WO2007132928A1

WO2007132928A1 - 抗体希釈用組成物

Info

Publication number: WO2007132928A1
Application number: PCT/JP2007/060176
Authority: WO
Inventors: Wataru Matsuyama
Original assignee: Kagoshima University NUC
Current assignee: Kagoshima University NUC
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2008-11-15
Also published as: JP2007333723A

Abstract

　免疫学的分析の精度を上げることができる抗体希釈用組成物を提供する。　抗体希釈用組成物に寒天、カラジーナン又はそれらの混合物を含有する。

Description

明細書抗体希釈用組成物 . 技術分野

本発明は、免疫学的分析の精度を上げることができる抗体希釈用組成物、その製造方法及び使用方法、並びに抗体希釈用組成物を含む免疫学的分析用キットに関する。背景技術

免疫染色は、検体（例えば、血液や細胞の溶解液等）中に目的のタンパク質又は目的の抗体が存在するか否かを調べる方法であり、免疫学や分子生物学等の幅広い分野の研究で用いられている。また、当該免疫染色により、目的のタンパク質の量や活性化の有無を調べることもできる。

免疫染色では、使用する抗体や血清等の実験材料をバッファーで希釈して使用する。免疫染色において、目的のタンパク質を検出する上で最も問題となることは、目的のタンパク質に対応するパンド以外の非特異的なバンドが出現する現象である。この現象は、「バックグラウンドがあがる」とも呼ばれる。

そこで、従来より、このような非特異的なパンドの出現を防ぐべく、例えばブ口ッキング溶液（例えば、プロックエース（登録商標） Catalog number : UK- B25 (大日本住友製薬株式会社製)）を使用する方法、あるいは市販のバッファー（例えば、 DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components Catalog number : S3022 (Dako Cytomation社製））を使用して抗体を希釈する方法がある。

しかしながら、免疫染色において、これら従来の方法を用いても、非特異的なパンドが出現することが多い。

そこで、免疫染色における非特異的なバンドの出現を抑制する方法や試薬が望まれている。 ·

一方、特許文献 1には、免疫学的測定に用いる免疫反応を促進するための組成物が開示されている。また、特許文献 2には、抗原を安定化するための緩衝液が開示されている。さらに、特許文献 3には、タンパク及ぴペプチドのための安定化溶液が開示されている。

しかしながら、これまでに、寒天又はカラジ一ナン（carrageenan)を含有する抗体希釈用組成物の、免疫分析の精度を向上させる目的及び/又は免疫分析における非特異的な検出を抑制する目的での使用は知られていなかった。

特許文献 1 国際公開第 2005/121790号パンフレツト

特許文献 2 特表 2001- 517799号公報

特許文献 3 特表平 10-500704号公報発明の開示

本発明は、上述した実情に鑑み、免疫学的分析の精度を向上させるための及び/ 又は免疫学的分析における非特異的な検出を抑制するための抗体希釈用組成物を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、寒天又はカラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を使用することで、免疫学的分析の精度を上げることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は以下を包含する。

( 1 ) 寒天、カラジ一ナン又はそれらの混合物を含有することを特徴とする、免疫分析の精度を向上させるための及び/又は免疫分析における非特異的な検出を抑制するための抗体希釈用組成物。

( 2 ) 上記カラジ一ナンが λカラジ一ナンであることを特徴とする、（1 ) 記载の抗体希釈用組成物。

( 3 ) さらに糖及びゼラチンを含有することを特徴とする、（1 ) 記載の抗体希釈用組成物。

( 4 ) 塩、キレート剤、緩衝液及び非イオン系界面活性剤から成る群より選択される 1以上の成分を含有することを特徴とする、（ 1 )記載の抗体希釈用組成物。

( 5 ) 上記寒天の濃度が 0. 1〜5重量％であることを特徴とする、（1 ) 記載の抗体希釈用組成物。 6

(6) 上記寒天の濃度が 0.2〜3重量％であることを特徴とする、（1) 記載の抗体希釈用組成物。

( 7 )上記力ラジーナンの濃度が 0.01〜5重量％であることを特徴とする、（ 1 ) 記載の抗体希釈用組成物。

(8)上記カラジ一ナンの濃度が 0.03〜2重量％であることを特徴とする、（1) 記載の抗体希釈用組成物。

( 9 )上記糖がショ糖であることを特徴とする、（ 3 )記載の抗体希釈用組成物。

(1 0) 上記糖の濃度が 0.0017〜0.⁸3モル濃度であることを特徴とする、（3) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 1) 上記ゼラチンの濃度が 0.01〜2重量％であることを特徴とする、（3) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 2) 上記塩が塩化ナトリゥムであることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 3) 上記塩の濃度が 10mM〜2Mであることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(14) 上記キレート剤がエチレンジァミン四酢酸であることを特徴とする、 (4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 5) 上記キレート剤の濃度が lmM〜100mMであることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 6) 上記緩衝液がトリスであることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 7) 上記緩衝液の濃度が 10mM〜lMであることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 8) 上記非ィオン系界面活性剤が Tween 20又は Triton X- 100であることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(1 9) 上記非イオン系界面活性剤の濃度が 0.01〜1容量％であることを特徴とする、（4) 記載の抗体希釈用組成物。

(20) (1) 〜（1 9) のいずれかに記載の抗体希釈用組成物を使用することを特徴とする免疫学的分析方法。 (21) 上記免疫学的分析がウェスタンブロッテイング又は免疫染色であることを特徴とする、（20) 記載の方法。

(22) (1) 〜（19) のいずれかに記載の抗体希釈用組成物と抗体とを含む免疫学的分析用キット。

(23) 上記免疫学的分析がウェスタンプロッティング又は免疫染色であることを特徴とする、（22) 記載の免疫学的分析用キット。

(24) 以下の工程：

(i)塩、キレート剤、緩衝液及び非イオン系界面活性剤からなる群より選択される 1以上の成分を含む水中の混合液を攪拌する工程：

(ii)工程（i)で生じた混合液を加温下でィンキュペートする工程；

(iii)前記混合液を冷却する工程；及び

(iv)カラジ一ナンを添加して攪拌する工程；

を含む、抗体希釈用組成物の製造方法。

(25)上記工程（i)の水中の混合液がさらにゼラチンを含むことを特徴とする、 (24)記載の方法。

(26) 上記工程（ii)において、インキュベーションの温度を 35°C〜40°Cとすることを特徴とする、（24) 記載の方法。

(27) 上記工程（iii)において、混合液を 4°C〜30°Cに冷却することを特徴とする、（24) 記載の方法。

(28) 上記工程（iv)において、カラジ一ナンと共に糖を添加して攪拌することを特徴とする、（24) 記載の方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-24437 号及ぴ 2006- 135032号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明に係る、寒天を含有する抗体希釈用組成物を用いたウェスタンプロッティングの結果を示す（左図：従来方法、右図：本発明に係る寒天含有抗体希釈用組成物を使用）。

図 2は、本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を用いたゥエスタンブロッテイングめ結果を示す。 A の左図と右図は、それぞれ従来方法を使用した結果と、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用した結果を示す。 B の左図と右図は、それぞれ従来方法を使用した結果と、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用した結果を示す。 C は、それぞれカラジ一ナンを含まない本発明の抗体希釈用組成物を使用した結果（左図）と、カラジ一ナンを含む本発明の抗体希釈用組成物を使用した結果（右図）を示す。 D の左図と右図は、それぞれ従来方法を使用した結果と、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用した結果を示す。

図 3は、本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を用いた肺組織の免疫組織染色の結果を示す（A :従来方法、 B.:カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用、 C :一次抗体にラビット IgGを使用した negative control (カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用）、 D :へマトキシリンェォジン染色）。

図 4は、本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を用いた腎組織の免疫組織染色の結果を示す（A :従来方法、 B :カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用、 C :一次抗体にャギ IgGを使用した negative control (カラジーナン含有抗体希釈用組成物を使用）、 D :へマトキシリンェォジン染色）。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る抗体希釈用組成物は、寒天、カラジ一ナン又はそれらの混合物を含有する組成物である。本発明に係る抗体希釈用組成物は、免疫学的分析に使用する抗体を希釈するために使用する。本発明に係る抗体希釈用組成物を使用すれば、免疫学的分析の精度を上げることができる。

具体的には、免疫学的分析において、目的のタンパク質 (抗原）以外のタンパク質の非特異的な検出を抑制することができる。例えば、ウェスタンブロッテイング又は免疫染色において本発明に係る抗体希釈用組成物を使用することで、非特異的なパンドの出現を抑制することができる。

本発明の組成物には、寒天又はカラジ一ナン以外に、塩、キレート剤、緩衝液及び非イオン系界面活性剤から成る群より選択される 1以上の成分、特に好ましくはこれら全ての成分を含有する。その他、例えば、アジ化ナトリウム、グリセ

'ロール、ゥシ血清アルブミン（BSA)、 2 -メルカプトエタノール、ジチオスレィトール、ゼラチン、糖等を混合液中に含有させてもよい。ゼラチン及ぴ糖を含有することが特に好ましい。本発明に使用し得る糖は、例えばショ糖、セルロースが挙げられ、特にショ糖を含むことが好ましい。糖の添加は、カラジ一ナンの溶解性を高めるのに有効である。また、ゼラチンの添加は本組成物の汎用性の向上に効果的である。その際、混合液中の糖の濃度は 0. 0017〜0. 83モル濃度、好ましくは 0. 005〜0. 33モル濃度となるように調整する。混合液中のゼラチンの濃度は 0· 01 〜2重量％、好ましくは 0. 05〜1重量％となるように調整する。また、本発明の組成物の成分類の混合に使用する水として、例えば、 2 回蒸留水（D2 、蒸留水、滅菌水等を使用することができる。

使用する寒天としては、例えば、特級粉末寒天、粉末寒天、粉寒天、糸寒天、角寒天等が挙げられ、特に特級粉末寒天が好ましい。混合液中の寒天の濃度は 0. 1 〜5重量％、好ましくは 0. 2〜3重量％となるように調製する。

使用するカラジ一ナンは、 κカラジ一ナン、 tカラジ一ナン及び λカラジーナンが挙げられ、特にえカラジ一ナンを使用することが好ましい。混合液中のカラジーナンの濃度は 0. 01〜5重量⁰ /₀、好ましくは 0. 03〜2重量％である。

一方、塩としては、その形態は限定されないが、例えば塩化ナトリゥム（NaCl)、塩化カリゥム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が挙げられ、特に NaClが好ましい。混合液中の塩の濃度は 10mM〜2M、好ましくは 100mM〜l. 5Mとなるように調製する。

キレート剤としては、例えば、エチレン:ジァミン四酢酸（EDTA)、ヒドロキシェチルェチレンジアミン三酢酸（HEDTA)、ジヒドロキシェチルェチレンジァミン二酢酸（DHEDDA)、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA)、 EDTA金属塩等が挙げられ、特に EDTAが好ましい。 EDTAを使用する際は、例えば ρΗ7· 0〜8. 5、特に ρΗ8のものを使用することが好ましい。混合液中のキレート剤の濃度は lmM〜100mM、好ましくは 3mM〜50mMとなる.ように調製する。

また、緩衝液としては、例えばトリス（トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン；以下、「Tti s」という）、グリシン、フタル酸、クェン酸、コノヽク酸、酢酸、リン酸、ホウ酸、炭酸、グッドバッファー（MES、 PIPES, MOPS, HEPES、ビストリス等）等が挙げられ、特に Trisが好ましい。 Trisを使用する際は、例えば ρΗ7· 0 〜8. 0、特に ρΗ7. 4のものを使用することが好ましい。混合液中の緩衝液の濃度は 10mM〜lM、好ましくは 30mM〜600mMとなるように調製する。

さらに、非イオン系界面活性剤としては、例えば Tween 20 (Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (ポリォキシエチレンソルビタンモノラゥレー卜) )、 Triton X - 100 (Octylphenolpoly (ethylene glycolether) (オタチノレフエノーノレポリ（ェチレングリコーノレエーテノレ）））、 Tween 80、 Brij 35、 Triton X— 114、 Nonidet P-40 (NP-40)、 Octyl b-glucoside等が挙げられ、特に Tween 20又は Triton X - 100 が好ましい。混合液中の非イオン系界面活性剤の濃度は 0. 01〜1容量％、好ましくは 0. 03〜0. 6容量％となるように調製する。

本発明の別の態様では、本発明の抗体希釈用溶液の製造方法が提供される。寒天を含有する本発明の抗体希釈用組成物の製造方法では、先ず寒天を含有する混合液を撹拌する。撹拌においては、温度は、例えば 10〜30°C、好ましくは 15 〜20°Cとする。撹拌速度は、例えば 200〜1500rpm、好ましくは 600〜800rpmとする。また撹拌時間は例えば 1〜6時間、好ましくは 1〜2時間とする。次いで、撹拌後の混合液をインキュベートする。インキュベーションにおいて、温度は例えば 35〜40°C、好ましくは 37°Cとする。また、インキュベーション時間は、例えば' 5〜24時間、好ましくは 8〜12時間とする。以上に説明した方法により、本発明に係る、寒天を含有する抗体希釈用組成物を製造することができる。

カラジ一ナンを含有する本発明の抗体希釈用組成物の製造方法は、（i)塩、キレ一ト剤、緩衝液及ぴ非イオン系界面活性剤からなる群より選択される 1以上の成分を含む水中の混合液を攪拌する工程：（i i)工程（i)で生じた混合液を加温下でィンキュベートする工程；（ii i)前記混合液を冷却する工程；及び（iv)カラジ一ナンを添加して攪拌する工程を含む。

上記工程（i)で、先ず力ラジーナン及び糖 (含有する場合）を除く全ての成分（例えば、'ゼラチン、塩、キレート剤、.緩衝液、非イオン系界面活性剤等）を含む水中の混合液を攪拌する。攪拌時の温度は、例えば 10〜30°C、好ましくは 15〜20°C とする。攪拌速度は、例えば 200〜1500rpm、-好ましくは 600〜800rpmとする。また攪拌時間は例えば 1〜6時間、好ましくは 1〜2時間とする。次いで、上記工程

(ii)で攪拌後の混合液をインキュベートする。インキュベーションにおいて、温度は例えば 35〜40°C、好ましくは 37°Cとする。また、ィンキュベーション時間は、例えば 5〜24時間、好ましくは 8〜12時間とする。インキュベーション後、工程

(iii)でこの混合液を 4°C〜30°C、好ましくは 4°C〜20°C、最も好ましくは 4°C〜 12°Cまで冷却し、次いで工程（iv)でカラジ一ナンを加えて攪拌する。工程（iv)の攪拌速度は、例えば 200〜1500rpm、好ましくは 600〜800rpmとし、攪拌時間は、例えば 1〜6時間、好ましくは 1〜2時間とする。以上に説明した方法により、本発明に係る、カジーナンを含有する抗体希釈用組成物を製造することができる。本発明の好ましい態様では、上記工程（i)の混合液はゼラチンを含む。その際、混合液中に含まれるゼラチンの濃度は 0. 01〜2重量％、好ましくは 0. 05〜：！重量。 /₀ となるように調整する。これによつて、本組成液の汎用性が向上する。

本発明の別の好ましい態様では、工程（iv)においてカラジ一ナンと共に糖を添加して攪拌する。添加する糖の量は、 0. 0017〜0. 83モル濃度、好ましくは 0. 005 〜0. 33モル濃度である。これにより、本発明の溶解速度が増し、混合液中での力ラジーナンの十分な溶解を達成することができる。

また、寒天及びカラジ一ナンの混合物を含有する本発明の抗体希釈用組成物は、上記工程（iv)においてカラジ一ナンと共に寒天を添加して攪拌することを除き、上記と同様に製造することができる。なお、その際に添加することができる成分量は以下の通りである：カラジ一ナン、 0. 001〜5 重量％、好ましくは 0. 005〜1 重量⁰ /₀ ;寒天、 0. 001〜3重量％、好ましくは、 0. 015〜1重量⁰ /₀；ゼラチン、 0. 005 〜2重量％、好ましくは 0. 01〜1重量％；糖、 0. 00017〜0. 83モル濃度、好ましくは 0. 00083〜0. 165モル濃度。

なお、本発明に係る抗体希釈用組成物を免疫学的分析で使用する際には、例えば、 D2W、蒸留水、滅菌水等の水を使用して適宜希釈したものを使用してもよい。使用時の抗体希釈用組成物における寒天又はカラジ一ナンの濃度は、例えば 0· 1〜0. 5重量％、好ましくは 0· 2〜0· 3重量％、特に好ましくは 0. 28重量％とする。

また、使用時の抗体希釈用組成物における塩の濃度は、例えば 50mM〜200mM、 · 好ましくは 100mM〜150mM、特に好ましくは 120mMとする。

さらに、使用時の抗体希釈用組成物におけるキレート剤の濃度は、例えば ImM 〜8mM、好ましくは 3raM〜5mM、特に好ましくは 4mMとする。

使用時の抗体希釈用組成物における緩衝液の濃度は、例えば 10mM〜 80mM、好ましくは 30mM〜60mM、特に好ましくは 50mMとする。

また、使用時の抗体希釈用組成物における非イオン系界面活性剤の濃度は、例えば 0. 01〜1容量％、好ましくは 0. 03〜0. 06容量％、特に好ましくは 0. 05容量％とする。

本発明に係る抗体希釈用組成物は、免疫学的分析に使用する抗体の希釈に使用する。本発明に係る抗体希釈用組成物を用いて希釈する抗体としては、特に限定されないが、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、 Fab、 F (ab' ) ₂)、抗血清及び腹水（モノクローナル抗体含有）等が挙げられる。また、標識抗体（例えば、蛍光標識抗体、酵素標識抗体）の希釈にも、本発明に係る抗体希釈用組成物を使用することができる。抗体希釈倍率としては、例えば、 2倍、 5倍、 10倍、 50倍、 100倍、 200倍、 500倍、 1000倍、 5000倍、 10000倍等が挙げられる。

このように希釈された抗体を使用することで、免疫学的分析の精度を上げることができる。ここで、免疫学的分析としては、例えば免疫染色、免疫細胞染色、免疫組織染色、酵素免疫測定（例えば、 ELISA、 EIA)、放射免疫測定、螢光抗体法及びフローサイトメトリ一が挙げられる。例えば、ウェスタンプロッティング終了後のメンプレンに対して、あるいは生物学的組織又は細胞の免疫学的分析において、本発明の抗体希釈用組成物で希釈した一次抗体及び/又は二次抗体を用いて発色又は免疫染色することで、非特異的な検出を抑制することができる。また、本発明に係る抗体希釈用組成物で希釈した抗体を用いて免疫学的に発色又は染色するときには、従来より使用されるブロッキング溶液を使用する必要がない。さらに、本発明に係る抗体希釈用組成物は、抗体保存に使用することもできる。さらに、本発明に係る抗体希釈用組成物は、抗体と共に免疫学的分析用キットとして提供することができる。当該キットでは、本発明に係る抗体希釈用組成物と抗体とは、同じ容器又は別々の容器に入れて提供することができる。またその際、抗体は上記例示の抗体を含む。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1 :本発明に係る、寒天を含有する抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッテイング

〔材料及び方法〕 '

1. 抗原及び抗体

抗原には、 1 X 10⁸個の C0S-1細胞 lysate (以下、「タンパク A」という）及び I X 10⁸個の MCF- 7細胞 lysate (以下、「タンパク B」という）を使用した。

抗体には、 Cell Signal ing 社製マウスモノクローナル抗 Phospho- Estrogen Receptor a (Serl l8)抗体（#2511)を使用した。

2. 本発明に係る寒天含有抗体希釈用組成物の作製

以下のようにして、本発明に係る、寒天を含有する抗体希釈用組成物を作製した。

先ず、 5M NaC1 240ml、 0. 5M EDTA (pH8) 80ml , 1M Tris (pH7. 4) 500ml, Tween 20 5ml及び特級粉末寒天（和光純薬工業株式会社製） 28gを混合し、 D2Wで合訐 1Lとした。

次いで、この混合液を 17°Cにおいて 700rpmの速度で 1時間攪拌した。攪拌後の混合液を、 37°Cで 10時間ィンキュベートし、使用時の 10倍濃度の抗体希釈用組成物を作製した。さらに、同組成物を D2Wにて 1倍濃度に薄め、抗体希釈用組成物とした。

3. 電気泳動、ウェスタンブロッテイング及ぴ発色

以下のようにして電気泳動、ウェスタンプロッティング及び発色を行った。 3-1. 電気泳動及ぴウェスタンブロッテイング

タンパク A 10 i l及ぴタンパク B 10 i lを、それぞれサンプルバッファー（20% グリセロール、 6%SDS、 10% 2-メルカプトエタノール） 10 / lと混合し、 10分間 95°Cでィンキュベートした。

冷却後、これら 2種のサンプル 20 μ 1を、 10%Tri s- Glycineポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製）にアプライして、電気泳動を 15mAで 90分間行った。電気泳動後、電気泳動を行ったゲルから Hybond- ECL Membrane (Amersham社製）へタンパク質をトランスファーした。トランスファ一は、膜の面積 X lmAで 60分間行った。

3-2. 従来方法を用いたウェスタンプロッティング

第 3-1 節のウェスタンブロッテイング後に得られた膜を、 TBS (0. l%Tween - 20 含有）で洗浄し、その後、発色に供した。

従来方法を用いた場合では、洗浄後の膜をブロッキングバッファー（ブロックエース：大日本住友製薬株式会社製）中に浸し、 37°Cで 1時間インキュベートした（ブロッキング）。 '

ブロッキング後、膜を TBS (0. l%Tween- 20含有）で洗浄し、続いて一次抗体反応を行った。一次抗体として、 Dako Cytomation社製 DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components (Catalog number： S3022) で 1000倍に希釈したマウスモノクローナル抗 Phospho- Estrogen Receptor a (Serll8)抗体を用いた。一次抗体反応は、 4°Cで 10時間のィンキュベーションにより行った。

一次抗体反応後、膜を TBS (0. l%Tween- 20含有）で洗浄し、二次抗体反応を行つた。二次抗体として、 Dako Cytomation社製匿 0 Antibody Diluent with Background Reducing Componentsで 1000倍希釈した HRP標識抗マウス IgG抗体 (Amersham 社製）を用いた。二次抗体反応は、 20°Cで 15分間のインキュベーションにより行つた。

二次抗体反応後、膜を TBS (0. l % Tween- 20 含有).で洗浄し、 Amersham 社製 ECL-plus キットを用いて、膜を発色させた。発色後、膜を Amersham 社製の Hyperfi lmECLに露光して解析した。

3-3. 本発明に係る抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッテイング

第 2節で作製した抗体希釈用組成物を使用する場合には、第 3-1節のウェスタンブロッテイング後に得られた膜を、 TBS (0. l%Tween-20含有）で洗浄した後、ブロッキングを行わずに、一次抗体反応を直接行った。一次抗体として、第 2節で作製した抗体希釈用組成'物で 1000 倍希釈したマウスモノクローナル抗

Phospho- Estrogen Receptor CK (Serll⁸)抗体を使用した。一次抗体反応は、 4°Cで

10時間のインキュベーションにより行った。一次抗体反応後、膜を TBS (0. l %T_Ween- 20含有）で洗浄し、二次抗体反応を行つた。二次抗体として、第 2節で作製した抗体希釈用組成物で 1000倍希釈した HRP 標識抗マウス IgG抗体（Amersham社製）を用いた。二次抗体反応は、 20°Cで 15 分間のィンキュベーションにより行った。

二次抗体反応後、膜を TBS (0. l % Tween- 20 含有）で洗浄し、 Amersham 社製 ECL-plus キットを用いて、膜を発色させた。発色後、膜を Amersham 社製の Hyperfi lmECLに露光して解析した。

〔結果〕 '

上記のように、従来方法で行ったウェスタンプロッティング（第 3-2節）の結果と本発明に係る抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッテイング（第 3 - 3節）の結果を図 1に示す。図 1において、 Mは分子量マーカー（kDa)を示す。また、矢印で示すバンドは、目的のタンパク質（Phospho— Estrogen Receptor (Serl l8) ) のバンドである。

図 1に示すように本 §明に係る抗体希釈用組成物を使用したウェスタンプロッティングでは、従来方法に比べてはるかに非特異的パンドの出現を抑えていた。実施例 2 :本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を用いたゥエスタンプロッティング

〔材料及び方法〕

1. 抗原及ぴ抗体

抗原には、上記タンパク質 A及ぴ8、並びに 1 X 10⁸個の THP-1細胞 lysate (以下、「タンパク質おとレ、う）を使用した。

抗体には、タンパク質 A及ぴ Bについては Cell Signal ing社製マウスモノク口一ナル抗 Phospho-Estrogen Receptor ひ（Serl l8)抗体（#2511)を使用し、タンパク質 Cについてはラビットポリクローナル抗 DDR1抗体（Santa - Cruz社 sc-532)を使用した。

2. 本発明に係るカラジ一ナン含有抗体希釈用組成物の作製'

以下のようにして、本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を作製した。

先ず、 200raM NaCl 11· 7g、 40mM EDTA (pH8. 0) 80ml, 500mM Tri s (pH7. 4) 500ml , 0. 05% Tween 20 0. 5ml、 0. 1%ゼラチン lgを混合し、 D2Wで総量 1Lとした。この混合液を 800rpmで 2時間、 16°Cで攪拌し、その後、 37°Cで 10時間インキュべートした。次いで、この混合液を室温まで冷やし、 0. 3 重量。 /₀のショ糖に続いて 0. 1 重量％のぇカラジ一ナン（和光純薬工業株式会社 035-09693) を添加して 800rpmで 2時間攪拌することにより、カラジーナンを含有する抗体希釈用組成物を完成させた。

3. 電気泳動、ウェスタンブロッテイング及ぴ免疫染色

図 2は、上記のようにして製造したカラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。

図 2A〜Bに示されるウェスタンプロッティングは、実施例 1に記載の方法に従つて行った。タンパク質 Cに関するウェスタンプロッティング（図 2B)については、一次抗体としてラビットポリクローナル抗 DDR1抗体を 150倍に希釈したものを用いた。

図 2Cは、カラジ一ナンを含む本発明の抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッティング結果と、カラジ一ナンを含まない本発明の抗体希釈用組成物を用いたウェスタンブロッティング結果との比較を示す。

図 2Cに示される実験において、電気泳動からトランスファーまでは実施例 1に記載される方法で行った。カラジーナン無含抗体希釈用組成物を用いる方法では、トランスファー後、カラジ一ナン無含抗体希釈用組成物でマウスモノクローナル抗ァクチン抗体（Santa - Cruz社 sc- 8432)を 200倍に希釈し、 4°Cで 10時間のィンキュベーシヨン後に洗浄し、カラジ一ナン無含抗体希釈用組成物で 1000倍に希釈した HRP標識抗マウス IgG抗体で二次抗体反応を行い、実施例 1に記載の方法で発色させた。カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を用いる方法では、カラジーナン無含抗体希釈用組成物に代えてカラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を用いる点を除いて、上記と同様の方法で行った。

図 2D. に示される実験では、実施例 1 に記載のサンプルバッファー 20 /i 1に

Human brain lysate (IMGENEX Corporation .#40141)、 Human Spinal Cord lysate (GENETX, Inc. #GTX15³⁷²)を 10 μ gずつ混合し、実施例 1に記載される方法で電気泳動からトランスファーまで行った。トランスファー後、従来の方法では、実施例 1に記載の方法で洗浄した後にブロッキングを行い、里吉病（この病気では脳や脊髄に対する抗体が血清中に産生される）の患者から取得した血清を

Dako社の Antibody Diluent with Background Deducing Components (#S3022)で 2 倍に希釈し、 4°Cで 10 時間インキュベーションした後に洗浄し、 Dako 社の Antibody Diluent with Background Deducing Componentsで 1000 {¾■に希釈した HRP標識抗ヒト IgG抗体で二次抗体反応を行い、実施例 1に記載の方法で発色させ解析した。一方、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を用いた方法では、上記トランスファーの後、プロッキングは行わずカラジ一ナン含有抗体希釈用組成物で患者血清を 2倍に希釈し、 4°Cで 10時間ィンキュベーションした後に洗浄し、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物で 1000倍に希釈した HRP標識抗ヒト IgG抗体によって二次抗体反応を行い、実施例 1に記載の方法で発色させ解析した。

[結果]

図 2A、 B及び Dに示すように、本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を使用したウェスタンプロッティングでは、従来方法に比べてはるかに非特異的バンドの出現を抑えていた。また図 2Cから、本発明に係る抗体希釈用組成物の上記効果が、カラジ一ナンの存在と有意に関連していることがわかる。実施例 3 :本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を使用した肺組織の免疫組織染色

器質化肺炎の肺組織を、標準的なプロトコールに従って、ホルマリン固定後に脱水処理を行い、その後パラフィンにて包埋し、 4 の厚さでプレパラートに薄切し、それをキシレンを用いて脱パラフィンを行った。そのプレパラートを 2% 0₂メチルエーテルで 10分間ィンキュベートし脱ペルォキシダーゼ反応を行った。その後、 PBSで洗浄した。

従来の方法では、洗浄後のプレパラートを 4%BSA及ぴ 1%馬血清入りの PBSで

10 分間ブロッキング反応を行い、その後 Dako 社の Antibody Diluent with

Background Deducing Componentsで 150倍に希釈したラビッ卜ポジクローナノレ抗

DDR1抗体（Santa- Cruz社 S C- 532) と共に 4°Cで 10時間インキュベーションして一次抗体反応を行った。その後、 PBSで洗浄し Dako社の Antibody Diluent with

Background Deducing Componentsで 1000倍に希釈したビォチン標識抗ラビット IgG抗体（VECTOR社 BA- 1000)で二次抗体反応を行い、 PBSで洗浄した後、 VECTOR 社の VECTASTAIN ABC Kit Standard (PK6100)で三次反応を行い 3， 3' -ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライドで発色させた。

本発明に係る、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用する方法では、洗浄後プロッキングは行わず、カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物で 150倍に希釈したラビットポリクロ一ナル抗 DDR1抗体（Santa - Cruz社 sc - 532) と共に 4°Cで 10 時間インキュベーションして一次抗体反応を行った。その後、 PBS で洗浄し、力ラジーナン含有抗体希釈用組成物で 1000 倍に希釈したビォチン標識抗ラビット IgG抗体（VECTOR社 BA- 1000)で二次抗体反応を行い、 PBSで洗浄した後、 VECTOR 社の VECTASTAIN ABC Kit Standard (PK6100)で三次反応を行い 3, 3 -ジァミノベンジジンテトラヒドロクロライドで発色させた。

[結果]

上記のように、従来方法で行った免疫組織染色の結果と本発明に係るカラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を用いた免疫組織染色の結果を図 3に示す（A :従来方法、 B :カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用、 C :一次抗体にラビット IgGを使用した negative control (カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用）、 D :へマトキシリンェォジン染色）。図 3において、茶色に染まっている部分が陽性である。図 3からわかるように、通常の希釈液を使用すると全体が茶色に染まって判断し辛いのに対し、本発明の抗体希釈用組成物を用いると陽性部分が非常にクリァであることがわかる。

実施例 4 :本発明に係る、カラジ一ナンを含有する抗体希釈用組成物を使用した腎組織の免疫組織染色

急性進行性糸球体腎炎の腎組織について、一次抗体にャギポリクローナル抗 TRAILレセプター 3抗体（R&DSystem社、 AF630)、二次抗体にビォチン標識抗ャギ IgG抗体（VECTOR社 BA- 5000)を用いて実施例 3と同様にして免疫組織染色を行つた。

[結果] '

従来方法で行つた免疫組織染色の結果と本発明に係るカラジーナン含有抗体希釈用組成物を用いた免疫組織染色の結果を図 4に示す（A :従来方法、 B :カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用、 C :一次抗体にャギ I_gG を使用した negative control (カラジ一ナン含有抗体希釈用組成物を使用）、 D :へマトキシリンェォジン染色）。図 4において、茶色に染まっている部分が陽性である。図 4からわかるように、通常の希釈液を使用する方法に比べ、本発明の抗体希釈用組成物を用いた方法により、陽性部が顕著にクリァになることが分かる。産業上の利用可能性

本発明に係る抗体希釈用組成物によれば、非特異的な検出を抑制し、それによつて免疫学的分析の精度を上げることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1. 寒天、カラジ一ナン又はそれらの混合物を含有することを特徴とする、免疫分析の精度を向上させるための及び/又は免疫分析における非特異的な検出を抑制するための抗体希釈用組成物。

2. 上記カラジ一ナンがえカラジ一ナンであることを特徴とする、請求項 1 記載の抗体希釈用組成物。

3. さらに糖及びゼラチンを含有することを特徴とする、請求項 1記載の抗体希釈用組成物。

4. 塩、キレート剤、緩衝液及び非イオン系界面活性剤から成る群より選択される 1以上の成分を含有することを特徴とする、請求項 1記載の抗体希釈用組成物。.

5. 上記寒天の濃度が 0.1〜5重量％であることを特徴とする、請求項 1記載の抗体希釈用組成物。

6. 上記寒天の濃度が 0.2〜3重量％であることを特徴とする、請求項 1記載の抗体希釈用組成物。

7. 上記カラジーナンの濃度が 0.01〜5重量％でぁることを特徴とする、請求項 1 ^載の抗体希釈用組成物。

8. 上記カラジーナンの濃度が 0.03〜2重量％でぁることを特徴とする、請求項 1記載の抗体希釈用組成物。

9. 上記糖がショ糖であることを特徴とする、請求項 3記載の抗体希釈用組成物。

1 0. 上記糖の濃度が 0.0017〜0.83モル濃度であることを特徴とする、請求項 3記載の抗体希釈用組成物。

1 1. 上記ゼラチンの濃度が0.01〜2重量％でぁることを特徴とする、請求項 3記載の抗体希釈用組成物。

1 2. 上記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 3. 上記塩の濃度が 10mM〜2Mであることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 4 . 上記キレート剤がエチレンジァミン四酢酸であることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 5 . 上記キレート剤の濃度が lmM〜100raMであることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 6 . 上記緩衝液がトリスであることを特徴とする、請求項 4'記載の抗体希釈用組成物。

1 7 . 上記緩衝液の濃度が 10mM~ lMであることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 8 . 上記非イオン系界面活性剤が Tween 20又は Triton X- 100であることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

1 9 . 上記非イオン系界面活性剤の濃度が 0. 01〜1容量％であることを特徴とする、請求項 4記載の抗体希釈用組成物。

2 0 . 請求項 1〜19のいずれか 1項記載の抗体希釈用組成物を使用することを特徴とする免疫学的分析,方法。

2 1 . 上記免疫学的分析がウェスタンプロッティング又は免疫染色であることを特徴とする、請求項 20記載の方法。

2 2 . 請求項 1〜19のいずれか 1項記載の抗体希釈用組成物と抗体とを含む免疫学的分析用キット。

2 3 . 上記免疫学的分析がウェスタンブロッテイング又は免疫染色であることを特徴とする、請求項 22記載の免疫学的分析用キット。

2 4 . 以下の工程：

(i)塩、キレート剤、緩衝液及び非イオン系界面活性剤からなる群より選択される 1以上の成分を含む水中の混合液を攪拌する工程；

(i i)工程（i)で生じた混合液を加温下でインキュベートする工程；

(ii i)前記混合液を冷却する工程；及び

(iv)カラジ一ナンを添加して攪拌する工程；

を含む、抗体希釈用組成物の製造方法。

2 5 . 上記工程（i)の水中の混合液がさらにゼラチンを含むことを特徴とする請求項 24記載の方法。

2 6 . 上記工程（ii)において、インキュベーションの温度を 35°C〜40°Cとすることを特徴とする、請求項 24記載の方法。

2 7 . 上記工程（iii)において、混合液を 4° (：〜 30°Cに冷却することを特徴とする、請求項 ²4記載の方法。 ·

2 8 . 上記工程（iv)において、カラジ一ナンと共に糖を添加して攪拌することを特徴とする、請求項 24に記載の方法。