ES2301352A1 - Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. - Google Patents
Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2301352A1 ES2301352A1 ES200601065A ES200601065A ES2301352A1 ES 2301352 A1 ES2301352 A1 ES 2301352A1 ES 200601065 A ES200601065 A ES 200601065A ES 200601065 A ES200601065 A ES 200601065A ES 2301352 A1 ES2301352 A1 ES 2301352A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polyhedra
- baselineskip
- spodoptera
- genotypes
- nucleopoliedrovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
Abstract
Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. La invención se refiere a seis nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua denominados AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 y su uso, preferentemente como mezcla de dos o más genotipos, dentro de composiciones insecticidas contra plagas producidas por Spodoptera exigua. Una forma preferida de realización de la invención es añadir a estas composiciones abrillantadores ópticos, potenciando así su capacidad insecticida. La invención describe también un método de producción de poliedros del virus inoculando larvas de Spodoptera exigua, preferiblemente tratadas previamente con un análogo de la hormona juvenil de este lepidóptero. Las composiciones insecticidas de la invención representan una tecnología limpia y segura, al no dejar residuos tóxicos sobre las cosechas ni ser tóxicas para el hombre ni otros animales, incluidos parasitoides y depredadores de plagas.
Description
Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de
Spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las
plagas producidas por este insecto.
La invención se adscribe al sector técnico de
los plaguicidas biológicos de aplicación al control de plagas
provocadas por las larvas del lepidóptero Spodoptera exigua,
mediante el uso de nuevos genotipos de nucleopoliedrovirus.
Alguno de los principales cultivos producidos en
invernadero, por producción y valor de la misma, son pimiento,
tomate, sandía, melón, calabacín, pepino, judía y berenjena. La
problemática fitosanitaria asociada a estos cultivos es bastante
amplia concurriendo en ellos plagas, incluyendo larvas del
lepidóptero Spodoptera exigua (Moreno, R. et al.
1992; Belda, J. et al. 1994). El control de S. exigua
en los invernaderos se realiza por medio de la aplicación de
plaguicidas químicos. Sin embargo, la utilización sistemática de
estos insecticidas no funciona con la eficacia esperada a causa de
graves problemas de resistencias en esta plaga (Cuadrado Gómez I.M.
y Viñuela Sandoval, E. 1998). Adicionalmente, el control químico de
S. exigua conlleva problemas relacionados con los niveles de
residuos de plaguicidas que deben ser mantenidos por debajo de los
límites máximos de residuos, siguiendo las regulaciones establecidas
para frutas y hortalizas en la Unión Europea (http://europa.eu.
int/comen/food/fvo/specialreports/pesticides_index_en.htm).
La familia Baculoviridae agrupa a virus
de DNA de doble cadena cuyos viriones están característicamente
incluidos en una matriz cristalina de naturaleza proteica, de 3 a 15
de diámetro, en la que puede estar incluido un alto número de
partículas virales y a la que se hace referencia en la presente
memoria con el nombre de cuerpo de oclusión (abreviados "OB",
del inglés "occlusion body") o también, debido a su
forma geométrica, con el nombre de poliedro. A efectos también de la
presente memoria, el término virión se define como la partícula
viral formada por una o más moléculas circulares de ADN de doble
hebra empaquetadas individualmente en una cápsida proteica y
envueltas por una membrana lipoproteica de estructura laminar. La
familia consta de los géneros Nucleopoliedrovirus (NPV) y
Granulovirus (GV); la mayoría de los cuales han sido
aislados de lepidópteros (Caballero, P. et al. 2001). Los
virus de esta familia se caracterizan por tener un estrecho
espectro de huéspedes y una elevada patogenicidad y virulencia. El
poliedro que los caracteriza los hace estables durante largos
periodos (Jaques, R. P. 1985) y facilita su aplicación mediante
pulverizaciones acuosas convencionales. Además, el uso insecticida
de los baculovirus, debido a su estrecho espectro de huéspedes
(Gröner, A. 1986) y a la ausencia de otros posibles efectos
perjudiciales, no entraña riesgos ambientales mayores.
El estado susceptible del lepidóptero es el de
la larva que es infectada al alimentarse de un substrato vegetal
contaminado con poliedros del virus. Al final del proceso
infeccioso, que se completa entre tres y ocho días, la larva muere y
el tegumento se degrada liberando grandes cantidades de poliedros
que contaminan las plantas, los cuales constituyen el inóculo que
sirve para dar origen al proceso de infección en otras larvas
susceptibles.
La utilidad y efectividad de los baculovirus
para el control de las plagas han sido ampliamente demostradas
(Moscardi, F. 1999). Se sabe que, en general, la actividad
insecticida del virus (medida en términos de la dosis letal media,
DL_{50}) cambia en función del estadio larvario, siendo el virus
más activo, en general, para las larvas más jóvenes (las de los
primeros estadios) y disminuyendo su actividad (aumenta el valor de
la DL_{50}) a medida que aumenta el tamaño de la larva.
Actualmente hay comercializados más de treinta bioinsecticidas
basados en baculovirus contra algunas de las plagas más importantes
en el ámbito mundial entre las que se incluye S. exigua. Los
bioinsecticidas basados en baculovirus, dadas sus características,
son agentes de control ideales para su inclusión en programas de
control integrado y su acción insecticida es especialmente útil:
(i) contra aquellas especies fitófagas que han desarrollado
resistencia múltiple o cruzada a los insecticidas químicos de
síntesis y (ii) en los programas de control donde se incluyen
agentes biológicos de control susceptibles a la acción de los
insecticidas químicos (Hunter-Fujita et al.,
1998).
Con frecuencia se encuentra que los distintos
aislados de un mismo baculovirus difieren significativamente en sus
propiedades insecticidas para un mismo insecto. Por tanto, la
selección de la variante más efectiva para una determinada especie
fitófaga es un importante elemento a la hora de desarrollar un
bioinsecticida. El nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua (al que se hace referencia también en la presente
memoria mediante sus correspondientes siglas en ingles SeMNPV) es un
virus de la familia Baculoviradae, capaz de infectar y matar larvas
del lepidóptero Spodoptera exigua, que se ha aislado en
diferentes regiones del mundo incluyendo Norte América, Tailandia,
Países Bajos, Taiwán, India, Egipto y Japón (Hara K. et al.
1995). Este virus también se ha aislado en España, donde provoca
epizootias naturales en poblaciones de S. exigua en girasol
y en los cultivos hortícolas de los invernaderos de Almería
(Caballero P. et al. 1992). La eficiencia de preparados
simples de algunos aislados de SeMNPV ha resultado igual o mejor
que el grado de control logrado por aplicación de insecticidas
químicos de síntesis (Kolodny-Hirsch, D. M., et
al. 1997).
Un aislado del SeMNPV originario de Florida,
USA, se ha desarrollado como un producto comercial registrado bajo
el nombre de Spod-X® en Holanda, Estados Unidos y
Tailandia (Smits, P. H. y Vlak, J. M. 1994). El producto se utiliza
en los invernaderos de los Países Bajos en cultivos de plantas
ornamentales. Actualmente el virus es comercializado por la empresa
Certis USA (http://www.certisusa.com/products/viruses.html). Sin
embargo, este producto presenta importantes problemas relacionados
con su efectividad: la calidad biológica del producto está afectada
por la presencia de genotipos autoparásitos que reducen la
capacidad insecticida del virus (Muñoz, D. et al., 1998). Los
genotipos autoparásitos se caracterizan por haber perdido genes
esenciales para su replicación y dependen de manera parasítica de
otros genotipos presentes en la cepa silvestre para producir las
proteínas necesarias durante su replicación (Muñoz, D. et
al., 2000).
Hoy en día se pueden identificar las diferentes
variantes genotípicas presentes en poblaciones naturales de
baculovirus mediante técnicas moleculares basadas en el uso de
endonucleasas de restricción y secuenciación del genoma o de
fragmentos del mismo. Se ha reconocido la presencia de diversas
variantes genotípicas con diferentes actividades insecticidas en
aislados de SeMNPV colectadas en el sur de España (Muñoz, D. et
al., 1999).
Los bioinsecticidas basados en baculovirus, a
diferencia de los plaguicidas químicos, actúan exclusivamente por
ingestión y su persistencia sobre el cultivo es mucho menor. La
mayoría de los baculovirus actualmente comercializados como
bioinsecticidas utilizan el mismo tipo de formulación que los
insecticidas químicos.
Los abrillantadores ópticos son un grupo de
compuestos químicos que, por su capacidad de absorber la radiación
ultravioleta y emitir luz en la región azul del espectro visible,
son utilizados comúnmente para dar mayor brillo a pinturas, fibras,
etc.. Los más conocidos son los derivados del estilbeno. Se ha
demostrado la capacidad que tienen estas sustancias de potenciar la
actividad insecticida del baculovirus (Patente de EE.UU. US5124149)
debido a la interacción del blanqueador con la membrana peritrófica
del intestino del insecto (Wang, P. y Granados, R. R. 2000). En
S. exigua, la actividad sinérgica de la sustancia aumenta
con la edad del huésped tratado de forma que los valores de las
concentraciones letales requeridas para el control de larvas de los
últimos estadios puede reducirse a valores similares a los que se
requieren para el control de larvas de los primeros estadios
(Murillo, R. et al. 2003).
La producción in vivo sobre huéspedes
permisibles es la metodología actualmente utilizada para la
producción de todos los bioinsecticidas basados en baculovirus
disponibles en el mercado incluido el SeMNPV. Básicamente consiste
en alimentar larvas con dieta semisintética que es superficialmente
contaminada con una determinada suspensión acuosa del virus que se
quiere multiplicar. Algunos de los aspectos esenciales de esta
metodología, como por ejemplo las dietas para insectos o los
métodos de cría masiva, deben ser específicamente desarrollados para
cada sistema huésped-patógeno. El método de cría
masiva de S. exigua ha sido optimizado para la producción de
SeMNPV en Tailandia (Cherry, A. J. et al. 1997). También se
ha desarrollado un sistema de producción de baculovirus el cual
utiliza una alta densidad de larvas que aun no ha sido probado para
la producción de SeMNPV (Patente de EE.UU. US5351643).
La invención se refiere a seis nuevos genotipos
del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua
denominados AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449,
AlPstM0923, y AlPstM0657, cuyo depósito se ha efectuado en la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut
Pasteur, París, Francia. Estos genotipos se diferencian entre sí, y
con respecto a otros descritos en la literatura, por la secuencia
de nucleótidos localizados entre las 10.637 y 11.744 pares de bases
del genoma viral, tomando como referencia la secuencia del genoma
cuyo número de GeneBank es N0002169 y que corresponde a un genotipo
procedente de un aislado de Estados Unidos. Una diferenciación
rápida y precisa de cada uno de estos genotipos puede obtenerse
empleando una combinación de la técnica de la PCR y la digestión con
endonucleasas de restricción de los fragmentos amplificados. Cada
genotipo posee una actividad insecticida característica para las
larvas de Spodoptera exigua, la cual se determina como la
relación estadística entre el número de partículas del virus
(poliedros) y la mortalidad inducida en larvas tratadas y se expresa
como dosis letal media (DL_{50}). La mezcla de dos o más
genotipos tiene una actividad insecticida significativamente mayor
que la de los genotipos individuales. Mediante la adición de
abrillantadores ópticos, como por ejemplo Leucophor, se puede
incrementar la actividad insecticida del virus entre 20 y 1000
veces. Los poliedros, en los cuales radica la actividad
insecticida, pueden producirse de forma masiva in vivo,
inoculando larvas de Spodoptera exigua con dosis elevadas.
El tratamiento de las larvas con un análogo de la hormona juvenil,
previamente a su inoculación con el virus, permite aumentar la
producción de poliedros por larva entre 3 y 8 veces. Los poliedros
extraídos de las larvas, pulverizados como suspensiones acuosas,
protegen de una forma efectiva a los cultivos de las plagas
ocasionadas por larvas de Spodoptera exigua, incluso cuando
estas han desarrollado resistencias a los insecticidas químicos.
Este producto representa una tecnología limpia y segura ya que no
deja residuos tóxicos sobre las cosechas y no es tóxico para el
hombre ni otros animales, incluidos los enemigos los parasitoides y
depredadores de las plagas.
Un objeto de la presente invención es un
nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua que
pertenece a un genotipo seleccionado entre AlPstM0935, AlPstM1400,
AlPstM1033, M1PstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657, preferentemente en
forma de poliedro. Dicho nucleopoliedrovirus se caracteriza por
comprender una secuencia de ADN seleccionada entre: SEQ ID NO:4,
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID
NO:9.
Otro objeto de la presente invención son
composiciones plaguicidas que contengan, en forma de poliedros,
alguno de los nucleopoliedrovirus AlPstM0935, AlPstM1400,
AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657, o combinaciones de
los mismos, con cualquier otro excipiente o vehículo apropiado en
el sector agrícola que lo haga apto para ser aplicado según
cualquiera de los métodos habituales en agricultura: pulverización
a nivel de tierra, pulverización aérea, en disolución, en forma de
polvo, por cualquier tipo de sistema de riego o irrigación, en
forma sólida, asociado a abonos, fertilizantes, etc.
Son también objeto de la presente invención las
composiciones plaguicidas definidas anteriormente que comprendan un
agente potenciador del efecto patógeno del nucleopoliedrovirus
sobre el lepidóptero. Especialmente útiles se han mostrado las
composiciones plaguicidas en que dicho agente potenciador es un
abrillantador óptico, particularmente un derivado del estilbeno y,
en concreto, composiciones plaguicidas que contengan Leucophor
AP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genotipos del SeMNPV AlPstM0935, AlPstM1400,
AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 han sido aislados
de muestras de suelo incorporadas a dieta artificial [Richards y
Christian , 1999]. Aproximadamente 10 g de suelo se añaden en 90 ml
de dieta artificial (7,2% germen de trigo, 3,3% caseína, 2,9% azúcar
comercial, 1,4% levadura de cerveza, 0,94% mezcla de sales de
Wesson, 0,15% ácido sórbico, 0,09% colesterol, 0,09% nipagina, 1,9%
agar industrial y 82,8% agua destilada). De este preparado se
colocan pequeñas pastillas (5x5x5 mm) en viales de 1 ml y se
infestan con una larva de primer o segundo estadio. Para cada
muestra se tratan un total de 50 larvas y como control un grupo de
larvas alimentadas con dieta a la que se incorporó una muestra de
suelo previamente esterilizado. Las larvas así tratadas se
mantienen en condiciones de temperatura constante de 26 \pm 2ºC y
oscuridad. Las larvas que mueren en los días siguientes se examinan
al microscopio óptico en contraste de fases para determinar el
agente causante de la muerte. En las larvas muertas por
nucleopoliedrovirus se purifican los poliedros triturando los
cadáveres en agua bidestilada que contiene dodecilsulfato sódico al
0,01% y filtrando la suspensión resultante a través de un filtro de
muselina. Los poliedros se precipitan por centrifugación a 6000 g
durante 10 min. Posteriormente se realiza un lavado con agua que
contiene cloruro sódico al 0,01% y se precipitan por centrifugación
en las mismas condiciones. Para conservar los poliedros se
resuspenden finalmente en agua estéril. Debido a sus características
los poliedros pueden ser almacenados en refrigeración durante
largos periodos de tiempo en agua o agua con un 50% de glicerol a
-80º C o por liofilización. En suspensiones acuosas almacenadas a
4ºC también mantienen su capacidad patogénica durante largos
periodos de tiempo, mientras que a temperatura ambiente pierden
parte de esta capacidad después de ocho o diez meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir una mayor cantidad de poliedros de
los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033,
AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 es necesario infectar larvas sanas de S. exigua alimentándolas con dieta artificial contaminada o también en distintas líneas celulares de S. exigua cultivadas in vitro, en medio de cultivo (Hara K. et al., 1994).
AlPstM1449, AlPstM0923 y AlPstM0657 es necesario infectar larvas sanas de S. exigua alimentándolas con dieta artificial contaminada o también en distintas líneas celulares de S. exigua cultivadas in vitro, en medio de cultivo (Hara K. et al., 1994).
Para poder diferenciar genéticamente los seis
genotipos se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica
(Muñoz, D. et al., 2001). Un método preciso, reproducible y
ampliamente utilizado es el análisis del ADN genómico, aprovechando
la existencia de regiones que muestran una alta variabilidad
estructural entre distintos aislados geográficos (Li et al.,
2005) o incluso entre genotipos purificados de un mismo aislado
(García-Maruniak et al., 1996), como las
regiones homólogas (hr), que se localizan en número variable
a lo largo del genoma. En el genoma del SeMNPV existen 6 hrs,
de las que la denominada hr1, que actúa como origen de
replicación del virus in vitro, es la que muestra mayor
variabilidad entre los genotipos (Muñoz, D. et al., 1999).
Esta zona hipervariable del genoma del virus SeMNPV está localizada
en el fragmento de restricción PstI-M (Fig.
1) y es útil para diferenciar variantes genotípicas en distintos
aislados del SeMNPV. La digestión del ADN de los genotipos
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 y
AlPstM0657 con las endonucleasas de restricción BglII y
PstI produce un perfil de restricción característico y único
para cada genotipo (Fig 2). Por ejemplo, los fragmentos polimórficos
generados por la endonucleasa de restricción BglII
(BglII-A, BglII-H,
BglII-J o K) o por PstI
(PstI-M), pueden utilizarse como marcadores
para diferenciar entre dos o más genotipos.
Una diferenciación más precisa de cada genotipo
(AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449,
AlPstM0923, y AlPstM0657) se obtiene empleando una combinación de la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) junto con la digestión de los fragmentos amplificados por PCR con endonucleasas de restricción (Restriction Endonuclease, REN). El empleo de dos cebadores genéricos para todos estos genotipos (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) permite amplificar una zona hipervariable del genoma comprendida en el fragmento de restricción PstIM (Tabla 1).
AlPstM0923, y AlPstM0657) se obtiene empleando una combinación de la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) junto con la digestión de los fragmentos amplificados por PCR con endonucleasas de restricción (Restriction Endonuclease, REN). El empleo de dos cebadores genéricos para todos estos genotipos (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) permite amplificar una zona hipervariable del genoma comprendida en el fragmento de restricción PstIM (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
La digestión de los fragmentos amplificados por
PCR con la endonucleasa de restricción BglII produce
perfiles de restricción únicos para cada uno de los genotipos
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y
AlPstM0657 (Tabla 2; Fig. 3). De esta manera el genotipo AlPstM0935
se caracteriza por dar un producto de PCR de 1,2 kb que al ser
digerido por BglII genera tres fragmentos de 0,55; 0,4 y
0,25 kb. El genotipo AlPstM1400 se caracteriza por dar un producto
de PCR de 1,7 kb que al ser digerido por BglII genera tres
fragmentos de 0,25; 0,4 y 1,05 kb. El genotipo AlPstM1033 se
caracteriza por dar un producto de PCR de 1,3 kb que al ser
digerido por BglII genera dos fragmentos de 0,4 y 0,9 kb. El
genotipo AlPstM1449 se caracteriza por dar un producto de PCR de
1,6 kb que al ser digerido por BglII genera cuatro
fragmentos de 0,2; 0,3, 0,4 y 0,7 kb. El genotipo AlPstM0923 se
caracteriza por dar un producto de PCR de 1,2 kb que no produce
fragmentos al ser digerido por BglII.
El genotipo AlPstM0657 se caracteriza por dar un
producto de PCR de 0,9 kb que al ser digerido por BglII
genera dos fragmentos de 0,4 y 0,5 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos de la región
variable entre genotipos es el método más preciso para la
caracterización e identificación de los genotipos. El diseño de un
nuevo cebador interno situado en la región conservada para todos
los genotipos del extremo 5', cuya secuencia viene representada por
SEQ ID NO:3, permite obtener la secuencia de nucleótidos completa
correspondiente a la zona variable entre los genotipos AlPstM0935,
AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657.
Genotipo AlPstM0935: Se llevaron a cabo
nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R} Big
Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un
termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este
proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un
secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO: 4).
Genotipo AlPstM1400: Se llevaron a cabo
nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R} Big
Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un
termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este
proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un
secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO:5).
Genotipo AlPstM1033: Se llevaron a cabo
nueve reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R} Big
Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un
termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este
proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un
secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO: 6).
Genotipo AlPstM1449: Se llevaron a cabo
catorce reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R}
Big Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en
un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras
este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en
un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO: 7).
Genotipo AlPstM0923: Se llevaron a cabo
catorce reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R}
Big Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en
un termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras
este proceso, los productos de las reacciones se han analizado en
un secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO: 8).
Genotipo AlPstM0657: Se llevaron a cabo
ocho reacciones de secuenciación utilizando el ABI PRISM^{R} Big
Dye^{TM} Terminatior Ready Reaction Cycle Sequencing kit en un
termociclador modelo 9600 de Perkin-Elmer. Tras este
proceso, los productos de las reacciones se han analizado en un
secuenciador automático modelo ABI PRISM 3110 de Applied
Biosystems. Finalmente se ha realizado el ensamblaje y edición en un
solo contig. El procedimiento interno que describe estos procesos
es el PEN06 (SEQ ID NO: 9).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad insecticida de los genotipos
individuales o distintas mezclas de genotipos se determina en
términos de patogenicidad y tiempo de matar. La patogenicidad de los
genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449,
AlPstM0923, y AlPstM0657 y las mezclas AlPstM-M1
(AlPstM1400:AlPstM1033 en la proporción 1:1),
AlPstM-M2 (AlPstM0935:AlPstM1400:AlPstM1033 en la
proporción 1:1:1), y AlPstM-M3 (AlPstM0935:
AlPstM1033 en la proporción 1:1) se expresa como la dosis letal media (DL_{50}). Este valor se determina mediante bioensayo (Hughes y Wood, 1981) sobre larvas de S. exigua del segundo estadio. Las larvas se inoculan por ingestión de la cantidad de poliedros correspondiente para obtener cada una de las siguientes concentraciones: 7,50\times10^{5}; 2,50\times10^{5}; 8,18\times10^{4}; 2,72\times10^{4}; 9,03\times10^{3} poliedros/ml, que corresponden a las dosis de 3, 9, 27, 81, y 243 poliedros/larva (esta relación, el número de poliedros por larva, se abreviará en lo sucesivo como OB/larva). Como testigo se incluye un grupo de larvas tratadas con la misma solución sin poliedros. Las larvas tratadas se mantienen a 26ºC y cada 12 horas se registra el número de larvas muertas por infección de poliedros (Tabla 3).
AlPstM1033 en la proporción 1:1) se expresa como la dosis letal media (DL_{50}). Este valor se determina mediante bioensayo (Hughes y Wood, 1981) sobre larvas de S. exigua del segundo estadio. Las larvas se inoculan por ingestión de la cantidad de poliedros correspondiente para obtener cada una de las siguientes concentraciones: 7,50\times10^{5}; 2,50\times10^{5}; 8,18\times10^{4}; 2,72\times10^{4}; 9,03\times10^{3} poliedros/ml, que corresponden a las dosis de 3, 9, 27, 81, y 243 poliedros/larva (esta relación, el número de poliedros por larva, se abreviará en lo sucesivo como OB/larva). Como testigo se incluye un grupo de larvas tratadas con la misma solución sin poliedros. Las larvas tratadas se mantienen a 26ºC y cada 12 horas se registra el número de larvas muertas por infección de poliedros (Tabla 3).
Los datos dosis-mortalidad son
analizados mediante una regresión probit entre el logaritmo de la
dosis y la mortalidad que nos permite obtener los valores de la
DL_{10} DL_{50} para los genotipos individuales y las mezclas
de varias combinaciones de los mismos (Tabla 4). La patogenicidad
de las mezclas AlPstM-M2 y AlPstM-M3
es mayor que la de los genotipos individules.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El tiempo de matar de los genotipos AlPstM0935,
AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449 y las mezclas
AlPstM-M1, AlPstM-M2,
AJPstM-M3 se muestra como el porcentaje de
mortalidad medido en dos momentos distintos a lo largo de la
infección, porcentajes que no son acumulativos, sino que
corresponden a las muertes de larvas registradas a las 72 horas de
haber sido tratadas y en el período comprendido entre las 72 y las
96 horas después de haber sido tratadas (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El pico de mortalidad se registra a las 72
horas, es decir, el período comprendido entre las 60 horas
postinfección y las 72 horas postinfección, es el período en el que
se registra mayor porcentaje de larvas muertas.
Tal como se comentó anteriormente, la actividad
insecticida del virus (medida en términos de la dosis letal media,
DL_{50}) cambia en función del estadio larvario. En general,
puede decirse que el virus es más activo (presenta un menor valor de
DL_{50}) para las larvas más jóvenes (de los primeros estadios) y
disminuye su actividad (aumenta el valor de la DL_{50}) a medida
que aumenta el tamaño de la larva. Interesa, sin embargo, que el
virus pueda matar a las larvas a la dosis más baja posible, para que
sea necesario aplicar menos producto y el correspondiente
insecticida resulte más barato. Por ello, se buscó un producto que
pudiera mostrar una actividad sinérgica con el virus.
El Leucophor AP aumenta la actividad insecticida
del nucleopoliedrovirus de S. exigua cuando se suministra
mezclado al 0,1 o al 1% con los poliedros de diferentes genotipos
de SeMNPV. Dicha mortalidad se determinó mediante el método de
bioensayo por contaminación de superficie de dieta (Muñoz, D. et
al., 2001). Varias suspensiones del nucleopoliedrovirus, en
agua destilada o soluciones acuosas de Leucophor AP (suministrado
por Clariant Ibérica, Barcelona, España) al 1% se aplicaron
superficialmente sobre la dieta previamente dispensada en los
pocillos (400 mm^{2}) de una caja de petri compartimentalizada,
para obtener las siguientes concentraciones de virus: 273, 91, 18,
9, 2 y 0 poliedros por mm^{2} de dieta. En cada uno de estos
pocillos se coloca una larva de S. exigua y se mantienen a
25ºC en oscuridad. La mortalidad de las larvas debida a virus se
registra a los 7 días (Tabla 6). Se muestran los resultados
correspondientes a larvas del cuarto estadio, en las que el efecto
sinérgico del abrillantador es más fácil de apreciar debido a que
las dosis letales medias de SeMNPV requeridas en ausencia de
compuesto con efecto sinérgico (aproximadamente 100 OB/larva) son
más elevadas que en estadios más tempranos como por ejemplo el
segundo (al que le corresponden un valor de DL_{50} en ausencia de
compuesto con efecto sinérgico de aproximadamente 10 OB/larva),
siendo la disminución de la DL_{50} más fácil de apreciar cuando
se parte de valores más elevados. Los resultados mostraron un
importantísimo incremento de la mortalidad causada por el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo ensayo se utilizaron
concentraciones más bajas del nucleopoliedrovirus tanto en
suspensiones acuosas de Leucophor AP al 1% (2,73; 0,91; 0,18; 0,05 y
0,01 poliedros/mm^{2} de dieta) como en las suspensiones de
Leucophor AP 0,1% (27,3; 9,1; 1,8; 0,5 y 0,1 poliedros/mm^{2} de
dieta), de manera que se pudiera establecer la concentración
requerida (número de OBs por unidad de superficie o por unidad de
volumen) para matar el 50% de las larvas tratadas en cada caso
(CL_{50}; ver Tabla 7). Los resultados muestran claramente que el
Leucophor AP a una concentración del 0,1% produce un incremento de
la actividad del virus de más de 20 veces y a la concentración del
1% dicho incremento llega a ser de más de 1000 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la producción masiva de la
mezcla del nucleopoliedrovirus de S. exigua
AlPstM-M2 se utiliza como criterio el número de OBs
que producen las larvas letalmente infectadas. Para llevar a cabo
este procedimiento, se considera que el estadio larvario de S.
exigua más adecuado para la producción masiva de virus es el
último posible (el cual, si el desarrollo larvario se produce de
forma natural, sería el quinto) pues es aquel en el que el tamaño
del huésped es mayor, por lo que también lo es el número de células
en el que puede multiplicarse el virus y mayor es la cantidad de OBs
que se obtienen por huésped infectado, pero también podrían
utilizarse larvas de otros estadios. En cuanto a la cantidad de
virus suministrados por larva, se prefiere utilizar entre 10^{6}
y 10^{7} OB/larva, para asegurar que haya una mortalidad del 100%
de las larvas tratadas. La temperatura adecuada para mantener las
larvas es de 26\pm2ºC.
Larvas recién mudadas al último estadio (quinto
estadio) son individualmente alimentadas con dieta artificial
sólida (8 mm^{3}) (preparada tal como se describe en Muñoz, D.
et al., 2001), contaminada con 10 \mul de una suspensión
acuosa de 10^{8} OBs/ml del virus. Se trataron un total de 30
larvas por repetición y se hicieron tres repeticiones de la misma
prueba. Las larvas tratadas se mantuvieron a 25ºC hasta que se
produjo su muerte (aproximadamente a los 6 días). Los poliedros
producidos por cada larva muerta se extrajeron y se purificaron
según se ha indicado anteriormente (ver ejemplo 1). La suspensión
final de OBs se tituló al microscopio óptico en contraste de fases
haciendo uso de un hemocitómetro (cámara Neubauer). Los resultados
indican que la producción de poliedros por larva oscila entre
0,66\times10^{9} y 3,94\times10^{9} y la producción de
poliedros por miligramo de larva varía entre 0,41 \times10^{7}
y 2,35\times10^{7} (Tabla 8).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo ensayo se midió la producción de
OBs en larvas que habían recibido previamente un tratamiento con un
químico análogo de la hormona juvenil. Larvas recién mudadas al
quinto estadio fueron alimentadas con dieta artificial
superficialmente tratada con una suspensión de Fenoxicarb al 1% en
agua destilada. Las larvas así tratadas experimentan una muda
supernumeraria, muda extra que da lugar a un sexto estadio. Las
larvas recién mudadas al sexto estadio son tratadas utilizando la
misma concentración de virus y la misma metodología indicada en el
apartado anterior. Los resultados indican que la producción de
poliedros por larva oscila entre 1,82\times10^{9} y
10,40\times10^{9} y la producción de poliedros por miligramo de
larva varía entre 0,65\times10^{7} y 2,16\times10^{7}
(Tabla 9).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El método de producción in vivo que
utiliza un análogo de la hormona juvenil produce un incremento de
más de 2,7 veces la cantidad media de cuerpos de poliedros
producidos por larva. Los valores de producción por larva así como
el peso medio final que adquieren las larvas se puede apreciar en
la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Inicialmente, se determina el tiempo que tardan
las larvas en infectarse en condiciones de campo cuando el virus se
aplicó a dos concentraciones diferentes. Para ello, como criterio
se utiliza el porcentaje de mortalidad observado en grupos de larvas
recogidas a distintos intervalos de tiempo (0, 6, 24, 48 y 96
horas) después de haber realizado la aplicación de suspensiones del
virus a dos concentraciones distintas: 1\times10^{8} y
5\times10^{8} poliedros por litro de caldo aplicado. Las larvas
se individualizan y se mantienen sobre dieta artificial en el
laboratorio hasta que se produce su muerte por infección viral o
tiene lugar su pupación (Tabla 11).
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo ensayo, se comparó la efectividad
del virus en campo respecto a un insecticida comercial (Lufenuron
0,05%). Además, se comprobó el incremento de capacidad insecticida
de la formulación del virus con el abrillantador óptico Leucophor
AP al 0,1% (Tabla 12).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Depósitos de los 6 genotipos reivindicados del
nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua han sido
efectuados en una Autoridad de Depósito de acuerdo con el Tratado
de Budapest de depósito de microorganismos con fines de patente. La
colección es la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
(CNCM) con sede en el Institut Pasteur, con dirección en el nº 25
de la Rue du Docteur Roux, F-75724 París Cedex 15
(Francia).
El depósito de todas las muestras quedó
registrado el 16 de Febrero de 2006 y a cada uno de los genotipos
virales correspondió el siguiente nº de registro:
AlPstM0935 CNCM I-3572
AlPstM1400 CNCM I-3573
AlPstM1033 CNCM I-3574
AlPstM1449 CNCM I-3575
AlPstM0923 CNCM I-3576
AlPstM0657 CNCM I-3577
\vskip1.000000\baselineskip
Belda, J. et al. 1994,
Phytoma 57: 9-39.
Caballero, P. et al. 1992,
Biocontr. Sci. Technol. 2: 35-38.
Caballero, P. et al. 2001,
Los baculovirus y sus aplicaciones como bioinsecticidas en el
control biológico de plagas. Phytoma S.A., Valencia.
Cuadrado Gómez I.M. y Viñuela
Sandoval, E. 1998, Resistencia a los pesticidas en los
hortícolas. FIAPA, La Cañada, Almería.
Cherry, A. J. et al. 1997,
J. Invertebr. Pathol. 70: 50-58.
García-Maruniak et
al., 1996, Virus Research,
41:123-132.
Gröner, A. 1986, Specificity and
safety of baculoviruses. pp. 177-202. En: R. R.
Granados y Federici, B. A. (eds.), The biology of
baculoviruses, Vol. 1. Academic Press, San Diego.
Hara K. et al., 1994,
Appl. Entornol. Zool. 29: 395-402 .
Hara K. et al., 1995,
Acta Virol. 39: 215-222.
Hughes y Wood, 1981, J.
Invertebr. Pathol. 37:154-159.
Hunter-Fujita et
al., 1998, Insect viruses and pest management.
Wiley, Chichester, Reino Unido.
Jaques, R. P. 1985. Stability of
insect viruses in the environment. pp. 285-360. En:
K. Maramorosch y K. E. Sherman (eds.), Viral insecticides for
biological control. Academic Press, Orlando, EE.UU.
Kolodny-Hirsch, D. M.,
et al. 1997, Biocontr. Sci. Technol. 7:
475-488.
Li et al., 2005, Journal
of General Virology, 86:91-105.
Moreno, R. et al. 1992,
Hortofruticultura 1: 41-54;
Moscardi, F. 1999, Annu. Rev.
Entomol. 44: 257-289.
Muñoz, D. et al., 1998,
Appl. Environ. Microbiol. 64: 4372-4377.
Muñoz, D. et al., 1999,
Virus Res., 59:61-74.
Muñoz, D. et al., 2000,
Entomol. Exp. Appl. 97: 275-282.
Muñoz, D. et al., 2001.
Técnicas básicas para la caracterización de baculovirus. pp.
479-518. En: Los baculovirus y sus aplicaciones
corno bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Eds:
P. Caballero, M. López-Ferber y T. Williams.
Murillo, R. et al. 2003,
J. Econ. Entomol. 96: 1668-1674.
Richards y Christian, 1999.
J. Virol. Meth. 82:63-75.
Smits, P. H. y Vlak, J. M.
1994. Med. Fac. Landbouw. Univ. Gent 59:
383-392.
Wang, P. y Granados, R. R.
2000, Insect Biochem. Mol. Biol. 30:
135-143
Figura 1: A) Mapa físico del genoma de SeMNPV
(aislado de referencia) con la endonucleasa de restricción
PstI, destacando al posición del fragmento M que contiene la
zona hipervariable correspondiente a la región homóloga hr1;
B) ORFs más próximas a la zona hipervariable; C) localización de
los cebadores y su posición en la secuencia de nucleótidos.
Figura 2: Electroforesis de los fragmentos de
restricción obtenidos al tratar el ADN viral de los
genotipos
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 con la enzima BglII. Para cada genotipo se indican los fragmentos polimórficos a la derecha del carril. A la izquierda de la figura se indican los tamaños de algunos fragmentos de restricción en kilobases.
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y AlPstM0657 con la enzima BglII. Para cada genotipo se indican los fragmentos polimórficos a la derecha del carril. A la izquierda de la figura se indican los tamaños de algunos fragmentos de restricción en kilobases.
Figura 3: Electroforesis de los fragmentos de
restricción generados por la digestión con BglII de los
productos de PCR obtenidos para cada uno de los genotipos
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923, y
AlPstM0657. La última columna (M) muestra el marcador de tamaño de
fragmento cuyos valores se señalan a la derecha de la figura en
kilobases.
<110> Universidad Pública de Navarra
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos genotipos del
nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua y su uso en el
control de las plagas producidas por este insecto
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-100278
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttgtcatc gtcacctacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagatcatca tcgatgaaat c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatgacgg ttgatgcaaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 964
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM0935
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1460
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM1400
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1033
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM1033
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM1449
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 923
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM0923
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 657
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nucleopoliedrovirus múltiple de
Spodoptera exigua
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genotipo AlPstM0657
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua que pertenece a un genotipo seleccionado entre:
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657.
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o AlPstM0657.
2. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1, que pertenece al
genotipo
AlPstM0935, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:4.
AlPstM0935, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:4.
3. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1 que pertenece al genotipo
AlPstM 1400, caracterizado por comprender la secuencia de
ADN representada por SEQ ID NO:5.
4. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1 que pertenece al
genotipo
AlPstM1033, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:6.
AlPstM1033, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:6.
5. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1 que pertenece al
genotipo
AlPstM1449, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:7.
AlPstM1449, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:7.
6. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1 que pertenece al
genotipo
AlPstM0923, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:8.
AlPstM0923, caracterizado por comprender la secuencia de ADN representada por SEQ ID NO:8.
7. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según la reivindicación 1 que pertenece al
genotipo
AlPstM0657, caracterizado por comprender la secuencia representada por SEQ ID NO:9.
AlPstM0657, caracterizado por comprender la secuencia representada por SEQ ID NO:9.
8. Nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera
exigua según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que está
en forma de poliedro.
9. Una composición plaguicida que comprende
poliedros según la reivindicación 8.
10. Una composición plaguicida según la
reivindicación 9 que comprende nucleopoliedrovirus múltiples de
Spodoptera exigua de un genotipo seleccionado entre
AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449, AlPstM0923 o
AlPstM0657.
11. Una composición plaguicida según la
reivindicación 9 que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus
múltiples de Spodoptera exigua de al menos dos genotipos
seleccionados entre AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033, AlPstM1449,
AlPstM0923 o AlPstM0657.
12. Una composición plaguicida según la
reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus
múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos AlPstM1400 y
AlPstM1033.
13. Una composición plaguicida según la
reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus
múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos AlPstM0935,
AlPstM1400 y AlPstM1033.
14. Una composición plaguicida según la
reivindicación 11, que comprende mezclas de nucleopoliedrovirus
múltiples de Spodoptera exigua de los genotipos AlPstM0935 y
AJPstM1033.
15. Una composición plaguicida según la
reivindicación 14, en la que los poliedros se encuentran en un
vehículo acuoso.
16. Una composición plaguicida según cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 15 que comprende adicionalmente un
abrillantador óptico.
17. Una composición plaguicida según la
reivindicación 16, en la que el abrillantador óptico es un derivado
del estilbeno.
18. Una composición plaguicida según la
reivindicación 17, en la que el derivado del estilbeno es Leucophor
AP.
19. Una composición plaguicida según la
reivindicación 18, en la que el Leucophor AP está presente en un
porcentaje que oscila entre el 0,1% y el 1%.
20. Una composición plaguicida según cualquiera
de las reivindicaciones 18 ó 19, que comprende mezclas de
nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera exigua de al
menos los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400 y AlPstM1033.
21. Un procedimiento de obtención in vivo
de poliedros de los genotipos AlPstM0935, AlPstM1400, AlPstM1033,
AlPstM1449, AlPstM0923 y/o AlPstM0657 del nucleopoliedrovirus
múltiple de Spodoptera exigua, que comprende las etapas
de:
\newpage
- a)
- alimentar larvas de Spodoptera exigua con dieta artificial contaminada con poliedros de virus de la reivindicación 8;
- b)
- mantener las larvas a 24ºC-28ºC hasta que se produce su muerte;
- c)
- purificar los poliedros generados en las larvas triturando los cadáveres de las larvas en agua bidestilada que contiene dodecilsulfato sódico, filtrando la suspensión resultante, precipitando los poliedros mediante centrifugación, lavando el precipitado con agua con cloruro sódico y precipitando de nuevo por centrifugación;
- d)
- resuspender el precipitado final en agua estéril;
- e)
- almacenar las muestras a temperatura ambiente o, preferentemente, en refrigeración u, opcionalmente, si se añade glicerol al agua, a temperatura igual o inferior a -70ºC; u
- f)
- opcionalmente, liofilizar la muestra y conservar a temperatura ambiente.
22. Un procedimiento de obtención de poliedros
según la reivindicación 21, en el que se suministran de 10^{6} a
10^{7} poliedros por larva.
23. Un procedimiento de obtención de poliedros
según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que la
dieta artificial que recibe cada larva se suministra en forma de
pastillas que contienen 7,2% de germen de trigo, 3,3% de caseína,
2,9% de azúcar comercial, 1,4% de levadura de cerveza, 0,94% de
mezcla de sales de Wesson, 0,15% de ácido sórbico, 0,09%
colesterol, 0,09% nipagina, 1,9% agar industrial y 82,8% agua
destilada.
24. Un procedimiento de obtención de poliedros
según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que las
larvas de Spodoptera exigua se encuentran en el quinto
estadio larvario en el momento de iniciar las etapas del
procedimiento.
25. Un procedimiento de obtención de poliedros
según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que comprende
adicionalmente la adición de un análogo de la hormona juvenil de la
larva a la dieta previamente a la adición de los virus a la
misma.
26. Un procedimiento de obtención de poliedros
según la reivindicación 25, en el que el análogo de la hormona
juvenil es el Fenoxicarb.
27. Un procedimiento de obtención de poliedros
según la reivindicación 26, en el que el Fenoxicarb se añade en la
superficie de las pastillas de la dieta en forma de suspensión al
1% en agua destilada.
28. Uso de nucleopoliedrovirus múltiples de
Spodoptera exigua de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8 o de composiciones plaguicidas según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 20 para controlar plagas producidas por
Spodoptera exigua.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200601065A ES2301352B1 (es) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. |
PCT/ES2007/000252 WO2007122278A2 (es) | 2006-04-26 | 2007-04-26 | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200601065A ES2301352B1 (es) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2301352A1 true ES2301352A1 (es) | 2008-06-16 |
ES2301352B1 ES2301352B1 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=38625359
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200601065A Active ES2301352B1 (es) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
ES (1) | ES2301352B1 (es) |
WO (1) | WO2007122278A2 (es) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017109605A1 (es) * | 2015-12-21 | 2017-06-29 | Corporación Colombiana De Investigación Agropecuaria-Corpoica | Bioplaguicida a base de virus |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2504866B1 (es) * | 2013-04-04 | 2015-07-16 | Universidad Pública de Navarra | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Chrysodeixis chalcites (ChchSNPV), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico |
-
2006
- 2006-04-26 ES ES200601065A patent/ES2301352B1/es active Active
-
2007
- 2007-04-26 WO PCT/ES2007/000252 patent/WO2007122278A2/es active Application Filing
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
IJKEL, W.F., et al., "Sequence and organization of the spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus genome.", J. GEN. VIROL., 1999, Vol. 80, No. 12, páginas 3289-3304. Todo el documento. * |
MUÑOZ, D. et al., "Four genotypic variants of a Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus (Se-SP2) are distinguishable by a hypervariable genomic region.", VIRUS RESEARCH, 1999, Vol. 59, No. 1, páginas 61-74. Todo el documento. * |
MUÑOZ, D. et al., "In vivo recombination between two strains of the genus Nucleopolyhedrovirus in its natural host, Spodoptera exigua.", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., 1997, Vol. 63, No. 8, páginas 3025-3031. Todo el documento. * |
MURILLO, R. et al., "{}Application of the PCR-RFLP method for the rapid differentiation of Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus genotypes.", J. VIROL. METHODS, Jul. 2006, Vol. 135, No. 1, páginas 1-8. [Artículo publicado 'on line' el 21.02.2006]. Materiales y Métodos; Resultados; Figuras 1-3; Tabla 1. * |
MURILLO, R. et al., "Application of the PCR-RFLP method for the rapid differentiation of Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus genotypes.", J. VIROL. METHODS, Jul. 2006, Vol. 135, No. 1, páginas 1-8. [Artículo publicado 'on line' el 21.02.2006]. Materiales y Métodos; Resultados; Figuras 1-3; Tabla 1. * |
MURILLO, R. et al., "Effect of tinopal LPW on the insecticidal properties and genetic stability of the nucleopolyhedrovirus of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae).", J. ECON. ENTOMOL., 2003, Vol. 96, No. 6, páginas 1668-1674. Todo el documento. * |
MURILLO, R. et al., "Genetic and phenotypic variability in Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus isolates from greenhouse soils in southern Spain.", BIOLOGICAL CONTROL, Ago. 2006, Vol. 38, No. 2, páginas 157-165. [Artículo publicado 'on line' el 19.01.2006]. Materiales y Métodos; Resultados. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017109605A1 (es) * | 2015-12-21 | 2017-06-29 | Corporación Colombiana De Investigación Agropecuaria-Corpoica | Bioplaguicida a base de virus |
US10440959B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-10-15 | La Corporación Colombiana De Investigación Agropecuaria—Agrosavia | Virus-based biopesticide |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007122278A2 (es) | 2007-11-01 |
ES2301352B1 (es) | 2009-05-01 |
WO2007122278A3 (es) | 2007-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fisher et al. | Diversity of rhizosphere associated entomopathogenic fungi of perennial herbs, shrubs and coniferous trees | |
Benítez et al. | Biofungicides: Trichoderma as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi. | |
ES2663372T3 (es) | Biocontrol de nematodos | |
Klingen et al. | Effect of Norwegian entomopathogenic fungal isolates against Otiorhynchus sulcatus larvae at low temperatures and persistence in strawberry rhizospheres | |
HU228475B1 (en) | Methods of controlling cutworm pests | |
Jaques | THE PERSISTENCE OF A NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS IN THE HABITAT OF THE HOST INSECT, TRICHOPLUSIA NI II.: POLYHEDRA IN SOIL1 | |
Samšiňáková et al. | Mass production of Beauveria bassiana for regulation of Leptinotarsa decemlineata populations | |
EP3305892B1 (en) | Method for the prevention and/or the biological control of wilt caused by ralstonia solanacearum | |
IL265999A (en) | Liquid antifungal biological preparation including pyatium oligandrome microorganism and production method | |
CN110093301A (zh) | 一种苏云金芽孢杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用 | |
CN107043716A (zh) | 一种苏云金芽胞杆菌及其应用 | |
ES2301352B1 (es) | Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de spodoptera exigua y uso de los mismos en el control de las plagas producidas por este insecto. | |
WO2017109605A1 (es) | Bioplaguicida a base de virus | |
JPH07501324A (ja) | 害虫制御 | |
US5811092A (en) | Nematophage agent against nematodes of the meloidogyne genus | |
Stadler et al. | Biocontrol potential of Microsphaeropsis ochracea on microsclerotia of Verticillium longisporum in environments differing in microbial complexity | |
EP2981608B1 (en) | Novel genotypes of chrysodeixis chalcites single nucleopolyhedrovirus (chchsnpv), a procedure for its production and use as a biological control agent | |
ES2307870T3 (es) | Composicion bactericida, bacteriostatica y fingicida que comprende dos o mas especies vivas de trichoderma. | |
Baki et al. | ISOLATION AND MORPHO MOLECULAR IDENTIFICATION OF INDIGENOUS SOIL BORNE ENTOMOPATHOGENIC FUNGI, AND THEIR PATHOGENICITY TO L.(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) AS A MODEL INSECT | |
RU2511042C1 (ru) | ШТАММ ХС-18 ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Helicoverpa armigera Hbn, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА | |
ES2220087T3 (es) | Proteccion de plantas usando rhizoctonia. | |
RU2396750C2 (ru) | Препарат для борьбы с хлопковой совкой | |
ES2693153T3 (es) | Producción de cuerpos de inclusión de virus que incluyen viriones que contienen genomas de diferentes especies de baculovirus que pueden usarse para combatir plagas de insectos | |
SU1638161A1 (ru) | Штамм вируса дерного полиэдроза дл производства инсектицидного препарата | |
Fernando et al. | Some studies on the use of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. for the control of Oryctes rhinoceros in Sri Lanka |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20080616 Kind code of ref document: A1 |