WO2007119563A1 - ヒトメガリンの測定方法 - Google Patents

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Shinya Ogasawara
Shuhei Miura
Akihiko Saito
Tetsuro Takeda
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Niigata University
Denka Seiken Co., Ltd.
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    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring human megalin.
  • cells / tissues where megalin expression is observed Detects megalin expressed locally and specifically in organs in a rapid and simple manner.
  • the present invention relates to a detection method that makes it possible to make an early diagnosis of the degree of disability, and to maintain the progress of the disorder and the prognosis of the treatment to be improved.
  • the present invention can be applied to diagnosis of diseases of organs in which megalin expression is observed, such as renal diseases and lung diseases.
  • Megalin also known as Glycoprotein 330 (gp330) o ii Low Density Lipoprotein (LDL-1 receptor related protein 2 (LRP-2)
  • LRP-2 Low Density Lipoprotein
  • megalin functions as an endocytosis receptor involved in reabsorption of endocytosis such as proteins in the proximal tubule before urinary excretion. The resorbed protein and the like are then degraded by lysosomes (see Non-Patent Document 6).
  • Megalin is the most highly expressed on the mammalian renal proximal tubular epithelial cell membrane A glycoprotein, and its cDNA coding sequence is the gene disclosed in Korenberg, JR et al. (1994), gene accession number U04441, Hjaeln, G. et al. (1996). It has nucleotide identity with the human megalin cDNA sequence with accession number U33837 (see Non-Patent Documents 7 and 8). In rat, rat megalin having homology with human megalin has been found by Saito et al. (1994), and its cDNA sequence is disclosed as Gene Accession No.L34049 (Non-Patent Document). 2).
  • Megalin is a huge cell membrane protein consisting of 4655 amino acids in humans and 4660 amino acids in rats. Its molecular weight is predicted to be about 520 kDa, and when sugar chains are added, it reaches about 600 kDa (Non-patent Document 2). reference). Megalin belongs to the LDL receptor gene family, and its large extracellular region has four functional domains that continue to a short intracellular region via a single transmembrane region.
  • Megalin is glomerular (rat), proximal tubule, alveolar type II cell, paratesticular gland, thyroid, parathyroid, yolk sac membrane, inner ear, small intestine, choroid and other luminal side (glomerulus)
  • In megalin knockout mice low molecular weight proteinuria, abnormal bone metabolism, respiratory failure, brain malformations, etc. occur (see Non-patent Document 11).
  • Megalin homologues are also present in nematodes (C. el egans), and biological significance has also been suggested (see Non-Patent Document 12).
  • megalin is most abundantly expressed on the luminal side of proximal tubular epithelial cells. In the human kidney, expression other than the proximal tubular epithelial cells, including glomeruli, is not observed. Megalin incorporates various ligands (such as low molecular weight proteins and drugs) that filter the glomeruli into the cell by endocytosis and transports them to the lysosome. (See Patent Documents 9 and 10). It is also related to transcytosis from the luminal side to the basement membrane side. Vitamins,
  • Leptin is secreted from cells and increases in blood in obese patients. It has been shown to be taken up and metabolized by proximal tubular epithelial cells as a ligand for megalin (see Non-patent Document 17). As a result of the accumulation of adipocytes, visceral fat, metabolic syndrome is manifested as a complex pathology, but lebutin, one of the adipocyte force-in secreted by fat cells, increases in the blood of patients with metabolic syndrome. Yes. It is suggested that the kidney is the organ in which levtin in blood is most concentrated and levtin plays a role of nephrotoxicity (see Non-Patent Document 18). It has also been found that the so-called lebutin receptor exists from the proximal tubule to the collecting duct downstream from the area of action of megarin.
  • Metabolic syndrome is defined as a pathological condition based on insulin resistance, which includes visceral obesity, hypertension, hyperlipidemia, and impaired glucose tolerance. In such a pathological condition, there is a risk of developing arteriosclerotic disease. Nephropathy that presents with high proteinuria and histological characteristics of glomerular 'tubule hypertrophy may develop. If such cases are associated with obvious diabetes, the symptoms of hyperglycemia may be further added, and diabetic nephropathy may become apparent and become severe. Or, since type 2 diabetes is basically preceded or coexisting with metabolic syndrome, it can be said that the pathology of nephropathy is inherently associated with metabolic syndrome-related nephropathy. [0009] Saito A. et al.
  • AGE advanced glycation end products
  • L2 cells rat yolk sac epithelium-derived cells
  • megalin is involved in the uptake pathway.
  • Involvement of advanced glycoprotein end products (AGE) by the Maillard reaction has been pointed out as the pathogenesis of glycouric nephropathy.
  • the low molecular weight AGE present in the blood filters the glomeruli and is reabsorbed and metabolized by the proximal tubular epithelial cells.
  • NHE3 Na + —H + exchanger isoform 3
  • NHE3 Na + re-absorption It is an antiporter that plays an important role in the yield. It also affects ligand uptake by megalin (see Non-Patent Document 28). Megalin may also be involved in the inactivation of NHE3 'metabolism. Diabetic nephropathy is associated with glomerular hyperfiltration in the early stages of metabolic syndrome-related nephropathy.
  • Non-Patent Document 29 This is presumed to be primarily caused by increased Na + reabsorption in the proximal tubule (see Non-Patent Document 29), and NHE3 plays an important role in this process. Inactivation of NHE3 by megalin as described above is considered to be involved in metabolism (see Non-Patent Document 28).
  • Megalin is involved in the metabolism of various low molecular weight proteins into proximal tubular epithelial cells as described above. In renal failure, such metabolic mechanisms are impaired, resulting in the accumulation of low molecular weight proteins in the blood 'tissue as so-called uremic proteins.
  • the representative example is j8-microglobulin-m), and dialysis amyloid in long-term dialysis patients
  • Non-Patent Document 32 causes a single cis (see Non-Patent Document 32).
  • the above-mentioned AGE has also been suggested to accumulate in blood in renal failure / dialysis patients and cause arteriosclerosis and organ damage, and is considered as a kind of uremic protein (see Non-patent Document 33).
  • lebutin also accumulates in dialysis patients and is thought to be related to nutritional disorders and immune decline.
  • Tabata Y. and Gejyo F. et al. Have demonstrated the efficacy and effectiveness of a metabolic model of uremic toxin protein using the function of megalin (see Non-Patent Document 34 and Patent Document 1).
  • transplanted L2 cell mass was significantly 125 1 labeled compared to other organs
  • kidney disease includes albumin, creatine, ⁇ -microglobulin, L-F in urine and blood
  • Patent Document 1 International Publication No. WO02 / 091955 Pamphlet
  • Non-patent literature l Kerjaschki D., Farquhar M.G. (1892) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 5557-5561
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  • Non-Patent Document 4 Juhlin C., Klareskog et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 8275-8279
  • Non-Patent Document 5 Zheng G, McCluskey RT et al. (1994) J. Histochem. Cytochem. 42, 531-542
  • Non-Patent Document 6 Mausbach AB, Christensen EI (1992) Handbook of Physiology: Renal Physiology, Windhager, editor, New York, Oxford University Press, 42—207
  • Non-Patent Document 7 Korenberg JR et al. (1994) Genomics 22 , 88-93
  • Non-Patent Document 8 Hjalm G. et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239, 132-137
  • Non-patent document 9 Farquhar MG et al. (1995) J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47
  • Non-patent document 10 Christensen EI et al. (2002) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 , 256-266
  • Non-Patent Document 11 Willnow TE et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8460-84
  • Non-Patent Document 12 Yochem J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 4572-4576
  • Non-Patent Document 13 Kerjaschki D. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 89, 11179-11183
  • Non-Patent Document 14 Saito A., Farquhar M.G. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9 3, 8601-8605
  • Non-Patent Document 15 Yamazaki H., Farquhar MG et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1638-1644
  • Non-Patent Document 16 Orlando R.A.Farquhar M.G. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 94, 2368-2373
  • Non-patent literature 17 Saito A., Gejyo F. et al. (2004) Endocrinology.145, 3935-3940
  • Non-patent literature 18 Tarzi RM Lord GM et al. (2004) Am. J. Pathol. 164, 385- 390
  • Non-Patent Document 19 Saito A. Gejyo F. et al. (2003) J. Am. Soc. Nephrol. 14, 1123-1131
  • Non-Patent Document 20 Takeda T., Gejyo F., Saito A. et al. (2005) Lab. Invest. 85, 522-5 31
  • Non-Patent Document 21 01einikov A.V. et al. (2000) Biochem. J.347, 613-621
  • Non-Patent Document 22 Rader K., Farquhar M.G. et al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol. 11, 21
  • Non-Patent Document 23 Patrie K.M., Margolis B. et al. (2001) J. Am. Soc. Nephrol. 12, 667 -677
  • Non-Patent Document 24 Lou X., Farquhar M.G. et al. (2002) J. Am. Soc. Nephrol. 13, 918-927
  • Non-Patent Document 25 Petersen HH, Willnow TE (2003) J. Cell. Sci. 116, 453-461
  • Non-Patent Document 26 Takeda T., Farquhar MG et al. (2003) Mol. Biol. Cell. 14, 984 -4996
  • Non-patent document 27 Biemesderfer D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 17518-17524
  • Non-patent document 28 Hryciw DH et al. (2004) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 372- 3 79
  • Non-patent document 29 Vallon V. et al. (2003) J. Am. Soc. Nephrol. 14, 530-537
  • Non-patent document 30 Leheste J. et al. (1999) Am. J. Pathol. 155, 1361 -1370
  • Non-Patent Document 31 Anthony G.W., Moestrup S.K. et al. (2002) J. Am. Soc. Nephrol. 13, 125-133
  • Non-Patent Document 32 Gejyo F., Schmid K. et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 701-706
  • Non-Patent Document 33 Henle T., Miyata S. (2003) Adv. Ren. Replace Ther. 10, 321-331
  • Non-Patent Document 34 Saito A., Tabata ⁇ ., Gejyo F. et al. (2003) J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032
  • Non-Patent Document 35 Zou Z., Biemesderfer D. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 34302-3 4310
  • Non-Patent Document 36 Grigorenko A.P. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 149 55-14960
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring human megalin that is simpler and requires less time than conventional methods, and is capable of quantifying human megalin. Furthermore, by using this measurement method, functional diseases specific to cells, tissues, and organs can be diagnosed directly and at an early stage. In particular, the object is to provide a method for detecting renal disease by measuring urinary megalin.
  • the present inventors have conducted extensive studies on a method for measuring human megalin with high sensitivity and speed, and used a ligand capable of binding to human megalin, particularly anti-human megalin antibody, to detect megalin in body fluid samples such as urine. A method for accurate measurement was found.
  • the present inventors have measured human megalin in a body fluid of a patient having an organ function disorder and found for the first time that human megalin can serve as a marker for detecting and diagnosing an organ disease, thereby completing the present invention. I came to let you.
  • the present invention is as follows.
  • a method for measuring human megalin in a sample using a first ligand capable of binding to human megalin bound to a solid phase and a second ligand capable of binding to human megalin comprising: Reacting a specimen with a first ligand capable of binding to bound human megalin, and A second ligand that binds to the solid phase reacts with a specimen that reacts with a second ligand that binds to human megalin, and forms a complex between the human megalin in the specimen and a ligand that binds to human megalin.
  • a method for measuring human megalin in a sample comprising measuring a ligand.
  • [0025] A step of reacting a specimen with a second ligand capable of binding to human megalin after the reaction of the specimen with a first ligand capable of binding to human megalin bound to a solid phase, two steps The method of measuring human megalin in the specimen of [1], which is also powerful.
  • [3] A step in which the reaction between the first ligand having binding ability to human megalin bound to the solid phase and the specimen and the reaction between the second ligand having binding ability to human megalin and the specimen are simultaneously performed.
  • the method of measuring human megalin in the specimen of [1] which is also powerful.
  • the first ligand capable of binding to human megalin and the second ligand capable of binding to human megalin are both antibodies.
  • the human megalin in any one of the samples [1] to [3] is measured. Method.
  • the first ligand capable of binding to human megalin is a lectin specific for the sugar chain of human megalin
  • the second ligand capable of binding to human megalin is an antibody [1] to [3 ] The method for measuring human megalin in any specimen.
  • the first ligand capable of binding to human megalin is an antibody
  • the second ligand capable of binding to human megalin is a lectin specific for the sugar chain of human megalin [1] to [3] Method for measuring human megalin in any of the samples.
  • the first ligand capable of binding to human megalin and / or the second ligand capable of binding to human megalin is transcobalamin-vitamin B (Transcobalamin-vitamin B),
  • Vitamin-binding protein (Vitamin-D-binding protein) or Retinol-binding protein (Vitamin-binding protein); Apolipoprotein B, Apolipoprotein B Lipoprotein, which is protein E (Apolipoprotein E), apolipoprotein J / clusterin, or apolipoprotein H; parathyroid hormone (PTH), insulin, epidermal growth factor (EGF), prolatatin Leptin or thyroglobulin or hormones that are these receptors or receptors for those hormones; Immune and stress response-related protein that is a chain, PAP-1 or
  • PAI-1 PAI-1-urokinase
  • PAI-1-tPA prourokinase
  • lipoprotein lipase plasminogen, ⁇ -amylase, j8-amylase, microglobulin or
  • RAP receptor-related protein
  • NHE3 H + exchange transporter isoform 3
  • [0031] A method for measuring human megalin in a specimen using human megalin or a fragment of human megalin bound to a solid phase and a ligand capable of binding to human megalin, wherein the specimen has binding ability to specimen and human megalin. Ligand is then reacted, and then the reaction product is reacted with human megalin bound to the solid phase, and a ligand having binding property to human megalin bound to the solid phase is measured, and binding property to the human megalin bound to the solid phase is measured.
  • a method for measuring human megalin in a specimen wherein human megalin in a specimen is competitively quantified based on a decrease rate of the ligand possessed.
  • a method for measuring human megalin in a specimen using a ligand capable of binding to human megalin comprising reacting the specimen with a ligand capable of binding to human megalin bound to a particle to cause an agglutination reaction.
  • [0035] [12] A method for detecting a disease in an organ in which megalin expression is observed by measuring human megalin by any one of the methods [1] to [11]. [13] The method for detecting an organ disease according to [12], wherein the organ disease in which megalin expression is observed is a lung disease.
  • kits for detecting a disease in an organ in which megalin expression is observed comprising a ligand capable of binding to human megalin.
  • a disease detection marker for detecting a disease in an organ in which megalin expression is observed which is also a human megalinker.
  • the disease for organ detection where the expression of megalin is observed is lung disease [22].
  • the disease for organ detection in which megalin expression is observed is renal disease [22].
  • [28] Use of human megalin as a disease detection marker according to [26], wherein the organ disease in which megalin expression is observed is renal disease.
  • [0052] [29] Use of human megalin as a disease detection marker according to [28], wherein the renal disease is tubule injury.
  • human megalin in a sample such as urine can be measured with high sensitivity and accuracy.
  • megalin deviates from the cells and accumulates in the specimen. That is, by measuring human megalin in a specimen, it is possible to directly detect and diagnose a dysfunction of a cell, tissue, or organ directly. Therefore, by measuring human megalin in a sample using the method of the present invention, it becomes possible to early and accurately detect diseases of organs in which megalin expression is observed, such as renal diseases and lung diseases. .
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a human megalin locus and protein.
  • FIG. 2 shows an ELISA calibration curve for human megalin detection using a standard human megalin standard.
  • FIG. 3 shows clinical results of urinary human megalin (part 1).
  • FIG. 4 shows clinical results of urinary human megalin (part 2).
  • the present invention is a method for measuring human megalin in a specimen.
  • SEQ ID NO: 1 represents the nucleotide sequence of human megalin
  • SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of human megalin.
  • a first ligand capable of binding to human megalin is bound to a solid phase.
  • a solid phase any of those used in conventional immunoassays can be used.
  • plastic microtiter plate wells or magnetic particles can be preferably used.
  • Examples of ligands capable of binding to human megalin include anti-human megalin antibodies.
  • a lectin specific for the sugar chain of human megalin can also be used.
  • the lectins include concanavalin and wheat embryo lectin (WG A), castor lectin (RCA), lentil lectin (LCA), and the like, but are not limited thereto.
  • transcobalamin vitamin B (Tr)
  • vitamin B vitamin D-binding protein 3 ⁇ 4 (Vitamin—D—binding protein; b
  • Vitamin-binding proteins such as Retinol-binding protein; Apolipoprotein B, Apolipoprotein E, Apolipoprotein J / Clusterin ( Lipoproteins such as Apolipoprotein J / clus terin) or apolipoprotein H; parathyroid hormone (PTH), insulin, epidermal growth factor (EGF), prolatatin, leptin or thyroglobulin or hormones such as these receptors Or receptors for those hormones; immunoglobulins and immunoglobulins such as immunoglobulin light chain, PAP-1 or
  • Enzymes and enzyme inhibitors PAH, PAI-1-urokinase, PAI-I-tPA, prolokinase, lipoprotein lipase, plasminogen, ⁇ -amylase, j8-amylase, a-microglobulin or lysozyme Or these inhibitors or inhibitors of these enzymes; drugs or toxicants such as aminoglycosides, polymyxin B, Aprotinin or Trichosantin; albumin, ratatopherin, hemoglobin, odorant binding proteins (Odorant- binding protein), a carrier protein that is transthyretin or L-FABP; and cytochrome-c, calcium (Ca 2+ ), advanced glycation end products (AGE), cubilin or Na + -H + exchange Transporter isoform (Na +-H + exc a substance selected from the group consisting of a receptor-related protein (RAP) such as hanger isofor m 3 (NHE3)), or a
  • Binding of a ligand capable of binding to human megalin, such as an anti-human megalin antibody, to the solid phase can be performed by a conventional method using a well-known method in this field, for example, binding to a well of a microtiter plate, etc.
  • a ligand solution that binds to human megalin such as an antibody of about 3 to 10 / zg / mL (preferably about 5 / zg / mL) to the solid phase, and overnight at 4 ° C (preferably It can be done by leaving it for 12 hours or more.
  • the solid phase concentration the above The recommended concentration range described is a value calculated theoretically when a full-length antibody is solid-phased. Its theoretical formula is
  • the theoretical solid phase concentration is set depending on the above variable factors such as individual molecular weights. It depends on the shape of the surface. Therefore, it is not limited to the above-mentioned solid phase concentration.
  • the present invention is also applicable when the solid-phase adsorption mode is a covalent bond. In this case, the number of functional groups used for the covalent bond, etc. present on the adsorption surface is also taken into account.
  • the solid phase concentration is not limited.
  • BSA urine serum albumin
  • casein casein
  • a specimen is reacted with a ligand having a binding property to human megalin such as an anti-human megalin antibody bound to the solid phase in this way, and the human megalin in the specimen is reacted with the solid phase by a ligand-receptor binding reaction such as an antigen-antibody reaction. It binds to the solid phase via a ligand capable of binding to human megalin bound to. That is, a first ligand-human megalin complex having a binding property to human megalin such as an anti-human megalin antibody bound to a solid phase is formed.
  • the sample may be anything as long as it does not have a force including human megalin.
  • the antigen-antibody reaction can be performed at 4 ° C to 45 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C, and even more preferably 25 ° C to 38 ° C.
  • the reaction time is 10 minutes to 18 hours. More preferably, it is about 10 minutes to 1 hour, more preferably about 30 minutes to 1 hour.
  • the second ligand capable of binding to human megalin is reacted with human megalin in the sample bound to the solid phase. That is, a complex of a first ligand having binding ability to human megalin such as an anti-human megalin antibody bound to a solid phase-human megalin-secondary ligand having binding ability to human megalin is formed.
  • a first ligand having binding ability to human megalin such as an anti-human megalin antibody bound to a solid phase-human megalin-secondary ligand having binding ability to human megalin
  • the second ligand capable of binding to human megalin the same ligand as the first ligand capable of binding to human megalin, such as an anti-human megalin antibody, can be used.
  • the first anti-human megalin antibody and the second anti-human megalin antibody are anti-human megalin monoclonal antibodies
  • the first anti-human megalin antibody and the second anti-human megalin antibody are The 'recognition' bindings need to be different.
  • the combinations of the first anti-human megalin antibody and the second anti-human megalin antibody include monoclonal antibodies and monoclonal antibodies, monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and combinations of polyclonal antibodies and polyclonal antibodies. V, any combination can also be used.
  • This reaction can be carried out at 4 ° C to 45 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C, more preferably 25 ° C to 38 ° C, and the reaction time is 10 minutes to 18 hours, More preferably, it is about 10 minutes to 1 hour, and more preferably about 30 minutes to 1 hour.
  • the second ligand capable of binding to human megalin is bound to the solid phase through the first ligand capable of binding to human megalin and human megalin.
  • a second ligand having binding ability to human megalin such as a second anti-human megalin antibody bound to the solid phase is measured.
  • a second ligand capable of binding to human megalin is labeled with an enzyme, fluorescence, piotin, radiolabel, etc. to prepare an enzyme label, and then bound to the solid phase by measuring these labels.
  • a second ligand capable of binding to human megalin can be measured.
  • peroxidase, alkaline phosphatase, 13-galatatosidase and glucose oxidase isoenzymes are preferred for enzymes or fluorescent labels such as Fluorescein Isothiocyanate (FITC).
  • FITC Fluorescein Isothiocyanate
  • the detection of the label can be performed by reacting the corresponding substrate with the enzyme label and measuring the dye, fluorescence, luminescence, etc. resulting from the reaction.
  • a second ligand having a binding property to human megalin is labeled, and in this case, a labeled third antibody is reacted with the second ligand having a binding property to human megalin, and this label is used. Based on the measurement of the third antibody, the second ligand capable of binding to human megalin can also be measured.
  • the anti-human megalin antibody used for solid phase or labeling is an immunoglobulin fragment such as Fab or F (a) specific for human megalin, or a sc expressed as a recombinant.
  • antibody also includes those fragments specific for human megalin. The preparation of these fragments is well known in the art!
  • a sample is reacted with a first ligand having binding ability to human megalin such as an anti-human megalin antibody bound to a solid phase, then washed, and then secondly binding to human megalin.
  • This is a two-step force method that allows the ligand to react.
  • a one-step force that allows the reaction between the first ligand that binds to human megalin, such as an anti-human megalin antibody bound to the solid phase, and the sample and the reaction between the sample and the second ligand that binds to human megalin simultaneously.
  • the present invention further relates to a method for measuring human megalin in a specimen using human megalin or a partial fragment of human megalin bound to a solid phase and a ligand capable of binding to human megalin, which binds to the specimen and human megalin. Then, the reaction product is reacted with the human megalin bound to the solid phase, the ligand having the binding property to human megalin bound to the solid phase is measured, and the human megalin bound to the solid phase is measured.
  • the method also includes a method for measuring human megalin in a specimen, wherein human megalin in a specimen is competitively quantified based on the reduction rate of a ligand having binding ability.
  • the partial fragment of human megalin is not limited, and a partial fragment of human megalin to which a ligand capable of binding to human megalin binds may be used.
  • a partial fragment of human megalin a partial partial sequence of the amino acid sequence of human megalin represented by SEQ ID NO: 2 is obtained by chemical synthesis or genetic engineering techniques. It can be made and used.
  • the above-mentioned ligands having binding ability to human megalin can be used, and among them, anti-human megalin antibody is preferable.
  • the competition method the amount of human megalin or a partial fragment of human megalin bound to the solid phase to be used and the amount of the ligand capable of binding to human megalin is important, but the competition method is known and is determined appropriately based on known techniques. be able to.
  • the present invention relates to a method for measuring human megalin in a specimen using a ligand capable of binding to human megalin, comprising reacting a specimen with a ligand capable of binding to human megalin bound to particles. And a method of measuring human megalin, in which human megalin is measured based on the degree of aggregation obtained after the aggregation reaction has occurred.
  • particles used in the method include latex having a diameter of 0.05 to 10 ⁇ m, preferably 0.1 to 0.4 ⁇ m, gelatin particles having a diameter of 0.5 to 10 ⁇ m, and animal erythrocytes.
  • Methods for conjugating antibodies to particles are well known in the art, and can be applied to either physisorption or covalent attachment modes.
  • the anti-human megalin antibody is bound on the particles, and the particles and the specimen are mixed on, for example, a black slide glass, and the presence or absence of particles that aggregate and precipitate is determined.
  • human megalin in the test can be detected.
  • human megalin can be quantified by measuring the absorbance of this aggregation.
  • it can also be detected by Pulse Immunoassay.
  • the cell, tissue or organ may be any cell, tissue or organ in which megalin expression is observed, but is preferably the lung and kidney, more preferably the kidney.
  • kidney disease nephritis and tubule injury can be detected.
  • diabetic nephropathy can be suitably detected. It can also be used to detect metabolic syndrome and metabolic syndrome-related nephropathy.
  • human megalin deviates from the cell, and the amount of human megalin in the sample increases. If human megalin in a sample collected from a subject is measured in vitro, and the human megalin concentration in the sample is significantly increased compared to a normal subject, the function of the cell, tissue, or organ is impaired. Can be diagnosed.
  • urine, alveolar lavage fluid, blood / serum / plasma, exhaled breath condensate, etc. can be used as the specimen, especially when detecting lung disease, alveolar lavage fluid is used.
  • Urine is preferred when detecting kidney disease.
  • the risk of suffering from a cell, tissue or organ dysfunction such as kidney disease can be evaluated.
  • Subject force The risk of suffering from cell, tissue or organ dysfunction when human megalin in a sample collected is measured in vitro and the human megalin concentration in the sample is significantly increased compared to normal subjects. Can be evaluated as high. That is, by measuring human megalin in a specimen, it becomes possible to screen a subject at high risk of suffering from a disease such as a renal disease reserve army and to perform an appropriate treatment.
  • organ function can be managed by periodically measuring human megalin in a sample from which the subject's strength has also been collected and monitoring the concentration of human megalin.
  • Human megalin can be used as a marker for detecting or diagnosing dysfunction of cells, tissues or organs in which human megalin expression is observed.
  • the present invention encompasses the use of human megalin as a detection marker for detecting dysfunction or disease of an organ in which megalin expression is observed, and also a human megalinker, a cell, tissue or organ in which megalin expression is observed. It includes a diagnostic marker for detecting and diagnosing a dysfunction of a disease, ie, a disease.
  • a fragment of human megalin that is not limited to intact human megalin may be measured.
  • the presence or absence of anti-human megalin antibody in the culture supernatant was examined. Therefore, the cells in the positive well where antibody production was recognized were diluted by limiting dilution and cultured for 2 weeks, and the culture supernatant was similarly examined for the presence of anti-human megalin antibody. Thereafter, the cells in the positive well in which antibody production was recognized were again diluted at the limit and cultured in the same manner. Cells producing anti-human megalin antibody at this stage are cultured in flasks, and a portion of them is suspended in urine fetal serum (FCS) containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) (5 ⁇ 10 6 cells). / mL), stored in liquid nitrogen.
  • FCS urine fetal serum
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • H7.3 Dissolved in H7.3 (hereinafter abbreviated as PBS, pH 7.3).
  • PBS plastic microtiter plate
  • 100 L per well of the above human megalin / PBS, pH 7.3 solution to 3 pmol / well.
  • Human megalin was immobilized on a microtiter plate at 4 ° C for 12 hours. After 12 hours, the human megalin / PBS, pH 7.3 solution added to the well was removed by decantation, and the microtiter plate was washed with 145 mM NaCl, 3.6 mM Na H.
  • PBS-T Tween20
  • antigen solid phase plate Latatose
  • enzyme-labeled anti-antibody was diluted with 145 mM NaCl, 3.6 mM Na HPO, 1.4 mM KH PO, 0.05% (v./v.) Tween 20, 0.5% (wt./v.) BSA (hereinafter referred to as enzyme-labeled anti-antibody).
  • reaction stop solution 313 mM H 2 SO solution
  • the solid-phase human megalin showed a strong reactivity of anti-human megalin antibody.
  • -Select Narui Hypridoma cells and use the Immunoglobulin Typing Kit, Mouse (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for the immunoglobulin class and subclass of the main culture supernatant. Confirmed. Based on the results, the resulting monoclonal cell library was transferred to ascites described later, limited to the IgG class.
  • Ascitic fluid (lOmL) and turbid serum treatment agent (FRIGEN (registered trademark) II: manufactured by Kyowa Junyaku Kogyo Co., Ltd.) were mixed in a ratio of 1 volume of FRIGEN (registered trademark) II to 1.5 volumes of ascites, The ascites was degreased by shaking with stirring for 1-2 minutes. Centrifugation was performed at 3000 rpm (1930 Xg) for 10 minutes with a centrifuge, and the clarified ascites supernatant (10 mL) was collected.
  • the ascites supernatant (10 mL) was subjected to ammonium sulfate fractionation (final concentration 50% saturated ammonium sulfate) in an ice bath for 1 hour, and the precipitated immunoglobulin fraction was suspended and dissolved in PBS. This ammonium sulfate fractionation operation was performed twice in total to obtain a crude immunoglobulin fraction from ascites. Equal amount of 20 mM sodium phosphate, pH7.0 (hereinafter referred to as 20 mM NaPB, pH7.0) is mixed with the resulting crude immunoglobulin fraction (10 mL), and the protein G column (HiTrap Protein G HP , 5 mL: manufactured by Amersham Biosciences).
  • Tris (hydroxymethyl) aminomethane is abbreviated as Tris).
  • the purified product was dialyzed with 500 volumes of PBS at 4 ° C for 6 hours, and this dialysis was performed twice in total.
  • the dialysis membrane used in the dialysis operation was a cellulose tube for dialysis (Viskase Companies).
  • the IgG elution fraction thus obtained was used as a purified product of anti-human megalin monoclonal antibody, which was stored at 4 ° C and used for the operations described later.
  • the above-mentioned protein G column was connected to a BioLogic LP system (manufactured by Bio Rad Laboratories), and the flow rate was consistently 1 mL / min.
  • the anti-human megalin monoclonal antibody / PBS, pH 7.3 solution was removed by decantation and added to the well, and PBS-T was added to the well of the microtiter plate at 200 L / well. Then, PBS-T was removed by decantation, and the excess anti-human megalin monoclonal antibody in the well was washed. This washing process was performed twice. Thereafter, 86 mM NaCl, 100 mM Tris, 0.5% (wt./v.) BSA, 0.05% (v./v.) Tween20 (hereinafter referred to as blocking solution for antibody solid phase plate) was added at 200 / z L / well. Then, blocking was performed in the wells of the microtiter plate on which human megalin was immobilized at 4 ° C for 12 hours. 1 After 2 hours, stored at 4 ° C.
  • HRP Horseradish rust penoleoxidase
  • Peroxidase from horseradish Type VI: manufactured by Sigma was dissolved in pure water at a concentration of 4 mg / mL.
  • a sodium metaperiodate solution (100 L) was added and stirred for 20 minutes at room temperature. This was dialyzed twice at 4 ° C for 6 hours with 500 volumes of ImM sodium acetate, pH 4.0 solution (hereinafter referred to as lm M acetate buffer) against the HRP solution.
  • the dialysis membrane used for dialysis was a cellulose tube for dialysis (manufactured by Viskase Companies).
  • anti-human megalin monoclonal antibody was mixed with 2.4 mM Na 2 CO 3, 7.6 mM NaHCO 3, pH 9.6 solution (hereinafter referred to as 10 mM).
  • a sorbitol solution (hereinafter referred to as labeled antibody storage solution) was added.
  • An HRP-labeled anti-human megalin monoclonal antibody was obtained. Since this HRP labeling method was first reported by Nakane PK and Kawaoi A. in 1974, many reports have been made so far, and the basis of this technology is based on a solid foundation. (Nakane PK, Kawaoi A. (1974) J. Histochem. Cytochem. 22, 1084).
  • Human megalin in urine was measured using the above-mentioned anti-human megalin monoclonal antibody-immobilized microtiter plate and HRP-labeled anti-human megalin monoclonal antibody.
  • 90 ⁇ L of raw urine and 2 ⁇ Tris, 0.2M Ethylenediamine— ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '—tetraacetic acid (hereinafter Ethylenediamine- ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid is abbreviated as EDTA)
  • 10 ⁇ L of the ⁇ -8.0 solution was mixed, and 100 L of the mixed solution was transferred to a well of an anti-human megalin monoclonal antibody-immobilized microtiter plate.
  • TMB solution TMB One-Step Substrate System: DAKO
  • DAKO peroxidase enzyme reaction substrate solution
  • the substrate reaction solution in the well was added with 100 L / well of reaction stop solution to stop the enzyme reaction in the well.
  • the absorbance of this well was then measured, and the value obtained by subtracting the absorbance at 630 nm from the absorbance at 450 nm was used as an index for the evaluation of urinary human megalin.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring human megalin that is simpler and requires less time than conventional methods, and is capable of quantifying human megalin. Furthermore, by using this measurement method, 'Tissue' Organ-specific functional diseases can be diagnosed directly and at an early stage, but the above-mentioned clinical results greatly support this.

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Abstract

　従来法に比較して簡便で所要時間が短く、且つ、ヒトメガリンの定量も可能なヒトメガリンの測定方法ならびに細胞・組織・臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可能とする方法の提供。 　ヒトメガリンを測定することによりメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出する方法。

Description

明 細 書
ヒトメガリンの測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒトメガリンの測定方法に関する。ヒトにおいて、メガリンの発現の認めら れる細胞 ·組織 '臓器に対して、局所特異的に発現しているメガリンを迅速かつ簡便 に定量検出し、それによつて細胞 ·組織 '臓器の直接的な障害の程度の早期診断を 可能とせしめ、障害の進行ならびにその治療による予後を維持 '改善に向かわすこと を可能とする検出方法に関する。本発明は、腎疾患や肺疾患等のメガリンの発現が 認められる臓器の疾病の診断に適応することができる。
背景技術
[0002] 1.メガリンのクローニング
実験膜性腎症モデルである Heymann腎炎の病因抗原の検索の結果、 1982年、 Kerj aschki D.と Farquhar M.G.は、細胞膜タンパク質 gp330を同定した (非特許文献 1参照 )。 1994年、 Saito A.らはラットの gp330の完全一次構造を決定し、脊椎動物でクロー- ングされた最大の細胞膜タンパク質であることにちなんでメガリン (Megalin)と改名した (非特許文献 2参照)。
[0003] 2.メガリンの発現部位
Glycoprotein330(gp330)め o ヽ iiLow Density Lipoprotein(LDLノ一 receptor related p rotein 2(LRP-2)としても知られるメガリン (Megalin)は、腎臓近位尿細管上皮、ならび に他の組織および細胞、例えば、肺の Π型細胞、精巣、子宮内膜、胎盤、内耳の上 皮細胞、腎上皮で、ならびに胚卵黄嚢、および神経外胚葉上に発現される分子量が 約 600kDaの糖タンパク質である (非特許文献 3〜5を参照)。腎臓においては、メガリン は、尿排泄前に近位尿細管内のタンパク質等のエンドサイト一シス '再吸収に関係す るエンドサイト一シス受容体として機能する。再吸収されたタンパク質等は、その後、 リソゾームにより分解される (非特許文献 6参照)。
[0004] 3.メガリンのヌクレオチド配列
メガリン (Megalin)とは、哺乳動物の腎近位尿細管上皮細胞膜上に最も多く発現する 糖タンパク質であり、そしてその cDNAコーディング配列は、 Korenberg , J.R. et al.(19 94)中に開示される遺伝子受託番号第 U04441号、 Hjaeln , G. et al.(1996)中に開示さ れる遺伝子受託番号 U33837号をもつヒトメガリン cDNA配列とヌクレオチド同一性を持 つものである（非特許文献 7および 8を参照)。また、ラットにおいてもヒトメガリンと相同 性をもつラットメガリンが Saito et al.(1994)により見出されており、その cDNA配列は遺 伝子受託番号第 L34049号として開示されて ヽる (非特許文献 2参照)。
[0005] 4.メガリンのアミノ酸配列およびタンパク質構造
メガリンは、ヒトでは 4655アミノ酸、ラットでは 4660アミノ酸力 成る巨大な細胞膜タン パク質であり、そのアミノ酸配列力も予想される分子量は約 520kDaで、糖鎖を加える と約 600kDaに及ぶ (非特許文献 2参照)。メガリンは LDLレセプター遺伝子ファミリーに 属し、その巨大な細胞外領域は 4つの機能的ドメインを有し、単一の細胞膜貫通領域 を介して短い細胞内領域へ続く。メガリンは糸球体 (ラット)、近位尿細管、肺胞 II型細 胞、副睾丸腺、甲状腺、副甲状腺、卵黄嚢膜、内耳、小腸、脈絡膜などの上皮細胞 膜の管腔側（糸球体上皮では管腔側と基底膜側の両方)の clathrin-coated pitに主 に存在し、多様なリガンドの細胞内への取り込み ·代謝に関係している (非特許文献 9 および 10を参照)。メガリンのノックアウトマウスでは、低分子量蛋白尿、骨代謝異常、 呼吸不全、脳奇形などが起こる (非特許文献 11参照)。メガリンのホモログは線虫 (C.el egans)にも存在し、生物学的重要性も示唆されている (非特許文献 12参照)。
[0006] 5.腎炎の病因としてのメガリンの重要性
実験膜性腎症 (Heymann腎炎)の主要病因抗原であるメガリンは、上皮細胞型スカ ベンジャー受容体であり、その生理学的 ·病理学的役割が明らかにされてきて 、る。 その中で、ヒト膜性腎症の発症機序の解明の為に、古くから動物モデルが使われて きたが、なかでもラット Heymann腎炎 (Heymann nephritis )は最も解析が進んでいる膜 性腎症モデルである。 Saito A.らは、 Heymann腎炎の病的ェピトープとリガンド結合ド メインについても解析した結果を開示しており、メガリンの主要抗原領域ならびにリガ ンドとの結合に主に寄与するメガリンの機能領域についても明らかにしている（非特 許文献 13〜16を参照)。
[0007] 6.メガリンの多様なリガンド 生体内でメガリンは近位尿細管上皮細胞の管腔側に最も豊富に発現している。ヒト 腎では、近位尿細管上皮細胞以外は、糸球体を含め、発現は認められない。メガリン は糸球体を濾過する様々なリガンド (低分子量タンパク質や薬剤など)をエンドサイト 一シスによって細胞内に取り込み、それらをライソゾームへ運搬した後、メガリン自身 はリサイクリングによって細胞表面に再び現れる (非特許文献 9および 10を参照)。あ るいは管腔側カゝら基底膜側へのトランスサイト一シスにも関係している。ビタミン Α,Β ,
12
Dなどの結合タンパク質の取り込み ·代謝にも関係する (非特許文献 10を参照)。 Chris tensenと Willnowは、メガリンは、 3つのビタミン担体タンパク質、ビタミン D結合タンパク 質 (DBP)、レチノール結合タンパク質 (RBP)、及びトランスコバラミン (TC)、ならびにそ れらの会合ビタミンである (OH)ビタミン 25D 、ビタミン A (レチノール)、およびビタミン B
3 1 の再吸収を仲介することを明らかにしている (非特許文献 3参照)。 Saito A.らは、脂肪
2
細胞から分泌され、肥満患者で血液中に増加するレブチン力 メガリンのリガンドとし て近位尿細管上皮細胞に取り込まれ、代謝されることを明らかにしている (非特許文 献 17参照)。この脂肪細胞つまり、内臓脂肪の蓄積の結果としてメタボリック症候群と いう複合的な病態を呈するが、脂肪細胞が分泌するアディポサイト力インのひとつで あるレブチンは、メタボリック症候群患者の血液中において増加している。腎臓は血 液中のレブチンが最も集積する臓器であるとともに、レブチンは腎障害性の役割を演 ずることが示唆されている (非特許文献 18参照)。また、いわゆるレブチン受容体はメ ガリンの作用域より下流の近位尿細管から集合管にかけて存在することも判明してい る。
メタボリック症候群とは、内臓肥満、高血圧、高脂血症、耐糖能異常などを合併し、 インスリン抵抗性を基盤とする病態として定義されるが、このような病態では動脈硬化 性疾患の発症リスクが高ぐ蛋白尿を呈し、糸球体'尿細管肥大を組織学的な特徴と する腎症が発症することもある。このような症例が、明らかな糖尿病を合併すると、更 に高血糖の病像が加わり、糖尿病性腎症が顕在化するとともに、重症化する可能性 がある。あるいは 2型糖尿病は基本的にメタボリック症候群の病態が先行あるいは並 存する為、本来その腎症の病像は、メタボリック症候群関連腎症として内包していると もいえる。 [0009] また、 Saito A.らはメガリンを高発現するラット卵黄嚢上皮由来細胞 (L2細胞)を用い た実験において、 1251標識 AGE(advanced glycation end products) (グルコース由来） の L2細胞への取り込みが、抗メガリン抗体によって有意に抑制されることから、その 取り込み経路にメガリンが関与することを明らかにしてきている (非特許文献 19)。糖 尿病性腎症の発症機序として、メイラード反応による糖ィ匕修飾蛋白 advanced glycatio n end products(AGE)の関与が指摘されている。血液中に存在する低分子量の AGE は糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞によって再吸収 ·代謝される。さらに腎症が 進行すれば、より高分子量の AGEも糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞に蓄積し 、過剰な代謝負荷となる。また更に、 Saito A.らは、グルコース以外にも、メチルダリオ キサールゃグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド由来の AGEの細胞取り込みにも メガリンが関与することを明らかにしている。また、メタボリック症候群では脂肪肝など の肝障害を合併することが多い。肝臓内に豊富に存在する liver type fatty acid bindi ng protein(L-FABP)は、健常者でも血液中に放出されている力 肝障害ではさらに 血液中に逸脱し増加する。 Saito A.らは血液中に存在する L-FABPも速やかに糸球 体を濾過し、近位尿細管上皮細胞にぉ ヽてメガリンを介して再吸収されることを明ら かにして 、る (非特許文献 20)。
[0010] 7.メガリンと相互作用する機能性タンパク質
細胞内でのメガリンの輸送機序を明らかにする為に、メガリンの細胞内ドメインに結 合するアダプター分子が探索され、 Dab2 , ANKRA , MAGI- 1 , GAIP , GIPC , Galp hai3 ,MegBP , ARH等々の様々なタンパク質が同定されている (非特許文献 21〜26 を参照)。このような分子を介して、メガリンはエンドサイト一シスあるいはトランスサイト 一シスに関わるとともに、これらに関連したシグナル伝達にも関与している。メガリンは また、近位尿細管上皮細胞においキュビリン (Cubilin)という細胞膜受容体と共役的に 働くことによって、更に多様なリガンドの細胞取り込みに関与する (非特許文献 2参照) 。たとえばキュビリンは、トランスフェリン、アルブミン、内因性ビタミン B などに直接結
12
合する受容体である力 それらのエンドサイト一シスにメガリンが間接的に関与してい る。また、メガリンは、近位尿細管上皮細胞の、 Na+— H+exchanger isoform 3(NHE3) と相互作用を及ぼしあうことも知られて 、る (非特許文献 27参照)。 NHE3は Na+再吸 収に重要な役割を演ずるアンチポーターである力 メガリンによるリガンド取り込みに も影響を与えている (非特許文献 28参照)。メガリンはまた、 NHE3の不活性化 '代謝 に関与して 、る可能性がある。糖尿病性腎症ゃメタボリック症候群関連腎症の初期 には糸球体過剰濾過が起こる。これは近位尿細管の Na+再吸収の亢進が第一義的 な原因であると推定されており (非特許文献 29参照)、その際、重要な役割を演ずる のが NHE3であり、ここに上述したメガリンによる NHE3の不活性化 '代謝が関与してい ると考えられている (非特許文献 28参照)。
[0011] 8.メガリンの尿中排泄とメガリンのリガンドの尿中排泄の関連性
Lehesteらは、メガリン'ノックアウト 'マウスおよび、近位尿細管機能が弱められた Fa nconi症候群を伴う患者が、その尿中にタンパク質およびレチノールの排泄増加を来 すことを開示している (非特許文献 30)。更に、 Moestrup S.K.らは、 Fanconi症候群患 者において、メガリンの尿中排泄量が正常に比して際立って低下しており、このことが 近位尿細管におけるメガリンの機能 ·発現の低下およびそれに続く、レチノール結合 タンパク質を含む糸球体濾過タンパク質の尿中排泄増加を来す要因であることを明 らかにしている (非特許文献 31)。
[0012] 9.尿毒症モデル実験と臓器再生モデル実験によって得られたメガリンの機能の重要 性
メガリンは前述のように様々な低分子量タンパク質の近位尿細管上皮細胞への取り 込み '代謝に関わる。腎不全になると、そのような代謝機構が障害される結果、低分 子量タンパク質が、いわゆる尿毒素タンパク質として、血液'組織に蓄積する。その代 表例が j8 -ミクログロブリン -m)であり、長期透析患者で透析アミロイド
2 2 一シスを引 き起こす原因となる (非特許文献 32参照)。前述の AGEも、腎不全 ·透析患者で血液 中に蓄積し、動脈硬化や臓器障害の病因となることが示唆されており、一種の尿毒 素タンパク質として考えられている (非特許文献 33参照)。さらにレブチンも透析患者 で蓄積し、栄養障害や免疫低下に関係していると考えられている。 Tabata Y.と Gejyo F.らはメガリンの機能を利用した尿毒素タンパク質の代謝モデルの効果 ·有効性を開 示している (非特許文献 34および特許文献 1を参照)。これは、メガリンを発現する細 胞を、生体内において足場タンパク質 (scaffold)とともに移植し、周囲の血管 (新生血 管)から漏出する低分子量タンパク質を、メガリンを介してその細胞に取り込ませ代謝 させるというものである。移植に用いたメガリン発現細胞 (卵黄嚢上皮由来 L2細胞）自 体力 ガリンを介して 13 -mを取り込み ·代謝することを確認して!/ヽる (非特許文献 34
2
参照)。 L2細胞を皮下組織に移植したヌードマウスの両腎を摘出後、腎不全状態を惹 起させ、その後服腔内注射した1251標識 i8 -mの移植組織塊および各種臓器での取り
2
込みを測定した結果、移植 L2細胞塊はその他の臓器に比較して有意に1251標識 |8 -
2 mを取り込むこと、 L2細胞を移植しない対照群と比して血液中の1251標識 |8 - mのタリ
2 ァランスは L2細胞移植群で促進されることを明らかにしている (特許文献 34参照)。
[0013] 10.プロテオライシスとメガリンの尿中排泄
また、近年、メガリンが Notchlike signal pathwayの下で、 proteolysisを受けている可 能性が示唆されてきている (非特許文献 35および 36を参照)。これは、 metalloproteas e力 S媒介する ectodomainの sheddingと gamma— secretase力 介す intramemDrane pro teolysisの 2段階による切断様式を含む。
[0014] また、肺胞 II型細胞上にもメガリンが発現することが知られている。
[0015] 上記のように、メガリンについては、腎臓等の臓器における代謝との関係で多くの研 究がされている。しかしながら、腎臓を含めた臓器疾患とメガリンとの関係は明確にな つておらず、また種々の臓器疾患において、メガリンの発現や体液中への排泄等が どうなつて!/、るのかにつ ヽては研究されて 、なかった。
[0016] 従来メガリンの検出方法としては、ゥサギ等の免疫動物に免疫してえられたポリクロ ーナル抗体を用いた組織染色ある 、は Western Blottingによる方法が知られて!/、る。
[0017] し力しながら、この従来法では、細胞や電気泳動で分離したタンパク質等を染色す るため、組織の固定や切片の作成、電気泳動やその後の膜上への転写等、極めて 煩雑で多くの時間を必要とし、また、メガリンの量を定量することは困難である。
[0018] また、組織'臓器の機能障害の程度を診断するという観点からいえば、特に腎疾患 において尿細管障害を特異的かつ簡便に診断する有効な術は無い。腎疾患の診断 マーカーとしては、尿や血液中のアルブミン、クレアチュン、 β -ミクログロブリン、 L-F
2
ΑΒΡ等々を検出すると!/、う数多くの診断方法が用いられて 、る現状であるが、これら の診断マーカーは何れも腎組織由来のものではなぐ腎糸球体での濾過と尿細管で の再吸収の過程の総合的な現象 '機能の結果を捉えたものでしかない。すなわち、 上記マーカーを用いても腎臓における糸球体障害と尿細管障害の特定は困難であ り、上記マーカーは腎臓外由来の間接的なマーカーであるため疾患の早期診断に は有効性が乏しい。また、肺疾患、特に炎症に対する現状の診断マーカーである KL -6(急性期炎症マーカー)等と比しても同様のことが ヽえる。
特許文献 1：国際公開第 WO02/091955号パンフレット
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 本発明の目的は、従来法に比較して簡便で所要時間が短ぐ且つ、ヒトメガリンの 定量も可能なヒトメガリンの測定方法を提供することである。更に、本測定方法を用い ることで、細胞 ·組織 ·臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可 能とするものである。特に、尿中メガリンを測定することによる腎疾患を検出する方法 の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0020] 上記のように、ヒトメガリンについては多数の報告がなされており、腎臓や肺等の臓 器代謝との関連は示唆されていた。しかしながら、臓器機能に障害が表れた場合に 、メガリンの発現がどのように変動し、メガリンの消長がどうなるか等については不明 であった。
[0021] 本発明者らは、高感度かつ迅速にヒトメガリンを測定する方法について鋭意検討を 行い、ヒトメガリンに結合性を有するリガンド、特に抗ヒトメガリン抗体を用いた、尿等の 体液検体中のメガリンを正確に測定する方法を見出した。
[0022] さらに、本発明者らは、臓器機能に障害を有する患者体液中のヒトメガリンを測定し 、ヒトメガリンが臓器疾患を検出 '診断するためのマーカーとなり得ることをはじめて見 出し、本発明を完成させるに至った。
[0023] すなわち、本発明は以下の通りである。
[0024] [1] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよびヒトメガリンに 結合性を有する第 2のリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって 、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体を反応させ、かつ ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドと検体とを反応させ、検体中のヒトメガリン とヒトメガリンに結合性を有するリガンドとの複合体形成により固相に結合したヒトメガリ ンに結合性を有する第 2のリガンドを測定することを含む検体中のヒトメガリンを測定 する方法。
[0025] [2] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体との反応の後 にヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドと検体との反応を行わせる、 2ステップ 力もなる、 [1]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[0026] [3] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体との反応とヒト メガリンに結合性を有する第 2のリガンドと検体との反応を同時に行わせる、 1ステップ 力もなる、 [1]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[0027] [4] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する 第 2のリガンドが共に抗体である [1]〜[3]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定す る方法。
[0028] [5] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレク チンであり、ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドが抗体である [1]〜[3]のいず れかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[0029] [6] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドが抗体であり、ヒトメガリンに結合性を 有する第 2のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンである [1]〜[3]のいず れかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[0030] [7] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよび/またはヒトメガリンに結合性 を有する第 2のリガンドがトランスコバラミンビタミン B (Transcobalamin-vitamin B )、
12 12 ビタミン D結合タンパク質（Vitamin-D-binding protein)もしくはレチノール結合タンパ ク質（Retino卜 binding protein)であるビタミン結合性タンパク質（Vitamin-binding prot eins)；ァポリポプ口ティン B (Apolipoprotein B)、アポリポプロテイン E (Apolipoprotein E)、アポリポプロテイン J/クラステリン（ApolipoproteinJ/clusterin)もしくはァポリポプ口 ティン H (Apolipoprotein H)であるリポプロテイン；副甲状腺ホルモン (PTH)、インスリ ン、上皮細胞成長因子 (EGF)、プロラタチン、レプチンもしくはサイログロブリンまたは これらの受容体であるホルモンまたはそれらのホルモンの受容体;ィムノグロブリン軽 鎖、 PAP-1もしくは |8 -マイクログロブリンである免疫およびストレス応答関連タンパク
2
質； PAI- 1、 PAI- 1-ゥロキナーゼ、 PAI- 1- tPA、プロゥロキナーゼ、リポプロテインリパー ゼ、プラスミノーゲン、 α -アミラーゼ、 j8 -アミラーゼ、 -マイクログロブリンもしくはリ
1
ゾチームまたはこれらのインヒビターである酵素またはそれらの酵素のインヒビター； アミノグリコシド、ポリミキシン B、ァプロチュン (Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Tricho santin)である薬剤または毒物；アルブミン、ラタトフエリン、ヘモグロビン、匂い物質結 合タンパク質（Odorant-binding protein) ,トランスサイレチンもしくは L- FABPであるキ ャリアタンパク質;ならびにチトクローム- c、カルシウム (Ca2+)、後期糖化生成物（advan ced glycation end products(AGE))、キュビリンもしくは Na+- H+交換輸送体アイソフォ ーム（Na+-H+exchanger isoform 3(NHE3))である受容体関連タンパク質 (RAP)、から なる群力も選択される物質またはその結合性断片である [1]〜[6]のいずれかの検体 中のヒトメガリンを測定する方法。
[0031] [8] 固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結 合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体と ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前記固相に結 合したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドを 測定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少率に基づいて 、検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[0032] [9] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である [8]の検体中のヒ トメガリンを測定する方法。
[0033] [10] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する 方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応さ せ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメガリンを測定す るヒトメガリンを測定する方法。
[0034] [11] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体であり、凝集反応が免 疫凝集反応である、 [10]のヒトメガリンを測定する方法。
[0035] [12] [1]〜[11]のいずれかの方法によりヒトメガリンを測定することによりメガリンの発 現が認められる臓器の疾患を検出する方法。 [0036] [13] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である [12]の臓器の疾患を 検出する方法。
[0037] [14] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である [12]の臓器の疾患を 検出する方法。
[0038] [15] 腎疾患が尿細管障害である、 [14]の腎臓疾患を検出する方法。
[0039] [16] 検体が尿である、 [14]または [15]の方法。
[0040] [17] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを含む、メガリンの発現が認められる臓器 の疾患を検出するためのキット。
[0041] [18] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である、 [17]のメガリ ンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[0042] [19] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である [18]のメガリンの発現 が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[0043] [20] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である [18]のメガリンの発現 が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[0044] [21] 腎疾患が尿細管障害である、 [20]の腎疾患を検出するためのキット。
[0045] [22] ヒトメガリンカもなる、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための 疾患検出用マーカー。
[0046] [23] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である [22]の疾患検出用マ 一力一。
[0047] [24] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である [22]の疾患検出用マ 一力一。
[0048] [25] 腎疾患が尿細管障害である、 [24]の疾患検出用マーカー。
[0049] [26] ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患 検出用マーカーとしての使用。
[0050] [27] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である、 [26]のヒトメガリンの 疾患検出用マーカーとしての使用。
[0051] [28] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である、 [26]のヒトメガリンの 疾患検出用マーカーとしての使用。 [0052] [29] 腎疾患が尿細管障害である、 [28]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとして の使用。
発明の効果
[0053] 本発明の方法により、尿等の検体中のヒトメガリンを高感度にかつ正確に測定する ことができる。また、メガリンを発現する細胞、組織または臓器の機能に障害が生じた 場合に、細胞からメガリンが逸脱し検体中に蓄積する。すなわち、検体中のヒトメガリ ンを測定することにより、細胞、組織または臓器の機能障害を間接的にではなぐ直 接的に検出'診断することができる。従って、本発明の方法を用いて検体中のヒトメガ リンを測定することにより、腎疾患、肺疾患等のメガリンの発現が認められる臓器の疾 患を早期にかつ正確に検出することが可能になる。
[0054] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-089306号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0055] [図 1]ヒトメガリンの遺伝子座およびタンパク質の構造概略を示した図である。
[図 2]ヒトメガリンの標準品を用いたヒトメガリン検出 ELISA検量線を示した図である。
[図 3]尿中ヒトメガリン臨床結果を示した図である（その 1)。
[図 4]尿中ヒトメガリン臨床結果を示した図である（その 2)。
発明を実施するための最良の形態
[0056] 本発明は、検体中のヒトメガリンを測定する方法である。配列番号 1にヒトメガリンの ヌクレオチド配列、配列番号 2にヒトメガリンのアミノ酸配列を表す。
[0057] 本発明のヒトメガリンの測定においては、ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンド を固相に結合したものを用いる。固相としては、従来の免疫分析において用いられて いる何れのものをも用いることができ、例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレ 一トのゥエルや、磁性粒子等を好ましく用いることができる。
[0058] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとしては、例えば抗ヒトメガリン抗体が挙げられ
、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も用いることができる。
[0059] また、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとして、ヒトメガリンの糖鎖に特異的なレク チンを用いることもできる。レクチンとしては、コンカナバリン 、コムギ胚レクチン (WG A)、ヒマレクチン（RCA)、レンズマメレクチン（LCA)等が挙げられるがこれらには限定 されない。
[0060] さらに、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとして、トランスコバラミンビタミン B (Tr
12 anscobalamin— vitamin B )、ビタミン D結合タンノヽク ¾ (Vitamin— D— binding protein; b
12
しくはレチノール結合タンパク質（Retino卜 binding protein)等のビタミン結合性タンパ ク質（Vitamin- binding proteins)；ァポリポプ口ティン B (Apolipoprotein B)ゝァポリポプ 口ティン E (Apolipoprotein E)、アポリポプロテイン J/クラステリン（ApolipoproteinJ/clus terin)もしくはアポリポプロテイン H (Apolipoprotein H)等のリポプロテイン；副甲状腺 ホルモン (PTH)、インスリン、上皮細胞成長因子 (EGF)、プロラタチン、レプチンもしく はサイログロブリンまたはこれらの受容体等のホルモンまたはそれらのホルモンの受 容体;ィムノグロブリン軽鎖、 PAP-1もしくは |8 -マイクログロブリン等の免疫およびスト
2
レス応答関連タンパク質； Enzymes and enzyme inhibitors： PAH, PAI- 1-ゥロキナー ゼ、 PAI-I-tPA、プロゥロキナーゼ、リポプロテインリパーゼ、プラスミノーゲン、 α -アミ ラーゼ、 j8 -アミラーゼ、 a -マイクログロブリンもしくはリゾチームまたはこれらのインヒ ビタ一等の酵素またはそれらの酵素のインヒビター；アミノグリコシド、ポリミキシン B、 ァプロチュン (Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Trichosantin)等の薬剤または毒物； アルブミン、ラタトフエリン、ヘモグロビン、匂い物質結合タンパク質（Odorant-binding protein)、トランスサイレチンもしくは L-FABPであるキャリアタンパク質；ならびにチトク ローム- c、カルシウム (Ca2+)、後期糖化生成物（advanced glycation end products(AG E))、キュビリンもしくは Na+- H+交換輸送体ァイソフォーム（Na+- H+exchanger isofor m 3(NHE3))等の受容体関連タンパク質 (RAP)、からなる群から選択される物質または その結合性断片等が挙げられる。ここで、結合性断片とは、前記物質の断片であつ て、ヒトメガリンと結合する部位を含む断片をいう。
[0061] 抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリガンドの固相への結合は、従 来力もこの分野において周知の方法で行うことができ、例えば、マイクロタイタープレ 一トのゥエル等に結合する場合には 3〜10 /z g/mL程度 (好ましくは 5 /z g/mL程度）の 抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリガンド溶液を固相に加え、 4°Cで一夜 (好まし くは 12時間以上)放置することにより行うことができる。尚、固相濃度に関しては、上記 記載の推奨濃度幅は完全長の抗体を固相する際に、理論的に算出した値である。そ の理論式は、
Q = (2 / 3) . (MW / N) - (2r)"2 - 109 (ng / cm2)
Q： molecular weight density (ng / cmノ
MW： molecular weight (dalton： Da)
N： Avogadro 5 s number = 6 · 10 、mole L)
r： Stokes radius of molecular = (R-T ) / (6 · π · 7 e D ·Ν) (cm)
20 20 20
R： gas constant = 8.3 · 107 (ge cm e sec · K 1 · mole 1
T ： room temperature(20°C) = 293° K
20
77 ： viscosity of water at 20°C = 1 · 10 2(g · cm e sec l)
20
D ： diff. coeff. of molecular ref. to water at 20°C (cm2 · sec l)
20
であり、これは物理吸着様式による固相化の際に適応される。従って、ヒトメガリンに 結合性を有するリガンドの固相化においては、個々の分子量等の上記変動因子に 左右された理論上の固相濃度が設定される為、個々の固相分子種及び、固相面の 形状等で異なる。従って、上記の固相濃度に限定されるものではない。また、固相吸 着様式が、共有結合の場合にも、本発明は適応されるが、この場合は吸着面に存在 する、共有結合に用いる官能基の数等も加味される為、これについても、固相濃度 は限定されるものではない。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックする 為に、定法に基づき、ゥシ血清アルブミン (以下、 BSAと略す)やカゼイン等でブロッキ ングを行う。また、固相が磁性粒子の場合も、上記マイクロタイタープレートの場合と 同様である。
このように固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリ ガンドと、検体を反応させ、検体中のヒトメガリンを、抗原抗体反応等のリガンド -レセ プター結合反応により前記固相に結合されたヒトメガリンに結合性を有するリガンドを 介して固相に結合させる。すなわち、固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメ ガリンに結合性を有する第 1のリガンド-ヒトメガリンの複合体を形成させる。ここで、検 体はヒトメガリンを含む力もしれないものであれば何であってもよい。検体としては、例 えば、尿、肺胞洗浄液、血液 '血清'血漿、呼気凝縮液等を挙げることができる。この 抗原抗体反応は 4°C〜45°C、より好ましくは 20°C〜40°C、さらに好ましくは 25°C〜38 °Cで行うことができ、また、反応時間は、 10分〜 18時間、より好ましくは 10分〜 1時間、 さらに好ましくは 30分〜 1時間程度である。
[0063] 次いで、洗浄後、ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドを、前記固相に結合さ れた検体中のヒトメガリンと反応させる。すなわち、固相に結合された抗ヒトメガリン抗 体等のヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンド-ヒトメガリン-ヒトメガリンに結合性 を有する第 2のリガンドの複合体を形成させる。ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリ ガンドとしては抗ヒトメガリン抗体等、ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと同じ ものを用いることができる。但し、ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよびヒト メガリンに結合性を有する第 2のリガンドの両方が抗ヒトメガリンモノクローナル抗体で ある場合、第 1の抗ヒトメガリン抗体と第 2の抗ヒトメガリン抗体が認識'結合するェピト ープは異なっている必要がある。なお、第 1の抗ヒトメガリン抗体および第 2の抗ヒトメ ガリン抗体の組合せとしては、モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体、モノク ローナル抗体およびポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびモノクローナル 抗体ならびにポリクローナル抗体およびポリクローナル抗体の組合せがある力 V、ず れの組合せも用いることができる。この反応は 4°C〜45°C、より好ましくは 20°C〜40°C 、さらに好ましくは 25°C〜38°Cで行うことができ、また、反応時間は、 10分〜 18時間、 より好ましくは 10分〜 1時間、さらに好ましくは 30分〜 1時間程度である。これにより、ヒ トメガリンに結合性を有する第 2のリガンドは、ヒトメガリン及びヒトメガリンに結合性を 有する第 1のリガンドを介して固相に結合される。
[0064] 次いで、洗浄後、固相に結合された第 2の抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合 性を有する第 2のリガンドを測定する。これは、免疫分析の分野において定用されて いる種々の方法により行うことができる。例えば、ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリ ガンドを、酵素、蛍光、ピオチン、放射標識等で標識して酵素標識体を作製しておき 、これらの標識を測定することにより固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 2 のリガンドを測定することができる。これらのうち、酵素あるいは蛍光による標識が好ま しぐ酵素としてはペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 13 -ガラタトシダーゼ 及びグルコースォキシダーゼ等力 蛍光としては Fluorescein Isothiocyanate(FITC)等 が挙げられるがこの限りではない。標識の検出は、対応する基質と酵素標識体とを反 応させ、反応の結果生じる色素、蛍光、発光等を測定することにより行うことができる。 あるいは、ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドが標識されて 、な 、場合には、 ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドに対する、標識された第 3の抗体を反応さ せ、この標識に基づき第 3の抗体を測定することによつてもヒトメガリンに結合性を有 する第 2のリガンドを測定することができる。
[0065] なお、固相あるいは標識に用いる抗ヒトメガリン抗体は、ヒトメガリンに対して特異的 な Fabや F(a ）のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現された sc
2
Fv、 dsFv、 diabody、 minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗 体」という語は、ヒトメガリンに特異的なこれらの断片をも包含する。これらの断片の調 製方法はこの分野にお!、て周知である。
[0066] 上記の方法は、固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有 する第 1のリガンドと検体を反応させ、次いで洗浄し、その後にヒトメガリンに結合性を 有する第 2のリガンドを反応させる 2ステップ力 なる方法である。固相に結合された 抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体との反応と検 体とヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドとの反応を同時に行わせる 1ステップ 力もなる方法を採用してもょ 、。
[0067] 本発明は、さらに固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒ トメガリンに結合性を有するリガンドを用 、て検体中のヒトメガリンを測定する方法であ つて、検体とヒトメガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前 記固相に結合したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有 するリガンドを測定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少 率に基づいて、検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測 定する方法をも包含する。この方法のためには、ヒトメガリンを固相に結合する必要が あるが、前記の物質の固相へ結合の方法に従って行うことができる。また、ヒトメガリン の一部断片は限定されず、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが結合するヒトメガリ ンの一部断片を用いればよい。ヒトメガリンの一部断片としては、配列番号 2に表され るヒトメガリンのアミノ酸配列の一部部分配列をィ匕学合成や遺伝子工学の手法により 作製して用いることができる。ヒトメガリンに結合性を有するリガンドは前記のものを用 いることができ、その中でも抗ヒトメガリン抗体が好ましい。競合法においては、用いる 固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合性 を有するリガンドの量が重要であるが、競合法は公知であり、公知技術に基づいて、 適宜決定することができる。
[0068] さらに、本発明は、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリ ンを測定する方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガ ンドとを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメ ガリンを測定するヒトメガリンを測定する方法を包含する。
[0069] 該方法において用いられる粒子としては、直径 0.05〜10 μ mの、好ましくは直径 0.1 〜0.4 μ mのラテックス、直径 0.5〜10 μ mのゼラチン粒子及び動物赤血球を挙げるこ とができる。粒子への抗体の結合方法は、この分野において周知であり、物理吸着あ る 、は共有結合のどちらの結合様式をも適応可能である。
[0070] 該方法にお!、て、粒子上に抗ヒトメガリン抗体が結合されて 、る粒子と検体とを、例 えば、黒色のスライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無を観察すること により検対中のヒトメガリンを検出することができる。また、この凝集の吸光度測定によ りヒトメガリンを定量することもできる。更にまた、 Pulse Immunoassayにより検出すること も可能である。
[0071] 本発明のヒトメガリンの測定方法を用いることにより、インタタトなヒトメガリンだけでは なぐヒトメガリンの断片を測定することもできる。
[0072] 検体中のヒトメガリンを測定することにより、検体を採取した被験体がヒトメガリンを発 現する細胞 ·組織 '臓器等に障害を有しているかどうかを判定することができる。すな わち、臓器の疾患等を検出または診断することができる。
[0073] 細胞、組織または臓器としては、メガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器 ならばいずれも対象となり得るが、好ましくは肺および腎臓であり、さらに好ましくは腎 臓である。また、腎臓疾患では、特に腎炎や尿細管障害を検出することができる。ま た、糖尿病性腎障害も好適に検出することができる。さらに、メタボリック症候群やメタ ボリック症候群関連腎症の検出にも利用できる。 [0074] 上記の細胞、組織または臓器の機能障害を有する被験体にぉ 、ては、細胞からヒ トメガリンが逸脱し、検体中のヒトメガリン量が増加する。被験体から採取した検体中 のヒトメガリンを in vitroで測定し、正常人に比較して検体中のヒトメガリン濃度が有意 に増カロしている場合、細胞、組織または臓器の機能障害を有していると診断すること ができる。
[0075] ここで、検体は上記のように、尿、肺胞洗浄液、血液 ·血清 ·血漿、呼気凝縮液等を 用いることができる力 肺疾患を検出する場合には特に肺胞洗浄液を用いるのが好 ましぐ腎疾患を検出する場合には、尿が好ましい。
[0076] さらに、被験体力も採取した検体中のヒトメガリンを測定することにより、腎疾患等の 細胞、組織または臓器の機能障害に罹患するリスクを評価することができる。被験体 力 採取した検体中のヒトメガリンを in vitroで測定し、正常人に比較して検体中のヒト メガリン濃度が有意に増カロしている場合、細胞、組織または臓器の機能障害に罹患 するリスクが高いと評価することができる。すなわち、検体中のヒトメガリンを測定する ことにより、腎疾患予備軍等の疾患に罹患するリスクの高い被験体をスクリーニングし 、適切な処置を施すことが可能になる。
[0077] さらに、被験体力も採取した検体中のヒトメガリンを定期的に測定し、ヒトメガリン濃 度をモニタすることにより、臓器機能の管理をすることができる。
[0078] ヒトメガリンは、ヒトメガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器の機能障害の 検出または診断のためのマーカーとして用いることができる。本発明は、ヒトメガリンの 、メガリンの発現が認められる臓器の機能障害すなわち疾患を検出するための検出 用マーカーとしての使用を包含し、さらにヒトメガリンカもなる、メガリンの発現が認め られる細胞、組織または臓器の機能障害すなわち疾患を検出'診断するための疾患 検出'診断用マーカーを包含する。
[0079] また、ヒトメガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器の機能障害の検出また は診断においては、インタタトなヒトメガリンだけではなぐヒトメガリンの断片を測定し てもよい。
実施例
[0080] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限 定されるものではない。尚、実施例に用いた Enzyme -Linked Immunosorbent Assay( ELISA)という方法は、 1971年に Engvall E.と Perlmann P.が最初の報告をして以来、現 在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立って いる (Engvall E , Perlmann P. (1971) Immunochemistry. 8 , 87ト 874)。
[0081] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
[0082] Enzyme -Linked Immunosorbent Assay(ELISA)を用いた尿中ヒトメガリンの検出
(1)抗ヒトメガリン'マウスモノクローナル抗体の作製
ヒトメガリン 50 gをマウス腹腔にアジュバントと共に数回免疫し、その血清力価が上 昇したことを確認した。追加免疫 (静脈内）後 3日目に脾臓を取り出し、脾細胞を得た 。これとマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール 3500の存在下 (10 : 1細胞)で融 合させ、ハイプリドーマ細胞を作製した。この細胞を 1週間 CO気下 37°Cで培養し、そ
2
の培養上清中の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。そこで抗体産生を認めた陽性ゥ エル中の細胞を限界希釈法により希釈し 2週間培養し、同様に培養上清の抗ヒトメガ リン抗体の有無を調べた。更にその後、抗体産生を認めた陽性ゥエル中の細胞を再 度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ヒトメガリン抗体を産生している細 胞を、フラスコにて培養し、その一部をジメチルスルホキシド (DMSO) 10%含有ゥシ胎 児血清 (FCS)にサスペンドし (5 X 106個/ mL)、液体窒素中に保存した。
[0083] 次に各ゥエルの上清を用い、ヒトメガリンに対する培養上清中の産生抗体の反応性 を調べた。ヒトメガリンを 140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na HPO ,1.8mM KH PO ,p
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H7.3(以下、 PBS,pH7.3と略す)に溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート (N unc- Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, Nalge Nunc International干土製) のゥエルに、 1ゥエル当たり 100 Lの、上記ヒトメガリン/ PBS,pH7.3溶液をカ卩え、 3pmol /ゥエル、 4°C、 12時間の条件下で、ヒトメガリンをマイクロタイタープレート上に固相化 した。 12時間後、ゥエルに加えておいたヒトメガリン/ PBS,pH7.3溶液をデカンテーショ ンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ、 145mM NaCl,3.6mM Na H
2
PO ,1.4mM KH PO ,0.05%(v./v.) Tween20(以下、 PBS- Tと略す)を 200 L/ゥエルで
4 2 4
添加し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、ゥエル内の吸着過剰分のヒトメ ガリンを洗浄した。この洗浄工程を計 2回行った。その後、 145mM NaCl,7.2mM Na H
2
PO ,2.8mM KH PO ,l%(wt./v.) BSA,5%(wt./v.)ラタトース (以下、抗原固相プレート用
4 2 4
ブロッキング液と称す)を 200 L/ゥエルで添加し、 4°C、 12時間の条件化でヒトメガリン 固相化マイクロタイタープレートのゥエル内のブロッキングを行った。 12時間経過後、 4°Cのままで保存状態とした。培養上清中の抗体の反応性を確認する為に、このプロ ッキング完了後のヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートを用いた。上記ヒトメガリ ン固相化マイクロタイタープレートのゥエルへ、ハイプリドーマ培養上清を 100 μ L/ゥ エルでカ卩え、 37°C、 1時間加温した。その後、ゥエルにカ卩えておいた培養上清をデカ ンテーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ PBS-Tを 200 μ L/ ゥエルで添カ卩し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、ゥエル内の洗浄をした 。この洗浄工程を計 3回行った。その後、ゥエルへ Peroxidase- Conjugated Goat Anti- Mouse Immunoglobulins(DAKO社製)を 100 μ L/ゥエル (2000倍希釈： 0.55 μ g/mL)で 加え、 37°C、 1時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には、 145mM NaCl,3.6mM N a HPO ,1.4mM KH PO ,0.05%(v./v.) Tween20,0.5%(wt./v.) BSA (以下、酵素標識抗
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体希釈液と称す)を用いた。その後、ゥエルに加えておいた酵素標識抗体をデカンテ ーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ PBS-Tを 200 L/ゥェ ルで添加し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、ゥエル内の洗浄をした。こ の洗浄工程を計 3回行った。その後、ゥエルへ 3,3，，5,5，-tetramethylbenzidine (以下、 TMBと略す)溶液 (TMB One-Step Substrate System： DAKO社製)をペルォキシダー ゼ酵素反応基質溶液として、 100 L/ゥエルで加え、 25°C、 30分放置した。その後直 ちに、そのゥエル内の基質反応液へ 313mM H SO溶液 (以下、反応停止液と称する）
2 4
を 100 L/ゥエルで添カ卩し、ゥヱル内での酵素反応を停止させた。その後、本ゥエル の吸光度を測定し、 450nmの吸光度から 630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性 評価の指標とした Oosephy P.D. , Mason R.P. et al.(1982) J. Biol. Chem. 257 , 3669 -3675)。尚、 TMBを用いた比色定量の方法は、 1981年に Bos E.S.らが最初の報告を して以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上 に成り立つている (Bos E.S. et al. (1981) J. Immunoassay. 2 , 187-204)。
その結果、固相化したヒトメガリンへ抗ヒトメガリン抗体の強い反応性を示すモノクロ ーナルイ匕ハイプリドーマ細胞を選択し、本培養上清中のィムノグロプリンのクラスとサ ブクラスを Immunoglobulin Typing Kit,Mouse (和光純薬工業社製)を用いて、培養上 清原液 100 しから、各クローン毎に確認した。その結果を基に、得られた単クローン 細胞ライブラリーの中から、 IgGクラスに限定して後述する腹水化へ移行した。
[0085] 次に、これらの細胞を 25mLのフラスコで培養し、更に 75mLのフラスコで培養した。こ の細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。
[0086] (2)抗ヒトメガリン'マウスモノクローナル (IgG)抗体の精製
得られた腹水 (lOmL)と混濁血清処理剤 (FRIGEN (登録商標) II：協和純薬工業社製 )を、腹水 1.5容に対して FRIGEN (登録商標) IIを 1容の比率で混和し、 1〜2分攪拌振 とうすることで、腹水からの脱脂を行った。遠心機で 3000rpm(1930 X g)、 10分間遠心 分離を行い、清澄化された腹水遠心上清 (lOmL)を分取した。この腹水遠心上清 (10m L)に硫安分画処理 (終濃度 50%飽和硫安)を氷浴中で 1時間施し、沈降したィムノグロ ブリン画分を PBSで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計 2回行い、腹水からのィ ムノグロブリン粗画分を得た。得られたィムノグロブリン粗画分 (lOmL)に対して等量の 20mMリン酸ナトリウム， pH7.0(以下、 20mM NaPB,pH7.0と称す)を混合し、プロテイン Gカラム (HiTrap Protein G HP,5mL:Amersham Biosciences社製)を用いてァフィ-テ ィー精製を行った。サンプルをプロテイン Gカラムに吸着後、 20mM NaPB,pH7.0(50m L)をプロテイン Gカラム内に通し、サンプル中の IgG以外の夾雑物を洗浄除去した。そ の後、プロテイン Gカラムにァフィ-ティー吸着した IgGは、 0.1Mグリシン- HCl,pH2.7 で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を 1M Tris(hydroxymethyl)aminometh ane- HCl,pH9.0(以下、 Tris(hydroxymethyl)aminomethaneを Trisと略す)で中和し回収 した。中和後、ァフィユティー精製物に対して 500倍容の PBSで 4°C、 6時間の透析を 行い、本透析は計 2回行った。本透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチュ ーブ (Viskase Companies社製)で行った。そこで得られた IgG溶出画分を、抗ヒトメガリ ンモノクローナル抗体の精製物とし、 4°Cでの保存ならびに後述する操作に用いるこ ととした。尚、本精製には、 BioLogic LPシステム (Bio Rad Laboratories社製)に上述の プロテイン Gカラムを接続し、流速は lmL/minで一貫して行った。
[0087] (3)抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートの作成 精製抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を PBS,pH7.3に終濃度 5 μ g/mLで溶解した。 プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc- Immuno™Module F8 Maxisorp™ Surfa ce plate, Nalge Nunc International社製）のゥエルに、 1ゥエル当たり 100 Lの、上記 抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/ PBS,pH7.3溶液を加え、 4°C、 12時間の条件下で、 抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。 12時間 後、ゥヱルに加えてお 、た抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/ PBS,pH7.3溶液をデカン テーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ、 PBS- Tを 200 L/ ゥエルで添カ卩し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、ゥエル内の吸着過剰 分の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を計 2回行った。その 後、 86mM NaCl,100mM Tris,0.5%(wt./v.) BSA,0.05%(v./v.) Tween20(以下、抗体固 相プレート用ブロッキング液と称す)を 200 /z L/ゥエルで添カ卩し、 4°C、 12時間の条件 化でヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのゥエル内のブロッキングを行った。 1 2時間経過後、 4°Cのままで保存状態とした。
(4)ペルォキシダーゼ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の作成
西洋ヮサビぺノレォキシダーゼ (以下、 HRPと略す) (Peroxidase from horseradish Typ eVI : Sigma社製)を純水に 4mg/mLの濃度で溶かし、この HRP溶液 500 /z L(2mg)に対し て、 lOOmMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液 (100 L)をカ卩えて、 20分間、室温で攪拌し た。これを、該 HRP溶液に対して 500倍容の ImM酢酸ナトリウム ,pH4.0溶液 (以下、 lm M酢酸緩衝液と称す)で 4°C、 6時間の透析を 2回行った。透析操作に用いた透析膜 は透析用セルロースチューブ (Viskase Companies社製)であった。次に、抗ヒトメガリン モノクローナル抗体を、 2.4mM Na CO , 7.6mM NaHCO , pH9.6溶液（以下、 10mM
2 3 3
炭酸緩衝液と称す）に 8mg/mLの濃度で溶カゝした。上述の HRP溶液 500 L(2mg)に、 HRP溶液に対して 1/3倍容の 120mM Na CO , 380mM NaHCO , pH9.6溶液（以下、 0
2 3 3
.5M炭酸緩衝液と称す）を加え、ここに、上述の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体 500 μ L(4mg)を混合し、室温で 2時間攪拌した。その後、 4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウ ム溶液 (50 L)を加え、氷水浴中で 2時間攪拌した。これに対し、硫安分画処理 (終濃 度 50%飽和硫安)を氷浴中で 1時間施し、沈降した画分を lOOmM Tris,145mM NaCl.l %(v./v.)BSA,pH7.6溶液 (以下、標識抗体浮遊液と称す) lmLで懸濁溶解させた。この 硫安分画操作を計 2回行い、標識抗体溶液量に対して 3/4倍容の 2.8mM KH PO ,7.
2 4
2mM Na HPO ,145mM NaCl,l%(wt./v.)BSA,0.02%(v./v.)フエノール， 40%(wt./v.) D—
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ソルビトール溶液 (以下、標識抗体保存液と称す)を加えた。 HRP標識ィ匕抗ヒトメガリ ンモノクローナル抗体を得た。尚、本 HRP標識化の方法は、 1974年に Nakane P.K.と Kawaoi A.が最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の 根幹は確固たる基盤の上に成り立つている (Nakane P.K. , Kawaoi A. (1974) J.Histoc hem.Cytochem. 22 , 1084)。
(5)尿中ヒトメガリンの測定
上述した抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートと、 HRP 標識ィ匕抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて、尿中のヒトメガリンを測定した。先 ず、原尿 90 μ Lと 2Μ Tris,0.2M Ethylenediamine— Ν,Ν,Ν' ,Ν'— tetraacetic acid (以下、 Ethylenediamine- Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraacetic acidを EDTAと略す) ,ρΗ8.0溶液 10 μ Lを混 合し、該混合液 100 Lを抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープ レートのゥエルへカ卩えた。 37°Cで 1時間放置し、その後、ゥエルにカ卩えておいた尿サン プル溶液をデカンテーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ、 PBS-Tを 200 L/ゥエルで添カ卩し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、洗 浄を行った。この洗浄工程を計 3回行った。その後、 HRP標識ィ匕抗ヒトメガリンモノクロ ーナル抗体 (上記調製原液を標識抗体希釈液で 10000倍希釈)溶液を 100 μ L/ゥエル で加えた。 37°Cで 1時間放置し、その後、ゥエルに加えておいた HRP標識ィ匕抗体溶液 をデカンテーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのゥエルへ、 PBS-Tを 2 00 L/ゥエルで添加し、デカンテーシヨンによる PBS-Tの除去を行い、洗浄を行った 。この洗浄工程を計 3回行った。次に、ゥエルへ TMB溶液 (TMB One-Step Substrate System : DAKO社製)をペルォキシダーゼ酵素反応基質溶液として、 100 L/ゥエル で加え、 25°C、 30分放置した。その後直ちに、そのゥエル内の基質反応液へ反応停 止液 100 L/ゥエルで添カ卩し、ゥエル内での酵素反応を停止させた。その後、本ゥェ ルの吸光度を測定し、 450nmの吸光度から 630nmの吸光度を差し引 、た数値を尿中 ヒトメガリン測定評価の指標とした。検量線の標準品としては、抗ヒトメガリンモノクロ一 ナル抗体作出時に免疫用抗原として用いたヒトメガリンを使用し、その検量線結果を 表 1および図 2に記載した。尚、実際の尿中ヒトメガリン測定の臨床結果については、 表 2、図 3および図 4に示した。この結果、健常人に比して、腎疾患患者および腎疾 患予備軍で有意に、尿中へのヒトメガリンの排泄が認められた（図 3および 4)。尚、尿 中へのメガリン排泄量のクレアチニンクリアランスの結果からも、同様の結果が得られ 、尿排泄時の濃縮率の影響ではないことも示された (図 3および 4)。本発明の目的は 、従来法に比較して簡便で所要時間が短ぐ且つ、ヒトメガリンの定量も可能なヒトメガ リンの測定方法を提供することであり、更に、本測定方法を用いることで、細胞'組織' 臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可能とするものであるが、 上述の臨床結果は、これを大きく支持するものである。
[表 1]
Figure imgf000026_0001
[表 2]
項目 尿中クレアチニン 尿中メガリン
酵索; ί ： カラ一
測定法 ELISA
法
O.D.(450nm) クレアチニン
[メガリン]
検体 - O.D.(630nm) クリアランス 検体の背景
No. (nmol Megalin/g
(nM)
(mg/dU Cre)
D-1 117 O.96 0.241 0.513 0.435 糖尿病 D-2 68.16 0.110 0.168 0.246
D- 3 102.53 0.102 0.146 0.142
N-1 178.52 2.472 6.398 3.584
N-2 33.55 0.459 1.088 3.243 賢炎 N-3 41.24 0.161 0.302 0.732
N-4 78.29 0.110 0.168 0.215
N-5 36.97 0.129 0.218 0.590 メタボリック M-1 302.32 0.169 0.323 0.10フ
BE候群 M-2 59.56 0.086 0.104 0.175
H-1 44.1 0.061 0.038 0.086
H-2 92.72 0.082 0.094 0.101
H-3 134.72 0.056 0.025 0.019 健 «人
H-4 123.59 0.063 0.044 0.036
H-5 104.31 0.052 0.015 0.014
H-6 96.64 0.050 0.009 0.009 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参 として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよびヒトメガリンに結合 性を有する第 2のリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、固 相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体を反応させ、かつヒト メガリンに結合性を有する第 2のリガンドと検体とを反応させ、検体中のヒトメガリンとヒ トメガリンに結合性を有するリガンドとの複合体形成により固相に結合したヒトメガリン に結合性を有する第 2のリガンドを測定することを含む検体中のヒトメガリンを測定す る方法。
[2] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体との反応の後にヒ トメガリンに結合性を有する第 2のリガンドと検体との反応を行わせる、 2ステップから なる、請求項 1記載の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[3] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドと検体との反応とヒトメガ リンに結合性を有する第 2のリガンドと検体との反応を同時に行わせる、 1ステップか らなる、請求項 1記載の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[4] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第 2 のリガンドが共に抗体である請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の検体中のヒトメガリ ンを測定する方法。
[5] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチン であり、ヒトメガリンに結合性を有する第 2のリガンドが抗体である請求項 1〜3のいず れカ 1項に記載の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[6] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドが抗体であり、ヒトメガリンに結合性を有 する第 2のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンである請求項 1〜3のいず れカ 1項に記載の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[7] ヒトメガリンに結合性を有する第 1のリガンドおよび Zまたはヒトメガリンに結合性を有 する第 2のリガンドがトランスコバラミンビタミン B (Transcobalamin- vitamin B )、ビタ
12 12 ミン D結合タンパク質（Vitamin-D-binding protein)もしくはレチノール結合タンパク質 (Retinol- binding protein)であるビタミン結合性タンパク質（Vitamin- binding proteins) ；ァポリポプ口ティン B (Apolipoprotein B)、アポリポプロテイン E (Apolipoprotein E)、 アポリポプロテイン J/クラステリン（ApolipoproteinJ/clusterin)もしくはァポリポプロティ ン H (Apolipoprotein H)であるリポプロテイン；副甲状腺ホルモン (PTH)、インスリン、 上皮細胞成長因子 (EGF)、プロラタチン、レプチンもしくはサイログロブリンまたはこれ らの受容体であるホルモンまたはそれらのホルモンの受容体;ィムノグロブリン軽鎖、 PAP-1もしくは β -マイクログロブリンである免疫およびストレス応答関連タンパク質; Ρ
2
ΑΙ-Ι、 ΡΑΙ-Ι-ゥロキナーゼ、 PAI-I-tPA、プロゥロキナーゼ、リポプロテインリパーゼ、 プラスミノーゲン、 α -アミラーゼ、 j8 -アミラーゼ、 0L -マイクログロブリンもしくはリゾチ
1
ームまたはこれらのインヒビターである酵素またはそれらの酵素のインヒビター；ァミノ グリコシド、ポリミキシン B、ァプロチュン（Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Trichosanti n)である薬剤または毒物；アルブミン、ラタトフヱリン、ヘモグロビン、匂い物質結合タ ンパク質（Odorant- binding protein) ,トランスサイレチンもしくは L-FABPであるキヤリ ァタンパク質；ならびにチトクローム- c、カルシウム (Ca2+)、後期糖化生成物（advance d glycation end products(AGE))、キュビリンもしくは Na+- HT交換輸送体ァイソフォー ム（Na+-H+exchanger isoform 3(NHE3))である受容体関連タンパク質 (RAP)、からな る群力 選択される物質またはその結合性断片である請求項 1〜6のいずれか 1項に 記載の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[8] 固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合 性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体とヒト メガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前記固相に結合 したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドを測 定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少率に基づいて、 検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[9] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である請求項 8記載の検 体中のヒトメガリンを測定する方法。
[10] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用 、て検体中のヒトメガリンを測定する方法 であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応させ、 凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づ 、てヒトメガリンを測定するヒト メガリンを測定する方法。
[11] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体であり、凝集反応が免疫 凝集反応である、請求項 10記載のヒトメガリンを測定する方法。
[12] 請求項 1〜： L 1のいずれか 1項に記載の方法によりヒトメガリンを測定することによりメ ガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出する方法。
[13] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項 12記載の臓器の疾 患を検出する方法。
[14] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項 12記載の臓器の疾 患を検出する方法。
[15] 腎疾患が尿細管障害である、請求項 14記載の腎臓疾患を検出する方法。
[16] 検体が尿である、請求項 14または 15に記載の方法。
[17] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを含む、メガリンの発現が認められる臓器の疾 患を検出するためのキット。
[18] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である、請求項 17記載の メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[19] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項 18記載のメガリンの 発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[20] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項 18記載のメガリンの 発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[21] 腎疾患が尿細管障害である、請求項 20記載の腎疾患を検出するためのキット。
[22] ヒトメガリンカもなる、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための診断 用マーカー。
[23] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項 22記載の疾患検出 用マーカー。
[24] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項 22記載の疾患検出 用マーカー。
[25] 腎疾患が尿細管障害である、請求項 24記載の疾患検出用マーカー。
[26] ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出 用マーカーとしての使用。
[27] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である、請求項 26記載のヒトメガリ ンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[28] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である、請求項 26記載のヒトメガリ ンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[29] 腎疾患が尿細管障害である、請求項 28記載のヒトメガリンの疾患検出用マーカーと しての使用。
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