WO2007122278A2

WO2007122278A2 - Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto

Info

Publication number: WO2007122278A2
Application number: PCT/ES2007/000252
Authority: WO
Inventors: Primitivo Caballero Murillo; Trevor Williams; Delia MUÑOZ LABIANO; Rosa MURILLO PÉREZ; Rodrigo Lasa Covarrubias
Original assignee: Universidad Pública de Navarra
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2007-11-01
Also published as: ES2301352B1; WO2007122278A3; ES2301352A1

Abstract

Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. La invención se refiere a seis nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua denominados AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 y su uso, preferentemente como mezcla de dos o más genotipos, dentro de composiciones insecticidas contra plagas producidas por Spodoptera exigua. Una forma preferida de realización de la invención es añadir a estas composiciones abrillantadores ópticos, potenciando así su capacidad insecticida. La invención describe también un método de producción de poliedros del virus inoculando larvas de Spodoptera exigua, preferiblemente tratadas previamente con un análogo de la hormona juvenil de este lepidóptero. Las composiciones insecticidas de la invención representan una tecnología limpia y segura, al no dejar residuos tóxicos sobre las cosechas ni ser tóxicas para el hombre ni otros animales, incluidos parasitoides y depredadores de plagas.

Description

NUEVOS GENOTIPOS DEL NUCLEOPOLIEDROV1RUS DE SPODOPTERA EXIGUA Y USO DE LOS MISMOS EN EL CONTROL DE LAS PLAGAS PRODUCIDAS POR ESTE INSECTO

Ámbito de la invención

La invención se adscribe al sector técnico de los plaguicidas biológicos de aplicación al control de plagas provocadas por las larvas del lepidóptero Spodoptera exigua, mediante el uso de nuevos genotipos de nucleopoliedrovirus.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Problemática fitosanitaria en los invernaderos: control de Spodoptera exigua

Alguno de los principales cultivos producidos en invernadero, por producción y valor de la misma, son pimiento, tomate, sandía, melón, calabacín, pepino, judía y berenjena. La problemática fitosanitaria asociada a estos cultivos es bastante amplia concurriendo en ellos plagas, incluyendo larvas del lepidóptero Spodoptera exigua (Moreno, R. et al. 1992; Belda, J. et al. 1994). El control de S. exigua en los invernaderos se realiza por medio de la aplicación de plaguicidas químicos. Sin embargo, la utilización sistemática de estos insecticidas no funciona con la eficacia esperada a causa de graves problemas de resistencias en esta plaga (Cuadrado Gómez LM. y Vifiuela Sandoval, E. 1998). Adicionalmente, el control químico de S. exigua conlleva problemas relacionados con los niveles de residuos de plaguicidas que deben ser mantenidos por debajo de los límites máximos de residuos, siguiendo las regulaciones establecidas para frutas y hortalizas en la Unión Europea

(http://europa.eu.int/comm/food/rVo/specialreports/pesticides_index_en.htm).

Los Baculovirus como insecticidas biológicos

La familia Baculoviridae agrupa a virus de DNA de doble cadena cuyos viriones están característicamente incluidos en una matriz cristalina de naturaleza proteica, de 3 a 15 μm de diámetro, en la que puede estar incluido un alto número de partículas virales y a la que se hace referencia en la presente memoria con el nombre de cuerpo de oclusión (abreviados "OB", del inglés "occlusion body") o también, debido a su forma geométrica, con el nombre de poliedro. A efectos también de la presente memoria, el término virión se define como la partícula viral formada por una o más moléculas circulares de ADN de doble hebra empaquetadas individualmente en una cápsida proteica y envueltas por una membrana lipoproteica de estructura laminar. La familia consta de los géneros Nucleopoliedrovirus (NPV) y Granulovirus (GV); la mayoría de los cuales han sido aislados de lepidópteros (Caballero, P. et al. 2001). Los virus de esta familia se caracterizan por tener un estrecho espectro de huéspedes y una elevada patogenicidad y virulencia. El poliedro que los caracteriza los hace estables durante largos periodos (Jaques, R. P. 1985) y facilita su aplicación mediante pulverizaciones acuosas convencionales. Además, el uso insecticida de los baculovirus, debido a su estrecho espectro de huéspedes (Groner, A. 1986) y a la ausencia de otros posibles efectos perjudiciales, no entraña riesgos ambientales mayores.

El estado susceptible del lepidóptero es el de la larva que es infectada al alimentarse de un substrato vegetal contaminado con poliedros del virus. Al final del proceso infeccioso, que se completa entre tres y ocho días, la larva muere y el tegumento se degrada liberando grandes cantidades de poliedros que contaminan las plantas, los cuales constituyen el inoculo que sirve para dar origen al proceso de infección en otras larvas susceptibles.

La utilidad y efectividad de los baculovirus para el control de las plagas han sido ampliamente demostradas (Moscardi, F. 1999). Se sabe que, en general, la actividad insecticida del virus (medida en términos de la dosis letal media, DL₅o) cambia en función del estadio larvario, siendo el virus más activo, en general, para las larvas más jóvenes (las de los primeros estadios) y disminuyendo su actividad (aumenta el valor de la DL₅₀) a medida que aumenta el tamaño de la larva. Actualmente hay comercializados más de treinta bioinsecticidas basados en baculovirus contra algunas de las plagas más importantes en el ámbito mundial entre las que se incluye S. exigua. Los bioinsecticidas basados en baculovirus, dadas sus características, son agentes de control ideales para su inclusión en programas de control integrado y su acción insecticida es especialmente útil: (i) contra aquellas especies fitófagas que han desarrollado resistencia múltiple o cruzada a los insecticidas químicos de síntesis y (ii) en los programas de control donde se incluyen agentes biológicos de control susceptibles a la acción de los insecticidas químicos (Hunter-Fujita et al, 1998). EI nucleopoliedrovirus de S. exigua: selección de una materia activa adecuada

Con frecuencia se encuentra que los distintos aislados de un mismo baculovirus difieren significativamente en sus propiedades insecticidas para un mismo insecto. Por tanto, la selección de la variante más efectiva para una determinada especie fitófaga es un importante elemento a la hora de desarrollar un bioinsecticida. El nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua (al que se hace referencia también en la presente memoria mediante sus correspondientes siglas en ingles SeMNPV) es un virus de la familia Baculoviradae, capaz de infectar y matar larvas del lepidóptero Spodoptera exigua, que se ha aislado en diferentes regiones del mundo incluyendo Norte América, Tailandia, Países Bajos, Taiwán, India, Egipto y Japón (Hará K. et al. 1995). Este virus también se ha aislado en España, donde provoca epizootias naturales en poblaciones de S. exigua en girasol y en los cultivos hortícolas de los invernaderos de Almería (Caballero P. et al. 1992). La eficiencia de preparados simples de algunos aislados de SeMNPV ha resultado igual o mejor que el grado de control logrado por aplicación de insecticidas químicos de síntesis (Kolodny-Hirsch, D. M., et al. 1997).

Un aislado del SeMNPV originario de Florida, USA, se ha desarrollado como un producto comercial registrado bajo el nombre de Spod-X^® en Holanda, Estados Unidos y Tailandia (Smits, P. H. y Vlak, J. M. 1994). El producto se utiliza en los invernaderos de los Países Bajos en cultivos de plantas ornamentales. Actualmente el virus es comercializado por la empresa Certis USA

(http://vvrww.certisusa.com/products/viruses.html). Sin embargo, este producto presenta importantes problemas relacionados con su efectividad: la calidad biológica del producto está afectada por la presencia de genotipos autoparásitos que reducen la capacidad insecticida del virus (Muñoz, D. et al., 1998). Los genotipos autoparásitos se caracterizan por haber perdido genes esenciales para su replicación y dependen de manera parasítica de otros genotipos presentes en la cepa silvestre para producir las proteínas necesarias durante su replicación (Muñoz, D. et al., 2000).

Hoy en día se pueden identificar las diferentes variantes genotípicas presentes en poblaciones naturales de baculovirus mediante técnicas moleculares basadas en el uso de endonucleasas de restricción y secuenciación del genoma o de fragmentos del mismo. Se ha reconocido la presencia de diversas variantes genotípicas con diferentes actividades insecticidas en aislados de SeMNPV colectadas en el sur de España (Muñoz, D. et al., 1999) Formulación de los bioinsecticidas basados en baculovirus

Los bioinsecticidas basados en baculovirus, a diferencia de los plaguicidas químicos, actúan exclusivamente por ingestión y su persistencia sobre el cultivo es mucho menor. La mayoría de los baculovirus actualmente comercializados como bioinsecticidas utilizan el mismo tipo de formulación que los insecticidas químicos.

Los abrillantadores ópticos son un grupo de compuestos químicos que, por su capacidad de absorber la radiación ultravioleta y emitir luz en la región azul del espectro visible, son utilizados comúnmente para dar mayor brillo a pinturas, fibras, etc.. Los más conocidos son los derivados del estilbeno. Se ha demostrado la capacidad que tienen estas sustancias de potenciar la actividad insecticida del baculovirus (Patente de EE.UU. US 5124149) debido a la interacción del blanqueador con la membrana peritrófica del intestino del insecto (Wang, P. y Granados, R. R. 2000). En S. exigua, la actividad sinérgica de la sustancia aumenta con la edad del huésped tratado de forma que los valores de las concentraciones letales requeridas para el control de larvas de los últimos estadios puede reducirse a valores similares a los que se requieren para el control de larvas de los primeros estadios (Murillo, R. et al. 2003).

Producción de SeMNPV

La producción in vivo sobre huéspedes permisibles es la metodología actualmente utilizada para la producción de todos los bioinsecticidas basados en baculovirus disponibles en el mercado incluido el SeMNPV. Básicamente consiste en alimentar larvas con dieta semisintética que es superficialmente contaminada con una determinada suspensión acuosa del virus que se quiere multiplicar. Algunos de los aspectos esenciales de esta metodología, como por ejemplo las dietas para insectos o los métodos de cría masiva, deben ser específicamente desarrollados para cada sistema huésped- patógeno. El método de cría masiva de S. exigua ha sido optimizado para la producción de SeMNPV en Tailandia (Cherry, A. J. et al. 1997). También se ha desarrollado un sistema de producción de baculovirus el cual utiliza una alta densidad de larvas que aun no ha sido probado para la producción de SeMNPV (Patente de EE.UU. US5351643). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a seis nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua denominados AlPstÍV10935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923₅ y AlPstM0657, cuyo depósito se ha efectuado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Instituí Pasteur, París, Francia. Estos genotipos se diferencian entre sí, y con respecto a otros descritos en la literatura, por la secuencia de nucleótidos localizados entre las 10.637 y 11.744 pares de bases del genoma viral, tomando como referencia la secuencia del genoma cuyo número de GeneBank es NC002169 y que corresponde a un genotipo procedente de un aislado de Estados Unidos. Una diferenciación rápida y precisa de cada uno de estos genotipos puede obtenerse empleando una combinación de la técnica de la PCR y la digestión con endonucleasas de restricción de los fragmentos amplificados. Cada genotipo posee una actividad insecticida característica para las larvas de Spodoptera exigua, la cual se determina como la relación estadística entre el número de partículas del virus (poliedros) y la mortalidad inducida en larvas tratadas y se expresa como dosis letal media (DL₅₀). La mezcla de dos o más genotipos tiene una actividad insecticida significativamente mayor que la de los genotipos individuales. Mediante la adición de abrillantadores ópticos, como por ejemplo Leucophor, se puede incrementar la actividad insecticida del virus entre 20 y 1000 veces. Los poliedros, en los cuales radica la actividad insecticida, pueden producirse de forma masiva in vivo, inoculando larvas de Spodoptera exigua con dosis elevadas. El tratamiento de las larvas con un análogo de la hormona juvenil, previamente a su inoculación con el virus, permite aumentar la producción de poliedros por larva entre 3 y 8 veces. Los poliedros extraídos de las larvas, pulverizados como suspensiones acuosas, protegen de una forma efectiva a los cultivos de las plagas ocasionadas por larvas de Spodoptera exigua, incluso cuando estas han desarrollado resistencias a los insecticidas químicos. Este producto representa una tecnología limpia y segura ya que no deja residuos tóxicos sobre las cosechas y no es tóxico para el hombre ni otros animales, incluidos los enemigos los parasitoides y depredadores de las plagas.

Un objeto de la presente invención es un nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua que pertenece a un genotipo seleccionado entre AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, MlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657, preferentemente en forma de poliedro. Dicho nucleopoliedrovirus se caracteriza por comprender una secuencia de ADN seleccionada entre: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO.9. Otro objeto de la presente invención son composiciones plaguicidas que contengan, en forma de poliedros, alguno de los nucleopoliedrovirus AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657, o combinaciones de los mismos, con cualquier otro excipiente o vehículo apropiado en el sector agrícola que lo haga apto para ser aplicado según cualquiera de los métodos habituales en agricultura: pulverización a nivel de tierra, pulverización aérea, en disolución, en forma de polvo, por cualquier tipo de sistema de riego o irrigación, en forma sólida, asociado a abonos, fertilizantes, etc.

Son también objeto de la presente invención las composiciones plaguicidas definidas anteriormente que comprendan un agente potenciador del efecto patógeno del nucleopoliedrovirus sobre el lepidóptero. Especialmente útiles se han mostrado las composiciones plaguicidas en que dicho agente potenciador es un abrillantador óptico, particularmente un derivado del estilbeno y, en concreto, composiciones plaguicidas que contengan Leucophor AP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1: Aislamiento de los genotipos del nucleopoliedrovirus de S. exigua AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 de muestras de suelo o insectos

Los genotipos del SeMNPV AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 han sido aislados.de muestras de suelo incorporadas a dieta artificial [Richards y Christian , 1999]. Aproximadamente 10 g de suelo se añaden en 90 mi de dieta artificial (7,2% germen de trigo, 3,3% caseína, 2,9% azúcar comercial, 1,4% levadura de cerveza, 0,94% mezcla de sales de Wesson, 0,15% ácido sórbico, 0,09% colesterol, 0,09% nipagina, 1,9% agar industrial y 82,8% agua destilada). De este preparado se colocan pequeñas pastillas (5x5x5 mm) en viales de 1 mi y se infestan con una larva de primer o segundo estadio. Para cada muestra se tratan un total de 50 larvas y como control un grupo de larvas alimentadas con dieta a la que se incorporó una muestra de suelo previamente esterilizado. Las larvas así tratadas se mantienen en condiciones de temperatura constante de 26 ± 2⁰C y oscuridad. Las larvas que mueren en los días siguientes se examinan al microscopio óptico en contraste de fases para determinar el agente causante de la muerte. En las larvas muertas por nucleopoliedrovirus se purifican los poliedros triturando los cadáveres en agua bidestilada que contiene dodecilsulfato sódico al 0,01% y filtrando la suspensión resultante a través de un filtro de muselina. Los poliedros se precipitan por centrifugación a 6000 g durante 10 min. Posteriormente se realiza un lavado con agua que contiene cloruro sódico al 0,01% y se precipitan por centrifugación en las mismas condiciones. Para conservar los poliedros se resuspenden finalmente en agua estéril. Debido a sus características los poliedros pueden ser almacenados en refrigeración durante largos periodos de tiempo en agua o agua con un 50% de glicerol a -80° C o por liofilización. En suspensiones acuosas almacenadas a 4⁰C también mantienen su capacidad patogénica durante largos periodos de tiempo, mientras que a temperatura ambiente pierden parte de esta capacidad después de ocho o diez meses.

Ejemplo 2: Caracterización de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657

Para producir una mayor cantidad de poliedros de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 es necesario infectar larvas sanas de S. exigua alimentándolas con dieta artificial contaminada o también en distintas líneas celulares de S. exigua cultivadas in vitro, en medio de cultivo (Hará K. et al., 1994).

Para poder diferenciar genéticamente los seis genotipos se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica (Muñoz, D. et al., 2001). Un método preciso, reproducible y ampliamente utilizado es el análisis del ADN genómico, aprovechando la existencia de regiones que muestran una alta variabilidad estructural entre distintos aislados geográficos (Li et al., 2005) o incluso entre genotipos purificados de un mismo aislado (García-Maruniak et al, 1996), como las regiones homologas (hr), que se localizan en número variable a lo largo del genoma. En el genoma del SeMNPV existen 6 hrs, de las que la denominada hr\, que actúa como origen de replicación del virus in vitro, es la que muestra mayor variabilidad entre los genotipos (Muñoz, D. et al, 1999). Esta zona hipervariable del genoma del virus SeMNPV está localizada en el fragmento de restricción PM-M (Fig. 1) y es útil para diferenciar variantes genotípicas en distintos aislados del SeMNPV. La digestión del ADN de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 con las endonucleasas de restricción BgM y Pstl produce un perfil de restricción característico y único para cada genotipo (Fig 2). Por ejemplo, los fragmentos polimórficos generados por la endonucleasa de restricción BgIIl (BgIU-A, BgDl-H, BgHl-J o K) o por PM (Pstl-M), pueden utilizarse como marcadores para diferenciar entre dos o más genotipos.

Una diferenciación más precisa de cada genotipo (AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657) se obtiene empleando una combinación de la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) junto con la digestión de los fragmentos amplificados por PCR con endonucleasas de restricción (Restriction Endonuclease, REN). El empleo de dos cebadores genéricos para todos estos genotipos (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) permite amplificar una zona hipervariable del genoma comprendida en el fragmento de restricción PstIM (Tabla 1).

La digestión de los fragmentos amplificados por PCR con la endonucleasa de restricción BgIU produce perfiles de restricción únicos para cada uno de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 (Tabla 2; Fig. 3). De esta manera el genotipo AlPstM0935 se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,2 kb que al ser digerido por BgILl genera tres fragmentos de 0,55; 0,4 y 0,25 kb. El genotipo AlPstM1400 se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,7 kb que al ser digerido por BgHI genera tres fragmentos de 0,25; 0,4 y 1,05 kb. El genotipo AlPstM1033 se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,3 kb que al ser digerido por BgIII genera dos fragmentos de 0,4 y 0,9 kb. El genotipo AlPstM1449 se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,6 kb que al ser digerido por BgHI genera cuatro fragmentos de 0,2; 0,3, 0,4 y 0,7 kb. El genotipo AlPstM0923 se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,2 kb que no produce fragmentos al ser digerido por BgHL. El genotipo AlPstM0657 se caracteriza por dar un producto de PCR de 0,9 kb que al ser digerido por BgRl genera dos fragmentos de 0,4 y 0,5 pb.

Tabla 2

Genotipo Fragmentos de restricción generados por BgRl (kb)

AlPstM0935 0,55; 0,4; 0,25

AlPstM1400 0,25; 0,4; 1,05

AlPstM1033 0,4; 0,9

AlPstM1449 0,2; 0,3; 0,4; 0,8

AlPstM0923 1,2

AlPstM0657 0,4; 0,5

La secuencia de nucleótidos de la región variable entre genotipos es el método más preciso para la caracterización e identificación de los genotipos. El diseño de un nuevo cebador interno situado en la región conservada para todos los genotipos del extremo 5", cuya secuencia viene representada por SEQ ID NO :3, permite obtener la secuencia de nucleótidos completa correspondiente a la zona variable entre los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657

Genotipo AlPstM0935: Se llevaron a cabo nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO: 4).

Genotipo AlPstM1400: Se llevaron a cabo nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO:5). Genotipo AlPstM1033: Se llevaron a cabo nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO: 6).

Genotipo AlPstM1449: Se llevaron a cabo catorce reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO: 7).

Genotipo AlPstM0923: Se llevaron a cabo catorce reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO: 8).

Genotipo AIPstM0657: Se llevaron a cabo ocho reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^R Big Dye™ Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos es el PEN06 (SEQ ID NO: 9). Ejemplo 3: Actividad insecticida de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 y distintas mezclas de estos genotipos

La actividad insecticida de los genotipos individuales o distintas mezclas de genotipos se determina en términos de patogenicidad y tiempo de matar. La patogenicidad de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449_s AlPstM0923, y AlPstM0657 y las mezclas AIPstM-Ml (AlPstM1400:AlPstM1033 en la proporción 1:1), AlPstM-M2 (AlPstM0935:AlPstM1400:AlPstM1033 en la proporción 1:1:1), y AlPstM-M3 (AlPstM0935:AlPstM1033 en la proporción 1:1) se expresa como la dosis letal media (DL₅₀). Este valor se determina mediante bioensayo (Hughes y Wood, 1981) sobre larvas de S. exigua del segundo estadio. Las larvas se inoculan por ingestión de la cantidad de poliedros correspondiente para obtener cada una de las siguientes concentraciones: 7,5OxIO⁵; 2,5OxIO⁵; 8,18xlO⁴; 2,72xlO⁴; 9,O3xlO³ poliedros/ml, que corresponden a las dosis de 3, 9, 27, 81, y 243 poliedros/larva (esta relación, el número de poliedros por larva, se abreviará en lo sucesivo como OB/larva). Como testigo se incluye un grupo de larvas tratadas con la misma solución sin poliedros. Las larvas tratadas se mantienen a 26 ⁰C y cada 12 horas se registra el número de larvas muertas por infección de poliedros (Tabla 3).

Tabla 3

Dosis Larvas Larvas

Tratamiento (OB/larva) tratadas muertas

AlPstM0935

3 119 10 9 119 28

27 119 52 81 120 65

243 120 109

AlPstM1400

3 120 25 9 116 31

27 120 59

81 118 81

243 118 110

AlPstM1033

3 120 20 9 119 32

27 117 55

81 119 82

243 118 105

AlPstM1449

3 116 20 9 119 34

27 120 59 81 120 81

243 118 109

AIPstM-Ml

3 120 23 9 120 39

27 120 57 81 120 81

243 118 115

AlPstM-M2

3 118 12 9 120 21

27 120 44

81 120 66

243 118 112

AlPstM-M3

3 117 30 9 118 41

27 118 60

81 120 84

243 120 115

Las mezclas de genotipos corresponden a las siguientes combinaciones : AlPStM-Ml= AlPstM1400:AlPstM1033 AlPstM-M2= AlPstM0935:AlPstM1400:AlPstM1033 AlPstM-M3= AlPstM0935: AlPstM1033. Los datos dosis-mortalidad son analizados mediante una regresión probit entre el logaritmo de la dosis y la mortalidad que nos permite obtener los valores de la DL₁₀ DL₅o para los genotipos individuales y las mezclas de varias combinaciones de los mismos (Tabla 4). La patogenicidad de las mezclas AlPstM-M2 y AlPstM-M3 es mayor que la de los genotipos individules.

El tiempo de matar de los genotipos AlPstM0935, AIPstMHOO, AlPstM1033, AlPstM1449 y las mezclas AIPstM-Ml, AlPstM-M2, AlPstM-M3 se muestra como el porcentaje de mortalidad medido en dos momentos distintos a lo largo de la infección, porcentajes que no son acumulativos, sino que corresponden a las muertes de larvas registradas a las 72 horas de haber sido tratadas y en el período comprendido entre las 72 y las 96 horas después de haber sido tratadas (Tabla 5).

AlPstM-M2= AlPstM0935:AlPstM1400:AlPstM1033 AlPstM-M3= AlPstM0935: AlPstM1033.

El pico de mortalidad se registra a las 72 horas, es decir, el período comprendido entre las 60 horas postinfección y las 72 horas postinfección, es el período en el que se registra mayor porcentaje de larvas muertas.

Ejemplo 4: Efecto del abrillantador óptico Leucophor AP sobre la actividad insecticida del nucleopoliedrovirus de S. exigua

Tal como se comentó anteriormente, la actividad insecticida del virus (medida en términos de la dosis letal media, DL₅₀) cambia en función del estadio larvario. En general, puede decirse que el virus es más activo (presenta un menor valor de DL₅₀) para las larvas más jóvenes (de los primeros estadios) y disminuye su actividad (aumenta el valor de la DL₅₀) a medida que aumenta el tamaño de la larva. Interesa, sin embargo, que el virus pueda matar a las larvas a la dosis más baja posible, para que sea necesario aplicar menos producto y el correspondiente insecticida resulte más barato. Por ello, se buscó un producto que pudiera mostrar una actividad sinérgica con el virus.

El Leucophor AP aumenta la actividad insecticida del nucleopoliedrovirus de S. exigua cuando se suministra mezclado al 0,1 o al 1% con los poliedros de diferentes genotipos de SeMNPV. Dicha mortalidad se determinó mediante el método de bioensayo por contaminación de superficie de dieta (Muñoz, D. et al., 2001). Varias suspensiones del nucleopoliedrovirus, en agua destilada o soluciones acuosas de Leucophor AP (suministrado por Clariant Ibérica, Barcelona, España) al 1% se aplicaron superficialmente sobre la dieta previamente dispensada en los pocilios (400 mm ) de una caja de petri compartimentalizada, para obtener las siguientes concentraciones de virus: 273, 91, 18, 9, 2 y 0 poliedros por mm² de dieta. En cada uno de estos pocilios se coloca una larva de & exigua y se mantienen a 25⁰C en oscuridad. La mortalidad de las larvas debida a virus se registra a los 7 días (Tabla 6). Se muestran los resultados correspondientes a larvas del cuarto estadio, en las que el efecto sinérgico del abrillantador es más fácil de apreciar debido a que las dosis letales medias de SeMNPV requeridas en ausencia de compuesto con efecto sinérgico (aproximadamente 100 OB/larva) son más elevadas que en estadios más tempranos como por ejemplo el segundo (al que le corresponden un valor de DL₅₀ en ausencia de compuesto con efecto sinérgico de aproximadamente 10 OB/larva), siendo la disminución de la DL₅₀ más fácil de apreciar cuando se parte de valores más elevados. Los resultados mostraron un importantísimo incremento de la mortalidad causada por el virus.

En un segundo ensayo se utilizaron concentraciones más bajas del nucleopoliedro virus tanto en suspensiones acuosas de Leucophor AP al 1% (2,73; 0,91; 0,18; 0,05 y 0,01 poliedros/mm² de dieta) como en las suspensiones de Leucophor AP 0,1% (27,3; 9,1;

1,8; 0,5 y 0,1 poliedros/mm² de dieta), de manera que se pudiera establecer la concentración requerida (número de OBs por unidad de superficie o por unidad de volumen) para matar el 50% de las larvas tratadas en cada caso (CL₅o; ver Tabla 7). Los resultados muestran claramente que el Leucophor AP a una concentración del 0,1% produce un incremento de la actividad del virus de más de 20 veces y a la concentración del 1% dicho incremento llega a ser de más de 1000 veces.

Ejemplo 5: Producción masiva del nucleopoliedrovirus de S. exigua

Para determinar la producción masiva de la mezcla del nucleopoliedrovirus de S. exigua AlPstM-M2 se utiliza como criterio el número de OBs que producen las larvas letalmente infectadas. Para llevar a cabo este procedimiento, se considera que el estadio larvario de S. exigua más adecuado para la producción masiva de virus es el último posible (el cual, si el desarrollo larvario se produce de forma natural, sería el quinto) pues es aquel en el que el tamaño del huésped es mayor, por lo que también lo es el número de células en el que puede multiplicarse el virus y mayor es la cantidad de OBs que se obtienen por huésped infectado, pero también podrían utilizarse larvas de otros estadios. En cuanto a la cantidad de virus suministrados por larva, se prefiere utilizar entre 10⁶ y 10⁷ OB/larva, para asegurar que haya una mortalidad del 100% de las larvas tratadas. La temperatura adecuada para mantener las larvas es de 26+2⁰C.

Larvas recién mudadas al último estadio (quinto estadio) son individualmente alimentadas con dieta artificial sólida (8 mm ) (preparada tal como se describe en Muñoz,D. et al, 2001), contaminada con 10 μl de una suspensión acuosa de 10⁸ OBs/ml del virus. Se trataron un total de 30 larvas por repetición y se hicieron tres repeticiones de la misma prueba. Las larvas tratadas se mantuvieron a 25⁰C hasta que se produjo su muerte (aproximadamente a los 6 días). Los poliedros producidos por cada larva muerta se extrajeron y se purificaron según se ha indicado anteriormente (ver ejemplo 1). La suspensión final de OBs se tituló al microscopio óptico en contraste de fases haciendo uso de un hemocitómetro (cámara Neubauer). Los resultados indican que la producción de poliedros por larva oscila entre 0,66x10⁹ y 3, 94x10⁹ y la producción de poliedros por miligramo de larva varía entre 0,4IxIO⁷ y 2,35x10⁷ (Tabla 8).

El método de producción in vivo que utiliza un análogo de la hormona juvenil produce un incremento de más de 2,7 veces la cantidad media de cuerpos de poliedros producidos por larva. Los valores de producción por larva así como el peso medio final que adquieren las larvas se puede apreciar en la Tabla 10.

Ejemplo 6: Estudios de la efectividad en campo del nucleopoliedrovirus de S. exigua

Inicialmente, se determina el tiempo que tardan las larvas en infectarse en condiciones de campo cuando el virus se aplicó a dos concentraciones diferentes. Para ello, como criterio se utiliza el porcentaje de mortalidad observado en grupos de larvas recogidas a distintos intervalos de tiempo (O₅ 6, 24, 48 y 96 horas) después de haber realizado la aplicación de suspensiones del virus a dos concentraciones distintas: 1x10 y 5x10 poliedros por litro de caldo aplicado. Las larvas se individualizan y se mantienen sobre dieta artificial en el laboratorio hasta que se produce su muerte por infección viral o tiene lugar su pupación (Tabla 11).

En un segundo ensayo, se comparó la efectividad del virus en campo respecto a un insecticida comercial (Lufenuron 0,05%). Además, se comprobó el incremento de capacidad insecticida de la formulación del virus con el abrillantador óptico Leucophor AP al 0,1% (Tabla 12).

Depósito de microorganismos

Depósitos de los 6 genotipos reivindicados del nucleopoliedrovirus múltiple de

Spodoptera exigua han sido efectuados en una Autoridad de Depósito de acuerdo con el Tratado de Budapest de depósito de microorganismos con fines de patente. La colección es la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) con sede en el Instituí Pasteur, con dirección en el n° 25 de la Rué du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15 (Francia).

El depósito de todas las muestras quedó registrado el 16 de Febrero de 2006 y a cada uno de los genotipos virales correspondió el siguiente n° de registro:

AIPstM0935 CNCM 1-3572

AIPstM1400 CNCM 1-3573 AIPstM1033 CNCM 1-3574

AIPstM1449 CNCM 1-3575

AIPstM0923 CNCM 1-3576

AIPstM0657 CNCM 1-3577

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Figura 1: A) Mapa físico del genoma de SeMNPV (aislado de referencia) con la endonucleasa de restricción Pstl, destacando al posición del fragmento M que contiene la zona hipervariable correspondiente a la región homologa hr\\ B) ORFs más próximas a la zona hipervariable; C) localización de los cebadores y su posición en la secuencia de nucleótidos.

Figura 2: Electroforesis de los fragmentos de restricción obtenidos al tratar el ADN viral de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 con la enzima BgIlI. Para cada genotipo se indican los fragmentos polimórficos a la derecha del carril. A la izquierda de la figura se indican los tamaños de algunos fragmentos de restricción en kilobases.

Figura 3: Electroforesis de los fragmentos de restricción generados por la digestión con Bgffl de los productos de PCR obtenidos para cada uno de los genotipos AlPstM0935, AIPstMHOO, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657. La última columna (M) muestra el marcador de tamaño de fragmento cuyos valores se señalan a la derecha de la figura en kilobases.

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Claims

28REIVINDICACIONES

1. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua que pertenece a un genotipo seleccionado entre: AlPstM0935, AIPstMHOO, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657.

2. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación 1, que pertenece al genotipo AlPstM0935, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:4.

3. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación 1 que pertenece al genotipo AIPstMHOO, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:5.

4. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación

1 que pertenece al genotipo AlPstM1033, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:6.

5. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación 1 que pertenece al genotipo AlPstM1449, caracterizado por comprender la secuencia de

ADN representada por SEQ ID NO:7.

6. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación 1 que pertenece al genotipo AlPstM0923, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO : 8.

7. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según la reivindicación 1 que pertenece al genotipo AlPstM0657, caracterizado por comprender la secuencia representada por SEQ ID NO :9.

8. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que está en forma de poliedro.

9. Una composición plaguicida que comprende poliedros según la reivindicación 8. 29

10. Una composición plaguicida según la reivindicación 9 que comprende nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de un genotipo seleccionado entre AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449₅ AlPstM0923 o AlPstM0657.

11. Una composición plaguicida según la reivindicación 9 que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de al menos dos genotipos seleccionados entre AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657.

12. Una composición plaguicida según la reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos AlPstM1400 y AlPstM1033.

13. Una composición plaguicida según la reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos

AlPstM0935, AlPstM1400 y AlPstM1033.

14. Una composición plaguicida según la reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos AlPstM0935 y AIPstMl 033.

15. Una composición plaguicida según la reivindicación 14, en la que los poliedros se encuentran en un vehículo acuoso.

16. Una composición plaguicida según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15 que comprende adicionalmente un abrillantador óptico.

17. Una composición plaguicida según la reivindicación 16, en la que el abrillantador óptico es un derivado del estilbeno.

18. Una composición plaguicida según la reivindicación 17, en la que el derivado del estilbeno es Leucophor AP.

19. Una composición plaguicida según la reivindicación 18, en la que el Leucophor AP está presente en un porcentaje que oscila entre el 0,1% y el 1%. 30

20. Una composición plaguicida según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de al menos los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400 y AlPstM1033.

21. Un procedimiento de obtención in vivo de poliedros de los genotipos

AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y/o AlPstM0657 del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua, que comprende las etapas de: a) alimentar larvas de Spodoptera exigua con dieta artificial contaminada con poliedros de virus de la reivindicación 8; b) mantener las larvas a 24°C-28°C hasta que se produce su muerte; c) purificar los poliedros generados en las larvas triturando los cadáveres de las larvas en agua bidestüada que contiene dodecilsulfato sódico, filtrando la suspensión resultante, precipitando los poliedros mediante centrifugación, lavando el precipitado con agua con cloruro sódico y precipitando de nuevo por centrifugación; d) resuspender el precipitado final en agua estéril; e) almacenar las muestras a temperatura ambiente o, preferentemente, en refrigeración u, opcionalmente, si se añade glicerol al agua, a temperatura igual o inferior a -7O⁰C; u f) opcionalmente, liofilizar la muestra y conservar a temperatura ambiente.

22. Un procedimiento de obtención de poliedros según la reivindicación 21, en el que se suministran de 10⁶ a 10⁷ poliedros por larva.

23. Un procedimiento de obtención de poliedros según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que la dieta artificial que recibe cada larva se suministra en forma de pastillas que contienen 7,2% de germen de trigo, 3,3% de caseína, 2,9% de azúcar comercial, 1,4% de levadura de cerveza, 0,94% de mezcla de sales de Wesson, 0,15% de ácido sórbico, 0,09% colesterol, 0,09% nipagina, 1,9% agar industrial y 82,8% agua destilada.

24. Un procedimiento de obtención de poliedros según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que las larvas de Spodoptera exigua se encuentran en el quinto estadio larvario en el momento de iniciar las etapas del procedimiento. 31

25. Un procedimiento de obtención de poliedros según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que comprende adicionalmente la adición de un análogo de la hormona juvenil de la larva a la dieta previamente a la adición de los virus a la misma.

26. Un procedimiento de obtención de poliedros según la reivindicación 25, en el que el análogo de la hormona juvenil es el Fenoxicarb.

27. Un procedimiento de obtención de poliedros según la reivindicación 26, en el que el Fenoxicarb se añade en la superficie de las pastillas de la dieta en forma de suspensión al 1% en agua destilada.

28. Uso de nucleopoliedro virus múltiples de Spodoptera exigua de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de composiciones plaguicidas según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20 para controlar plagas producidas por Spodoptera exigua.