으로 하여 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 치환하였다. 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 레벨의 감소를 기준으로 새로운 레퍼런스 조합(제 1-1 레퍼런스 조합)을 제공하는 과정에서의 치환은 다이머 링크의 개수의 감소를 기준으로 새로운 레퍼런스 조합(제 2 레퍼런스 조합)을 제공하는 과정에서의 치환 과정과 동일하다. 다이머 링크의 개수의 감소가 소정의 값(D-link: 1)이하인 경우에는 상술한 치환 과정과 동일하게 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여, 다이머가 모두 제거된, 즉 다이머가 생성되지 않는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 최적 조합 2로 선정하였다. 그리고, 상기 최적 조합에 IC에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트를 순위 순으로 추가하여 다이머 생성 여부를 확인하였고, 다이머가 생성되지 않은 조합은 아래 표 2에 정리하였다:
| 검출대상 (Analyte) |
순위 | 타입 | 가닥 (Strand) |
시작 (Start) |
끝 (end) |
서열 (Sequence) |
| A1 | 6 | 프라이머 | 전방향 (Forward; F) |
1316 | 1347 | GCAHARAGAGAGGGAGCTIIIIIAACAGGGAA |
| 6 | 프라이머 | F | 1261 | 1296 | AYCAATGGAACTCAGCAAAAGIIIIIGTGGAAGAYG | |
| 6 | 프로브 | 역방향 (Reverse; R) |
1426 | 1452 | TCCCARCCACATGTACCATATTGCRCG | |
| 6 | 프로브 | R | 1354 | 1380 | TCCCCATCATGTTGTARACACACGTRG | |
| 6 | 프라이머 | R | 1488 | 1521 | TGAATTCTCTCTGCTGAACCIIIIITCTTCGTTC | |
| 6 | 프라이머 | R | 1479 | 1513 | CTCTACTGAACCAGTGATCTIIIIICATGAAACCA | |
| 6 | 프라이머 | R | 1514 | 1546 | GTCCTTCTCCYTCCACTCCIIIIIGTGAATTCT | |
| A2 | 36 | 프라이머 | F | 151 | 182 | ACCCTCATGGCCATAGAYIIIIITGARTTGTG |
| 36 | 프라이머 | F | 160 | 192 | GCCATDGACCTTGGTGAAIIIIITGAAGAYACA | |
| 36 | 프라이머 | F | 214 | 247 | CTCAGGCAGAATGARCCAIIIIICATAGAYTGT | |
| 36 | 프라이머 | F | 170 | 202 | TTGGTGARTTGTGTGAAGAIIIIITCACGTAYA | |
| 36 | 프로브 | F | 357 | 380 | TGGAGACACGAACTGAAACATGGA | |
| 36 | 프로브 | F | 357 | 383 | TGGAAACGAGAACTGAAACATGGATGT | |
| 36 | 프로브 | F | 377 | 400 | TGGATGTCRTCAGAAGGGGCYTGG | |
| 36 | 프라이머 | R | 439 | 471 | GCCAGGATTGCTGCCATTAIIIIIAAGCCTGGA | |
| 36 | 프라이머 | R | 410 | 443 | CTGGATGTCTCARGAYCCAIIIIICAATTCTCTG | |
| 36 | 프라이머 | R | 449 | 483 | CCTATGGTGTATGCCARGATIIIIICCATTATGGT | |
| A3 | 49 | 프라이머 | F | 599 | 631 | AYGGAGGAATGCTTGTGAIIIIICCACTYTCAC |
| 49 | 프로브 | R | 796 | 821 | TCCATRTTGGGTGTTTCTGGTTCYGC | |
| 49 | 프라이머 | R | 935 | 968 | ACTCCRTTTATCATGGAGGAIIIIIAGCCTGTRG | |
| A4 | 46 | 프라이머 | F | 130 | 160 | CCCTTACGGATGGTGYTIIIIITCATYACGT |
| 46 | 프라이머 | F | 91 | 129 | AGATTCTCRACYGGACTTTIIIIIGGGAAAGGA | |
| 46 | 프로브 | F | 179 | 200 | TCCCACCAACAGCAGGGATTCT | |
| 46 | 프로브 | R | 250 | 274 | TGCGRCCTATCTCCTTCCTRAATCC | |
| 46 | 프라이머 | R | 313 | 344 | GCCATTACGGTGGGAAYCIIIIICARCAATGT | |
| 46 | 프라이머 | R | 299 | 331 | GAATCAAGCACARCARTGTIIIIITTGACCTTT | |
| 46 | 프라이머 | R | 322 | 355 | ACARGTGAAACGCCATTACIIIIIGAATCAARCA | |
| 46 | 프라이머 | R | 396 | 433 | GTTGTCTTRAACAAGAGAGGIIIIICCCTTTCRT | |
| IC | 7 | 프라이머 | F | 447 | 478 | GGGTGGACTGTGGAGAGIIIIIGCACTGCTAA |
| 7 | 프로브 | F | 514 | 535 | CCGTATGGCCAACAACTGGCGC | |
| 7 | 프라이머 | R | 548 | 583 | GCTAACGCATCTAAGGTATGGIIIIICGAGAAAGGA |
(5) 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 3 내지 10의 제공
상기 (3) 및 (4)의 과정을 반복하여, 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 3 내지 10을 제공하였다.
실시예 1의 방법으로 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 1 내지 10을 제공하는데 총 9.0초가 걸렸다.
실시예 2: 호흡기 감염증(Respiratory infection) 관련 바이러스 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합의 제공
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 아데노바이러스(Adenovirus) 및 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus)를 포함하는 호흡기 감염증 관련 바이러스 11종 및 내부 대조군(IC)를 동시 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합을 10개 까지 제공하고자 한다.
바이러스 11종 및 내부 대조군(IC) 각각에 대하여 591, 419, 1921, 510, 282, 1, 315, 20661, 4831, 3872, 357 및 195개의 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀을 제공하였다.
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 선정 및 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 1 내지 10은 다음 표 3에 정리하였으며, 상기 10개의 최적 조합을 제공하는데 약 13분이 소요되었다.
| No. | 올리고뉴클레오타이드 세트들의 최적 조합 |
| 1 | [66, 11, 1, 12, 100, 1, 283, 1, 1, 1, 2, 8] |
| 2 | [3, 325, 114, 7, 260, 1, 21, 11, 7, 5, 3, 64] |
| 3 | [12, 198, 29, 37, 3, 1, 177, 264, 28, 400, 14, 29] |
| 4 | [86, 86, 167, 25, 30, 1, 1, 130, 74, 522, 26, 23] |
| 5 | [14, 158, 74, 65, 16, 1, 247, 141, 589, 921, 20, 40] |
| 6 | [95, 19, 76, 27, 31, 1, 16, 295, 336, 680, 58, 45] |
| 7 | [118, 171, 173, 89, 69, 1, 126, 219, 746, 1088, 184, 12] |
| 8 | [88, 134, 311, 59, 201, 1, 78, 274, 596, 1382, 248, 51] |
| 9 | [110, 216, 73, 87, 87, 1, 18, 521, 911, 1467, 147, 55] |
| 10 | [48, 56, 234, 75, 146, 1, 115, 933, 2518, 1725, 7, 19] |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (21)
- 다음 단계를 포함하는 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법:
(a) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
(b) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계;
(c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계;
(d) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계;
(e) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 및
(f) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하는 단계; 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 복수의 타겟 핵산분자는 하나의 유기체 또는 복수의 유기체의 타겟 핵산분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 쌍 및/또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 올리고뉴클레오타이드 세트는 소정의 정렬 기준에 따라 순위(rank)가 부여되고, 상기 단계 (b)의 제 1 레퍼런스 조합은 소정의 순위 합(rank sum)을 가지며, 상기 단계 (c) 및 (e)에서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드 세트는 후순위의 올리고뉴클레오타이드 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 올리고뉴클레오타이드 세트의 순위 부여는 다음의 소정의 정렬 기준 중 하나 이상의 기준에 대하여 랭킹화하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법:
(ⅰ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고,
(ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입된 축퇴성 염기 및/또는 유니버설 염기 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높고,
(ⅲ) 타겟 핵산분자의 복수의 타겟 핵산서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트의 타겟-커버리지; 상기 타겟-커버리지가 클수록 우선순위가 높고,
(ⅳ) 올리고뉴클레오타이드 세트에 포함되는 올리고뉴클레오타이드에 도입되는 축퇴성 염기에 의해 생성되는 올리고뉴클레오타이드 패턴 개수의 총합; 상기 총합이 작을수록 우선순위가 높다.
- 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 제 1 레퍼런스 조합은 최소 순위 합을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 다이머 생성 여부의 확인은 다음의 기준 중 하나 이상의 기준을 만족하는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법:
(ⅰ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 전체 뉴클레오타이드 비율이 소정의 값 이상; 및
(ⅱ) 올리고뉴클레오타이드들 사이에 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 연속적인 뉴클레오타이드 비율이 소정의 값 이상.
- 제 1 항에 있어서, 상기 다이머 생성은 다이머 링크(dimer link) 및/또는 다이머 레벨(dimer level)로 나타내고, 상기 다이머 링크는 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 두 개의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에서 생성된 하나 이상의 다이머 쌍(dimer pair)을 나타내고 상기 하나 이상의 다이머 쌍은 하나의 다이머 링크로 고려되며, 상기 다이머 레벨은 상기 조합의 상기 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 생성되는 모든 다이머 링크를 제거하기 위해 치환이 필요한 올리고뉴클레오타이드 세트의 최소 개수를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 (e)에서, 상기 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트는 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 치환은 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시되고, 상기 단계 (e)의 치환은 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트들 중 어느 하나의 올리고뉴클레오타이드 세트에서부터 다른 올리고뉴클레오타이드 세트까지의 순서로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소될 때까지 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (c) 이후에, c-i) 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계; 또는 c-ii) 상기 단계 c-i)를 실시하고, 상기 단계 c-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 (c)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 c-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 (d)는 다음의 단계인 것을 특징으로 하는 방법:
c-1) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 레벨의 감소 여부를 확인하는 단계;
d-1) 상기 다이머 레벨의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1-1 레퍼런스 조합으로 제공하는 단계;
c-2) 상기 제 1-1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1-1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1-1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인하는 단계; 및
d-2) 상기 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1-1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합으로 제공하는 단계.
- 제 13 항에 있어서, 상기 단계 c-1)의 치환은 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 레벨이 감소될 때 까지 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 단계 c-2)의 치환은 상기 제 1-1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소될 때 까지 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 (d)는 다음의 단계인 것을 특징으로 하는 방법:
(c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머 링크를 가지는 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 다이머 링크의 개수의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계.
- 제 16 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 링크의 개수가 감소될 때 까지 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (d) 이후에, d-i) 상기 단계 (d)의 제 2 레퍼런스 조합을 상기 단계 (c)의 제 1 레퍼런스 조합으로 고려하여, 상기 고려한 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소될 때까지, 상기 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 제 2 레퍼런스 조합으로부터 다이머가 생성되지 않을 때 까지 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (e) 이후에, e-i) 상기 단계 (e)에서 제공한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합에서 치환한 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 단계 (e)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 또는 e-ii) 상기 단계 e-i)를 실시하고, 상기 단계 e-i)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 상기 단계 (e)에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합으로 고려하여 상기 단계 e-i)를 반복하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트들(oligonucleotide sets)의 최적 조합을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각을 검출하는데 이용되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀(a pool of an oligonucleotide set)을 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
(b) 상기 복수의 타겟 핵산분자 각각에 대하여 제공되는 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀로부터 조합되는 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 1 레퍼런스 조합(the first reference combination)으로 제공하고, 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계;
(c) 상기 제 1 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 1 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부 및 상기 제 1 레퍼런스 조합과 비교하여 다이머 생성의 감소 여부를 확인하는 단계;
(d) 상기 다이머 생성의 감소 여부를 확인한 조합에서, 상기 제 1 레퍼런스 조합 보다 다이머 생성이 감소된 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제 2 레퍼런스 조합(the second reference combination)으로 제공하는 단계;
(e) 상기 제 2 레퍼런스 조합에서 다이머가 생성된 올리고뉴클레오타이드 세트를 이와 동일한 올리고뉴클레오타이드 세트의 풀에 속하는 다른 올리고뉴클레오타이드 세트로 치환하여 상기 제 2 레퍼런스 조합과 상기 치환한 다른 올리고뉴클레오타이드 세트만이 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하고 상기 조합의 올리고뉴클레오타이드 세트들 사이에 다이머 생성 여부를 확인하는 단계; 및
(f) 상기 다이머 생성 여부를 확인한 조합에서, 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합을 제공하는 단계; 상기 다이머가 생성되지 않은 올리고뉴클레오타이드 세트들의 조합은 복수의 타겟 핵산분자를 동시에 검출하는데 이용된다.
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