WO2007139100A1 - 土壌汚染及び／または水質汚染の判定方法 - Google Patents

土壌汚染及び／または水質汚染の判定方法 Download PDF

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WO2007139100A1
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test plant
water
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Chikara Masuta
Yukio Maruta
Shunpei Sugiyama
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National University Corporation Hokkaido University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention provides a method for easily determining whether or not a soil or water source planned to grow a crop is contaminated with a contamination source that adversely affects the growth of the crop.
  • Non-Patent Document 1 nematodes that grow on soil can be observed directly with a microscope (Non-Patent Document 1), or microorganisms can be isolated from soil or water sources and grown on an appropriate medium to confirm their presence (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 2 a method for determining the presence or absence of a contamination source by amplifying and confirming DNA possessed by a specific organism by a PCR method (Patent Document 2) or non-patent document 3).
  • Patent Document 4 a method for determining the presence or absence of a contamination source by amplifying and confirming DNA possessed by a specific organism by a PCR method
  • heavy metals and organic substances in soil and water sources can be detected using analytical chemistry techniques such as gas or liquid chromatographs and mass spectra (Non-patent Document 4).
  • PCR results only in the presence of contamination sources. It is a method that does not give any information on the actual toxicity, infectivity or toxicity of the source. Therefore, the PCR method requires a determination method using another test plant for determining the presence or absence of infectivity.
  • analytical chemical methods enable accurate quantification of abiotic sources, such as heavy metals and organic pollutants, by type.
  • pretreatment of appropriate specimens depends on the measurement target. Need to do.
  • this method requires a facility with measuring equipment, so it is extremely difficult to inspect the soil and water source to be examined on the spot.
  • this method only confirms the presence of the source and is not a method of presenting the toxicity, infectivity or harm of the source. Therefore, it is necessary to check the measurement results against a database of known hazardous substances, or to conduct a confirmation test using a certified plant, etc., in order to determine toxicity.
  • Non-Patent Document 1 Nematode Experimental Method 2004, Japanese Nematode Society
  • Non-Patent Document 2 Hideki Hara, Kuniaki Ono Studies on the ecology of tobacco leaf blight. I. Detection and quantification of pathogenic bacteria. Okayama Tobacco Trial Reports 42, 127-138
  • Non-Patent Document 3 Clapp, JP MOLECULAR ECOLOGY, 2000, 9th, 9th, 1 223-1232
  • Non-Patent Document 4 Techno Tokyo 21, 2003, September, 126, pp. 2-3, Tokyo Metropolitan Bureau of Industry, Academia and Labor
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2005-534292
  • the present invention can be carried out at the site of soil and water sources, and it is possible to determine new harmful soils and soils that can accurately determine the harmfulness or infectivity of the contaminated source as well as the presence or absence of the contaminated source.
  • a method for determining contaminated water is provided.
  • the present invention provides a method by which the state of plant nutrient sources contained in soil and water sources can be easily determined.
  • the present inventors pay attention to the fact that the expression of a specific gene group, which is determined differently for each pollution source when the plant comes into contact with the pollution source, fluctuates in the plant tissue. By bringing the assay plant into direct contact with the pollution source, It was found that the presence or absence of a contamination source can be determined by causing this gene group expression variation and confirming this, and completed the following inventions.
  • a method for judging soil contamination and Z or water pollution 1) planting in the soil to be tested for the test plant and supplying water to be tested for Z or the test plant for 1 to 14 days Cultivating, 2) recovering nucleic acid from the tissue strength of the cultivated test plant, 3) expression of the recovered nucleic acid is changed by contact between the contamination source in soil and / or water and the test plant. Confirming the expression of one or more genes from the test plant
  • the test plant is at least one selected from the group power consisting of solanaceous plants, cruciferous plants, gramineous plants, cucurbitaceae plants, legumes, rosaceae, and liliaceae, (1) Judgment method described in.
  • nucleic acid extracted from the test plant is attached with a radioactive label or a non-radioactive label.
  • (8) A method for determining the excess or deficiency of plant nutrients contained in soil and Z or water, 1) planting the test plant in the soil to be determined and trying to determine Z or test plant Cultivate for 1 to 14 days with water, 2) Collect nucleic acids for the tissue strength of the cultivated test plants, 3) Excessive or insufficient plant nutrients in soil and Z or water in the collected nucleic acids. And confirming the expression of one or more genes derived from a test plant whose expression varies.
  • the test plant is at least one selected from the group consisting of solanaceous plants, cruciferous plants, gramineous plants, cucurbitaceae plants, legumes, roses and lilies, Judgment method of description
  • the method of the present invention does not require isolation of a source of contamination such as microorganisms from a specimen, and does not require verification of the infectivity of the isolated microorganism by another method. It is a method that has advantages such as being able to make a judgment, judging whether it is infectious or harmful by a single operation.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a DNA macroarray used in Example 1.
  • 1-16 in the figure is 1: Sub 29 P-rich protein, 2: hypothetical protein Zinnia elegans TED4, 3: Wound— induce d protein Sn— 1, 4: PR protein STH— 2, 5: homeotic protein VAHOX, 6: gibberellin— regulated protein RSI— 1, 7: protease inhibitor multicystatin, 8: putative receptor lik e kinase ⁇ 9: Protease Inhibitor type II (Short) ⁇ 10: Protease Inhibitor type II (long), 11: dof zinc finger ⁇ 12: BURP-domain containing protein, 13: Probe DNA corresponding to pectinesterase 14 to 16 are 14: elongation f actor-1 ⁇ and 15: ⁇ -tubulin ⁇ lo: actin, respectively.
  • FIG. 2-a Photographs showing the hybridized spots of RNA collected from healthy tomatoes (left) and infected tomatoes (middle: 3rd day, right: 7th day) analyzed by DNA macroarray It is.
  • FIG. 2-b A graph showing the intensity of spots on the DNA macroarray for infected and healthy tomatoes.
  • FIG. 3-a is a photograph showing spots (left: infected tomato, right: healthy tomato) when analyzed by DNA macroarray for the tomato root of Example 1.
  • FIG. 3-b is a photograph showing spots (left: infected tomato, right: healthy tomato) when analyzed by DNA macroarray for the tomato leaves of Example 1.
  • Fig. 3-c Fig. 3-a and b show the intensity of spots on each macro array.
  • FIG. 4 is a diagram showing spots when the tomato leaves of Example 1 are analyzed by a DNA macroarray by chemical color development using a BT / BCIP substrate.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between chemiluminescence from a CDP-Star substrate and signals obtained by chemical color development from an NBT-BCIP substrate.
  • FIG. 6 is a photograph showing hybridized spots when RNA collected from tomato (left), healthy tomato (middle) and nematode-infected tomato (right) infected with Fusarium was analyzed by DNA macroarray.
  • the spot surrounded by the mouth is the spot of the Water Channel gene.
  • FIG. 7 Rice roots grown in phosphorus-containing hydroponic culture solution (+ P) and non-phosphorus-containing hydroponic culture solution (P) and the above-ground (leaf) strength Recovered RNA is expressed in DNA macroarray It is the photograph which shows the hybridized spot when analyzing. The spots surrounded by the mouth are OsIPSl on the top and OsPIl on the bottom.
  • Contamination determined in the present invention is mainly contamination that may hinder the growth of agricultural crops. Even if the contamination is intended for dyeing but does not hinder the growth of agricultural crops, it is not necessary to use the present invention as long as it is a contamination that induces the expression of certain genes in the test plant. It can be used as a judgment target.
  • the method of the present invention can be applied to phytopathogenic nematodes such as soybean cyst centimeter, potato cyst centiu, potato root centimeter, and phytopathogenic microorganisms such as Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Psudomonas, and Xanthomonas.
  • Soil-borne viruses such as sugar beet root disease, wheat stripe dwarf disease, soil insects such as bark beetles, heavy metals such as cadmium, arsenic, lead, mercury, dioxin, PCB, chemical fertilizer, insecticide, fungicide, herbicide Soil contamination and Z or water contamination from organic sources such as can be determined.
  • the method of the present invention provides a nutrient source important for plant growth, particularly nitrogen, phosphorus, and potassium, which are deficient or excessive in the soil to be planted and the water for hydroponics. Can be determined.
  • One of the steps of the method of the present invention is to plant the test plant in the soil to be judged and to supply Z or the test plant with water to be judged and to cultivate it for 1 to 14 days.
  • the test plants include solanaceous plants such as tomatoes and potatoes, africanaceae plants such as Arabidopsis, rice plants such as wheat and rice, cucurbits such as melon, legumes such as soybean, and strawberries.
  • Rose family such as lily family or lily family such as lily can be used.
  • these plants are grown to plant individuals with roots, stems and leaves in a pollution-free environment.
  • the test plant When determining soil contamination or the state of plant nutrients in the soil, the test plant may be directly planted in the soil to be determined, or the soil to be determined in an appropriate pot may be collected, You may plant a test plant in this.
  • an appropriate plastic eg, polyethylene or polypropylene bag
  • planting plants in soil placed directly on the pod often causes root loss when harvesting plants from the pod, which can cause unwanted stress on the plant and fluctuations in gene expression in response to the stress.
  • by cultivating the plant in the soil in the bag it is possible to prevent fluctuations in gene expression due to root breakage when the plant is recovered.
  • Cultivation of the test plant is continued for 1 to 14 days, preferably 3 to 14 days.
  • Cultivation conditions can be determined appropriately according to the soil and water source to be tested, their surrounding environment, climate, test plants, etc. Such conditions can be set by ordinary abilities of those skilled in the art.
  • One of the steps of the method of the present invention is to collect nucleic acid from the tissue strength of the test plant cultivated using the soil to be determined and Z or the water to be tested.
  • the tissue to be collected may be any tissue of the test plant, but is preferably a root, a leaf, or a stem.
  • the tissues that are in direct contact with the soil or water to be determined are mainly roots. Therefore, it is assumed that the tissues in which changes in gene expression are observed due to the influence of the pollution source are also roots. Surprisingly, however, it was confirmed that such variation in gene expression was also observed in leaves and stems even after cultivation for only 3-7 days. Therefore, it can be said that the method of the present invention is an invention having excellent workability that soil contamination can be determined simply by picking and collecting the leaves of the test plant after cultivation.
  • the nucleic acid to be collected may be DNA or RNA, but for the purpose of observing gene expression fluctuations, it is preferable to collect RNA, particularly total RNA including mRNA.
  • RNA particularly total RNA including mRNA.
  • various methods known to those skilled in the art for example, the method described in Molecular cloning—A Laboratory Manual, 3rd ed ”chapter 7, protocols 1-2) are used for lj. It can be carried out.
  • One of the steps of the method of the present invention is to detect a gene derived from a test plant that changes in expression due to contact between a contamination source contained in soil and / or water and the test plant.
  • the above example is an example of tomatoes and potato cysts.
  • pollutants such as nematodes, heavy metals, pathogens, and plants that are in contact with or infected with them.
  • pollutants such as nematodes, heavy metals, pathogens, and plants that are in contact with or infected with them.
  • Numerous examples have already been reported for genes that cause fluctuations. The following are non-limiting examples.
  • any of the combinations of the contamination sources exemplified above and one or more genes that cause expression fluctuations can be used. Also limited to the above examples Alternatively, known combinations of other sources of contamination and the genes that result in expression fluctuations are also available.
  • the present invention can also be applied to a pollution source in which a gene causing expression fluctuation in a plant is unknown.
  • the method for determining the excess or deficiency of plant nutrient sources contained in soil and Z or water is one or more derived from a test plant whose expression varies depending on the excess or deficiency of plant nutrient sources contained in soil and Z or water. Confirming the expression of the gene. For example, it is known that the expression of the gene OsPIl is increased in rice (Oryza sativa) that has been deficient in phosphorus (Wasaki et al., New Phytologist, 2003, 158, 239-248). Furthermore, the present inventors confirmed the enhanced expression of the genes shown below in rice (Oryza sativa) placed in a phosphorus-deficient state using a microarray.
  • the OsIPSl gene, the OsSAPl gene, and the Z or OsGMRl gene can be used to determine the phosphorus deficiency state.
  • a known plant such as a microarray or a differential display method is used to cultivate a test plant in a medium lacking various phytonutrients or a medium containing an excessive amount of phytonutrients and to change the gene expression as a result. Detection by specifying in advance It is preferable to specify the gene to be used.
  • the gene identified as described above can be detected by using a known method capable of detecting gene expression, such as Northern hybridization or PCR.
  • a known method capable of detecting gene expression such as Northern hybridization or PCR.
  • a DNA array is a detection means known per se, and is used in the form of a chip carrying thousands to tens of thousands of types of DNA! /, In the form of a flat plate, or produced commercially (for example, Genomics, gene expression and DNA arrays, Nature, 2000, 405, 827-836).
  • a powerful DNA array can be used.
  • the type and number of DNAs to be detected are specified in advance, a simple and accurate determination can be made by using a DNA array specially carrying only such genes. I can.
  • the DNA array used in the present invention is prepared by synthesizing a probe DNA comprising the whole or a part of the base sequence of the specific gene described in the previous section by using a PCR method or a DNA synthesizer, etc. It can be easily prepared by supporting it on glass or a membrane. Alternatively, a DNA array obtained by synthesizing the above-mentioned probe DNA on a flat plate such as Aflfymetrix GeneChip can also be used in the present invention. In addition, when synthesizing the probe DNA, the probe DNA can be labeled using a dye, a fluorescent substance, a radioisotope element or other appropriate labeling compound.
  • the nucleic acid in the sample may be labeled and hybridized with the probe DNA on the DNA array for detection.
  • the detection of nucleic acid hybridized on the DNA array can be carried out using a known method according to the type of label used, and further quantified as necessary.
  • any of the methods for synthesizing DNA, the type of labeling compound, the method for labeling DNA using the labeling compound, and the method for supporting DNA on a slide glass or membrane, etc. are all applicable. This can be done by using a method known to a trader.
  • Examples of the DNA array suitably used in the present invention include a macroarray using a membrane manufactured by Labo Corporation (http: www.labo.co.jp/).
  • This macro Ray is a DNA array in which multiple types (about 10 to 200) of cDNA PCR products are carried at equal intervals on a nylon membrane.
  • the probe DNA solution is quantitatively spotted by a production method using a spotter (Patent No. 3305295), which is characterized by high uniformity between arrays.
  • This DNA array detects the presence or absence of hybridization between the DNA in the sample and the probe DNA by a color reaction, so use a scanner connected to a personal computer, etc. The presence or absence of the hybridization can be confirmed.
  • a normal DNA microarray requires the use of a detection device having a complicated mechanism, but the above-described macroarray using a nylon membrane does not require such a complicated detection device, making analysis extremely simple and inexpensive. This is advantageous in that it can be performed. In addition, since complex detection equipment is not required, it is possible to perform analysis at the site of soil or water source.
  • PCN Potato Cyst Nematode
  • tomato strong rice life
  • PCN was grown in potatoes grown in a greenhouse, eggs were separated from cysts, and then hatched in tomato root exudates to obtain second stage larvae.
  • Tomato strong rice life
  • Tomato is cultivated in a pot at 22 ° C for 16 hours and inoculated, and 30 days after sowing, inoculate approximately 10,000 larvae of the above PCN to the root of the tomato to produce infected tomatoes. did.
  • the tomato inoculated with water was prepared as a negative control tomato (healthy tomato).
  • cDNA was synthesized from the total RNA of b) by reverse transcription, and then fluorescently labeled with cy3 and cy5, respectively.
  • Microarray analysis is performed by the so-called two-color method, in which a mixture of cy3 labeled cDNA from NC tomato and cy5 labeled cDNA from each sample from PC tomato is prepared and hybridized on one microarray. It was broken. The obtained values were standardized by global normalization, and the Lowess method was applied to correct the Dye bias. With reference to the signal intensity and expression ratio of fluorescent dyes, genes that showed significant changes in expression due to nematode infection were selected.
  • SAGE compared the gene expression of infected tomato samples on day 14 and healthy tomato samples on day 14.
  • SAGE Library uses I-SAGE long Kit (Invitrogen) And constructed according to that protocol. The sequencing reaction was carried out using the BigDye Terminat or cycle sequencing ready reaction kit, and the reaction was analyzed by the DNA sequencer ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Sequence data was analyzed using SAGE analysis software SAGE2000 ver.4.5 (Invitrogen). In order to annotate the tag sequence extracted by the software, BLAST search of the sequence was performed with cDNA and EST database of Sol Genomics Network (SGN).
  • SGN Sol Genomics Network
  • the collected nucleic acid is subjected to expression analysis by semi-quantitative PCR or Northern blotting, and the same expression change due to PCN infection occurs as in the comprehensive expression analysis results. It was confirmed.
  • d) Cloning of diagnostic genes As an index for soil diagnosis, PCR primer sets specific to each nucleotide sequence of the 12 genes identified in c) were designed to clone the probe DNA spotted on the macroarray. Using Takara RNA PCR Kit (AMV) ver.1.1, probe DNA was amplified from total RNA by RT-PCR using the above set of primers, and then TA-cloned into pGEM T easy vector (Promega). The base sequence of the probe DNA amplified by this primer set is as follows.
  • Protease Inhibitor type II long (eyes tl ⁇ U number 1)
  • SubC29 P-rich protein (SEQ ID NO: 5)
  • PR protein STH-2 (SEQ ID NO: 6)
  • BURP- domain containing protein SEQ ID NO: 7
  • protease inhibitor multicystatin (Umi 8)
  • pectinesterase SEQ ID NO: 10.
  • homeotic protein VAHOX SEQ ID NO: 11
  • dof zinc finger SEQ ID NO: 12
  • the probe DNA carried on the DNA array was adjusted to a concentration of 0.5 / zg / 1 after PCR amplification using the plasmid clones of the above genes as templates.
  • the prepared probe DNA was analyzed by nylon membrane biodine plu with HYDRA-HTS (Robbins). Two 0.2 ⁇ l portions were dispensed on each s nylon membrane (Pall) and two spots were dispensed on each clone.
  • To fix the probe DNA to the membrane treat the membrane after spotting with filter paper in an oven at 120 ° C for 30 minutes, and then apply UV to the membrane using a UV cross-linker (UV P) at 120 mJ / cm. Irradiation was performed.
  • UV P UV cross-linker
  • RNA was purified using MagExtractor-mRNA- (TOYOBO) according to the protocol.
  • Biotin-labeled cDNA was amplified by the synthesized PCR reaction. After the amplified cDNA was purified by ethanol precipitation, dATP was added using Caro, Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT), and dA tail was attached to the 3rd end of the 1st strand cDNA.
  • the macroarray image data spots obtained in the TIFF format were numerically calculated using DNA chip expression analysis software ImaGene (biodiscovery).
  • actin SGN-U213638
  • j8-tubulin SGN-U212618
  • elongation factor-1a SGN-U21 2845
  • healthy tomatoes had the least amount of expression of each gene on the DNA macroarray compared to the expression patterns of the two PCN-infected tomatoes.
  • the expression pattern of infected tomatoes on day 3 after nematode infection showed a marked increase in protease inhibitor typell expression compared to healthy tomatoes.
  • the expression level of SubC 29 P-rich protein, STH-2 was also increased (Fig. 2-b). The reproducibility of these results was very high.
  • Planted tomatoes plants with strong rice life, roots, leaves and stems grown on uncontaminated soil in 200 g of soil collected from Kutchan Town, Hokkaido, 22 ° C, 16 Cultivated in a pot for 14 days with time lighting.
  • the root expression of the field soil samples obtained as a result showed the same expression pattern as the 7th day sample of infected tomatoes in the preliminary test (Fig. 3-a, Fig. 3-c).
  • Expression analysis was also performed on RNA collected from tomato leaves after cultivation, and the same expression pattern as that in the roots was confirmed (Fig. 3-b and Fig. 3-c). As a result, it was confirmed that the field soil collected in Kutchan Town, Hokkaido was contaminated with PCN!
  • Example 2 For the leaves collected in Example 1, the macroarray filter (Fig. 3-b) used for chemiluminescence detection with Phototope Star detection Kit (New England Biolabs) was washed with Wash solution 1 (0.5% SDS, 12. Wash twice with 5 mM NaCl, 2.5 mM sodium phosphate) for 10 minutes, and then wash solution 2 (1 OmM Tris—HC1, 10 mM NaCl, ImMMgCl, pH 9.5)
  • Tomato strong rice life
  • Tomato strong rice life
  • the plant is cultivated under the above conditions for another 7 days, and then the tomato roots are collected, and total RNA is extracted according to the protocol using T Rlzol (invitrogen), and then the RNeasy plant column is used. Purified. The yield (concentration) of purified total RNA was measured and its purity was confirmed by non-denaturing agarose gel electrophoresis, Agilent 2100 Bioanalyzer, spectrophotometer, and the like.
  • RNA microarray Filgen Array tomato 13K
  • the steps of RNA amplification and labeling, and the ability of hybridization were standardized by the same method as the microarray analysis of nematode-infected samples described in the preliminary test.
  • genes that change in expression due to Fusarium infection include PR — ⁇ a (Unigene ID: Les.54), PR-5 (Unigene ID: Les. «J683), chitinase (Unigene ID: Les. 122), XTH3 (Unigene ID: Les. 4353), and water channel (Unigene ID: les. 12273) were selected.
  • RNAs derived from the five selected genes were performed using the illumina total prep RNA amplification kit (Ambion) according to the protocol, and the PCR amplification fragment was determined. A piece was spotted and immobilized on a nylon membrane to prepare a cDNA macroarray. On this cDNA macroarray, DNA derived from the above five genes and tubulin and actin cDNA as control DNA were spotted in double, respectively.
  • the signal of the Water Channel gene (spots surrounded by b in the figure) is compared to healthy tomato (control) and nematode-infected tomato prepared as a comparison target.
  • the difference in the expression level that was clearly stronger in tomato was clear.
  • the expression of PR-la gene and PR-5 gene was increased in Fusarium-infected tomatoes compared with healthy tomato (control) and nematode-infected tomatoes.
  • the method of the present invention can detect Fusarium infection separately from nematode infection by examining the expression level of Water Channel gene, PR-la gene and Z or PR-5 gene in the test plant. It was shown that soil contamination resulting in Fusarium infection could be clarified.
  • Air germination was performed for germination treatment.
  • On a bat filled with 1 mM CaCl solution 1 mM CaCl solution
  • a net was floated on the seedlings, and germinated rice seeds were placed thereon for preculture.
  • the plant height is about 10-15 cm, transplant the rice seeds after the pre-culture into the phosphorus-containing hydroponic culture solution and the phosphorus-free hydroponic culture solution with the following composition, and replace each culture solution every day. Cultivated for 10 days.
  • ADP glucose pyrophosphorylase large subunit (OsAGPL) A 100910
  • OsPIl was selected as a known phosphorus deficiency-inducing gene
  • rice actin gene was selected as a control, and added to the above eight selected genes.
  • RNA from 8 selected genes, RNA from OsPIl gene, and RNA from actin gene as a control was performed according to the protocol using illumina total prep RNA amplification kit (Ambion).
  • the PCR amplified fragment was spotted and immobilized on nylon membrane to prepare a cDNA macroarray.
  • the above eight selected gene cDNAs, the OsPIl gene-derived cDNA, and the control actin cDNA were each spotted in double.
  • the above RNA sample was amplified and labeled using the illumina totalprep RNA amplification kit according to the protocol.
  • the process of standardizing the signal from the hybridization of the cDNA macroarray to the numerical value of the signal was performed in the same manner as the analysis of the cDNA macroarray for nematode diagnosis.
  • RNA extracted from the root and above-ground culm of rice cultivated in a phosphorus-containing hydroponic medium for 10 days and rice cultivated in a non-phosphorous hydroponic medium was analyzed.
  • Fig. 7 In rice roots cultured in a non-phosphorus-containing hydroponic medium, strong expression of OsIPSl (upper mouth in the figure) and OsPIl (lower mouth in the figure) was observed, and OsSAPl and Increased expression was also observed with OsH ADP.
  • OsIPSl and OsPIl were also upregulated in the aerial region due to phosphorus deficiency.
  • suppression of OsPM expression was confirmed specifically on the ground.
  • the method of the present invention reveals phosphorus deficiency in the culture medium by examining the expression level of the OsIPSl gene, OsPIl gene, OsSAPl gene, OsH ADP gene and / or OsPM gene in the test plant. It was shown that you can. Also, test plants It was shown that the above-ground organization that uses only roots is also available. Diagnosis with above-ground tissues is more advantageous than diagnosis with root tissues because it is easier to extract tissues and extract RNA than roots.

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Abstract

　作物を栽培することを計画された土壌やその水源について、その土壌や水源が作物の生育に悪影響を与える汚染源によって汚染されているかを簡便に判定する方法を提供する。 　土壌汚染及び／または水質汚染の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１～１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変動する検定植物由来の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。 　本発明の方法は、微生物等の汚染源を検体から単離する必要がない、単離した微生物等の感染性を別の方法で検証する必要がない、短時間に多数の検体について判定を行うことができる、一度の操作で感染性ないし有害性まで判定することができる、などの利点を有する方法である。 　また判定は特異的な遺伝子の発明の有無によって行われるので、顕微鏡観察等の特別な熟練操作は特に必要とせず、また判定の信頼性が高い。

Description

明 細 書
土壌汚染及び Zまたは水質汚染の判定方法
技術分野
[0001] 本発明は、作物を栽培することを計画された土壌やその水源について、その土壌 や水源が作物の生育に悪影響を与える汚染源によって汚染されているかを簡便に 判定する方法を提供する。
背景技術
[0002] ある土壌または水源が作物の栽培に適している力、あるいは作物を土壌に植えて、 あるいは水源の水を利用して栽培を行うことが可能かどうかを調べるために、その土 壌や水源が作物の生育に悪影響を与える微生物、ウィルス、線虫、重金属や有機物 質などに汚染されている力否力、又はその土壌や水源が植物の生長にとって望まし い量の植物栄養源を含んでいる力否力 を確認することは、極めて重要な作業であ る。
[0003] これまでは、作物の生育に悪影響を与える微生物、ウィルス、線虫、重金属や有機 物質などの汚染源を直接検出する方法が主に使用されてきた。例えば、土壌に生育 する線虫を直接的に顕微鏡等で観察したり（非特許文献 1)、土壌や水源から微生物 を単離し、適当な培地上で増殖させてその存在を確認したり（非特許文献 2)、あるい は特定の生物が有する DNAを PCR法などによって増幅させて確認したりして（非特 許文献 3)、汚染源の有無を判定する方法が知られている。また、土壌や水源中の重 金属や有機物質などについては、ガス又は液体クロマトグラフ、マススペクトルなどの 分析化学的手法を用いて検出することが行われて ヽる (非特許文献 4)。
[0004] し力しながら、線虫等の直接観察は卓越した技術者による経験的な判断を必要とし 、多数の検体を迅速に検査するためには適さない方法である。また微生物の単離等 は、検体から菌体を分離'培養して、さらに検定植物に感染させて病原性を確認する までに例えば 2ヶ月程度の長時間を要するなどの問題を抱えている。 PCRを利用し た方法は、時間的な問題を解消するけれども、非特異的産物 (ノイズ)を提示すること 力 Sしばしば認められている。また、 PCR法は単に汚染源の存在のみを結果として与 えるだけで、その汚染源の現実的な毒性、感染性ないし有害性については全く情報 を与えない方法である。そのため、 PCR法は、感染性の有無の決定に別の検定植物 を用いた判定方法を必要とする。
[0005] また、分析化学的手法は、重金属や有機汚染物質などの非生物的汚染源を種類 ごとに正確に定量することを可能とするが、通常、測定対象に応じて適正な検体の前 処理を行う必要がある。またこの方法は、測定設備を有する施設を要求するので、調 ベようとする土壌や水源をその場で検査することは極めて難しい方法である。さらにこ の方法は、汚染源の存在を確認するのみであり、汚染源の毒性、感染性ないし有害 性を提示する方法ではない。そのため、有害性等の判定のために、測定結果を既知 の有害物質データベースと照らし合わせたり、検定植物などを用いて確認試験をした りなどが必要となる。
[0006] 近年、汚染源によって発現が制御される特定のプロモーターにレポーター遺伝子 を連結した遺伝子を有する形質転換植物を用意し、その種子を土壌に播！ヽて形質 転換植物を生育させた後に、レポーター遺伝子の発現の有無を確認して、土壌汚染 源の検出を行う方法が報告されて 、る (特許文献 1)。
[0007] し力しこの方法は、特定の形質転鎌物を用意しなければならな 、こと、その様な 形質転換体の種子を土壌環境に播く必要があること、感染した植物個体を種子から 栽培して回収するのに長期間を要することなどから、土壌汚染の判別方法としては非 実用的である。
[0008] 非特許文献 1 :線虫学実験法 2004年、日本線虫学会
非特許文献 2 :原秀紀、小野邦明 タバコ立ち枯れ病の発生生態に関する研究. 第 一報病原細菌の検出 ·定量用培地. 岡山タバコ試報第 42卷、第 127— 138頁 非特許文献 3 : Clapp, JPら、 MOLECULAR ECOLOGY, 2000年、第 9卷、第 9号、第 1 223-1232頁
非特許文献 4:テクノ東京 21、 2003年、 9月号、第 126卷、第 2-3頁、東京都産学労働 局
特許文献 1：特表 2005 - 534292号公報
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、土壌や水源の現場でも行うことができ、汚染源の存在の有無だけではな ぐその汚染源の有害性ないし感染性も的確に判定することのできる、新たな汚染土 壌や汚染水の判定方法を提供する。また、本発明は、土壌や水源に含まれる植物栄 養源の状態を簡便に判定できる方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、植物が汚染源と接触したときに汚染源毎に異なって定まる特定の 遺伝子群の発現が植物組織において変動することに着目し、検定植物を汚染源に 直接接触させることでこの遺伝子群発現の変動を生じさせ、これを確認することで、 汚染源の有無を判定することができることを見出し、以下の各発明を完成した。
[0011] (1)土壌汚染及び Zまたは水質汚染の判定方法であって、 1)検定植物を判定しょう とする土壌に植えて Z又は検定植物に判定しょうとする水を与えて 1〜14日間栽培 すること、 2)栽培した検定植物の組織力ゝら核酸を回収すること、 3)回収した核酸にお いて、土壌及び/または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変 動する検定植物由来の 1以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法
[0012] (2)検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ゥリ科植物、マメ科植物 、バラ科、及びユリ科よりなる群力も選ばれる一種以上である、 (1)に記載の判定方 法。
[0013] (3)核酸が RNAである、（1)に記載の判定方法。
[0014] (4)汚染源が植物病原性線虫、植物病原性微生物、植物病原性昆虫、植物病原性 ウィルス、重金属、及び有機汚染源より選ばれる一種以上である、 (1)に記載の判別 方法。
[0015] (5)遺伝子の発現の確認を、 DNAアレイを用いて行う、 (1)に記載の方法。
[0016] (6) DNAアレイがナイロンメンブレンを用いたマクロアレイである、（5)に記載の方法
[0017] (7)検定植物カゝら抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用す る、請求項 1に記載の方法。 [0018] (8)土壌及び Z又は水に含まれる植物栄養源の過不足の判定方法であって、 1)検 定植物を判定しょうとする土壌に植えて Z又は検定植物に判定しょうとする水を与え て 1〜14日間栽培すること、 2)栽培した検定植物の組織力も核酸を回収すること、 3 )回収した核酸において、土壌及び Zまたは水に含まれる植物栄養源の過不足によ つて発現が変動する検定植物由来の 1以上の遺伝子の発現を確認することを含む、 前記判定方法。
[0019] (9)検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ゥリ科植物、マメ科植物 、バラ科及びユリ科よりなる群力も選ばれる一種以上である、 (8)に記載の判定方法
[0020] (10)核酸が RNAである、（8)に記載の判定方法。
[0021] (11)植物栄養源は窒素、リン又はカリウムである、 (8)に記載の判別方法。
[0022] (12)遺伝子の発現の確認を、 DNAアレイを用いて行う、 (8)に記載の方法。
[0023] ( 13) DNAアレイがナイロンメンブレンを用いた DNAマクロアレイである、（12)に記 載の方法。
[0024] (14)検定植物カゝら抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用 する、 (8)に記載の方法。
発明の効果
[0025] 本発明の方法は、微生物等の汚染源を検体から単離する必要がない、単離した微 生物等の感染性を別の方法で検証する必要がない、短時間に多数の検体について 判定を行うことができる、一度の操作で感染性な 、し有害性まで判定することができ る、などの利点を有する方法である。
また、判定は特異的な遺伝子の発現の有無によって行われるので、顕微鏡観察等 の特別な熟練操作は特に必要とせず、判定の信頼性は高 、ものである。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]実施例 1で使用した DNAマクロアレイの模式図である。図中の 1〜16は 1 : Sub し 29 P— rich protein、 2： hypothetical protein Zinnia elegans TED4、 3 : Wound— induce d protein Sn— 1、 4 : PR protein STH— 2、 5： homeotic protein VAHOX、 6 : gibberellin— regulated protein RSI— 1、 7： protease inhibitor multicystatin、 8： putative receptor lik e kinase ^ 9： Protease Inhibitor type II (Short) ^ 10 : Protease Inhibitor type II (long)、 11： dof zinc finger ^ 12 : BURP- domain containing protein、 13 : pectinesteraseにそ れぞれ対応するプローブ DNAのスポットであり、 14〜16はそれぞれ 14 : elongation f actor- 1 α、 15 : β -tubulin ^ lo : actinである。
[図 2-a]健全トマト (左端)と感染トマト（中：3日目、右：7日目）から回収した RNAにつ いて DNAマクロアレイで発現を解析したときのハイブリダィズしたスポットを示す写真 である。
[図 2- b]感染トマトと健全トマトについて、 DNAマクロアレイ上のスポットの強度を表し たグラフである。
[図 3-a]実施例 1のトマトの根について DNAマクロアレイで解析したときのスポット（左 ：感染トマト、右:健全トマト)を示す写真である。
[図 3-b]実施例 1のトマトの葉について DNAマクロアレイで解析したときのスポット（左 ：感染トマト、右:健全トマト)を示す写真である。
[図 3-c]図 3— a、 bの各マクロアレイ上のスポットの強度を表した図である。
[図 4]実施例 1のトマトの葉について BT/BCIP基質を用いた化学発色による DNAマ クロアレイで解析したときのスポットを表す図である。
[図 5]CDP-Star基質による化学発光と NBT-BCIP基質による化学発色で得られたシ グナルの相関を示すグラフである。
[図 6]フザリウムに感染したトマト (左端)、健全トマト（中)及び線虫感染トマト (右)から 回収した RNAについて DNAマクロアレイで発現を解析したときのハイブリダィズした スポットを示す写真である。口で囲ったスポットは Water Channel遺伝子のスポットであ る。
[図 7]リン含有水耕培養液（ + P)、リン非含有水耕培養液（ P)で栽培したイネの根 と地上部（葉）力 回収した RNAにつ 、て DNAマクロアレイで発現を解析したときの ハイブリダィズしたスポットを示す写真である。口で囲ったスポットは、上が OsIPSlの、 下が OsPIlの各スポットである。
発明を実施するための最良の形態
本発明で判定する汚染は、主に農業用作物の生育に支障を来すおそれのある汚 染を対象とするが、農業用作物の生育に支障を来すものでない汚染であっても、検 定植物にぉ ヽて一定の遺伝子の発現を誘導するような汚染であれば、本発明にお ける判定対象とすることができる。
[0028] 例えば、本発明の方法は、ダイズシストセンチユウ、ジャガイモシストセンチユウ、ジ ャガイモネコブセンチユウ等の植物病原性線虫、 Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Ps eudomonas, Xanthomonas等の植物病原微生物、テンサイそう根病、ムギ縞萎縮病等 の土壌伝搬性ウィルス、ネキリムシ等の土壌性昆虫、カドミウム、ヒ素、鉛、水銀等の 重金属、ダイォキシン、 PCB、化学肥料、殺虫剤、殺菌剤、除草剤などの有機汚染源 による土壌汚染及び Z又は水質汚染を判定することができる。また本発明の方法は 、植物の生育にとって重要な栄養源、特に窒素、リン、カリウムの含有量が、その植物 を植えようとする土壌や水耕栽培用の水において欠乏しているのかあるいは過剰な のかを判定することができる。
[0029] 本発明の方法は、検定植物を判定しょうとする土壌に植えて Z又は検定植物に判 定しょうとする水を与えて 1〜14日間栽培することを、工程の一つとする。
[0030] 検定植物としては、トマト、ジャガイモなどのナス科植物、シロイヌナズナなどのアブ ラナ科植物、ムギ、イネなどのイネ科植物、メロンなどのゥリ科植物、ダイズなどのマメ 科植物、イチゴなどのバラ科、又はユリなどのユリ科などを利用することができる。好ま しくは、汚染源のない環境下で根、茎ならびに葉を有する植物個体にまで生育させ たこれらの植物を利用する。
[0031] 土壌汚染又は土壌中の植物栄養源の状態を判定する場合には、判定しょうとする 土壌に検定植物を直接植えてもよぐまた適当なポットに判定しょうとする土壌を回収 し、これに検定植物を植えてもよい。ポットで検定植物を培養する際には、適当なプ ラスチック製の、例えばポリエチレン製のあるいはポリプロピレン製のバッグに入れた 土壌をポッドに置き、このバッグに入れた土壌に検定植物を植えることが好ましい。ポ ッドに直接置いた土壌で植物を栽培すると、ポッドから植物を回収する際に根切れを 起こすことがしばしばあり、植物に不要なストレスと当該ストレスに反応する遺伝子発 現の変動を与えるおそれがあるが、バッグに入れた土壌で植物を栽培することによつ て、植物を回収する際の根切れによる遺伝子発現の変動を防止することができる。 [0032] 水質汚染を判定する場合には、汚染源のない土壌に検定植物を植え、ここに判定 しょうとする水を加えて栽培すればょ ヽ。また判定しょうとする水を用いた水耕栽培を 行ってもよい。水に含まれる植物栄養源の状態を判定する場合は、その水を用いた 水耕栽培を行うことが好ましい。なお、判定しょうとする土壌や水源の汚染源に影響 を与えな！/、範囲であれば、検定植物の栽培に好適な肥料や添加物を適宜判定しょう とする土壌や水に加えてもよい。
[0033] 検定植物の栽培は、 1〜14日間、好ましくは 3〜14日間継続して行う。栽培条件は 、検定しょうとする土壌や水源、それらの周囲環境、気候、検定植物等に応じて適宜 定めればよぐその様な条件設定は当業者の通常の能力によって行うことができる。
[0034] 本発明の方法は、判定しょうとする土壌及び Z又は検定しょうとする水を用いて栽 培した検定植物の組織力も核酸を回収することを、工程の一つとする。
[0035] 回収される組織は、検定植物のいずれの組織でもよいが、好ましくは根、葉、又は 茎である。本発明の方法において、判定しょうとする土壌ないし水と直接接触する組 織は主に根であるので、汚染源の影響を受けて遺伝子発現の変動が観察される組 織も根であると想定されたが、意外にも、僅か 3〜7日の栽培であっても、その様な遺 伝子発現の変動は葉や茎でも観察されることが確認された。したがって、本発明の方 法は、栽培後の検定植物の葉を摘み取って回収するだけで土壌汚染の判定を行うこ とができるという、優れた作業性を有する発明であるということができる。 回収する核 酸は DNAでも RNAでもよいが、遺伝子発現の変動を観察するという目的からすれ ば、 RNA、特に mRNAを含む全 RNAを回収することが好ましい。 DNAあるいは R NAの植物組織からの回収は、当業者に公知の種々の方法（例えば Molecular clonin g— A Laboratory Manual, 3rd ed" chapter7, protocols 1—2に 載の方法)を禾 lj用し て行うことができる。
[0036] 本発明の方法は、土壌及び/または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によ つて発現変動が生じる検定植物由来の遺伝子を検出することを、工程の一つとする。
[0037] 本発明者らは、ジャガイモシストセンチユウ（Potato Cyst Nematode)に感染したトマ トにおいて特異的に発現変動が生じる遺伝子を網羅的に解析し、その結果、表 1に 示す特定の遺伝子の発現変動が生じることを確認した。 [0038] [表 1]
Figure imgf000010_0001
[0039] 従って、トマトを土壌等に植えて栽培した後に、トマトにおいて上記の遺伝子群の発 現を検出することにより、トマトがジャガイモシストセンチユウに感染したことを確認する ことができ、その結果、土壌は感染性のジャガイモシストセンチユウによって汚染され ていたと判定することができる。この様に、本発明の方法の好適な一態様は、土壌等 に検定植物であるトマトを植えて栽培した後、検定植物において上記の遺伝子の発 現変動が生じて 、るかどうかを確認することで、土壌等がジャガイモシストセンチユウ に汚染されているかどうかの判定を行う方法である。
[0040] 上記の例はトマトとジャガイモシストセンチユウとの例である力 その他にも、線虫、 重金属、病原菌などの、ある特定の汚染源とこれに接触ないし感染した植物におい て特異的に発現変動が生じる遺伝子については、既に多数の例が報告されている。 以下はその非限定的な例示である。
[0041] (1)線虫について
•Jammes, F., Lecomte, P., De Almedia Engler, J., Bitton, F., Martin— Magnitte, M— L., Renou, J. P., Abad, P. and Favery, B., Genome-wide expression profiling of the host response to root-knot nematode infection in Arabidopsis., Plant J. 44, 447—45 8, 2005.
•Khan, R., Alkharouf, N., Beard, H., MacDonald, M., Chouikha, I., Meyer, S., Greff enstette, J., Knap, H. and, Matthews, Β·， Microarray analysis of gene expression in soybean roots susceptible to the soybean cyst nematode two days post invasion., J. NematoL, 36， 241-248, 2004.
• Puthoif, D.， Nettleton, D.， Rodermel, S.R. and Baum, T.J., Arabidopsis gene expr ession changes during cyst nematode parasitism revealed by statistical analyses of m icroarray expression profiles., Plant J., 33, 911—921， 2003.
•Klink, V.P., Alkharouf, Ν·， MacDonald, M. and Mattews, Β·， Laser capture microd issection (LCM) and expression analyses of Glycine max (soybean) syncytium cininin g root regions formed by the plant pathgen Heterodera glycines (soybean cyst nemat ode)., Plant Mol. Biol, 59， 965—979， 2005.
[0042] (2)重金属について
• Krizek, B.A., Prost, V.， Joshi, R.M., Stoming, T. and Glenn, T.C., Developing tra nsgenic arabidopsis plants to be metal-specific bioindicators. Environmental Toxicol ogy and Chemistry, 22, 175 - 181， 2003.
•Weber, M., Harada, Ε·， Vess, C.， Roepenack— Lahaye, E. v. and Clemens, S.， Com parative microarray analysis of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis halleri roots ide ntifies nicotianamine synthase, a ZIP transporter and other genes as potential metal hyperaccumulation factors., The Plant Journal, 37, 269—281， 2004
[0043] (3)病原性微生物について
•Rep, M., Dekker, H.L., Vossen, J.H., de Boer, A.D., Houterman, P.M., Speijer, D ·, Back, J.W., de Koster, C.G., Cornells sen, B.J.C., Mass spectrometric identificat ion of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato. Plant Physiolo gy, 130， 904-917, 2002
•Iqbal, M.J., Yaegashi, S.， Ahsan, R.， Shopinski, K.L. and Lightfoot, D.A., Root res ponse to Fusarium solani f. sp. glycines: temporal accumulation of transcripts in part ially resistant and susceptible soybean., Theor. Appl. Genet., 110， 1429 - 1438， 2005 [0044] 本発明においては、上記に例示した汚染源とそれにより発現変動が生じる 1以上の 遺伝子との組み合わせのいずれも利用することができる。また上記の例示に制限さ れず、その他の汚染源とそれにより発現変動が生じる遺伝子の公知の組み合わせも 利用可能である。
[0045] また、後述する実施例においても実証されているように、調べようとする汚染源を用 いて適当な検定植物を人為的に感染させ、その結果発現変動が生じる遺伝子をマイ することによって、植物において発現変動が生じる遺伝子が未知である汚染源につ いても、本発明を適用することができる。
[0046] また、土壌及び Z又は水に含まれる植物栄養源の過不足を判定する方法は、土壌 及び Zまたは水に含まれる植物栄養源の過不足によって発現が変動する検定植物 由来の 1以上の遺伝子の発現を確認することを含む。例えば、リン欠乏状態に置か れたイネ（Oryza sativa)では、遺伝子 OsPIlの発現が亢進することが知られている（ Wasakiら、 New Phytologist, 2003年、第 158卷、第 239-248頁）。本発明者らはさらに 、リン欠乏状態に置かれたイネ（Oryza sativa)において、下記に示される遺伝子の発 現の亢進をマイクロアレイを用いて確認した。
[0047] [表 2]
Figure imgf000012_0001
[0048] 上記の遺伝子のうち、 OsIPSl遺伝子、 OsSAPl遺伝子及び Z又は OsGMRl遺伝子 は、リンの欠乏状態の判定に利用可能である。
[0049] また、種々の植物栄養素の欠乏培地あるいは植物栄養源を過剰に含む培地で検 定植物を栽培して、その結果発現変動が生じる遺伝子をマイクロアレイやディファレ ンシャルディスプレイ法などの公知の手法を用いて予め特定することによって、検出 すべき遺伝子を特定しておくことが好ま U ヽ。
[0050] 上記のように特定された遺伝子の検出は、ノーザンノヽイブリダィゼーシヨンや PCR などの、遺伝子発現を検出することのできる公知の方法を利用して行うことが可能で ある。特に本発明では、特定された遺伝子の全部あるいは一部の塩基配列力 なる プロープを担持させた DNAアレイの利用が好まし!/、。
[0051] DNAアレイは、自体公知の検出手段であり、数千〜数万種類の DNAを担持した チップな!/、し平板の形態で利用され、また商業的に生産されて 、る（例えば Genomic s, gene expression and DNA arrays, Nature, 2000年、第 405卷、第 827— 836頁 参照)。 本発明では、力かる DNAアレイを利用することができる。特に、本発明では 検出すべき DNAの種類と数が予め特定されて 、ることから、その様な遺伝子のみを 特別に担持させた DNAアレイを適時使用することにより、簡便かつ正確な判定を行 うことができる。
[0052] 本発明で使用する DNAアレイは、前項で述べた特定の遺伝子の塩基配列の全部 又は一部の塩基配列からなるプローブ DNAを PCR法あるいは DNAシンセサイザー 等を用いて合成し、これをスライドガラスやメンブレン等に担持させることで、簡便に 調製することができる。あるいは、 Aflfymetrix社の GeneChipの様な平板上で上記のプ ローブ DNAを合成することで得られる DNAアレイも、本発明で利用することができる 。 また、プローブ DNAの合成の際に、色素、蛍光物質、放射性同位体元素その 他の適当な標識化合物を利用して、プローブ DNAをラベル化することができる。プロ ーブ DNAのラベル化に代えてあるいはプローブ DNAのラベル化と同時に、サンプ ル中の核酸をラベル化して DNAアレイ上のプローブ DNAとハイブリダィズさせて検 出を行ってもよい。 DN Aアレイ上でノヽイブリダイスした核酸の検出は、用いた標識の 種類に応じて公知の方法を採用して行 、、さらに必要に応じて定量化すればょ 、。
[0053] DNAの合成法、標識化合物の種類、該標識ィ匕合物を用いた DNAの標識ィ匕の手 法、さらにはスライドガラスやメンブレン上に DNAを担持させる方法などは、いずれも 当業者に公知の方法を利用して行うことができる。
[0054] 本発明で好適に利用される DNAアレイとしては、株式会社ラボ（http：〃 www.labo.c o.jp/)が製造するメンブレンを用いたマクロアレイを挙げることができる。このマクロァ レイは、ナイロン製メンブレン上に、複数種類（10〜200種類程度）の cDNAの PCR 産物を等間隔で担持させた DNAアレイである。スポッターを用いた作製法 (特許第 3 305295号）によりプローブ DNA溶液が定量的にスポットされており、アレイ間の高 い均一性が特長である。この DNAアレイは、検体中の DNAとプローブ DNAとのハ イブリダィゼーシヨンの有無を、発色反応によって検出するので、パーソナルコンビュ ータなどに接続して使用するスキャナーを用いて、 DNAアレイ上のハイブリダィゼー シヨンの有無を確認することができる。通常の DNAマイクロアレイでは、複雑な機構 を有する検出機器の使用が必要となるが、上記のナイロンメンブレンを用いたマクロ アレイはその様な複雑な検出機器を必要とせず、極めて簡便かつ安価に分析を行う ことができる点で有利である。また、複雑な検出機器を必要としないことから、土壌や 水源現場で分析を行うことも可能である。
[0055] また、多数の汚染源について、それらの汚染源に応じて発現が変動する遺伝子群 につ 、て詳細な発現解析を行 、、さらに汚染の種類間でクロスして変動する遺伝子 などについても把握した上で、かかる汚染源とそれに応じて発現が変動する遺伝子 群に関するデータベースを構築することもできる。遺伝子群の発現パターンの変化は 、上記に説明したマクロアレイによれば着色によって検出できるため、肉眼での簡易 判定も可能である力 適当なスキャナーを用いてこの着色で表されるパターンを読み 取り、これを適当な解析プログラムによって前記データベースと照合した上で、土壌 汚染の有無ならびに汚染源の特定を含めた総合判定を行うシステムを構築すること もできる。このシステムは、判定の精度ならびに信憑性を著しく高め、誤診を最小限 にする。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
実施例
[0056] <予備試験 >
汚染源としてジャガイモシストセンチユウ (Globodera rostchiensis、 Potato Cyst Nem atode, PCN)を、検定植物としてトマト（強力米寿)をそれぞれ選択し、人工的に孵化 させた PCNに感染させたトマトをポジティブコントロール (感染トマト）として、 PCNへ の感染によって発現変動が生じる遺伝子を特定する予備実験を行った。
[0057] a)感染トマトの作製
PCNを温室で栽培したジャガイモで増殖させ、シストから卵を分離した後、トマト根 浸出液中でふ化させ、 2期幼虫を獲得した。トマト (強力米寿)を 22°C、 16時間照明 にてポットで栽培し、播種後 30日で上記の PCNの 2期幼虫をトマトの根元に 1万頭程 度接種して、感染トマトを作製した。また、水を接種したトマトをネガティブコントロール トマト (健全トマト)として準備した。
PCNないし水を接種後、 3日目、 7日目、 14日目に感染トマトと健全トマトのそれぞ れの根を回収し、発現解析に用いた。
[0058] b)全 RNAの回収
回収した根 2gを乳鉢に入れ、液体窒素を加えて凍結させ乳棒で破砕した後、 TRIZ OL Reagent (Invitrogen)を用いて、そのプロトコルに従って全 RNAを抽出した。
[0059] c)遺伝子解析
土壌診断の指標となり得る遺伝子を同定するために、トマト cDNAマイクロアレイ T OM1 (CGEP)と SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)による網羅的な遺伝子 発現解析を行った。前者はボイストンプソン研究所力 提供された、 TOM1マイクロ レイのホ ~~ムへ' ~~シ—ti載の方法 (http:/ 1 ted.bti.cornell.edu/ array/ interface/ proto col/protocol.html)、後者はインビトロジェン社力 提供されたプロトコルに従って実行 した。
[0060] cDNAマイクロアレイ解析は、 b)の全 RNAから逆転写反応により cDNAを合成後、 各々 cy3と cy5で蛍光標識した。マイクロアレイ解析は、 NCトマトからのサンプルの cy 3標識 cDNAと PCトマトからの各サンプルの cy5標識 cDNAの混合液を調製し、そ れを 1枚のマイクロアレイ上でハイブリダィズする、いわゆる 2色法で行われた。得られ た数値の標準化は、 global normalizationにより行い、さらに Dyeバイアスを補正する ために Lowess法を適用した。蛍光色素のシグナル強度と発現比を参考にして、線虫 感染によって有意な発現変化を示す遺伝子を選定した。
[0061] SAGEにより、感染トマトの 14日目のサンプルと健全トマトの 14日目のサンプルの 遺伝子発現が比較された。 SAGEライブラリ一は、 I- SAGE long Kit (Invitrogen)を用 いて、そのプロトコルに従って構築された。シークェンシング反応は BigDye Terminat or cycle sequencing ready reaction kitを用 ヽて行 ヽ、その反応 ま DNAシークェン サー ABI PRISM 3100(Applied Biosystems)により解析された。シークェンスデータの 解析は、 SAGE解析ソフト SAGE2000 ver.4.5 (Invitrogen)を用いて行われた。そのソ フトで抽出されたタグ配列のァノテーシヨンのために、 Sol Genomics Network (SGN) の cDNA and EST databaseでその配列を BLAST検索した。 17bpのタグ配列と完全 に一致する配列を含む遺伝子が同定された後、その遺伝子配列中でタグ配列が正 しい方向に向 ヽて 、るかどうか、及び制限酵素 Nlalllの切断部位の下流に位置して V、るかが確認された。同定された遺伝子の健全トマトサンプルと感染トマトサンプルの タグの数が比較された。
[0062] 上記の網羅的発現解析の結果を基に、線虫感染により発現が変化する遺伝子 12種 類を選抜した。以下に遺伝子名と SGNの Unigene IDを示す。
[0063] Protease Inhibitor type II (SGN— U212876)
Wound-induced protein Sn- 1 (SGN- U216965)
hypothetical protein Zinnia elegans TED4 (SGN— U214087)
SubC29 P- rich protein (SGN- U213037)
PR protein STH- 2 (SGN- U214460)
BURP- domain containing protein (SGN- U217045)
protease inhibitor multicystatin (SGN-U220775)
putative receptor like kinase (SGN-U224043)
pectinesterase (SGN— U213347)
homeotic protein VAHOX (SGN-U213417)
dof zinc finger (SGN-U224743)
gibberellin— regulated protein RSI-1 (SGN-U213623)
[0064] 上記の遺伝子の一部について、回収した核酸に対して半定量 PCRやノーザンブロッ ティングによる発現解析を行い、網羅的な発現解析の結果と同じぐ PCN感染による 発現変化が生じて 、ることを確認した。
[0065] d)診断用遺伝子のクローユング 土壌診断の指標として、マクロアレイにスポットされるプローブ DNAのクロー-ング を行うために、 c)で特定した 12種の遺伝子の各塩基配列に特異的な PCR用プライ マーセットを設計した。 Takara RNA PCR Kit (AMV) ver.1.1を用いて、上記プライマ 一セットを用いて全 RNAから RT— PCRによりプローブ DNAを増幅後、 pGEM T Ea sy vector (Promega)に TAクローユングした。このプライマーセットによって増幅される プローブ DNAの塩基配列は次の通りである。
Protease Inhibitor type II long (目 tl歹 U番号 1)
Figure imgf000017_0001
[0067] Protease Inhibitor type II Short (配列番号 2)
Figure imgf000017_0002
ATCT
[0068] Wound- induced protein Sn-1 (配列番号 3)
Figure imgf000018_0001
[0070] SubC29 P-rich protein (配列番号 5)
GTTTTGCTTATGAGCAATGTTCAAGTG [0071] PR protein STH-2 (配列番号 6)
Figure imgf000019_0001
ACACGTGTT
[0072] BURP- domain containing protein (配列番号 7)
Figure imgf000019_0002
AGATGGTGGCATGTCATACCA
[0073] protease inhibitor multicystatin (酉己歹 U番号 8)
putative receptor like kinase (酉己列番号 9)
Figure imgf000020_0001
ATGCACATAG
[0075] pectinesterase (配列番号 10)
Figure imgf000020_0002
TACACTGTCCTCGAATACGCTTTCCATGGTCTGC
[0076] homeotic protein VAHOX (配列番号 11) [0077] dof zinc finger (配列番号 12)
Figure imgf000021_0001
GGGAACATTATTCTTGCACCTGATCCA
[0078] gibberellin- regulated protein RSI- 1 (配列番号 13)
Figure imgf000021_0002
TCTGAGCTGAGTTGTAGTACTGGAGC
[0079] 4) DNAマクロアレイの作製（図 1)
DNAアレイに担持させるプローブ DNAは、上記の各遺伝子のプラスミドクローンを テンプレートとして PCRにより増幅後、各々 0. 5 /z g/ 1の濃度に調整された。調製さ れたプローブ DNAは、 HYDRA- HTS (Robbins)により、ナイロンメンブレン biodine plu s nylon membrane(Pall)に 0. 2 μ 1ずつ、各クローンにっき 2スポットずつ分注された。 プローブ DNAをメンブレンに固定するため、スポット後のメンブレンをろ紙に挟んだ 状態でオーブンで 120°C 30分処理した後、メンブレンに対して UV cross-linker (UV P)にて 120mJ/cmの UV照射を行った。
[0080] 5) mRNAの精製
b)で抽出された全 RNA50 gから、 MagExtractor- mRNA- (TOYOBO)を用い、そ のプロトコルに従って mRNAを精製した。
[0081] 6)ピオチン標識された cDNAの増幅と精製
上記で f した mRNA力ら、 Gene Navigator cDNA amplification system ver.2 (T OYOBO)を用い、そのキットのプロトコルに従い、アンカー配列付カ卩オリゴ dTプライマ 一から逆転写酵素 ReverTra Aceを用いて cDN Aを合成した PCR反応により、ビォチ ン標識 cDNAを増幅した。増幅 cDNAをエタノール沈殿により精製した後、 dATPを カロ 、 Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)によつ飞、 1st strand cDNAの 3 ，末端に dA tailを付カ卩した。その dA tailを付加された cDNAをテンプレートとして、ァ ンカー配列付加 oligo (dT)プライマーとアンカー配列プライマーを加えて、 DNAポリ メラーゼ KOD dashを用いた PCRを行った。この PCR反応液に biotin- 16- dUTPを添 加しておくことで、ピオチン標識された cDNAを増幅した。ピオチン標識 cDNAは、 エタノール沈殿により精製後、再蒸留水 100 1で溶解した。
[0082] 7)ハイブリダィゼーシヨン
DNAマクロアレイをハイブリダィゼーシヨンボトル（Thermo Hybaid)〖こセットし、再蒸 留水 5mlをカ卩え、ハイブリダィゼーシヨンオーブン（Iwaki)で 68°C10分間洗い、ハイ ブリダィゼーシヨンバッファー PerfectHyb (TOYOBO) 5mlで 68°C1時間プレハイブリ ダイゼーシヨンを行った。前述のピオチン標識 cDNA溶液 1を 100°C5分で変性 後、 PerfectHyb 5mlに添加して、 68°C 14時間ハイブリダィゼーシヨンを行った。 2 X SSC、0. 1%SDS洗净液で 68。C10分間の洗净を 3回洗净行い、さらに 0. 1 X SSC 、 0. 1%SDS洗浄液で 68°C5分間の洗浄を 3回行った後、 Phototope- Star detectio n kit(New England Biolabs)を用いて化学発光により検出した。その化学発光シグナ ルは Fluor- S Multilmager(BioRad)により画像化した。 [0083] 8)数値化，診断
TIFFフォーマットで得られたマクロアレイ画像データのスポットを DNAチップ発現解 析用ソフトウェア ImaGene(biodiscovery社)により数値ィ匕した。内部標準遺伝子として a ctin (SGN—U213638)、 j8—tubulin(SGN—U212618)、 elongation factor— 1 a (SGN-U21 2845)を同じアレイ上にスポットした。これらの遺伝子は、そのシグナル強度の値で各 スポットのシグナル強度値を割って標準化するのに利用した。
[0084] 9)感染トマトの遺伝子発現パターンの解析
人工的に PCNに感染させて、各々 3日目と 7日目のトマトと健全なトマトを含んだ 3種 類の検体について、上記 6)〜8)で説明した DNAマクロアレイを用いた発現解析を 行った（図 2— a)。
[0085] その結果、健全トマトは 2つの PCN感染トマトの発現パターンと比較して、 DNAマク ロアレイ上の各遺伝子の発現量が最も少な力つた。線虫感染後 3日目の感染トマトの 発現パターンは、健全トマトに比べて protease inhibitor typellの発現が顕著な増加を 示した。線虫感染後 7日目トマトでは、 protease inihibitor typellの他にも、さらに SubC 29 P-rich protein, STH-2の発現量の増加が見られた（図 2— b)。これらの結果の再 現 ¾は非常に高いものであった。
[0086] <実施例 1 >
北海道倶知安町の圃場カゝら採取された土壌 200gに、汚染されていない土壌で栽 培して調製したトマト (強力米寿、根、葉、茎を有する植物個体)を植え、 22°C、 16時 間照明で、ポットにて 14日間栽培した。
[0087] 栽培後のトマトの根から、上記予備試験における操作に準じて RNAを回収し、 DN Aマクロアレイを用いて解析した（図 3— a)。その結果得られた圃場土サンプルの根 の発現は、予備試験における感染トマトの 7日目サンプルと同様の発現パターンを示 した（図 3— a、図 3— c)。また栽培後のトマトの葉から回収した RNAについても発現 解析を行 ヽ、根における発現パターンと同様の発現パターンが確認された（図 3— b 、図 3— c)。この結果、北海道倶知安町の圃場力 採取された土壌が PCNにより汚 染されて!/ヽることを確認した。
[0088] <実施例 2 > 実施例 1で回収した葉について、 Phototope Star detection Kit (New England Biola bs)による化学発光検出に使用されたマクロアレイフィルター（図 3— b)を、 Wash溶液 1 (0. 5%SDS、 12. 5mMNaCl、 2. 5mM sodium phosphate)で 10分間 2回洗浄を 行い、さらに Wash溶液 2 (1 OmM Tris— HC1、 10mMNaCl、 ImMMgCl、 pH9. 5)
2
で 5分間 3回洗浄を行った。洗浄したフィルタ一につ!/、て NBT/BCIP基質 (Roche)を 用いた化学発色による検出を行い、その化学発光シグナルは Fluor- S MultiImager(B ioRad)により画像化された（図 4)。 TIFFフォーマットで得られたマクロアレイ画像デー タのスポットを DNAチップ発現解析用ソフトウェア ImaGene(biodiscovery社)により数 値化した。化学発光とィ匕学発色の数値ィ匕データは、高い相関湘関係数 0. 99)を示 した (図 5)。
[0089] <実施例 3 >
トマト (強力米寿)をポットに播種して 22°C、 16時間照明 14日間栽培後、トマト萎凋病 菌で teるフサリウム菌 (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, race2) トマト苗の核兀 に接種した。接種後、前記の条件でさらに 7日間栽培した後にトマトの根を回収し、 T Rlzol(invitrogen)を用いて、そのプロトコルに従って全 RNAを抽出し、 RNeasy plant mi ni kitの RNeasyスピンカラムを用いて精製した。非変性ァガロースゲル電気泳動、 Agil ent 2100バイオアナライザ及び分光光度計等により、精製全 RNAの収量 (濃度)の測 定及び純度を確認した。
[0090] 純度確認後の全 RNAをサンプルとして、 DNAマイクロアレイ（Filgen Array tomato 1 3K)を用いた網羅的な発現解析を行った。 RNAの増幅と標識の工程及び、ノ、イブリ ダイゼーシヨン力 得られたシグナル強度の標準化は、前記予備試験に記載した線 虫感染サンプルのマイクロアレイ解析と同様の方法で行った。このマイクロアレイによ る網羅的な発現解析の結果、フザリウム感染により発現が変化する遺伝子として、 PR —丄 a (Unigene ID : Les.54)、 PR-5 (Unigene ID : Les.«j683)、 chitinase(Unigene ID : Les. 122)、 XTH3(Unigene ID : Les.4353)、 water channel(Unigene ID : les.12273)の 5種類を 選抜した。
[0091] 選抜した 5種類の遺伝子由来の RNAの増幅及び標識を、 illumina total prep RNA amplification kit (Ambion)を用いて、そのプロトコルに従って行い、その PCR増幅断 片をナイロンメンブレンにスポット、固定化して、 cDNAマクロアレイを作製した。この c DNAマクロアレイには、上記 5種類の遺伝子由来の DNAと、コントロール DNAとし て tubulin及び actinの cDNAを、それぞれダブルでスポットした。
[0092] この cDNAマクロアレイを用いて、フザリウム菌接種後 7日目のトマトと陰性コントール として健全トマトの根について発現解析を行った。その結果を図 6に示す。図 6の各ス ポットのシグナル強度は、その遺伝子の mRNA発現量を示す。 cDNAマクロアレイ のハイブリダィゼーシヨン力もシグナルの数値化'標準化の工程は、前記く予備試験 >に記載した線虫診断用 cDNAマクロアレイの解析時と同様の方法で行った。
[0093] 図 6に示される様に、 Water Channel遺伝子（図中ロで囲んだスポット）のシグナル は、健全トマト（コントロール)及び比較対象として用意した線虫感染トマトと比較して 、フザリウム菌感染トマトにおいて明らかに強ぐその発現量の差は明瞭であった。ま た、 PR-la遺伝子と PR-5遺伝子の発現も、健全トマト (コントロール)及び線虫感染ト マトと比較して、フザリウム菌感染トマトにおいて亢進していることが確認された。この 様に、本発明の方法は、 Water Channel遺伝子、 PR-la遺伝子及び Z又は PR-5遺伝 子の検定植物における発現量を調べることで、フザリウム感染を線虫感染と区別して 検出することが出来、フザリウム菌の感染をもたらす土壌汚染を明らかにすることがで きることが示された。
[0094] <実施例 4>
イネ（Oryza sativa L.品種：キタァケ）の種子を 1 mM CaCl溶液中で喑所にて 48時
2
間エアレーシヨンを行い、発芽処理を行った。 1 mM CaCl溶液を満たしたバットの上
2
に網を浮かべ、その上に発芽したイネ種子を載せて前培養を行った。草丈が 10〜15 cm程度になったところで、下記の組成からなるリン含有水耕培養液とリン非含有水耕 培養液に前培養後のイネ種子を移植し、各培養液を毎日交換しながら、 10日間栽培 した。
[0095] [表 3] リン含有水耕培地 リン非含有水耕培養液 使用塩 終濃度 (mgじ'） 終濃度 (mg L 1)
Fe-EDTA 2 2
MnS04' 5H20 0.5 0.5
Figure imgf000026_0001
ZnS04- 7H20 0.2 0.2
CuS04- 5H20 0.01 0.01
( H4)6Mo6024-4H20 0.005 0.005
( ¾)2S04 30 30
Figure imgf000026_0002
KC1 15 15
MgS04- 7H20 20 20
CaCl2 40 40
NaH2P04- 2H20 1 0
[0096] 全ての栽培は人工気象器 (28°C、相対湿度 60%、 24時間明期）で実施した。栽培 終了後、根部と地上部に分けて採取し、液体窒素につけて凍結後- 80°Cで保存した
[0097] 凍結した試料約 0.5 gをそのままマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて粉砕 し、 Plant RNA Isolation Mini Kit (Agilent Technologies社）を用いて抽出した全 RNA をサンプルとして、イネオリゴマイクロアレイ (Agilent Technologies社）を用いた網羅的 な発現解析を行った。 Low RNA Input Linear Amplification & Labeling Kit (Agilent T echnologies)を用いて、全 RNAから Cy3および Cy5標識された cRNAを合成し、 RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて精製した後に、プロトコルに従って標識 cRNAを用いて 60 °Cで 16時間ハイブリダィゼーシヨンを行い、 6 X SSC, 0.005% TritonX-102と 0.1 x SSC , 0.005% Triton X- 102を用いて洗浄後、マイクロアレイスキャナ (Agilent Technologie s)を使用して搭載された各遺伝子の発現量を定量した。 RNAの増幅と標識の工程及 び、ノ、イブリダィゼーシヨン力も得られたシグナル強度の標準化は、前記予備試験に 記載した線虫感染サンプルのマイクロアレイ解析と同様の方法で行った。
[0098] このマイクロアレイによる網羅的な発現解析の結果、リン欠乏状態に置かれることで 発現が変化する遺伝子として、下記の遺伝子を選抜した。
[0099] [表 4] 遺伝子の名称 Accession No. putative bifunctional nuclease I (Bnuc) AK059608 ribonuclease S-like protein (OsRNS) A 061438 phosphorus starvation-induced gene (OsIPS 1 ) A 063904 ossap2 gene for secretory acid phosphatase precursor (OsSAPl) A 066273 phosphoethanolamine N-methyltransferase ((OsPM) A腸 9137 putative receptor- like kinase (OsGMR) AK073061
ADP glucose pyrophosphorylase large subunit (OsAGPL) A 100910
HAD-superfamily phosphatase, subfamily IIIC containing protein (OsHADP) AK111457
[0100] また、既知のリン欠乏誘導性遺伝子として OsPIlを、コントロールとしてイネの actin 遺伝子をそれぞれ選択して、上記の 8種類の選抜遺伝子に追加した。
[0101] 選抜した 8種類の遺伝子由来の RNA、 OsPIl遺伝子由来の RNA、コントロールとし て actin遺伝子由来の RNAの増幅及び標識を、 illumina total prep RNA amplification kit (Ambion)を用いて、そのプロトコルに従って行い、その PCR増幅断片をナイロンメ ンブレンにスポット、固定化して、 cDNAマクロアレイを作製した。この cDNAマクロァ レイには、上記 8種類の選抜遺伝子の cDNA、 OsPIl遺伝子由来の cDNA、コント口 ールの actinの cDNAを、それぞれダブルでスポットした。上記の RNA試料の増幅及 び標識は、 illumina totalprep RNA amplification kitを用いて、そのプロトコルに従って 行った。また、 cDNAマクロアレイのハイブリダィゼーシヨンからシグナルの数値化'標 準化の工程は、線虫診断用 cDNAマクロアレイの解析時と同様の方法で行った。
[0102] このマクロアレイを用いて、リン含有水耕培養液で 10日間培養したイネ及びリン非 含有水耕培養液で栽培したイネそれぞれの根と地上部カゝら抽出した全 RNAを解析 した（図 7)ところ、リン非含有水耕培養液で培養したイネの根において、 OsIPSl (図 中上の口）と OsPIl (図中下の口）の強い発現の亢進が観察され、また OsSAPlと OsH ADPでも発現の亢進が観察された。 OsIPSlと OsPIlは、地上部でもリンの欠乏による 発現の亢進が確認された。また、地上部特異的に OsPMの発現の抑制が確認された
[0103] この様に、本発明の方法は、 OsIPSl遺伝子、 OsPIl遺伝子、 OsSAPl遺伝子、 OsH ADP遺伝子及び/又は OsPM遺伝子の検定植物における発現量を調べることで、栽 培培地におけるリン不足を明らかにすることができることが示された。また、検定植物 の組織として、根のみでなぐ地上部の組織も利用可能であることが示された。地上 部組織での診断は、根に比べて組織の採取や RNA抽出が容易なため、根組織での 診断より有利である。

Claims

請求の範囲
[1] 土壌汚染及び Z又は水質汚染の判定方法であって、 1)検定植物を判定しょうとする 土壌に植えて Z又は検定植物に判定しょうとする水を与えて 1〜14日間栽培するこ と、 2)栽培した検定植物の組織力 核酸を回収すること、 3)回収した核酸において、 土壌及び/または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変動する 検定植物由来の 1以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。
[2] 検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ゥリ科植物、マメ科植物、バ ラ科及びユリ科よりなる群力も選ばれる一種以上である、請求項 1に記載の判定方法
[3] 核酸が RNAである、請求項 1に記載の判定方法。
[4] 汚染源が植物病原性線虫、植物病原性微生物、植物病原性昆虫、植物病原性ウイ ルス、重金属、及び有機汚染源より選ばれる一種以上である、請求項 1に記載の判 別方法。
[5] 遺伝子の発現の確認を、 DNAアレイを用いて行う、請求項 1に記載の方法。
[6] DNAアレイがナイロンメンブレンを用いた DNAマクロアレイである、請求項 5に記載 の方法。
[7] 検定植物カゝら抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、 請求項 1に記載の方法。
[8] 土壌及び Z又は水に含まれる植物栄養源の過不足の判定方法であって、 1)検定植 物を判定しょうとする土壌に植えて Z又は検定植物に判定しょうとする水を与えて 1 〜14日間栽培すること、 2)栽培した検定植物の組織力ゝら核酸を回収すること、 3)回 収した核酸において、土壌及び Zまたは水に含まれる植物栄養源の過不足によって 発現が変動する検定植物由来の 1以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記 判定方法。
[9] 検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ゥリ科植物、マメ科植物、バ ラ科及びユリ科よりなる群力も選ばれる一種以上である、請求項 8に記載の判定方法
[10] 核酸が RNAである、請求項 8に記載の判定方法。
[11] 植物栄養源は窒素、リン又はカリウムである、請求項 8に記載の判別方法。
[12] 遺伝子の発現の確認を、 DNAアレイを用いて行う、請求項 8に記載の方法。
[13] DNAアレイがナイロンメンブレンを用いた DNAマクロアレイである、請求項 12に記 載の方法。
[14] 検定植物カゝら抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、 請求項 8に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011072941A (ja) * 2009-09-30 2011-04-14 Kumagai Gumi Co Ltd 土壌の状態判定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003100068A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-04 Aresa Biodetection Aps Reporter system for plants
JP2004105030A (ja) * 2002-09-13 2004-04-08 Japan Science & Technology Corp リン栄養に発現応答性を有する新規遺伝子、およびそのプロモーター

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003100068A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-04 Aresa Biodetection Aps Reporter system for plants
JP2004105030A (ja) * 2002-09-13 2004-04-08 Japan Science & Technology Corp リン栄養に発現応答性を有する新規遺伝子、およびそのプロモーター

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IQBAL M.J. ET AL.: "Root response to Fusarium solani f. sp. glycines: temporal accumulation of transcripts in partially resistant and susceptible soybean", THEOR. APPL. GENET., vol. 110, no. 8, 2005, pages 1429 - 1438, XP019321925 *
JAMMES F. ET AL.: "Genome-wide expression profiling of the host response to root-knot nematode infection in Arabidopsis", THE PLANT JOURNAL, vol. 44, 2005, pages 447 - 458, XP003019269 *
JOHANSSON I. ET AL.: "The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1465, no. 1-2, 2000, pages 324 - 342, XP004273217 *
KOVALCHUK I. ET AL.: "Biomonitoring the genotoxicity of environmental factors with transgenic plants", TRENDS IN PLANT SCIENCE, vol. 6, no. 7, 2001, pages 306 - 310, XP003019274 *
KRIZEK B.A. ET AL.: "Developing transgenic Arabidopsis plants to be metal-specific bioindicators", ENVIRON. TOXICOL. CHEM., vol. 22, no. 1, 2003, pages 175 - 181, XP003019272 *
LI C. ET AL.: "The tomato suppressor of prosystemin-mediated responses2 gene encodes a fatty acid desaturase required for the biosynthesis of jasmonic acid and the production of a systemic wound signal for defense gene expression", THE PLANT CELL, vol. 15, 2003, pages 1646 - 1661, XP003019270 *
REP M. ET AL.: "Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato", PLANT PHYSIOL., vol. 130, 2002, pages 904 - 917, XP003019275 *
WANG Y.-H. ET AL.: "Nitrate-induced gene in tomato roots. Array analysis reveals novel genes that may play a role in nitrogen nutrition", PLANT PHYSIOL., vol. 127, 2001, pages 345 - 359, XP003019273 *
XU P. ET AL.: "In spite of induced multiple defense responses, tomato plants infected with Cucumber mosaic virus and D satellite RNA succumb to systemic necrosis", MOL. PLANT-MICROBE INTERACT., vol. 16, no. 6, 2003, pages 467 - 476, XP003019271 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011072941A (ja) * 2009-09-30 2011-04-14 Kumagai Gumi Co Ltd 土壌の状態判定方法

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