WO2015197900A1 - Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de helicoverpa armigera (hearsnpv), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico - Google Patents

Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de helicoverpa armigera (hearsnpv), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico Download PDF

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Oihane SIMÓN
Primitivo Caballero Murillo
Trevor Williams
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Universidad Pública de Navarra
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Instituto De Ecología, A.C.
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Definitions

  • HearSNPV Heücoverpa arm ⁇ gera simple nucleopoliedrovirus
  • the invention is part of the technical sector of biological pesticides applicable to the control of insect pests. Specifically, the invention relates to two new genotypes of a nucleopoliedrovirus that is capable of infecting larvae of the Heücoverpa arm ⁇ gera iepidoptera (Hübner, 1809), to compositions comprising one or more of the new genotypes, to a method for its production and its use for pest control of! mentioned insect.
  • arm ⁇ gera has been one of the key pests in extensive crops such as cotton and corn, but for a little over a decade it has gained equal importance in the horticultural greenhouses of the Spanish Levant, from where it has been extended to rest of the Spanish regions and Portugal (Torres-Vila et al., 2003). It is currently considered the most problematic phytophagous species in much of the outdoor tomato crops in the Mediterranean region (Torres-Vila et al., 2003). The larvae can attack the crop in any phenological state, however, the period preferred by females to oviposit is that of flowering. Its preference for parts of the plant with a high concentration of nitrogen, such as reproductive structures (flower and fruit) and growth points, makes its action very directly influence
  • H. arm ⁇ gera The control of H. arm ⁇ gera is usually carried out through the application of chemical insecticides (Torres-Vila et ai., 2003).
  • chemical insecticides Teorres-Vila et ai., 2003.
  • the indiscriminate use of synthetic insecticides has led to various problems, such as the increase in production costs, the emergence of resistance to different active materials, reduction of useful fauna, decrease in quality due to the increase in chemical waste. in fruits and derivatives (Torres-Vila et al., 2000).
  • These facts have favored the search for other control methods, including viruses and other entomopathogenic microorganisms (oscardi, 1999).
  • Baculoviridae baculovirus
  • Baculoviridae family is the most widely studied of all those that affect insects because of their usefulness to humans, since they have very desirable characteristics such as bioinsecticides: high pathogenicity, compatibility with the natural enemies of pests, high specificity (infect specifically to arthropods) (Groner, 1986), lasting persistence in places protected from ultraviolet light, high horizontal transmission and, therefore, ability to cause epizootics (Caballero et al., 1992; Gelernter and Federici, 1986). They can also be formulated in the same way as synthetic chemical insecticides, they are perfectly compatible with them and can be applied with conventional equipment (Cherry and Williams, 2001).
  • Baculovirus isolates have been collected in different parts of the world, which have been characterized at a biological and biochemical level (Gelix and Federici, 1986; Caballero et al., 1992; Haá et al., 1995). In addition, some of them are currently registered as insecticides in various parts of the world and are used in pest control (Moscardi, 1999).
  • baculoviruses were classified based on the morphology of viral occlusion bodies (OBs), comprising two genera: Nucleopolyhedrov ⁇ rus, in which the occlusion bodies are formed by polyhedron, irregularly shaped polyhedron, and Granu ⁇ ovirus (GV), in which the occlusion bodies are formed by granulin, granule-shaped (Theilmann et al., 2005).
  • OBs viral occlusion bodies
  • GV Granu ⁇ ovirus
  • Baculoviruses have a circular double-stranded DNA genome wrapped by a protein-like capsid, forming the nucleocapsid, which in turn is surrounded by a trilaminar envelope composed of a layer of proteins between two layers of lipids, which is acquired during virus replication, constituting the virion (Caballero et al., 2001). Said lipoprotein membrane can be acquired in two different ways, in turn constituting two types of virions.
  • nucleocapsids If the nucleocapsids remain in the same cell in which they have been formed, they acquire a de novo synthesized membrane, giving rise to virions derived from occlusion bodies (ODV), which are then wrapped in a matrix formed by a only protein giving rise to the body of occlusion (occlusion body, OB).
  • ODV occlusion bodies
  • OB occlusion body
  • other nucleocapsids once they have been synthesized, move and leave the host cell, acquiring the membrane from the cytoplasm membrane of the host cell when it passes through specific points where a virus-encoded giicoprotein is inserted (GP84 or F protein, depending on the virus).
  • budded virions are called budded virions (budded virus, BV) and are free in the host's hemocephalic cavity, being responsible for spreading the infection to the cells of different tissues.
  • BV budded virus
  • all baculoviruses synthesize large amounts of polyhedrin (in the case of ios nucleopoliedrovirus, NPVs) or granuiine (in the case of ios granulov ⁇ rus, GVs), which crystallize forming a matrix or occlusion body (OB) in the form of irregular polyhedron (polyhedrin) or granule (granuiina).
  • polyhedrin in the case of ios nucleopoliedrovirus
  • granuiine in the case of ios granulov ⁇ rus, GVs
  • polyhedrin OBs are also known as polyhedra
  • granuiine OBs are also known as granules.
  • the larva tegument degrades by releasing millions of occlusion bodies that contaminate the foliage of the plants, which constitute the inoculum that serves to give rise to a new infectious process in other susceptible hosts (Caballero et al. ., 2001).
  • baculoviruses have two types of virions or infective viral particles that are morphologically and functionally different.
  • ODVs are present in all known baculoviruses, and are the infectious particles responsible for primary infection in the epithelial cells of the mesenteron (digestive tract) and therefore, responsible for the horizontal transmission of the virus among susceptible individuals.
  • BVs for their part always contain a single nucleocapsid and are, in all cases, morphologically equal (Fig. 1A).
  • BVs are the infectious particles responsible for disseminating the infection between the organs and tissues of the host's hemocetic cavity that are susceptible, leading to secondary infection, as well as in cell cultures in viiro (Caballero et ai., 2001).
  • ODVs In the occlusion bodies of the NPVs several ODVs are included while in the granule or GVs only one.
  • the ODVs of the nucleopoliedroviruses can be of two different types: ios called simple (giving rise to the single or single nucleopolyhedrovirus, SNPV) that contain a single nucleocapsid per virion, or multiple type (multiple type nucleopoliedrovirus or Multiple nucleopolyhedrovirus, MNPV) containing one to several nucleocapsids per virion (Fig. 1 B).
  • simple giving rise to the single or single nucleopolyhedrovirus
  • MNPV Multiple nucleopolyhedrovirus
  • Occlusion bodies whether polyhedra or granules, provide protection to virions by preserving the infectious capacity of these viruses outside the host, since they are able to persist in the environment for long periods in places protected from ultraviolet light, are insoluble in water, resistant to rot and decay by chemical agents and also to physical treatments such as freezing, drying or lyophilization. In contrast, occlusion bodies are soluble in alkaline solutions, such as those produced in the digestive tract of some insects (pH 9-11), which allows the release of ODVs for infection to begin (Caballero et al. , 2001).
  • Bacuioviruses have been isolated from more than 500 species of insects, mainly of the order Lepidoptera, among which are many of the most important agricultural pests. In addition to an important interspecific diversity, bacuioviruses have a great intraspecific diversity, which has been demonstrated both in the characterization of different geographic isolates of the same virus and within the same isolate, since wild isolates frequently comprise different genotypic variants. To differentiate and characterize both isolates and genotypes present within the same isolate, viral DNA analysis with restriction enzymes is usually used, as it provides characteristic profiles of each isolate or genotype (Erlandson et ai., 2007; Figueiredo et al., 1999; Harrison and Bonning, 1999).
  • HearSNPV Helicoverpa arm ⁇ gera singie nucleopolyhedrovirus, genus Alphabaculovirus. It is a simple type nucleopoliedrovirus (SNPV) that also infects larvae of other members of the Helicoverpa spp. and Hel ⁇ othis spp., such as larvae of Helicoverpa zea. HearSNPV isolates have been characterized in different regions of the world, such as China or Kenya (Chen et al., 2001; Ogembo et al., 2005).
  • homologous regions 1, 4 and 5 are intergenic zones that are present in many of the baculoviruses, and are located multiple times throughout the genome. They are characterized by the presence of multiple and imperfect repeated sequences.
  • Figure 1 of the article by Chen et al. (2000) shows the restriction profiles with the restriction endonucleases Bam, Bg / il, EcoRl, Hinolll, Kpnl, Pstl, Sacl and Xhol (Fig. 2 of present request).
  • the estimated sizes of the restriction fragments generated by each of said restriction endonudeases are shown in Table 1 of said article.
  • Table 1 Estimated sizes of the HearG4 fragments obtained by digestion with BamHI, Bgftl, £ coR !, HindlU, Kpnl, Pst ⁇ , Sac ⁇ and Xho ⁇ and estimated total genome size (Chen et al., 2000).
  • HearNNgl An isolate from Kenya, HearSNPV-NNg1, referred to herein as HearNNgl, whose genome is also completely sequenced (Ogembo et aL, 2009). HearNNgI was selected by Ogembo and collaborators (2007) as the isolate with the best characteristics to be developed as a bioinsecticide against larvae of H. arm ⁇ gera in Japan. HearNNgI was between 3.2 and 82.6 times more pathogenic than the other isolates studied, and 31 1.5 times more pathogenic than the Chinese isolate HearG4, compared to third-stage larvae. In addition, the NNg1 isolate killed the third stage larvae of H.
  • the article by Ogembo et al. (2009) compares the genome of HearNNgl with the genomes of the Chinese genotypes HearCI and HearG4, as well as with the genome of the simple nucleopoliedrovirus of He ⁇ coverpa zea (HzSNPV).
  • the NNg1 genotype shows the greatest differences with the genomes of HearCI, HearG4 and HzSNPV in the homologous regions (hr) and in the bro genes, as was the case in the comparison of the genomes of HearCI and HearG4.
  • the complete genome of HearNNgl is accessible in the GenBank database with access number AP0109Q7.
  • the invention provides an effective solution to that problem.
  • the present invention is based on obtaining new genotypes of the He ⁇ coverpa arm ⁇ gera simple nucleopoliedrovirus, which were isolated by in vivo purification. Two of these genotypes were purified from the HearSNPV-SP1 (HearSPI) isolate (Figueiredo et al., 1999), named HearSNPV-SP1A and HearSNPV-SP1 B (or in shorthand HearSPIA and HearSPI B), while another six genotypes they were isolated from dead larvae during a laboratory-produced epizootic in the second generation of a population of H.
  • HearSNPV-SP1 HearSPI
  • HearSNPV-LB1 a cotton crop of Lebrija (Sevilla), called HearSNPV-LB1, HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV -LB4, HearSNPV-LB5 and HearSNPV-LB6 (or abbreviated HearLBI, HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLB5 and HearLB8).
  • HearSNPV-LB1 HearSNPV-LB2
  • HearSNPV-LB3 HearSNPV -LB4
  • HearSNPV-LB5 HearSNPV-LB6
  • nucleopoliedrovirus have the additional advantage of ease and good performance in their production.
  • the object of the present invention relates to a single nucleopolyhedrirus of H. arm ⁇ gera (HearSNPV) that belongs to a genotype selected from the group of: i) ios HearSNPV genotypes deposited in the Nationale de Cultures de Cultures de icroorganismes (CNC) with the deposit numbers CNCM 1-4808 (HearSNPV-SP1 B), CNCM I-4807 (HearSNPV-LB6), or ii) the genotypes whose genome is represented by SEQ ID NO: 13 (HearSNPV-SP1 B ), or SEQ ID NO: 14 (HearSNPV-LB6).
  • CNC Nationale de Cultures de Cultures de icroorganismes
  • Said nucleopoliedrovirus can be in different forms, either that of the viral particle or virion, or in the form of occlusion bodies, which is the way in which the nucleopoliedrovirus is found in nature, and therefore the form ingested by the larvae.
  • An occlusion body may contain virions of only one of the HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4808) or HearSNPV-LB8 (CNCM I-4807) genotypes, or virions of more than one of said coocluded genotypes within the same occlusion body .
  • Virions can be virions derived from occlusion bodies (ODV) (the form of propagation that is included in the occlusion bodies and that is released in the intestine of the larvae after the dissolution of the polyhedrin), or sprouted virions (BV ) (the way in which the infection spreads to the different tissues of an infected insect, and which can also be found in cell cultures).
  • ODV occlusion bodies
  • BV sprouted virions
  • An aspect of the present invention is also an occlusion body that contains several virions, in which at least one of them belongs to a genotype of the single nucleopoliedrovirus of H. arm ⁇ gera selected from the group of HearSNPV-SP1 B (CNCM i-4806) and HearSNPV-LB6 (CNCM ⁇ -4807).
  • the occlusion body may contain several virions of the same genotype or virions of different genotypes co-occluded in the same occlusion body. When the virions are of the same genotype, this may be any of the HearSNPV-SP1 B or HearSNPV-LB6 genotypes.
  • co-occluded genotypes may be of any of HearSNPV-SP1 B and / or HearSNPV-LB6, in different proportions.
  • virions of other genotypes of the single nucleopolyhedrirus of H. arm ⁇ gera may also be included in the mixture or it may be that all virions belong to one of the genotypes of the HearSNPV- group SP1 B and HearSNPV-LB6. In either case, the virions contained in the occlusion bodies will be virions derived from the occlusion bodies (ODVs).
  • the HearSNPV-SP1 B and HearSNPV-LB8 genotypes can be distinguished by the specific sequence they present in certain areas of their genomes, of great variability, such as the regions of the genome known as homologous regions (hr) 1 and 5 (hr1 and hr5) , as described in the examples of the present application.
  • embodiments of this aspect of the invention are also possible ios occlusion bodies containing at least one virion (ODV) whose genome comprises a DNA fragment whose sequence is represented by: i) SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 (the specific sequences of the homologous region 1
  • SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 12 the complete sequences of the homologous region 5 (hr5), belonging, respectively, to the HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) and HearSNPV-LB6 ( CNCM i-4807)).
  • nucleopoliedrovirus of at least one of the HearSNPV-SP B (CNCM i-4806) and HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) genotypes, or combinations thereof.
  • the nucleopoliedroviruses can be in different forms, such as free virions or, preferably, in the form of occlusion bodies, which can have a variable number of co-occluded virions (virions which, as previously mentioned, they will be virions derived from occlusion bodies (ODVs)).
  • the virions contained in the occlusion body can be of a single genotype or of several, as long as at least one of the genotypes is HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) or HearSNPV-LB6 (CNCM I- 4807). Therefore, this aspect of the invention relates to a composition comprising a nucleopoliedrovirus of the invention or an occlusion body of the invention.
  • compositions comprising a mixture of virions of the HearSNPV-SP1 B genotypes ( CNCM I-4806) and HearSNPV-LB8 (CNC i-4807).
  • the different genotypes may be in any relative proportion, preferably in the proportion that showed the best results in the examples described below, that is, in which the HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4808) and HearSNPV- genotypes LB6 (CNCM I-4807) are in the HearSNPV-SP B: HearSNPV-LB6 1: 1 ratio.
  • compositions of the invention may comprise any excipient or suitable vehicle in the agricultural sector, preferably those that make it suitable for application according to any of the usual methods in agriculture: spraying, either at ground or aerial level, application in suspension or in powder form, or by any type of irrigation system.
  • the composition may be in any form, such as in aqueous or solid form.
  • the composition may contain any other component, preferably those of particular agricultural interest; thus, the simple nucleopoliedrovirus of H. arm ⁇ gera may be mixed, for example, with a fertilizer, a fertilizer or a pesticide, or mixtures thereof.
  • a specific case may be one in which the composition of the invention additionally comprises an insecticide based on the Bacillus thuringiensis bacteria selected from among the endospores of said bacterium, Cry protein crystals or mixtures thereof.
  • compositions that may comprise agents that enhance the pathogenic effect of the nucleopoliedrovirus on the lepidoptera.
  • a further aspect of the invention is the use as insecticide of at least one of the nucleopoliedrovirus of the present invention, or of a composition containing at least one of them.
  • the insect to be controlled is preferably H. arm ⁇ gera, in particular when it is in the form of a larva or caterpillar. It is preferred that the nucleopoliedrovirus be in the form of occlusion bodies, since it is the form that larvae commonly ingest.
  • the composition contains a mixture of the HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) and HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) genotypes, preferably mixtures in which said genotypes are in the HearSNPV-SP1 B ratio: HearSNPV- LB6 1: 1.
  • Another aspect of the invention is a process for the production of occlusion bodies comprising a stage in which larvae of H. arm ⁇ gera are fed with an artificial diet containing occlusion bodies of the nucleopoliedrovirus of H. arm ⁇ gera with virions of any one of ios HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4808) or HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) genotypes or mixtures thereof.
  • An aspect of the invention is also a method for identifying the presence in a sample of a genotype of the single nucleopolyhedrirus of H. arm ⁇ gera selected from HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) and HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) comprising the steps of: i) amplifying by PCR the DNA extracted from said sample using a pair of primers, which amplify in the homologous region (hr, of the English homologous region) 1 or 5, which is selected from those formed by: a. SEQ ID NO: 1 (F-hr1) and SEQ ID NO: 2 (R-hr1), or b.
  • SEQ ID NO: 3 F-hr5 and SEQ ID NO: 4 (R-hr5); ii) analyze the amplified fragment to determine its size or sequence; iii) digest the amplified fragment with the Ndel endonuclease: iv) analyze the fragments generated after digestion to determine the number of fragments and the size of each of them; v) conclude that one of the HearSNPV-SP1 B (CNCM 1-4808) or HearSNPV-LB6 (CNCM 1-4807) genotypes is present if: a. the fragment amplified by the pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 has: i.
  • HearSNPV-SP1 B 2,177
  • HearSNPV-LB6 2,117 nucleotides
  • Digestion of said fragment with endonuclease A / del generates 8 fragments of 857, 508, 381, 306, 78 and 47 nucleotides (HearSNPV-SP1 B) or 5 fragments of 1,210, 475, 307, 78 and 47 nucleotides (HearSNPV- LB6); iii. the sequence represented by SEQ ID NO: 5 (HearSNPV-SP B) or SEQ ID
  • the fragment amplified by the pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 has: i. a size of 2,326 (HearSNPV-SP1 B) or 2,330 (HearSNPV-LBo) nucieotides; ii. digestion of said fragment with endonudease A / del generates 4 fragments of 1,120, 917, 21 1 and 78 nucieotides (HearSNPV-SP1 B) or 3 fragments of 1,120, 998 and 212 nucieotides (HearSNPV-LB6); iii. the sequence represented by SEQ ID NO: 7 (HearSNPV-SP1 B) or SEQ ID
  • Figure 1 Transmission microscopy and schematic representation of virions derived from occlusion bodies (ODVs) and sprouted virions (BVs), and (B) of multiple type nucleopoliedrovirus (NPV) with virions with a number nucleocapsid variable, and simpie type (SNPV) with virions with a single nucleocapsid.
  • ODVs occlusion bodies
  • BVs sprouted virions
  • NPV nucleopoliedrovirus
  • SNPV simpie type
  • FIG 4 (A) Restriction profiles of HearSPI, HearSP2, HearSP3, HearSP4, HearSPS, HearSP6, HearSP7, HearSPS, HearPTI and HearPT2 isolates after genomic DNA digestion with the Bgll endonudease, to the left of the figure shows the Lambda ( ⁇ ) molecular weight marker digested with Hindl ll, and their sizes are indicated in base pairs (Figueiredo et ai., 2009).
  • FIG. 6 Schematic representation of a mixture of occlusion bodies of different genotypes, where each occlusion body is formed by ODVs of the same genotype, and a mixture of co-occluded genotypes in the same occlusion body, where each body of Occlusion is formed by ODVs of different genotypes.
  • FIG. (A) Electrophoresis of the restriction fragments obtained by treating the viral DNA of the HearSPI isolate and of the HearSPIA and HearSPI B genotypes with the restriction endonucleases Bg ⁇ W and EcoRI.
  • FIG 8 (A) Fragments obtained by amplifying by PCR the zones of variability of the homologous region hr1 (primers identified by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and hr5 (primers identified by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) of the HearSP B and HearLB6 genotypes, of the HearSPI isolate and of the Chinese HearG4 genotype, being c-: negative control without viral DNA.
  • the 1 kb molecular weight marker (NI PPON) is shown to the left of the figure, and the fragment sizes are indicated in kilobases.
  • FIG. 9 (A) Alignment of the nucleotide sequences of the amplified fragments by PCR of the homologous region 1 (hr1) corresponding to the HearSPI B and Hearl_B6 genotypes and to the HearG4, HearCI, HearNNgl and HearAus isolates. (B) Alignment of the nucleotide sequences of the fragments amplified by PCR of the homologous region 5 (hr5) corresponding to the HearSPI B and HearLB6 genotypes and to the HearG4, HearCI, HearNNgl and HearAus isolates.
  • Figure 10 Average production of occlusion bodies ( ⁇ 10 'occlusion bodies / larvae) in second stage larvae of H. arm ⁇ gera after being infected with the individual HearSPIA and HearSPI B genotypes and with the isolated HearSPL Vertical bars indicate the standard error . The same letters of significance that accompany the values indicate that there are no significant differences between the treatments (P> 0.05).
  • Figure 11 Average production of occlusion bodies (x10 8 occlusion bodies / larva) in second stage larvae of H. arm ⁇ gera after being infected with the individual genotypes HearLBl, HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS and HearLB6 and with the isolated HearSPL Vertical bars indicate the standard error. The different letters of significance that accompany the values indicate that there are significant differences between treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 12 Average production of occlusion bodies (x 0 7 occlusion bodies / larvae) in second stage larvae of H. arm ⁇ gera after being infected with the individual genotypes HearSPIA, HearSPI B, HearLBl, HearLBS and HearLB6 and with mixtures co -HearSP1A: SP1 B (1: 1), HearSP1A: SP1 B (1: 2), HearLBl: LB3, HearLBS: LB6, HearLBl: LB3: LB6, HearLBmix, HearSPI B: LB1 and HearSPI B: LB6. Vertical bars indicate the standard error. The different letters of significance that accompany the values indicate that there are significant differences between the treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 13 Percentage of mortality due to infection, survival (or reached the state of pupa) and cannibalism in larvae of third, fourth and fifth stage (L 3 , L and L s ), healthy and infected with lethal concentration 90% (CL 90 ) of the co-occluded HearSP1 B: LB6 mixture at different larval densities (1, 5, 10 and 20 larvae per box). The different letters of significance that accompany the values indicate that there are significant differences between the treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 14 Percentage of larval mortality after inoculating larvae of H. arm ⁇ gera newly moved to the third, fourth and fifth stage (L 3> L 4 and L 5 ) and one day after molting (L 3 +1, L 4 +1 and L5 + I) with a lethal concentration 95% (CL 95 ), 90% (CL 90 ) or 80% (CL 80 ) of the HearSP B co-occluded mixture: LB6. Vertical bars indicate the standard error. The lyrics of Different significance that accompany the values indicate that there are significant differences between treatments (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 15 Average production of occlusion bodies (x 10 8 occlusion bodies / larvae) in H. arm ⁇ gera larvae newly moved to the third, fourth and fifth stage (L 3 , L 4 and L 5 ) and one day after the change to these stages (L 3 ⁇ 1, L 4 ⁇ 1 and L 5 +1) inoculated with a lethal convention 95% (CL 95 ), 90% (CL 90 ) or 80% (CL 8 o) of the co-occluded mixture HearSP1 B: LB6.
  • Figure 18 Average production of occlusion bodies (x 10 9 occlusion bodies / larvae) in fifth-stage larvae (L 5 ) of H. arm ⁇ gera inoculated with the 95% lethal concentration (CL 95 ) of the HearSP1 co-occluded mixture B: LB6 and incubated at 23, 26 and 30 ° C. Vertical bars indicate the standard error. The same letters of significance that accompany the values indicate that there are no significant differences between treatments (P> 0.05).
  • Figure 17 Percentage of mortality obtained in second stage larvae of H. arm ⁇ gera collected in tomato plants treated under laboratory conditions. The larvae were collected at 1, 3 and 5 days after the application of HearSNPV at three concentrations (10 6 , 10 7 and 0 8 occlusion bodies / mi) of the HearSP1 B: LB6 co-occluded mixture, and raised individually in the laboratory in vessels with a semi-synthetic diet until death or pupation.
  • Figure 18 Percentage of fruits damaged in tomato cultivation in the greenhouse 10 days after the application of Turex, Spintor and HearSNPV. The different letters of significance that accompany the values indicate that there are significant differences between the treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 19 Percentage of larval mortality observed in tomato cultivation in the greenhouse 10 days after the application of Turex, Spintor and HearSNPV. The different letters of significance that accompany the values indicate that there are significant differences between treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 21 Amount of residual insecticidal activity per gram of tomato leaf in greenhouse 1, 72, 144 and 216 hours (0, 3, 8 and 9 days) after the application of the treatments: A) Turex (mg), B ) Spintor ( ⁇ ) and C) HearSNPV (occlusion bodies). Vertical bars indicate the standard error.
  • Figure 22 Percentage of damaged fruits, whether healed or fresh, in tomato cultivation outdoors after application of HearSP B: LB6, HearSPI, Spintor, Turex and Dursban during (A) the first, (B) second, (C) third, and (D) fourth fortnight.
  • HearSP B LB6, HearSPI, Spintor, Turex and Dursban during (A) the first, (B) second, (C) third, and (D) fourth fortnight.
  • the different letters of significance that appear in the columns in each group indicate that there are significant differences within each group between the different treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 23 Percentage of harvested damaged fruits, whether rotten red, scarred red or chopped green, in tomato cultivation outdoors, after the application of HearSPI B: LB6, HearSP Spintor, Turex and Dursban.
  • the different letters of significance that appear in the columns in each group indicate that there are significant differences within each group between the different treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 24 Tons of A) green tomatoes, both chopped and healthy and B) healthy, healed or rotten red tomatoes per hectare in outdoor cultivation after application of HearSP1 B: LB6, HearSPI, Spintor, Turex and Dursban.
  • HearSP1 B LB6, HearSPI, Spintor, Turex and Dursban.
  • the different letters of significance that appear in the columns in each group indicate that there are significant differences within each group between the different treatments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 25 Percentage of residual insecticidal activity (HearSPI B: LB6, HearSPI, Spintor, Turex and Dursban) present in tomato leaves in open air culture over time, with respect to the amount of insecticide present in tomato leaves one hour after the application of treatments. Vertical bars indicate the standard error.
  • Figure 26 Amount of residual insecticidal activity per gram of tomato leaf in outdoor culture 1, 72, 168 and 240 hours (0, 3, 7 and 10 days) after the application of the treatments: A) HearSPI B: LB6 (occlusion bodies), B) HearSPI (occlusion bodies), C) Spintor ( ⁇ ), D) Turex (mg) and E) Dursban (mg). Vertical bars indicate the standard error.
  • the object of the present invention relates to the obtaining of new genotypes of Helicoverpa arm ⁇ gera simple nucleopoliedrovirus (Fig, 5).
  • These genotypes have been isolated in two different ways: i) from the HearSNPV-SP1 isolate (or, more abbreviated HearSP), by a plaque assay with in vitro cell culture.
  • the genotypes present in said isolate different from all the isolates and genotypes characterized so far, have been called HearSNPV-SP1A and HearSNPV-SP1 B (or, in short, HearSPIA and HearSPI B).
  • HearSNPV-LB1 The genotypes obtained from these larvae, different from all isolates and genotypes characterized so far, have been called HearSNPV-LB1, HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV-LB4, HearSNPV-LB5 and HearSNPV-LB6 (or, of form more abbreviated, HearLBI, HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS and HearLB6). Each of these genotypes comes from an individual larvae killed by said epizootic.
  • the restriction profiles obtained after the genome digestion of each of these genotypes with different restriction enzymes confirmed that they were different genotypes (HearSPIA, HearSPI B, HearLBI, HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS and HearLB8) (Fig. 7) and were also different from other isolates and genotypes characterized so far (Table 4), such as the Chinese genotypes HearCI and HearG4 (Fig. 2), the isolate from Kenya HearNNgl (Fig. 3) and isolated from the Iberian Peninsula HearSPI, HearSP2, HearSP4, HearSPT, HearSPS, HearPTI and HearPT2 (Fig. 4).
  • HearSPI B and HearLB6 which can be easily distinguished from each other and differentiated from other isolates and genotypes of HearSNPV by the profiles obtained by treating their genomes with restriction enzymes, such as EcoR ⁇ and fig / ll.
  • restriction enzymes such as EcoR ⁇ and fig / ll.
  • figures 2, 3, 4 it show the restriction profiles obtained for the previously characterized HearSNPV isolates
  • Figure 7 the restriction profiles of the HearSPI A, HearSPI B, HearLBI, HearLB2, HearLB3, Hearl_B4, HearLB5 and HearLB6 genotypes are shown.
  • the HearSPI isolate shows several submolar bands around 6.5-7 kb, which are not observed in the profile of the pure HearSPI B genotype ( Figure 8B).
  • the HearSPI isolate shows an 18.8 kb submoiar band that is not observed in the profile of the HearSPI B genotype.
  • the presence of said submolar bands shows that the HearSPI wild isolate is composed of a heterogeneous mixture of genotypes.
  • HearSPI B and HearLB6 genotypes In order to differentiate more clearly the HearSPI B and HearLB6 genotypes, and also differentiate them from other HearSNPV isolates whose genomes have been completely sequenced (HearG4, HearCI, HearNNgl and HearAus), the numerical values of sizes are shown in Table 4 of the restriction fragments generated after digesting said isolates and genotypes with the EcoR? endonuclease.
  • Table 4 Estimated sizes (kb) of the DNA fragments generated after the digestion of the genomic DNA of different isolates and genotypes with the EcoR endonuclease and estimated total size of the genomes. DNA fragments are named alphabetically, with fragment A being the largest.
  • the HearSPI B and HearLB6 genotypes also differ from each other and with respect to other HearSNPV isolates and genotypes described in the literature, by the specific nucleotide sequences that each presents in specific regions of the genome.
  • the genome region known as homologous region 1 (hr1) can be used, taking as a reference the corresponding sequence of the genomes of two isolates from China, HearG4 (Chen et al., 2001; with the access number in GenBank AF271059) and HearCI (Zhang et al., 2005; GenBank AF303045), from an isolate from Kenya, HearNNgl (Ogembo et al., 2007; GenBank AP010907) and from an isolate from Australia, HearAus (GenBank JN584482). You can also use the region in ia that is ia hr5 (homologous region 5).
  • hr5 In the homologous region 5, hr5. In this region of the genome of HearSNPV it has been found that the specific primers F-hr5 (5 -CTAGCCGGTCCGTTTCTGTT- 3:!) And R-hr5 (5'-GCCCCACCCAAAACATAACG-3 ') amplified a fragment of 2326 nucleotides and 2330 for HearSPI B and HearLB8 genotypes, respectively.
  • Figure 8 in its panel A, shows the photograph obtained after electrophoresis the PCR amplified fragments using the primers specific for the hr1 and hr5 regions.
  • Panel B shows the photograph after electrophoresis the fragments obtained after digesting with the endonuciease A / of the fragments amplified by PCR for hr1 and hr5, from the previous point.
  • the fragments obtained for each genotype are different and distinguishable from each other. It can also be seen that the fragments obtained for each genotype are different and distinguishable from each other.
  • the 1.2 0 bp fragment is characteristic of the HearLB6 genotype, while the HearSPI B genotype has a characteristic fragment of 857 bp.
  • the HearSPI B genotype has a fragment of 917 bp, while the HearLB6 genotype has one of 998 bp.
  • the different genotypes can be differentiated from each other and with respect to any other virus genotype described in the literature (see Table 6 below, in the Example 2).
  • the proportion of the two HearSPI B and HearLB6 genotypes in the mixture can be determined by quantitative PCR, using specific primers for each one of the genotypes, as mentioned later in the materials and methods section of examples.
  • sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 correspond to the sequences of the amplified fragments using primers F-hr1 and R-hr1 that amplify in the hr1 of the HearSPI B and HearLB6 genotypes, respectively, while SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 correspond to the sequences of the fragments amplified for hr5, for the same genotypes.
  • the complete genome sequence of each of these two genotypes HearSPI B and HearLB6 has been obtained, sequences that are shown, respectively, as SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and that can be used to differentiate some genotypes from others.
  • the complete sequences of the zones of variability corresponding to the homologous region 1 (hr1) are shown individually (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, corresponding, respectively, to the HearSPI genotypes B and HearLB6) and to the homologous region 5 (hr5) (SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 12, corresponding, respectively, to the HearSPI B and HearLB8 genotypes).
  • sequences are indicated in the sense in which they appear in the complete genome sequence. Being intergenic areas, located between two open reading guidelines, there is no coding address as in the reading guidelines. The latter can be transcribed in the sense (coding sequence) or antisense (sequence complementary to the coding sequence).
  • the complete genome sequences of each of these two genotypes HearSP B (SEQ ID NO: 13) and HearLB6 (SEQ ID NO: 14), characteristic and defining feature of each of them, have been obtained. Therefore, said genotypes are described in the present application in such a way that an expert can reproduce the invention.
  • the complete sequences of each of the genomes are complemented by the data provided in the present application that the Helicoverpa arm ⁇ gera nudeopoiiedrovirus is a simple type nudeopoiiedrovirus (SNPV), that is, each complete viral particle or virion contains a single nucleocapsid, and therefore, a single copy of the genome of the nudeopoiiedrovirus.
  • SNPV simple type nudeopoiiedrovirus
  • Additional data are also provided to identify each of the genotypes according to the profile obtained after digesting their genome with different restriction endonucleases, as well as the size and sequence of the fragments obtained by amplifying the zones of variability of the homologous regions by PCR. 1 and 5 (hr1 and hr5), using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, as per the pattern of bands obtained after digesting these PCR fragments with the enzyme Ndel.
  • the Examples also show data on the insecticidal activity of each genotype and mixtures of occlusion bodies that contain co-occluded virions of different genotypes within the same occlusion body, as well as how to obtain the different mixtures.
  • the differences in pathogenicity, virulence and productivity turn out to be significant between genotypes, and between the mixtures of the genotypes of the invention, the mixture of the two HearSPI B and HearLB6 genotypes being, in a 1: 1 ratio, more pathogenic than the rest of genotypes and mixtures and as virulent as the fastest genotypes,
  • the HearSPI B: LB6 mixture in a 1: 1 ratio was the one that presented the most desirable effects with synergistic activity from the bioinsecticide point of view.
  • this synergistic activity is not observed in many other genotype mixtures (in which there may simply be an additive or even antagonistic effect) and there is no way to predict in which mixtures such activity will occur. It is a result that is not obvious or predictable, even more bearing in mind that genotypes come from different geographical areas (Badajoz and Lebrija) and that both genotypes (HearSPI B and HearLB6) had not been obtained pure, up to date, as of the date complex wild mixtures like ios isolated from the field.
  • each of the new HearSPI B and HearLB8 genotypes has a specific insecticidal activity against H. arm ⁇ gera larvae, which can all be considered comparable to those of ios chemical insecticides, such as Dursban and Spintor, or those of a biological type based on Bacillus thuringiensis, such as Turex, commonly used against H. arm ⁇ gera. But it has also been found that the mixture of the two genotypes
  • HearSP1 B LB6 in a specific proportion (1: 1), as occlusion bodies that include
  • ODVs that have been co-occluded so that the same occlusion body can contain different genotypes of HearSNPV has a better insecticidal activity than that of each of the individual genotypes or any of the HearSNPV wild isolates currently known, since it presents greater pathogenicity than the rest of genotypes and mixtures, and the same average mortality time (TMM) as the fastest genotypes.
  • TMM average mortality time
  • this virus can be produced in a short time since inoculating 100 larvae recently moved to the fifth stage (L 5 ) and incubating them with a diet at 30 ° C, they are obtained in the order of 5 x 10 11 occlusion bodies in a period of time of about 5 or 6 days.
  • HearSPI B and HearLB6 are better adapted to the prevailing environmental conditions in southern Europe than those isolated from other geographical origins. This fact is especially significant considering the negative effect that UV radiation exerts on the deposits of a bioinsecticide application, which requires that NPVs be maintained. active until ingestion by H. arm ⁇ gera where they can exert their insecticidal effect. In addition, it has been observed that there is a certain predisposition for the natural isolates of a given geographical area to be more pathogenic and virulent for the larvae of the same area.
  • nucleopoliedrovirus can be mass produced.
  • Their occlusion bodies in which the insecticidal activity lies, can be massively produced in vivo by inoculating larvae of H. arm ⁇ gera with occlusion bodies previously obtained after oral infection of larvae with the 1: 1 mixtures of pure occlusion bodies HearSPI B and HearLB6.
  • the occlusion bodies may contain virions of any one of the HearSPI B or HearLB6 genotypes, if they want to obtain occlusion bodies with virions of a single genotype, or mixtures thereof, if they want to obtain virions of different co-occluded genotypes within of the same occlusion body.
  • the occlusion body production process may comprise the steps of: i) feeding fifth-stage larvae of H. arm ⁇ gera with an artificial diet comprising occlusion bodies of the H.
  • refrigeration conditions are those in which the product is maintained between 0 ° C and 8 ° C, and freezing conditions would correspond to maintenance below Q ° C, for the purposes of In the present invention, it is preferred that the cooling conditions be maintained between 0 ° C and 6 ° C and those of freezing between -20 ° C and -80 ° C.
  • the production of said occlusion bodies can also be carried out by feeding the fifth stage larvae with an aqueous solution, containing 10% sucrose together with the selected co-occluded mixture at a lethal concentration ai 95% (CL 95 ).
  • This method was described by Hughes and Wood in 1986, and consists of administering in droplet form a suspension containing suspended occlusion bodies at the desired concentration, as well as a dye that indicates whether the larvae have ingested the drop, as is the Blue food coloring Fluoreila biue (Hiiton-Davis, Cincinnati, Ohio). This method is less cumbersome than the previous one, since in the artificial diet the diet must be impregnated well with the viral suspension, and it takes longer to prepare the diet taps impregnated with viruses.
  • the artificial diet by which the larvae are fed or infected is administered in solid form, by means of pills that additionally to the occlusion bodies of the heiicoverpa arm ⁇ gera nucleopoliedrovirus (when the objective is the infection of said larvae) contain 7.2% germ of wheat, 2.5% soy protein, 1.4% beer yeast, 1.9% agar, 2.9% sugar, 1% mixed salts, 0.1% cholesteroi, 0.4% ascorbic acid, 0, 2% sorbic acid, 0.02% streptomycin, 0.04% ciortetracycline hydrochloride, 0.1% nipagina, 0.1% nipasol, 0.2% benzoic acid, 0.1% choline chloride, 0.01% vitamins , 15% agar and 80% distilled water.
  • the larvae can be infected by administering the occlusion bodies either in an aqueous suspension in the form of drops or as an artificial diet in solid form. Normally a volume of several liters of diet is prepared, mixing the ingredients mentioned above, which is then self-sterilized to sterilize and allow the agar to dissolve, and before it cools completely (at a temperature of 50 ° C) the antibiotics, and after mixing them well, aliquots of it are made in 120x120 mm square Petri dishes. Subsequently, the diet of the Petri dishes is cut into 5x5 mm cubes.
  • Example 4 of the present application shows the mass production method set up for the host-pathogen system described in this application, H. arm ⁇ gera-
  • HearSNPV HearSNPV.
  • factors that can influence the final production of occlusion bodies such as the larval stage, the concentration of the initial inoculum, or even the temperature. These parameters can be modified so that different final productions are obtained. In the tests carried out in our laboratory, it has been shown that preference is given to certain conditions since they are the ones with which the best results are obtained and therefore greater final production of occlusion bodies. Below are the different parameters that can be modified indicating their preference: i) H.
  • larval larvae of the third (L 3 ), fourth (L 4 ) and fifth (L 5 ) stages although preference is given by the larvae of the fifth stage; ii) different concentrations of occlusion bodies supplied in the artificial diet, as evidenced by tests with different concentrations in the range of 5.5 x 10 6 to 1, 5 x 10 8 occlusion bodies / mi, although preference is given to larvae L 5 the concentration of 1.5 x 10 8 occlusion bodies / ml; iii) individualized larvae in 12-well plates, to avoid cannibalism, iv) larvae incubated at 30 ° C until their death.
  • Occlusion bodies produced in H. arm ⁇ gera larvae can be purified, formulated in a solid or liquid form and sprayed as aqueous suspensions, which effectively protect tomato crops, both in the greenhouse and outdoors, from pests caused by larvae of H, arm ⁇ gera.
  • the nucleopoliedrovirus may also be applied by other methods, such as ground or aerial spraying, or suspension application, in the form of dust, or irrigation.
  • the occlusion bodies may be mixed with excipients, and used with appropriate vehicles in the agricultural sector, especially those that facilitate preparation in a manner suitable for the desired application method.
  • a fertilizer for example, a fertilizer or a pesticide.
  • it may also contain an agent that enhances the pathogenic effect of nucleopoliedrovirus on H. arm ⁇ gera.
  • the pesticide can be, for example, another biological insecticide, such as those based on Bac ⁇ lius thur ⁇ ngiens ⁇ s (Bt) previously mentioned, the case of the Turex® product subsequently used in Example 6 of the present application, which is used for crops attacked by H. arm ⁇ gera .
  • Bt-based insecticides Mixing with Bt-based insecticides is interesting, since cases of synergistic interactions of the insecticidal activity between these products and the nocturnal baculoviruses have been described (Granados et ai., 2001).
  • each of these two genotypes has a characteristic insecticidal activity against H. arm ⁇ gera larvae, determined by the pathogenicity, the average mortality time ( TMM) and the ability to produce occlusion bodies in the larvae of H. arm ⁇ gera.
  • mixtures of virions of different co-occluded genotypes in the same occlusion body may have a different activity than mixtures of occlusion bodies where the virions of each occlusion body belong to a single genotype (López-Ferber et al., 2003), since it can there is synergism or antagonism between some genotypes.
  • the study of the insecticidal activity of different mixtures of coocluded virions in the same occlusion body has been carried out, to check if said mixtures had insecticidal characteristics different from the occlusion bodies of a single genotype, if the Genotypes presented antagonistic or synergistic activity, and determined the variations that could occur between different combinations and different types of mixtures.
  • Example 3 of the present invention the tests of the insecticidal activity of the different genotypes and mixtures are described, which surprisingly demonstrate that the new isolated nucleopoliedroviruses, and especially their combination, are among the biological insecticides with the greatest activity against pests of insects Therefore, its use as an insecticide is proposed, particularly for the control of insects of the genera on which it is known to act, Heücoverpa or Heiioihis, with special preference for the use for the control of H. arm ⁇ gera.
  • the plants in which this formula is applied can be anyone that damages this species of lepidoptera and where they want to control the damage caused by this insect, whether they grow or are grown in the greenhouse or outdoors, especially tomato crops, especially in the Iberian Peninsula, where its effectiveness has been proven, both in greenhouse tomato cultivation and outdoors.
  • each of the new isolated genotypes, HearSPI B and HearLB6 is new, since each of them is different from the other genotypes and different from the so-called H. arm ⁇ gera nudeopoliedrovirus, from which we can distinguish both for the differences in the sequences of their genomes (particularly, in the zones of homologous regions 1 and 5, hr1 and hr5) as well as for the differences in the profiles generated by digestion with restriction enzymes of said genomes, in particular EcoRl and / or f / N.
  • the two new isolated genotypes share, among others, the technical characteristics of: a) their insecticidal activity and their productivity, individually, is greater than or equal to that of any of the previously known natural isolates; b) its mixtures, in partici- pating the co-produced mixture of the two, HearSPI B: LB6, in a 1: 1 ratio, presents a pathogenicity and virulence against the larvae of H.
  • arm ⁇ gera better or equal to that of the isolated ones wild animals of this virus and comparable to that of insecticides (although without inconveniences) that are commonly used against this pest, such as insecticides traded under the name Dursban®, Spintor® or biological insecticide based on Bt, Turex®; c) given that the two genotypes have been isolated in relatively close geographical areas, it is expected that they will be especially active against the possible variants of H. arm ⁇ gera of said geographical area, the south of the Iberian Peninsula or Andalusia and Extremadura specifically .
  • H. arm ⁇ gera arvas used for the amplification of the different viruses, for the recovery of the bioassays in the laboratory and for the greenhouse tests, were obtained from a laboratory laboratory of the Public University of Navarra ( UPNA) established from pupae received from the Center for Ecology and Hydroogy (NERC-CEH) in Oxford (United Kingdom). The population is maintained in the UPNA insectarium at 25 ⁇ 1 ° C, with a reiative humidity of 70 ⁇ 5% and a photoperiod of 16: 8 (light: dark). The larvae feed on an artificial diet described previously by Greene et al. (1976) and adults ad ibitum with 30% diluted honey (weight / volume).
  • the larvae of H. arm ⁇ gera used to carry out the outdoor field trials came from a natural infestation of the tomato crop in Guadajira (Badajoz),
  • Occlusion bodies occlusion bodies, OBs or occlusion bodies were extracted from dead larvae by crushing the bodies in sterile double-distilled water with dodeci! 0.1% sodium sulfate (SDS) (weight / volume) and filtering the resulting suspension through muslin.
  • SDS sodium sulfate
  • the occlusion bodies are sedimented by centrifugation at 6,000 x g for 10 minutes. Subsequently, 2 water washes were performed and the occlusion bodies were sedimented under the same conditions.
  • the purified occlusion bodies were resuspended in sterile double-distilled water and their concentration was determined by triplicate sample counting using an improved Neubauer hemocytometer (Hawksley, Laucing, United Kingdom) under 400x phase contrast microscopy.
  • the occlusion bodies of the different isolates were multiplied by a single pass in fourth-stage larvae of H. arm ⁇ gera. Groups of 24 larvae from the laboratory colony were individualized and kept without food for approximately 12 hours. After that time they were infected per os by the method of gout (Hughes and Wood, 1981) with a concentration of 10 6 occlusion bodies / ml, 10% sucrose (weight / volume) and 0.001% (weight / volume) of the Fiuorelia Biue food dye (Hilton-Davis, Cincinnati, Ohio). The food coloring allows to differentiate the larvae that have ingested the suspension of occlusion bodies from those that have not.
  • the purified occlusion bodies were stored at -20 ° C until their molecular and biological characterization.
  • a plaque assay was performed (Mu ⁇ oz et al., 2001). For this, 25 larvae of H. arm ⁇ gera fourth stage were infected orally with the concentration that produced 90% of Mortality (LC 90 ) of 10 6 occlusion bodies / ml. At 48 hours after infection, a small incision was made in the last pair of pseudopods of the larvae in order to remove the hemolymph. At this time the hemolymph is full of BVs (sprouted virions) that contain a single nucleocapsid and therefore a single genotype.
  • LC 90 Mortality
  • the hemolymph was filtered through a 0.45 filter to eliminate possible contaminants such as bacteria, and subsequently diluted serially with a dilution factor 5 with EX-CELL 420 medium (Sigma). 2 x 10 6 HzA 1 cells were subsequently incubated in six-well plates (35 mm in diameter) at 27 ° C for three hours to allow cell deposition. After this time, the medium was replaced by 100 ⁇ of the hemolymph dilutions. After one hour, the viral inoculum contained in the hemolymph dilutions was replaced with a new EX-CELL 420 medium with 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Lonza) and 2% agarose to prevent excessive spread of the infection.
  • EX-CELL 420 medium Sigma
  • 2 x 10 6 HzA 1 cells were subsequently incubated in six-well plates (35 mm in diameter) at 27 ° C for three hours to allow cell deposition. After this time, the medium was replaced by 100 ⁇ of the hemo
  • plaque or bald which corresponds to a set of dead cells due to infection by a single BV, and therefore, by a single genotype.
  • plaque or bald a non-colored area
  • EX-CELL 420 medium 50 ⁇ of EX-CELL 420 medium.
  • Each suspension was subsequently injected into fourth stage larvae of H. arm ⁇ gera for multiplication in vivo and thus Obtain large numbers of occlusion bodies, which were analyzed at the molecular DNA level in order to determine the number of different genotypes.
  • This supernatant contains sprouted virions (BVs) that were injected into fourth-stage larvae of H. arm ⁇ gera for multiplication, so that sufficient occlusion bodies were obtained to perform its molecular characterization, and to determine the purity of each genotype or number of different genotypes.
  • BVs sprouted virions
  • ODVs occlusion bodies
  • the ODVs that were within the occlusion bodies were released by incubating a suspension of 10 9 occlusion bodies with an alkaline solution (1 volume of Na 2 C0 3 0.1 M) for 30 minutes at 28 ° C.
  • the polyhedrin and other debris were sedimented by low speed centrifugation (2,500 xg) for 5 minutes.
  • the supernatant containing the virions was centrifuged in density equilibrium (90,000 xg) for 1 hour in a continuous gradient of 30-60% sucrose (weight /volume). After that, a visual inspection was carried out and photographed, so that the nature of them could be determined.
  • a suspension of occlusion bodies at the concentration of 10 9 occlusion bodies / ml were incubated with 100 ⁇ of sodium carbonate (Na 2 C0 3 ) 0.5 M, 50 ⁇ of SDS at 10% (weight / volume) and 250 ⁇ of H 2 0 at 60 ° C for 10 minutes, to dissolve the polyhedrin and release the virions.
  • Non-deterrent occlusion bodies and other debris were removed by low speed centrifugation (3,800 xg) for 5 minutes.
  • the supernatant containing the virions was incubated with 500 ⁇ g of proteinase K at 50 ° C for 1 hour.
  • the viral DNA was extracted twice with a volume of saturated phenol, followed by one with chloroform, and precipitated with 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 volumes of cold absolute ethanol at 12,000 xg for 10 minutes. Subsequently, it was washed with 70% cold ethanol and centrifuged for 5 minutes. Finally, the DNA was resuspended in 100 ⁇ of 0.1x TE buffer (Tris-EDTA, pH 8) at 80 ° C for 10 minutes. The concentration was estimated by reading the optical absorption at 260 nm in a spectrophotometer (Biophotometer Plus, Eppendorf, Freiberg, Germany).
  • Electrophoresis was carried out using horizontal gels of 1% agarose (weight / olumen) in TAE buffer (0.04 Tris-acetate, 0.001 EDTA, pH 8.0) at 20 V for 12 to 16 hours.
  • the DNA fragments were stained with ethidium bromide and visualized on an ultraviolet transilluminator (Chemi-Doc, BioRad, California, USA).
  • sarcosii sodium Lauroil Sarcosine or / V-Laurylsarcosine sodium sait
  • sample was dialyzed in a beaker containing 500 ml of TE buffer under stirring at 4 ° C, making between 2-3 changes of TE every 8 h.
  • DNA was transferred to a tube, quantified on a spectrophotometer and stored at 4 ° C until use.
  • a restriction analysis was also performed with the EcoRl and fi / il endonucleases to confirm the identity and quality of the DNA.
  • DNA sequencing of the two genotypes was carried out by Lifesequencing S.L, (Paterna, Valencia), using PacBio technology. Between 5 and 10 g of the DNA purified by CICs were used. Basically, a genomic library was made in a sequencing vector with the DNA of each of the genotypes, with 0kb inserts. 24,627 and 3,731 readings were carried out for the genomes of HearSPI B and HearLB6, respectively. Finally, the assembly of all the information was carried out, the use of the HGAP v2.0.2 program being necessary.
  • HearSPI is the isolate with the best insecticidal characteristics against larvae of H. arm ⁇ gera in Spain (Arrizubieta et al., 2014).
  • HearLBI the following three genotypes from infected larvae collected in Lebrija were selected: HearLBI, because it is one of the most virulent and one of the most productive in terms of the number of occlusion bodies produced in infected insects: HearLB3 because it is one of the fastest; and HearLB6 for being the most virulent. In total, eight genotype mixtures were made.
  • HearSPI A HearSP B in a 1: 1 ratio, referred to herein as HearSP1A: SP1 B (1: 1) and HearSP1A: HearSP1 B in a 1: 2 ratio, to which it will be made reference as HearSPI A: SP1 B (1: 2).
  • HearSPI A SP1 B (1: 2).
  • four mixtures were also constructed that contained only Lebrija genotypes such as
  • HearLBI HearLB3 in a 1: 1 ratio, referred to as HearLBI: LB3,
  • HearLB3 HearLB6 in a 1: 1 ratio as well and referred to as
  • HearLB3 LB6, HearLBI: HearLB3: HearLB8 in a 1: 1: 1 ratio and to which you will refer HearLB1: LB3: LB6 and finally a mixture was also made with the six Lebrija genotypes in the proportions found in the population, which was called HearLBmix.
  • HearSPI B HearLB1 mixture contained the HearSPI B and HearLBI genotype in a 1: 1 ratio, referred to as HearSPI B: LB1
  • the HearSPI B HearLB6 mixture containing the HearSPI B and HaerLB6 genotype as well. in a 1: 1 ratio, and the one referred to as HearSPI B: LB6.
  • the concentrations of the different genotypes were homogenized, diluting them to the same concentration of 10 9 occlusion bodies / ml and subsequently mixing the same volume of each of them, so that ratios were in all cases 1: 1, except in the case of the HearSPI A: SP1 B (1: 2) mixture, in which twice the volume of HearSPI B was mixed than that of HearSPI A.
  • the bodies of occlusion contain virions of the same genotype.
  • arm ⁇ gera from the fourth stage were infected orally with the different mixtures of occlusion bodies at a concentration of 10 6 occlusion bodies / mi (mixtures of occlusion bodies produced before were diluted by a factor of one thousand (10 3 ) before infecting the larvae).
  • ODVs virions
  • HearSP A SP1 B (1: 1)
  • HearSP1A SP1 B (1: 2)
  • HearLBI LB3 (1: 1)
  • HearLB3 LB6 (1: 1)
  • HearLBI LB3: LB6 (1: 1: 1)
  • HearLBmix six genotypes in their natural ratio, HearLB1-6
  • HearSP1 B LB1 (1: 1)
  • HearSPI B LB6 (1: 1).
  • the viral DNA obtained therefrom was subjected to PCR amplification using primer pairs F-hr1 / R-br1 and F -hr5- / R-hr5, 20.5 ⁇ m was mixed for the PCR! H 2 0, 2.5 ⁇ of polymerase buffer (10x), 0.75 ⁇ of magnesium chloride (50 rrM gCI 2 ), 0.25 ⁇ ! of dNTPs (phosphated nucieotides), 0.25 ⁇ of the respective primers (R-hr1 / F-hr1 or F-hr5 / R-hr5), 0.25 ⁇ of Taq polymerase and 0.25 ⁇ of extracted DNA.
  • the reaction conditions were from a period of denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles that include denaturation at 94 ° C for 1 minute, alignment that occurs at 60 ° C for 1 minute and elongation at 72 ° C for 3 minutes, finally followed by 10 minutes at 72 ° C to finish elongation.
  • HearSNPV genotypes purified from the HearSPI isolate (HearSPIA and HearSPI B) and those from Lebrija (Sevilla) (HearLBI, HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS and HearLB6), as well as co-occluded mixtures HearSP1A: SP1 B (1: 1), HearSP1A: SP1 B (1: 2), HearLBI: LB3, HearLBS: LB6, HearLBI: LB3: LB6, HearLBmix, HearSPI B: LB1 and HearSPI B: LB8, was compared with the of the wild isolate HearSPI, previously selected as the isolate of the Iberian Peninsula with the best insecticidal characteristics (Arrizubieta et al., 2014).
  • the concentration-mortality curves (lethal concentration 50, CL 50 ), the average mortality time (TMM) and the viral productivity (number of occlusion bodies produced by a single larva, occlusion bodies / larva) were determined by per os (orally), carried out using the method of gout feeding, described above.
  • the mean mortality time (TM) of the individual genotypes, of the different genotype mixtures and of the HearSPI isolate was determined by bioassay on larvae of H. arm ⁇ gera of second stage.
  • the larvae were inoculated by ingestion with the LC 90 (concentration that kills approximately 90% of the inoculated larvae) of each virus calculated in the pathogenicity assays described above (2.0 x 10 5 , 1, 8 x 10 5 , 9 , 9 x 10 4 , 1, 5 x 10 5 , 1, 5 x 10 5 , 2.5 x 10 5 , 3.5 x 10 5 , 1, 5 x 10 5 , 9.8 x 10 4 , 1, 0 x 10 5 , 1, 5 x 10 5 , 1, 2 x 10 5 , 1, 8 x 10 5 , 9.3 x 10 4 , 1, 2 x 10 5 , 5.8 x 10 4 and 5, 1 x 10 4 occlusion bodies / ml for the HearSPI wild isolate and the
  • a group of larvae treated with the same solution without occlusion bodies was included.
  • the larvae were maintained individually on a diet at 25 ° C and mortality was recorded every 8 hours until all the larvae died or pupated. 24 larvae were infected per treatment and three independent repetitions were performed.
  • the mortality data according to time were subjected to a Weibull survival analysis using the Generalized Linear Interactive Modeling (GLIM) program (Crawley, 1993). The distribution of mortality according to the time of the different isolates was analyzed graphically. By microscopic observation of the dead larvae, those that had died from a disease caused by nucleopoliedrovirus could be identified, and were the ones that were included in the analysis.
  • GLIM Generalized Linear Interactive Modeling
  • occlusion bodies of pure genotypes, mixtures of genotypes and the HearSPI isolate was determined in second stage larvae of H. arm ⁇ gera infected by the method of gout and with the concentrations of occlusion bodies that produce 90 % of mortality (the same concentrations used in the study of the average mortality time). All larvae that died of nucleopoliedrovirus disease were collected and stored at -20 ° C until they were used for the occlusion body count. For this, each larva was homogenized in 100 ⁇ of distilled water and the total yield of occlusion bodies per larva was estimated by a triplicate sample count using an improved Neubauer hemocytometer. The data was normalized by a log transformation and analyzed by an analysis of variance (ANOVA) using the SPSS 15.0 program.
  • ANOVA analysis of variance
  • HearSNPV-SP1 isolate or more briefly HearSPl has been selected in previous studies as the isolate of the Iberian Peninsula with the best insecticidal characteristics against H. arm ⁇ gera (Figueiredo et ai., 1999; Arrizubieta et al., 2014).
  • restriction profiles performed with different endonucleases in these studies showed submolar bands, indicating the presence of different genotypic variants within the wild isolate (Fig, 4, 7, 8).
  • HearSNPV-LB1 HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV-LB4, HearSNPV-LB5 and HearSNPV-LB6 or, in abbreviated form, HearLBI , HearLBS, Hearl_B4, HearLBS and Hearl_B6 (Fig. 7B and 7C).
  • the 6 genotypes were found in different proportions, the HearLBS genotype being the most abundant, since it was isolated in 6 different larvae (representing 35.3% of the total genotypes), followed by HearLBI and HearLB2, which were isolated in 4 larvae (23.5%), and finally the genotypes HearLB4, HearLBS and HearLB6, which were isolated in a single larva each (5.9%),
  • a limit dilution test (EPD) was carried out as described in the material and methods section.
  • EPD a limit dilution test
  • 20 wells were selected with the presence of occlusion bodies in the dilution that produced less than 10% of viral infection (about 1/500 for all isolates).
  • the BVs obtained were multiplied in larva by intrahemoceic injection and the viral DNA of the occlusion bodies obtained with the Bg ⁇ ⁇ and EcoR ⁇ endonucieases as mentioned in the material and methods section was analyzed. All clones / wells obtained from a single isolate had the same restriction profile as the original isolate, from which the clones were obtained, so it follows that each of the 8 isolates is composed of a single genotype.
  • Fig. 7A, 7B and 7C Digestion of the viral DNA of the different genotypes with the restriction endonuclease EcoR ⁇ produces a characteristic and unique profile for each of them (Fig. 7A, 7B and 7C; Table 5), being able to use some of the restriction fragments generated by This enzyme as markers to differentiate them.
  • the EcoRi-B fragment of the HearLB4 genotype (11.0 kb) is larger than in the HearLB2, HearLBS and HearLBo genotypes (10.5 kb), the HearSPIA and HearSPI B genotypes (10, 18 kb) and the genotype HearLBI (10, 15 kb), while not in the HearLBS genotype.
  • the HearLBI genotypes (EcoRI-D), HearSPl A (£ coR ⁇ -D) and HearSPl B (EcoRI-E) present a single fragment common to all three genotypes (9.20 kb), while in HearLB2 (£ coRI-D), HearLB3 (EcoRI-) genotypes D), Hearl_B4 (EcoRI-D), HearLBS (EcoRI-C) and Hearl_B6 (EcoRI-D) said fragment is 9.38 kb.
  • the HearLBS genotype has a unique fragment of 3.10 kb (EcoRI-S), while it does not have a 2.83 kb fragment, present in the rest of the genotypes. No submoiar bands were observed in the restriction profiles of these genotypes after a larval pass and the profiles were maintained along the passes, indicating the stability and purity of the genotypes.
  • restriction profiles of these genotypes are also differentiated by the use of other restriction endonucieases, such as Bgft l (Fig. 7A and 7C).
  • the HearSPl isolate shows several submoial bands around 6.5-7 kb, which are not observed in the profile of the pure HearSPl B genotype.
  • the HearSPl isolate shows an 18.8 kb submoiar band, which does not appear in the profile of the HearSPl B genotype.
  • the absence of such bands in the pure genotypes demonstrates the purity of the same, thus the HearSPl genotype B shows a band of 9.73 kb that is not observed in the profile of the HearSPl isolate
  • the estimated sizes of the restriction fragments generated after digestion of the viral DNA of the different genotypes with the EcoRI enzyme are shown in Table 5.
  • the difference in the number of fragments of the HearSPIA, HearSPl B, HearLBI, HearLBS, HearLB6, HearG4, HearCI, HearNNgl and HearAus genotypes with the HearLB2, HearLB4 and HearLBS genotypes is due to the fact that their genomes are completely sequenced, small fragments are detected that cannot be detected by analyzing band patterns since they are not visible in the restriction profiles (indicated by an asterisk [*] in Table 5).
  • HearLBI, HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS and HearLB6, and HearG4 isolates HearCl, HearNNgl and HearAus obtained by digestion with EcoR! , and total size! Estimated genomes.
  • a more precise differentiation of each genotype is obtained by amplifying regions of the genome characteristic for each of the genotypes using the PCR technique (polymerase chain reaction), using specific primers designed in the zones of variability, followed by a digestion of the fragments amplified by PCR with restriction endonucleases.
  • PCR technique polymerase chain reaction
  • R-hr5 5 ; - GCCCCACCCAAAACATAACG-3 '(SEQ ID NO: 4).
  • the complete sequences of the homologous region 1 (hr1) corresponding to each of the two HearSPI B and HearLB6 genotypes are represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.
  • the complete sequences of the homologous region 5 (hr5) corresponding to each of the two HearSPI B and HearLBo genotypes are represented by SEQ ID NQ: 11 and SEQ ID NQ: 12, respectively.
  • the alignments of these sequences with those of the analogous zones of the genomes of HearG4, HearCI, HearNNgl and HearAus are shown in Figure 9.
  • Table 8 Specific primers designed in hr1 and hr5, nucleotide sequence, size of fragments amplified for each genotype, number of fragments obtained after digesting the fragment amplified by PCR with endonuclease A / del, size of said fragments and number of reference of the sequence of the fragment amplified by PCR.
  • F-hr1 (SEQ ID NO: 1) HearLB6 2.1 17 5 1 .210, 475, 307, 78, 47 6
  • R-hr1 (SEQ ID NO: 2) HearCI 2,252 6
  • F-hr5 (SEQ ID NO: 3) HearLB6 2.330 3 1 .120, 998, 212 8
  • R-hr5 (SEQ ID NO: 4) HearCI 1 .872 4 1 .1 19, 464, 21 1, 78
  • the pathogenicity bioassays showed that the pathogenicity of the HearSPI B genotype is 2.8 times higher than that of the HearSPI wild isolate. However, the HearSPI A genotype has an intermediate pathogenicity, being similar to both the HearSPI wild isolate and the genotype. HearSPI B (Table 7).
  • HearSPI A 2.4 x 1 Q 4 1, 5 0.8 2.7 99.6 to 96.5 102.8 individual HearSPI B 1, 3 x 10 * 2.8 1, 6 4.9 98.3 genotypes to 95.3 101, 4
  • HearSPIA genotypes (5.2 x 10 7 occlusion bodies / larvae) and HearSPI B (5.3 x 10 7 occlusion bodies / larvae) are as productive as the HearSPI isolate (7.3 x 10 7 bodies of occlusion / larva), in larvae inoculated in the second stage of H. arm ⁇ gera (Fig. 10).
  • the pure HearSPI B genotype has better insecticidal qualities since its pathogenicity is greater than that of the wild isolate or the pure HearSPIA genotype, while its virulence (TMM) and occlusion body production are not inferior to those of the other isolates / genotypes.
  • the biological activity of the individual genotypes was determined individually and compared with the HearSPI isolate (Figueiredo et al ,, 1999; Arrizubieta et al ,, 2014) in terms of pathogenicity, virulence and productivity as described in section 3.1.
  • Table 8 shows the values of the CL 50 and the relative potency of the HearSPI isolate and of the individual genotypes HearLBI, HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS and HearLB6. These values allow us to observe how the fiducial limits at 95% of the relative potencies calculated for LC 50 overlap widely in all treatments, indicating that the pathogenicity is similar for pure genotypes and the HearSP isolate.
  • Genotypes HearLB2 1, 8 x 10 4 0.8 0.4 1, 4 108.0 to 106.4 109.7 nd HearLBS 1, 5 x 10 4 0.8 0.4 1, 5 1 16.3 be 1 14.5 118.2
  • HearLBI, HearLB2, HearLBS and HearLB6 genotypes were significantly faster to kill the second-stage larvae of, arm ⁇ gera than the rest of genotypes and the isolated HearSP (Table 8),
  • HearLBI genotype is the most productive (5.3 x 10 8 occlusion / larvae bodies), although it does not show significant differences with the HearLB4 genotype (4.2 x 10 8 occlusion / larvae bodies).
  • the HearLBI, HearLB4 and HearLBS genotypes are more productive than the HearSPI isolate in H, second-stage, larval armory.
  • HearSPI A SP1 B in a 1: 1 ratio.
  • the objective of this mixture is to increase the pathogenicity since the HearSPI B genotype is more pathogenic than HearSPI, and in this mixture it is found in a greater proportion than in the wild HearSPI isolate ( natural ratio 2: 1).
  • - HearLBI LB3 in a 1: 1 ratio.
  • the HearLBI genotype is one of the fastest and is also among the most productive.
  • the HearLBS genotype is among the most productive, because it is the slowest.
  • the objective of this mixture is to maintain the virulence of the HearLBI genotype and the productivity of both.
  • Genotype HearLB6 is one of the fastest and least productive genotypes, while HearLB3 is among the most productive. In this case, it is intended to maintain the virulence of HearLB6 and the productivity of HearLB3.
  • HearLB1-6 HearLB1-6 in a 4: 4: 6: 1: 1: 1 ratio.
  • This mixture includes the six Lebrija genotypes in the proportion in which they were isolated. The fact that each of the genotypes has been isolated in a proportion after an epizootic may have some biological significance.
  • HearSP1B LB1 in a 1: 1 ratio. This mixture could maintain the pathogenicity of the HearSPIB genotype and the virulence of HearLBI, and increase productivity, since HearLBI is one of the most productive genotypes.
  • HearSPIB LB8 in a 1: 1 ratio. In this case it is intended to maintain the pathogenicity of HearSPIB and the virulence of HearLB8.
  • the insecticidal activity of the different co-ociuid mixtures was compared in terms of pathogenicity, virulence and productivity as described in section 3.1. Individual genotypes HearSPIA, HearSPIB, HearLBI, HearLB3 and HearLB8 were included as a reference.
  • Table 9 Relative insecticidal activity of mixtures of occlusion bodies HearSP1A: SP1B (1: 1), HearSP1A: SP1B (1: 2), HearLBI: LB3, HearLB3: LB6, HearLBI: LB3: LB6, HearLBmix, HearSPIB: LB1 and HearSPIB: LB6, and of the individual genotypes HearSPIA, HearSPIB, HearLBI, HearLBS and HearLB6.
  • HearLB3 LB6 2.1 X 10 4 0.8 0.5 1, 2 114.1 b 112.8 115.5
  • HearSP1 B LB1 9.8 x 0 3 1, 6 1, 1 2.4 112.8 b 110.6 115.3
  • HearSP1 B LB6 5.7 x 10 3 2.8 1, 8 4.3 106.5 111, 1 ab
  • Table 9 shows the values of LC 50 , the relative potency of co-occluded mixtures and individual genotypes (with reference to that of HearSP A), as well as the average mortality time.
  • the mixture of HearSP1 B: Heari_B6 genotypes (5.7 x 10 3 occlusion bodies / mi) turns out to be the most pathogenic, between 1, 7 and 3.7 times more pathogenic than the individual genotypes and the rest of the mixtures.
  • this mixture with a TMM of 108.8 hours, is as virulent as the fastest genotypes killing the larvae, such as HearSPIA, HearSPI B and HearLB8. Analyzing the data provided in Table 9, it is concluded that it is not expected that one or the other mixture is more or less pathogenic, since there is no standard or standard that a priori predicts which of all the mixtures is the most potent.
  • the productivity bioassays showed that the HearLBI and HearLBS genotypes and the co-occluded HearLBI: LB3 and HearLBI: LB3: LB6 mixtures were the most productive (4.9 x 0 8 , 5.7 x 0 8 , 5.7 x 10 8 and 4.0 x 10 8 occlusion bodies / larva, respectively) (Tukey, P ⁇ 0.05), followed by the HearLB6 genotype and the HearSP1A co-occluded mixtures: SP1 B (1: 2), HearLB3: LB6 , HearLBmix, HearSP1 B: LB1 and HearSP1 B: LB6 (3.4 x 10 8 , 2.5 x 10 8 , 3.7 x 10 8 , 2.2 x 0 8 , 2.5 x 10 8 and 1, 6 x 10 8 occlusion bodies / larva, respectively).
  • the HearSPIA and HearSPI B genotypes and the HearSP1A: SP1 B (1: 1) mix were the least productive, with a viral productivity of 6.3 x 10 7 , 1, 4 x 10 8 and 9.3 x 10 7 occlusion bodies / larva, respectively (Tukey, P ⁇ 0.05) (Fig. 12).
  • HearSPI B: LB6 The mixture of co-occluded genotypes HearSPI B: LB6 is more pathogenic than the rest of pure genotypes and mixtures and, in addition, is as virulent as the faster genotypes. It is anticipated that these characteristics would allow the rapid suppression of pest populations in the field using the minimum amount of product, lowering crop production costs. For these reasons, we selected the HearSPI B: LB6 mixture as the active material of a new bioinseticide for the control of H. arm ⁇ gera. Therefore, the Mass production and efficiency tests described below have been carried out with said mixture.
  • the percentage of mortality due to nucleopoüedrovirus obtained in individualized arvas was greater than 90%; however, in containers of higher densities, the 50% mortality, because the diseased larvae were cannibalized before their death (Fig, 13).
  • each stage was infected with three different concentrations of the virus, corresponding to the CL 80 (1.5 x 10 5 , 4.8 x 10 s and 5.5 x 10 6 occlusion bodies / ml, for stages L 3 , L and L 5 , respectively), CL 90 (6, 1 x 10 5 , 2.4 x 10 6 and 2.5 x 10 7 occlusion bodies / mi, for stages L 3 , L 4 and L 5 , respectively) and CL 9S (1, 9 x 10 6 , 9, 1 x 10 6 and 1.5 x 10 8 occlusion bodies / ml, for stages L 3 , L 4 and L 5 , respectively); these concentrations were previously determined in preliminary bioassays.
  • the larvae were inoculated individually according to the drop method described by Hughes and Wood (1981) and deposited in individual cups to avoid cannibalism with an artificial diet until they died from viruses or reach pupal status.
  • the occlusion bodies produced by each dead larva were extracted, purified and titrated as indicated above. 24 larvae were inoculated per treatment and three repetitions were performed. The data obtained were analyzed by ANOVA analysis and Tukey Test with the statistical program SPSS 15.0.
  • the larvae produced significantly greater amounts of occlusion bodies as their age increased when they were inoculated (F 17i36 14.25; P ⁇ 0.05) (Fig. 15A).
  • the larvae inoculated one day after moving to L 4 and L 5 and the newly molted L 5 produced significantly more occlusion bodies than the rest of the larvae (between 5.6 and 9, 1 x 10 9 bodies of occlusion / larva) (Tukey, P ⁇ 0.05).
  • the newly inoculated L 5 larvae with the CL 95 produced 6.9 x 10 11 occlusion bodies / 100 inoculated larvae, compared to 1, 6 x 10 11 - 4.2 x 10 1 1 occlusion bodies / 100 inoculated larvae a day after moving to L 5 .
  • the optimal stage for the production of the HearSP1 B is L 5 by inoculating them recently molted with the CL 9S (1.5 x 10 8 occlusion bodies / mi). This treatment produces a mortality close to 100% and is the treatment that reaches a higher productivity (6.9 x 10 11 occlusion bodies / 100 inoculated larvae).
  • the incubation temperature may influence larval development and therefore, viral productivity (Subramanian et al., 2006). Therefore, a study was carried out to determine the optimum temperature for the production of HearSNPV.
  • Freshly molted L 5 larvae were inoculated with LC 95 (conditions selected in section 4.2) and incubated at 23, 26 and 30 ° C. Mortality was recorded every 8 hours to determine the larval mortality time as a function of temperature and the bodies were collected individually to determine the production of occlusion bodies. 24 larvae were infected per treatment and five repetitions were performed. The production of occlusion / larval bodies and the T were calculated as described above. There were no significant differences in productivity between the larvae incubated at different temperatures (F 2 , 12 0.30; P> 0.05) (Fig. 16). However, at 30 ° C the larvae die between 13 and 34 hours faster than at 28 ° C and 23 ° C, respectively (Table 10). Therefore, the optimum temperature for the production of HearSNPV is 30 ° C, since it allows to obtain the same amount of occlusion bodies faster than the other incubation temperatures.
  • Table 10 Average mortality time (MMR), expressed in hours after infection, of larvae L 5 of H. arm ⁇ gera infected with GL 95 and incubated at 23, 28 and 30 ° C.
  • HearSP1 B LB6 co-ociuide mixture for the control of H. arm ⁇ gera
  • a test was carried out on tomato plants treated and maintained in laboratory conditions.
  • the tomato plants were treated by spraying with an aqueous suspension containing the co-occluded mixture HearSP1 B: LB6 at different concentrations (10 9 , 10 10 and 10 11 occlusion bodies / liter) together with an agricultural wetting agent (Agral®, Syngenta) ai 0.2% (vol./vol.).
  • an agricultural wetting agent Agral®, Syngenta
  • ai 0.2% vol./vol.
  • the plants were allowed to dry and placed in 50 ml cups with Hoagland nutrient solution in glass containers of 10 liters in volume and infested with 150 larvae of H. second-stage H. arm ⁇ gera (L 2 ).
  • the plants were maintained at 25 ⁇ 1 ° C, 70 ⁇ 5% relative humidity and photoperiod of 16: 8 hours light: dark.
  • the evaluation of the effectiveness of the treatment was determined by quantifying the percentage of mortality. For this, 15 larvae were collected from each of the treatments on days 1, 3 and 5 after treatment. These larvae were deposited individually in vessels with artificial diet and mortality was recorded 7 days after being collected from the plants.
  • the concentration of 1x10 10 occlusion bodies / liter is the minimum concentration that produces 100% mortalities every day of collection. Therefore, this concentration is selected as the optimum for the control of H. arm ⁇ gera larvae in tomato crops under laboratory conditions.
  • HearSP1 B LB6 to protect tomato cultivation in greenhouse conditions against H. arm ⁇ gera
  • trials were conducted in an experimental greenhouse of the Higher Institute of Agronomy (Technical University of Lisbon).
  • the effectiveness of the HearSP1 B: LB6 coocluid mixture was evaluated at a concentration of 1x10 13 occlusion bodies / Ha (equivalent to 10 10 occlusion bodies / liter, when about 1,000 were used liters / Ha).
  • the efficacy of HearSP1 B: LB6 was compared with that of:
  • a biological insecticide based on the entomopathogenic bacterium Bacii ⁇ us thuringiensis aizawa ⁇ (Turex®, from Certis, Elche, Spain, containing B, 50% thuringiensis in the form of wettable powder).
  • This bioinsecticide is usually used at a concentration of 1-2 kg / Ha, 1.5 kg / Ha (using 1,000 liters / Ha) being used in this case,
  • a biological insecticide based on spinosad a product of two spinosin toxins, which are obtained naturally by fermentation of the bacterium Saccharopoiyspora spinosa (Spintor 480SC®, Dow AgroSciences, Madrid, Spain, containing 48% weight / volume Spinosad ).
  • Said insecticide is usually used at a concentration of 250 ml / Ha (using 1,000 liters / Ha).
  • the percentage of damaged fruits was determined 10 days after the application of the treatment.
  • the percentage of larval survival due to treatment was also determined.
  • the number of larvae that were alive on each plant were counted 10 days after the application of! treatment.
  • the data obtained were analyzed by ANOVA analysis and Tukey Test with e! SPSS 15.0 statistical program.
  • the relationship between mortality and the amount of viable insecticide was obtained by calibration of! bioassay
  • the calibration curves of the three insecticides were obtained by mixing leaves collected before treatment and therefore not infected with artificial diet, and with five known and different concentrations of insecticides. 50 larvae were used per concentration.
  • the amount of persistent insecticide in the leaves was estimated by comparing the percentage of mortality obtained in the different treatments with the calibration curves.
  • the amount of insecticide data obtained was analyzed by ANOVA and Tukey Test with e! SPSS 15.0 statistical program.
  • a biological insecticide based on two spinosin toxins which are obtained naturally by fermentation of a soil organism, the bacterium Saccharopoiyspora spinosa (Spintor 480SC®, Dow AgroSciences, Madrid, Spain, which contains 48% weight / volume Spinosad ). It is usually used at a concentration of 250 ml / Ha (diluting 250 ml in 1 000 liters, when 1 000 liter / Ha is used).
  • the trial consisted of 48 plots (1.5 m x 4 m), each of which was composed of approximately 30 plants.
  • the design was random blocks.
  • Each of the blocks consisted of two rows with 6 elementary plots and half of the plots of each block the different treatments were applied three times while the other half five times, making a total of 4 repetitions for 3 and 5 applications. All applications were made 15 days apart.
  • the central plants were observed to determine the percentage of damaged fruits, the persistence of the different treatments, and the yield of each plot.
  • the percentage of damaged fruits was determined, with both fresh and healed damage, every 3 or 4 days, during the entire trial period.
  • the data obtained were grouped by biweekly means and analyzed by ANOVA analysis and Tukey Test with the statistical program SYSTAT (1990).
  • Figure 22 shows the percentage of fresh and scarred damaged fruits in each of the fortnights for each treatment.
  • the second and third fortnight in the control plots there was a percentage of damaged fruits both fresh and healed greater than in the plots treated with the different insecticides (Tukey, P ⁇ 0.05) (Fig. 22B and 22C).
  • the percentage of damaged scarred fruits was also higher in the control plots (Tukey, P ⁇ 0.05) but there were no differences in the percentage of fruits with fresh damage ( P> 0.05) (Fig. 22D).
  • each plot was determined.
  • the fruits of the central meter of each plot were harvested and separated into green and red.
  • the green fruits separated into healthy and chopped, and the red ones into healthy, chopped, healed and chopped.
  • the weighing of each of the groups was carried out.
  • the data obtained were analyzed by ANOVA and Tukey Test with the statistical program SYSTAT.
  • the quality controls of the canning companies reject items of tomatoes in which less than 80% of the fruits are ripe, and in which more than 5% of the ripe tomatoes are damaged. Green fruits are discarded before reaching the canning.
  • the amount of persistent insecticide in the leaves was estimated by comparing the percentage of mortality obtained in the different treatments with the calibration curves.
  • the data on the amount of insecticide obtained were analyzed by ANOVA and Tukey Test with the statistical program SPSS 15.0 In order to be able to compare the persistence of the different treatments in the tomato leaves outdoors, the percentage of residual insecticidal activity of each of the treatments about one hour after application.
  • the two genotypes were deposited by one of the inventors, Prof. Dr. Primitivo Caballero (Institute of Agrobiotechnology and Natural Resources, Public University of Navarra, Campus of Arrosad ⁇ a, Mutilva Baja, E-31006, Pamplona, Navarra, Spain), as an employee of the first applicant, on behalf and representation of the three applicants (Public University of Navarra, Higher Council for Scientific Research, Institute of Ecology AC).
  • Caballero P., Williams, T., López-Ferber, M., 2001. Structure and classification of ios bacuiovirus, pp. 15-46. In: Caballero, P., Williams, T., López-Ferber, M. (Eds.). Baculoviruses and their applications as bioinsecticides in the biological control of pests. Phytoma-Spain, Valencia, Spain.
  • Granados R., Fu, Y., Corsaro, B., Hughes, P., 2001. Enhancement of Bacii ⁇ us thuringiensis toxicity to lepidopterous species with the enhancin from Trichopiusia ni granulovirus. Biological Control 20, 153-159.
  • Sys ⁇ a ⁇ the system for sta ⁇ istics. Systat incorporation, Evaston, Illinois.
  • Torres-Vila LM, Rodr ⁇ guez-Molina, MC, Lacasa-Plasencia, A., 2003. Impact of Helicoverpa larval density and crop phenoiogy on yieid and quality losses in processing tomato: developing fruit count-based damage thresholds for IPM decision- making. Crop Protection 22, 521-532.

Abstract

Se describen dos nuevos genotipos del nucieopoiiedrovirus simple de Helicoverpa armígera, HearSNPV, HearSNPV-SP1 B y HearSNPV-LB6, cada uno procedente de mezclas de genotipos obtenidas de localizaciones y cultivos diferentes. Cada uno de ellos tiene una actividad insecticida específica frente a larvas de H. armígera comparable a la de los insecticidas comerciales habituales. Además, la mezcla de los dos genotipos, particularmente en proporción 1 : 1 con viriones co-ocluidos de genotipos mezclados, es capaz de controlar las plagas de H. armígera en cultivo de tomate, siendo tan eficaz como los insecticidas utilizados habituaimente, químicos o biológicos. Su uso como bioinsecticida representa una tecnología segura para los vertebrados, por ser específico de artrópodos. Además puede producirse con facilidad y buen rendimiento por inoculación oral de larvas de H. armígera con cuerpos de oclusión de HearSNPV.

Description

DESCRIPCIÓN
Título de la invención
Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Heücoverpa armígera (HearSNPV), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico
Campo de la invención
La invención se adscribe al sector técnico de los plaguicidas biológicos de aplicación al control de plagas de insectos. Concretamente, la invención se refiere a dos nuevos genotipos de un nucleopoliedrovirus que es capaz de infectar a larvas del iepidóptero Heücoverpa armígera (Hübner, 1809), a composiciones que comprendan uno o varios de ios nuevos genotipos, a un procedimiento para su producción y su uso para el control de plagas de! mencionado insecto.
Antecedentes de la invención
En España el cultivo del tomate ocupa 59.300 hectáreas, con una producción mayor de 4,3 millones de toneladas ai año, es el cuarto país productor de tomate, sólo por detrás de Estados Unidos (California), China e Italia
(http://wvvw.magrama.gob.es/estadistica/pags/anuario/2011/AEm201 1_13_06_27_01.pdf). La mayor parte de! tomate se cultiva en Extremadura (73%), Andalucía (13%) y valle del Ebro (10%) (http://www.navarraagraria.com/n184/artoma11.pdf). En Portugal, el cultivo de tomate también ocupa un lugar importante, con 15.300 hectáreas y una producción de más de 1 , 1 millones de toneladas
(http://www.ine.pt/ine__novidades/Estatisticas__Agricolas_2011/index.html#). Entre las plagas que afectan ai cultivo del tomate, la más importante es el taladro del tomate, Heücoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae) (Torres-Viia et al., 2003). A escala mundial, pocas plagas causan tantas pérdidas económicas como el noctúido H. armígera (Cunningham et al., 1999; Reed y Pawar, 1982). En España H. armígera ha sido una de las plagas clave en cultivos extensivos como el algodón y el maíz, pero desde hace algo más de una década está cobrando igual grado de importancia en ios invernaderos hortícolas del Levante español, desde donde se ha extendido al resto de las regiones españolas y a Portugal (Torres- Vila et al., 2003). Actualmente está considerada como la especie fitófaga más problemática en gran parte de los cultivos de tomate ai aire libre de la región mediterránea (Torres-Vila et al., 2003). Las larvas pueden atacar ai cultivo en cualquier estado fenoiógico, sin embargo, el periodo preferido por las hembras para ovipositar es el de la floración. Su preferencia por las partes de la planta con alta concentración en nitrógeno, como las estructuras reproductivas (flor y fruto) y los puntos de crecimiento, hace que su acción influya de forma muy directa en
l !a cosecha. Además, es una especie muy polífaga, y posee una gran movilidad, alia fecundidad y mulíivolíismo, por lo que sus niveles de población pueden variar rápidamente en el espacio y en el tiempo. Los controles de calidad de las empresas conserveras de tomate establecen el límite de daños entre el 2 y el 5% de los tomates cosechados. Si hay larvas presentes, este límite se reduce al 0-2% (Torres-Vila et ai., 2003). Estos reducidos límites de calidad ponen de manifiesto la necesidad de un método de control eficaz contra la plaga H. armígera.
El control de H. armígera se realiza habitualmente mediante la aplicación de insecticidas químicos (Torres-Vila et ai., 2003). Sin embargo, el uso indiscriminado de los insecticidas de síntesis ha acarreado diversos problemas, como el incremento de los costes de producción, aparición de resistencias a distintas materias activas, reducción de la fauna útil, disminución de la calidad por el incremento de los residuos químicos en frutos y derivados (Torres-Vila et al., 2000). Estos hechos han favorecido la búsqueda de otros métodos de control, entre ellos virus y otros microorganismos entomopatógenos ( oscardi, 1999).
La familia Baculoviridae (baculovirus) es la más ampliamente estudiada de todas las que afectan a insectos por su utilidad para el hombre, ya que presentan características muy deseables como bioinsecticidas: elevada patogenicidad, compatibilidad con ios enemigos naturales de las plagas, alta especificidad (infectan específicamente a artrópodos) (Groner, 1986), persistencia duradera en lugares protegidos de la luz ultravioleta, elevada transmisión horizontal y, por lo tanto, capacidad para originar epizootias (Caballero et al., 1992; Gelernter y Federici, 1986). Además se pueden formular de igual manera que ios insecticidas químicos de síntesis, son perfectamente compatibles con éstos y pueden ser aplicados con equipos convencionales (Cherry y Williams, 2001). Se han recogido aislados de baculovirus en distintos lugares del mundo, los cuales han sido caracterizados a nivel biológico y bioquímico (Gelernter y Federici, 1986; Caballero et al., 1992; Hará et al., 1995). Además, algunos de ellos se encuentran actualmente registrados como insecticidas en varias partes del mundo y se utilizan en el control de plagas (Moscardi, 1999).
Antiguamente los baculovirus se clasificaban en base a la morfología de los cuerpos de oclusión virales (OBs por sus siglas en inglés), comprendiendo dos géneros: Nucleopolyhedrovírus, en ios que los cuerpos de oclusión están formados por poiiedrina, con forma de poliedro irregular, y Granuíovirus (GV), en los que los cuerpos de oclusión están formados por granulina, con forma de gránulo (Theilmann et al., 2005). Sin embargo, una clasificación más actual, basada en la filogenia (homología a nivel genómico), divide la familia Baculoviridae en cuatros géneros: Alphabaculovírus (ios nucleopolíedrovirus [NPV] específicos de lepidópteros), Betabaculovírus (GV específicos de lepidópteros), Deitabacuíovirus (NPV específicos de dípteros) y Gammabacuíovirus (NPV específicos de himenópteros) (Jehle et a!., 2006).
Los baculovirus poseen un genoma circular de ADN de doble cadena envuelto por una cápsida de naturaleza proteica, formando la nucleocápsida, que a su vez queda rodeada por una envuelta trilaminar compuesta por una capa de proteínas entre dos capas de lípidos, la cual es adquirida durante la replicación del virus, constituyendo el virión (Caballero et al., 2001). Dicha membrana lipoproteica puede ser adquirida de dos maneras diferentes, constituyendo a su vez dos tipos de viriones. Sí las nucleocápsidas permanecen en la misma célula en la que han sido formadas adquieren una membrana sintetizada de novo, dando lugar a los viriones derivados de cuerpos de oclusión (occlusion derived virus, ODV), los cuáles quedan después envueltos en una matriz formada por una única proteína dando lugar al cuerpo de oclusión (occlusion body, OB). Sin embargo, otras nucleocápsidas, una vez han sido sintetizadas, se mueven y abandonan la célula huésped, adquiriendo la membrana a partir de la membrana del citoplasma de la célula huésped cuando la atraviesa por puntos concretos donde se encuentra insertada una giicoproteina codificada por el virus (GP84 o proteína F, dependiendo del virus). A estos viriones se les denomina viriones brotados (budded virus, BV) y se encuentran libres en la cavidad hemocélica del huésped, siendo los responsables de propagar la infección a las células de distintos tejidos. En esta fase todos los baculovirus sintetizan grandes cantidades de poliedrina (en el caso de ios nucleopoliedrovirus, NPVs) o granuiina (en el caso de ios granulovírus, GVs), las cuales cristalizan formando una matriz o cuerpo de oclusión (OB) con forma de poliedro irregular (poliedrina) o de gránulo (granuiina). Por esa razón, a los OB de poliedrina se les conoce también como poliedros y a los de granuiina se les conoce también como gránulos. Ai final del proceso infeccioso, que se completa entre tres y seis días, la larva muere conteniendo en su cavidad hemocélica grandes cantidades de cuerpos de oclusión que son fácilmente observables al microscopio óptico. Como consecuencia del proceso infeccioso, el tegumento de la larva se degrada liberando millones de cuerpos de oclusión que contaminan el follaje de las plantas, los cuales constituyen el inoculo que sirve para dar origen a un nuevo proceso infeccioso en otros huéspedes susceptibles (Caballero et al., 2001).
Por tanto, los baculovirus presentan dos tipos de viriones o partículas víricas infectivas que son morfológicamente y funcionalmente diferentes. Los ODVs están presentes en todos ios baculovirus conocidos, y son las partículas infecciosas responsables de la infección primaria en las células epiteliales del mesenterón (tubo digestivo) y por tanto, responsables de la transmisión horizontal del virus entre los individuos susceptibles. Los BVs por su parte contienen siempre una sola nucleocápsida y son, en todos los casos, morfológicamente iguales (Fig. 1A). Estos BVs son las partículas infecciosas responsables de diseminar la infección entre los órganos y tejidos de la cavidad hemocéiica del huésped que son susceptibles, dando lugar a la infección secundaria, así como en los cultivos celulares in viiro (Caballero et ai., 2001). En los cuerpos de oclusión de los NPVs quedan incluidos varios ODVs mientras que en el gránulo o GVs solamente uno. Morfológicamente, los ODVs de los nucleopoliedrovirus pueden ser de dos tipos distintos: ios denominados simples (dando lugar a los nucleopliedrovirus de tipo simple o single nucleopolyhedrovirus, SNPV) que contienen una única nucleocápsida por virión, o de tipo múltiple (nucleopoliedrovirus de tipo múltiple o múltiple nucleopolyhedrovirus, MNPV) que contienen de una hasta varias nucleocápsidas por virión (Fig. 1 B).
Los cuerpos de oclusión, ya sean poliedros o granulos, proporcionan protección a ios viriones preservando ia capacidad infecciosa de estos virus fuera del huésped, ya que son capaces de persistir en el medio durante largos periodos en lugares protegidos de la luz ultravioleta, son insolubles en agua, resistentes a la putrefacción y desintegración por agentes químicos y también a tratamientos físicos como la congelación, ia desecación o liofilización. En cambio, los cuerpos de oclusión son solubles en soluciones alcalinas, como las que se producen en el tubo digestivo de algunos insectos (pH 9-11), lo que permite ia liberación de los ODVs para que comience la infección (Caballero et al., 2001).
Los bacuiovirus se han aislado de más de 500 especies de insectos, principalmente del orden Lepidoptera, entre las que se encuentran muchas de las plagas agrícolas más importantes. Además de una importante diversidad interespecífica, los bacuiovirus presentan una gran diversidad intraespecífica, la cual se ha demostrado tanto en ia caracterización de diferentes aislados geográficos del mismo virus como dentro de un mismo aislado, ya que los aislados silvestres comprenden frecuentemente distintas variantes genotipicas. Para diferenciar y caracterizar tanto aislados como genotipos presentes dentro de un mismo aislado se recurre habitualmente al análisis del ADN viral con enzimas de restricción, ya que proporciona perfiles característicos de cada aislado o genotipo (Erlandson et ai., 2007; Figueiredo et al., 1999; Harrison y Bonning, 1999).
Estas diferencias genómicas entre los distintos aislados y genotipos de un mismo virus pueden dan lugar a diferencias significativas en sus características insecticidas, como la patogenicidad, que se define como ia cantidad de inoculo necesario para matar a un porcentaje de ia población, la virulencia, o velocidad con ia que se mata al insecto, y la productividad viral. Otras características fenotípicas que se pueden ver afectadas son el espectro de huésped, el tamaño de los cuerpos de oclusión y la licuefacción de las larvas (Cory et ai., 2005; Harrison et al., 2012). Conocer ia diversidad intrapoblacional de ios bacuiovirus tiene, por tanto, especial importancia a la hora de diseñar bioinsecticidas, cuyas materias activas deberán incluir las cepas o genotipos con mayor potencial insecticida. Por otro lado, se sabe que poblaciones locales de insectos son más susceptibles a aislados nativos del virus (Barrera et al. , 201 1 ; Berna! et a!., 2013a), por lo que sería conveniente seleccionar un aislado del virus con el mismo origen geográfico que las poblaciones a ¡as que se desea combatir.
De forma natural ¡as larvas de H. armígera se ven infectadas por un nucleopoliedrovirus conocido de forma abreviada como HearSNPV (Helicoverpa armígera singie nucleopolyhedrovirus, género Alphabaculovirus). Se trata de un nucleopoliedrovirus de tipo simple (SNPV) que infecta también larvas de otros miembros de los géneros Helicoverpa spp. y Helíothis spp., como por ejemplo larvas de Helicoverpa zea. Se han caracterizado aislados de HearSNPV en diferentes regiones del mundo, como China o Kenia (Chen et al., 2001 ; Ogembo et al., 2005). También se han obtenido aislados de este virus en España y Portugal (Figueiredo et al., 1999, 2009), donde provoca epizootias naturales en poblaciones de H. armígera. Hasta ¡a fecha se han caracterizado varios aislados de este virus siendo ¡os siguientes ¡os más estudiados:
- Dos genotipos puros procedentes de China, cuyos genomas han sido completamente secuenciados, HearSNPV-G4 (Chen et al., 2001) y HearSNPV-C1 (Zhang et al., 2005), a ¡os que se hará referencia a ¡o largo de la presente memoria de forma abreviada como HearG4 y Heard . Guo y colaboradores (2006) compararon ¡a actividad biológica de estos dos genotipos. En términos de ¡a re¡ación concentración/dosis- mortaüdad, HearCI resultó 2,8 veces más patogénico que HearG4 frente a ¡arvas de tercer estadio de una pobiación de H. armígera procedente de China. Además, ¡as ¡arvas infectadas con HearCI murieron 9 horas antes que ¡as infectadas con HearG4. El artículo de Zhang y colaboradores del año 2005 compara ¡os genomas de estos dos genotipos, observando una identidad en ia secuencia de nudeótidos de¡ 98, 1 %. La comparación de estos dos genomas muestra cuatro regiones variabíes entre estos dos genotipos, ¡as regiones homóiogas 1 , 4 y 5 (hr1 , hr4 y hr5) y ¡a región bro-b. Las regiones homologas (hr) son zonas intergénicas que están presentes en muchos de los baculovirus, y se encuentran localizadas múltiples veces a ¡o largo del genoma. Se caracterizan por la presencia de múltiples e imperfectas secuencias repetidas.
En el genoma de HearSNPV aparecen cinco regiones homologas. En la figura 1 del artículo de Chen y colaboradores (2000) aparecen ¡os perfiles de restricción con ¡as endonucleasas de restricción Bam \, Bg/il, EcoRl, Hinólll, Kpnl, Pstl, Sacl y Xhol (Fig. 2 de ¡a presente solicitud). En ¡a Tabla 1 de dicho artículo se muestran ¡os tamaños estimados de ¡os fragmentos de restricción generados por cada una de dichas endonudeasas de restricción
(Tabla 1). Los genomas comp¡etos de HearG4 y de HearCI están accesibles en ¡a base de datos del GenBank con ¡os números de acceso AF271059 y AF303045, respectivamente. Ei genotipo HearG4 se encuentra actualmente comercializado para el control de H. armígera en cultivo de algodón en China (Zhang, 1994).
Tabla 1: Tamaños estimados de ios fragmentos de HearG4 obtenidos por digestión con BamHI, Bgftl, £coR!, HindlU, Kpnl, Pst\, Sac\ y Xho\ y tamaño total estimado del genoma (Chen et al., 2000).
Fragmento BamHl BgiW EcoR\ HindUl Kpnl Psil Sac\ Xho\
A 37,3 24,5 14,1 22,2 55,5 39,0 65,0 36,5
B 31,8 18,5 13,9 16,5 34,2 36,8 22,3 34,6
C 14,4 15,8 9,8 14,7 23,6 32,3 19,3 20,0
D 14,0 14,8 9,1 12,8 9,8 11,8 9,7 11,0
E 12,7 13,7 9,0 1 ,6 6,1 6,1 9,4 10,9
F 7,7 12,1 6,8 10,8 0,9 3,4 4,4 7,0
G 3,9 7,1 6,4 10,2 0,6 4,4
H 3,3 5,9 6,0 10,1 3,5
I 1,9 4,9 6,0 7,3 2,2
J 1,8 4,3 5,8 6,5
K 1,3 3,4 5,6 3,2
L 2,6 4,7 2,7
2,5 4,6 1,5
N 4,5
O 4,4
D r Λ,
Q 3,7
R 3,3
S 3,1
T 1,7
U 1,0
V 0,8
W 0,5
X 0,5
Y 0,5
Total 130,1 130,1 130,1 130,1 130,1 130,1 130,1 130,
- Un aislado procedente de Kenia, HearSNPV-NNg1, al que se hará referencia en la presente memoria como HearNNgl, cuyo genoma también se encuentra completamente secuenciado (Ogembo et aL, 2009). HearNNgI fue seleccionado por Ogembo y colaboradores (2007) como el aislado con las mejores características para ser desarrollado como bioinsecticida frente a larvas de H. armígera en Japón. HearNNgI resultó entre 3,2 y 82,6 veces más patogénico que el resto de aislados estudiados, y 31 1 ,5 veces más patogénico que el aislado chino HearG4, frente a larvas de tercer estadio. Además, el aislado NNg1 mató a las larvas de tercer estadio de H. armígera entre 0,4 y 1 ,8 días antes que el resto de aislados, y 4,3 días antes que el genotipo HearG4. En la figura 1 de dicho artículo se muestran los perfiles de restricción con las endonucleasas fíg/i l y Xba\ de los aislados caracterizados (Fig. 3 de la presente solicitud). En la Tabla 2 del mismo artículo se muestran los tamaños estimados de los fragmentos de restricción de los distintos aislados digeridos con las endonucleasas BgíW , Xba\ y HínóW (Tabla 2).
Tabla 2: Tamaños estimados de los fragmentos de HearNNgI (NNg1 ) y otros aislados procedentes de Sudáfrica (NS2), Kenia (N a1), Zimbabue (NZ3), Tailandia (NT1 ) y China (G4) obtenidos por digestión con fíg/i l, Xba\ y H/ndi l l y tamaño total estimado de los genomas (Ogembo et al. , 2007).
BgíW Xba\
Fragmento NNg1 NS2 NMa1 NZ3 NT1 G4 NNg1 NS2 N a1 NZ3 NT1 G4
A 23,7 25,5 25,5 23,7 23,7 25,5 14,2 14,2 14,2 14,2 14,2 14,2
B 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 13,0 13,0 13,0 13,0 13,0 13,0
C 15,3 15,3 15,3 15,3 15,3 15,3 1 1 ,9 1 1 ,9 1 1 ,9 1 1 ,9 12,4 1 1 ,9
D 15,0 15,0 15,0 15,0 13,3 15,0 10,6 10,6 10,6 10,6 1 1 ,9 10,6
E 13,3 13,3 13,3 13,3 12,4 13,3 9,3 9,3 9,3 9,3 10,6 9,3
F 12,4 12,4 12,4 1 1 ,5 10,7 12,4 9,1 9,1 7,2 9,1 9,3 9,1
G 10,7 10,7 10,7 10,7 9,4 6,9 7,2 7,2 6,2 7,2 9,1 7,2
H 9,4 6,9 6,9 6,9 8,8 5,8 6,2 6,2 6,1 6,2 6,2 6,2 í 4,3 4,3 4,3 4,3 6,9 5,0 6,1 6,1 5,9 6,1 5,9 5,9
J 3,3 3,3 3,3 3,3 4,3 4,3 5,9 5,9 5,7 5,8 5,7 5,8
K 2,7 2,6 2,6 3,2 3,3 3,3 5,7 5,7 5,5 5,7 5,5 5,7
L 2,5 1 ,3 1 ,3 2,6 2,7 2,6 5,5 5,5 5,4 5,5 4,0 5,5
M - - - 1 ,3 2,5 2,5 5,4 5,4 4,8 5,4 3,6 4,0
N 3,4 4,8 4,6 4,8 3,3 3,3
O 3,2 4,6 3,6 3,4 3,2 3,2
P 3,1 4,4 3,2 3,2 2,1 2,5
Q 1 ,9 3,6 1 ,6 1 ,6 1 ,6 2,1 R 1,6 3,1 1,2 1,2 1,2 1,9
S 1,2 1,9 1,1 1,1 1,1 1,6
T 1.1 1,6 1,0 1,0 1,0 1,3
U 1,0 1,2 - - - 1,2
V 1,1 - - - 1,1 w 1,0 - - - -
Tota i 129,3 131,3 129,3 129,8 132 130,6 137,4 126,6 122,1 126,2 124,9 126,6
Tabla 2 Continuación
Figure imgf000009_0001
Por oíro lado, el artículo de Ogembo y colaboradores (2009) compara el genoma de HearNNgl con los genomas de los genotipos chinos HearCI y HearG4, así como con el genoma del nucleopoliedrovirus simple de Heíícoverpa zea (HzSNPV). El genotipo NNg1 muestra las mayores diferencias con los genomas de HearCI , HearG4 y HzSNPV en las regiones homologas (hr) y en los genes bro, al igual que ocurría en la comparación de los genomas de HearCI y HearG4. El genoma completo de HearNNgl está accesible en la base de datos del GenBank con el número de acceso AP0109Q7.
- Un aislado procedente de Australia, HearSNPV-Aus, al que se hará referencia en la presente memoria de la forma abreviada HearAus, cuyo genoma ha sido completamente secuencíado y está disponible en la base de datos del GenBank con el número de acceso JN584482.
- Siete aislados procedentes de la Península Ibérica, cinco españoles, HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7 y HearSPS, y dos portugueses, HearPTI y HearPT2 (Arrizubieta et ai., 2014; Figueiredo et al., 1999, 2009). Figueiredo y colaboradores (1999) seleccionaron el aislado HearSPI como el aislado con las mejores características insecticidas, ya que fue dos veces más patogénico que el aislado HearSP2 frente a larvas de segundo estadio de una población de H. armígera procedente de Portugal. Posteriormente, en un nuevo estudio realizado por Figueiredo y colaboradores (2009) se determinó que los aislados HearSP7, HearPTI y HearPT2 presentaban las características más favorables como bioinsecticidas, pero en este trabajo no se incluyó el aislado HearSPI . En un estudio realizado recientemente en nuestro laboratorio en el que se compararon todos estos aislados de la Península Ibérica, se seleccionó el aislado HearSPI por sus mejores características insecticidas contra H. armígera, ya que aunque presenta la misma patogenicidad que el resto de aislados estudiados, es el más virulento y además se encuentra entre ios más productivos en términos de la cantidad de cuerpos de oclusión producidos en cada insecto infectado (Arrizubieta et ai., 2014). En la figura 1 B del artículo de Figueiredo y colaboradores (2009) aparecen los perfiles de restricción con la endonucleasa Bg/!l de los aislados españoles HearSPI , HearSP2, HearSP3, HearSP4, HearSP7 y HearSPS, y de los aislados portugueses HearPTI y HearPT2 (Fig. 4A de la presente solicitud). La figura 1 del artículo de Arrizubieta y colaboradores (2014) muestra los perfiles de los aislados HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7, HearSPS, HearPT HearPT2 y HearG4 con la endonucleasa EcoR\ (Fig. 4B de la presente solicitud), y en la Tabla 1 de dicho artículo se indican ios tamaños de los fragmentos de restricción (Tabla 3). Tabla 3. Tamaños estimados de los fragmentos de HearSPI, HearSP2, HearSP4, HearSP7, HearSP8, HearPTI, HearPT2 y HearG4, y tamaño rea! de los fragmentos de HearG4 generados in silico (G4*) a partir de la secuencia (AF271059) obtenidos por digestión con EcoR\ y tamaño total estimado de los genomas (Arrizubieta et al., 2014).
Aislac ios He« arSNP
Fragme snto SP1 SP2 SP4 SP7 SP8 PT1 PT2 G4 G4*
A 13,4 13,4 13,4 13,2 13,4 13,4 13,4 14,3 14,13
B 10,7 13,2 10,7 10,0 10,7 10,7 10,7 13,4 13,45
C 9,3 10,7 9,3 9,3 9,0 9,3 9,3 10,1 10,15
D 9,2 9,3 9,2 9,0 8,2 9,0 9,2 9,0 9,05
E 8,2 9,2 8,2 8,2 7,5 8,2 8,2 6,6 6,64
F 7,1 7,1 7,1 7,1 6,3 7,5 7,5 6,4 6,36
G 6,3 6,3 6,3 6,3 6,0 6,3 6,3 6,3 6,29
H 6,0 6,0 6,0 6,0 5,9 6,0 6,0 6,0 5,99
I 5,9 5,9 5,9 5,9 5,8 5,9 5,9 5,8 5,84
J 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,84
K 5,8 5,7 5,8 5,8 5,7 5,8 5,8 5,7 5,67
L 5,7 5,3 5,7 5,7 4,9 5,3 5,7 4,8 4,75
M 5,3 4,9 4,9 4,9 4,6 4,9 5,3 4,6 4,58
N 4,9 4,6 4,6 4,6 4,4 4,6 4,9 4,4 4,42
0 4,6 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,6 4,4 4,40
P 4,4 4,4 4,4 4,4 3,3 4,4 4,4 4,1 4. Ί 4
Q 4,4 3,3 3,3 3,3 3,0 3,3 4,4 3,7 3,68
R 3,3 3,0 3,0 3,0 2,8 3,0 3,3 3,4 3,36
S 3,0 2,8 2,8 2,8 1,7 2,8 3,0 3,0 3,0
T 2,8 1,7 1,7 1,7 1,0 1,7 2,8 2,8 2,83
U 1,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,7 1,7 1,74
V 1,0 1,0 1,0 1,0 0,8 1,0 1,0 1,5 1,48
X 1,0 0,8 0,8 0,8 - 0,8 1,0 1,0 1,00
Y 0,8 - - - - - 0,8 0,8 0,78
7 n *> n 4ñ
a 0,4 0,45 b 0,4 0.41 c 0,3 0,31 d 0, 18 - 0, 18 e 0,02 - 0,02
Total 132,4 129,8 125,3 124,2 1 16,2 125, 1 131 ,0 129,8 131 ,4
La diferencia en el número de fragmentos de ios distintos genotipos con los del genotipo HearG4 generados in siiico se debe a que su genoma se encuentra completamente secuenciado, por lo que se detectan fragmentos de pequeño tamaño que son imposibles de detectar mediante el análisis de patrones de bandas ya que no son visibles en los perfiles REN. En el caso de HearSPI , ios fragmentos de pequeño tamaño fueron detectados mediante amplificación por PCR y secuenciación del fragmento amplificado utilizando primers diseñados en los extremos de los fragmentos clonados (Arrizubieta et al., 2014).
Tras la selección de la materia activa adecuada, antes de comercializar un bioinsecticida es necesario realizar ensayos de campo para comprobar su eficiencia en las condiciones en las que se va a aplicar, ya que su efectividad en campo puede variar respecto a la obtenida en condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, para llevar a cabo dichos ensayos y poder tratar así superficies extensas de cultivo se necesitan conseguir grandes cantidades de cuerpos de oclusión, siendo necesario desarrollar un sistema de producción masiva del virus. Actualmente, la metodología empleada para la producción masiva de la mayoría de los baculovirus es la producción in vivo en huéspedes permisivos (Kalia et al. , 2001 ; Lasa et al., 2007), Esta técnica consiste en alimentar larvas susceptibles con dieta artificial contaminada superficialmente con una suspensión de cuerpos de oclusión. Algunos de los aspectos esenciales de esta metodología, como la dieta artificial de insectos o los métodos de cría masiva deben ser desarrollados específicamente para cada sistema huésped- patógeno (Lasa et al., 2007). Por otro lado, en Estados Unidos se ha desarrollado un sistema de producción de HearSNPV que implica tanto la producción in vivo como in vitro (Patente de EEUU n° US 7521219 B2). Esta técnica consiste en multiplicar primero el virus en larvas de H. armígera, y posteriormente realizar un número limitado de pases seriados en células para conseguir una gran cantidad de cuerpos de oclusión.
Como consecuencia de las cada vez más frecuentes resistencias desarrolladas por las larvas de H. armígera a los insecticidas químicos de síntesis, la cantidad aplicada necesaria para que este tipo de sustancias consiga el efecto deseado se están viendo incrementada progresivamente. En la Península Ibérica, debido a la gran superficie cultivada de tomate, entre otros, este hecho se está convirtiendo en un problema cuyas consecuencias son tremendamente negativas para agricultores, consumidores y el medio ambiente.
La contaminación de ios suelos, acuíferos y demás espacios naturales, el efecto sobre otros organismos vivos, así como el aumento de los costes de producción de los productos agrícolas y la disminución de la calidad de los mismos suponen una seria amenaza para varios sectores estratégicos en la Península Ibérica. Debido a las resistencias desarrolladas por las larvas de H. armígera a ios insecticidas químicos de síntesis, sería interesante disponer de una alternativa con buena capacidad insecticida y que además tuviera un espectro de huéspedes muy reducido, para no perjudicar a los enemigos naturales ni otros organismos beneficiosos, como por ejemplo un agente de control biológico. Dentro de ellos, sería especialmente deseable que fuera un método de control eficiente para la Península Ibérica, y que fuera lo suficientemente potentes para solventar las amenazas y problemas que presentan las plagas de H. armígera en la Península Ibérica. Además de presentar una elevada eficacia para las plagas de la Península Ibérica, sería interesante que su método de producción también lo fuera, para que el coste de su producción y la cantidad de insecticida a aplicar no implicara elevaciones de costes que no lo hicieran competitivo.
La invención proporciona una solución eficaz a ese problema.
Sumario de ¡a invención
La presente invención se basa en la obtención de nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Heíícoverpa armígera, los cuales fueron aislados mediante purificación in víiro. Dos de estos genotipos se purificaron a partir del aislado HearSNPV-SP1 (HearSPI) (Figueiredo et al., 1999), denominados HearSNPV-SP1A y HearSNPV-SP1 B (o de forma abreviada HearSPIA y HearSPI B), mientras que otros seis genotipos se aislaron a partir de larvas muertas durante una epizootia producida en laboratorio en la segunda generación de una población de H. armígera procedente de un cultivo de algodón de Lebrija (Sevilla), denominados HearSNPV-LB1 , HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV-LB4, HearSNPV-LB5 y HearSNPV-LB6 (o de forma abreviada HearLBI , HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLB5 y HearLB8). Dichos genotipos son distintos de todos ios aislados y genotipos caracterizados hasta el momento.
Sorprendemente, los ensayos realizados con estos genotipos demuestran que dos de los nuevos genotipos aislados HearSNPV-SP1 B (CNC I-4806) y HearSNPV-LB8 {CNCM I- 4807), y en particular, la mezcla de los mismos HearSNPV-SP1 B:LB6 en proporción 1 : 1 , se encuentran entre los nucleopoliedrovirus más activos que han sido desarrollados como bioinsecticidas hasta la fecha. Este producto representa una tecnología limpia y segura ya que no deja residuos tóxicos sobre los suelos ni las cosechas y no es tóxico para el hombre ni otros animales, incluidos los enemigos naturales de las plagas, como los depredadores y parasitoides.
Además, estos nucleopoliedrovirus tienen la ventaja adicional de la facilidad y buen rendimiento en su producción.
Así, en un primer aspecto, el objeto de la presente invención se refiere a un nucleopoliedrovirus simple de H. armígera (HearSNPV) que pertenece a un genotipo seleccionado del grupo de: i) ios genotipos de HearSNPV depositados en la Coliection Nationale de Cultures de icroorganismes (CNC ) con ios números de depósito CNCM 1-4808 (HearSNPV- SP1 B), CNCM I-4807 (HearSNPV-LB6), o ii) ios genotipos cuyo genoma está representado por SEQ ID NO: 13 (HearSNPV- SP1 B), o SEQ ID NO: 14 (HearSNPV-LB6).
Dicho nucleopoliedrovirus puede estar en distintas formas, ya sea la de partícula vírica o virión, o en forma de cuerpos de oclusión, que es la forma en la que ios nucleopoliedrovirus se encuentran en la naturaleza, y por tanto la forma que ingieren las larvas. Un cuerpo de oclusión puede contener viriones de solo uno de los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I- 4808) o HearSNPV-LB8 (CNCM I-4807), o viriones de más de uno de dichos genotipos coocluidos dentro del mismo cuerpo de oclusión. Los viriones pueden ser viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODV) (la forma de propagación que queda incluida en los cuerpos de oclusión y que se libera en el intestino de las larvas tras la disolución de la poliedrina), o viriones brotados (BV) (la forma mediante la cual se propaga la infección a los distintos tejidos de un insecto infectado, y que puede encontrarse también en cultivos celulares).
También es un aspecto de la presente invención un cuerpo de oclusión que contiene varios viriones, en el que ai menos uno de ellos pertenece a un genotipo del nucleopoliedrovirus simple de H. armígera seleccionado del grupo de HearSNPV-SP1 B (CNCM i-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM í-4807). El cuerpo de oclusión puede contener varios viriones de un mismo genotipo o bien viriones de genotipos diferentes co-ociuidos en el mismo cuerpo de oclusión. Cuando los viriones sean de un mismo genotipo, éste podrá ser cualquiera de los genotipos HearSNPV-SP1 B ó HearSNPV-LB6. Mientras que cuando se trate de viriones coocluidos, los genotipos co-ociuidos podrán ser de cualquiera de HearSNPV-SP1 B y/o HearSNPV-LB6, en distintas proporciones. Además, también pueden estar incluidos en la mezcla viriones de otros genotipos del nucleopoliedrovirus simple de H. armígera o puede ser que todos los viriones pertenezcan a alguno de los genotipos del grupo de HearSNPV- SP1 B y HearSNPV-LB6. En cualquiera de los casos los viriones contenidos en ios cuerpos de oclusión serán viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODVs).
Los genotipos HearSNPV-SP1 B y HearSNPV-LB8 pueden distinguirse por la secuencia específica que presentan en ciertas zonas de sus genomas, de gran variabilidad, como son las regiones del genoma conocidas como regiones homologas (hr) 1 y 5 (hr1 y hr5), tal como se describe en ios ejemplos de la presente solicitud. Así, son también posibles realizaciones de este aspecto de la invención ios cuerpos de oclusión que contienen al menos un virión (ODV) cuyo genoma comprende un fragmento de ADN cuya secuencia está representada por: i) SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 (las secuencias específicas de la región homologa 1
(hr1) amplificadas por PCR utilizando los cebadores F-hr1 y R-hr1 en ejemplos de la presente solicitud, pertenecientes, respectivamente, a los genotipos HearSNPV- SP1 B (CNC I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807)). ii) SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 (las secuencias específicas de la región homologa 5
(hr5) amplificadas por PCR utilizando los cebadores F-hr5 y R-hr5 en ejemplos de la presente solicitud, pertenecientes, respectivamente, a los genotipos HearSNPV- SP1 B (CNCM I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807)). iii) SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 (las secuencias completas de la región homologa 1
(hr1), pertenecientes, respectivamente, a los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I- 4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807)).
¡v) SEQ ID NO: 1 1 o SEQ ID NO: 12 (las secuencias completas de la región homologa 5 (hr5), pertenecientes, respectivamente, a los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I- 4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM i-4807)).
Otro aspecto de la invención es una composición que contiene nucleopoliedrovirus de ai menos uno de los genotipos HearSNPV-SP B (CNCM i-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I- 4807), o combinaciones de los mismos. Como en el caso anterior, los nucleopoliedrovirus pueden estar en distintas formas, como la de viriones libres o, preferiblemente, en forma de cuerpos de oclusión, que pueden tener un número variable de viriones co-ocluidos (viriones que, como se comentó previamente, serán viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODVs)). En este caso, los viriones contenidos en el cuerpo de oclusión pueden ser de un solo genotipo o de varios, siempre y cuando al menos uno de los genotipos sea HearSNPV- SP1 B (CNCM I-4806) o HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807). Por tanto, este aspecto de la invención se refiere a una composición que comprenda un nucleopoliedrovirus de la invención o un cuerpo de oclusión de la invención. En particular, son realizaciones posibles de la invención las que comprendan las mezclas de viriones de distintos genotipos con las que se realizaron los ensayos descritos más adelante en los ejemplos de la presente invención, con preferencia por las composiciones que comprendan una mezcla de viriones de ios genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) y HearSNPV-LB8 (CNC i-4807).
Los distintos genotipos pueden estar en cualquier proporción relativa, preferiblemente en la proporción que mostró los mejores resultados en los ejemplos que se describen más adelante, es decir, aquella en la que ios genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4808) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) están en la proporción HearSNPV-SP B:HearSNPV-LB6 1 : 1.
Adicionaimente, las composiciones de la invención pueden comprender cualquier excipiente o vehículo apropiado en el sector agrícola, con preferencia por aquellos que lo hagan apto para ser aplicado según cualquiera de los métodos habituales en agricultura: pulverización, ya sea a nivel de suelo o aérea, aplicación en suspensión o en forma de polvo, o por cualquier tipo de sistema de riego. La composición podrá estar en cualquier forma, como puede ser en forma acuosa o en forma sólida. La composición podrá contener cualquier otro componente, preferiblemente aquellos de particular interés agrícola; así, los nucleopoliedrovirus simples de H. armígera podrán estar mezclados, por ejemplo, con un abono, un fertilizante o un plaguicida, o mezclas de ios mismos. Un caso concreto puede ser aquel en la que la composición de la invención comprende adicionaimente un insecticida basado en la bacteria Bacillus thuringiensis seleccionado entre endosporas de dicha bacteria, cristales de proteínas Cry o mezclas de los mismos.
Por otro lado, posibles realizaciones de dicha invención son también las composiciones que pueden comprender agentes potenciadores del efecto patogénico del nucleopoliedrovirus sobre el lepidóptero.
Un aspecto adicional de la invención es el uso como insecticida de al menos uno de ios nucleopoliedrovirus de la presente invención, o de una composición que contenga ai menos uno de ellos. El insecto que se desea controlar es preferiblemente H. armígera, en concreto cuando se encuentra en forma de larva u oruga. Se prefiere que los nucleopoliedrovirus estén en forma de cuerpos de oclusión, ya que es la forma que comúnmente ingieren las larvas. Se prefiere también que la composición contenga un mezcla de los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807), preferiblemente las mezclas en las que dichos genotipos estén en la proporción HearSNPV-SP1 B:HearSNPV- LB6 1 : 1. Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la producción de cuerpos de oclusión que comprende una etapa en la que se alimentan larvas de H. armígera con una dieta artificial que contiene cuerpos de oclusión del nucleopoliedrovirus de H. armígera con viriones de uno cualquiera de ios genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4808) o HearSNPV- LB6 (CNCM I-4807) o mezclas de los mismos.
Es también un aspecto de la invención un método para identificar ia presencia en una muestra de un genotipo del nucleopoliedrovirus simple de H. armígera seleccionado entre HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) que comprende las etapas de: i) amplificar mediante PCR el ADN extraído de dicha muestra utilizando una pareja de cebadores, que amplifican en ia región homologa (hr, del inglés homologous región) 1 o 5, que se selecciona entre las formadas por: a. SEQ ID NO: 1 (F-hr1) y SEQ ID NO:2 (R-hr1), o b. SEQ ID NO:3 (F-hr5) y SEQ ID NO:4 (R-hr5); ii) analizar el fragmento amplificado para determinar su tamaño o su secuencia; iii) digerir el fragmento amplificado con la endonucleasa Ndel: iv) analizar los fragmentos generados tras ia digestión para determinar el número de fragmentos y el tamaño de cada uno de ellos; v) concluir que está presente uno de los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM 1-4808) o HearSNPV-LB6 (CNCM 1-4807) si: a. el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2 tiene: i. un tamaño de 2.177 (HearSNPV-SP1 B) ó 2.117 (HearSNPV-LB6) nucleótidos; ii. ia digestión de dicho fragmento con la endonucleasa A/del genera 8 fragmentos de 857, 508, 381 , 306, 78 y 47 nucleótidos (HearSNPV-SP1 B) ó 5 fragmentos de 1.210, 475, 307, 78 y 47 nucleótidos (HearSNPV-LB6); iii. la secuencia representada por SEQ ID NO:5 (HearSNPV-SP B) o SEQ ID
NO:8 (HearSNPV-LB6); o, alternativamente, b) el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 tiene: i. un tamaño de 2,326 (HearSNPV-SP1 B) ó 2.330 (HearSNPV-LBo) nucieótidos; ii. la digestión de dicho fragmento con la endonudeasa A/del genera 4 fragmentos de 1.120, 917, 21 1 y 78 nucieótidos (HearSNPV-SP1 B) ó 3 fragmentos de 1 .120, 998 y 212 nucieótidos (HearSNPV-LB6); iii. ia secuencia representada por SEQ I D NO:7 (HearSNPV-SP1 B) o SEQ I D
NO:8 (HearSNPV-LB6).
La invención se explicará con más detalle mediante ¡as Figuras y Ejemplos que aparecen a continuación.
Descripción de las figuras
Figura 1. (A) Fotos al microscopio de transmisión y representación esquemática de viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODVs) y de viriones brotados (BVs), y (B) de nucleopoliedrovirus de tipo múltiple ( NPV) con viriones con un número variable de nucleocápsidas, y de tipo simpie (SNPV) con viriones con una única nucleocápsida.
Figura 2. Perfiles de restricción del aislado HearSNPV-G4 obtenidos tras la digestión del ADN genómico con las endonucleasas Bam \, fíg/N , EcoRl , Hindl ll , Kpn\ , Pstl , Sad y Xhol . A la izquierda de la figura se muestra ei marcador de peso moiecular Lambda (λ) digerido con Bam l-EcoRl-HinóUl , y sus tamaños se indican en kilobases (Chen et al. , 2000).
Figura 3, Perfiles de restricción de distintos aislados de HearSNPV: NNg1 (procedente de Kenia), NS2 (Sudáfrica), NMa1 (Kenia), NZ3 (Zimbabwe) y NT1 (Tailandia) obtenidos tras la digestión del ADN genómico con las endonucleasas Bgll l (A) y Xbal (B). A ia izquierda de las figuras se muestra el marcador de peso molecular Lambda (λ) digerido con Hindl ll (MI) y con EcoRl-Hindl l l (Mi l), y sus tamaños se indican en kilobases (Ogembo et a!. , 2007).
Figura 4, (A) Perfiles de restricción de ios aislados HearSPI , HearSP2, HearSP3, HearSP4, HearSPS, HearSP6, HearSP7, HearSPS, HearPTI y HearPT2 tras la digestión del ADN genómico con la endonudeasa Bgll l, a la izquierda de la figura se muestra el marcador de peso molecular Lambda (λ) digerido con Hindl l l , y sus tamaños se indican en pares de bases (Figueiredo et ai. , 2009). (B) Perfiles de restricción de los aislados HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7, HearSPS, HearPT HearPT2 y HearG4 con ia endonudeasa EcoRl, a ia izquierda de la figura se muestra el marcador de peso molecular HyperLadder I (Bioline), y sus tamaños se indican en kilobases (Arrizubieta et al. , 2014). Figura 5. Patrón de bandas obtenido en gradiente continuo de sacarosa tras la centrifugación de los ODVs obtenidos de (A) HearSNPV y (B) Ac NPV. Los asteriscos biancos indican ias bandas que representan ios ODVs. Como se puede observar en ei panel A sóio es visible una banda, por tanto todos los viriones presentan la misma morfología, conteniendo una única nucleocápsida. Sin embargo, en el panel B se observan varias bandas, cada una de ellas representa ODVs con un número determinado de nucleocápsidas, dependiendo del número de nucleocápsidas tendrán mayor o menor peso, apareciendo a menor o mayor altura.
Figura 6. Representación esquemática de una mezcla de cuerpos de oclusión de distintos genotipos, donde cada cuerpo de oclusión está formado por ODVs de un mismo genotipo, y de una mezcla de genotipos co-ociuidos en un mismo cuerpo de oclusión, donde cada cuerpo de oclusión está formado por ODVs de distintos genotipos.
Figura 7. (A) Electroforesis de los fragmentos de restricción obtenidos ai tratar el ADN viral del aislado HearSPI y de ios genotipos HearSPIA y HearSPI B con ias endonucleasas de restricción BgíW y EcoRI . (B) Electroforesis de los fragmentos de restricción obtenidos al tratar el ADN viral de los aislados HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7, HearSP8, HearPTI y HearPT2 y de los genotipos HearG4, HearSPIA, HearSPI B, HearLBI , HearLB2, Hearl_B3, HearLB4, HearLBS y HearLB6 con la endonucleasa de restricción EcoRi . (C) Electroforesis de los fragmentos de restricción obtenidos ai tratar el ADN viral de ios aislados HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7, HearSP8, HearPTI y HearPT2 y de los genotipos HearG4, HearSPIA, HearSPI B, HearLBI , HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS y HearLB6 con ia endonucleasa de restricción BgíW . A la izquierda de las figuras se muestra el marcador de peso molecular 1 kb (NI PPON Genetics, Europe GmbH), y ios tamaños de sus fragmentos se indican en kilobases.
Figura 8, (A) Fragmentos obtenidos ai amplificar mediante PCR las zonas de variabilidad de la región homologa hr1 (cebadores identificados por SEQ I D NO: 1 y SEQ I D NO:2) y hr5 (cebadores identificados por SEQ I D NO:3 y SEQ I D NO:4) de ios genotipos HearSP B y HearLB6, del aislado HearSPI y del genotipo chino HearG4, siendo c-: control negativo sin ADN viral. A la izquierda de la figura se muestra ei marcador de peso molecular 1 kb (NI PPON), y los tamaños de sus fragmentos se indican en kilobases. (B) Fragmentos obtenidos tras digerir con la endonucleasa Nde\ los fragmentos obtenidos mediante PCR de las zonas de variabilidad hr1 y hr5 de los genotipos HearSPI B y HearLB6, del aislado HearSPI y del genotipo chino HearG4. A la izquierda de la figura se muestra el marcador de peso molecular 100 pb (NI PPON Genetics, Europe GmbH), y ios tamaños de sus fragmentos se indican en pares de bases. Figura 9, (A) Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos amplificados mediante PCR de la región homologa 1 (hr1) correspondiente a los genotipos HearSPI B y Hearl_B6 y a los aislados HearG4, HearCI , HearNNgl y HearAus. (B) Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de ios fragmentos amplificados mediante PCR de la región homologa 5 (hr5) correspondiente a los genotipos HearSPI B y HearLB6 y a ios aislados HearG4, HearCI , HearNNgl y HearAus.
Figura 10. Producción media de cuerpos de oclusión (χ10' cuerpos de oclusión/larva) en larvas de segundo estadio de H. armígera tras ser infectadas con los genotipos individuales HearSPIA y HearSPI B y con el aislado HearSPL Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación iguales que acompañan a ios valores indican que no hay diferencias significativas entre ios tratamientos (P>0,05).
Figura 11. Producción media de cuerpos de oclusión (x108 cuerpos de oclusión/larva) en larvas de segundo estadio de H. armígera tras ser infectadas con los genotipos individuales HearLBl , HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS y HearLB6 y con el aislado HearSPL Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05).
Figura 12. Producción media de cuerpos de oclusión (x 07 cuerpos de oclusión/larva) en larvas de segundo estadio de H. armígera tras ser infectadas con los genotipos individuales HearSPIA, HearSPI B, HearLBl , HearLBS y HearLB6 y con las mezclas co-ociuidas HearSP1A:SP1 B (1 : 1), HearSP1A:SP1 B (1 :2), HearLBl :LB3, HearLBS: LB6, HearLBl :LB3:LB6, HearLBmix, HearSPI B: LB1 y HearSPI B: LB6. Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre ios tratamientos (P<0,05).
Figura 13. Porcentaje de mortalidad debido a la infección, de supervivencia (o alcanzaron el estado de pupa) y de canibalismo en larvas de tercer, cuarto y quinto estadio (L3, L y Ls), sanas e infectadas con la concentración letal 90% (CL90) de la mezcla co-ocluida HearSP1 B:LB6 a diferentes densidades larvarias (1 , 5, 10 y 20 larvas por caja). Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre ios tratamientos (P<0,05).
Figura 14. Porcentaje de mortalidad larvaria tras inocular larvas de H. armígera recién mudadas ai tercer, cuarto y quinto estadio (L3> L4 y L5) y un día después de la muda (L3+1 , L4+1 y L5+I) con una concentración letal 95% (CL95), 90% (CL90) ó 80% (CL80) de la mezcla co-ocluida HearSP B: LB6. Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05).
Figura 15. (A) Producción media de cuerpos de oclusión (x 108 cuerpos de oclusión/larva) en larvas de H. armígera recién mudadas al tercer, cuarto y quinto estadio (L3, L4 y L5) y un día después de la muda a dichos estadios (L3÷1 , L4÷1 y L5+1) inoculadas con una concentación letal 95% (CL95), 90% (CL90) ó 80% (CL8o) de la mezcla co-ocluida HearSP1 B:LB6. (B) Producción media de cuerpos de oclusión (x 1010 cuerpos de oclusión/ 00 larvas) en larvas de H, armígera recién mudadas a L3, L4 y L5 y un día después de la muda a dichos estadios (L3÷1 , L +1 y L5÷1) inoculadas con la CL95, CL90 y CL80 de la mezcla co-ociuida HearSP1 B:LB6. Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación diferentes que acompañan a ios valores indican que hay diferencias significativas entre ios tratamientos (P<0,05).
Figura 18. Producción media de cuerpos de oclusión (x 109 cuerpos de oclusión/larva) en larvas de quinto estadio (L5) de H. armígera inoculadas con la concentración letal 95% (CL95) de la mezcla co-ocluida HearSP1 B:LB6 e incubadas a 23, 26 y 30°C. Las barras verticales indican el error estándar. Las letras de significación iguales que acompañan a los valores indican que no hay diferencias significativas entre los tratamientos (P>0,05).
Figura 17. Porcentaje de mortalidad obtenido en larvas de segundo estadio de H. armígera recogidas en plantas de tomate tratadas en condiciones de laboratorio. Las larvas fueron recogidas a los 1 , 3 y 5 días después de la aplicación de HearSNPV a tres concentraciones (106, 107 y 08 cuerpos de oclusión/mi) de la mezcla co-ociuida HearSP1 B:LB6, y criadas individualmente en el laboratorio en vasos con dieta semisintética hasta la muerte o pupación.
Figura 18. Porcentaje de frutos dañados en cultivo de tomate en invernadero 10 días después de la aplicación de Turex, Spintor y HearSNPV. Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre ios tratamientos (P<0,05).
Figura 19. Porcentaje de mortalidad larvaria observada en cultivo de tomate en invernadero 10 días después de la aplicación de Turex, Spintor y HearSNPV. Las letras de significación diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05).
Figura 20, Porcentaje de actividad insecticida residual (Turex, Spintor y HearSNPV) en las hojas de tomate en invernadero a lo largo del tiempo, respecto a la cantidad de insecticida presente en las hojas de tomate a una hora después de la aplicación de los tratamientos. Las barras verticales indican el error estándar.
Figura 21. Cantidad de actividad insecticida residual por gramo de hoja de tomate en invernadero 1 , 72, 144 y 216 horas (0, 3, 8 y 9 días) después de la aplicación de ios tratamientos: A) Turex (mg), B) Spintor (μΙ) y C) HearSNPV (cuerpos de oclusión). Las barras verticales indican el error estándar.
Figura 22. Porcentaje de frutos dañados, ya sean cicatrizados o frescos, en cultivo de tomate al aire libre después de la aplicación de HearSP B: LB6, HearSPI , Spintor, Turex y Dursban durante (A) la primera, (B) segunda, (C) tercera, y (D) cuarta quincena. Las letras de significación diferentes que aparecen en las columnas en cada grupo indican que hay diferencias significativas dentro de cada grupo entre los distintos tratamientos (P<0,05).
Figura 23. Porcentaje de frutos dañados cosechados, ya sean rojos podridos, rojos cicatrizados o verdes picados, en cultivo de tomate al aire libre, después de la aplicación de HearSPI B: LB6, HearSP Spintor, Turex y Dursban. Las letras de significación diferentes que aparecen en las columnas en cada grupo indican que hay diferencias significativas dentro de cada grupo entre los distintos tratamientos (P<0,05).
Figura 24. Toneladas de A) tomates verdes, tanto picados como sanos y B) tomates rojos sanos, cicatrizados o podridos por hectárea en cultivo al aire libre después de la aplicación de HearSP1 B: LB6, HearSPI , Spintor, Turex y Dursban. Las letras de significación diferentes que aparecen en las columnas en cada grupo indican que hay diferencias significativas dentro de cada grupo entre los distintos tratamientos (P<0,05).
Figura 25. Porcentaje de actividad insecticida residual (HearSPI B: LB6, HearSPI , Spintor, Turex y Dursban) presente en hojas de tomate en cultivo ai aire libre a lo largo del tiempo, respecto a la cantidad de insecticida presente en las hojas de tomate a una hora después de la aplicación de los tratamientos. Las barras verticales indican el error estándar.
Figura 26. Cantidad de actividad insecticida residual por gramo de hoja de tomate en cultivo al aire libre 1 , 72, 168 y 240 horas (0, 3, 7 y 10 días) después de la aplicación de ios tratamientos: A) HearSPI B: LB6 (cuerpos de oclusión), B) HearSPI (cuerpos de oclusión), C) Spintor (μΙ), D) Turex (mg) y E) Dursban (mg). Las barras verticales indican el error estándar.
Descripción detallada de la invención El objeto de ¡a presente invención se refiere a la obtención de nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Helicoverpa armígera (Fig, 5). Dichos genotipos se han aislado de dos maneras diferentes: i) a partir del aislado HearSNPV-SP1 (o, de forma más abreviada HearSP ), mediante un ensayo de placa con cultivo celular in vitro. Los genotipos presentes en dicho aislado, diferentes de todos los aislados y genotipos caracterizados hasta el momento, se han denominado HearSNPV-SP1A y HearSNPV-SP1 B (o, de forma abreviada, HearSPIA y HearSPI B). ii) a partir de larvas muertas durante una epizootia en laboratorio en la segunda generación de una población de H. armígera procedente de un cultivo de algodón de Lebrija (Sevilla). Los genotipos obtenidos de dichas larvas, distintos de todos ios aislados y genotipos caracterizados hasta el momento, se han denominado HearSNPV-LB1 , HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV-LB4, HearSNPV-LB5 y HearSNPV-LB6 (o, de forma más abreviada, HearLBI , HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS y HearLB6). Cada uno de estos genotipos procede de una larva individual muerta por dicha epizootia. La ausencia de bandas submolares en los perfiles de restricción, sugiere que estos genotipos son genotipos puros ya que dichas bandas submolares se producen por la presencia de varios genotipos en distintas proporciones. Sin embargo, con el fin de tener la certeza de su pureza, se llevó a cabo la clonación in vitro de los distintos aislados mediante ensayo de dilución límite (end point dilution, EPD). Dicha clonación y su posterior análisis mediante enzimas de restricción, confirmó la pureza de los mismos, demostrando que cada una de las larvas había muerto por la infección de un único genotipo.
Por otro lado, ios perfiles de restricción obtenidos tras la digestión del genoma de cada uno de estos genotipos con distintas enzimas (endonucleasas) de restricción confirmaron que se trataban de genotipos diferentes (HearSPIA, HearSPI B, HearLBI , HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS y HearLB8) (Fig. 7) y además eran diferentes a otros aislados y genotipos caracterizados hasta el momento (Tabla 4), como los genotipos chinos HearCI y HearG4 (Fig. 2), el aislado procedente de Kenia HearNNgl (Fig. 3) y los aislados de la Península ibérica HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSPT, HearSPS, HearPTI y HearPT2 (Fig. 4).
De los distintos genotipos encontrados, se seleccionaron dos de ellos, denominados
HearSPI B y HearLB6, que pueden distinguirse fácilmente unos de otros y diferenciarse de otros aislados y genotipos de HearSNPV por ios perfiles obtenidos ai tratar sus genomas con enzimas de restricción, como pueden ser EcoR\ y fíg/ll. En las figuras 2, 3, 4 se muestran los perfiles de restricción obtenidos para los aislados de HearSNPV caracterizados previamente, mientras que en la figura 7 se muestran los perfiles de restricción de los genotipos HearSPI A, HearSPI B, HearLBI , HearLB2, HearLB3, Hearl_B4, HearLB5 y HearLB6, así como los correspondientes a ios aislados españoles HearSPI , HearSP2, HearSP4, HearSP7 y HearSPS, a los aislados portugueses HearPTI y HearPT2, y al genotipo chino HearG4. La diferenciación se basa en la presencia de fragmentos polimórficos característicos en los perfiles de restricción de cada genotipo o aislado. Las bandas submolares (bandas que contienen una menor cantidad de moléculas que el resto de las bandas del mismo perfil de DNA) indican la presencia de una mezcla de aislados como se observa en el caso de HearSPI en la Figura 7A. Otro ejemplo es el genotipo HearSPI B que ai ser digerido con la enzima Nde\ muestra una banda de 9,73 kb que no se observa en el perfil del aislado HearSPI (Figura 8B). Además, el aislado HearSPI muestra varias bandas submolares en torno a 6,5-7 kb, que no se observan en el perfil del genotipo puro HearSPI B (Figura 8B), Por otro lado, en los perfiles obtenidos con la endonucleasa fíg/li, el aislado HearSPI muestra una banda submoiar de 18,8 kb que no se observa en el perfil del genotipo HearSPI B. La presencia de dichas bandas submolares pone de manifiesto que el aislado silvestre HearSPI está compuesto por una mezcla heterogénea de genotipos.
Con el fin de diferenciar más claramente los genotipos HearSPI B y HearLB6, y diferenciarlos también de otros aislados de HearSNPV cuyos genomas han sido completamente secuenciados (HearG4, HearCI , HearNNgl y HearAus), se muestran en la Tabla 4 los valores numéricos de los tamaños de los fragmentos de restricción generados tras digerir dichos aislados y genotipos con la endonucleasa EcoR\.
Tabla 4: Tamaños (kb) estimados de los fragmentos de ADN generados tras la digestión del ADN genómico de distintos aislados y genotipos con la endonucleasa EcoR\ y tamaño total estimado de los genomas. Los fragmentos de ADN se nombran alfabéticamente, siendo el fragmento A el de mayor tamaño.
Tamaño (kb)
Fragmento HearSPI B HearLB8 HearG4 HearCI HearNNgl HearAus
_ 13:54 13,55 14, 13 14, 13 13,51 13,44
B 10, 18 10,50 13,45 12,84 10,20 10, 15
C 9,73 9,74 10, 15 9,75 9,73 9,48 D 9,20 9,38 9,05 9,05 9,20 9,06
E 8,21 8,26 6,64 6,91 8,23 8,23
F 8,52 6,45 6,36 6,54 6,60 6,68
G 6,30 6,29 6,29 6,30 6,30 6,28
H 6,15 5,98 5,99 6,00 6,23 6,00
! 5,98 5,93 5,84 5,84 6,00 5,94
J 5,93 5,85 5,84 5,84 6,00 5,84
K 5,84 5,84 5,67 5,67 5,80 5,84
L 5,69 5,68 4,75 4,74 5,80 5,70
M 5,25 5,25 4,58 4,65 5,70 4,83
N 4,73 4,73 4, 42 4,57 4,75 4,75
0 4,57 4,57 4,40 4,41 4,57 4,57
P 4,42 4,42 4,14 4,40 4,41 4,41
Q 4,40 4,40 3,68 4,14 4,40 4,40
R 3,34 3,32 3,36 3,36 3,34 3,68
S 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,35
T 2,83 2,83 2,83 2,83 2,83 3,00
U 1 ,74 1 ,01 1 ,74 1 ,74 1 ,74 1 ,74
V 1 ,01 0,98 1 ,48 1 ,00 1 ,00 1 ,00
X 0,97 0,78 1 ,00 0,78 0,80 0,80
Y 0,78 0,48 0,78 0,48 0,48 0,48
Z 0,47 0,45 0,48 0,45 0,45 0,45 a 0,45 0,42 0,45 0,42 0,41 0,41 b 0,42 0,41 0,41 0,41 0,41 0,30 c 0,41 0,31 0,31 0,31 0,31 0,18 d 0, 18 0, 18 0, 18 0, 18 0, 18 0,02 e 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 f
Total 132,26 130,99 131 ,42 130,76 132,4 131 ,01
Al realizar la comparación de los datos reflejados en la Tabla 4, se observa que hay diferencias en el número y tamaño de los fragmentos, lo que indica que los genotipos HearSPI B y HearLB6 son diferentes de los ya conocidos y, por tanto, nuevos. Por ejemplo, el fragmento EcoRI-B del genotipo HearLB6 (10,50 kb) es mayor que el del genotipo HearSPI B (10, 18 kb). El fragmento £coR!-F (6,45 kb) del genotipo HearLB6 no se encuentra en los perfiles de HearSPI B ni en los de los genotipos secuenciados. Sin embargo, el fragmento £coRI-U (1 ,74) del genotipo HearSPI B no aparece en el perfil del genotipo HearLB6, pero si aparece en los genotipos secuenciados. Esto mismo puede observarse en la figura 7.
Los genotipos HearSPI B y HearLB6 también se diferencian entre sí y respecto a otros aislados y genotipos de HearSNPV descritos en la literatura, por las secuencias de nucleótidos específicas que cada uno presenta en regiones concretas del genoma. Puede utilizarse, por ejemplo, la región del genoma conocida como región homologa 1 (hr1), tomando como referencia la secuencia correspondiente de los genomas de dos aislados de China, HearG4 (Chen et al., 2001 ; con el número de acceso en GenBank AF271059) y HearCI (Zhang et al., 2005; GenBank AF303045), de un aislado de Kenia, HearNNgl (Ogembo et al., 2007; GenBank AP010907) y de un aislado de Australia, HearAus (GenBank JN584482). También puede recurrirse a la región en ia que se encuentra ia hr5 (región homologa 5).
Así, una diferenciación rápida y precisa de cada uno de estos dos genotipos puede obtenerse empleando la técnica de la amplificación por PCR y posterior digestión con ia endonucleasa de restricción Nde\ de ios fragmentos amplificados utilizando cebadores específicos que amplifican, por ejemplo, en una de las siguientes regiones alternativas: i) La región homologa 1 , hr1. En esta región del genoma de HearSNPV, se ha comprobado que los cebadores específicos F-hr1 (5'- CGAAATCGACAACACCATGCA-3') y R-hr1 (S'-ACTTTTGTACGCCAGAGACGA-S') amplifican un fragmento de 2.177 y 2.1 17 nucleótidos para los genotipos HearSPI B y HearLB6, respectivamente. La digestión de estos fragmentos amplificados con la endonuc!easa de restricción A/del produce perfiles únicos para cada genotipo: siendo para HearSPI B de seis fragmentos de 857, 508, 381 , 306, 78 y 47 nucleótidos o de cinco fragmentos de 1.210, 475, 307, 78 y 47 nucleótidos en el caso de HearLB8. A su vez estos perfiles son diferentes de ios obtenidos para ios genotipos secuenciados (Tabla 6, Fig. 8B). Concretamente y a modo de ejemplo, en la Figura 8B se aprecia como las banda de 508 y 381 nucleótidos no coinciden con ninguna otra banda del gel, al estar las bandas del aislado HearSPI levemente por encima, indicando un tamaño superior a ios de HearSPI B. ii) En la región homologa 5, hr5. En esta región del genoma de HearSNPV, se ha comprobado que los cebadores específicos F-hr5 (5!-CTAGCCGGTCCGTTTCTGTT- 3:) y R-hr5 (5'-GCCCCACCCAAAACATAACG-3') amplifican un fragmento de 2.326 y 2.330 nucleótidos para los genotipos HearSPI B y HearLB8, respectivamente. En este caso, la digestión de estos fragmentos amplificados con la endonucieasa de restricción Nde\ también produce perfiles únicos para cada genotipo: siendo de cinco fragmentos de 1.120, 917, 211 y 78 nucleótidos para HearSPI B ó de tres fragmentos de 1.120, 998 y 212 nucleótidos para HearLB8. A su vez estos perfiles son diferentes de los obtenidos para los genotipos secuenciados (Tabla 6, Fig. 8B).
La figura 8, en su panel A, muestra la fotografía obtenida tras someter a electroforesis los fragmentos amplificados por PCR utilizando los cebadores específicos para las regiones hr1 y hr5. En el panel B se muestra la fotografía tras someter a electroforesis ios fragmentos obtenidos tras digerir con la endonucieasa A/del los fragmentos amplificados por PCR para la hr1 y la hr5, del punto anterior. En dicha fotografía puede apreciarse que los fragmentos obtenidos para cada genotipo son diferentes y distinguibles unos de otros. También puede apreciarse que ios fragmentos obtenidos para cada genotipo son diferentes y distinguibles unos de otros. Por ejemplo, en el caso de la hr1 , el fragmento de 1.2 0 bp es característico del genotipo HearLB6, mientras que el genotipo HearSPI B presenta un fragmento característico de 857 bp. En el caso de la hr5, el genotipo HearSPI B presenta un fragmento de 917 bp, mientras que el genotipo HearLB6 presenta uno de 998 bp.
De esta forma, con una única reacción de PCR seguido de una digestión con la endonucieasa Nde\ pueden diferenciarse ios distintos genotipos entre sí y con respecto a cualquier otro genotipo del virus descrito en la literatura (véase la Tabla 6 más adelante, en el Ejemplo 2).
En el caso de aislados naturales o de mezclas artificiales que puedan contener mezclas de genotipos, la proporción de los dos genotipos HearSPI B y HearLB6 en la mezcla puede determinarse mediante una PCR cuantitativa, utilizando cebadores específicos para cada uno de los genotipos, como se menciona posteriormente en la sección de materiales y métodos de ejemplos.
Por otro lado ¡a secuenciación de dichos fragmentos generados por PCR también permitiría comprobar la identidad de los distintos genotipos en la mezcla. Así, las secuencias representadas por SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 corresponden a las secuencias de los fragmentos amplificados utilizando los cebadores F-hr1 y R-hr1 que amplifican en la hr1 de los genotipos HearSPI B y HearLB6, respectivamente, mientras que las SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 se corresponden con ¡as secuencias de los fragmentos amplificados para la hr5, para los mismos genotipos.
Tal como se comenta más adelante, se ha obtenido la secuencia del genoma completo de cada uno de esos dos genotipos HearSPI B y HearLB6, secuencias que se muestran, respectivamente, como SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 y que pueden utilizarse para diferenciar unos genotipos de otros. En concreto, por su variabilidad, se muestran de forma individualizada las secuencias completas de las zonas de variabilidad correspondientes a la región homologa 1 (hr1) (SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO: 10, correspondientes, respectivamente, a los genotipos HearSPI B y HearLB6) y a la región homologa 5 (hr5) (SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12, correspondientes, respectivamente, a los genotipos HearSPI B y HearLB8). Tanto en el caso de la región homologa 1 (hr1) como la 5 (hr5) dichas secuencias se indican en el sentido en el que aparecen en la secuencia del genoma completo. Al ser zonas intergénicas, localizadas entre dos pautas de lectura abiertas, no hay una dirección codificante como ocurre en las pautas de lectura. Éstas últimas pueden transcribirse en sentido (secuencia codificante) o antisentido (secuencia complementaria a la secuencia codificante).
En la presente invención, se han obtenido las secuencias completas del genoma de cada uno de estos dos genotipos HearSP B (SEQ ID NO: 13) y HearLB6 (SEQ ID NO: 14), rasgo característico y definitorio de cada uno de ellos. Por ello, dichos genotipos quedan descritos en la presente solicitud de tai manera que un experto puede reproducir la invención. Además, las secuencias completas de cada uno de los genomas se complementan con los datos que se aportan en la presente solicitud de que el nudeopoiiedrovirus de Helicoverpa armígera es un nudeopoiiedrovirus de tipo simple (SNPV), es decir, cada partícula vírica completa o virión contiene una única nucleocápsida, y por lo tanto, una única copia del genoma del nudeopoiiedrovirus. También se aportan datos adicionales para identificar cada uno de ios genotipos según el perfil obtenido tras digerir su genoma con distintas endonucleasas de restricción, así como por ei tamaño y la secuencia de los fragmentos obtenidos al amplificar por PCR las zonas de variabilidad de las regiones homologas 1 y 5 (hr1 y hr5), utilizando los cebadores de SEQ I D NO: 1 y SEQ I D NO:2 o SEQ I D NO:3 y SEQ I D NO:4, respectivamente, como por el patrón de bandas obtenidos tras digerir estos fragmentos de PCR con la enzima Ndel . En los Ejemplos también se muestran datos sobre la actividad insecticida de cada genotipo y de mezclas de cuerpos de oclusión que contienen viriones co-ociuidos de distintos genotipos dentro de un mismo cuerpo de oclusión, así como la forma de obtener las distintas mezclas. Las diferencias en la patogenicidad, virulencia y productividad resultan ser significativas entre genotipos, y entre las mezclas de ios genotipos de la invención, siendo la mezcla de ios dos genotipos HearSPI B y HearLB6, en proporción 1 : 1 , más patogénica que el resto de genotipos y mezclas e igual de virulenta que los genotipos más rápidos,
Ei gran número de combinaciones de genotipos posibles y las diferencias entre las mismas en cuanto a su potencia relativa, hace que en ningún caso se hubiera podido predecir a príori que la combinación de la presente invención pudiera dar mejores resultados que el resto.
De todas las mezclas de genotipos construidas, la mezcla HearSPI B: LB6 en proporción 1 : 1 fue la que presentó los efectos con actividad sinérgica más deseables desde el punto de vista bioinsecticida. Sin embargo, esta actividad sinérgica no se observa en otras muchas mezclas de genotipos (en la que simplemente puede darse un efecto aditivo o incluso antagonista) y no hay forma de predecir en qué mezclas se va a producir dicha actividad. Es un resultado que no es obvio o predecible, más aún teniendo presente que los genotipos provienen de distintas zonas geográficas (Badajoz y Lebrija) y que ambos genotipos (HearSPI B y HearLB6) no habían sido obtenidos puros, hasta ia fecha, a partir de mezclas silvestres complejas como ios aislados de campo.
Además, se aportan datos sobre ei depósito de los dos genotipos según el Tratado de Budapest, posibilitando la referencia a dichos genotipos por su número de depósito: CNC 1-4806 (HearSPI B) y CNCM 1-4807 (HearLB8).
Respecto a las posibles aplicaciones de los nucleopoliedrovirus de la presente invención, se ha comprobado que cada uno de ios nuevos genotipos HearSPI B y HearLB8 posee una actividad insecticida específica frente a las larvas de H. armígera, que pueden considerarse todas ellas comparables a las de ios insecticidas químicos, como Dursban y Spintor, o a las de tipo biológico basados en Bacílíus thuringiensis, como Turex, comúnmente utilizados frente a H. armígera. Pero se ha encontrado además que la mezcla de los dos genotipos
HearSP1 B: LB6 en una proporción concreta (1 : 1), como cuerpos de oclusión que incluyen
ODVs que han quedado co-ociuidos de forma que un mismo cuerpo de oclusión puede contener distintos genotipos del HearSNPV, posee una actividad insecticida mejor que la de cada uno de ¡os genotipos individuales o que cualquiera de los aislados silvestres de HearSNPV actualmente conocidos, puesto que presenta mayor patogenicidad que el resto de genotipos y mezclas, y el mismo tiempo medio de mortalidad (TMM) que los genotipos más rápidos. Esto supone una ventaja significativa, puesto que ios mayores inconvenientes a la hora de desarrollar los baculovirus como materia activa de bioinsecticidas son su patogenicidad y su velocidad de acción. Por otro lado, este virus se puede producir en poco tiempo ya que inoculando 100 larvas recién mudadas al quinto estadio (L5) e incubándolas con dieta a 30°C, se consiguen del orden de 5 x 1011 cuerpos de oclusión en un periodo de tiempo de unos 5 o 6 días.
Además los ensayos en planta de tomate, tanto en laboratorio como en invernadero o ai aire libre, han puesto de manifiesto que concentraciones del orden de 1013 cuerpos de oclusión/hectárea del nucieopoiiedrovirus de la presente invención son capaces de controlar de forma efectiva las plagas producidas por las larvas de esta oruga, con la misma eficiencia que los insecticidas que se utilizan habitualmente para combatir esta plaga en cultivo de tomate (Spintor, a base de dos toxinas spinosinas (spinosad); Turex, a base de Bacülus thuringiensis var. Aizawai; y Dursban, a base del insecticida químico clorpírifos). Dichas aplicaciones consiguen una reducción significativa del número de frutos dañados cosechados, tanto verdes como maduros, respecto al tratamiento control, y no presentan diferencias con el resto de insecticidas comúnmente usados.
El hecho de que el espectro de huéspedes de los baculovirus esté restringido a invertebrados, y la gran especificidad de HearSNPV en particular (que parece afectar sólo a larvas de unas pocas especies de polillas del género Heücoverpa, todas ellas muy relacionadas fílogenéticamente) hace que el producto represente una tecnología limpia y segura, ya que no deja residuos tóxicos sobre los suelos ni las cosechas y no es tóxico para el hombre ni otros animales, incluidos los enemigos naturales como parasitoides o depredadores.
Sorprendemente, los resultados presentados en la presente solicitud de patente demuestran que la mezcla co-ocluida de estos dos genotipos clonados (HearSPI B y HearLB6) en una proporción 1 : 1 se encuentra entre ios nucieopoiiedrovirus más activos de entre los que han sido desarrollados como bioinsecticidas hasta la fecha.
Al tratarse de aislados de HearNPV nativos de la Península Ibérica, HearSPI B y HearLB6 están mejor adaptados a las condiciones medioambientales reinantes en el sur de Europa que ios aislados procedentes de otros orígenes geográficos. Este hecho es especialmente significativo teniendo en cuenta el efecto negativo que ejerce la radiación UV sobre ios depósitos de una aplicación del bioinsecticida, que requiere que los NPV se mantengan activos hasta el momento de la ingestión por parte de H. armígera donde pueden ejercer su efecto insecticida. Además, se ha observado que existe cierta predisposición a que los aislados naturales de una determinada zona geográfica sean más patogénicos y virulentos para las larvas propias de la misma zona.
Una ventaja adicional de estos nucleopoliedrovirus es que se pueden producir masivamente. Sus cuerpos de oclusión, en los cuales radica la actividad insecticida, pueden producirse de forma masiva in vivo inoculando larvas de H. armígera con cuerpos de oclusión previamente obtenidos tras la infección oral de larvas con las mezclas 1 : 1 de ios cuerpos de oclusión puros HearSPI B y HearLB6. Los cuerpos de oclusión pueden contener viriones de uno cualquiera de los genotipos HearSPI B o HearLB6, si se quieren obtener cuerpos de oclusión con viriones de un único genotipo, o mezclas de ios mismos, si se quieren obtener viriones de distintos genotipos co-ocluidos dentro de un mismo cuerpo de oclusión. El procedimiento concreto utilizado para la producción de los nuevos cuerpos de oclusión puede ser cualquiera de ios conocidos por ios expertos en la materia o el mismo que se ha utilizado en los Ejemplos de la presente solicitud descritos más adelante. En dichos Ejemplos se describe también un ejemplo de la composición de la dieta artificial, la cual es compatible con el procedimiento de producción de cuerpos de oclusión de la presente invención. Así, el procedimiento de producción de cuerpos de oclusión puede comprender las etapas de: i) alimentar larvas de quinto estadio de H. armígera con una dieta artificial que comprende cuerpos de oclusión del nucleopoliedrovirus de H. armígera que contienen viriones de uno cualquiera de ios genotipos HearSPI B (CNC i-4806) y HearLB6 (CNCM i-4807) o mezclas de ios mismos; ii) mantener las larvas individualizadas a 30°C hasta que se produce su muerte; iii) purificar los cuerpos de oclusión generados en las larvas triturando los cadáveres de las larvas en agua, filtrando la suspensión resultante, precipitando ios cuerpos de oclusión, lavando el precipitado y volviendo a precipitarlos; iv) resuspender el precipitado final en agua a pH neutro; v) opcionalmente, almacenar la suspensión obtenida en una de las siguientes condiciones: a) a temperatura ambiente b) en refrigeración c) ¡iofilizar la suspensión y conservarla a temperatura ambiente.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, se entiende por condiciones de refrigeración aquellas en las que el producto se mantiene entre 0°C y 8°C, y condiciones de congelación corresponderían al mantenimiento por debajo de Q°C, Para los efectos de la presente invención, se prefiere que las condiciones de refrigeración se mantengan entre 0°C y 6°C y las de congelación entre -20°C y -80°C.
También puede llevarse a cabo la producción de dichos cuerpos de oclusión alimentando las larvas de quinto estadio con una solución acuosa, que contiene sacarosa al 10% junto con la mezcla co-ocluida seleccionada a una concentración letal ai 95% (CL95). Este método fue descrito por Hughes y Wood en 1986, y consiste en administrar en forma de gotas una suspensión que contiene suspendidos ios cuerpos de oclusión a la concentración deseada, así como un colorante que indica si las larvas han ingerido la gota, como es el colorante alimenticio de color azul Fluoreila biue (Hiiton-Davis, Cincinnati, Ohio). Este método es menos engorroso que el anterior, ya que en el de la dieta artificial hay que impregnar bien la dieta con la suspensión viral, y lleva más tiempo la preparación de ios taquitos de dieta impregnados de virus.
La dieta artificial mediante la cual las larvas son alimentadas o infectadas se administra en forma sólida, mediante pastillas que adicíonalmente a los cuerpos de oclusión del nucleopoliedrovirus de Heiicoverpa armígera (cuando el objetivo sea la infección de dichas larvas) contienen 7,2% germen de trigo, 2,5% proteína de soja, 1 ,4% levadura de cerveza, 1 ,9% agar, 2,9% azúcar, 1 % sales mixtas, 0, 1 % colesteroi, 0,4% ácido ascórbico, 0,2% ácido sórbico, 0,02% estreptomicina, 0,04% ciortetraciclina hidroclorido, 0, 1 % nipagina, 0, 1 % nipasol, 0,2% ácido benzoico, 0, 1 % cloruro de colina, 0,01 % vitaminas, 15% agar y 80% agua destilada. Las larvas pueden ser infectadas administrándose los cuerpos de oclusión tanto en una suspensión acuosa en forma de gotas o como dieta artificial en forma sólida. Normalmente se prepara un volumen de varios litros de dieta, mezclando ios ingredientes mencionados anteriormente, que posteriormente se autociava para esterilizar y permitir que el agar se disuelva, y antes de que se enfríe totalmente (a una temperatura de 50°C) se incluyen los antibióticos, y tras mezclarlos bien se hacen alícuotas de la misma en placas Petri cuadradas de 120x120 mm. Posteriormente, la dieta de las placas Petri se corta en cubos de 5x5 mm.
En el Ejemplo 4 de la presente solicitud se muestra el método de producción masiva puesto a punto para el sistema huésped-patógeno descrito en esta solicitud, H. armígera-
HearSNPV. Hay muchos factores que pueden influenciar la producción final de cuerpos de oclusión, como puede ser el estadio larvario, la concentración del inoculo inicial, o incluso la temperatura. Dichos parámetros pueden modificarse de forma que se obtienen distintas producciones finales. En los ensayos realizados en nuestro laboratorio se ha comprobado que se tiene preferencia por unas condiciones determinadas puesto que son con las que se obtienen mejores resultados y por tanto mayor producción final de cuerpos de oclusión. A continuación se muestran los distintos parámetros que se pueden modificar indicando la preferencia de los mismos: i) larvas de H. armígera de ios estadios tercero (L3), cuarto (L4) y quinto (L5), aunque se tiene preferencia por las larvas del quinto estadio; ii) distintas concentraciones de cuerpos de oclusión suministrados en la dieta artificial, como demuestran los ensayos con distintas concentraciones del rango de 5,5 x 106 a 1 ,5 x 108 cuerpos de oclusión/mi, aunque se tiene preferencia para las larvas L5 la concentración de 1 ,5 x 108 cuerpos de ociusión/ml; iii) larvas individualizadas en placas de 12 pocilios, para evitar el canibalismo, iv) larvas incubadas a 30°C hasta el momento de su muerte.
El estudio de distintas edades larvarias y distintas dosis virales demostró que la producción óptima de cuerpos de oclusión se obtiene cuando se tratan larvas recién mudadas al quinto estadio, inoculando las larvas con una concentración cercana a la concentración que da lugar a la muerte del 95% de las larvas de dicho estadio (CL95), que en este caso es una concentración de 1 ,5 x 108 cuerpos de oclusión/ml, y manteniéndolas de manera individualizada, debido al alto grado de canibalismo que presentan las larvas de esta especie, con dieta a 30°C hasta su muerte. Estas condiciones permiten obtener aproximadamente 5 x 109 cuerpos de oclusión/larva en un periodo de 5 a 6 días. Así, infectando 100 larvas se obtendrían del orden de 5 x 1011 cuerpos de oclusión.
Los cuerpos de oclusión producidos en larvas de H. armígera pueden ser purificados, formulados de forma sólida o líquida y pulverizados como suspensiones acuosas, las cuales protegen de forma muy efectiva a los cultivos de tomate, tanto en invernadero como al aire libre, de las plagas ocasionadas por larvas de H, armígera.
El nucleopoliedrovirus también podrá ser aplicado mediante otros métodos, como pulverización a nivel de tierra o aérea, o aplicación en suspensión, en forma de polvo, o riego. Además, como se ha expuesto anteriormente, los cuerpos de oclusión pueden estar mezclados con excipientes, y usados con vehículos apropiados en el sector agrícola, especialmente aquellos que faciliten la preparación en la forma adecuada para el método de aplicación que se desee. En la misma composición también puede haber, por ejemplo, un abono, un fertilizante o un plaguicida. Además, también puede contener un agente potenciador del efecto patógeno del nucleopoliedrovirus sobre H. armígera.
Es conveniente incluir mojantes agrícolas a ios productos que incluyen estos cuerpos de oclusión, como es el caso del producto comercial Agral® (Syngenta), que se utiliza en Ejemplos de la presente solicitud. El compuesto mojante presente en el producto es el alcohol isotridecílico etoxilado, que aumenta la acción biológica de los insecticidas, herbicidas, fungicidas y pesticidas en general, ya que se consigue una mejor cobertura y penetración del producto en el cultivo a tratar. En la página web en la que se describen sus características
(http://www.syngenta.com/country/es/sp/productos/proteccion__cultivos/mojantes/Paginas/agr al.aspx) se indica que se trata de un mojante y dispersante tensoactivo no iónico, especialmente indicado para mezclar con toda clase de insecticidas, fungicidas y agroquímicos.
También es otro caso de especial interés aquel en el que la composición contiene otro plaguicida, de forma que se aumenta el espectro de acción a otras posibles plagas que afecten a los mismos cultivos, sin restringirlo únicamente a H. armígera. El plaguicida puede ser, por ejemplo, otro insecticida biológico, como los basados en Bacílius thuríngiensís (Bt) previamente mencionados el caso del producto Turex® utilizado posteriormente en el Ejemplo 6 de la presente solicitud, que se utiliza para cultivos atacados por H. armígera. La mezcla con insecticidas basados en Bt es interesante, ya que se han descrito casos de interacciones sinérgicas de la actividad insecticida entre dichos productos y los baculovirus frente a noctúidos (Granados et ai., 2001).
En ios ensayos descritos en los Ejemplos de la presente solicitud que se describen más adelante se muestra que cada uno de estos dos genotipos posee una actividad insecticida característica frente a las larvas de H. armígera, determinada por la patogenicidad, el tiempo medio de mortalidad (TMM) y por la capacidad de producir cuerpos de oclusión en las larvas de H. armígera.
En trabajos realizados previamente en el grupo de investigación de los presentes inventores se ha observado que las mezclas de cuerpos de oclusión o mezclas de viriones co-ociuidos en un mismo cuerpo de oclusión en ocasiones presentan mejores cualidades insecticidas que los genotipos individuales (Bernal et al. , 2013b; López-Ferber et ai., 2003; Simón et ai.,
2005) o incluso que el aislado silvestre (Muñoz et al., 1998). Por otro lado, las mezclas de viriones de distintos genotipos co-ocluidos en el mismo cuerpo de oclusión pueden tener una actividad diferente a la mezclas de cuerpos de oclusión donde ios viriones de cada cuerpo de oclusión pertenecen a un único genotipo (López-Ferber et al. , 2003), dado que puede haber sinergismo o antagonismo entre algunos genotipos. Por ello, en la presente invención se ha realizado el estudio de la actividad insecticida de distintas mezclas de viriones coocluidos en un mismo cuerpo de oclusión, para comprobar si dichas mezclas presentaban características insecticidas diferentes a los cuerpos de oclusión de un único genotipo, si los genotipos presentaban actividad antagónica o sinérgica, y determinar las variaciones que pudieran darse entre distintas combinaciones y distintos tipos de mezclas.
La mezcla de ios dos genotipos HearSP1 B:LB6, co-ocluidos en el mismo cuerpo de oclusión en la proporción 1 : 1 (es decir cada uno de esos cuerpos de oclusión contiene los dos genotipos en esa proporción), en contra de lo esperado se vio que tiene una actividad insecticida en términos de patogenicidad, mayor que la de ios genotipos individuales. Pero, por otra parte, su virulencia (TMM) es similar a ia de los genotipos más rápidos matando a las larvas. Por esta razón, se seleccionaron para su aplicación estos genotipos, en su forma co-ocluida en un mismo cuerpo de oclusión, frente a los restantes genotipos individuales aislados de HearSNPV.
En el Ejemplo 3 de ia presente invención se describen los ensayos de la actividad insecticida de los diferentes genotipos y mezclas, que sorprendentemente demuestran que los nuevos nucleopoliedrovirus aislados, y en especial su combinación, se encuentran entre los insecticidas biológicos con mayor actividad contra plagas de insectos. Por ello, se propone su uso como insecticida, particularmente para el control de insectos de los géneros sobre los que se conoce que actúa, Heücoverpa o Heiioihis, con especial preferencia por el uso para el control de H. armígera.
De entre las combinaciones elegidas, no existe ningún tipo de experiencia y/o predicción anticipada que sugiera que la combinación de ambos genotipos vaya a mostrar unos resultados en cuanto a la potencia relativa notablemente superiores al resto de aislados. La actividad sinérgica que ocurre en el caso de HearSP1 B:LB6 no se observa en muchas otras mezclas de genotipos, dándose incluso casos en los que se produce un efecto claramente antagónico. Dicha actividad es sorprendente al no ser esperable la actividad sinérgica de dos genotipos distintos que de modo natural se encuentran en zonas geográficas alejadas.
Las plantas en las que se aplique este formulado pueden ser cualquiera que dañe esta especie de lepidóptero y donde se quieran controlar los daños producidos por este insecto, tanto si crecen o se cultivan en invernadero como al aire libre, destacando los cultivos de tomate, especialmente en la Península Ibérica, donde se ha comprobado su efectividad, tanto en cultivo de tomate en invernadero como ai aire libre.
Teniendo en cuenta todos estos datos, puede decirse que: i) cada uno de ¡os nuevos genotipos aislados, HearSPI B y HearLB6 es nuevo, pues cada uno de ellos es distinto de los otros genotipos y diferente de ¡os nudeopoliedrovirus de H. armígera hasta ahora conocidos, de ¡os cuales puede distinguirse tanto por las diferencias en ¡a secuencias de sus genomas (particularmente, en ¡as zonas de las regiones homologas 1 y 5, hr1 y hr5) así como por las diferencias en ¡os perfiles generados por la digestión con enzimas de restricción de dichos genomas, en particular EcoRl y/o fíg/N. ii) los dos nuevos genotipos aisiados comparten, entre otras, las características técnicas de: a) su actividad insecticida y su productividad, de forma individual, es superior o igual a la de cualquiera de los aislados naturales previamente conocidos; b) sus mezdas, en particuiar ¡a mezcla co-oduida de ios dos, HearSPI B: LB6, en proporción 1 : 1 , presenta una patogenicidad y viruiencia frente a la larvas de H. armígera mejor o igual que la de ¡os aislados silvestres de este virus y comparable a la de ¡os insecticidas (aunque sin ¡os inconvenientes) que se usan habituaimente contra esta plaga, como ios insecticidas comerciaüzados bajo ei nombre Dursban®, Spintor® o e¡ insecticida biológico basado en Bt, Turex®; c) dado que ¡os dos genotipos han sido aisiados en zonas geográficas relativamente próximas, es de esperar que sean especialmente activos frente a las posibles variantes de H. armígera de dicha zona geográfica, el sur de ¡a Península Ibérica o Andalucía y Extremadura concretamente.
Ejemplos
Para ¡levar a cabo ¡os ensayos que se describen en la presente solicitud se utilizaron ¡os siguientes materiales y métodos:
- Insectos
No hay cepas o estirpes de H. armígera reconocidas oficialmente. Las ¡arvas de H. armígera utüizadas para ¡a amplificación de ¡os diferentes virus, para ¡a reaüzación de ¡os bioensayos en laboratorio y para ios ensayos en invernadero, se obtuvieron de un cuitivo de laboratorio de ¡a Universidad Pública de Navarra (UPNA) establecido a partir de pupas recibidas del Centre for Ecology and Hydro¡ogy (NERC-CEH) de Oxford (Reino Unido). La población se mantiene en e¡ insectario de ia UPNA a 25±1°C, con una humedad reiativa de¡ 70±5% y un fotoperiodo de 16:8 (luz: oscuridad). Las larvas se alimentan con una dieta artificial descrita anteriormente por Greene et al. (1976) y los adultos ad ¡ibitum con miel diluida al 30% (peso/volumen).
Las larvas de H. armígera utilizadas para la realización de los ensayos de campo ai aire libre procedían de una infestación natural del cultivo de tomate en Guadajira (Badajoz),
- Aislamiento y amplificación de ios cuerpos de oclusión
Los cuerpos de oclusión (occlusion bodies, OBs) o cuerpos de oclusión se extrajeron de larvas muertas triturando los cadáveres en agua bidestilada estéril con dodeci! sulfato sódico (SDS) al 0, 1 % (peso/volumen) y filtrando la suspensión resultante a través de muselina. Los cuerpos de oclusión se sedimentan por centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos. Posteriormente se realizaron 2 lavados con agua y se sedimentaron los cuerpos de oclusión en las mismas condiciones. Finalmente, los cuerpos de oclusión purificados se resuspendieron en agua bidestilada estéril y se determinó su concentración mediante un recuento de muestras por triplicado utilizando un hemocitómetro mejorado de Neubauer (Hawksley, Laucing, Reino Unido) bajo microscopía de contraste de fases a 400x.
Los cuerpos de oclusión de los diferentes aislados se multiplicaron mediante un único pase en larvas de cuarto estadio de H. armígera. Grupos de 24 larvas procedentes de la colonia de laboratorio se individualizaron y mantuvieron sin alimento durante aproximadamente 12 horas. Pasado ese tiempo fueron infectadas per os mediante el método de la gota (Hughes y Wood, 1981) con una concentración de 106 cuerpos de ociusión/ml, sacarosa al 10% (peso/volumen) y 0.001 % (peso/volumen) del colorante alimenticio Fiuorelia Biue (Hilton- Davis, Cincinnati, Ohio). El colorante alimenticio permite diferenciar las larvas que han ingerido la suspensión de cuerpos de oclusión de las que no lo han hecho. Las larvas con intestinos azules, y por tanto las que bebieron la suspensión, se criaron de forma individual con dieta artificial hasta su muerte. La ventaja de este método de la gota es que la dosis o concentración viral se ingiere en un corto periodo de tiempo, lo cual es de especial importancia a la hora de calcular algunos parámetros como el tiempo medio de mortalidad (TMM).
Los cuerpos de oclusión purificados se almacenaron a -20°C hasta su caracterización molecular y biológica.
- Purificación de genotipos mediante ensayo de placa
Para realizar la purificación de ios distintos genotipos presentes en el aislado HearSP se procedió a un ensayo de placa (Muñoz et al., 2001). Para ello, se infectaron oralmente 25 larvas de cuarto estadio de H. armígera con la concentración que producía el 90% de mortalidad (CL90) de 106 cuerpos de ociusión/ml. A las 48 horas después de la infección se realizó una pequeña incisión en el último par de pseudópodos de las larvas con el fin de extraer la hemolinfa. En este momento la hemolinfa está llena de BVs (viriones brotados) que contienen una única nucleocápsida y por tanto un único genotipo. La hemolinfa se filtró a través de un filtro de 0,45
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para eliminar posibles contaminantes como las bacterias, y se diluyó posteriormente de forma seriada con un factor de dilución 5 con medio EX-CELL 420 (Sigma). Posteriormente se incubaron 2 x 106 células HzA 1 en placas de seis pocilios (35 mm de diámetro) a 27°C durante tres horas para permitir la deposición de las células. Pasado este tiempo se sustituyó el medio por 100 μΙ de las diluciones de hemolinfa. Ai cabo de una hora se sustituyó el inoculo viral contenido en las diluciones de hemolinfa por medio EX-CELL 420 nuevo con antibióticos al 1 % (penicilina-estreptomicina) (Lonza) y agarosa al 2% para evitar una excesiva propagación de la infección. Ai cabo de 5 días se tiñeron las células con rojo neutro con el fin de diferenciar las células sanas de las infectadas, ya que las células sanas se tiñen de una coloración rojiza, mientras que las infectadas dan lugar a una zona no coloreada denominada placa o calva, que se corresponde con un conjunto de células muertas debido a la infección por un único BV, y por tanto, por un único genotipo. Estas zonas de infección única (placas) se extrajeron con una pipeta Pasteur estéril y se diluyeron individualmente en 50 μΙ de medio EX-CELL 420. Cada suspensión se inyectó posteriormente en larvas de cuarto estadio de H. armígera para su multiplicación in vivo y así obtener grandes cantidades de cuerpos de oclusión, ios cuales se analizaron a nivel de ADN molecular con el fin de determinar el número de genotipos diferentes.
- Purificación de genotipos mediante dilución de punto límite
Para realizar la purificación de los genotipos obtenidos a partir de larvas muertas durante una epizootia en laboratorio en la segunda generación de una población de H. armígera procedente de un cultivo de algodón de Lebrija, se infectaron oralmente 25 larvas de cuarto estadio de H. armígera con 106 cuerpos de oclusión/mi. A las 48 horas después de la infección se extrajo la hemolinfa, se filtró a través de un filtro de 0,45 pm, y se diluyó posteriormente de forma seriada con un factor de dilución 5 con medio EX-CELL 420
(Sigma) con antibióticos al 1 % (penicilina-estreptomicina) (Lonza). A un volumen de 100 μΙ de cada dilución se mezclaron 900 μΙ de una suspensión de células HzAM1 a una concentración de 2 x 10s céiuias/ml. Se añadieron 00 μΙ de la suspensión virus-células a ios
10 primeros pocilios de una fila de una placa de 98, dejando ios dos últimos con una suspensión que contenía sólo células (sin virus) como control negativo. Se realizaron un total de cuatro repeticiones. Estas placas se incubaron a 28°C durante 7 días. Pasado ese tiempo, se observaron todos los pocilios ai microscopio para determinar la presencia de células infectadas. Los núcleos de las células infectadas se encuentran llenas de cuerpos de oclusión. En las diluciones en la que se encontró menos de un 10% de ios pocilios infectados, indicativo de que la infección del pocilio se ha realizado por único virión brotado (y por tanto un solo genotipo), se extrajo el sobrenadante de dichos pocilios con una pipeta Pasteur estéril. Este sobrenadante contiene viriones brotados (BVs) que se inyectaron en larvas de cuarto estadio de H. armígera para su multiplicación, de forma que se obtuvieron cuerpos de oclusión suficientes para poder realizar su caracterización molecular, y poder determinar la pureza de cada genotipo o el número de genotipos diferentes.
- Determinación del número de nucleocápsidas por virión
Para determinar si los viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODVs) de los aislados españoles del nucieopoiiedrovirus de H. armígera eran de tipo simple o múltiple, se liberaron los ODVs que se encontraban dentro de los cuerpos de oclusión ai incubar una suspensión de 109 cuerpos de oclusión con una solución alcalina (1 volumen de Na2C03 0, 1 M) durante 30 minutos a 28°C. La poliedrina y otros restos se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad (2.500 x g) durante 5 minutos. Para separar las distintas bandas (si son múltiples) o la única banda (tipo simple) el sobrenadante que contenía ios viriones se centrifugó en equilibrio de densidad (90.000 x g) durante 1 hora en un gradiente continuo de sacarosa al 30-60% (peso/volumen). Tras ello, se realizó una inspección visual y se fotografió, de forma que se pudo determinar la naturaleza de ios mismos.
- Extracción de ADN y análisis con endonucleasas de restricción
Para extraer el ADN, 100 μΙ de una suspensión de cuerpos de oclusión a la concentración de 109 cuerpos de oclusión/mi se incubaron con 100 μΙ de carbonato de sodio (Na2C03) 0,5 M, 50 μΙ de SDS al 10% (peso/volumen) y 250 μΙ de H20 a 60°C durante 10 minutos, para disolver la poliedrina y liberar ios viriones. Los cuerpos de oclusión no disueitos y otros restos se retiraron mediante centrifugación a baja velocidad (3.800 x g) durante 5 minutos. El sobrenadante que contenía los viriones se incubó con 500 μg de proteinasa K a 50°C durante 1 hora. El ADN viral se extrajo dos veces con un volumen de fenol saturado, seguido de uno con cloroformo, y se precipitó con 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío a 12.000 x g durante 10 minutos. Posteriormente, se lavó con etanol frío al 70% y se centrifugó durante 5 minutos. Finalmente, el ADN se resuspendíó en 100 μΙ de tampón TE 0, 1x (Tris-EDTA, pH 8) a 80°C durante 10 minutos. La concentración se estimó leyendo la absorción óptica a 260 nm en un espectrofotómetro (Biophotometer Plus, Eppendorf, Freiberg, Alemania).
Para el análisis mediante endonucleasas de restricción, 2 μg del ADN viral, o de los fragmentos amplificados por PCR, se incubaron con 10 U de una de las siguientes enzimas: EcoR\ y Bg!W (Takara Bio Inc. , Japón) durante 4 a 12 horas a 37°C. En el caso de los fragmentos de PGR, se utilizó la enzima Afefel , del mismo proveedor. Las reacciones se pararon por la adición de 4 μΐ de tampón de carga (azul de bromofenol al 0,25% (peso/ olumen), sacarosa al 40% (peso/volumen)). Las electroforesis se llevaron a cabo utilizando geies horizontales de agarosa ai 1 % (peso/ olumen) en tampón TAE (Tris-acetato 0,04 , EDTA 0,001 , pH 8,0) a 20 V durante 12 a 16 horas. Los fragmentos de ADN se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron sobre un transiluminador de ultravioleta (Chemi-Doc, BioRad, California, EE. UU.).
- Secuenciación completa de los genomas
Para la secuenciación completa de ios dos genotipos HearSPI B y HearLB6, se llevó a cabo la purificación de ADN en cloruro de cesio (CICs) (King y Possee, 1997). inicialmente, se realizó la liberación y purificación de ODVs como se indica en el apartado de determinación del número de nucleocápsidas por virión. Para ello, se mezclaron 500 μΐ de cuerpos de oclusión (109 cuerpos de oclusión/mi) con 500 μΙ de carbonato de sodio (Na2C03) 0, 1 M , y tras centrifugar en un gradiente continuo de sacarosa se obtuvo la única banda para cada uno de los tres genotipos. Con una aguja y jeringuilla de 1 mi se pinchó en el tubo de centrifugación donde se encontraba la banda y se aspiró, de forma que se recogió la totalidad de la banda, es decir, los ODVs de tipo simple. Estos viriones se diluyeron 1 :3 en búfer TE (Tris-EDTA, pH 8), y para concentrarlos se sedimentaron a 24.000 rpm durante 1 hora, y se resuspendieron en 400 μΙ de TE, Para la extracción del ADN, estos 400 μΙ de viriones purificados se mezclaron con 100 μΙ de una suspensión que contiene 20%
(peso/volumen) de sarcosii (Sodio Lauroil Sarcosina ó /V-Laurylsarcosine sodium sait,
Sigma) y se incubaron a 60°C durante 30 minutos. Esto permitió la iisis de los viriones y ruptura de las nucleocápsidas liberando el ADN al medio. Inmediatamente, se transfirió este lisado sobre 5 mi de una suspensión de cloruro de cesio (50% en TE (peso/peso)) que contenía a su vez 12,5 μΙ de bromuro de etidio (10 mg/ml), lo que permitió la tinción del ADN y por tanto su visuaiización, y posteriormente se centrifugó a 35.000 rpm durante ai menos
18 h a 20°C. Tras la centrifugación, el ADN era visible como dos bandas naranjas (debido al bromuro de etidio). Las dos bandas se correspondían con el ADN súper-enrollado (la banda de abajo) y ADN abierto circular (la banda de arriba). Mediante el uso de una aguja y jeringuilla de 1 mi se pinchó sobre el tubo y se extrajeron ambas bandas. Una vez extraídas, se retiró el bromuro de etidio con varios pases de butanol. Para ello, se añadió el mismo volumen de butanol, se mezcló y se centrifugó, y se eliminó la fase de arriba que contenía el butanol y el bromuro de etidio. Este paso se repitió varias veces hasta que la solución se vio ciara. Finalmente, se diaiizó la muestra en un vaso de precipitados que contenía 500 mi de búfer TE en agitación a 4°C, realizando entre 2-3 cambios de TE cada 8 h. Tras la diálisis, se transfirió el ADN a un tubo, se cuantificó en un espectrofotómetro y se guardó a 4°C hasta su uso. También se realizó un análisis de restricción con las endonucleasas EcoRl y fíg/il para confirmar la identidad y calidad del ADN.
La secuenciación del ADN de los dos genotipos la llevó a cabo la empresa Lifesequencing S.L, (Paterna, Valencia), mediante la tecnología PacBio. Se utilizaron entre 5 y 10 g del ADN purificado por CICs. Básicamente, se realizó una librería genómica en un vector de secuenciación con el ADN de cada uno de los genotipos, con insertos de 0kb. Se llevaron a cabo 24.627 y 3.731 lecturas para ios genomas de HearSPI B y HearLB6, respectivamente. Finalmente, se realizó el ensamblaje de toda la información, siendo necesario el uso del programa HGAP v2.0.2. Las secuencias completas obtenidas para cada uno de ios genotipos se compararon con las ya existentes de otros aislados de HearSNPV (HearSNPV- G4, HearSNPV-C1 , HearSNPV-NNg1 y HearSNPV-Aus) y entre sí, usando el programa informático Clone Manager (Scientific & Educational Software, 1994-2007).
- Construcción de las mezclas de genotipos
Con el fin de encontrar la mezcla de genotipos que tuviera las mejores propiedades insecticidas para el control de H, armígera, se realizaron mezclas con distintos genotipos.
Para ello se seleccionaron cinco genotipos en base a sus características insecticidas con el fin de poder optimizar la actividad biológica y obtener así una mezcla con mayor patogenicidad, virulencia y/o productividad viral. Por un lado, se seleccionaron ios dos únicos genotipos obtenidos a partir del aislado HearSPI , HearSPIA y HearSPI B, ya que
HearSPI es el aislado con las mejores características insecticidas contra larvas de H. armígera en España (Arrizubieta et al., 2014). Por otro lado, se seleccionaron ios siguientes tres genotipos procedentes de larvas infectadas colectadas en Lebrija: HearLBI , porque es uno de los más virulentos y uno de los más productivos en términos de la cantidad de cuerpos de oclusión producidos en insectos infectados: HearLB3 porque es uno de los más rápidos; y HearLB6 por ser el más virulento. En total se hicieron ocho mezclas de genotipos.
Entre las que incluyen únicamente los genotipos de HearSPI encontramos
HearSPI A: HearSP B en proporción 1 : 1 , a la que se hará referencia a lo largo de la presente memoria como HearSP1A:SP1 B (1 : 1) y HearSP1A:HearSP1 B en proporción 1 :2, a la que se hará referencia como HearSPI A:SP1 B (1 :2). Por otro lado, también se construyeron cuatro mezclas que contenían únicamente los genotipos de Lebrija como son
HearLBI :HearLB3 en proporción 1 : 1 , a la que se hará referencia como HearLBI :LB3,
HearLB3:HearLB6 en proporción 1 : 1 también y a la que se hará referencia como
HearLB3:LB6, HearLBI :HearLB3:HearLB8 en proporción 1 : 1 : 1 y a la que se referirá HearLB1 :LB3:LB6 y finalmente también se hizo una mezcla con los seis genotipos de Lebrija en las proporciones encontradas en la población, a la que se le llamó HearLBmix, Finalmente, se construyeron dos mezclas que incluían un genotipo del aislado HearSPI y otro de Lebrija, así la mezcla HearSPI B:HearLB1 contenía el genotipo HearSPI B y HearLBI en proporción 1 : 1 , a la que se hará referencia como HearSPI B:LB1 , y la mezcla HearSPI B:HearLB6 que contiene el genotipo HearSPI B y HaerLB6 también en proporción 1 : 1 , y la que se hará referencia como HearSPI B:LB6.
Por otro lado, es sabido que las mezclas co-ocluidas, ai estar ios genotipos en una proporción dentro del mismo cuerpo de oclusión, la proporción se mantiene a la hora de entrar en el huésped (Bernal et al., 2013b; Clavijo et al., 2010). Pero cuando se mezclan simplemente cuerpos de oclusión con un mismo genotipo, la proporción no tiende a mantenerse a la hora de entrar a las células epiteliales del mesenterón. Además en un trabajo realizado recientemente en nuestro laboratorio se ha podido comprobar que las mezclas co-ocluidas son más rápidas en matar ai huésped que las mezclas de cuerpos de oclusión (Berna! et ai., 2013b). Así, para la construcción de las mezclas co-ocluidas iniciaimente se homogenízaron las concentraciones de los distintos genotipos, diluyéndolos a una misma concentración de 109 cuerpos de oclusión/ml y mezclando posteriormente el mismo volumen de cada uno de ellos, por lo que las proporciones fueron en todos los casos 1 : 1 , excepto en el caso de la mezcla HearSPI A:SP1 B (1 :2), en la que se mezcló el doble de volumen de HearSPI B que de HearSPI A. En estas mezclas los cuerpos de oclusión contienen viriones del mismo genotipo. Posteriormente para co-ocluir los distintos genotipos dentro de un mismo cuerpo de oclusión (mezclas co-ocluidas), se infectaron oralmente larvas de H. armígera del cuarto estadio con las diferentes mezclas de cuerpos de oclusión a una concentración de 106 cuerpos de oclusión/mi (las mezclas de cuerpos de oclusión producidas antes se diluyeron por un factor de mil (103) antes de infectar las larvas). De esta forma, la mezcla de cuerpos de oclusión con viriones (ODVs) del mismo genotipo entra en el tubo digestivo, y tras la liberación de los viriones, se produce una mezcla de viriones de distintos genotipos (provenientes de distintos cuerpos de oclusión). Ai entrar y replicarse en la misma célula se co-ocluyen en el mismo cuerpo de oclusión, formándose las mezclas coocluidas donde los viriones de distintos genotipos quedan co-ocluidos en un mismo cuerpo de oclusión y es más en la misma proporción en la que han sido inoculados (Berna! et al., 2013b; López-Ferber et al., 2003) (Fig. 6).
Resumiendo, en total se construyeron ocho mezclas co-ocluidas: HearSP A:SP1 B (1 : 1), HearSP1A:SP1 B (1 :2), HearLBI :LB3 (1 : 1), HearLB3:LB6 (1 : 1 ), HearLBI :LB3:LB6 (1 : 1 : 1), HearLBmix (seis genotipos en su proporción natural, HearLB1-6), HearSP1 B:LB1 (1 : 1) y HearSPI B:LB6 (1 : 1). - Identificación de genotipos en las mezclas mediante PCR y análisis de restricción del producto de PCR
Con el fin de determinar la naturaleza de ios distintos genotipos puros, aparte del análisis de restricción del genoma completo, el ADN viral obtenido de los mismos se sometió a una amplificación por PCR usando las parejas de cebadores F-hr1/R-br1 y F-hr5-/R-hr5, Para la PCR se mezclaron 20,5 μ! H20, 2,5 μΙ de tampón polimerasa (10x), 0,75 μΙ de cloruro de magnesio (50 rr¡M gCI2), 0,25 μ! de dNTPs (nucieótidos fosfatados), 0,25 μΙ de ios respectivos cebadores (R-hr1/F-hr1 o F-hr5/R-hr5), 0,25 μΙ de Taq polimerasa y 0,25 μΙ de ADN extraído. Las condiciones de las reacciones fueron de un periodo de desnaturalización a 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos que incluyen la desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, el alineamiento que se produce a 60°C durante 1 minuto y la elongación a 72°C durante 3 minutos, seguido finalmente de 10 minutos a 72°C para terminar la elongación.
Posteriormente, los fragmentos amplificados por PCR para la hr1 y la hr5 se digirieron con la endonucleasa A/del de la manera descrita anteriormente.
- Bioensayos sobre insectos
La actividad insecticida de los genotipos de HearSNPV purificados a partir del aislado HearSPI (HearSPIA y HearSPI B) y los procedentes de Lebrija (Sevilla) (HearLBI , HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS y HearLB6), así como de las mezclas co-ocluidas HearSP1A:SP1 B (1 : 1), HearSP1A:SP1 B (1 :2), HearLBI :LB3, HearLBS: LB6, HearLBI :LB3:LB6, HearLBmix, HearSPI B:LB1 y HearSPI B:LB8, se comparó con la del aislado silvestre HearSPI , seleccionado anteriormente como el aislado de la Península Ibérica con las mejores características insecticidas (Arrizubieta et al., 2014). Las curvas de concentración-mortalidad (concentración letal 50, CL50), el tiempo medio de mortalidad (TMM) y la productividad viral (número de cuerpos de oclusión producidos por una sola larva, cuerpos de oclusión/larva) se determinaron mediante ensayos per os (por vía oral), llevados a cabo utilizando el método de la alimentación de la gota, descrito anteriormente.
Para determinar la CL50 de ios distintos genotipos, de las mezclas de estos y del aislado HearSPI se utilizaron cinco concentraciones virales: 5,7 x 10¾, 1 ,9 x 10¾, 6,3 x 104, 2, 1 x 104 y 7,0 x 103 cuerpos de oclusión/ml para larvas de segundo estadio, que previamente se había determinado que matan entre el 95% y el 5% de los insectos experimentales, aproximadamente. Las larvas que ingirieron la suspensión en los 10 minutos siguientes se transfirieron a pocilios individuales de una placa de cultivo de 24 pocilios que contenían la dieta artificial en forma de cubo como se ha descrito anteriormente. Los bioensayos con 24 larvas por concentración viral y 24 larvas como controles negativos se llevaron a cabo en tres ocasiones. Las larvas se criaron a 25°C y se tomaron datos de la mortalidad cada 24 horas hasta que los insectos murieron o se transformaron en pupas. Los resultados de mortalidad inducida por virus se sometieron a análisis iogit utilizando el programa POLO-PC (Le Ora Software, 1987).
El tiempo medio de mortalidad (T M) de los genotipos individuales, de las diferentes mezclas de genotipos y del aislado HearSPI se determinó mediante bioensayo sobre larvas de H. armígera de segundo estadio. Las larvas se inocularon por ingestión con la CL90 (concentración que mata aproximadamente al 90% de las larvas inoculadas) de cada virus calculada en los ensayos de patogenicidad descritos anteriormente (2,0 x 105, 1 ,8 x 105, 9,9 x 104, 1 ,5 x 105, 1 ,5 x 105, 2,5 x 105, 3,5 x 105, 1 ,5 x 105, 9,8 x 104, 1 ,0 x 105, 1 ,5 x 105, 1 ,2 x 105, 1 ,8 x 105, 9,3 x 104, 1 ,2 x 105, 5,8 x 104 y 5, 1 x 104 cuerpos de ociusión/ml para el aislado silvestre HearSPI y los genotipos puros HearSPI A, HearSPI B, HearLBI , HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLB5, HearLB6, y para las mezclas co-ocluidas HearSPI A:SP1 B (1 : 1), HearSP1A:SP1 B (1 :2), HearLBI :LB3, HearLB3:LB8, HearLBI :LB3:LB6, HearLBmix, HearSPI B:LB1 y HearSPI B:LB6, respectivamente). Como testigo se incluyó un grupo de larvas tratadas con la misma solución sin cuerpos de oclusión. Las larvas se mantuvieron individualmente con dieta a 25°C y se registró la mortalidad cada 8 horas hasta que todas las larvas murieron o puparon. Se infectaron 24 larvas por tratamiento y se realizaron tres repeticiones independientes. Los datos de mortalidad según el tiempo se sometieron a un análisis de supervivencia de Weibull utilizando el programa de Modelado Interactivo Lineal Generalizado (GLIM) (Crawley, 1993). La distribución de la mortalidad según el tiempo de ios diferentes aislados se analizó gráficamente. Mediante observación microscópica de las larvas muertas se pudieron identificar aquellas que habían muerto por enfermedad causada por nucleopoliedrovirus, y fueron las que se incluyeron en el análisis.
La producción de cuerpos de oclusión de ios genotipos puros, de las mezclas de genotipos y del aislado HearSPI se determinó en larvas de segundo estadio de H. armígera infectadas mediante el método de la gota y con las concentraciones de cuerpos de oclusión que producen el 90% de mortalidad (las mismas concentraciones usadas en el estudio del tiempo medio de mortalidad). Todas las larvas que murieron de enfermedad causada por nucleopoliedrovirus se recogieron y se almacenaron a -20°C hasta ser utilizadas para el recuento de cuerpos de oclusión. Para ello, cada larva se homogeneizó en 100 μΙ de agua destilada y el rendimiento total de cuerpos de oclusión por larva se estimó mediante un recuento de muestras por triplicado utilizando un hemocitómetro mejorado de Neubauer. Los datos se normalizaron mediante una transformación log y se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa SPSS 15.0. Ejemplo 1 : Aislamiento de nuevos genotipos del nucieopoliedrovirus de H. armígera
1.1. A partir del aislado HearSNPV-SP1
El aislado HearSNPV-SP1 , o de forma más abreviada HearSPl ha sido seleccionado en estudios anteriores como el aislado de la Península Ibérica con las mejores características insecticidas contra H. armígera (Figueiredo et ai., 1999; Arrizubieta et al. , 2014). Además, los perfiles de restricción realizados con diferentes endonucleasas en dichos estudios mostraron bandas submolares, lo que indica la presencia de diferentes variantes genotípicas dentro del aislado silvestre (Fig, 4, 7, 8).
Para aislar ios posibles genotipos dentro del aislado HearSPl se realizó un ensayo de placa in vitro como se describe en la sección de material y métodos. De esta forma se obtuvieron 145 clones, constituidos cada uno de ellos por un único genotipo. Mediante el empleo de técnicas moleculares basadas en el uso de endonucleasas de restricción se identificaron dos genotipos diferentes entre ios distintos clones aislados, a ios que se denominó HearSNPV-SP A y HearSNPV-SP1 B, o de forma abreviada, HearSPl A y HearSPl B (Fig. 7A). El genotipo HearSPl A se encontró en el 69% de los clones, mientras que el genotipo HearSPl B se encontró en el 31 % (Fig. 7A).
1.2. A partir de cadáveres de insectos muertos durante una epizootia en laboratorio
Durante una epizootia ocurrida en la segunda generación de una población de H. armígera establecida en laboratorio a partir de larvas recogidas en cultivo de algodón en Lebrija (Sevilla) en agosto de 2009, se recogieron individualmente 17 cadáveres con típicos signos de muerte por enfermedad causada por nucieopoliedrovirus. Los cuerpos de oclusión de cada cadáver individual se purificaron como se menciona en la sección de materiales y métodos descrita anteriormente. A veces la cantidad de cuerpos de oclusión que se obtiene de una sola larva no es suficiente para realizar una caracterización y es necesario amplificar estos aislados inoculando a larvas sanas de una colonia de laboratorio mediante el método de la gota. Por ello, se realizó la amplificación de las muestras en larvas en condiciones de laboratorio, como se menciona anteriormente en el apartado de aislamiento y amplificación de los cuerpos de oclusión. Entre los 17 aislados multiplicados sólo se pudieron identificar 6 perfiles diferentes, a ios que se denominó HearSNPV-LB1 , HearSNPV-LB2, HearSNPV-LB3, HearSNPV-LB4, HearSNPV-LB5 y HearSNPV-LB6 o, de forma abreviada, HearLBI , HearLB2, HearLBS, Hearl_B4, HearLBS y Hearl_B6 (Fig. 7B y 7C). Los 6 genotipos se encontraron en diferentes proporciones, siendo el genotipo HearLBS el más abundante, ya que se aisló en 6 larvas diferentes (lo que representa el 35,3% del total de genotipos), seguido por HearLBI y HearLB2, ¡os cuales se aislaron en 4 larvas (23,5%), y por último los genotipos HearLB4, HearLBS y HearLB6, que se aislaron en una sola larva cada uno (5,9%),
Posteriormente con el fin de determinar la pureza de los seis aislados identificados se llevó a cabo un ensayo de dilución límite (EPD, end point dilution) como se describe en la sección de material y métodos. Tras la infección oral de larvas de H. armígera con los distintos aislados se extrajo la hemolinfa, la cual se diluyó de forma seriada y se utilizó para la infección de células. Posteriormente, se seleccionaron 20 pocilios con presencia de cuerpos de oclusión en la dilución que produjo menos de 10% de infección viral (alrededor de 1/500 para todos los aislados). Los BVs obtenidos se multiplicaron en larva mediante inyección intrahemoceiica y se analizó el ADN viral de ios cuerpos de oclusión obtenidos con las endonucieasas Bgñ\ y EcoR\ como se menciona en la sección de material y métodos. Todos los clones/pocilios obtenidos a partir de un solo aislado presentaron el mismo perfil de restricción que el del aislado original, a partir del cual se obtuvieron los clones, por lo que se deduce que cada uno de los 8 aislados está compuesto por un solo genotipo.
Ejemplo 2: Caracterización moiecuiar de Sos nuevos genotipos de HearSNPV
2.1. Determinación del número de nucleocápsidas por vsrión
Para determinar si ios diferentes genotipos eran de tipo simple o múltiple se realizó una liberación de ios ODVs y una centrifugación de ios mismos en gradiente continuo de sacarosa. Todos los genotipos presentaron una única banda, lo que indica que todos ios viriones contienen una única nucleocápsida (Fig. 5A). Si se tratara de aislados de tipo múltiple se observarían varias bandas, y cada una de ellas contendría ODVs con diferente número de nucieocápsidas, ya que el peso de los viriones varía en función del número de nucleocápsidas que contienen (Fig. 5B). De esta observación se concluyó que todos ios aislados de HearNPV eran de tipo simple con una sola nucleocápsida por virión (ODV).
2.2. Perfiles de restricción
La digestión del ADN viral de los distintos genotipos con la endonucleasa de restricción EcoR\ produce un perfil característico y único para cada uno de ellos (Fig. 7A, 7B y 7C; Tabla 5), pudiendo utilizarse algunos de los fragmentos de restricción generados por esta enzima como marcadores para diferenciarlos. Por ejemplo, el fragmento EcoRi-B del genotipo HearLB4 (11 ,0 kb) es mayor que en los genotipos HearLB2, HearLBS y HearLBo (10,5 kb), los genotipos HearSPIA y HearSPI B (10, 18 kb) y el genotipo HearLBI (10, 15 kb), mientras que no se encuentra en el genotipo HearLBS. Los genotipos HearLBI (EcoRI-D), HearSPl A (£coR¡-D) y HearSPl B (EcoRI-E) presentan un fragmento único común a los tres genotipos (9,20 kb), mientras que en los genotipos HearLB2 (£coRI-D), HearLB3 (EcoRI-D), Hearl_B4 (EcoRI-D), HearLBS (EcoRI-C) y Hearl_B6 (EcoRI-D) dicho fragmento es de 9,38 kb. El fragmento £coR!-E (9,01 kb) del genotipo HearLBI sólo está presente en este genotipo, ai igual que el fragmento £coRi-E (8,70 kb) del genotipo HearLB4 que sólo se encuentra en el genotipo HearLBS (EcoRI-D), Por otro lado, el fragmento EcoRI-F (7, 16 kb) del genotipo HearSPIA solo se localiza en el perfil del genotipo HearLB2 (EcoRI-F), aunque su tamaño es menor (7, 10 kb), mientras que el fragmento £coRi- del genotipo HearSPIA (5,26 kb) no está presente en los genotipos HearLB2 ni HearLBS. El genotipo HearLBS presenta un fragmento único de 3, 10 kb (EcoRI-S), mientras que no presenta un fragmento de 2,83 kb, presente en el resto de genotipos. No se observaron bandas submoiares en los perfiles de restricción de estos genotipos tras un pase en larva y ios perfiles se mantuvieron a lo largo de los pases, lo que indica la estabilidad y pureza de ios genotipos.
Los perfiles de restricción de estos genotipos también se diferencian mediante el uso de otras endonucieasas de restricción, como Bgft l (Fig. 7A y 7C).
En los perfiles obtenidos con ambas enzimas se observa claramente la presencia de bandas submoiares en el aislado silvestre HearSPl , poniendo de manifiesto que el aislado silvestre está compuesto por una mezcla heterogénea de genotipos. Así, en el perfil generado con la enzima EcoRI el aislado HearSPl muestra varias bandas submoiares en torno a 6,5-7 kb, que no se observan en el perfil del genotipo puro HearSPl B. Igualmente, en el perfil obtenido con la endonudeasa fíg/l i el aislado HearSPl muestra una banda submoiar de 18,8 kb, que no aparece en el perfil del genotipo HearSPl B. Por el contrario, la ausencia de dichas bandas en los genotipos puros demuestra la pureza de ios mismos, así el genotipo HearSPl B muestra una banda de 9,73 kb que no se observa en el perfil del aislado HearSPl
En la Tabla 5 se muestran los tamaños estimados de ios fragmentos de restricción generados tras la digestión del ADN viral de los distintos genotipos con la enzima EcoRI . La diferencia en el número de fragmentos de los genotipos HearSPIA, HearSPl B, HearLBI , HearLBS, HearLB6, HearG4, HearCI , HearNNgl y HearAus con ios genotipos HearLB2, HearLB4 y HearLBS se debe a que sus genomas se encuentran completamente secuencíados, por lo que se detectan fragmentos de pequeño tamaño que no se pueden detectar mediante el análisis de patrones de bandas ya que no son visibles en los perfiles de restricción (señalado con un asterisco [*] en la Tabla 5).
Tabla 5: Tamaños estimados de los fragmentos de ios genotipos HearSPIA, HearSPl B,
HearLBI , HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS y HearLB6, y de los aislados HearG4, HearCl , HearNNgl y HearAus obtenidos por digestión con EcoR! , y tamaño tota! estimado de los genomas.
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Fragrru snto HearSPI A HearSPI E HearLBI HearLB5 HearLBS HearLB" 4 HearL
A 13,55 13,54 13,55 13,55 13,58 13,55 13,55
B 10,18 10,18 10,15 10,50 10,5 11 ,00 9,74
C 9,73 9,73 9,80 9,74 9,74 9,74 9,38
D 9,20 9,20 9,20 9,38 9,38 9,38 8,70
E 8,23 8,21 8,26 8,26 8,26 8,70 8,26
F 7,16 6,52 6,49 7,10 6,39 8,26 6,45
G 8,30 6,30 6,29 6,45 6,30 6,45 6,29
H 5,98 6,15 5,99 6,29 6,23 5,98 5,98
¡ 5,93 5,98 5,96 5,98 5,98 5,93 5,93
J 5,85 5,93 5,86 5,93 5,93 5,85 5,85
K 5,85 5,84 5,84 5,85 5,84 5,84 5,84
L 5,68 5,69 5,68 5,84 5,68 5,68 5,68
M 5,26 5,25 5,26 5,68 4,73 5,25 5,25
N 4,73 4,73 4,74 4,73 4,57 4,73 4,73
0 4,57 4,57 4,57 4,57 4,42 4,57 4,57
P 4,42 4,42 4 , 42 4,42 4,40 4,42 4,42
Q 4,40 4,40 4,40 4,40 3, 32 4,40 4,40
R 3,34 3,34 3,34 3,32 3,00 3,32 3,32
S 3,00 3,00 3,00 3,00 2,82 3,00 3,10
T 2,83 2,83 2,83 2,83 1 ,01 2,83 3,00 u 1 ,74 1 ,74 1 ,74 1 ,70 0,78 1 ,70 1 ,70
V 1 ,01 1 ,01 1 ,01 1 ,01 0,48 1 ,01 1 ,01
X 0,99 0,97 0,98 0,98 0,45* 0,98 0,98
Y 0,97 0,78 0,78 0,78 0,42* 0,78 0,78 z 0,78 0,47 0,48 0,48 0,41* 0,48 0,48 a 0,48 0,45* 0,45* 0,31*
b 0,42* 0,42* 0,41* 0,18*
c 0,41* 0,41* 0,31* 0,02*
d 0,31* 0,18* 0,18*
e 0,18* 0,02* 0,02*
0,02*
Tota! 132,48 132,26 131 ,97 132,77 130,95 133,83 129,3 * Fragmentos de pequeño tamaño detectados por secuenciación que no son visibles en ¡os perfiles de restricción.
Continuación Tabla 5:
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Fragmento HearLB8 HearG4 HearCI HearNNgl HearAus
A 13,55 14,13 14,13 13,51 13,44
B 10,50 13,45 12,84 10,20 10,15
C 9,74 10,15 9,75 9,73 9,48
D 9,38 9,05 9,05 9,20 9,06
E 8,26 6,64 6,91 8,23 8,23
F 6,45 o, 3o 6,54 6,60 6,68
G 6,29 6,29 6,30 6,30 6,28
H 5,98 5,99 6,00 6,23 6,00
1 5,93 5,84 5,84 6,00 5,94
J 5,85 5,84 5,84 6,00 5,84
K 5,84 5,67 5,67 5,80 5,84
L 5,68 4,75 4,74 5,80 5,70
M 5,25 4,58 4,65 5,70 4,83
N 4,73 4,42 4,57 4,75 4,75
0 4,57 4,40 4,41 4,57 4,57
P 4,14 4,40 4,41 4,41
Q 4,40 3,68 4,14 4,40 4,40
R 3,32 3,36 3,36 3,34 3,68
S 3,00 3,00 3,00 3,00 3,35
T 2,83 2,83 2,83 2,83 3,00
u 1 ,01 1 ,74 1 ,74 1 ,74 1 ,74
V 0,98 1 ,48 1 ,00 1 ,00 1 ,00
X 0,78 1 ,00 0,78 0,80 0,80
Y 0,48 0,78 0,48 0,48 0,48
z 0,45* 0,48 0,45* 0,45* 0,45*
a 0,42* 0,45* 0,42* 0,41* 0,41*
b 0,41* 0,41* 0,41* 0,41* 0,30*
c 0,31* 0,31* 0,31* 0,31* 0,18*
d 0,18* 0,18* 0,18* 0,18* 0,02*
e 0,02* 0,02* 0,02* 0,02*
Tota! 130,99 131 ,42 130,76 132,40 131 ,01 * Fragmentos de pequeño tamaño detectados por secuenciación que no son visibles en ios perfiles de restricción.
2.2. Diferenciación por amplificación por PCR y digestión del fragmento amplificado
Una diferenciación más precisa de cada genotipo se obtiene mediante la amplificación de regiones del genoma características para cada uno de los genotipos mediante la técnica de la PCR (reacción en cadena de la poiimerasa), utilizando cebadores específicos diseñados en las zonas de variabilidad, seguido de una digestión de los fragmentos amplificados por PCR con endonucleasas de restricción.
Las comparaciones de ios genomas completos secuenciados hasta el momento de HearSNPV han mostrado que las zonas de variabilidad se corresponden principalmente con las regiones homologas (hr1 , hr2, hr3, hr4 y hr5) y con los genes bro (Zhang et al., 2005; Ogembo et al., 2009). En este caso se diseñaron cebadores específicos para amplificar las regiones homologas hr1 y hr5.
Así, se diseñaron los siguientes cebadores:
- Para la hr1 :
- directo F-hM : 5'- CGAAATCGACAACACCATGCA-3 (SEQ ID NO: 1),
- inverso R-hr1 : 5'- ACTTTTGTACGCCAGAGACGA-3' (SEQ ID NO:2).
- Y para la hr5:
- directo: F-hr5: 5'- CTAGCCGGTCCGTTTCTGTT-3' (SEQ ID NO:3),
- inverso: R-hr5: 5;- GCCCCACCCAAAACATAACG-3' (SEQ ID NO:4).
Se comprobó su utilidad para la amplificación de las regiones homologas 1 y 5 (hr1 y hr5), respectivamente, mediante PCR como se indica en el apartado sobre las técnicas utilizadas. El resultado obtenido tras someter a electroforesis los fragmentos amplificados se muestra en la figura 8A. Para la hr1 se obtuvieron fragmentos amplificados de 2.177 y 2.117 nucleótidos para HearSPI B y HearLB6, respectivamente, y para la hr5 se obtuvieron fragmentos de 2.326 y 2.330 nucleótidos para HearSPI B y HearLB8.
Para poder diferenciar los genotipos de forma clara, los fragmentos amplificados por PCR para la hr1 y hr5 se digirieron con la endonucleasa A/del . Dichos fragmentos, una vez digeridos, fueron sometidos a electroforesis, como se describe anteriormente. El resultado obtenido tras someter a electroforesis los fragmentos digeridos se muestra en la figura 8B y
Tabla 6. En el caso de la hr1 , la digestión con Nde\ generó 6 fragmentos de 857, 508, 381 , 306, 78 y 47 nucleóíidos para HearSPI B, y 5 fragmentos de 1 ,210, 475, 307, 78 y 47 nucleótidos para HearLB8, En el caso de la hr5, la digestión con Λ/efel generó cuatro fragmentos de 1.120, 917, 211 y 78 nucleótidos para HearSPI B, y 3 fragmentos de 1.120, 998 y 212 nucleótidos para HearLB6.
Las secuencias completas de la región homologa 1 (hr1) correspondientes a cada uno de los dos genotipos HearSPI B y HearLB6 están representadas por SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Por otro lado, las secuencias completas de las región homologa 5 (hr5) correspondientes a cada uno de ios dos genotipos HearSPI B y HearLBo están representadas por SEQ ID NQ: 11 y SEQ ID NQ: 12, respectivamente. Los alineamientos de dichas secuencias con las de las zonas análogas de los genomas de HearG4, HearCI , HearNNgl y HearAus se muestran en la figura 9.
Tabla 8: Cebadores específicos diseñados en la hr1 y hr5, secuencia de nucleótidos, tamaño de los fragmentos amplificados para cada genotipo, número de fragmentos obtenidos tras digerir el fragmento amplificado por PCR con la endonucleasa A/del, tamaño de dichos fragmentos y número de referencia de la secuencia del fragmento amplificado por PCR.
N° fragmentos Tamaño fragmentos
Cebadores Tamaño
Genotipo generados iras generados tras
(secuencia) amplicón ID NO digestión Nde\ digestión Afcfei
857, 508, 481 , 306,
HearSPI B 2.177 6 5
78, 47
F-hr1 (SEQ ID NO:1) HearLB6 2.1 17 5 1 .210, 475, 307, 78, 47 6
1 .251 , 425, 383, 189,
HearG4 2.358 6
77, 33
1 .145, 425, 197, 189,
R-hr1 (SEQ ID NO:2) HearCI 2.252 6
77, 33
HearNNgl 2.260 5 963, 505, 385, 360, 47
1 .237, 425, 383, 189,
HearAus 2.345 6
77, 34
HearSPI B 2.326 4 1 .120, 917, 21 1 , 78 7
F-hr5 (SEQ ID NO:3) HearLB6 2.330 3 1 .120, 998, 212 8
1 .120, 778, 21 1 , 210,
HearG4 2.475 6
78, 78
R-hr5 (SEQ ID NO:4) HearCI 1 .872 4 1 .1 19, 464, 21 1 , 78
HearNNgl 2.330 4 1 .1 19, 920, 213, 78
1 .120, 778, 21 1 , 210,
HearAus 2.475 6
78, 78 Ejemplo 3: Actividad insecticida de los genotipos individuales y de las mezclas de genotipos co-ocluidos
Para la construcción de las mezclas se emplearon distintas combinaciones de genotipos en varias proporciones como se describe en el apartado anterior de técnicas referido a "Construcción de mezclas de genotipos". Brevemente, para obtener las mezclas co-ocluidas se inocularon oralmente (per os) larvas L4 de H. armígera con las mezclas de cuerpos de oclusión, que se obtuvieron mediante la preparación de mezclas de cuerpos de oclusión de distintos genotipos en las proporciones deseadas, y tras el proceso de infección se obtuvieron cuerpos de oclusión con viriones de los distintos genotipos co-ocluidos en el mismo cuerpo de oclusión en las proporciones deseadas.
3.1. Actividad insecticida del aislado silvestre HearSPI y de los genotipos puros HearSPI A y HearSPI B
Con el fin de determinar la actividad biológica de los genotipos individuales purificados a partir del aislado HearSPI se determinó la actividad biológica de ios dos genotipos individualmente y del aislado silvestre HearSPI (Figueiredo et al., 1999; Arrizubieta et al., 2014). La Tabla 7 muestra ios valores de la CL50 y la potencia relativa de los genotipos individuales HearSPI A y HearSPI B en comparación con la del aislado silvestre HearSP Las potencias relativas se refieren al ratio entre la CL50 de ios distintos genotipos respecto al aislado silvestre HearSPI
Los bioensayos de patogenicidad mostraron que la patogenicidad del genotipo HearSPI B es 2,8 veces superior a la del aislado silvestre HearSPI Sin embargo, el genotipo HearSPI A presenta una patogenicidad intermedia, siendo similar tanto a la del aislado silvestre HearSPI como a la del genotipo HearSPI B (Tabla 7).
Tabla 7. Actividad insecticida relativa de cuerpos de oclusión del aislado silvestre HearSPI y de los genotipos individuales HearSPI A y HearSPI B.
CL50 Límites Limites
Potencia
Tratamiento fiduciales 95% 95%
(cuerpos de T (h) fiduciales
relativa
oclusión/ml) Inferior Superior inferior Superior
Aislado
HearSPI 3,6 x 104 1 - - 102,8 a* 100,0 105,7 silvestre
Genotipos HearSPI A 2,4 x 1 Q4 1 ,5 0,8 2,7 99,6 a 96,5 102,8 individuales HearSPI B 1 ,3 x 10* 2,8 1 ,6 4,9 98,3 a 95,3 101 ,4
*Las letras iguales que acompañan a ios valores indican que no hay diferencias significativas entre ios trat< amientes (f-te; 3t, P>0,0; 5). No se observan diferencias significativas en los tiempos medios de mortalidad (TMM) entre los genotipos puros y el aislado silvestre, siendo HearSPIA y HearSPI B estadísticamente igual de rápidos matando las larvas de segundo estadio de H. Armígera que aislado silvestre (Tabla 7).
Además, los genotipos HearSPIA (5,2 x 107 cuerpos de oclusión/larva) y HearSPI B (5,3 x 107 cuerpos de oclusión/larva) son igual de productivos que el aislado HearSPI (7,3 x 107 cuerpos de oclusión/larva), en larvas inoculadas en el segundo estadio de H. armígera (Fig. 10).
Por tanto podemos concluir que el genotipo puro HearSPI B presenta mejores cualidades insecticidas ya que su patogenicidad es mayor que la del aislado silvestre o el genotipo puro HearSPIA, mientras que su virulencia (TMM) y producción de cuerpos de oclusión no son inferiores a las de los otros aislados/genotipos.
3.2. Actividad insecticida de los genotipos individuales de Lebrija (HearLB)
Con el fin de realizar la caracterización biológica de los genotipos individuales procedentes de Lebrija se determinó la actividad biológica de ios distintos genotipos individualmente y se comparó con el aislado HearSPI (Figueiredo et al,, 1999; Arrizubieta et al,, 2014) en términos de patogenicidad, virulencia y productividad como se ha descrito en el apartado 3.1.
La Tabla 8 muestra los valores de la CL50 y la potencia relativa del aislado HearSPI y de los genotipos individuales HearLBI , HearLB2, HearLB3, HearLB4, HearLBS y HearLB6. Estos valores permiten observar como los límites fiduciales ai 95% de las potencias relativas calculadas para la CL50 se solapan ampliamente en todos ios tratamientos, lo que indica que la patogenicidad es similar para los genotipos puros y el aislado HearSP
Tabla 8. Actividad insecticida relativa de cuerpos de oclusión del aislado silvestre HearSPI y de ios genotipos individuales HearLBI , HearLB2, HearLBS, HearLB4, HearLBS y HearLB8.
CL50 Límites Límites
(cuerpos de Potencia fiduciales 95% fiduciales 95%
TMM (h)
Tratamiento oclusion/ml) relativa Inferior Superior Inferior Superior
HearLBI 1 ,2 x 104 1 - - 109,8 a* 108, 1 11 1 ,5
Genotipos HearLB2 1 ,8 x 104 0,8 0,4 1 ,4 108,0 a 106,4 109,7 ndividuales HearLBS 1 ,5 x 104 0,8 0,4 1 ,5 1 16,3 be 1 14,5 118,2
HearLB4 1 ,6 x 104 0,7 0,5 1 ,4 1 18,4 c 1 16,9 119,9 HearLBS 1 ,4 x 104 0,8 0,5 1 ,5 109, 1 a 107,3 110,9 HearLB6 1 ,3 x 104 0,9 0,5 1 ,8 108,9 a 107,4 110,6 lisiado HearSPI 1 ,6 x 104 08 04 ΪΑ 1 14,5 b 1 12,8 116,4
*Las letras diferentes que acompañan a los valores indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (Mest, P<0,05).
Por otro lado, ios genotipos HearLBI , HearLB2, HearLBS y HearLB6 fueron significativamente más rápidos para matar a las larvas de segundo estadio de , armígera que el resto de genotipos y el aislado HearSP (Tabla 8),
Los datos de producción de cuerpos de oclusión fueron analizados mediante análisis ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SPSS 15.0 (Fig. 1 1). El genotipo HearLBI es el más productivo (5,3 x 108 cuerpos de oclusión/larva), aunque no presenta diferencias significativas con el genotipo HearLB4 (4,2 x 108 cuerpos de oclusión/larva). Además, ios genotipos HearLBI , HearLB4 y HearLBS son más productivos que el aislado HearSPI en larvas de segundo estadio de H, armígera.
3.3. Actividad insecticida de las mezclas co-oc!uidas obtenidas con los cinco genotipos seleccionados en los apartados anteriores (punto 3.2 y 3.3), y de la mezcla HearLBmix
En base a las mínimas diferencias de actividad insecticida observada entre los distintos genotipos se seleccionaron cinco de ellos en los apartados anteriores (punto 3.2 y 3.3) y se realizaron varias mezclas con el fin de optimizar la actividad biológica y obtener así una mezcla con mejores cualidades insecticidas. Para ello, se hicieron ocho mezclas co-ocluidas que incluían:
- HearSPI A:SP1 B en una proporción 1 : 1. El objetivo de esta mezcla es aumentar la patogenicídad ya que el genotipo HearSPI B es más patogénico que HearSPI , y en esta mezcla se encuentra en mayor proporción que en el aislado silvestre HearSPI (proporción natural 2: 1).
- HearSPI A:SP1 B en una proporción 1 :2. El objetivo de esta mezcla es también aumentar la patogenicídad ya que el genotipo HearSPI B es más patogénico que HearSPI , y en esta mezcla se encuentra incluso en mayor proporción que en la mezcla anterior.
- HearLBI :LB3 en una proporción 1 : 1. El genotipo HearLBI es uno de los más rápidos y además está entre los más productivos. Por otro lado, el genotipo HearLBS está entre los más productivos, debido a que es el más lento. El objetivo de esta mezcla es mantener la virulencia del genotipo HearLBI y la productividad de ambos. - HearLB3:LB6 en una proporción 1:1. E! genotipo HearLB6 es uno de los genotipos más rápidos y de los menos productivos, mientras que HearLB3 está entre los más productivos. En este caso, se pretende mantener la virulencia de HearLB6 y la productividad de HearLB3.
- HearLB1:LB3:LB6 en una proporción 1:1:1. Esta mezcla podría mantener la virulencia de los genotipos HearLBI y Hearl_B6, y la productividad de HearLBI y Hearl_B6.
- HearLBmix (HearLB1-6) en proporción 4:4:6:1:1:1. Esta mezcla incluye los seis genotipos de Lebrija en la proporción en la que se aislaron. El hecho de que cada uno de los genotipos se haya aislado en un proporción tras una epizootia puede tener algún significado a nivel biológico.
- HearSP1B:LB1 en una proporción 1:1. Esta mezcla podría mantener la patogenicidad del genotipo HearSPIB y la virulencia de HearLBI, y aumentar la productividad, ya que HearLBI es uno de ios genotipos más productivos.
- HearSPIB: LB8 en una proporción 1:1. En este caso se pretende mantener la patogenicidad de HearSPIB y la virulencia de HearLB8.
La actividad insecticida de las diferentes mezclas co-ociuídas se comparó en términos de patogenicidad, virulencia y productividad como se ha descrito en el apartado 3.1. Los genotipos individuales HearSPIA, HearSPIB, HearLBI, HearLB3 y HearLB8 se incluyeron como referencia.
Tabla 9: Actividad insecticida relativa de las mezclas de cuerpos de oclusión HearSP1A:SP1B (1:1), HearSP1A:SP1B (1:2), HearLBI :LB3, HearLB3:LB6, HearLBI :LB3:LB6, HearLBmix, HearSPIB: LB1 y HearSPIB: LB6, y de los genotipos individuales HearSPIA, HearSPIB, HearLBI, HearLBS y HearLB6.
CL50 Límites Límites
Potencia 95% TMM
Tratamiento (cuerpos de fiduciales Aducíale 5S 95% relativa
oclusión/mí) Inferior Superior (h) inferior Superior
HearSPIA ,6 x 104 1 - - 108,1 a* 105,7 110,4
112,4
HearSPIB 1,1 x 104 1,4 0,9 2,1 109,9 114,9
3b
Benotipos
HearLBI 1,6X10* 1,0 0,7 1,5 112,3 b 110,8 113,8 ndividuales
HearLBS 1,5X 104 1,1 0,8 1.8 113,5 b 112,0 115,0
109,5
HearLB6 1,3X 10* 1,2 0,9 1,9 107,8 111,3 ab
i/lezclas HearSP1A:SP1B
1,7x104 0,9 0,6 1,4 108,2 a 106,0 110,5
;o-oeiuidas (1:1) HearSP1A:SP1 E 3 110,9
1 ,2 x 104 1 ,3 0,8 2,0 108,6 113,2 (1 :2) ab
HearLBI :LB3 1 ,6 X 10* 1 ,0 0,7 1 ,5 115,8 b 114,3 117,3
HearLB3:LB6 2,1 X 104 0,8 0,5 1 ,2 114,1 b 112,8 115,5
108,7
HearLBI :LB3:LB6 1 ,1 X 04 1.5 0,9 2,3 107,3 110,1 ab
HearLBmix 1 ,4 x 104 1 ,1 0,7 1 ,8 115,3 b 113,6 117,1
HearSP1 B:LB1 9,8 x 03 1 ,6 1 ,1 2,4 112,8 b 110,6 115,3
108,8
HearSP1 B:LB6 5,7 x 103 2,8 1 ,8 4,3 106,5 111 ,1 ab
; diferentes que : acompañan a los valores 5 indics 3n que hay diferencia s significativas entre los tratamientos (f-test, P<0,05).
La Tabla 9 muestra los valores de la CL50, la potencia relativa de las mezclas co-ocluidas y de los genotipos individuales (con referencia a la de HearSP A), así como el tiempo medio de mortalidad. Sorprendentemente, la mezcla de genotipos HearSP1 B:Heari_B6 (5,7 x 103 cuerpos de oclusión /mi) resulta ser la más patogénica, entre 1 ,7 y 3,7 veces más patogénica que ios genotipos individuales y el resto de mezclas. Además, esta mezcla, con un TMM de 108,8 horas, es igual de virulenta que los genotipos más rápidos matando a las larvas, como puede ser HearSPIA, HearSPI B y HearLB8. Analizando los datos aportados en la Tabla 9 se concluye que no es esperabie que una u otra mezcla resulte más o menos patogénica, al no haber un patrón o norma que prediga a priori cuál de todas las mezclas es la más potente.
Los bioensayos de productividad mostraron que los genotipos HearLBI y HearLBS y las mezclas co-ocluidas HearLBI :LB3 y HearLBI :LB3:LB6 eran las más productivas (4,9 x 08, 5,7 x 08, 5,7 x 108 y 4,0 x 108 cuerpos de oclusión/larva, respectivamente) (Tukey, P<0,05), seguidos por el genotipo HearLB6 y las mezclas co-ocluidas HearSP1A:SP1 B (1 :2), HearLB3:LB6, HearLBmix, HearSP1 B:LB1 y HearSP1 B:LB6 (3,4 x 108, 2,5 x 108, 3,7 x 108, 2.2 x 08, 2,5 x 108 y 1 ,6 x 108 cuerpos de oclusión/larva, respectivamente). Por último, los genotipos HearSPIA y HearSPI B y la mezcla HearSP1A:SP1 B (1 : 1) fueron los menos productivos, con una productividad viral de 6,3 x 107, 1 ,4 x 108 y 9,3 x 107 cuerpos de oclusión/larva, respectivamente (Tukey, P<0,05) (Fig. 12).
La mezcla de genotipos co-ocluidos HearSPI B: LB6 es más patogénica que el resto de genotipos puros y mezclas y, además, es igual de virulenta que los genotipos más rápidos. Se preveé que estas características permitirían la rápida supresión de las poblaciones de la plaga en campo empleando la mínima cantidad de producto, abaratando los costes de producción de los cultivos. Por estas razones, seleccionamos la mezcla HearSPI B: LB6 como materia activa de un nuevo bioinseticida para el control de H. armígera. Por ello, los ensayos de producción masiva y eficacia que se describen a continuación se han ¡levado a cabo con dicha mezcla.
Ejemplo 4: Producción masiva de HearSNPV 4.1. Estudio de! canibalismo de H. armígera
Para determinar las condiciones óptimas para la producción masiva de HearSNPV se utilizó como criterio el número de cuerpos de oclusión que producen ¡as larvas ¡etalmente infectadas. La producción masiva de ¡a mezcla co-oeiuida HearSP1 B:LB6 en larvas de H. armígera puede hacerse con larvas individualizadas en placas de 12 pocilios o en recipientes de mayor volumen con un mayor número de larvas. Sin embargo, este último método puede tener problemas dependiendo del grado de canibalismo que presente ¡a especie. El canibalismo depende normalmente entre otras cosas de ¡a densidad larvaria, aun cuando no hay ¡imitación de ¡a comida (Polis, 1981). Normalmente, el canibalismo también aumenta con la edad larvaria (Chapman et al., 1999).
En este caso se estudió el canibalismo de tres estadios larvarios de H. armígera, L3, L4 y L5, tanto en larvas sanas como infectadas con ¡a CL90, ¡a cual fue de 8, 1 x 105, 2,4 x 106 y 2,5 x 107 cuerpos de odusión/ml para los estadios L3, L4 y L5, respectivamente. Estas concentraciones fueron estimadas en bioensayos preliminares, a tres densidades diferentes: 5, 10 y 20 larvas por caja de plástico de capacidad 0,5 litros. Como control se incluyeron cinco larvas individualizadas de cada estadio, tanto sanas como infectadas. El ensayo se repitió tres veces.
Los porcentajes de canibalismo, de mortalidad por nucleopoüedrovirus y de larvas que alcanzaron el estado de pupa fueron analizados mediante análisis ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SPSS 15.0. El canibalismo observado en H. armígera fue similar entre los estadios L3 y L4, y entre ¡arvas sanas e infectadas (observándose alrededor de un 30% de canibalismo) (Tukey, P>0,05), Sin embargo, en el estadio L5 se observó un significativamente mayor porcentaje de canibalismo en las ¡arvas infectadas (entre el 77 y 87%) que en ¡as sanas (20-55%) (Tukey, P<0,05) (Fig. 12). Por otro lado, el canibalismo aumentó significativamente con la densidad larvaria (Tukey, P<0,05), siendo aproximadamente del 40% en ¡a densidad de 5 ¡arvas por caja, aumentando hasta e¡ 50- 60% en ¡a densidad de 10 ¡arvas por caja y alcanzando finalmente un 80% en ¡as cajas con 20 ¡arvas. No obstante, en las ¡arvas L5 infectadas el porcentaje de canibalismo fue similar para todas las densidades, siendo entre el 77 y el 87% (Tukey, P>0,05) (Fig. 13).
El porcentaje de mortalidad por nucleopoüedrovirus obtenido en las ¡arvas individuaüzadas fue superior al 90%; sin embargo en recipientes de mayores densidades no se alcanzó el 50% de mortalidad, debido a que las larvas enfermas fueron canibalizadas antes de su muerte (Fig, 13).
Debido al alto porcentaje de canibalismo observado en las larvas de H. armígera, que da lugar a una reducción de la mortalidad y por lo tanto de la producción de cuerpos de oclusión, la producción masiva de HearSNPV es mucho más eficiente si se hace con larvas individualizadas.
4.2. Efecto dei estadio larvario, momento de inoculación y concentración viral en ia producción de HearSNPV
Para conseguir una mayor producción de cuerpos de oclusión por larva es necesario seleccionar la edad larvaria, el momento de inoculación y la concentración viral que permitan un mayor crecimiento de la larva, y por lo tanto una mayor producción viral (Shieh, 1989; Gupta et al., 2007).
Para seleccionar el estadio y el momento de inoculación se realizó el estudio con los tres últimos estadios larvarios, L3, L4 y L5, infectados en dos momentos diferentes; tras la muda (recién mudadas) y un día después de haber mudado (1 día tras la muda). Por otro lado, se sabe que cuando se aplican concentraciones que producen elevados porcentajes de mortalidad la larva se desarrolla más lentamente por lo que llega a producir menos cuerpos de oclusión. Por lo tanto, conviene optimizar la concentración viral que produzca un alto porcentaje de mortalidad y con la mayor producción de cuerpos de oclusión/larva posible. Para ello, cada estadio se infectó con tres concentraciones diferentes del virus, correspondientes a las CL80 (1 ,5 x 105, 4,8 x 10s y 5,5 x 106 cuerpos de ociusión/ml, para los estadios L3, L y L5, respectivamente), CL90 (6, 1 x 105, 2,4 x 106 y 2,5 x 107 cuerpos de oclusión/mi, para los estadios L3, L4 y L5, respectivamente) y CL9S (1 ,9 x 106, 9, 1 x 106 y 1 ,5 x 108 cuerpos de ociusión/ml, para ios estadios L3, L4 y L5, respectivamente); dichas concentraciones fueron determinados previamente en bioensayos preliminares. Las larvas se inocularon de forma individual según el método de ia gota descrito por Hughes y Wood (1981) y se depositaron en vasitos individuales para evitar el canibalismo con dieta artificial hasta su muerte por virus o alcanzar el estado de pupa. Los cuerpos de oclusión producidos por cada larva muerta se extrajeron, se purificaron y se titularon según se ha indicado anteriormente. Se inocularon 24 larvas por tratamiento y se realizaron tres repeticiones. Los datos obtenidos se analizaron mediante análisis ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SPSS 15.0.
Los porcentajes de mortalidad obtenidos en las larvas infectadas tras ia muda fueron los esperados (entre el 80 y el 100%), sin embargo las larvas inoculadas un día después de la muda presentaron un porcentaje de mortalidad significativamente menor (Fi7i3e— 16,30, P<0,05), alcanzando entre el 31 y el 47% de mortalidad en el caso de las larvas de cuarto y quinto estadio (Fig. 14). Esto puede ser debido a que estas larvas son más resistentes a la infección ya que su tamaño es mayor un día después de haber mudado y las características del intestino medio cambian de acuerdo al estado de desarrollo intraestadiai (Washburn et al., 1998). Dentro de cada edad larvaria, las tres dosis utilizadas produjeron estadísticamente similares porcentajes de mortalidad, aunque se observa un ligero aumento de la mortalidad conforme se aumenta la dosis viral (Tukey, P>0,05) (Fig. 14).
Las larvas produjeron significativamente mayores cantidades de cuerpos de oclusión conforme aumentó la edad de éstas al ser inoculadas (F17i36=14,25; P<0,05) (Fig. 15A). Así, las larvas inoculadas un día después de mudar a L4 y a L5 y las L5 recién mudadas produjeron significativamente más cantidad de cuerpos de oclusión que el resto de las larvas (entre 5,6 y 9, 1 x 109 cuerpos de oclusión/larva) (Tukey, P<0,05). Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, las larvas inoculadas al día siguiente de mudar a L y a Ls presentaron un porcentaje de mortalidad mucho menor que las inoculadas recién mudadas a L5, por lo que la producción final de cuerpos de oclusión fue menor (Fig. 15B). Las larvas L5 inoculadas recién mudadas con la CL95 produjeron 6,9 x 1011 cuerpos de oclusión/100 larvas inoculadas, frente a 1 ,6 x 1011 - 4,2 x 101 1 cuerpos de oclusión/100 larvas inoculadas un día después de mudar a L5.
Por tanto, el estadio óptimo para la producción de la mezcla de genotipos HearSP1 B:LB6 en larvas de H. armígera es L5 inoculándolas recién mudadas con la CL9S (1 ,5 x 108 cuerpos de oclusión/mi). Este tratamiento produce una mortalidad cercana al 100% y es el tratamiento que alcanza una productividad (6,9 x 1011 cuerpos de oclusión/100 larvas inoculadas) mayor.
4.3. Efecto de la temperatura de incubación en la producción de HearSNPV
La temperatura de incubación puede influir en el desarrollo larvario y por tanto, en la productividad viral (Subramanian et al., 2006). Por ello, se realizó un estudio para determinar la temperatura óptima para la producción de HearSNPV.
Se inocularon larvas L5 recién mudadas con la CL95 (condiciones seleccionadas en el apartado 4,2.) y se incubaron a 23, 26 y 30°C. Cada 8 horas se registró la mortalidad para determinar el tiempo de mortalidad de las larvas en función de la temperatura y se recogieron los cadáveres individualmente para determinar la producción de cuerpos de oclusión. Se infectaron 24 larvas por tratamiento y se realizaron cinco repeticiones. La producción de cuerpos de oclusión/larva y el T se calcularon como se ha descrito anteriormente. No hubo diferencias significativas de productividad entre las larvas incubadas a las diferentes temperaturas (F2,12=0,30; P>0,05) (Fig. 16). Sin embargo, a 30°C las larvas mueren entre 13 y 34 horas más rápido que a 28°C y 23°C, respectivamente (Tabla 10). Por tanto, la temperatura óptima para la producción de HearSNPV es 30°C, ya que permite obtener la misma cantidad de cuerpos de oclusión de forma más rápida que las otras temperaturas de incubación.
Tabla 10: Tiempo medio de mortalidad (TMM), expresado en horas después de la infección, de larvas L5 de H. armígera infectadas con la GL95 e incubadas a 23, 28 y 30°C.
Límites fiduciales 95%
Temperatura TMM (h)
Inferior Superior
23°C 163,4 c* 167,0 159,8
26°C 142,2 b 145,2 139,3
30°C 129,6 a 132,4 126, 1
*Las letras diferentes que acompañan a ios valores indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (Mest, P<0,05).
Ejemplo 5: Ensayos de la efectividad de HearSNPV para e! control de H. armígera en plantas de tomate
5.1. Ensayos en cultivo de tomate en condiciones de laboratorio
Inicialmente, para determinar la efectividad de la mezcla co-ociuida HearSP1 B:LB6 para el control de H. armígera se realizó un ensayo en plantas de tomate tratadas y mantenidas en condiciones de laboratorio. Las plantas de tomate se trataron mediante pulverización con una suspensión acuosa que contenía la mezcla co-ocluida HearSP1 B:LB6 a distintas concentraciones (109, 1010 y 1011 cuerpos de oclusión/litro) junto con un mojante agrícola (Agral®, Syngenta) ai 0,2% (vol./vol.). Como control se utilizaron plantas tratadas con una solución que contenía agua y Agral® (0,2%) pero sin cuerpos de oclusión. Una vez tratadas, las plantas se dejaron secar y se colocaron en vasitos de 50 mi con solución nutritiva Hoagland dentro de recipientes de cristal de 10 litros de volumen y se infestaron con 150 larvas de H. armígera de segundo estadio (L2). Las plantas se mantuvieron a 25±1°C, 70±5% humedad relativa y fotoperiodo de 16:8 horas íuz:oscuridad.
La evaluación de la efectividad del tratamiento se determinó mediante la cuantificación del porcentaje de mortalidad. Para ello se recogieron 15 larvas de cada uno de los tratamientos a los días 1 , 3 y 5 después del tratamiento. Estas larvas se depositaron individualmente en vasitos con dieta artificial y se anotó la mortalidad a los 7 días después de haber sido recogida de las plantas.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 16. No se observó mortalidad en las larvas recogidas en el tratamiento control, lo que indica la ausencia de contaminación viral en las plantas utilizadas. En las plantas tratadas con 109 cuerpos de oclusión/litro se obtuvo un porcentaje de mortalidad de 88,9, 96,7 y 88% en larvas recogidas a ios días 1 , 3 y 5, respectivamente. Sin embargo, en las plantas tratadas con 1010 y 1011 cuerpos de oclusión/litro se obtuvo una mortalidad del 100% de todas las larvas de todos los días de recogida (Fig. 17).
La concentración de 1x1010 cuerpos de oclusión/litro es la concentración mínima que produce mortalidades del 100% todos los días de recogida. Por tanto, se selecciona dicha concentración como la óptima para el control de larvas de H. armígera en cultivos de tomate en condiciones de laboratorio.
5.2, Ensayos en cultivo de tomate en invernadero en Lisboa (Portugal)
Para determinar la efectividad de HearSP1 B:LB6 para proteger el cultivo de tomate en condiciones de invernadero frente a H. armígera se realizaron ensayos en un invernadero experimental del Instituto Superior de Agronomía (Universidade Técnica de Lisboa). En base a los resultados obtenidos en ios ensayos de laboratorio, la efectividad de la mezcla coocluida HearSP1 B:LB6 fue evaluada a la concentración de 1x1013 cuerpos de oclusión/Ha (equivalente a 1010 cuerpos de oclusión/litro, al usarse unos 1.000 litros/Ha). En ei presente estudio, la eficacia de HearSP1 B:LB6 se comparó con la de:
- un insecticida biológico a base de la bacteria entomopatógena Baciiíus thuringiensis aizawaí (Turex®, de Certis, Elche, España, que contiene B, thuringiensis al 50% en forma de polvo mojable). Este bioinsecticida se utiliza habitualmente a una concentración de 1-2 kg/Ha, habiéndose utilizado en este caso 1 ,5 kg/Ha (usando 1.000 litros/Ha),
- un insecticida biológico a base de spinosad, un producto de dos toxinas spinosinas, que se obtienen de forma natural por fermentación de la bacteria Saccharopoiyspora spinosa (Spintor 480SC®, Dow AgroSciences, Madrid, España, que contiene Spinosad al 48% peso/volumen). Dicho insecticida se usa habitualmente a una concentración de 250 mi/Ha (utilizando 1.000 litros/Ha).
Como control se hizo un tratamiento con agua. El método de aplicación fue mediante pulverización con una suspensión acuosa que contenía ios distintos tratamientos. El diseño experimenta! consistió en dos bloques con cuatro parcelas experimentales cada uno, lo que hizo un total de 8 repeticiones. En cada tratamiento se incluyeron un total de 28 plantas de tomate, de las cuales las 6 piantas centrales fueron observadas para determinar el porcentaje de mortalidad larvaria, el porcentaje de frutos dañados y la persistencia de los distintos tratamientos.
Para llevar a cabo los ensayos se realizó una suelta artificial de insectos, colocando 4 larvas de H. armígera en estadio L2 en ios frutos (seleccionados al azar) de cada una de las piantas de tomate. A! día siguiente se aplicaron ios distintos tratamientos.
En primer lugar, se determinó el porcentaje de frutos dañados a los 10 días después de la aplicación del tratamiento. También se determinó el porcentaje de supervivencia larvaria debido ai tratamiento. Para ello se contaron el número de larvas que quedaban vivas en cada planta 10 días después de la aplicación de! tratamiento. Los datos obtenidos fueron analizados mediante análisis ANOVA y Test de Tukey con e! programa estadístico SPSS 15.0.
Los tres insecticidas redujeron significativamente e! porcentaje de frutos dañados respecto al control (F3i2o-9,79; P<0,05). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre ios distintos insecticidas (Tukey, P>0,05) (Fig. 18). Los tratamientos con HearSP1 B:LB8, Turex y Spintor aumentaron significativamente la mortalidad larvaria respecto a! tratamiento control (F3 2o=37,70; P<0,05). Además, HearSP1 B:LB6 y Spintor produjeron significativamente mayores mortalidades larvarias que Turex (Tukey, P<0,05) (Fig. 19).
Por último, se determinó la persistencia de los distintos tratamientos en las hojas de tomate.
Para ello, se recogieron 15 hojas individualmente por tratamiento y repetición de la parte media-alta de las plantas 1 hora después del tratamiento y a los 3, 6 y 9 días, y se congelaron inmediatamente. Estas hojas se trituraron de forma individual y se mezclaron con dieta artificial (en proporción 1 :4 peso:peso). La mezcla se repartió en cinco vasitos de plástico, colocando una larva L2 en cada uno de los cinco vasitos para evitar el canibalismo.
A los 7 días se determinó e! porcentaje de mortalidad. La relación entre la mortalidad y la cantidad de insecticida viable se obtuvo por calibración de! bioensayo. Las curvas de calibración de los tres insecticidas se obtuvieron mezclando hojas recogidas antes del tratamiento y por tanto no infectadas con dieta artificial, y con cinco concentraciones conocidas y diferentes de los insecticidas. Se utilizaron 50 larvas por concentración. La cantidad de insecticida persistente en las hojas se estimó comparando el porcentaje de mortalidad obtenido en ios distintos tratamientos con las curvas de calibración. Los datos de cantidad de insecticida obtenidos fueron analizados mediante ANOVA y Test de Tukey con e! programa estadístico SPSS 15.0. Para poder comparar la persistencia de los distintos tratamientos en ¡as hojas de tomate en invernadero se calculó el porcentaje de actividad insecticida residual de cada uno de los tratamientos respecto al obtenido a una hora después de la aplicación, momento en el que se consideró que se encuentra en la planta el 100% de la actividad insecticida aplicada.
Al comparar la actividad insecticida residual de los distintos tratamientos en los distintos tiempos de recogida de ¡as hojas, se encontró diferencias significativas entre ¡a persistencia de HearSNPV y Turex a ¡os 6 y 9 días tras la aplicación, siendo menor ¡a persistencia de Turex (Tukey, P<0,05) (Fig. 20). El resto de ¡os días se observó un grado similar de actividad insecticida residual en todos los tratamientos.
La actividad insecticida residual disminuyó significativamente con el paso del tiempo
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P<0,05) en todos ¡os casos (Fig. 20 y 21). La persistencia de HearSNPV y Spintor se mantuvo hasta 6 días después de ¡a aplicación de los tratamientos, disminuyendo significativamente el día 9 (Tukey, P<0,05), aunque todavía persistía el 59% y 49% de actividad insecticida, respectivamente (Fig. 21 B y 21C). En el caso de Turex, la actividad insecticida residual tras ¡os 6 días de ¡a aplicación de ios tratamientos fue significativamente menor que la actividad insecticida que había en ¡as hojas una hora después del tratamiento (Tukey, P<0,05), y a ios 9 días sólo se mantuvo el 32% de insecticida (Tukey, P<0,05) (Fig. 21A).
5.3. Ensayos en cultivo de tomate al aire libre en Badajoz (España)
Para determinar la efectividad de ¡a mezda co-ocluida HearSP1 B:LB6 en cu¡tivo de tomate al aire libre, se realizaron ensayos en una parcela de ¡a finca experimental La Orden (Guadajira, Badajoz). En estos ensayos se utilizó ¡a misma dosis de HearSP1 B:LB8 que en los ensayos realizados en invernadero, 1013 cuerpos de oclusión/Ha (habiéndose utilizado un volumen de aplicación de 1.000 litros/Ha) y su eficacia se comparó con ¡a de:
- el aislado silvestre HearSPI procedente de Badajoz (Figueiredo et al,, 1999), lugar donde se realizaron los ensayos, utilizando la misma dosis que para HearSPI B:LB6, 1010 cuerpos de oclusión/ütro (equivaiente a 1013 cuerpos de oclusión/Ha, al aplicar un tratamiento en un volumen de 1.000 litros/Ha).
- un insecticida biológico a base de la bacteria entomopatógena Baciííus thuringiensís aizawai (Turex®, de Certis, Elche, España, que contiene B. thuringiensís al 50% en forma de polvo mojable). Se utiliza habituaimente a una concentración de 1-2 kg/Ha, habiéndose utilizado en este caso 1 ,5 kg/Ha (aplicado en un volumen de 1000 ¡itros/ha). - un insecticida biológico a base de dos toxinas spinosinas, que se obtienen de forma natural por fermentación de un organismo de suelo, la bacteria Saccharopoiyspora spinosa (Spintor 480SC®, Dow AgroSciences, Madrid, España, que contiene Spinosad al 48% peso/volumen). Se utiliza habitualmente a una concentración de 250 mi/Ha (diluyendo 250 mi en 1 ,000 litros, al usarse 1 ,000 litros/Ha).
- un insecticida químico a base de clorpirifos (Dursban 75WG®, Dow AgroSciences, Madrid, España, que contiene clorpirifos al 75% peso/peso). Se utiliza habitualmente a una concentración de 1-1 ,25 kg/Ha, habiéndose utilizado en este caso 1 ,25 kg/Ha (el cuál se diluyó de nuevo en 1 ,000 litros para usarse el mismo volumen en una Ha).
Como control se hizo un tratamiento con agua y agral ai 0,2%. El método de aplicación fue mediante pulverización con una suspensión acuosa que contenía los distintos tratamientos.
El ensayó constó de 48 parcelas (1 ,5 m x 4 m), cada una de las cuales estuvo compuesta por aproximadamente 30 plantas. El diseño fue de bloques ai azar. Cada uno de los bloques constaba de dos filas con 6 parcelas elementales y a la mitad de las parcelas de cada bloque se aplicaron los distintos tratamientos tres veces mientras que a la otra mitad cinco veces, realizando un total de 4 repeticiones para 3 y 5 aplicaciones. Todas las aplicaciones se realizaron con 15 días de diferencia. Las plantas centrales fueron observadas para determinar el porcentaje de frutos dañados, la persistencia de ios distintos tratamientos, y el rendimiento de cada parcela.
En primer lugar, se determinó el porcentaje de frutos dañados, tanto con daño fresco como cicatrizado, cada 3 o 4 días, durante todo el periodo del ensayo. Los datos obtenidos se agruparon por medias quincenales y fueron analizados mediante análisis ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SYSTAT (1990).
No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de frutos dañados entre las parcelas tratadas 3 y 5 veces para los distintos tratamientos (F1 i1 4= 0,22; P>0,05), por lo que se agruparon los datos de todas las parcelas tratadas con cada insecticida teniendo un total de 8 repeticiones.
En la figura 22 se muestra el porcentaje de frutos dañados frescos y cicatrizados en cada una de las quincenas para cada tratamiento. En la primera quincena no hubo diferencias en el porcentaje de frutos dañados obtenidos en las parcelas tratadas con ios diferentes insecticidas, siendo similar al obtenido con el tratamiento control (F5,15=0,55; P>0,05) (Fig. 22A). Sin embargo, en la segunda y tercera quincena en las parcelas control hubo un porcentaje de frutos dañados tanto frescos como cicatrizados mayor que en las parcelas tratadas con los distintos insecticidas (Tukey, P<0,05) (Fig. 22B y 22C). En la cuarta quincena, periodo de! cultivo que no suele ser muy atacado por las larvas de H. armígera, el porcentaje de frutos dañados cicatrizados también fue mayor en las parcelas control (Tukey, P<0,05) pero no hubo diferencias en el porcentaje de frutos con daño fresco (P>0,05) (Fig. 22D).
Estos resultados demuestran que HearSNPV reduce de forma significativa el número de frutos dañados, tanto con daño fresco como cicatrizado, respecto al tratamiento control y, además, lo hace de manera igual de efectiva que el resto de insecticidas que se utilizan habituaimente para controlar las plagas ocasionadas por H. armígera.
Posteriormente, se determinó el rendimiento de cada parcela. Para ello se cosecharon los frutos del metro central de cada parcela y se separaron en verdes y rojos. Los frutos verdes se separaron en sanos y picados, y los rojos en sanos, picados cicatrizados y picados podridos. Posteriormente se llevó a cabo el pesado de cada uno de los grupos. Los datos obtenidos fueron analizados mediante ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SYSTAT. Los controles de calidad de las empresas conserveras rechazan partidas de tomates en las que menos del 80% de ios frutos están maduros, y en las que más del 5% de los tomates maduros están dañados. Los frutos verdes se desechan antes de llegar a la conservera.
En este caso tampoco hubo diferencias entre las parcelas tratadas 3 o 5 veces, es decir, en el número de aplicaciones, por lo que se agruparon los datos de todas las parcelas tratadas con cada insecticida. El porcentaje de frutos dañados cosechados en cada uno de los tratamientos se muestra en la figura 23. El porcentaje de frutos dañados, ya sean verdes picados, rojos cicatrizados o rojos podridos, fue mayor en las parcelas control que en las tratadas con los distintos insecticidas (Tukey, P<0,05). Además, en las parcelas tratadas con Dursban y Spintor se obtuvo un porcentaje significativamente menor de frutos rojos cicatrizados que en las tratadas con Turex y HearSP1 B:LB6 (Tukey, P<0,05), en las parcelas tratadas con HearSPI y Turex se cosecharon un porcentaje mayor de frutos podridos que en las tratadas con Dursban (Tukey, P<0,05) (Fig. 23).
Las toneladas de frutos verdes sanos por hectárea (T/Ha) fue similar en todos ios tratamientos
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P>0,05) (Fig. 24A). Sin embargo, las toneladas de frutos verdes picados por hectárea fue significativamente mayor en las parcelas control que en las tratadas con los distintos insecticidas (F5!39=4,95; P<0,05) (Fig. 24A), Las toneladas de frutos rojos sanos por hectáreafue significativamente inferior en las parcelas control que en las parcelas tratadas con ios insecticidas, excepto con Turex
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P<0,05), aunque no mostró diferencias significativas con el resto de insecticidas (Tukey, P>0,05) (Fig. 24B). En cuanto a los frutos rojos dañados, tanto cicatrizados como podridos, se obtuvieron mayor número de toneladas por hectárea en las parcelas control que en las tratadas con los insecticidas (Tukey, P<0,05). Además, no hubo diferencias significativas entre las toneladas de frutos rojos cicatrizados obtenidos en las parcelas tratadas con HearSP1 B:LB6 y HearSPI respecto de las parcelas tratadas con el resto de insecticidas (Tukey, P>0,05), aunque en las parcelas tratadas con Dursban y Spintor se obtuvieron menos toneladas de frutos rojos cicatrizados que en las tratadas con Turex (Tukey, P<0,05) (Fig. 24B). Además, en las parcelas tratadas con Dursban se obtuvieron menos toneladas por hectárea de frutos rojos podridos que en las tratadas con HearSPI y Turex (Tukey, P<0,05) (Fig. 24B), pero no presentó diferencias significativas con HearSPI B:LB8 (Tukey, P>0,05),
En las parcelas tratadas con HearSPI B:LB6 o HearSPI se consigue una cosecha similar a la de las parcelas tratadas con otros insecticidas, ya que las toneladas de frutos rojos sanos, es decir, ios comercializabies, es similar en todos ios tratamientos, excepto en el tratamiento control. Además, el porcentaje de frutos dañados es muy bajo, al igual que en el resto de parcelas tratadas con insecticidas. Este dato es muy importante a la hora de comercializar los tomates, ya que las empresas conserveras españolas no aceptan lotes con más del 5% de los frutos dañados.
Por último, se determinó la persistencia de los distintos tratamientos en las hojas de tomate. Para ello, se recogieron hojas próximas ai fruto a una hora después del primer tratamiento y a ios 3, 7 y 10 días. Se recogieron 25 hojas de cada parcela y se congelaron inmediatamente. Estas hojas se trituraron en grupos de cinco, se mezclaron con dieta artificial (en proporción 1 :4, peso: eso) y se repartieron en 10 vasitos individuales con una larva L2 en cada uno para evitar el canibalismo. A los 7 días se determinó el porcentaje de mortalidad. La relación entre la mortalidad y la cantidad de insecticida viable se obtuvo por calibración del bioensayo. Las curvas de calibración de los cinco insecticidas se obtuvieron mezclando hojas recogidas antes del tratamiento con dieta artificial y con cinco concentraciones conocidas y diferentes de los insecticidas. Se utilizaron 50 larvas/concentración. La cantidad de insecticida persistente en las hojas se estimó comparando el porcentaje de mortalidad obtenido en los distintos tratamientos con las curvas de calibración. Los datos de cantidad de insecticida obtenidos fueron analizados mediante ANOVA y Test de Tukey con el programa estadístico SPSS 15.0Para poder comparar la persistencia de los distintos tratamientos en las hojas de tomate ai aire libre se calculó el porcentaje de actividad insecticida residual de cada uno de los tratamientos respecto a una hora después de la aplicación.
Si comparamos el porcentaje de actividad insecticida residual de ios distintos tratamientos en los distintos tiempos de recogida de las hojas, sólo encontramos diferencias significativas entre ¡a cantidad de HearSPI y Spintor a los 7 días de la aplicación, siendo menor ¡a persistencia de HearSPI (Tukey, P<0,05) (Fig. 25), y a los 10 días entre cantidad de HearSPI B:LB8 y HearSPI con Spintor y Dursban, siendo menor la persistencia de los baculovirus (Tukey, P<0,05) (Fig. 25).
La actividad insecticida residual en las plantas de tomate al aire libre disminuye significativamente con el paso del tiempo (F19i140=34,24; P<0,05) en todos los casos (Fig. 25 y 28). La cantidad de HearSNPV (tanto HearSPI B:LB6 como HearSPI) se mantiene igual desde el primer día hasta 3 días después de la aplicación del tratamiento, y a partir de este momento disminuye significativamente (Tukey, P<0,05). A los 7 días después de la aplicación todavía persiste en la planta e! 66% y el 52% de la actividad insecticida de los cuerpos de oclusión de HearSPI B:LB6 y HearSPI respectivamente, mientras que a los 10 días sólo persisten el 9 y el 2% de la actividad de los cuerpos de oclusión, aunque no se observan diferencias significativas entre ambos parece que pueda persistir más la mezcla seleccionada (Fig. 26A y 26B). La actividad de Dursban y Spintor se mantiene en la planta hasta 3 días después de la aplicación (Tukey, P>0,05), disminuyendo significativamente a ios 7 días (Tukey, P<0,05), presentando la misma actividad insecticida que a ios 10 días (Tukey, P>0,05), momento en el que todavía persiste en la planta el 59% de Spintor y el 46% de la actividad de Dursban (Fig. 26C y 26E). En el caso de Turex, la actividad insecticida desciende significativamente a los 3 días (Tukey, P<0,05) pero se mantiene hasta ¡os 7 días (Tukey, P>0,05), volviendo a disminuir significativamente a los 10 días (Tukey, P<0,05) persistiendo el 27% (Fig. 26D).
En el caso de los aislados de HearSNPV, inocuos para el ser humano y otros vertebrados, el hecho de que 7 días después de la aplicación del tratamiento persista más del 50% de ¡a actividad insecticida es positivo, ya que las larvas que ingieran las hojas contaminadas podrán adquirir la enfermedad. En el caso de Dursban, tóxico para humanos, es un punto negativo el hecho de que a los 10 días persista todavía aproximadamente el 50%, ya que aumenta el plazo de seguridad para poder cosechar los frutos del tomate, además de la contaminación medioambiental que conlleva.
A la vista de estos resultados, se concluye que ¡a aplicación de tratamientos con HearSNPV a la dosis de 1013 cuerpos de oclusión/Ha permite proteger los cultivos de tomate, tanto en invernadero como al aire libre, de forma satisfactoria siendo igual de eficaz que ios tratamientos químicos y biológicos que se utilizan actualmente en este cultivo y evitando los inconvenientes que presentan estos. Depósito de materia biológica
Los nuevos genotipos HearSPI B y HearLB8 han sido depositados en ia Coüection Nationaie de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Francia, de acuerdo con ias normas del Tratrado de Budapest. Los números de depósito y fechas de los mismos fueron las siguientes:
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Los dos genotipos fueron depositados por uno de ios inventores, Prof. Dr. Primitivo Caballero (Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales, Universidad Pública de Navarra, Campus de Arrosadía, Mutilva Baja, E-31006, Pamplona, Navarra, España), como empleado del primer solicitante, en nombre y representación de ios tres solicitantes (Universidad Pública de Navarra, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, instituto de Ecología A.C.).
Referencias bibliográficas
Arrizubieta, M. , Williams, T., Caballero, P., Simón, O., 2014. Seiection of a nucleopolyhedrovirus isoiate from Heücoverpa armígera as the basis for a biological insecíicide. Pest Management Science 70, 967-976.
Barrera, G., Simón, O., Villamizar, L, Williams, T., Caballero, P., 201 1. Spodoptera frugiperda múltiple nucleopolyhedrovirus as a potentiai biological insecticide: genetic and phenotypic comparison of field isoiates from Colombia. Biological Control 58, 113-120.
Bernal, A., Williams, T., Hernández-Suárez, E., Carnero, A., Caballero, P., Simón, O., 2013a. A native variant of Chrysodeixis chalates nucleopolyhedrovirus: The basis for a promising bioinsecticide for control of C. chalcites on Canary isiands' banana crops. Biological Control 67, 101-110.
Berna!, A., Simón, O., Williams, T., Muñoz, D., Caballero, P., 2013b. A Chrysodeixis chalcites single nucleopolyhedrovirus popuiation from the Canary isiands is genotypicaily structured to maximize survival. Applied and Environmenta! Microbiology 79, 7709-7718.
Caballero, P., Zuidema, D., Santiago-Aivarez, C, Viak, J.M., 1992. Biochemicai and biological characterization of four isoiates of Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus. Biocontrol Science and Technology 2, 145-157.
Caballero, P., Williams, T., López-Ferber, M., 2001. Estructura y clasificación de ios bacuiovirus, pp. 15-46. En: Caballero, P., Williams, T., López-Ferber, M. (Eds.). Los baculovirus y sus aplicaciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Phytoma-España, Valencia, España.
Chapman, J.W., Williams, T., Escribano, A., Caballero, P., Cave, R.D., Goulson, D., 1999. Age-related cannibalism and horizontal transmission of a nuclear polyhedrosis virus in larval Spodoptera frugiperda. Ecological Entomology 24, 268-275.
Chen, X., Li, M., Sun, X., Arif, B.M., Hu, Z., Vlak, J.M., 2000. Genomic organization of Heücoverpa armígera singie-nucieocapsid nucleopolyhedrovirus. Archives of Virology 145, 2539-2555.
Chen, X., IJkel, W.F.J., Tarchini, R., Sun, X., Sandbrink, H., Wang, H., Peters, S., Zuidema, D., Lankhorst, R.K., Vlak, J., Hu, Z., 2001. The sequence of the Helicoverpa armígera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus genome. Journal of General Virology 82, 241-257, Cherry, A., Williams, T., 2001 , Control de insectos plaga mediante baculovirus, pp. 389-450. En: Caballero, P., Williams, T., López-Ferber, . (Eds.). Los baculovirus y sus aplicaciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Phytoma-España, Valencia, España.
Clavijo, G., Williams, T., Muñoz, D., Caballero, P, López-Ferber, M., 2010. Mixed genotype transmission bodies and virions contribute to the maintenance of diversity in an insect virus. Proceedings of the Royal Society B 277, 943-951.
Cory, J.S., Green, B.M., Paul, R.K., Hunter-Fujita, F., 2005. Genotypic and phenotypic diversity of a baculovirus population within an individual insect host. Journal of Invertebrate Pathology 89, 101-11 1.
Crawiey, 1993. GLIM for ecologists. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK.
Cunningham, J.P., Zalucki, M.P., West, S.A., 1999. Learning in Heiicoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae): a new iook at the behaviour and control of a poiyphagous pest. Bulletin of Entomológica! Research 89, 201-207.
Erlandson, M., Newhouse, S., Moore, K., Janmaat, A., Myers, J., Theilmann, D., 2007. Characterization of baculovirus isolates from Tríchoplusia ni in populations from vegetable greenhouses. Biological Control 41 , 256-283.
Figueiredo, E., Muñoz, D., Escribano, A., Mexia, A., Viak, J.M., Caballero, P., 1999. Biochemical identification and comparative insecticida! activity of nucleopolyhedrovirus isolates pathogenic for Heliothis armígera (Lep. Noctuidae) iarvae. Journal of Applied Entomoiogy 123, 165-169.
Figueiredo, E., Muñoz, D., Murilio, R., Mexia, A., Caballero, P., 2009. Diversity of iberian nucleopolyhedrovirus wiid-type isolates infecting Heiicoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae). Biological Control 50, 43-49,
Gelernter, W.D., Federici, B.A., 1986. Isolation, identification and determination of viruience of a nuclear poiyhedrosis virus from the beet armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental Entomoiogy 15, 240-245.
Granados, R., Fu, Y., Corsaro, B., Hughes, P., 2001. Enhancement of Baciiíus thuringiensis toxicity to lepidopterous species with the enhancin from Trichopiusia ni granulovirus. Biological Control 20, 153-159.
Greene, G.L., Leppia, N.C., Dickerson, W.A., 1976. Velvetbean caterpiilar: a rearing procedure and artificial médium. Journal of Economic Entomoiogy 69, 487-488. Gróner, A., 1986. Specificity and safety of baculoviruses, pp, 77-202. En: Granados, R.R., Federici, B.A. (Eds,). The biology of baculoviruses: biológica! properíies and molecular biology. CRC Press, Boca Ratón, Florida.
Guo, Z,, Ge, J., Wang, D., Shao, Q., Zhang, C, 2006. Biológica! comparison of íwo genotypes of Heücoverpa armígera single-nucieocapsid nucleopolyhedrovirus. Biológica! Control 51 , 809-820.
Gupta, R.K., Raina, J.C., onobruliah, M.D., 2007. Optimization of in vivo production of nucleopolyhedrovirus in homologous host larvae of Heücoverpa armígera. Journal of Entomology 4, 279-288.
Hará, K., Funakoshi, M., Kawarabata, T., 1995. In vivo and in vítro characterization of severa! isolates of Spodopfera exigua nuclear polyhedrosis virus. Acta Viroiogica 39, 215-222.
Harrison, R.L., Bonning, B.C., 1999. The nucleopolyhedrovirus of Rachoplusía ou and Anagrapha falcifera are isolates of the same virus. Journal of General Virology 80, 2793- 2798.
Harrison, R.L., Popham, H.J.R., Breitenbach, J.E., Rowley, D.L., 2012. Genetic variation and virulence of Autographa californíca múltiple nucleopolyhedrovirus and Trichoplusia ni single nucleopolyhedrovirus isolates. Journa! of Invertebrate Pathoiogy 1 10, 33-47.
Hughes, P.R., Wood, H.A., 1981. A synchronous perora! technique for the bioassay of insect viruses. Journa! of Invertebrate Pathoiogy 37, 154-159.
Jehle, J.A., Blissard, G.W., Bonning, B.C., Cory, J.S., Herniou, E.A., Rohrmann, G.F., Theilmann, D.A., Thiem, S. ., Viak, J. ., 2006. On the classification and nomenciature of baculoviruses: a proposa! for revisión. Archives of Virology 151 : 1 , 257-266.
Kaiia, V., Chaudhari, S., Gujar, G., 2001. Optimization of production of nucleopolyhedrovirus of Heücoverpa armígera throughout larva! stages. Phytoparasitica 29, 23-28.
King, L.A., Possee, R.D., 1992. The baculovirus expression system. A iaboratory guide. Chapman & Hall, London, UK.
Lasa, R., Ruiz-Portero, C, Alcázar, M.D., Belda, J.E., Caballero, P., Williams, T., 2007. Efficacy of óptica! brightener formuiatíons of Spodoptera exigua múltiple nucleopolyhedrovirus (SeMNPV) as a biológica! insecticide in greenhouses in southern Spain. Biological Control 40, 89-96.
Le Ora Software, 1987. POLO-PC a user's guide to do probit or iogit analysis. Berkeiey, California, USA. López-Ferber, M., Simón, O., Williams, T., Caballero, P., 2003. Defective or effective? Mutualistic interactions beíween virus genotypes. Proceedings of the Royal Society B 270, 2249-2255. oscardi, F., 1999. Assessment of the application of bacuioviruses for control of Lepidoptera, Annual Review of Entomology 44, 257-289.
Muñoz, D., Castillejo, J.I., Caballero, P., 1998. Naturaily occurring deietion mutants are parasitic genotypes in a wiid-type nudeopolyhedrovirus popuiation of Spodoptera exigua. Applied and Environmental Microbiology 64, 4372-4377.
Muñoz D., Martínez, A.M., Muriiio, R., Ruiz de Escudero, i., Vilaplana, L. 2001. Técnicas básicas para la caracterización de baculovirus, pp. 479-518. En: Caballero, P., Williams, T., López-Ferber, M. (eds.) Los Baculovirus y sus Aplicaciones como Bioinsecticidas en el Control Biológico de Plagas. Phytoma-España, Valencia, España.
Ogembo, J.G., Kunjeku, E.C., Sithanantham, S., 2005. A preliminary study on the pathogenicity of two isolates of nucleopolyhedroviruses infecting the African bollworm, Heiicoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae). International Journal of Tropical Insect Science 25, 218-222.
Ogembo, J.G., Chaeychomsri, S., Kamiya, K., Ishikawa, H., Katou, Y., Ikeda, M., Kobayashi, M., 2007. Cloning and comparative characterization of nucleopolyhedroviruses isoiated from African Bollworm, Heiicoverpa armígera, (Lepidoptera: Noctuidae) in different geographic regions. Journal of insect Biotechnology and Sericology 76, 39-49.
Ogembo, J.G., Caoili, B.L., Shikata, M., Chaeychomsri, S., Kobayashi, M., ikeda, M., 2009. Comparative genomic sequence analysis of novel Heiicoverpa armígera nudeopolyhedrovirus (NPV) isoiated from Kenya and three other previousiy sequenced Heiicoverpa spp. NPVs. Virus Genes 39, 261-272,
Polis, G.A., 1981. The evolution and dynamics of intraespecific predation. Annual Review of Ecoiogy, Evolution and Systematics 12, 225-251.
Reed, W., Pawar, C.S., 1982, Heiiothis: a global problem, pp. 9-14. En: Reed, W., Kumble, V. (Eds.). Proceedings of the International Workshop on Heiiothis Management. ICRISAT, Pantanchera, india.
Shieh, T.R., 1989. Industrial production of viral pesticides. Advances in Virus Research 36, 315-343. Simón, O., Wiüiams, T., López-Ferber, M., Caballero, P., 2005. Funcíional importance of deletion mutant genotypes in an insect nucleopolyhedrovirus population. Applied and Environmeníai Microbiology 71 , 4254-4282.
Subramanian, S., Santharam, G., Sathiah, N., Kennedy, J.S., Rabindra, R.J., 2006. Infiuence of incubation temperature on productivity and qualiíy of Spocioptera Mura nucleopolyhedrovirus. Biological Conírol 37, 367-374.
Sysíaí, 1990. Systaí: the system for staíistics. Systat incorporation, Evaston, Illinois.
Theilmann, D.A., Biissard, G.W., Bonning, B., Jehle, J.A., O'Reiily, D.R., Rohrmann, G.F., Thiem, S., Vlak, J. ., 2005. Bacuioviridae, pp. 177-185. En: Fauqueí, C.M., Mayo, M.A., Maniioff, J., Desselberger, U., Bal!, L.A. (Eds.). Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, California.
Torres-Vila, L.M., Rodríguez-Molina, M.C., Palo, E., Bielza, P., Lacasa, A., 2000. La resistencia a insecticidas de Helicoverpa armígera Hübner en España: datos disponibles. Boletín de Sanidad Vegetal Plagas 26, 493-501.
Torres-Vila, L.M., Rodríguez-Molina, M.C., Lacasa-Plasencia, A., 2003. Impact of Helicoverpa armígera larval density and crop phenoiogy on yieid and quality losses in processing tomato: developing fruit count-based damage thresholds for IPM decision- making. Crop Protection 22, 521-532.
Washburn, J.O., Kirkpatrick, B.A., Haas-Stapieton, E., Voikman, L.E., 1998. Evidence that the stilbene-derived optical brightener M2R enhances Autographa calíforníca M nucleopolyhedrovirus infection of Tríchopíusía ni and Heüothis vírescens by preventing sioughing of infected midgut epitheliai celis. Biological Control 1 1 , 58-69.
Zhang G., 1994. Research, development and application of Heiíothís viral pesticide in China. Resource and Environment in the Yangtze Valiey 3, 1-6.
Zhang, C.X., Ma, X.C., Guo, Z.J., 2005. Comparison of complete genome sequence between C1 and G4 isolates of the Helicoverpa armígera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus. Virology 333, 190-199.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un nucleopoliedrovirus simple de Heücoverpa armígera (HearSNPV) caracterizado por pertenecer a un genotipo seleccionado del grupo de: i) ios HearSNPV depositados en la Colection Nationaie de Cultures de icroorganismes (CNC ) con los números de depósito CNC i-4806 (HearSNPV- SP1 B) o CNCM I-4807 (HearSNPV-LBo), o
ii) los genotipos cuyo genoma está representado por SEQ ID NO: 13 (HearSNPV-SP B) o SEQ ID NO: 14 (HearSNPV-LB6).
2. Un nucleopoliedrovirus simple aislado según la reivindicación 1 , que está en forma de: i) partícula vírica completa (virión),
ii) cuerpo de oclusión (OB).
3. Un cuerpo de oclusión que contiene varios viriones, en el que al menos uno de ios viriones pertenece a un genotipo del nucleopoliedrovirus simple de Heücoverpa armígera seleccionado del grupo de HearSNPV-SP1 B (CNCM I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I- 4807).
4. Cuerpo de oclusión según la reivindicación 3, que contiene viriones de genotipos diferentes.
5. Cuerpo de oclusión según la reivindicación 4, que contiene viriones de un solo genotipo seleccionado del grupo de HearSNPV-SP1 B (CNCM 1-4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM I- 4807).
6. Cuerpo de oclusión según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de ADN cuya secuencia está representada por SEQ ID NQ:5 ó SEQ ID NO:8.
7. Cuerpo de oclusión según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de ai menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de ADN cuya secuencia está representada por SEQ ID NQ:7 ó SEQ ID NO:8.
8. Cuerpo de oclusión según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de ai menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de ADN cuya secuencia está representada por SEQ ID NO:9 ó SEQ ID NO: 10.
9. Cuerpo de oclusión según las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en ¡os que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de ADN cuya secuencia está representada por SEQ ID NO: 11 ó SEQ ID NO: 12.
10. Una composición que comprende al menos un nudeopoliedrovirus de una cualquiera de ¡as reivindicaciones 1 ó 2 o al menos un cuerpo de oclusión de una cualquiera de ¡as reivindicaciones 3 a 8.
11. Composición según la reivindicación 10, en la que ios nudeopoüedrovirus están en forma de cuerpo de oclusión.
12. Composición según ¡a reivindicación 10 u 1 1 , que comprende cuerpos de odusión que contienen viriones co-oduidos, y en ia que ¡os viriones co-ociuidos en un mismo cuerpo de odusión pertenecen a¡ mismo genotipo o a genotipos diferentes.
13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende una mezcla de viriones de ¡os genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM ¡-48Q6) y HearSNPV-LB6 (CNC ¡-4807).
14. Composición según ¡a reivindicación 13, en ¡a que los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM ¡-4808) y HearSNPV-LB6 (CNCM ¡-4807) están en ¡a proporción HearSNPV- SP1 B:HearSNPV-LB6 1 :1.
15. Composición según la reivindicación 14, en ¡a que ¡os viriones están en forma de cuerpos de oclusión que contienen viriones co-oduidos, y en la que los viriones co- oduidos en un mismo nudeopoliedrovirus pertenecen al mismo genotipo o a genotipos diferentes.
18. Composición según una cualquiera de ¡as reivindicaciones 10 a 15, que adicionaimente contiene un excipiente o vehículo apropiado en el sector agríco¡a.
17. Composición según una cualquiera de ¡as reivindicaciones 10 a 18, que está en forma acuosa,
18. Composición según una cuaiquiera de ¡as reivindicaciones 10 a 18, que está en forma sóüda.
19, Composición según ¡a reivindicación 16, para ser aplicada por un método seleccionado entre pulverización a nivel de tierra, pulverización aérea, aplicación en disolución, aplicación en forma de polvo, riego o irrigación.
20, Composición según una cualquiera de ¡as reivindicaciones 16 a 19, en ¡a que ¡os nucieopoiiedrovirus simples de Heücoverpa armígera están mezclados con un abono, un fertilizante o un plaguicida.
21 , Composición según una cualquiera de ¡as reivindicaciones 16 a 20, que adicionalmente comprende un agente potenciador de¡ efecto del nucieopoiiedrovirus sobre Heücoverpa armígera,
22. Composición según una cualquiera de ¡as reivindicaciones 16 a 21 , que adicionaimente comprende un insecticida basado en la bacteria Bacilíus íhuríngiensís seleccionado entre endosporas de dicha bacteria, cristales de proteínas Cry o mezclas de los mismos.
23. Un procedimiento para la producción de cuerpos de oclusión de una cualquiera de ¡as reivindicaciones 3 a 10, que comprende una etapa en la que se alimentan larvas de Heücoverpa armígera mediante una dieta artificial que comprende cuerpos de oclusión del nucleopoüedrovirus de H. armígera que contienen viriones de uno cualquiera de ¡os genotipos HearSNPV-SP1 B (CNC I-4806) y HearSNPV-LB6 (CNC ¡-4807) o mezclas de ¡os mismos.
24. Procedimiento según ¡a reivindicación 23, que comprende ¡as etapas de: i) alimentar larvas de Heücoverpa armígera con una dieta artificial que comprende cuerpos de oclusión del nucleopoüedrovirus de H. armígera que contienen viriones de uno cualquiera de los genotipos HearSNPV-SP B (CNCM I- 4806) y HearSNPV-LB6 (CNCM ¡-4807) o mezclas de los mismos;
ii) mantener ¡as larvas a 23-30°C hasta que se produce su muerte;
iii) purificar ¡os cuerpos de oclusión generados en ¡as larvas triturando ¡os cadáveres de las larvas en agua, filtrando ¡a suspensión resultante, sedimentando los cuerpos de oclusión, ¡avando el sedimento y volviendo a sedimentarios;
iv) resuspender el sedimento final en agua a pH neutro;
v) opcionaimente, almacenar la suspensión obtenida en una de ¡as siguientes condiciones: a) a temperatura ambiente, b) en refrigeración, o congelación, c) iiofilizar la suspensión y conservarla a temperatura ambiente.
25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que ia dieta artificial que recibe cada larva se suministra: i) como suspensión acuosa en forma de gotas, opcionalmente con sacarosa al 10%, en la que se encuentran suspendidos los cuerpos de oclusión y que, preferiblemente, contiene también un colorante;
ii) en forma sólida, mediante pastillas que contienen, adicionaimente a los cuerpos de oclusión del nucleopoliedrovirus de Helicoverpa armígera: 7,2% germen de trigo, 2,5% proteina de soja, 1 ,4% levadura de cerveza, 1 ,9% agar, 2,9% azúcar, 1 % sales mixtas, 0, 1 % coiesterol, 0,4% ácido ascórbico, 0,2% ácido sórbico, 0,02% streptomicina, 0,04% clortetraciciina hidroclorido, 0, 1 % nipagina, 0, 1 % nipasoi, 0,2% ácido benzoico, 0, 1 % cloruro de colina, 0,01 % vitaminas y 80% agua destilada;
iii) iniciaimente como suspensión acuosa en forma de gotas como en el apartado i) y posteriormente en forma sólida como en el apartado ii).
26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que las larvas de H. armígera son larvas del quinto estadio.
27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que los cuerpos de oclusión con ios que se alimentan las larvas están a una concentración del rango de 2,00 x 107 a 1 ,00 x 109 cuerpos de oclusión/ml.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la concentración es de 1 ,8 x 108 cuerpos de ociusión/ml.
29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que se utilizan cajas de 12 pocilios con una larva por pocilio.
30. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que se utilizan cajas de 12 pocilios con una larva de H. armígera recién mudadas al quinto estadio y en el que las larvas se infectan con cuerpos de oclusión a una concentración de 1 ,8 x 108 cuerpos de ociusión/ml.
Un método para identificar en una muestra la presencia de un nucleopoliedrovirus simple de H. armígera de un genotipo seleccionado entre HearSNPV-SP1 B (CNC i-4806) y HearSNPV-LB8 (CNCM i-4807), comprende las etapas de: i) amplificar mediante PCR el ADN extraído de dicha muestra utilizando una pareja de cebadores que se selecciona entre las formadas por: a) SEQ ID NO: 1 (F-hr1) y SEQ ID NO:2 (R-hr1), o
b) SEQ ID NO:3 (F-hr5) y SEQ ID NO:4 (R-br5); ii) analizar el fragmento amplificado para determinar su tamaño o su secuencia; iii) digerir el fragmento amplificado con la endonucleasa A/del;
iv) analizar los fragmentos generados tras la digestión con Λ/del para determinar el número de fragmentos y el tamaño de cada uno de ellos;
v) concluir que está presente uno de los genotipos HearSNPV-SP1 B (CNCM I- 4806) o HearSNPV-LB6 (CNCM I-4807) si:
el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2 tiene:
i) un tamaño de 2.177 (HearSNPV-SP1 B) ó 2.117 (HearSNPV-LB6) nucleótidos;
ii) la digestión de dicho fragmento con la endonucleasa Nde\ genera 6 fragmentos de 857, 508, 381 , 306, 78 y 47 nucleótidos (HearSNPV-SP1 B) ó 5 fragmentos de 1.210, 475, 307, 78 y 47 nucleótidos (HearSNPV-LB6);
iii) la secuencia representada por SEQ ID NO:5 (HearSNPV-SP B) o SEQ ID NO:6 (HearSNPV-LB6); o, alternativamente, el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 tiene: i) un tamaño de 2.326 (HearSNPV-SP1 B) ó 2.330 (HearSNPV-LB6) nucleótidos;
ii) la digestión de dicho fragmento con la endonucleasa Λ/etel genera 4 fragmentos de 1.120, 917, 21 1 y 78 nucleótidos (HearSNPV-SP1 B) ó 3 fragmentos de 1.120, 998 y 212 nucleótidos (HearSNPV-LB6);
iii) la secuencia representada por SEQ ID NO:7 (HearSNPV-SP1 B) SEQ ID NO:8 (HearSNPV-LB6);
32, Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22 como insecticida.
33, Uso según la reivindicación 32, para controlar plagas de los géneros Heücoverpa o Heiiothis.
34, Uso según la reinvindicación 33, para controlar plagas del género Heücoverpa.
35. Uso según la reinvindicación 34, para controlar plagas de Heücoverpa armígera.
36. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35 como insecticida para plantas.
37. Uso según la reivindicación 36, en el que la planta se selecciona entre tomate, pimiento, algodón o maíz.
38. Uso según la reivindicación 37, en invernaderos o en cultivos ai aire libre.
39, Uso según la reivindicación 38, para cultivos de tomate y en el que la dosis es de entre 106 y 1010 cuerpos de ociusión/ml.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0908099A1 (en) * 1997-09-16 1999-04-14 Societe Des Produits Nestle S.A. Natural insecticide affecting the growth of Heliothis armigera

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0908099A1 (en) * 1997-09-16 1999-04-14 Societe Des Produits Nestle S.A. Natural insecticide affecting the growth of Heliothis armigera

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARRIZUBIETA, M. ET AL.: "Selection of a nucleopolydedrovirusisolate from Helicoverpa armigera as the basis for a biological insecticide", PEST MANAGEMENT SCIENCE, vol. 70, 22 June 2006 (2006-06-22), pages 967 - 976, XP055246797 *
CHRISTIAN P D ET AL.: "A rapid method for the identification and differentiation of Helicoverpa nucleopolyhedroviruses (NPV Baculoviridae) isolated from the environment..", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS NETHERLANDS, vol. 96, no. 1, July 2001 (2001-07-01), pages 51 - 65, XP055246800, ISSN: 0166-0934, [retrieved on 20010630] *
DATABASE DataBase [O] 23 April 2015 (2015-04-23), OGEMBO J.G. ET AL.: "Helicoverpa armígera NPV NNg 1 DNA", XP055246795, Database accession no. AP 010907 *
FIGUEIREDO ELISABETE ET AL.: "Diversity of Iberian nucleopolyhedrovirus wild-type isolates infecting Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae).", BIOLOGICAL CONTROL, vol. 50, no. 1, July 2009 (2009-07-01), pages 43 - 49, XP026091002, ISSN: 1049-9644, [retrieved on 20090630] *
ROWLEY DANIEL L ET AL.: "Genetic variation and virulence of nucleopolyhedroviruses isolated worldwide from the heliothine pests Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, and Heliothis virescens.", JOURNAL OF INVERTEBRATE PATHOLOGY UNITED STATES, vol. 107, no. 2, 31 May 2011 (2011-05-31), pages 112 - 126, XP028209657, ISSN: 1096-0805 *
ZHONG-JIAN GUO ET AL.: "Biological Comparison of Two Genotypes of Helicoverpa armigera Single-Nucleocapsid Nucleopolyhedrovirus.", BIOCONTROL, vol. 51, no. 6, 22 June 2006 (2006-06-22), pages 809 - 820, XP019447228, ISSN: 1573-8248 *

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