WO2008001498A1 - Modèle animal d'une maladie associée à l'inactivation génique d'immunorécepteurs de cellules dendritiques - Google Patents

Modèle animal d'une maladie associée à l'inactivation génique d'immunorécepteurs de cellules dendritiques Download PDF

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Yoichiro Iwakura
Shinobu Saijo
Noriyuki Fujikado
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Definitions

  • the present invention relates to a model animal for autoimmune diseases and bone diseases including arthropathy and the like in which a dendritic cell immune receptor (DGIR) gene is deleted (knockout (K0)). Furthermore, the present invention relates to a method for screening a disease treatment / prevention drug using the model animal, and further to diagnosis and / or treatment of an autoimmune disease or bone disease obtained by the screening method.
  • DGIR dendritic cell immune receptor
  • Rheumatoid arthritis is a systemic chronic inflammatory disease that mainly affects the synovium in many joints, which in turn causes cartilage destruction, bone erosion, and joint deformation and joints. Cause loss of function.
  • the disease is autoimmune and is characterized by infiltration of T cells, B cells, macrophages, and neutrophils into the synovial surface and periarticular fluid.
  • the present inventors have previously established two types of mouse models for rheumatoid arthritis using embryo genetic manipulation techniques. These are human T cell leukemia virus type I transgeneic (HTLV- ⁇ Tg) mice (Patent Document 1) and IL-1 receptor antagonist-deficient (IL-1 Ra-/ _) mice (Patent Document 2). Yes, spontaneously develop autoimmunity and arthritis. The pathology of infected joints in these animals was very similar to human rheumatoid arthritis. The inventors comprehensively analyzed the gene expression of these two arthritis model mice using a microarray, and found that there was a strong correlation in gene expression between HTLV-ITg mice and IL_1Ra + mice. I found something. That is, although the two mouse models were clearly different in etiology, not only histopathology but also gene expression patterns were similar to each other.
  • G-type lectin receptor is a pattern recognition molecule that recognizes a specific sugar chain structure on the self-antigen or pathogen cell wall by a sugar chain recognition domain (GRD) in the extracellular region.
  • MMR mannose receptor
  • IGAM3 dendritic cell specific IGAM3-grabbing non-integrin
  • GLR including (DC-SIGN; CD209), L-SIGN and S-GR (Dectin-1) are involved in the recognition of various microorganisms such as viruses, bacteria, fungi and several parasites.
  • G-type lectin receptor signaling has been reported to be facilitated by Tol ⁇ I ike receptor (TLR) signaling, suggesting crosstalk between these two signaling pathways .
  • TLR Tol ⁇ I ike receptor
  • G-type lectin receptors also regulate dendritic cell migration and their interaction with lymphocytes.
  • Other members on NK cells such as human GD94 / NKG2 and mouse Ly49 are associated with recognition of MHG class I to distinguish self from non-self. That is, GLR plays a role in both innate immunity and acquired immunity.
  • Some GLRs have an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) or an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (immunoreceptor) in their cytoplasmic region. It has a signaling motif such as tyros ine-based activating motif (ITAM)), suggesting a regulatory role in dendritic cell function expression.
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
  • immunoreceptoreceptor immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • DG Dendritic cells
  • APG antigen-presenting cells
  • GLRs are expressed on the surface of dendritic cells.
  • MMR CD206
  • DEG-205 DEG-205
  • GRD calcium-dependent extracellular sugar chain recognition domains
  • the second family of GLRs expressed on dendritic cells is a type II protein with a unique GRD at the G-terminus, including DG-SIGN (CD 209), Langerin (GD207), GLEG-1, Dectin -1 (S_GR), Dectin-2, DLEG, and DGIR are included.
  • DGIR also called LLIR
  • LLIR is expressed mainly on dendritic cells in humans and mice II It is a type membrane protein. This molecule has a single carbohydrate recognition domain (GRD) in the extracellular domain and a consensus ITIM in the intracellular domain. Since ITIM transmits an inhibitory signal into cells, it was suggested that mouse DGIR acts as an inhibitory receptor and regulates dendritic cell function. However, no specific evidence has been presented to date regarding the functional role of DGIR in vivo.
  • Patent Document 1 JP-A-6_38652
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000_209980
  • DG IR dendritic cell immune receptor
  • DGIR dendritic cell immunoreceptor
  • the present invention also provides
  • a screening method for a substance that promotes or suppresses differentiation and proliferation of bone marrow stem cell-derived cells or an arthritis development inhibitor using the disease model animal and also includes a compound or a salt thereof identified by the screening method Providing a preventive / therapeutic agent for autoimmune diseases.
  • the present invention provides: (3) A substance that promotes the activity of a dendritic cell immune receptor (DGI R) protein or a substance that promotes the expression of a gene encoding a dendritic cell immune receptor (DGI R) protein.
  • DGI R dendritic cell immune receptor
  • DGI R a substance that promotes the expression of a gene encoding a dendritic cell immune receptor
  • An autoimmune disease comprising a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as a dendritic cell immune receptor (DGIR) protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • DGIR dendritic cell immune receptor
  • a DNA encoding a nucleotide sequence identical to or substantially the same as a gene encoding a dendritic cell immune receptor (DGIR) protein, or for diagnosis of an autoimmune disease Provide kit.
  • DGIR dendritic cell immune receptor
  • the DGI R-deficient (K0) mouse (abbreviated as DGI R + mouse) according to the present invention has enhanced sensitivity to collagen-induced arthritis (GI A), and the mouse is a disease model animal for autoimmune diseases including arthritis. Useful.
  • aging DGI R deficient mice spontaneously develop autoimmune-like diseases such as inflammation (adherenceitis) and salivary glanditis in tendon, ligament and bone adhering areas.
  • the regulatory role of the disease model mice of the present invention was demonstrated for the first time in rheumatoid arthritis (RA), ankylosing spondylitis (AS), idiopathic systemic osteosclerosis (DI SH), or Sjogren's syndrome ( It is extremely useful as an autoimmune disease model such as SS).
  • the disease model animal of the present invention can be used as a model animal for bone disease because an increase in the calcified region in the heel joint and a decrease in bone mass in the femur are observed compared to the wild type.
  • DGI R is involved in regulating the inhibitory function of dendritic cells
  • DGI R protein or its equivalent can be an activator in cancer immunotherapy.
  • FIG. 1 (a) is a graph showing the expression level of DGIR mRNA in the joints of IL_1Ra ⁇ / _ mice and HTL V_T_Tg mice that developed arthritis by microarray analysis.
  • (B) It is a figure which shows the expression of DGIR mRNA by a Northern blot analysis.
  • FIG. 2 (a) Schematic diagram showing the structure of the mouse DGIR site (wild-type allele), DGIR targeting construct (targeting vector), and the predicted mutant DGIR gene (mutant allele) in the production of DGIR + mice. is there. Exons are shown in boxes. Exons 1 and 2 of the DGIR gene were replaced with the neomycin resistance (Neo) gene. The diphtheria toxin (DT) gene was ligated to the 3 'end of the genomic fragment for negative selection. The region of external homology found in the targeting aryl was used as a genomic probe for Southern plot analysis. Southern blot analysis for screening was performed using BanHI.
  • FIG. 3 is a diagram showing the characteristics of lymphocytes in DGIR-deficient mice. Thymocytes and spleen cells of wild type (WT) and DGIR-deficient mice were analyzed by flow cytometry. Thymocytes and splenocytes were analyzed for expression of GD4 and GD8, and splenocytes were also analyzed for expression of GD3 and B220.
  • FIG. 4 is a diagram showing proliferation of T cells depending on dendritic cells.
  • A Non-antigen-specific stimulation (anti-GD3 antibody) in the presence of spleen-derived T cells from wild-type mice and wild-type
  • FIG. 6 is a graph showing dendritic cell accumulation and sputum cell activation in aging DGIR-deficient mice.
  • A is a diagram stained GD11c and Bok A b lymph node cells. The numbers in the figure indicate the percentage of cells in a particular gate. The lower histogram shows the GD11C positive group in the lymph node cells.
  • B A graph showing the results of analyzing the ratio of GD11c-positive cells in lymph node cells in mice aged 4 months and over 12 months by flow cytometry. Average values and SEM are shown. *: p ⁇ 0.05.
  • C Stained GD4 and GD62L or GD44 of lymph node cells derived from 12-month-old wild-type and DG IR-deficient mice.
  • D Use a stained GD8 and GD62L or GD44.
  • FIG. 7 is a graph showing the progression of GIA in DGIR-deficient mice.
  • Avian I IG was suspended together with GF A and immunized subcutaneously at multiple sites on the bottom of the mouse tail.
  • the development of GIA was tested in the condition without boost.
  • the incidence (a) and severity (b) are shown. Average values and SEM are shown.
  • the graph is a combination of the results of two independent experiments. *: (a) c 2 test, (b) Mann-Whitney U test ⁇ ⁇ 0 ⁇ 05.
  • FIG. 8 is a graph showing an enhanced immune response in DGIR-deficient mice during GI ⁇ induction.
  • a Graph showing the serum levels of IgM and IgG in DG IR-deficient mice after IIG / GFA immunization.
  • C IIG-specific T cell proliferative response.
  • FIG. 9 is a graph showing increased proliferation of dendritic cells in DGIR-deficient mice after immunization with IIG / GFA.
  • (A) It is a graph which shows the result of having dyed GD11c and performing FAGS analysis. Average values and SEM are shown. *: p ⁇ 0.05; **: p ⁇ 0.01.
  • Lymph node cells were cultured for 72 h in the absence (Med) or presence (Gl I) of denatured avian IIG, then double-stained with GD11c and ⁇ A b , GD80, or GD86. It is a figure which shows the result analyzed by the tomtry. The numbers in the figure indicate the percentage of cells in the indicated gate.
  • FIG. 10 shows enhanced reactivity of DGIR-deficient bone marrow cells (DGIR-/-BMC) to GM-GSF.
  • B the GD11c and Bok A b nonadherent bone marrow-derived cells in 8 days after start of the culture were stained, Furosai DOO It is the figure analyzed by the metric.
  • FIG. 5 is a diagram obtained by analyzing the flow cytometry.
  • D Treat bone marrow cells with GM-GSF at the concentration shown in the figure for 20 minutes to prepare a whole cell lysate. After electrophoresis, phosphorylated STAT5 and STAT5 are anti-phosphorylated STAT5 antibody or anti-STAT5 antibody, respectively. Detected with.
  • FIG. 11 is an X-ray photograph showing the skeleton of the DGIR-deficient mouse and wild-type mouse in Example 11.
  • FIG. 12 is an X-ray photograph of an ankylosing part ( ⁇ ) of a DGIR-deficient mouse and a wild type mouse in Example 11.
  • FIG. 13 is a cross-sectional photograph of the tissue when Von Kossa staining (left side) and Toluidine blue staining (right side) of the DGIR-deficient mouse in Example 11 were performed.
  • FIG. 14 is a photograph showing the state of pQGT analysis in the femur of a DGIR-deficient mouse.
  • FIG. 15 is a graph showing bone density and bone mineral density of DGIR-deficient mice and wild-type mice obtained from pQGT analysis. Bone density is the average density of the selected area, and bone mineral density is the bone mineral density when the bone in the selected area is one country thick.
  • FIG. 16 is a graph showing changes in tumor size (A) and incidence (B) when MethA was inoculated into DGIR-deficient mice and wild-type mice.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of measuring cytotoxic activity using BALB / 3T3 APR-MUC1 clone16. * ⁇ 0.01
  • the disease model animal of the present invention is preferably a rodent, particularly a mouse.
  • autoimmune diseases such as arthritis occur spontaneously. It is useful as a model animal for autoimmune diseases.
  • Examples of autoimmune diseases that can be studied using the model animals of the present invention include rheumatoid arthritis (RA), ankylosing spondylitis (AS), Siegren's syndrome (SS), or idiopathic systemic osteosclerosis (DI SH). ) Etc., but is not limited to these.
  • RA rheumatoid arthritis
  • AS ankylosing spondylitis
  • SS Siegren's syndrome
  • DI SH idiopathic systemic osteosclerosis
  • Etc. but is not limited to these.
  • it can be used not only as a self-immune bone disease such as AS or DISH but also as a model of metabolic bone disease such as osteoporosis.
  • a test substance is administered to the disease model animal, or a tissue, organ, or cell derived from the animal is contacted with the test substance, and the animal or tissue A substance that promotes or suppresses the differentiation and proliferation of bone marrow stem cell-derived cells, comprising measuring and evaluating the differentiation and proliferation of bone marrow stem cell-derived cells in an organ or cell.
  • a test substance can be administered to the above-mentioned disease model animal, and the incidence of arthritis and the arthritis score of collagen-induced arthritis can be measured and evaluated to identify an arthritis development inhibitor.
  • the screening method of the present invention further includes comparing the measurement and evaluation results obtained with the disease model animal with the results obtained with a wild-type animal of the same species.
  • RA rheumatoid arthritis
  • AS ankylosing spondylitis
  • PsA psoriatic arthritis
  • SS Siegren's syndrome
  • DI SH idiopathic systemic osteosclerosis
  • the present invention provides a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease or osteoporosis comprising a substance that promotes the expression of a gene encoding a dendritic cell immune receptor (DGIR) protein.
  • DGIR dendritic cell immune receptor
  • the DNA encoding the gene encoding the DGI R protein or a partial sequence thereof is effective as a diagnostic agent for autoimmune diseases or osteoporosis. That is, the present invention also provides a diagnostic agent for autoimmune disease or osteoporosis containing the DNA.
  • a peptide having an amino acid sequence that is the same as or substantially the same as a dendritic cell immune receptor (DGI R) protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof is cultured with a candidate substance, By comparing the activity of the DGI R protein in the presence or absence of the candidate substance, a substance that promotes the activity of the DGI R protein, that is, a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease or osteoporosis, can be screened.
  • DGI R dendritic cell immune receptor
  • a DNA encoding a DGI R is obtained by using, as a probe, a DNA encoding the same or substantially the same base sequence or a partial sequence thereof as a gene encoding a dendritic cell immune receptor (DGI R) protein. It is possible to diagnose susceptibility to autoimmune disease or osteoporosis by measuring the presence or absence or the expression level thereof, and the present invention provides a kit therefor.
  • DGI R dendritic cell immune receptor
  • the present invention revealed for the first time that dendritic cell immune receptors (DGIR) are associated with the onset and progression of autoimmune diseases.
  • the dendritic cell immune receptor (DGIR) is one of the suppressors of the immune system and plays a role in suppressing the immune response in the physiological state. Therefore, conversely, a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as a dendritic cell immunoreceptor (DGI R) protein (especially a soluble extracellular protein portion) or a partial peptide thereof or a salt thereof is administered.
  • DGI R dendritic cell immunoreceptor
  • HTLV- ⁇ Tg mice were prepared by injecting the LT R-env-pX-LTR region of the HTLV-I genome into the embryo (G3H / Hen x C57BL / 6J) and BALB / cA mice (GLEA Japan. , Tokyo, Japan). These mice spontaneously develop arthritis at 4 weeks of age, 60% at 3 months and 80% at 6 months.
  • HTLV-Tg male, 6-9 weeks old
  • IL-1 Ra-/ _ mice For IL-1 Ra-/ _ mice, IL-1 Ra + mice prepared by homologous recombination were backcrossed to BALB / cA mice for 8 generations. These mice spontaneously develop arthritis at 5 weeks of age, with 80% and approximately 100% of mice developing by 8 and 13 weeks of age, respectively.
  • IL_1Ra ⁇ / _ mice (KS) (male, 13 weeks old) who developed severe arthritis (score 3) were used. Wild-type littermates (WT) were used as controls.
  • Frozen tissue is phys Homogenized with cotron (Microtech, Chiba, Japan), prepared total RNA by guanidine thiosocyanate-phenol-chloroform extraction method, and purified poly (A) + RNA using oligo (dT) _cellulose column .
  • Poly (A) + RNA was electrophoresed on a 1.3% denatured agarose gel and transferred to a nylon membrane (Gene Screen Plus, NEN Life Science, Boston, MA, USA).
  • Hybridization was labeled with 32 P-label using the megaprime DNA labeling system (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) and 32 P-dGTP (3,000 Ci / mmol; NEN Life Science, Boston, MA, USA).
  • the DNA probe was run at 42 ° C and overnight protocol. Radioactivity was measured using a BAS-2000 system (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan).
  • Mouse DGIR probe was amplified by PGR from the joint-derived cDNA of HTLV-1_Tg mice that developed arthritis. The following PGR primers were used.
  • the genomic DNA sequence containing DGIR was obtained from the mouse genome database of Celera Genomics (Rockvi Me, MD, USA), and 5 'homologous region consisting of 5.5-kb fragment and 3' homology consisting of 2.5-kb fragment.
  • the region was amplified by PGR from genomic DNA derived from ES cells (E14. 1).
  • the PGR primer set is as follows.
  • the targeting vector comprises an intracellular domain including ITIM and a transmembrane region.
  • the genomic fragment encoding the first and second exons contained was constructed by replacing with a fragment expressing the neomycin resistance gene (Neo) under the control of the PGK1 promoter.
  • a fragment expressing diphtheria toxin (DT) was ligated to the 3 'end under the control of the MG1 promoter motor.
  • the targeting vector was introduced into ES cells by electroporation and selected with G418. 672 neomycin-resistant ES clones were picked up and 660 clones were screened by Southern plot hybridization analysis using 5 'probe.
  • the 5 ′ probe used for screening was amplified with the following primers.
  • Southern blot hybridization analysis determined 96.2% of the clones and identified two targeting ES clones (targeting efficiency: 0.3%). These targeting clones were confirmed by 3 'and Neo probes.
  • the 3 ′ probe was amplified with the following primers.
  • the Neo probe was a Nar ⁇ Xbal fragment of the neomycin resistance gene. As a result of karyotype analysis, about 80% of both clones had 40 normal chromosomes. Chimera mice were prepared by agglutination method, male chimeric mice were mated with wild-type G57BL / 6J female mice, and propagation to germline was determined by coat color. DGI
  • DG IR-deficient mice were genotyped using the following PGR primers: Common primer: 5 '_AAG TGT GGG CTC TTG TAG TCT GTG-3' (SEQ ID NO: 1 4 )
  • Wild-type primer 5'-CAA AAT TCT GTC AAG CGT AGA GGG G-3 '(SEQ ID NO: 1 5)
  • Mutant primer 5'-CAT TAT ACG AAG TTA TCT CGA GTC GC-3 '(SEQ ID NO: 1 6)
  • the common primer and the wild type primer were used for detection of the wild type allele (1.3 kb), and the common primer and the mutant primer were used for detection of the mutant allele (0.9 kb).
  • mice and DGIR-deficient mice were anesthetized with ether and fixed with reflux in a neutral buffered 10% formalin solution.
  • the joint tissues including the legs, knees, wrists and thoracic vertebrae were decalcified using 10% formic acid and then embedded in paraffin. Two to three sections were prepared for each tissue and stained with hematoxylin and eosin.
  • GD11c HL3
  • lA b AF6-120.1
  • CD3 145-2C11
  • CD45R / B220 RA3-6B2
  • CD4 RM4-5
  • CD8 53-6.7
  • CD6 2L MEL-14
  • Hamster mouse or rat mAbs specific for CD44 (IM-7) were purchased from BD PharMingen (San Diego, Calif., USA).
  • Rat mAbs specific for mouse GD80 (RMM P2) and CD86 (RMMP1) were purchased from Immunotech (Marseille, France).
  • PE modified streptavidin was used for secondary staining of the biotin modified antibody.
  • Cell surface staining is performed according to standard protocols and analysis is performed using FAGSGal ibur and Gel I Quest (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ, USA) or FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR) software. It was. [0028] Growth analysis:
  • Thy1.2 positive T cells were prepared from wild type mice, and GD11c positive dendritic cells were obtained from CD90 (Thy1.2) microbeads or spleens of wild type mice and DGIR-deficient mice. Purification by magnetic cell separation using GD11c microbeads (Mi enyiBiotech, Bergisch Gladbach, Germany). Purified Thy 1.2 positive T cells (2x10 5 eel Is) and GD11c positive dendritic cells (2 x 10 4 eel Is) were added to the anti-GD3 antibody (145-2G11; BD PharMingen) and co-cultured for 3 days.
  • Tritium-muthymidine (0.25; uGi / m Amersham, Buckinghamshire, England) was incorporated for 6 hours. The cells were then harvested on a Micro 96 cell harvester (Skatron, Lier, Norway) glass fiber filter paper, and trithymthymidine radioactivity was measured using Micro Beta (Pharmacia Biotech, Pis cataway, NJ).
  • Thy1.2 positive T cells were purified from BALB / c mice using GD90 (Thy1.2) microbeads by magnetic cell sorting.
  • dendritic cells were derived from bone marrow cells of wild type mice and DGIR-deficient mice. Dendritic cells were treated with mitomycin G, then co-cultured with Thy1.2-positive T cells for 3 days, trimethylthymidine was taken up for 6 hours, and the radioactivity was measured.
  • alkaline phosphatase (AP) -modified goat anti-mouse lgM, IgG, IgE, IgGU lgG2a, lgG2b and lgG4 were incubated at room temperature for 1 hour, and AP activity was measured by Substrate Phosphatase SI GMA104 (Sigma- Aldrich) was measured with an ELISA micro reader (MTP-120; Colona, Tokyo, Japan).
  • mouse serum diluted with mouse nuclear antigen coating plate (Alpha Diagnostic, Inc., San Antonio, TX) was incubated and horseradish beloxidase (HRP) modified enzyme was incubated. After reacting with anti-mouse IgG, HRP activity was measured using TMB substrate.
  • I Lymph nodes were collected 7 days after IG / GFA immunization, and a single cell suspension was prepared. Lymph node cells were cultured in the absence or presence of heat-denatured I IG for 3 days, and triteam thymidine (0.25 mCi / ml) was taken up for 6 hours to measure triteam thymidine radioactivity. For measurement of site force-in production, culture supernatants in collagen-specific proliferative responses were collected after 3 days and used with BD OptiEIA EL ISA Set (BD PharMingen) for IFN-g, IL-4, and IL. -10 levels were measured.
  • BD PharMingen BD OptiEIA EL ISA Set
  • Bone marrow cell-derived dendritic cells were prepared from femur and tibia bone marrow. Briefly, 2 ⁇ 10 5 eel Is / ml bone marrow cells were cultured in 10% FCS-RPM 1640 supplemented with 20 ng / ml recombinant mouse GM-GSF (PeproTech, London, UK). Add 3 times the amount of fresh medium containing 20 ng / ml GM-GSF on the 3rd day and collect half of the medium supernatant on days 6 and 8. The cells were then centrifuged and the cells were resuspended in fresh medium containing 10 ng / ml GM-GSF and returned to the original plate.
  • Tenth non-adherent cells were used as bone marrow cell-derived dendritic cells.
  • Bone marrow cells were prepared from the femur and tibia and cultured in serum-free RPM-1640 medium supplemented with 20 ng / ml recombinant mouse GM-GSF. These cells were washed and resuspended in serum-free medium without the addition of GM-GSF. After starvation for 6 hours, treatment with various concentrations of GM-GSF and phosphatase inhibitor cocktail 11 (Sigma), and whole cell lysates were treated with anti-phosphorylated STAT5 antibody (Cel l Signaling, Denvers, MA ) And anti-STA T5 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Calif.) Were used for analysis by immunoblotting.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Student's t test was used for statistical evaluation of the results excluding the following data.
  • the incidence of GIA experiment was evaluated by X-square test, and severity was evaluated by Mann-Whitney U test.
  • the Mann-Whitney U test was also used to evaluate the frequency of histopathological abnormalities.
  • HTLV-1 Tg and IL_1Ra- mice The gene expression in the joints of two model mice (HTLV-1 Tg and IL_1Ra- mice) was compared with that in normal mouse joints, and the gene whose expression was increased in the joints that developed arthritis was identified. According to microarray analysis, mRNA expression of the DGIR gene was enhanced 2.2-fold in IL-1Ra-/ _ mice and 3.8-fold in HTLV-I Tg mice compared to wild-type joints (Fig. 1a). Increased expression was also confirmed by Northern plot hybridization analysis (Fig. 1b). [Example 2]
  • DGIR-deficient mice were prepared by conventional gene targeting methods. By replacing exons 1 and 2 of the DGIR gene with a neomycin resistance gene, the genomic sequence encoding most of the cytoplasmic region and transmembrane domain including ITIM was deleted (Fig. 2a).
  • the target ES screen was screened by Southern Plot hybridization using a 5 'probe (Fig. 2b), 3' probe (Fig. 2c) and Neo probe (Fig. 2d). ) was used to confirm the targeting aryl.
  • Targeting of the DGIR region in mice was confirmed by genomic Southern plot analysis ( Figure 2e). DGIR- mice were produced by crossing DGIR mice, and it was confirmed by Northern plot hybridization analysis that DGIR mRNA expression in the spleen was deficient (Fig. 2f).
  • DGIR- mice were fertile, born at a Mendelian ratio, and did not show clear phenotypic abnormalities at an early age under breeding conditions free of specific pathogens. In addition, no obvious abnormality was observed in thymus and spleen cells of DGI R-/-mice (Fig. 3).
  • T cell proliferation response and allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR) upon stimulation with anti-GD3 antibody in the presence of dendritic cells were measured. As a result, no significant difference was detected between DGIR-deficient dendritic cells and wild-type dendritic cells (Fig. 4).
  • mice developed hind limb joint abnormalities at 4 months of age. 28% Mau by 6 months of age, beginning with arthritis with redness and swelling of multiple joints Sus developed arthritis. The incidence and severity of arthritis increased with age, causing joint deformity and stiffness. Most of them were prominent in the hind limb ankle joint
  • Salivary glanditis wild type 0/3 (0) 0/2 (0) 0/5 (0)
  • DGIR-deficient mice produced higher levels of autoantibodies such as antinuclear antibody (ANA), rheumatoid factor (RF), and anti-IIG antibody compared to wild-type mice. This result suggests that DGIR deficiency is involved in autoantibody production.
  • autoantibodies such as antinuclear antibody (ANA), rheumatoid factor (RF), and anti-IIG antibody compared to wild-type mice. This result suggests that DGIR deficiency is involved in autoantibody production.
  • Dendritic cell proliferation and activation of GD4-positive T cells in DC IR-deficient mice As a result of examining the ratio of GD11c-positive cells that are DGIR-expressing cells in DGIR-deficient mice, the ratio of GD11c-positive cells was normal under young physiological conditions, but increased markedly after 12 months of age. Also, most of the GD11c positive cells expressed Bok A b. Furthermore, GD4-positive T cells of DGIR-deficient mice showed a low GD62L expression characteristic of activated T cells and a high GD44 expression phenotype. No significant changes were observed in GD8 positive T cells (Fig. 6).
  • GIA immunized mice 129 / Sv X C57BL / 6
  • I IG avian type II collagen
  • T cell responses to I IG were measured 7 days after the initial immunization with avian I IG / GF A.
  • the proliferation response of antigen-specific T cells in DGIR-deficient mice was significantly increased compared to wild-type mice (Fig. 7c), suggesting that priming of T cells was promoted in DGIR-deficient mice.
  • IFN-g production from lymph node cells after IG stimulation was similarly observed in DGIR-deficient mice and control mouth mice.
  • IL-4 and IL-10 levels were significantly increased in DGIR-deficient lymph node cells (Fig. 7d).
  • DGIR is mainly expressed in dendritic cells
  • the differentiation of DGIR-deficient bone marrow cells into dendritic cells was evaluated.
  • DGIR-deficient bone marrow cells were cultured with GM-GSF added, differentiation of nonadherent bone marrow-derived cells was significantly enhanced in DGIR-deficient bone marrow cells (Fig. 1 Oa).
  • Flow cytometric analysis of non-adherent cells on day 8 of culture showed that GD11C-positive bone marrow-derived dendritic cells (BMDG) increased markedly in culture of DGIR-deficient bone marrow cells ( Figure 10b). .
  • BMDG GD11C-positive bone marrow-derived dendritic cells
  • DGIR-deficient mice were produced, and DGI R was shown to be involved in autoimmune salivary glanditis and arthropathy.
  • DGIR-deficient mice spontaneously develop characteristic autoimmune diseases.
  • serum immune globulin levels increased in DGIR-deficient mice, producing higher levels of autoantibodies such as antinuclear antibodies, rheumatoid factors and anti-IGG antibodies compared to wild-type mice.
  • Histological analysis also showed pathological changes in the salivary glands and attachments of DGIR-deficient mice. Lymphocyte infiltration into the salivary glands is a typical sign of Siegren's syndrome (SS), a typical chronic autoimmune disease that targets the salivary glands.
  • SS Siegren's syndrome
  • N 0D, MRL / l pr and NZB / W ⁇ are widely accepted models of SS.
  • Patients with other autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis, complex joint tissue disease (MGTD), ankylosing spondylitis (AS), and spondyloarthropathy (SpA) also have a high rate of localized salivary glanditis. Is deeply involved in the production of rheumatoid factors.
  • DGI R-deficient mice Spontaneous ankylosing arthropathy was also observed spontaneously in aging DGI R-deficient mice. Histopathological analysis of these mice revealed erosive destruction of bones and attachments with infiltration of inflammatory cells. However, the pathological organization of DGI R-deficient mice was clearly different from that of other rheumatoid arthritis model mice such as HTLV- ⁇ Tg mice, IL_1Ra_K0 mice, and GIA mice. Unlike other model mice that develop characteristic synovitis similar to baboon rheumatoid arthritis, adherentitis is the first abnormality in DGI R-deficient mice, and synovitis is rarely observed. It was only.
  • Synovitis is a characteristic of rheumatoid arthritis, whereas adhesionitis is characterized by inflammatory rheumatic diseases such as ankylosing spondylitis (AS), spondyloarthritis (SpA) and psoriatic arthritis (PsA) It is a typical sign.
  • AS ankylosing spondylitis
  • SpA spondyloarthritis
  • PsA psoriatic arthritis
  • GIA was exacerbated in DGI R-deficient mice.
  • the levels of antigen-specific lgG1 and lgG3 in the serum of DGI R-deficient mice were greatly increased.
  • antigen-specific T cell responses were enhanced, and it was revealed that immune responses to IIG were enhanced in DGI R-deficient mice.
  • the proportion of dendritic cells in DGI R-deficient mice was markedly increased and activated. An increase in the percentage of dendritic cells was observed in aged DGI R-deficient mice, but was normal in young mice under physiological conditions.
  • GM-GSF force produced by stimulation with IG / GFA is involved in the proliferation of DG in GIA.
  • FIG. 10 enhanced sensitivity of GM-GSF signaling by DGIR deficiency promotes proliferation and differentiation of bone marrow-derived dendritic cells in vitro.
  • Increased STAT5 phosphorylation by GM-GSF stimulation in DGIR-deficient bone marrow cells suggests that DGIR suppresses GM-GSF signaling. It has been reported that human DCIR recruits SHP-1 and SHP-2.
  • SHP-1 is a SH2 domain-containing thymosine phosphatase that negatively regulates cytokine signaling including GM-GSF.
  • SHP-1-deficient motheaten mice show systemic autoimmunity and severe inflammation. Because mouse DGIR ITIM is functional and its amino acid sequence is identical to human DGIR ITIM, it is assumed that mouse DGIR also recruits SHP-1 and SHP-2 to regulate GM-GSF signaling Is done.
  • Dendritic cells are involved in the differentiation of Th1 and Th2 effector T cells. Dendritic cells exposed to intracellular parasites promote Th1 responses, while certain parasites promote Th2 cell differentiation by dendritic cells. Regulatory T cell (Treg) differentiation is also regulated by dendritic cells, and certain pathogens are known to induce Treg production. Thus, the interaction between dendritic cells and pathogens is important to induce a specific subset of effector T cells, and DGIR is one of the dendritic cell receptors involved in specific T cell differentiation there is a possibility. [0057] Recent genome-wide linkage analysis has revealed susceptibility regions for many autoimmune diseases.
  • the mouse 6F2 site band in which the DGIR gene is present, rat 4q42, which is the same chromosome, and human 12p13 region are associated with arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), spontaneous diabetes, atherosclerosis, encephalomyelitis, It is associated with several inflammatory diseases such as asthma or airway responsiveness, and allergies.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • spontaneous diabetes spontaneous diabetes
  • atherosclerosis encephalomyelitis
  • It is associated with several inflammatory diseases such as asthma or airway responsiveness, and allergies.
  • DGIR deficiency causes autoimmune-like diseases, suggesting that DGIR is one of the susceptibility genes for such inflammatory diseases.
  • DGIR is involved in the regulation of bone metabolism and differentiation and proliferation of chondrocytes, osteoblasts or osteoclasts. This suggests that DG IR will be a good model mouse for osteoporosis as well as AS and ISH.
  • MethA When MethA was used as a transplantable tumor cell, 1 ⁇ 10 6 cell / head of MethA was inoculated into DGI R-deficient mice and wild-type mice, and the difference in tumor formation was observed. As a result, although there was no difference in the incidence, a suppressive effect was observed predominantly in DGIR-/-mice in terms of tumor size (Fig. 16).
  • BALB / 3T3 APR-MUC1 (BALB / c background) in which human MUG1 known as a cancer antigen was expressed in fibrosarcoma
  • BALB / 3T3 was used as a transplantable tumor cell line.
  • BALB / 3T3 APR-MUC1 clone16 was provided by Tohoku University Aging Research Institute and contains 10% FBS (SIGMA), 50U penicillin (Meiji Seika), 50mg / ml streptomycin (Meiji Seika) 500mg / ml G418 (Nakarai Tesque)
  • the cells were cultured in RPM 1640 (SIGMA) and subcultured 2-3 times a week.
  • Induction of cytotoxic T cells (GTL) using the tumor cell line BALB / 3T3 APR-MUC1 clone16 was performed as follows. Tumor cells were inactivated by 8000 rad r-irradiation and inoculated intraperitoneally on days 1 and 10 at 1 ⁇ 10 7 cel Is / head. Five days after immunization, the mouse spleen was collected and spleen cells were prepared. The obtained spleen cells were co-cultured with tumor cells inactivated with 10we II plate so that the ratio was 1 ⁇ 10 7 : 1 ⁇ 10 6 and restimulated for 3 days.
  • Target cells are labeled with sodium lOO ⁇ Gi sodium chromate, 51 Gr (GE Healthcare Bioscience) for 1 hour at 37 ° C, then suspended in RPM ⁇ 1640 (10% FBS, 10 mM 2-Mercapto ethanol) did. Lymphocytes were separated from the re-stimulated spleen cells using Lymphocyte-M (GEDARLANE) and co-cultured with target cells labeled with a 96-well round-bottom plate (IWAKI). After 4 hours, the cytotoxic activity was measured by detecting the released 51 Gr as radioactivity with Micro Bete (Pharmacia).

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Description

明 細 書
樹状細胞免疫受容体遺伝子ノックァゥト疾患モデル動物
技術分野
[0001 ] 本発明は、 樹状細胞免疫受容体 (DG I R)遺伝子を欠損 （ノックアウト（K0) ) した関節症等を含む自己免疫疾患や骨疾患のモデル動物に関する。 さらに本 発明は、 当該モデル動物を用いた疾患治療/予防薬のスクリーニング方法、 さらには当該スクリーニング方法によって得られる自己免疫疾患又は骨疾患 の診断及び/又は治療にも関する。
背景技術
[0002] 関節リウマチ（RA)は、 全身性の慢性炎症性疾患であり、 主に多くの関節に おける滑膜に影響し、 滑膜の炎症は軟骨破壊、 骨侵食、 ひいては関節変形及 び関節機能の喪失をもたらす。 この疾患は自己免疫性であり、 滑膜表層及び 関節周辺腔液への T細胞、 B細胞、 マクロファージ及び好中球の浸潤を特徴 とする。
[0003] 本発明者等は、 以前に胚の遺伝子操作技術を用いて関節リゥマチについて の 2種類のマウスモデルを確立した。 これらは、 ヒト T細胞白血病ウィルス I型トランスジエニック （HTLV-卜 Tg) マウス （特許文献 1 ) 及び I L - 1受 容体アンタゴニスト欠損（I L-1 Ra-/_)マウス （特許文献 2 ) であり、 自己免疫と 関節炎を自発的に発症する。 これらの動物における感染した関節の病理組織 はヒトの関節リウマチに極めて類似していた。 本発明者等は、 マイクロアレ ィを用いてこれら 2つの関節炎モデルマウスの遺伝子発現を包括的に解析し たところ、 HTLV- I Tgマウスと I L_1 Ra+マウスとの間で遺伝子発現に強い相関 があることを見いだした。 即ち、 これら 2つのマウスモデルは病因学的に明 らかに相違しているにもかかわらず、 組織病理学的のみならず遺伝子発現パ ターンも互いに類似していた。
[0004] 即ち本発明者等は、 これらの関節リウマチ（RA)モデルマウスにおいて、 染 色体 6F2サイ トバンドに存在するいくつかの遺伝子の発現が有意に亢進するこ とを新たに発見した。 これらの遺伝子は、 カルシウム依存性 （G型） レクチン スーパ一ファミリ一遺伝子を含んでいた。 G型レクチン受容体 (GLR)はパター ン認識分子であり、 細胞外領域の糖鎖認識ドメイン （GRD)によって自己抗原 又は病原体細胞壁上の特定の糖鎖構造を認識する。 マクロファージマンノー ス受容体 （MMR; CD206) 、 樹状細胞特異的 IGAM3-グラビング非-インテグリン
(DC-SIGN; CD209) 、 L- SIGN及びS- GR (Dectin-1) を含む GLRは、 ウィルス 、 バクテリア、 真菌及び幾つかの寄生虫などの様々な微生物の認識に関与し ている。 興味深いことに、 G型レクチン受容体のシグナル伝達は Tol卜 I ike受 容体 (TLR)のシグナル伝達によって促進されることが報告され、 これら 2つの シグナル伝達経路の間のクロストークが示唆されている。 また G型レクチン受 容体は樹状細胞の遊走及びそれらのリンパ球との相互作用も調節する。 ヒト G D94/NKG2 及びマウス Ly49等の NK細胞上の他のメンバ一は、 自己を非自己から 識別するための MHGクラス Iの認識に関連している。 即ち、 GLRは、 自然免疫 及び獲得免疫の両方において役割を担っている。 GLR類の幾つかは、 それらの 細胞質領域に、 免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ （i國 unoreceptor ty rosine-based inhibitory motif ( I T I M) ) 又は免疫受容体チロシンべ一ス活 性化モチ一フ ( immunoreceptor tyros ine-based activating motif ( I TAM) ) といったシグナル伝達モチーフを有しており、 樹状細胞機能発現における調 節的な役割が示唆されている。
[0005] 樹状細胞 （DG)は主要な抗原提示細胞 （APG)であり、 免疫系の調節において 中枢的な役割を担う。 近年、 幾つかの GLR類が樹状細胞の表面に発現されると のキャラクタリゼ一シヨンがなされた。 I型の GLR類メンバ一である MMR (CD2 06)及び DEG-205 (GD205)は、 その N末端に複数のカルシウム依存性細胞外糖鎖 認識ドメイン （GRD)を有する。 樹状細胞上に発現する GLRの第 2のファミリ一 は、 G末端に唯一の GRDを持つ I I型タンパク質であり、 それらは DG-SIGN (CD 209) 、 Langerin (GD207)、 GLEG- 1、 Dectin-1 (S_GR) 、 Dectin- 2、 DLEG、 及 び DGIRを含む。
[0006] DGIRは LLIRとも呼ばれ、 ヒト及びマウスの主に樹状細胞上に発現する I I 型膜タンパク質である。 この分子は細胞外ドメインに一つの糖鎖認識ドメイ ン （GRD)を持ち、 細胞内ドメインにコンセンサス ITIMを持つ。 ITIMは細胞内 に抑制的シグナルを伝達するので、 マウス DGIRは抑制的な受容体として働き 、 樹状細胞機能を調節することが示唆された。 しかしながら、 in vivoにおけ る DGIRの機能的役割に関する具体的証拠は今日まで提示されていない。
[0007] 特許文献 1 ：特開平 6 _ 38652号公報
特許文献 2：特開 2000 _ 209980号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 即ち、 本発明は、 自己免疫疾患である関節リウマチについて確立された 2 つのマウスモデルにおいて共通して発現が亢進された樹状細胞免疫受容体 (DG IR)に着目してなされたものであり、 関節炎を含む自己免疫疾患の発症におけ る DGIRの役割を解明すべく DGIR欠損（K0)マウス （DGIR-/-マウス） を作製し、 該欠損マウスの疾患動物モデルとしての有用性を実証し、 当該欠損マウスを 用いた自己免疫疾患の治療あるいは予防に有効な薬剤のスクリーニング法を 提供し、 さらには当該スクリーニング法によって同定されうる自己免疫疾患 の治療■予防剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 即ち、 本発明は、
( 1 ) 樹状細胞免疫受容体 （DGIR)タンパク質をコードする遺伝子の一部又は 全部が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト疾患モデル動物を提供す る。
また、 本発明は、
(2) 前記疾患モデル動物を用いた、 骨髄幹細胞由来細胞の分化及び増殖促 進又は抑制する物質又は関節炎の発症抑制物質のスクリーニング方法、 並び に当該スクリーニング方法で同定される化合物又はその塩を含有してなる自 己免疫疾患の予防■治療剤を提供する。
[0010] さらに本発明は、 ( 3 ) 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質の活性を促進する物質、 あるい は、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質をコードする遺伝子の発現を促進 する物質を含有してなる自己免疫疾患の予防■治療剤、 並びに、 樹状細胞免 疫受容体 （DGI R)タンパク質をコードする遺伝子又はその部分配列をコードす る DNAを含有してなる自己免疫疾患の診断薬を提供する。
さらに本発明は、
( 4 ) 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質と同一又は実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩を含有す ることを特徴とする自己免疫疾患の予防■治療剤のスクリーニング用キット
、 並びに、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質をコードする遺伝子と同一 又は実質的に同一の塩基配列またはその部分配列をコードする DNAを含有する ことを特徴とする自己免疫疾患の診断用キットを提供する。
発明の効果
本発明に係る DGI R欠損 （K0)マウス （DGI R+マウスと略記） では、 コラーゲ ン誘導関節炎 （GI A)に対する感受性が亢進しており、 当該マウスは関節炎を 含む自己免疫疾患の疾患モデル動物として有用である。 また、 加齢した DGI R 欠損マウスが、 腱、 靱帯と骨の付着部における炎症 （付着部炎） や唾液腺炎 等の自己免疫様疾患を自発的に発症することから、 免疫系における DGI Rの調 節的役割が初めて明らかにされ、 本発明の疾患モデルマウスは、 関節リウマ チ （RA)、 強直性脊椎炎 (AS)、 特発性全身性骨硬化症 (D I SH) , あるいはシェ グレン症候群 (SS)等の自己免疫疾患モデルなどとして極めて有用である。 また、 本発明の疾患モデル動物は、 野生型に比較して踵関節における石灰 化領域の増加及び大腿骨における骨量の減少が見られるので、 骨疾患のモデ ル動物としても使用しうる。
さらに、 DGI Rを欠損した本発明のモデル動物においては抗腫瘍免疫効果の 向上が観察された。 DGI Rは樹状細胞の抑制性の機能調節に関与していること から、 DGI Rタンパク質又はその等価物は、 ガン免疫療法における賦活剤とな りうる。 本発明のモデル動物を用いることによって、 DGIRの生理学的機能の解析、 自己免疫発症機構の解析が可能になる。 また、 RAや AS、 DISHあるいは骨粗鬆 症といった骨■軟骨疾患の発症メカニズムを解明し、 より有効な治療/診断 の方法及び薬剤を開発することができる。
図面の簡単な説明
[図 1] (a) マイクロアレイ解析による関節炎を発症した IL_1Ra-/_マウス及び H TL V_T_Tgマウスの関節における DGIR mRNAの発現量を示すグラフである。 （ b) ノーザンブロット解析による DGIR mRNAの発現を示す図である。
[図 2] (a) DGIR+マウスの作製における、 マウス DGIR部位 （野生型アレル ) 、 DGIRターゲテイング構築物 （ターゲティングベクター） 、 及び予測され る変異 DGIR遺伝子 （変異体アレル） の構造を示す模式図である。 ェキソンは ボックスで示す。 DGIR遺伝子のェキソン 1及び 2は、 ネオマイシン耐性 （Neo ) 遺伝子で置換した。 ジフテリア毒素 （DT) 遺伝子は、 ネガティブセレクシ ヨンのためにゲノムフラグメントの 3' 末端に連結した。 タ一ゲティングァリ ルに見られる外部相同性領域をサザンプロット解析のためのゲノムプローブ として使用した。 スクリ一ニングのためのサザンブロット解析は BanHIを用い て実施した。 （b) タ一ゲティングした ESクローンの BanHI切断ゲノム DNAと 5 ' プローブを用いたサザンブロットハイブリダィゼ一シヨン解析の結果を示 す図である。 （c) EcoRI切断ゲノム DNAと 3' プローブを用いたサザンブロッ トハイブリダィゼ一シヨン解析の結果を示す図である。 （d) EcoRI切断ゲノ ム DNAと Neoプローブを用いたサザンブロットハイプリダイゼ一ション解析の 結果を示す図である。 （e) マウスの DGIR領域の正しいタ一ゲティングを確 認するゲノムサザンプロット分析結果を示す図である。 （ f ) ノーザンプロ ット解析による DGIR mRNAの発現を示す図である。
[図 3]DGIR欠損マウスにおけるリンパ球の特徴を示す図である。 野生型 （WT) 及び DGIR欠損マウスの胸腺細胞及び脾細胞をフローサイ トメ トリー解析した 。 胸腺細胞及び脾細胞は、 GD4及び GD8の発現について解析し、 さらに脾細胞 は GD3及び B220の発現についても解析した。 [図 4]樹状細胞に依存する T細胞の増殖を示す図である。 （a) 抗原非特異的 な刺激 （抗 GD3抗体） 存在下で、 野生型マウスからの脾臓由来 T細胞と野生型
(WT) 及び DGIR欠損 （K0) マウス由来の樹状細胞とを共培養したときの T細胞 によるトリチームチミジン取り込み量を示すグラフである。 （b) BALB/cAマ ウス （H_2d) 由来の T細胞を、 （129/Sv X C57BL/6) Π背景のマウス （H_2b) の野生型 （WT) 及び DGIR欠損 （K0) マウス由来の樹状細胞と共培養したとき の T細胞によるトリチームチミジン取り込み量を示すグラフである。
[図 5]DGIR欠損マウスにおける自己抗体産生の亢進を示すグラフである。 12ケ 月齢の DGIR欠損マウス （n=19) 及び野生型同腹子 （n=19) の血清抗体レベル を ELISA により測定した。 （a) 全 lgM、 IgG及び IgEレベルを示す。 （b) 自 己抗体のレベルを示す。 抗核抗体 （ANA) 、 リウマチ因子 （RF IgM及び RF IgG ) 、 及び抗 I IG抗体のレベルを示す。 平均値及び SEMを示す。 * : p<0.05； **
： ρ〈0·01。
[図 6]加齢 DGIR欠損マウスにおける樹状細胞の蓄積と Τ細胞の活性化を示す図 である。 （a) リンパ節細胞の GD11cおよび卜 Abを染色した図である。 図中の 数字は特定のゲート中の細胞の割合を示す。 下のヒストグラムはリンパ節細 胞中の GD11C陽性群を示す。 （b) 4ヶ月齢および 12ヶ月齢以上のマウスにお けるリンパ節細胞中の GD11c陽性細胞の割合をフローサイ トメ トリーで解析し た結果を示すグラフである。 平均値及び SEMを示す。 * : p〈0.05。 ( c) 12ケ 月齢の野生型および DG I R欠損マウス由来のリンパ節細胞の GD4及び GD62Lまた は GD44を染色した図である。 （d) GD8及び GD62Lまたは GD44を染色した図で める。
[図 7]DGIR欠損マウスにおける GIAの増悪化を示すグラフである。 トリ I IGを GF Aと共に懸濁し、 マウス尾底部の複数箇所に経皮下に免疫した。 GIAの発症は 追加免疫なしの条件で試験した。 発症率 （a) 及び重症度 （b) を示す。 平 均値及び SEMを示す。 グラフは独立した 2回の実験結果を合わせたデータであ る。 * : ( a) では c2検定、 （b) では Mann-Whitneyの U検定で ρ〈0· 05。
[図 8]GI Α誘導時の DGIR欠損マウスにおける免疫応答の亢進を示す図である。 ( a) I I G/GFA免疫後の DG I R欠損マウスにおける I gM及び I gGの血清レベルを示 したグラフである。 （b) I IG特異的な IgGサブクラスのレベルを示すグラフ である。 免疫前 （Pre) と IIG/GFA免疫後 3週間 （3W) の野生型マウス （WT ( n=12) ) 及び DGIR欠損マウス （KO (n=10) ) の血清を回収し、 IIG特異的抗体 レベルをそれぞれの IgGサブクラスについて ELISAで測定した。 （c) IIG特異 的な T細胞の増殖応答を示すグラフである。 I IG/GFA免疫後 1週間の野生型マ ウス （WT (n=9) ) 及び DGIR欠損マウス （KO (n=9) ) からリンパ節細胞を回 収して、 100 mg/mlの変性トリ I IGの非存在下 （Med) 、 存在下 （GII) で 72 h 培養し、 トリチームチミジンの取り込みを測定した。 グラフは独立した 3回 の実験結果を合わせたデータを示す。 （d) リンパ節細胞からのサイ トカイ ン産生を示すグラフである。 （c) で示した系における野生型マウス （WT (n =5) ) 及び DGIR欠損マウス （KO (n=5) ) のリンパ節細胞培養上清中の I FN_g 、 IL-4及び IL-10レベルを ELISAで測定した結果である。 平均値及び SEMを示す 。 *： p<0.05； **： p<0.005。
[図 9] I IG/GFA免疫後の DGIR欠損マウスにおける樹状細胞の増殖亢進を示す図 である。 I IG/GFA免疫後 1週間の野生型マウス （WT (n=3) ) 及び DGIR欠損マ ウス (KO (n=3) ) からリンパ節細胞を回収して、 100 mg/mlの変性トリ I の 非存在下 （Med) 、 存在下 （GII) で 72 h培養した。 （a) GD11cを染色し FAGS 解析した結果を示すグラフである。 平均値及び SEMを示す。 * : p〈0.05 ; **： p〈0.01。 （b) リンパ節細胞を変性トリ IIGの非存在下 （Med) 、 存在下 （Gl I ) で 72 h培養した後、 GD11c及び卜 Ab、 GD80、 または GD86を二重染色し、 フロ 一サイ トメ トリーで解析した結果を示す図である。 図中の数値は示したゲ一 ト中の細胞のパーセンテージを示す。
[図 10]DGIR欠損骨髄細胞 （DGIR-/- BMC) の GM-GSFへの反応性の亢進を示した図 である。 （a) 野生型マウス （WT) 及び DGIR欠損マウス （K0) 由来の骨髄細 胞を GM-GSFを添加して培養し、 非接着性骨髄由来細胞数の 8日目及び 10日目の 計測結果を示すグラフである （n=4) 。 * : p〈0.05 ; ** : p〈0.01。 （b) 培養 開始後 8日目の非接着性骨髄由来細胞の GD11c及び卜 Abを染色し、 フローサイ ト メ トリーによって解析した図である。 骨髄由来樹状細胞と考えられる細胞を ゲートで示し、 これらの全細胞中のパーセンテージを示す。 （C ) 培養開始 後 10日目の骨髄由来樹状細胞を LPSの非存在下 （シェードヒストグラム） 、 存 在下 （オープンヒストグラム） で 48 h培養し、 GD11c陽性細胞の卜 Ab、 GD80、 または GD86を染色し、 フローサイ トメ トリ一で解析した図である。 （d) 骨 髄細胞を図に示す濃度の GM-GSFで 20分処理して全細胞溶解液を調整し、 電気 泳動後リン酸化 STAT5、 及び STAT5をそれぞれ抗リン酸化 STAT5抗体または抗 ST AT5抗体で検出した。
[図 11]実施例 1 1における DGIR欠損マウス及び野生型マウスの骨格を示す X線 写真である。
[図 12]実施例 1 1における DGIR欠損マウス及び野生型マウスの強直発症部 （ 踵） の X線写真である。
[図 13]実施例 1 1における DGIR欠損マウスの踵関節を Von Kossa染色 （左側） 及び Toluidine blue染色 （右側） したときの組織断面写真である。
[図 14]DGIR欠損マウスの大腿骨における pQGT分析の様子を示す写真である。
[図 15]pQGT分析から得られた DGIR欠損マウス及び野生型マウスの骨密度及び 骨塩量を示すグラフである。 骨密度は選択領域の平均密度であり、 骨塩量は 選択領域の骨が 1國厚さであった場合の骨塩量である。
[図 16]MethAを DGIR欠損マウス及び野生型マウスに接種した場合の、 腫瘍の大 きさ （A) 及び発症率 （B) の変化を示すグラフである。 WT ： n=12、 KO ： η=11、 **〈0· 05、 *〈0· 01
[図 17]BALB/3T3 APR-MUC1 c I onel 6を DGIR欠損マウス及び野生型マウスに接種 した場合の発症率の変化を示すグラフである。 n=8、 *<0.05
[図 18]BALB/3T3 APR-MUC1 clone16を用いて細胞傷害活性を測定した結果を示 すグラフである。 *〈0.01
発明を実施するための最良の形態
本発明の疾患モデル動物は、 齧歯目動物、 中でもマウスであるのが好まし し、。 当該モデル動物では、 関節炎等の自己免疫疾患が自然発症するため、 自 己免疫疾患のモデル動物として有用である。 本発明のモデル動物を用いて研 究できる自己免疫疾患としては、 例えば、 関節リウマチ （RA)、 強直性脊椎炎 (AS) , シエグレン症候群 （SS)、 又は特発性全身性骨硬化症 （D I SH)等が挙げ られるが、 これらに限られるわけではない。 また、 前記 ASや D I SH等の自己免 疫性骨疾患のみならず、 骨粗鬆症等の代謝関連骨疾患のモデルとしても使用 できる。
[0014] 本発明のスクリーニング方法は、 例えば、 前記の疾患モデル動物に被検物 質を投与し、 又は、 当該動物由来の組織、 器官、 もしくは細胞を被検物質と 接触させ、 当該動物又は組織、 器官もしくは細胞における骨髄幹細胞由来細 胞の分化及び増殖を測定及び評価することを含み、 骨髄幹細胞由来細胞の分 化及び増殖促進又は抑制する物質を同定することができる。 あるいは、 例え ば、 前記の疾患モデル動物に被検物質を投与し、 コラーゲン誘導関節炎の発 症率及び関節炎スコアを測定、 評価すること含み、 関節炎の発症抑制物質を 同定することができる。
[0015] 本発明のスクリーニング方法は、 前記疾患モデル動物で得られた測定及び 評価結果を野生型の同種動物で得られた結果と比較することをさらに含むの が好ましい。
前記のスクリーニング方法を実施することにより、 関節リウマチ （RA)、 強 直性脊椎炎 （AS)、 乾癬性関節炎 （PsA)、 シエグレン症候群 （SS)、 及び特発 性全身性骨硬化症 （D I SH)を含む自己免疫疾患又は骨粗鬆症の予防及び治療に 有効な物質を同定することができる。
[0016] また、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)遺伝子を欠損した本発明の疾患モデル動 物において自己免疫疾患が自然発症又は増悪化したことから、 当該疾患の予 防又は治療において DGI Rタンパク質が有効であることが予測される。 従って 、 本発明は、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質をコードする遺伝子の発 現を促進する物質を含有してなる自己免疫疾患又は骨粗鬆症の予防■治療剤 を提供する。
さらに、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質を欠損した動物において自 己免疫疾患の発症がみられることから、 当該 DGI Rタンパク質をコードする遺 伝子又はその部分配列をコードする DNAは自己免疫疾患又は骨粗鬆症の診断薬 として有効である。 即ち、 本発明は、 当該 DNAを含有する自己免疫疾患又は骨 粗鬆症の診断薬も提供する。
[0017] また、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質と同一又は実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩は、 候 補物質とともに培養して、 当該候補物質の有無における DGI Rタンパク質の活 性を比較することにより、 DGI Rタンパク質の活性を促進する物質、 即ち自己 免疫疾患又は骨粗鬆症の予防■治療剤をスクリーニングすることができ、 本 発明はそのためのキットを提供する。
[0018] さらに、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R)タンパク質をコードする遺伝子と同一 又は実質的に同一の塩基配列またはその部分配列をコードする DNAをプローブ として使用し、 DGI Rをコードする DNA の有無あるいはその発現量などを測定 することにより、 自己免疫疾患又は骨粗鬆症に対する易罹患性を診断するこ とができ、 本発明はそのためのキットを提供する。
[0019] 本発明は、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R) が自己免疫疾患の発症ゃ增悪に関 連していることを初めて明らかにした。 即ち、 樹状細胞免疫受容体 （DGI R) は免疫系の抑制性調節因子の一つであり、 生理状態において免疫反応を抑制 する役割を果たしている。 従って、 逆に樹状細胞免疫受容体 （DGI R) タンパ ク質 （特に可溶性細胞外蛋白部分） と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列 を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩を投与することに より、 免疫系の抑制シグナルが除かれ、 免疫系が活性化されることが期待さ れる。 この結果、 種々のウィルス、 細菌、 カビ、 原虫などの感染症の治療薬 としてこれらを用いることができる。
また、 近年、 ガン免疫療法において、 樹状細胞に腫瘍細胞や抗原を体外で 取り込ませ活性化■成熟させた状態で体内に投与する方法が効果的な免疫反 応の惹起につながるとして注目を集めており、 この方法は自己の樹状細胞を 用いるために副作用の危険性が低下するという利点もある。 従って、 DGI Aタ ンパク質のぺプチド又はその等価物類はガン免疫療法における賦活剤として も作用し得る。
実施例
[0020] 以下、 具体例に則して本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれら具体例 に限定されるものではない。
実験方法
マウス：
遺伝子発現プロフアイリング実験には、 既述した HTLV-卜 Tgマウス及び I L-1 Ra- の 2つのマウスモデルを用いた。 HTLV-卜 Tgマウスは、 HTLV- I ゲノムの LT R-env-pX-LTR領域を（G3H/Hen x C57BL/6J) ド,胚に注入することにより作製し 、 BALB/cAマウス（GLEA Japan. , Tokyo, Japan)に 20世代戻し交配した。 これ らのマウスは 4週齢で関節炎を自然発症し、 3ヶ月齢で 60%、 6ヶ月齢で 80%が発 症する。 以下の実施例では、 重篤な関節炎 （スコア 3) を発症した HTLV -Tg (TS) (雌、 6〜9週齢）を用いた。 I L-1 Ra-/_マウスは、 相同組換えにより作製した I L_1 Ra+マウスを BALB/cA マウスに 8世代戻し交配した。 これらのマウスは 5週 齢で関節炎を自然発症し、 8週齢及び 13週齢までに、 各々 80% 及び約 100%のマ ウスが発症する。 以下の実施例では、 重篤な関節炎 （スコア 3) を発症した I L _1 Ra-/_マウス（KS) (雄、 13 週齢）を用いた。 また、 野生型同腹子 (WT)をコント ロールとして用いた。
[0021 ] 関節炎の重篤度は、 各足について、 発赤及び腫脹の程度を次のように 0から 3のスコアでランク付けした：スコア 0 =正常、 スコア 1 =関節の軽い腫脹及び /又は足躕の発赤、 スコア 2 =顕著な関節腫脹、 スコア 3 =関節の重篤な腫脹 及び強直。 なお、 全てのマウスは、 東京大学医科学研究所のクリーンルーム で、 特定病原体未感染 （SPF) 環境下で飼育した。 また、 全ての実験は動物実 験に関する倫理ガイ ドライン及び遺伝子操作に関する安全基準に従って実施 した。
[0022] ノ一ザンブロットハイブリダイゼ一ション解析：
関節組織を即座に液体窒素中で凍結し、 -80°Cで保存した。 凍結組織は phys cotron (Microtech, Chiba, Japan)でホモジナイズし、 グァニジンチオシァ ネ一ト-フエノール -クロロホルム抽出法により全 RNAを調整し、 オリゴ (dT)_ セルロースカラム用いて poly (A)+ RNA を精製した。 各標本について 4、 5匹の マウスの R N Aをプールした。 Poly (A)+ RNA を 1.3%変性ァガロースゲルで 電気泳動し、 ナイロン膜 （Gene Screen Plus, NEN Life Science, Boston, M A, USA) に転写した。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 メガプライム DNAラベリン グシステム（Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 及び32 P-dGTP (3,000 Ci/ mmol； NEN Life Science, Boston, MA, USA)を用いて標識した32 P-標識 DNAプ ローブで 42°C、 一晩のプロ トコルで実施した。 放射活性は、 BAS-2000システ ム（Fuji Photo Film Co. , Tokyo, Japan)を用いて測定した。 マウス DGIRプロ —ブは、 関節炎を発症した HTLV- 1 _Tgマウスの関節由来 c DNAから PGRにより増 幅した。 PGRプライマ一は次のものを使用した。
5' -CAT TTC CCT TAT CTC GCC CTG G-3' (配列番号： 4)
5' -GCA GCA TGA ATG TCC AAG ATC C-3' (配列番号： 5)
[0023] DGIR欠損 (Dcir- z- ) マウスの作製：
DGIRを含むゲノム DNAの配列を、 Celera Genomics (Rockvi Me, MD, USA) のマウスゲノムデータベースから得、 5.5-kbフラグメントからなる 5' ホモ口 ジ一領域及び 2.5-kbフラグメントからなる 3' ホモロジ一領域を ES細胞 （E14. 1) 由来のゲノム DNAから PGRによって増幅した。 PGRプライマ一の組は次の通 りである。
5' -アームについて：
5' -GAT TAA AAG CGG CCG CCA GAA TTC GTT TGA GAT GAG GC-3' (配列番号： 6)
5' -CTG GAT CCG TCA GAA GAG AGC GTT GTT CC-3' (配列番号： 7 )
3' -アームについて：
5' -CCA TCG ATG AAG AGA GGT TCC ACT CTA GC-3' (配列番号： 8 )
5' -TTA TCG ATG TCA ACT ACC TTT GCA TTG GG-3' (配列番号： 9 )
[0024] ターゲテイングベクターは、 ITIMを含む細胞内ドメイン及び膜貫通領域を 含有する第 1及び第 2ェキソンをコードするゲノムフラグメントを、 PGK1プロ モーター制御下にネオマイシン耐性遺伝子 （Neo) を発現するフラグメントで 置換することにより構築した。 また、 ネガティブセレクションのために MG1プ 口モータ一制御下にジフテリア毒素 （DT) を発現するフラグメントを 3' 末端 に連結した。 タ一ゲティングベクタ一を ES細胞にエレク トロポレーシヨンで 導入し、 G418で選択した。 672個のネオマイシン耐性 ESクローンをピックアツ プし、 5' プローブを用いたサザンプロットハイブリダィゼ一シヨン解析によ つて 660クローンをスクリ一ニングした。
スクリーニングに用いた 5' プローブは以下のプライマーで増幅した。
5' -TAA GAG TGA GGG AAG ATG CTA C-3' (配列番号 : 1 0 )
5' -TCT CAT TCT GAG TCT GAG TCT C-3' (配列番号 : 1 1 )
サザンブロットハイブリダイゼ一ション解析によって 96. 2%のク口一ンが判 定され、 2つのターゲティング ESクローンを同定した （ターゲティング効率 : 0. 3%) 。 これらのタ一ゲッティングクローンは 3' 及び Neoプローブにより 確認した。
3' プローブは以下のプライマーで増幅した。
5' -AGC CAT GAT AAG AGA GGG- 3' (配列番号 : 1 2 )
5' -TGA TAT GGG GTC TGG TAG G-3' (配列番号 : 1 3 )
Neoプローブはネオマイシン耐性遺伝子の Nar卜 Xba l フラグメントとした。 核 型分析の結果、 両クローンの約 80%の細胞は正常な 40染色体を有していた。 キ メラマウスを凝集法によって作製し、 雄のキメラマウスを野生型の G57BL/6J 雌マウスと交配させ、 被毛色によって生殖細胞系列への伝播を判定した。 DGI
R変異についてのヘテロ接合マウス同士を交配し、 同型接合マウスを産出した
。 以下の実施例では （129/Sv X C57BL/6) F,遺伝背景の DGI R欠損マウス及び同 腹子を用いた。
DG I R欠損マウスの遺伝子タイピングは以下の PGRプライマ一を用いて実施した 共通プライマ一： 5' _AAG TGT GGG CTC TTG TAG TCT GTG-3' (配列番号： 1 4 )
野生型プライマ一： 5' -CAA AAT TCT GTC AAG CGT AGA GGG G-3' (配列番号： 1 5)
変異体プライマー： 5' -CAT TAT ACG AAG TTA TCT CGA GTC GC-3' (配列番号 ： 1 6)
共通プライマ一及び野生型プライマ一は野生型アレル（1.3 kb)の検出に使用 し、 共通プライマ一及び変異体プライマ一は変異体アレル (0.9 kb)の検出に 使用した。
[0026] 組織病理検査：
12ヶ月齢の野生型マウス及び DGIR欠損マウスをエーテル麻酔し、 中性緩衝 1 0%ホルマリン溶液で還流固定した。 脳、 心臓、 大動脈、 肺、 気管、 塍臓、 肝 臓、 脾臓、 腋窩リンパ節、 顎下腺及び耳下腺、 腸、 胃、 腎臓、 及び生殖器を 含む主要な器官及び組織を取り出し、 組織病理学的検査に供した。 足、 膝、 手首及び胸椎を含む関節組織は 10%蟻酸を用いて脱灰してからパラフィン包埋 した。 各組織について 2~3國の切片を作製し、 へマトキシリン及びェォジン を用いて染色した。
[0027] フローサイ トメ トリ一解析：
各細胞を F I TG、 PE又はビォチン修飾の下記モノクロ一ナル抗体 (mAb)で染色 し、 フローサイ トメ トリ一解析を行った。 GD11c (HL3)、 l-Ab (AF6-120.1), C D3 (145-2C11), CD45R/B220 (RA3- 6B2)、 CD4 (RM4-5) 、 CD8 (53-6.7) 、 CD6 2L (MEL-14) 、 CD44 (IM-7) に特異的なハムスター、 マウス又はラットの mAb は、 BD PharMingen (San Diego, CA, USA)から購入した。 マウスの GD80 (RMM P2)、 CD86 (RMMP1) に特異的なラット mAbは Immunotech (Marseille, France) から購入した。 PE修飾ストレブトアビジン（PharMingen)はビォチン修飾抗体 の二次染色に用いた。 細胞表面の染色は標準的なプロ トコルに従って行い、 解析は FAGSGal ibur 及び Gel I Quest (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ , USA)または FlowJo (Tree Star, Inc. , Ashland, OR) ソフトウェアを用い て行った。 [0028] 増殖解析：
抗原特異的な応答を調べるために、 野生型マウスから Thy1.2陽性 T 細胞を 調整し、 野生型マウス及び DGIR欠損マウスの脾臓から GD11c陽性樹状細胞を、 CD90 (Thy1.2)マイクロビーズ又は GD11cマイクロビーズ（Miは enyiBiotech, B ergisch Gladbach, Germany)を用いた磁気細胞分離により精製した。 精製し た Thy 1.2陽性 T 細胞（2x105 eel Is)及び GD11c陽性樹状細胞（2 x104 eel Is)を 、 抗 GD3 抗体（145-2G11 ; BD PharMingen)を添加して 3日間共培養し、 トリチ —ムチミジン (0.25 ； uGi/mに Amersham, Buckinghamshire, England)を 6時間 取り込ませた。 次に、 細胞は Micro 96 cel l harvester (Skatron, Lier, Norw ay)ガラスファイバ一濾紙上に回収し、 Micro Beta (Pharmacia Biotech, Pis cataway, NJ)を用いてトリチ一ムチミジン放射活性を測定した。
同種異系混合白血球反応を調べるために、 BALB/cマウスから GD90 (Thy1.2 ) マイクロビーズを用いて Thy1.2陽性 T細胞を磁気細胞ソーティングにより精 製した。 また、 野生型マウス及び DGIR欠損マウスの骨髄細胞から樹状細胞を 誘導した。 樹状細胞はマイ トマイシン G処理してから、 Thy1.2陽性 T細胞と 3日 間共培養し、 トリチームチミジンを 6時間取り込ませてその放射活性を測定し た。
[0029] コラーゲン誘導関節炎：
5 mg/ml熱殺傷 M. tuberculosis (H37RA; Difco) を追加したフロイント完全 アジュバント (Difco Laboratories, Detroit, Ml) に 1 mg/ml トリ I I型コ ラ一ゲン （I IG; Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) を懸濁し、 マウス尾底部の 皮下複数箇所に免疫した。 関節炎の誘導は追加免疫なしで実施した。 各関節 は、 数日ごとに腫脹及び発赤について検査し、 各手足について重篤度を 0~3に ランク付けした （スコア 0 =変化なし；スコア 1 =関節の軽い腫脹及び/又は 足躕の発赤；スコア 2 =関節の顕著な腫脹；スコア 3 =関節の重篤な腫脹及び 強直） 。 関節炎の組織学的評価のために、 関節組織を 10%中性緩衝ホルマリン 溶液で固定し、 5%蟻酸で脱灰後パラフィン包埋した。 各組織について 4 國の 切片を作製し、 へマトキシリン及びェォジンを用いて染色した。 [0030] 抗体測定：
コラーゲン特異的抗体の測定には 10 mg/ml トリ I IGを、 血清中の抗体レベル の測定には、 ゥサギ抗マウス IgM (2 mg /ml； Zymed) 、 IgG (8.7 mg /ml； Zy med) 、 または IgE (2 mg /ml； PharMingen) を、 自己抗体の測定には、 熱変 性ゥサギ lgM、 IgG (50 mg /ml； Zymed) 、 またはトリ I IG (20 mg/ml； Sigma ) をそれぞれ Falcon 3912 Micro Test 111フレキシブルアツセィプレート （B D Bioscience, Oxnard, CA) に 4°Cで一晚コ一ティングした。 PBSで洗浄後、 希釈した血清サンプルを室温で 1時間ィンキュベ一トした。 PBS-Tweenで洗浄 後、 アルカリホスファタ一ゼ （AP) 修飾ャギ抗マウス lgM、 IgG, IgE, IgGU lgG2a、 lgG2b及び lgG4を室温で 1時間インキュベートし、 AP活性を Substrate Phosphatase SI GMA104 (Sigma-Aldr ich) を用いて ELISAマイクロリーダ一 (M TP- 120; Colona, Tokyo, Japan) により測定した。 抗核抗体の測定のために は、 マウス核抗原コ一ティングプレート （Alpha Diagnostic, Inc. , San Ant onio, TX) を用いて希釈したマウス血清をインキュベートし、 西洋わさびべ ルォキシダーゼ （HRP) 修飾ャギ抗マウス IgGを反応させた後、 TMB基質を用い て HRP活性を測定した。
[0031] コラーゲン特異的増殖応答及びサイ トカイン産生：
I IG/GFA免疫 7日後にリンパ節を回収し、 単一細胞懸濁液を調製した。 リン パ節細胞を熱変性 I IGの非存在下あるいは存在下で 3日間培養し、 トリチーム チミジン （0.25 mCi/ml) を 6時間取り込ませてトリチームチミジン放射活性 を測定した。 サイ ト力イン産生の測定には、 コラーゲン特異的増殖応答にお ける培養上清を 3日後に収集し、 BD OptiEIA EL ISA Set (BD PharMingen) を 用いて IFN-g、 IL-4、 及び IL-10レベルを測定した。
[0032] 骨髄細胞由来樹状細胞の調製：
骨髄細胞由来樹状細胞は大腿骨及び脛骨の骨髄から調製した。 簡潔には、 2 x105 eel Is/mlの骨髄細胞を 20 ng/mlの組換えマウス GM-GSF (PeproTech, Lon don, UK) を添加した 10% FCS- RPM卜 1640で培養した。 3曰目に 20 ng/mlの GM- GSFを含む倍量の新鮮な培地を加え、 6日及び 8日目に、 培地上清の半分を回収 して遠心分離し、 細胞を 10 ng/mlの GM-GSFを含む新鮮な培地に再懸濁し、 元 のプレー卜に戻した。 10曰目の非接着性細胞を骨髄細胞由来樹状細胞とした 。 さらに、 骨髄細胞由来樹状細胞の完全な成熟のために、 10日目の非接着性 細胞を回収し、 10 ng/mlの GM-GSF及び 1 mg/ml LPS (Sigma) を含有する新鮮 培地中に再懸濁した。 この細胞を更に 2日間培養し、 成熟樹状細胞とした。
[0033] ウェスタンブロット解析：
骨髄細胞は大腿骨及び脛骨から調整し、 20 ng/ml 組換えマウス GM-GSFを添 加した無血清 RPM卜 1640培地で一晚培養した。 これらの細胞を洗浄し、 GM-GSF を添加しない無血清培地に再懸濁した。 6時間飢餓状態にした後、 様々な濃 度の GM-GSFとフォスファタ一ゼ阻害剤カクテル 11 (Sigma) で処理し、 全細胞 溶解液を抗リン酸化 STAT5抗体 (Cel l Signal ing, Denvers, MA) および抗 STA T5抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA) を用しゝた免疫 ブロッテイングにより解析した。 検出抗体は西洋わさびペルォキシダーゼ （H RP) 修飾抗ゥサギ IgG (Cel l Signal ing) を用いた。 蛍光シグナルは EGLブラ ス検出溶液と Typhoon 9000 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) を用いて検出した。
[0034] 統計：
以下のデータを除く結果の統計評価には Studentの t検定を用いた。 GIA実験の 発症率は X 2乗検定で、 重症度は Mann-Whitney U検定で評価した。 Mann-Whit ney U検定は組織病理学的異常の頻度の評価にも用いた。
[0035] (実施例 1 )
関節リウマチ（RA)関連遺伝子としての DC I Rの同定：
2つのモデルマウス（HTLV- 1 Tg及び I L_1 Ra- マウス）の関節における遺伝子 発現を正常マウス関節と比較して、 関節炎を発症した関節において発現が亢 進する遺伝子を特定した。 マイクロアレイ解析によると、 DGIR遺伝子の mRNA 発現は、 野生型関節に比較して IL-1Ra-/_マウスでは 2.2倍、 そして HTLV-I Tgマ ウスでは 3.8倍に亢進し （図 1 a) 、 この発現亢進はノーザンプロットハイブ リダイゼ一ション解析でも確認された（図 1 b ) 。 [0036] (実施例 2)
DGIR欠損マウスの作製：
DGIR欠損マウス （DGIR-/-マウス） は、 通常の遺伝子タ一ゲティング法によつ て作製した。 DGIR遺伝子のェキソン 1及び 2をネオマイシン耐性遺伝子で置換 することにより、 IT I Mを含む細胞質領域及び膜貫通ドメインの大部分をコ一 ドするゲノム配列を欠損させた （図 2 a) 。 5' プローブを用いたサザンプロ ットハイプリダイゼ一シヨン解析によってタ一ゲッティング ESク口一ンをス クリーニングし （図 2 b) 、 3' プローブ （図 2 c) 及び Neoプローブ （図 2 d ) を用いてタ一ゲッティングァリルを確認した。 マウスにおける DGIR領域 のタ一ゲティングは、 ゲノムサザンプロット解析によって確認した （図 2 e ) 。 DGIR マウスの交配により DGIR- マウスを作製し、 ノーザンプロットハイ ブリダィゼ一シヨン解析によって脾臓における DGIR mRNAの発現が欠損してい ることを確認した （図 2 f ) 。
[0037] DGIR- マウスは繁殖力があり、 メンデル比率で産仔し、 特定病原体未感染の 飼育条件下では若年においては明確な表現型異常を示さなかった。 また、 DGI R-/-マウスの胸腺及び脾臓の細胞においても明らかな異常は見られなかった （ 図 3) 。 T細胞反応に対する DGIR欠損の影響を評価するために、 樹状細胞存在 下において抗 GD3抗体で刺激した際の T細胞の増殖反応及び同種異系混合リン パ球反応 （MLR) を測定した。 この結果、 DGIR欠損樹状細胞と野生型樹状細胞 との間に有意な差は検出されなかった （図 4) 。
[0038] (実施例 3)
加齢 DG I R欠損マウスにおける自己免疫疾患の自然発症：
DGIR欠損マウスを組織学的に検査した結果、 6-12ヶ月齢の DGIR欠損マウス 1 0匹ののうち 7匹の顎下腺に、 唾液腺間質へのリンパ球の蓄積及び小導管上皮 への単核細胞の浸潤、 それに伴う小導管の破壊を特徴とする唾液腺炎が観察 された （表 1 ) 。
[0039] また、 4ヶ月齢において 11%の DGIR欠損マウスが後肢の関節異常を発症した 。 発赤及び複数関節の腫脹を伴う関節炎に始まり、 6ヶ月齢までに 28%のマウ スが関節炎を発症した。 関節炎の発症率、 重症度は加齢とともに増大し、 関 節の変形及び強直を引き起こした。 その殆どは後肢の足関節で顕著であった
。 発症には性差があり、 12ヶ月齢において 44%の雄マウスで発症したが、 雌 マウスでは 6%であった。 関節の組織学的解析により、 DGIR欠損マウスにおい て腱及び靱帯と骨との付着部への炎症性細胞の浸潤、 顆粒化組織の侵襲によ る骨破壊が観察された。 付着部炎は、 検査した 23匹の DGIR欠損マウスのうち 9 匹で観察された （表 1 ) 。 これらの結果から、 DGIR遺伝子の欠損が自己免疫 を誘導し、 遅始性関節炎及び唾液腺炎を自然発症させることが示された。
[0040] [表 1] 加齢 DC1R欠損マウスにおける組織病理学5 •-的異常の頻度
特徴 ジ： r-ノタイプ 発症マゥス数ノ試験した全 ，ウス数 (%)
雄 雌 合計
唾液腺炎 野生型 0/3 {0) 0/2 (0) 0/5 (0)
DCIR欠損 4/6 (67)* 7/10(70)**
付着部炎 野生型 0/5 (0) 0/5 (0)
DCIR欠損 9/23 (39)*
唾液腺炎及ぴ付着部炎を発症した 6〜 ヶ月齢のマウス数及び発症率 （括弧内) を示す。 *: P<0.05， **: p<0.(H (M誦 -Whitneyひ test)
[0041] (実施例 4)
DGIR欠損マウスにおける自己免疫の自然発症：
DGIR欠損が自己免疫の発症に影響を与えることが示唆されたので、 DGIR欠 損マウスにおける自己抗体の産生を ELISAで測定した。 血清中の lgM、 IgG, lg E及び以下の自己抗体、 抗核抗体 （ANA) 、 リウマチ因子 （RF ; IgM及び IgG型 ) 、 及び抗 IIG IgGの産生を測定した （図 5) 。 12ヶ月齢の DGIR欠損マウスの 血清免疫グロブリンレベルに増加傾向が見られたが、 IgEレベル以外に有意差 はなかった。 しかしながら、 加齢 DGIR欠損マウスは抗核抗体 （ANA) 、 リウマ チ因子 （RF) 、 及び抗 IIG抗体などの自己抗体を野生型マウスと比較して高い レベルで産生した。 この結果は DGIR欠損が自己抗体の産生に関与しているこ とを示唆している。
[0042] (実施例 5)
DC I R欠損マウスにおける樹状細胞の増殖と GD4陽性 T細胞の活性化： DGIR欠損マウスにおいて DGIR発現細胞である GD11c陽性細胞の割合を調べた 結果、 GD11c陽性細胞の割合は若年の生理的条件下では正常であつたが、 12月 齢以上では顕著に増加していた。 また、 GD11c陽性細胞の大部分は卜 Abを発現 していた。 さらに、 DGIR欠損マウスの GD4陽性 T細胞は、 活性化 T細胞の特徴で ある GD62Lの発現が低く、 GD44の発現が高い表現型を示した。 GD8陽性 T細胞で は顕著な変化は見られなかった （図 6) 。
[0043] (実施例 6)
DGIR欠損マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の増悪化：
本発明の関節リウマチのモデルマウスにおいて DG I Rの発現が亢進していた ので、 コラーゲン誘導関節炎 （GIA) の発症に対する DGIR欠損の影響を試験し た。 GIAは （129/Sv X C57BL/6) F,雑種背景の若年 DGIR欠損マウスに、 250 mg の熱殺傷 Mycobacterium tuberculosisを添加したフロイント完全アジュバン 卜と 100 mgのトリ I I型コラーゲン （I IG) を免疫することにより誘導した。 通 常の免疫手法では、 マウスは初回免疫から 21日後に I IG/GFAで追加免疫を行う 。 し力、し、 今回の実験では初回免疫から 20日後に、 同腹子の 0%に対して、 DGI R欠損マウスでは 39%に疾患が発症した （図 7) 。 追加免疫の後では、 DGIR欠 損マウスにおける発症率の増大を観察することが困難になることが示唆され たので、 追加免疫を行わずに経過観察を行った。 図 7に示すように、 DGIR欠 損マウスにおける関節炎発症率は、 コントロールの同腹子と比較して顕著に 増大した。 また、 重症度も野生型マウスに比較して有意に増悪化した。 各群 の発症率及び重症度は独立した 2回の実験データの合計である。
[0044] GIAの組織学的解析において、 コントロールマウスの関節では極めて少量の 細胞浸潤のみを示し、 滑膜の増殖や骨破壊は観察されなかった。 それに対し 、 DGIR欠損マウスでは、 このようなマイルドな免疫条件下でも炎症性細胞の 浸潤、 滑膜の増殖、 及び骨破壊を伴う典型的な関節炎を示した。 この結果は 、 DC I Rが G I Aの発症を抑制することを示唆している。
[0045] (実施例 7 )
DGIR欠損マウスにおける抗原特異的 lgG1及び lgG3抗体産生の増加： 次に、 I IGを免疫した DGIR欠損マウスにおける I IG特異的抗体の産生を測定 した。 I IGに対する抗体レベルは関節炎の発症とよく相関することが知られて いる。 図 7 a、 bに示すように、 I IGに特異的な lgG、 lgG1及び lgG3レベルは 、 野生型同腹子に比較して DGIR欠損マウスで有意に増大した。 一方、 DGIR欠 損マウスにおける lgM、 lgG2a及び lgG2bレベルは正常であった。 即ち DGIRは GI Aにおける抗原特異的な lgG1及び lgG3サブクラスの抗体産生に関与していると 考えられる。
[0046] (実施例 8)
DC I R欠損マウスにおける T細胞の抗原特異的増殖反応の亢進：
次に、 DGIR欠損マウス及びそれらのコントロールである同腹子からの T細胞 の抗原特異的増殖反応を試験した。 I IGに対する T細胞の反応は、 トリ I IG/GF Aでの初回免疫から 7日後に測定した。 DGIR欠損マウスにおける抗原特異的 T 細胞の増殖反応は野生型マウスと比較して有意に増大し （図 7 c) 、 DGIR欠 損マウスにおいて T細胞のプライミングが促進していることが示唆された。 I I G刺激後のリンパ節細胞からの IFN-g産生は、 DGIR欠損マウス及びコント口一 ルマウスで同様に観察された。 これに対して、 IL-4 及び IL-10 レベルは DGIR 欠損リンパ節細胞で有意に増大した （図 7 d ) 。 これらの結果は、 DGIR欠損 マウスにおいて Th2サイ トカイン産生が選択的に促進したことを示し、 I IG特 異的な lgG1及び lgG3サブクラス抗体の産生が促進した観察結果と合致するも のである。
[0047] (実施例 9)
I IG/GFA免疫後の DGの含有量と活性化状態を調べた結果、 GD11c陽性細胞の 割合は DGIR欠損マウスのリンパ節において顕著に増加していた。 さらに、 卜 Ab 、 GD80、 および GD86を発現する活性化した樹状細胞の割合も野生型マウスと 比較して DGIR欠損マウスにおいて顕著に増加していた。 したがって、 DGIR欠 損マウスにおける樹状細胞の分化と活性化が I I G/GFA免疫により促進すること が認められた。
[0048] (実施例 1 0) DGIR欠損骨髄細胞 （BMG) の GM-GSFに対する反応性の亢進：
DGIRは主に樹状細胞に発現するので、 DGIR欠損骨髄細胞の樹状細胞への分 化を評価した。 DGIR欠損骨髄細胞を GM-GSFを添加して培養した場合、 非接着 性骨髄由来細胞の分化は、 DGIR欠損骨髄細胞において有意に亢進した （図 1 O a) 。 培養 8日目の非接着細胞のフローサイ トメ トリ一解析により、 GD11C 陽性骨髄細胞由来樹状細胞 （BMDG) が DGIR欠損骨髄細胞の培養において顕著 に増加することが示された （図 1 0 b) 。 これらの GD11c陽性細胞の殆どは卜 Abを発現したが、 活性化マーカーである GD80及び GD86 は発現していなかった 。 培養 10日目の BMDGを LPSで 48時間パルスすると、 DGIR欠損マウス及び野生型 マウスの樹状細胞は卜 Ab、 GD80及び GD86を高発現し、 同レベルの成熟が観察さ れた （図 1 0 c) 。
[0049] 次に、 DGIR欠損マウスの骨髄細胞における GM-GSF刺激による STAT5のリン酸 化を解析した。 図 1 O dに示すように、 GM-GSFによって誘導される STAT5の活 性化は、 DGIR欠損骨髄細胞において顕著に亢進しており、 DGIR欠損骨髄細胞 の GM-GSFに対する反応性の亢進と合致した。 したがって、 DGIR欠損骨髄細胞 の in vitroにおける樹状細胞分化の亢進は骨髄細胞の GM-GSFシグナルに対す る感受性が増大したことによると考えられる。 この観察結果と一致して、 in vivoにおける樹状細胞の割合も、 生理的条件下の若年マウスでは正常である 力 免疫や加齢に伴い増加している。
[0050] 以上詳細に述べたように、 本発明では、 DGIR欠損 （DGIR-/-) マウスを作製し、 DGI Rが自己免疫性唾液腺炎および関節症に関与することを示した。
[0051] 本発明によって、 加齢 DGIR欠損マウスが特徴的な自己免疫疾患を自然発症 することが示された。 12ヶ月齢において、 DGIR欠損マウスの血清免疫グロブ リンレベルが増加し、 野生型マウスと比較して抗核抗体、 リウマチ因子及び 抗 IIG抗体などの自己抗体を高レベルで産生した。 また、 組織学的解析により DGIR欠損マウスの唾液腺及び付着部における病理学的変化が観察された。 唾 液腺へのリンパ球浸潤は、 唾液腺が標的となる代表的な慢性自己免疫疾患で あるシエグレン症候群 （SS) の典型的な兆候である。 幾つかのマウス系統、 N 0D、 MRL/ l pr及び NZB/W Πは、 SSのモデルとして広く受け入れられている。 関 節リウマチ、 複合関節組織疾患 （MGTD) 、 強直性脊椎炎 （AS) 及び脊椎関節 症 （SpA) を含む他の自己免疫疾患を持つ患者では限局性唾液腺炎も高い割合 で見られ、 その発症はリウマチ因子の産生に深く関わっている。 これらの結 果は、 DGI Rが免疫系の恒常性の維持に重要であり、 DGI Rの欠損が自己免疫の 発症を引き起こすことを示唆している。
[0052] 加齢 DGI R欠損マウスでは、 遅発性の強直性関節症の自然発症も観察された 。 これらのマウスの組織病理学的解析により、 炎症性細胞の浸潤を伴う骨及 び付着部の浸食性の破壊が観察された。 しかしながら、 DGI R欠損マウスの病 理組織は、 HTLV-卜 Tgマウス、 I L_1 Ra_K0マウス、 及び GI Aマウス等の他の関節 リウマチモデルマウスの病理像とは明らかに相違していた。 ヒ卜の関節リウ マチと類似する特徴的な滑膜炎を発症する他のモデルマウスとは異なり、 DGI R欠損マウスでは付着部炎が第一の異常であり、 滑膜炎は希に観察されるだけ であった。 滑膜炎が関節リウマチの特徴であるのに対し、 付着部炎は、 強直 性脊椎炎 （AS) 、 脊椎関節症 （SpA) 及び乾癬性関節炎 （PsA) 等の炎症性リ ゥマチ疾患群に特徴的な兆候である。 したがって、 DGI Rの欠損が AS、 SpA 及 び PsAに類似した特徴的な炎症性関節炎の発症を引き起こすことが示唆された
[0053] 本発明では、 DGI R欠損マウスにおいて GI Aが増悪化したことが示された。 I I 型コラーゲンで免疫した後、 DGI R欠損マウスの血清中の抗原特異的 l gG1及び I gG3のレベルが非常に増加した。 また、 抗原特異的な T細胞応答が亢進し、 DGI R欠損マウスにおいて I I Gに対する免疫応答が亢進していることが明らかとな つた。 この時、 DGI R欠損マウスにおける樹状細胞の割合は顕著に増加し、 活 性化していた。 樹状細胞の割合の増加は、 加齢した DGI R欠損マウスでも観察 されたが、 生理的条件下の若年マウスにおいては正常であった。 樹状細胞は 細胞表面の抗原を提示し、 様々な免疫調節性のサイ トカインを産生すること によって T細胞を活性化するのに重要な役割を果たしているが、 本発明によつ て得られた観察結果は、 DGI R欠損マウスにおける樹状細胞の機能亢進が自己 免疫の発症の原因となることを示唆している。
[0054] 樹状細胞は GM-GSFにより骨髄幹細胞から分化するので、 I IG/GFAによる刺激 で産生される GM-GSF力《GIAにおける DGの増殖に関与していると考えられる。 本 発明によって、 DGIR欠損による GM-GSFシグナル伝達の感受性の亢進が、 in vi troでの骨髄由来樹状細胞の増殖及び分化を促進することが示された （図 1 0 ) 。 DGIR欠損骨髄細胞における GM-GSF刺激による STAT5のリン酸化の亢進は、 DGIRが GM-GSFシグナル伝達を抑制的に調節していることを示唆している。 ヒ ト DC I Rが SHP- 1及び SHP- 2をリクルートすることが報告されている。 SHP-1は SH 2ドメイン含有チ口シン脱リン酸化酵素で GM-GSFを含むサイ トカインシグナル 伝達を負に制御する。 さらに、 SHP-1欠損の motheatenマウスは全身性の自己 免疫と重篤な炎症を示す。 マウス DGIRの ITIMが機能的であり、 そのアミノ酸 配列がヒト DGIRの ITIMと同一であることから、 マウス DGIRも SHP-1及び SHP-2 をリクルートして GM-GSFシグナル伝達を調節するものと推察される。
[0055] GIAの際、 DGIR欠損マウスでは I IG特異的な lgG1および lgG3サブクラスの抗 体産生が亢進していることが明らかとなった。 DBA/1系統のマウスではコラ一 ゲン特異的な |gG2aクラスの抗体が GIAの発症に関与することが報告されてい るが、 抗原特異的な lgG2a抗体のレベルは （129xB6) Π雑種背景の DGI R欠損マ ウスでは特に増加していなかった。 DGIR欠損マウスで IL-4、 IL-10の産生が顕 著に亢進していることを示したが、 IL-4及び IL-10は、 lgG1及び lgG3のクラス スィッチに関与することが知られている。 これらの結果から DGI Rが Th2反応の 調節に関与していることが示唆される。
[0056] 樹状細胞は Th1及び Th2エフェクター T細胞の分化に関係している。 細胞内寄 生性病原体に晒された樹状細胞は Th1反応を促進するが、 ある種の寄生虫は樹 状細胞による Th2細胞分化を促進する。 調節性 T細胞 （Treg) の分化も樹状細 胞によって調節され、 特定の病原体が Tregの産生を誘導することが知られて いる。 したがって、 樹状細胞と病原体との相互作用はエフェクター T細胞の特 定のサブセットを誘導するのに重要であり、 DGIRは特定の T細胞分化に関与す る樹状細胞受容体の一つである可能性がある。 [0057] 最近のゲノムワイ ド連鎖解析は、 多くの自己免疫疾患の感受性領域を明ら かにした。 特に、 DGIR遺伝子が存在するマウス 6F2サイ トバンド、 同一染色体 であるラット 4q42、 及びヒト 12p13領域は、 関節炎、 全身性紅斑性狼瘡 （SLE ) 、 自発性糖尿病、 ァテローム性動脈硬化症、 脳脊髄炎、 喘息又は気道反応 性、 及びアレルギーをなど幾つかの炎症性疾患と関連している。 DGIRの欠損 は自己免疫様疾患を引き起こすので、 DGIRはそのような炎症性疾患の感受性 遺伝子の一つであることも示唆された。
[0058] (実施例 1 1 )
DGIR欠損マウスにおける骨代謝の変化：
骨代謝における DGIRの機能を調べるため、 12ヶ月齢の DGIR欠損マウスを用 し、、 X線解析、 組織切片による解析、 pQGT解析を行った。
まず、 DGIR欠損マウスにおいては、 ォスのみで踵関節に強直が観察された
X線解析により当該欠損マウスの骨格を野生型マウスの骨格と比較したとこ ろ、 図 1 1に示すように野生型マウスと同様であり、 骨格形成は正常であつ た。
次いで、 欠損マウス及び野生型マウスの強直発症部 （踵） の X線解析をした ところ、 図 1 2に示すように、 欠損マウスでは踵関節部において関節破壊が 起こり、 石灰化領域の増加が見られた。
[0059] DGIR K0マウス踵関節において、 石灰化領域を調べるために Von Kossa染色 、 軟骨組織を調べるために Toluidine blue染色を行った。 その結果、 踵関節 部において関節軟骨の増殖がみられ、 その軟骨が骨に置き換わっていること が明らかになった （図 1 3) 。
次いで、 大腿骨での骨量に異常があるかどうかを明らかにするため、 12ケ 月齢の個体で pQGTを行った （図 1 4) 。 その結果、 DGIR K0マウスでは骨密度 、 骨塩量共に減少が見られ、 骨量が減少していた （図 1 5) 。
即ち、 DGIR遺伝子の機能として踵関節では軟骨細胞の増加を伴い骨、 石灰 化町域の増加が見られ、 大腿骨では骨量が減少していることが明らかになつ た。 異常の結果から DGIRは骨代謝や軟骨細胞、 骨芽細胞あるいは破骨細胞の 分化や増殖の制御に関わっていることが示唆された。 このことから DG I Rは AS やり I SHだけでなく骨粗鬆症の良いモデルマウスになると考えられる。
[0060] DGIR欠損マウスにおける抗腫瘍免疫効果の測定：
( 1 ) 移植ガン実験における抗腫瘍免疫効果の評価
抑制性レセプターである DGIRの欠損により抗腫瘍免疫効果の向上が見られ るか否かを、 可移植性腫瘍細胞を用いて検討した。
可移植性腫瘍細胞として MethAを用いた場合、 1 x106cel l/headの MethAを DGI R欠損マウス及び野生型マウスに接種し、 腫瘍形成の差を観察した。 その結果 、 発症率に差は見られなかったものの、 腫瘍の大きさでは DGIR-/-マウスにお いて優位に抑制効果が観察された （図 1 6) 。
次いで、 可移植性腫瘍細胞株として、 繊維肉腫である BALB/3T3にガン抗原 として知られているヒト MUG1を発現させた BALB/3T3 APR-MUC1 (BALB/c背景） を用いた。 BALB/3T3 APR-MUC1 clone16は東北大学加齢研究所により供与され 、 10% FBS (SIGMA), 50Uペニシリン （明治製菓） ， 50mg/mlストレブトマイシ ン （明治製菓） 500mg/ml G418 (ナカライテスク） 含有 RPM卜 1640 (SIGMA)で 培養し、 1週間に 2-3回の頻度で継代培養した。
BALB/3T3 APR-MUC1 clone16を 1 x 106cel l/head接種したところ触診できる程 度 （約 4國程度まで） の腫瘍が形成された。 この腫瘍の発症率で抗腫瘍免疫効 果を評価したところ、 DGIR-/-マウスでは腫瘍退縮が有意に促進された （図 1
[0061] (2) DGIR-/-マウスの樹状細胞における細胞傷害活性の評価
腫瘍細胞株 BALB/3T3 APR-MUC1 clone16を用いた細胞傷害性 T細胞 （GTL)の 誘導は以下のように行った。 腫瘍細胞を 8000radの r線照射により不活化し、 1 x107cel Is/headで 1日目と 1 0日目にマウス腹腔内に接種した。 免疫下 5日 後にマウスの脾臓を採取し、 脾臓細胞を調製した。 得られた脾臓細胞を 10we I Iプレー卜で不活化した腫瘍細胞と 1 x107： 1 x106の割合になるよう共培養し 、 3日間の再刺激を行った。 標的細胞を lOO ^Giクロム酸ナトリウム、 51Gr (GEヘルスケアバイオサイェ ンス） で 1時間、 37°Cで標識した後、 RPM卜 1640 (10% FBS, 10mM 2-Mercapto ethanol) に懸濁した。 再刺激した脾臓細胞から Lymphocyte-M(GEDARLANE)で リンパ球を分離し、 96wel l round-bottomプレート （ IWAKI)で標識した標的細 胞と共培養した。 4時間後、 放出された51 Grを放射能活性として Micro Bete ( Pharmacia)で検出することによって細胞傷害活性を測定した。
BALB/3T3 APR-MUC1 clone16を用いて細胞傷害活性を測定したところ、 DCIR -/-マウスで細胞傷害活性が亢進していた。 このとき、 ネガティブコント口一 ルの細胞として用いた MethAに対する傷害活性はみられなかった （図 1 8) 。 従って、 DGIR- -マウスにおいて、 特異的な細胞傷害活性が有意に亢進してい ることがわかった。

Claims

請求の範囲
[I ] 樹状細胞免疫受容体 (DG I R)タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が 染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト疾患モデル動物。
[2] 齧歯目動物であることを特徴とする請求項 1に記載の疾患モデル動物。
[3] マウスであることを特徴とする請求項 2に記載の疾患モデル動物。
[4] 疾患が自己免疫疾患であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記 載の疾患モデル動物。
[5] 疾患が、 関節リウマチ（RA)、 強直性脊椎炎 (AS)、 乾癬性関節炎 (PsA)、 シェグ レン症候群 (SS)、 又は特発性全身性骨硬化症 (D I SH)であることを特徴とする 請求項 4に記載の疾患モデル動物。
[6] 疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の 疾患モデル動物。
[7] 請求項 1から 6のいずれかに記載の疾患モデル動物に被検物質を投与し、 又 は、 該動物由来の組織、 器官、 もしくは細胞を被検物質と接触させ、 当該動 物又は組織、 器官もしくは細胞における骨髄幹細胞由来細胞の分化及び増殖 を測定及び評価することを含む、 骨髄幹細胞由来細胞の分化及び増殖促進又 は抑制する物質のスクリーニング方法。
[8] 請求項 1から 4のいずれかに記載の疾患モデル動物に被検物質を投与し、 関 節炎又は関節症若しくは骨粗鬆症の発症率及び重症度を測定、 評価すること 含む、 関節炎又は関節症若しくは骨粗鬆症の発症抑制物質のスクリーニング 方法。
[9] 請求項 1から 4のいずれかに記載の疾患モデル動物で得られた測定及び評価 結果を野生型の同種動物で得られた結果と比較することをさらに含むこと特 徵とする、 請求項 7又は 8に記載のスクリーニング方法。
[10] 請求項 6から 9のいずれかに記載のスクリーニング方法で同定される物質を 含有してなる自己免疫疾患又は骨粗鬆症の予防■治療剤。
[I I ] 樹状細胞免疫受容体 (DG I R)タンパク質をコードする遺伝子又はその部分配列 をコードする D N Aを含有してなる自己免疫疾患又は骨粗鬆症の診断薬。
[12] 自己免疫疾患が、 関節リウマチ（RA)、 強直性脊椎炎 (AS)、 乾癬性関節炎 (PsA) 、 シエグレン症候群 (SS)、 又は特発性全身性骨硬化症 (D I SH)である請求項 1 1に記載の診断薬。
[13] 樹状細胞免疫受容体 (DGI R)タンパク質と同一又は実質的に同一のアミノ酸配 列を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩、 及び候補物質 を含有することを特徴とする自己免疫疾患又は骨粗鬆症の予防■治療剤のス クリーニング用キット。
[14] 樹状細胞免疫受容体 (DGI R)タンパク質をコードする遺伝子と同一又は実質的 に同一の塩基配列またはその部分配列をコードする D N Aを含有することを 特徴とする自己免疫疾患又は骨粗鬆症の診断用キット。
[15] 樹状細胞免疫受容体 (DGI R)タンパク質と同一又は実質的に同一のアミノ酸配 列を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩からなる、 ウイ ルス感染症、 細菌感染症、 原虫感染症、 真菌感染症を含む感染症の治療薬。
[16] 樹状細胞免疫受容体 (DGI R)タンパク質と同一又は実質的に同一のアミノ酸配 列を有するぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩からなる、 ガン 免疫療法における賦活剤。
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