WO2007114454A1

WO2007114454A1 - ペプチドのチオエステル化合物の製造方法

Info

Publication number: WO2007114454A1
Application number: PCT/JP2007/057508
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Kajihara; Naoki Yamamoto; Yuri Nambu; Kazuhiro Fukae; Hiroaki Asai
Original assignee: Otsuka Chemical Co., Ltd.
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2007-10-11
Also published as: DK2000474T3; KR20090007709A; CN101437836B; EP2000474A4; JPWO2007114454A1; US8058394B2; EP2000474A1; KR101462454B1; TWI353989B; TWI450905B; CN101437836A; SG170022A1; TW201109347A; CA2647867A1; US20090137780A1; JP5328345B2; AU2007232742A1; AU2007232742B2; EP2000474B1; TW200806686A

Abstract

(A)式(1)で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、(B)希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも1種の酸で固相とペプチドとの結合を切断して、C末端にカルポキシル基を有するペプチドを製造し、(C)溶媒中、縮合剤の存在下、チオール化合物を-100～0℃で反応させることを特徴とするペプチドのチオエステル化合物の製造方法。(1)[式中、R1はC1-4アルキル基を示し、R2は水素原子、C1-4アルコキシ基を示す。nは1～4の整数を示す。]

Description

明細書ぺプチドのチォエステル化合物の製造方法技術分野

本発明は、ぺプチドのチォエステル化合物の製造方法に関する。背景技術

生体内に存在するタンパク質の多くは、糖鎖を有する糖タンパク質である。糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の 3次元構造の維持や溶解性の調節、プロテアーゼ耐性の付加などの働きを担っている。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。このように、タンパク質に結合した糖鎖は様々な生理機能に重要な役割を果たしている。しかし、これら糖鎖の構造は多様で、その種類は膨大であるため、どの構造の糖鎖が生命現象に関与しているかを特定するのはきわめて困難な状況である。こういった機能の解明のためにも、単一構造の糖鎖を持った糖タンパク質、糖ペプチドの合成が必要不可欠である。現在のところ、生物学的手法ではタンパク質発現を用いて糖タンパク質を発現させることは可能であるが、均一な構造の糖鎖を持った糖タンパク質を得ることは難しい。そのため、近年では単一構造の糖鎖を有する糖ペプチド、糖タンパク質を化学的に精密合成することが検討されている。

本発明者等は、原料となりうる 2分岐複合型糖鎖を鶏卵より酵素法と化学法を組み合わせることで大量に調製する方法（特許文献 1 ) 、また複合型糖鎖をぺプチドの固相合成法を応用することで、シァリル糖鎖ペプチドを合成する方法（特許文献 2 ) を確立した。糖ペプチドを高分子化することができれば、単一構造の糖鎖を持つ大型の糖タンパク質の合成を行うことが可能となる。ペプチドを高分子化する方法としては、現在のところ N末端のアミノ酸がシスティン（Cys) のべプチドフラグメントと C末端にチォエステルを持つぺプチドをカップリングさせる N a t i V e c hemi c a l l i g a t i on法 (非特許文献 1) が最も有効であると考えられている。

ぺプチドの合成方法としては、不溶性樹脂担体に N末端が保護されたアミノ酸を固定化し、ァミノ酸の保護基を脱保護した後に順次べプチド鎖を伸長させていく固相合成法が一般的に用いられる。 C末端にチォエステルを持つペプチドを製造する方法としては、固相からペプチドを切り出す際にチォエステル化を行う方法、固相からペプチドを切り出した後にペプチドの C末端力ルポキシル基をチォエステル化する方法等が挙げられる。

固相からペプチドを切り出す際にチォエステル化する方法としては、例えば固相樹脂に S a f e t y Ca t c h L i n k e rを用いてペプチドを製造し、チオール化合物を作用させる方法が知られている（非特許文献 1、 2) 。しかしながら、 1つ目のアミノ酸を樹脂へ固定化する際の縮合効率が悪い点や、その縮合時にアミノ酸が僅かにラセミ化する点、チオール化合物によるエステル化の反応性が劣るなど多くの問題を有している。また、糖ペプチドの糖鎖水酸基が保護されていない場合には、 S a f e t y C a t c h L i nke rの活性化のために行われるアルキル化は、容易に糖水酸基をもアルキル化することになり、脱アルキル化の処理を行わなければならず、条件によっては糖鎖結合等に影響し、得られる糖ペプチドの均一な糖鎖構造を確保することができない。これを解消するために、予め糖鎖水酸基を保護することが提案されているが、保護、脱保護の工程を増加することになり、効率的な方法とは言えない。

固相樹脂からペプチドを切り出す場合、通常、 95%トリフルォロ酢酸ゃフッ化水素等の強酸を使用する。しかし、このような強酸の使用はペプチド側鎖の脱保護や糖ペプチドの糖鎖結合の切断を伴う。そのため弱酸を使用して脱保護しないように固相樹脂からペプチドを切り出す方法として、トリチル樹脂を固相とし、切り出しに酢酸を使用する方法（非特許文献 3, 4, 5) や 4ーヒドロキシメチルー 3—メトキシフエノキシ酪酸で修飾した樹脂（HMPBレジン）を固相とし、切り出しに 1%トリフルォロ酢酸（TFA) を使用する方法が報告されている

(非特許文献 6) 。しかしながら、トリチル樹脂を用いた方法では、水酸基を保護していない糖ペプチドを製造することができない。一方、 HMPBレジンを固相として使用して、糖ペプチドを作製した場合には 1%TFAでは切り出すことができず、 10%TFAを使用した場合には、ペプチド側鎖の保護基も一部脱保護される。ペプチドのチォエステル化を行なう場合には、特に N末端システィンのチオール基の保護が自己縮合を防止するために必須であるが、切り出し時の脱保護は次反応に致命的な結果を招くことになる。よって、これら方法は C末端にチォエステルを持つペプチドの製造原料となる力ルポキシル基を有するペプチドの製造方法として十分な方法とはいえない。

ぺプチドのチォエステル体は、側鎖が保護されたべプチドをアルキルチオールと反応させることで製造することができるが、 C末端のアミノ酸がラセミ化する問題がある。ラセミ化を避けるため、 C末端のアミノ酸をグリシンに置き換える方法（非特許文献 7) 、ジクロロメタン（DCM) 中、縮合剤としてべンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリスピロリジノホスホニゥムへキサフルォロホスフェート（PyBOP) Zジイソプロピルェチルァミン（D I PEA) を使用する方法（非特許文献 8) 、テトラヒドロフラン（THF) 中、縮合剤として 2 _ (1H_ベンゾトリァゾールー 1一ィル） —1, 1， 3, 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフエ一ト（HBTU) ZD I PEAを使用する方法 (非特許文献 9) が報告されている。しかし、 C末端アミノ酸をグリシンとする方法には、製造するペプチドが自ずと制限される。また、保護基で保護されていない水酸基を有する糖ペプチドを D CMや THFのような溶媒に溶解させることができずに溶媒の変更を余儀なくされるが、 C末端アミノ酸のラセミ化問題が再び生じてしまう。

【特許文献 1】 WO 03/008431号公報

【特許文献 2】 WO 2004/005330号公報【非特許文献 1】 J . Am. Chem. S o c. ， 121, 11369 - 11374 (1999)

【非特許文献 2】 An g ew. Ch em. I n t. Ed. , 44, 165 0 - 1654 (2005)

【非特許文献 3】 Te t r ahe d r on Le t t. , 38, 6237

- 6240 (1997)

【非特許文献 4】 Te t r ahe d r on Le t t. , 44, 3551

- 3554 (2003)

【非特許文献 5】 J . Am. Chem. S o c. , 123, 3885-3 891 (2001)

【非特許文献 6】 Te t r ahe do r on, 49, 9307-9320 (1993)

【非特許文献 7】 Te t r ahe d r on Le t t. , 38, 6237 -6240 (1997)

【非特許文献 8】 Te t r ahe d r on Le t t. , 44, 3551

- 3554 (2003)

【非特許文献 9】 J . Am. Chem. S o c. ， 123, 3885-3 891 (2001)

本発明の目的は、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドであっても適用可能な、ペプチド側鎖の保護基が維持された C末端にカルボキシル基を有するペプチドの製造方法を提供することにある。

本発明の目的は、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖ペプチドであっても適用可能な、ラセミ体の生成を抑制したぺプチドのチォエステル化合物の効率的な製造方法を提供することにある。発明の開示

本発明は以下の発明に係る。

(A) 式（1 ) で表されるリンカ一で修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でぺプチドを形成させ、

(B) 希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも 1種の酸で固相とべプチドとの結合を切断して、 C末端に力ルポキシル基を有するぺプチドを製造し、

(C) 溶媒中、縮合剤の存在下、チオール化合物を一 1 0 0〜0 °Cで反応させることを特徴とするペプチドのチォエステル化合物の製造方法。

[式中、 R ¹は一 ₄アルキル基を示し、 R ²は水素原子、 C i _ ₄アルコキシ基を示す。 nは 1〜4の整数を示す。 ]

本発明者等は、特定の固相樹脂を使用し、特定条件で生成したペプチドを該固相樹脂から切り出すことで、糖鎖構造に影響せず、側鎖保護基を維持した C末端に力ルポキシル基を有するぺプチドを製造できることを見出した。

更に得られたペプチドの C末端力ルポキシル基にチオール化合物を特定の縮合剤の存在下、低温で作用させることでべプチドの C末端のラセミ化が抑制されたぺプチドのチォエステル化合物を製造できることを見出した。

本発明のペプチドのチォエステル化合物の製造方法は、（A) 式（1 ) で表されるリンカーで修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、（B) 希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも 1種の酸で固相とペプチドとの結合を切断して、 C末端に力ルポキシル基を有するぺプチドを製造し、（C) 溶媒中縮合剤の存在下チオール化合物を一 1 0 0〜0 ^で反応させる工程からなる。工程（A) ：ペプチドの形成

本工程においては、式（1) で表されるリンカ一で修飾された樹脂（レジン）を使用する。

[式中、 R¹は ₄アルキル基を示し、 R²は水素原子、アルコキシ基を示す。 nは 1〜4の整数を示す。 ]

₄アルキル基としては、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、イソブチル基、 s e c一ブチル基、 t e r t—プチル基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数 1から 4のアルキル基を示す。

Ci-₄アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、イソブトキシ基、 s e c—ブトキシ基、 t e r t—ブトキシ基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数 1から 4のアルコキシ基を示す。

式（1) で表されるリンカ一で修飾された樹脂は、市販されているものや従来公知の樹脂であってもよく、例えば HMPB— BHA樹脂 (4ーヒドロキシメチル— 3—メトキシフエノキシ酪酸一ベンズヒドリルァミン）、 HMPB— MBH A樹脂（4ーヒドロキシメチルー 3—メトキシフエノキシ酪酸一メチルベンズヒドリルァミン）等が挙げられるが、糖ペプチドの製造においては、 Ami no— P EGAレジン（ノババイオケム社製）のァミノ基と式（2) で表される力ルポン酸化合物のカルボキシル基とを、従来公知のアミド化反応に従い、脱水縮合剤の存在下で反応させることによって得られた膨潤性に優れた樹脂を用いることができる。ここで PEGAレジンとはビスアクリルアミドプロブー 1—ィルポリエチレングリコールを示す。

[式中、 R¹, R²及び nは前記に同じ。 ]

得られる式（1) で表されるリンカ一を有する樹脂の中でも、 R¹がメチル基、 R²が水素原子、アルキル基である樹脂が好ましく、更には R¹がメチル基、 R²が水素原子、 — ₄アルキル基、 nが 2〜4である樹脂が好ましく、 R¹がメチル基、 R²が水素原子、 — 4アルキル基、 nが 3である樹脂が特に好ましい。具体的には、例えば式（3) で表される樹脂が特に好ましい。

[式中、 R²は前記に同じ。 ]

上記の式（1) で表されるリンカ一で修飾された樹脂を固相として用いてぺプチドを製造する。

例えば、以下の（a) 〜（e) の工程が挙げられる。

(a) 式（1) で表されるリンカ一で修飾された樹脂の式（1) で表されるリンカ一部の水酸基と、保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸の力ルポキシル基をエステル化反応させ、

(b) ァミノ基の保護基を脱保護して、保護されていないアミノ基を形成させ、

(c) この保護されていないァミノ基と、ァミノ基が保護されたアミノ酸の力ルポキシル基とをアミド化反応させ、

(d) 上記保護基を脱保護して、保護されていないアミノ基を形成させ、

(e) 上記（c) 及び（d) の工程を 1回以上繰り返してペプチドを形成する _c アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えばセリン（S e r) 、ァスパラギン（As n) 、パリン（Va l) 、ロイシン（Leu) 、イソロイシン（I 1 e) 、ァラニン (A 1 a) 、チロシン (Ty r) 、グリシン (G 1 y) 、リジン（L y s ) 、アルギニン（A r g) 、ヒスチジン（H i s) 、ァスパラギン酸（As p) 、グルタミン酸（G 1 u) 、グルタミン（G 1 n) 、スレオニン（Th r) 、システィン (Cy s) 、メチォニン（Me t) 、フエニルァラニン（Phe) 、トリブトファン（Tr p) 、プロリン（P r o) を挙げることができる。

保護基としては、例えば 9一フルォレニルメトキシカルポニル（Fmo c) 基や t—プチルォキシカルポニル（Bo c) 基、ァリルォキシカーボネート (A 1 1 o c) 基等のカーボネート含有基、ァセチル（Ac) 基等のァシル基、ァリル基、ベンジル基等の保護基等を挙げることができる。保護基を導入するには、例えば Fmo c基を導入する場合には 9一フルォレニルメチルー N—スクシニミジルカーポネートと炭酸水素ナトリゥムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は 0〜50°C、好ましくは室温で、約 1〜5時間程度行うのが良い。

脂溶性保護基でアミノ基を保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸のアミノ基に上記の方法又は公知の方法で脂溶性保護基を導入することで製造することができ、市販のものも使用することができる。例えば、 Fmo c基でアミノ基を保護したアミノ酸としては Fmo c一 S e r、 Fmo c一 A s n、 Fmo c -V a 1、 Fmo c — L e u、 Fmo c一 I 1 e、 Fmo c一 A I a、 Fmo c一 T y r、 Fmo c — G 1 y、 Fmo c - L y s , Fmo c一 A r g、 Fmo c一 H i s、 Fmo c — As p, Fmo c — G 1 u、 Fmo c一 G 1 n、 Fmo c一 T h r、 Fmo c — Cy s, Fmo c -Me t、 Fmo c -Phe, Fmo c一 T r p、 Fmo c — P r oを挙げることができる。

最後に導入するアミノ酸としてシスティン（Cy s) を選択すれば、 N末端にシスティンを有するペプチドを製造することができ、 Na t i ve Chemi c a 1 L i g a t i o nにおいてぺプチドのチオールエステル化合物と力ップリングさせるフラグメントとして使用することができる。

アミノ酸に糖鎖が結合した糖鎖ァミノ酸を使用することにより、糖鎖アミノ酸をべプチド鎖の任意の位置に導入した糖べプチドを製造することができる。使用する糖鎖アミノ酸としては、任意の数の糖残基を有するものであれば特に制限されず、マンノースを多く含む高マンノース、糖鎖の非還元末端にシアル酸やガラクトース残基を有する複合型糖鎖（F i g u r e 1 ) 、高マンノース構造と複合型糖鎖が混ざった混成型糖鎖、ァスパラギンの側鎖のアミド基と Nグリコシル化された N結合型糖鎖、セリン、スレオニンの側鎖のアルコールがグリコシル化された〇結合型糖鎖等を挙げることができる。具体的には、 WO 0 3 / 0 0 8 4 3 1号公報に記載の糖鎖ァスパラギンを挙げることができる。中でもジシァ口糖鎖ァスパラギン又はモノシァロ糖鎖ァスパラギンが好ましく、例えば、式

( 4 ) で表される該シアル酸の力ルポキシル基がベンジル基等の保護基により保護された糖鎖が特に好ましい。このようなジシァ口糖鎖ァスパラギンもしくはモノシァ口糖鎖ァスパラギンが結合した糖ペプチドは好ましい糖ペプチドである。

樹脂のリンカ一部の水酸基と、上記保護されたアミノ基を有するアミノ酸の力ルポキシル基とのエステル化反応は、例えば 1一メシチレンスルホニルー 3—二トロー 1, 2, 4一卜リアゾール (MSNT) 、 DCC、ジイソプロピルカルポジイミド（D I PCD I) 等の脱水縮合剤を用いて行うことができ、例えば固相力ラムにレジンを入れ、溶媒で洗浄し、その後アミノ酸の溶媒溶液を加えることにより行うのが好ましい。

洗浄用溶媒としては、例えば DMF、 2—プロパノール、 DCM等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えば DMSO、 DMF、 DC M等を挙げることができる。反応は 0〜50°C、好ましくは室温で、約 10分〜 30時間程度、好ましくは 15分〜 24時間程度行うのが良い。

この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてァセチル化しキヤッピングすることも可能である。

アミノ基の保護基の脱保護は、酸又は塩基で処理することにより行うことができ、例えば保護基が Fmo c基である場合、ピぺリジン、モルホリン等の塩基を使用することができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましく、例えば DMS 0、 DMF、メタノール等を挙げることができる。

保護されていないァミノ基と、ァミノ基が保護された任意のアミノ酸の力ルポキシル基とをアミド化する反応は、活性化剤および溶媒の存在下で行うのが好ましい。

活性化剤としては、例えば、ジシクロへキシルカルポジイミド（ D C C ) 、 1 一ェチル—3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド，塩酸塩（WS C/HC 1) 、ジフエニルホスホリルアジド（DPPA) 、力ルポニルジイミダゾール（CD I) 、ジェチルシアノホスホネート（DEPC) 、ジイソプロピルカルポジイミド（D I PC I) 、ベンゾトリアゾール— 1—ィルォキシートリスピロリジノホスホニゥムへキサフルォロホスフェート（PyBOP) 、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（HOB t) 、ヒドロキシスクシンイミド（HOS u) 、ジメチルァミノピリジン（DMAP) 、 1—ヒドロキシー 7—ァザベンゾトリァゾ一ル (HOA t) 、ヒドロキシフ夕ルイミド (HOP h t) 、ペンタフルオロフェノール（P f p—OH) 、 2— (1H—べンゾトリアゾール一 1—ィル）一 1， 1， 3， 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート (HBTU) 、 O— (7—ァザべンゾトリアゾ一ル— 1一ィル） —1, 1， 3， 3 —テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスホネート（HATU) 、 0—べンゾトリアゾ一ル _ 1一ィル— 1， 1, 3, 3—テトラメチルゥロニゥムテトラフルォロボレ一ト (TBTU) 、 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロジ一 4一ォキサ一 1, 2, 3—ベンゾトリアジン（Dhb t) 等を挙げることができる。

溶媒としては例えばジメチルスルホキシド (DMSO) 、 N, N—ジメチルホルムアミド（DMF) 、ジクロロメタン (DCM) 等を挙げることができる。活性化剤の使用量は、式（2) で表されるカルボン酸化合物に対して、 0. 1 〜20当量、好ましくは 0. 5〜10当量、さらに好ましくは、 0.8〜5当量とするのが好ましい。反応は溶媒中で行うことができ、 0〜50 、好ましくは室温で、約 10〜30時間程度、好ましくは 15分〜 24時間程度行うのが良い。また、固相合成用カラム中で反応を行うことによって、そのまま後の固相合成に使用することができ、好ましい。

保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。

工程（B) ：ペプチドの切り出し

樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。使用する酸としては、希塩酸、希硫酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸等のカルボン酸類を挙げることができる。希塩酸又は希硫酸としては、 0.01〜2規定程度、好ましくは 0.05〜1規定程度の塩酸又は硫酸の水溶液が挙げられる。これらの酸の中でも酢酸が好ましい。酸の使用量の使用量としては、ペプチド 1当量に対して 1当量以上であれば特に制限されず、例えば、 1〜 10000当量程度、好ましくは 10〜1000当量程度とすればよい。

本反応はアルコール存在下で行うのが好ましく、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、トリフルォロエタノール（TFE) 、トリクロロエタノール等のハロゲノアルコールが挙げられる。これらのアルコールの中でも、メタノール、トリフルォロエタノール力 S好ましく、トリフルォロェ夕ノールが特に好ましい。アルコールの使用割合は、酸 1容量に対してアルコールを 0. 1〜2容量、好ましくは 0. 5〜1. 5容量、更に好ましくは 0.8〜1. 2 容量とすればよい。

また、本反応は必要に応じて、 DCM、 DMF、 DMSO等の有機溶媒を使用してもよい。

溶媒の使用量は特に制限されず、酸 1容量に対して 0. 1〜100容量程度とすればよい。

反応は 0〜50°C、好ましくは室温で、約 1〜30時間程度行うのがよい。

以上のようにして、 C末端に力ルポキシル基を有するぺプチドを得ることができる。

工程（C) ：ペプチドのチォエステル化合物の製造

得られたペプチド（原料ペプチド）を溶媒中で縮合剤の存在下チオール化合物を作用させることで C末端がチォエステルであるべプチドを製造することができる。チオール化合物としては、フエ二ル環上任意の位置に、任意の数のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、メチル基、ェチル基等の炭素数 1〜4の低級アルキル基、メトキシ基、エトキシ基等の炭素数 1〜4のアルコキシ基、二トロ基等の置換基を有していてもよいべンジルメルカブタン類、メタンチオール、エタンチオール等の低級アル力ンチオール類等を挙げることができる。これらのチオール化合物の中でもベンジルメル力プ夕ンが特に好ましい。

チオール化合物の使用量としては、原料ペプチド 1当量に対して 1〜100当量、好ましくは 10〜80当量、更に好ましくは 20〜 50当量とすればよい。特に、ペプチドの C末端のラセミ化を抑制するためには、大過剰の量を使用するのが好ましく、 30当量程度以上とするのが好ましい。

使用する溶媒としては、例えば THF、 DCM、 DMSO, DMF等が挙げられるが、これらの中でも DMFが好ましい。

縮合剤としては、 HOB t/D I PC I又は PyBOP/D I PEA等を挙げることができ、 PyBOPZD I PEAが好ましい。 HOB t/D I PC Iの使用割合は HOB t 1当量に対して D I PC Iを 0. 1〜10当量、好ましくは 0. 5〜5当量、更に好ましくは 0. 8〜1.2当量とすればよい。

PyBOP/D I PEAの使用割合は P y BOP 1当量に対して D I PEAを 0. 1-10当量、好ましくは 0. 5〜5当量、更に好ましくは 0. 8〜 1. 2当量とすればよい。

HOB tの使用割合は、原料ペプチド 1当量に対して、 1〜20当量、好ましくは 3〜15当量、更に好ましくは 8〜12当量とすればよい。

PyBOPの使用割合は、原料ペプチド 1当量に対して、 1〜10当量、好ましくは 2〜 8当量、更に好ましくは 3 ~ 6当量とすればよい。

本反応においては、モレキュラーシーブ等の脱水剤を使用するのが好ましい。ペプチドのラセミ化は原料べプチドの C末端力ルポン酸が活性化された時点で生じる。そのため、反応は、原料ペプチドとチオール化合物とを混合した後、縮合剤を加えて行うことが好ましい。反応温度は— 100〜0°C、好ましくは—80 〜一 10 °Cとすればよく、 30分〜 2時間程度行えばよい。

本発明においては得られるペプチドのラセミ体の割合が抑制され、通常ラセミ体の割合は 6%以下、好ましくは 4%以下、更に好ましくは 2%以下、特に好ましくは 0〜1%である。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。

使用する Fmo c化されたアミノ酸は、公知のものであり、市販品かアミノ酸に Fmo c基を導入することで容易に調製できる。

また、 Fmo c— A l a、 Fmo c— As n、 Fmo c— G l y、 Fmo c— Leu、 Fmo c—Me t , Fmo c— Phe、 Fmo c— P r o、 Fmo c— Va 1は各アミノ酸のァミノ基が Fmo c基で保護されていることを意味する。 Bo c— Cy s (A cm) はシスティンのァミノ基が B o c基で、及びチオールがァセトアミドメチル基で保護されていることを意味する。 Fmo c -Ar g

(Pb f) は、アルギニンの位ァミノ基が Fmo c基で保護された N^G— (2, 2, 4, 6, 7—ペンタメチルジヒドロべンゾフラン一 5—スルホニル）アルギニンを意味する。 Fmo c— As p (O t Bu) 及び Fmo c— G l u (O t B u) は各アミノ酸のァミノ基が Fmo c基で保護され、ァスパラギン酸 ;6位及び. グルタミン酸ァ位の力ルポキシル基が t e r t—プチル基で保護されていることを意味する。 Fmo c—Cy s (t r t) は、システィンのァミノ基が Fmo c 基で、及びチオールがトリチル基で保護されていることを意味する。 Fmo c— Ly s (Bo c) は、リジンの ο;位ァミノ基が Fmo c基で、及び ε位ァミノ基が B o c基で保護されていることを意味する。 Fmo c— S e r (t Bu)、 F m o c - T y r ( t B u) 及び Fmo c— Th r ( t B u) は、各アミノ酸のァミノ基が Fmo c基で、及び水酸基がトリチル基で保護されていることを意味する。 Bo c_Leu及び（Bo c) Leuは、ロイシンのァミノ基が B o c基で保護されていることを意味する。（Bo c) Ly s (Bo c) は、リジンの位及び ε位ァミノ基が Bo c基で保護されていることを意味し、 Ly s (Bo c) はリジンの ε位ァミノ基が B o c基で保護されていることを意味する。 Bo c— Cy s (Th z) は N— t— Bo c— 1, 3 -チアゾリジン _ 4—力ルポン酸を意味する。 Th r (t Bu)、 Ty r (t Bu) 及び S e r (t Bu) は各アミノ酸の水酸基が t e r t一ブチル基で保護されていることを意味する。 H i s

(t r t) はイミダゾ一ル窒素が、 Cys (t r t) はシスティンのチオール基が、及び G l n (t r t) はグルタミンのアミド窒素がトリチル基で保護されていることを意味する。 As p (0 t Bu) 及び G 1 u (〇 t Bu) は、ァスパラギン酸; S位及びグルタミン酸ァ位の力ルポキシル基が t e r t一ブチル基で保護されていることを意味する。 Cys (Thz) は 1， 3—チアゾリジン一 4—力ルポニルを意味する。 Ar g (Pb f) は、 N^G— (2， 2 4, 6, 7一ペンタメチルジヒドロべンゾフラン一 5—スルホニル）アルギニンを意味する。これらの保護基の導入は従来公知の方法か、保護基が導入された市販品を使用することができる。また、 Phはフエ二ル基を示し、 Bnはベンジル基を示す。ェ11一 NMRは B r u k e rの AVANCE 400 (400MHzと表記）で測定した。

E S I ma s s測定器は B r uke r Da l t on i c s社製の E s q u i r e 3000 1 13を、 ¥八 01 m a s s測定器は B r u k e r D a 1 t on i c s社製の Au t o f 1 exをマトリックスには d i hy d r o x yb e nz o i c a c i dを用レた。

実施例 1

固相合成用カラムに Am i n o— PEGA r e s i n (1 g, 50 m o 1) を入れ、 DCM、 DMFで十分に洗浄した後、 DMFで十分に膨潤させた。 4—ヒドロキシメチル一 3—メトキシフエノキシ酪酸（HMPB) (30. lmg, 0. 13mmo 1)、 TBTU (40. lmg, 0. 13mmo 1 )、 N—ェチルモルホリン（15. 8 1， 0. 13mmo 1 ) を DMF (lml) に溶解させて力ラムに入れ、室温で 2時間攪拌した。樹脂を DMF及び D CMで十分に洗浄し、 HMPB-PEGA r e s i nを得、固相合成の固相として用いた。

Fmo c—Phe (96.8mg, 0.25 mm o 1 ) と MSNT (74mg, 0.25 mm o 1 )、 N—メチルイミダゾ一ル ( 15 i 1 , 0. 19 mm ο 1 ) を DCM (lml) に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、室温で 2時間攪拌した。攪拌後、樹脂を DCM、 DMFを用いて洗浄した。 Fmo c基を 20分 2 0%ピぺリジンZDMF溶液（lml) を用いて脱保護した。 DM Fで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。

Fmo c基でアミノ基を保護したアミノ酸と HOB t (33. 8mg， 0.25 mmo l)、 D I PC I (38^ 1 , 0.25mmo 1 ) を DMF (lml) に溶解させ 15分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で 1時間半攪拌した後、 Fmo c基を 20分 20%ピぺリジン ZDMF溶液（lml) を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。

Fmo c基でアミノ基を保護したアミノ酸には、 Fmo c— Ty r (t Bu) (1 14. 9mg, 0. 25 mm o 1 ) , Fmo c— As n (88. 6mg, 0. 2 5 mm o l)、 Fmo c— A 1 (77. 8mg, 0. 25 mm o 1 )、 Fmo c— H i s (t r t) (154. 9mg, 0. 25mmo l)、 Fmo c— S e r (t B u) (95. 9mg, 0. 25 mm o 1 ) , Fmo c— As p (O t B u) (102. 9 m g， 0. 25 mm o l)、 Fmo c— L e u (88.4mg, 0. 25 mm o 1)、 Fmo c— Va l (84. 9mg, 0. 25 mm o 1 ) を用い、固相樹脂に Phe— Ty r ( t B u) -Ty r ( t B u) —As n— A l a— H i s (t r t) -S e r ( t B u) —H i s (t r t) 一 As p (O t B u) 一 L e u— A s n -Ty r ( t B u) -L e u-Ph e -Phe-S e r ( t B u) —Va l — S e r (t Bu) 一 A s nの 19残基ペプチドを形成させた。

D CM及び DMFを用いて洗浄した後、 19残基のペプチド 2 mo 1相当の樹脂をエツペンチユーブに移した。

下記式（5) で表される糖鎖ァスパラギンのジベンジル体（10mg， 3. 6 mo 1 ) と DEPBT (2mg, 6 o 1 ) を DMF (0. 12ml) に溶解させ、エツペンチューブに入れた。

D I PEA (0. 68 ^ 1 , 4 ΠΙΟ 1) を加えて室温で 18時間攪拌した。 DMFで洗浄した後に、 20 %ピぺリジンを用いて Fmo c基を脱保護して、固相樹脂に P h e -Ty r (t Bu) -Ty r (t Bu) -As n-A l a-H i s ( t r t ) -S e r (t Bu) 一 H i s ( t r t) -As p (O t B u) -L e u-As n-Ty r ( t B u) -Le u-Phe-Phe-S e r ( t B u) - V a 1 - S e r ( t B u) — As n— As n (O l i go s a c c h a r i d e c ha i n) の 20残基べプチド（ 6 ) を形成させた。

実施例 2

実施例 1で得られた 20残基べプチドを形成した樹脂を一部固相合成用力ラムにとり、酢酸： D CM：メタノール（=5 ： 4 ： 1) を樹脂が十分に浸る程度に加え、 3時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を HPLC (C ad e n z a c o l umn C I 8 75 X 4. 6mm 展開溶媒 A : 0. 1 %T F A水溶液 B : 0. 1%TFA ァセト二トリル：水 = 90 : 10 グラジェント A： B = 60 ： 40→ 0 ： 100 1 5分流速 0. 1 m 1 Zm i n ) で精製し、 20残基のぺプチド（ 7 ) を得た。得られたペプチドは C末端に力ルポキシル基を有し、側鎖保護基が維持されたものであった。

ES I— MS : Ca l c d f o r C ₂₇₉ H₃₈₂ N₃₄0₉₄：

[M+3H] ³⁺ 1906.3, f ound. 1905. 8

実施例 3

実施例 2で使用した酢酸： DCM：メタノール及び反応時間を酢酸： TFE DMC (=2 : 2 : 6) で 2時間、又は酢酸： TFE (= 1 ： 1) で 27時間に変更して反応させた。

どちらも 20残基のペプチド（7) を得ることができた。

ただし、酢酸： TFE： DMCでの条件は、酢酸： DCM：メタノールの条件に比較して約 5倍、更に酢酸： TFEでの条件は酢酸： DCM：メタノールの条件に比較して約 8倍の収率を与えた。

実施例 4

実施例 1と同様にして HMPB— PEGA r es i n (25 xmo l ) を得、固相合成の固相として用いて、アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例 1と同様に行なった。第 1のアミノ酸として Fmo c—A 1 a (38. 9mg, 0. 13mmo 1) を用い、 MSNT (37mg, 0. 13m mo l)、 N— me t hy l imi d a z o l e ( 7. 5 jU.1 , 94 ULO 1 ) , DCM (0. 5ml ) によって縮合させた。

その後のアミノ基を保護したアミノ酸を HOB 1: (16.9mg, 0. 13mm o l)、 D I PC I (19. 2 1 , 0. 13mmo 1)、 DMF (0.5ml) によって順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸として Fmo c -G 1 n

(46. 1 mg, 0. 13 mm o 1 ) , Fmo c -Th r ( t B u) (49. 7mg, 0. 13mmo 1)、 Fmo c - I 1 e (44.2mg, 0. 13mmo 1 )、 Fm o c -V a 1 (42.4mg, 0. 13 mm o l)、 Fmo c - S e r ( t B u)

(47. 9mg, 0. 13mmo 1 ) を用いて順次縮合させた。

ペプチド伸長後、樹脂 2 mo 1に対して式（5) で表される糖鎖ァスパラギンのジベンジル体（1 Omg, 3.6 Aimo 1 ) と DEPBT (2mg， 6 urn o l)、 D I P EA (0.68^ 1 , 4^mo l)、 DMF (0. 12ml) とを用いた。その後、 B o c—Cy s (Acm) (2.9mg, 10 zmo 1 ) を HO B t (1.36mg, 10 o l)、 D I PC I (1. 54 1 , 10 o l)、 DMF (0. 25ml) によって縮合した。

樹脂に AcOH : TFE=1 ： 1 (lml) を加え、室温で 14時間反応させた。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した。 HP LC (C ade n z a c o 1 umn C I 8 75 X 4. 6mm 展開溶媒 A : 0. 1 %T F A水溶液 B： 0. 1 %TFA/ァセトニトリル：水 = 90 ： 10 グラジェント A： B = 60 : 40→0 : 100 1 5分流速 0. lm 1 /m i n) で精製することで側鎖の保護された 9残基ペプチド（8) を得た。

ES I— MS : C a l c d f o r C _{x 55}H₂₄₉ N _{x 8} O ₇₉ S ： [M+ 2 H] ⁺² 1830. 3, f oun d. 1 83 1. 0.

実施例 5

実施例 4で製造した 9残基ペプチド（8) (2mg, 0. 55 πιο 1 ) とモレキユラ一シ一ブ（MS) 4A (10mg)、ベンジルメル力プ夕ン（2 ^ 1， 1 6.4^mo 1) を DMF溶媒中（85 1) アルゴン気流下— 20 °Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (1.4mg, 2. 7 umo I), D I PEA (0.46 M 1 , 2. 7 / mo 1) を加え 4時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテル (5m l) を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をァセトニトリル 50%水溶液で回収した。これを凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品に 95 %TF A水溶液を加えて室温で 2時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、 50%ァセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品を HPLC (C ad e n z a c o l umn C 18 75 X 4. 6 mm 展開溶媒 A： 0· 1 %TFA水溶液 B : 0. 1%TFA ァセトニトリル：水 =9 0 : 10 グラジェント A： B=95 ： 5→25 ： 75 1 5分流速 0. 1m 1/mi n) で精製して、式（9) で表される C末端がベンジルチオエステルであるペプチド（NH₂— Cy s (A cm) -As n (d i s i a 1 o o 1 i g o) -Th r -S e r -Va l - I 1 e -Th r -G 1 n-A 1 a - COSB n) を製造した。

(9) ^XH-NMR (400MHz, 295K i n D₂〇， HOD= 54. 81) 7. 53 - 7. 33 (m, 1 5H， PhX 3), 5. 37 (d, 2H, J = 1 1. 7Hz , PhCH₂)， 5. 29 (d, 2 H, J = 1 1. 6Hz, P h CH₂), 5. 1 1 (s , 1 H, Man4-H- 1), 5. 02 (d, 1 H, G l cNAc 1一 H— 1)， 4. 92 (s， 1 H, Ma n 4' -H- 1), 4. 65— 4. 5 2 (m， 3H, G 1 cNAc 2, 5, 5' -H- 1), 2. 91 -2. 78 (m， 4 H， As n-/3 CH₂, Cy s - · j6 CH₂), 2. 67 (dd, 2H, Ne u Ac 7, 7' -H_3eq), 2. 39-2. 3 1 (m, 2H, G i n—ァ CH₃), 1. 83 (dd, 2H, J = 13. 1 , 13. 1 Hz , Ne uAc 7, 7' -H- 3 _ax)， 1. 38 (d， 3 H, A 1 a-j6 CH₃), 1. 20 (d, 3 H, J = 6 51 Hz, Th r -r CH₃), 1. 17 (d, 3H， J = 6.40Hz , Th r -r CH₃), 0. 95 - 0. 80 (m, 12H, Va l—ァ CH₃， l i e— • r CH₃, · CH₃)

ES I— MS : C a 1 c d f o r C ₁₄₅H₂₂₃ N₁₈0₇₆ S ： [M+ 2 H] ²⁺ 1749. 8, f ound. 1749. 2

実施例 6

C末端に力ルポキシル基を有するペプチド Ac NH— H i s -A 1 -A 1 a 一 P he— COOHを従来公知の方法で製造し、原料として使用した。当該ぺプチド（0. 5mg， 1 μ,τηο 1 ) と MS 4 A (1 Omg) 、ベンジルメルカプタン（3. 7mg, 30 mo 1 ) を DMF溶媒中（0. 14ml) アルゴン気流下一 20°Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (2. 6mg, 5 ^mo 1 ) と D I P EA (0. 85 1 , 5 nmo 1 ) を加え 17時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテル (5m l ) を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をァセトニトリル 50%水溶液で回収した。これを HPLC (Cad e n z a c o 1 umn C 18 75 X4. 6mm 展開溶媒 A : 0. 1 %T F A水溶液

B： 0. 1 % T F A ァセトニトリル：水 =90 : 10 グラジェント A : B = 70 ： 30→40 ： 60 1 5分流速 0. 1 m 1 Zm i n) で精製することにより C末端がベンジルチオエステルである Ac NH— H i s -A 1 a-A 1 a— Ph e—COS Bnを得た。

ラセミ体の生成は 2%以下であった。

ES I—MS : C a l c d f o r C₃₀H₃₆N₆O₅S ： [ + H] ⁺ 592.3, f oun d. 592. 2

実施例 7

反応温度を 0°Cとする以外は実施例 6と同様に操作してベンジルチオエステル体 AcNH— H i s -A 1 a-A 1 a— P h e _ C O S B nを得た。得られた化合物のマススぺクトルは実施例 6のものと同一であった。ラセミ体の生成は 6% であった。

実施例 8

ペプチド AcNH— H i s -A 1 a -A 1 a -P h e -COOH (0. 5mg, 1 o 1 ) と MS 4A (1 Omg) 、 HOB t (0. 7mg, 5 mo lもしくは 1.4mg， 10 ^mo 1 ) を DMF溶媒中（0. 14ml) アルゴン気流下 0°Cで 1時間攪拌した後、 D I PC I (0. 8 1 , 5 /mo 1もしくは 1. 6 1 , 10 umo 1 ) とべンジルメルカプタン（3. 7mg, 30 umo 1 ) を加えた。以下、実施例 6と同様に処理してベンジルチオエステル体 Ac NH— H i s— A 1 a— A 1 a— Ph e— COSBnを得た。 HOB tを 5当量使用した場合の収率は 75%で、 10当量での収率は 98%であった。得られた化合物のマススぺクトルは実施例 6のものと同一であった。ラセミ体の生成はそれぞれ 5% であった。

実施例 9

C末端に力ルポキシル基を有するペプチド AcNH—Cy s— Cy s— G 1 u 一 H i s— COOHを従来公知の方法で製造し、原料として使用した。当該ぺプチド（0. 5mg, 1 mo 1 ) と MS 4A ( 1 Omg) 、 HOB t ( 1. 4mg, 10 πιο 1 ) を DMF溶媒中（0. 14ml) アルゴン気流下— 20 °Cで 1時間攪拌した後、 D I PC I (1. 6 il l , 10 xmo l) とべンジルメルカブ夕ン（3. 7mg, 30 mo 1) を加え反応させた。以下、実施例 6と同様に処理してべンジルチオエステル体 A cNH-Cy s— Cy s— G l u— H i s— C OS Bnを得た。

ラセミ体の生成は 2%以下であった。

実施例 10

T r i t y l Ch l o r i de r e s i n ( 1 50 mo 1 ) を固相合成の固相として用いて、順次アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例 1と同様に行なった。

第 1のアミノ酸として Fmo c— L e u (1 59. Omg, 0.45mmo 1 ) を用い、 DCM (0. 9ml ) 及び D I EA (204. 1 ^ 1 , 1. 2mmo 1 ) によって縮合させた。

その後のァミノ基が保護されたアミノ酸を HOB t (10 1. 3mg, 0. 75 mmo l)、 D I PC I (1 1 5.4^ 1 , 0. 75mmo l)、 DMF (3ml ) によって縮合させた。ァミノ基が保護されたアミノ酸として Fmo c— P r o (253. lmg, 0. 75mmo l)、 Fmo c—Ar g (Pb f) (486.6mg, 0.75mmo 1)、 Fmo c -Ty r ( t B u) (334.7mg, 0.75mmo 1 ), Fmo c -G 1 u (O t B u) (319. 2mg, 0.75mmo l)、 Fmo c -Me t (278.6mg, 0.75 mm o 1 ) , Fmo c -Th r ( t B u) (298. 1 mg， 0.75 mm o 1 ) , Fmo c -Cy s (t r t) (439.3mg, 0.7 5 mm o l)、 Fmo c— A 1 a (233. 5 m g , 0.75 mm o 1 )、 Fmo c -P r o (253. lmg, 0.75mmo l)、 Fmo c— Ly s (Bo c) (3 51.4mg, 0.75 mm o 1 ) , Fmo c— P r o (253. lmg, 0.75 mmo l)、 Fmo c -Ty r ( t B u) (334.7mg, 0.75 mm o 1 ) > Fmo c -G 1 u (O t B u) (319.2mg, 0.75 mm o 1 ) , Fmo c— S e r ( t B u) (287.6mg, 0.75mmo l)、 Fmo c -C y s ( t r t ) (439.3mg, 0. 75 mm o 1 ) , Fmo c— As p (O t B u) (30 8. 6mg, 0.75 mm o 1 ) , Fmo c -V a 1 (254. 6mg, 0.75m mo l)、 Fmo c— S e r ( t B u) (287. 6 m g , 0. 75 mm o 1 ) , F mo c -V a 1 (254. 6mg, 0.75 mm o l)、 Fmo c— A l a (23 3. 5mg， 0.75mmo l)、 Fmo c— A l a (233. 5mg, 0.75m mo l)、 B o c -L e u (187mg, 0.75 mm o 1 ) を用いて順次縮合させた。

樹脂に Ac〇H： DC ： Me OH= 5 : 4 : 1 (lml) を加え、室温で 3 時間反応させた。反応溶液にへキサンを加えた。その後ろ過して樹脂を除いた。樹脂を Me OHで洗浄し、その溶液を濃縮した。濃縮残渣にベンゼンを加えて更に濃縮して、側鎖の保護された 23残基ペプチド（（Bo c) Le u— Al a— A 1 a-Va 1 -S e r ( t B u) 一 Va l— As p (O t B u) -Cy s ( t r t) -S e r ( t B u) -G 1 u (O t Bu) -Ty r ( t B u) 一 P r o— Ly s (Bo c) — P r o— A l a— Cy s (t r t) -Th r ( t B u) — M e t -G 1 u (O t Bu) -Ty r (t Bu) — Ar g (Pb f) -P r o-L e u-COOH) (10) を得た。

得られた 23残基ペプチド（10) (39mg， 10 iimo 1 ) と MS4A、ベンジルメルカブタン（35. 5/21， 300 nmo 1 ) を DMF溶媒中（13 50 ^ 1) アルゴン気流下一 20。Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (26mg, 50 mo 1)、 D I PEA (8. 5^ 1 , 50 mo 1) を加えて 2時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物を DM Fで回収した。これを濃縮し、残渣に 95 %TF A水溶液を加えて室温で 2時間攪拌し、その後凍結乾燥した。

凍結乾燥品を HP L C (C a d e n z a c o l umn C 18 75 X 4. 6mm 展開溶媒 A : 0. 1%TFA水溶液 B ： 0. 1 %TFA ァセ卜二トリル：水 = 90 ： 10 グラジェント A： B = 80 ： 20→ 40 ： 60 15分流速 1. OmlZmi n) で精製して、式（1 1) で表される C末端がベンジルチォエステルであるペプチド（L e u-A 1 a -A 1 a - V a 1 - S e r - V a 1一 As p— Cy s— S e r— G l u— Ty r— P r o— Ly s— P r o— A l a-Cy s -Th r -Me t一 G l u— Ty r— Ar g— P r o— Le u— CO SBn) を製造した。

収量： 2 Omg

ラセミ体の生成率： 2%以下

ES I— MS : C a 1 c d f o r C _x ! ₈ Hi _{8 x} N₂₇ O ₃₄ S ₄： [ + 2 H] +² 1325. 1, f ound. 1325. 3.

(11) 実施例 1 1

固相が T r i t y l r es i n (40 mo 1 ) である 26残基ペプチド (G 1 u (O t Bu) -Ty r (t Bu) -A 1 a-S e r ( t B u) -P r o -G 1 y-Ly s (Bo c) -A 1 a-Th r ( t B u) -G 1 u (O t B u) -Va 1 -Ar g (P b f ) 一 Va l— Th r (t Bu) -Va 1 -L e u-A r g (P b f ) —G i n (t r t) - A l a— As p (O t Bu) -S e r (t Bu) —G i n (t r t) -V a 1 -Th r ( t Bu) -G 1 u (O t B u) 一 G 1 y— CO— （T r i t y 1 r e s i n)) (30 Omg, ノバパイオケム社製造品）に、 Cy s (Thz) (46.7mg, 0.2mmo 1 ) を、 HOB t

(27. Omg, 0. 2 mm o l)、 D I PC I (30. 8 1 , 0.2 mm o 1 )、 DMF (lml) によって縮合させた。

樹脂に 1%TFAZDCM溶液（1. 0m l) を加え、室温で 2分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を 5回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加えて側鎖の保護されたペプチドを沈殿させた。沈殿物を DMF溶液で回収し、濃縮して、側鎖の保護された 27残基ペプチド（Cy s (Th z) -G 1 u (O t B u) 一 Ty r ( t B u) 一 A l a— S e r ( t B u) -P r o-G 1 y-Ly s (Bo c) -A 1 a-Th r ( t B u) —G l u (O t Bu) -V a 1 -A r g (P b f ) -V a 1 -Th r ( t B u) -V a 1 -L e u-A r g (Pb f) — G i n (t r t) — A l a— As p (O t Bu) -S e r ( t B u) 一 G i n (t r t) -V a 1 -Th r (t Bu) 一 G l u (O t Bu) -G 1 y-COOH) (12) を得た。

得られた 27残基ペプチド（12) (10 ii o 1 ) と MS 4A (20mg)、チォフエノール（30. 6 1 , 300 ^mo 1 ) を DMF溶媒中（1. 36 ^ 1) アルゴン気流下一 20°Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (8. 6mg, 5 0 ii o 1 )、 D I P EA (26. 0 /^ 1 , 50 ^mo 1 ) を加え 4時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物を DMFで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に 95%TFA水溶液を加えて室温で 2時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、 50%ァセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品を HP L C (C ad e n z a c o l umn C I 8 75 X 4. 6 mm 展開溶媒 A : 0. 1 %T FA水溶液 B : 0. 1 %TFA ァセトニトリル：水 = 90 ： 1 0 グラジェント A： B=95 ： 5→25 ·· 75 1 5分流速 0. 1ml Zm i n) で精製して、式（13) で表される C末端がフエ二ルチオエステルであるペプチド（Cy s (Th z) 一 G l u— Ty r—A l a— S e r— P r o— G l y-Ly s -A 1 -Th r -G 1 u -V a 1 -A r g -V a 1 -Th r -V a 1 -L e u-A r -G 1 n -A 1 a— As p - S e r -G 1 n -V a 1 -Th r—G 1 u— G 1 y— COSPh) を製造した。

収量： 5mg

ラセミ体の生成率： 1%以下

2H] +² 1499. 7, f ound. 1499. 8.

実施例 1 2

固相が T r i t y l r es i n (40 ix o 1 ) である 17残基ペプチド (A 1 a-A 1 a-Th r (t Bu) -Ty r ( t B u) —Me t— Me t— G 1 y-As n-G 1 u (O t B u) -L e u-Th r (t Bu) -P h e -L e u—As p (O t B u) -As p (O t B u) — S e r ( t B u) -G 1 y-C O- (T r i t y 1 r es i n)) (50 Omg, ノババイオケム社製造品）に、 Cy s (Th z) (46. 7mg, 0. 2mmo 1 ) を、 HOB t (27. Omg, 0. 2mmo l)、 D I PC I (30. 8 z 1 , 0. 2mmo l)、 DMF ( 1 m 1) によって縮合させた。

樹脂に 1%TFAZDCM溶液を加え、室温で 2分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を 5回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加え側鎖の保護されたペプチドを沈殿させた。沈殿物を DMF溶液で回収し、濃縮して、側鎖の保護された 1 8残基ペプチド（Cy s (Th z) 一 A 1 a-A 1 a-Th r ( t B u) -Ty r ( t B u) —Me t— Me t— G l y-As n-G 1 u (O t B u) -L e u-Th r ( t B u) -Phe-L e u — As p (O t Bu) — As p (O t B u) -S e r ( t B u) -G 1 y-CO OH) (14) を得た。

得られた 18残基ペプチド（14) (10 nmo 1 ) と MS 4A (20mg)、ベンジルメルカブタン（36. 0 1， 300 mo 1 ) を DMF溶媒中（1. 3 611 1) アルゴン気流下一 20°Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (8. 6mg, 50 iimo 1 )、 D I PEA (26. 0 /i 1 , 50 rno 1 ) を加えて 4時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルェ一テルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物を DMFで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に 95%TF A (エタンジチオール（EDT) を含む）水溶液を加えて室温で 2時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、 50%ァセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品を HP L C (C ad e n z a c o l umn C 18 75 X 4. 6mm 展開溶媒 A： 0. 1 %TFA水溶液 B ： 0. 1 %T FA/ァセトニ卜リル：水 =90 ： 10 グラジェント A： B= 95 ： 5→2 5 : 75 15分流速 0. lml /mi n) で精製して、式（15) で表される C末端がベンジルチオエステルであるペプチド（Cy s (Th z) —A l a— A 1 -Th r -Ty r -Me t -Me t -G 1 y-A s n -G 1 u— L e u— Th r—Phe—Le u— As p— As p— S e r—G l y— COSBn) を製造した。

収量： 4mg

ラセミ体の生成率： 1%以下

ES I—MS : C a 1 c d f o r C₈₉H_12gN₁₉0₂₉ S ₄： [M+ 2 H] ^+z 2056.8, f ound. 2057. 2.

(15) 実施例 13

固相が Tr i t y l r e s i n ( 20 mo 1 ) である 22残基ペプチド ((Bo c) Ly s (Bo c) — A l a— Me t—H i s ( t r t ) -V a 1 - A l a— G i n (t r t) -P r o-A l a-Va 1 -Va 1 -Le u-Al 一 S e r (t Bu) -S e r ( t Bu) 一 Ar g (Pb f) — G l y - l i e— A 1 a-S e r ( t B u) -P h e -G 1 y-CO- (T r i t y 1 r es i n)) ( 250 m g , ノバパイオケム社製造品）に 1 % T F A/D CM溶液を加え、室温で 2分間反応させ、樹脂をろ過して除き、反応溶液をピリジンで中和した。この反応を 5回繰り返し、反応溶液を濃縮後、水を加え側鎖の保護されたべプチドを沈殿させた。沈殿物を DMF溶液で回収し、濃縮して、側鎖の保護された 2 2残基ペプチド（（Bo c) Ly s (Bo c) — A 1 a— M e t— H i s ( t r t) -Va 1 -A 1 a-G 1 n (t r t) -P r o-A l a-Va 1 -Va 1 - L e u-A l a-S e r ( t B u) — S e r (t Bu) — Ar g (Pb f) — G 1 y- I 1 e -A 1 a-S e r ( t Bu) -P h e -G 1 y-COOH) (1 6) を得た。

ES I - MS : C a 1 c d f o r C _{x 70}H₂₄₅ N₂₉O₃₄ S ₂： [M+ 2 H] ⁺² 1652. 0, f ound. 1651. 6

得られた 22残基ペプチド（16) (7. 5mg， 2. 2 βτηο 1 ) と MS 4A (20. 0mg)、チオフエノ一ル（6. 7 /i l , 1 1. 0 /imo l) を DM F溶媒中（300 1 ) アルゴン気流下一 20°Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (5 7mg, 66. 0 τηο 1 ), D I PEA (1. 7 ^ 1 , 1 1. 0 mo 1 ) を加え 4時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物を DMFで回収した。これを濃縮し、得られた濃縮品に 95 %TF A水溶液を加えて室温で 2時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、 50 %ァセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品を HPLC (C a d e n z a c o l umn C 1 8 75 X4. 6 mm 展開溶媒 A : 0. 1 %TFA水溶液 B ： 0. 1%TFAZァセトニトリル：水 = 90 ： 1 0 グラジェント A： B = 95 ： 5→ 25 ： 75 1 5分流速 0. lml/mi n) で精製して、式（17) で表される C末端がフエニルチォエステルであるペプチド（Ly s— A 1 a-Me t -H i s -V a 1 -A 1 一 G i n— P r o— A l a-Va 1 -Va 1 -L e u-A l a— S e r— S e r —Ar g—G l y— I l e— A l a— S e r—Ph e— G l y— COS Ph) を製造した。

収量： 2 m g

ラセミ体の生成率： 1 %以下

E S I -MS ： C a 1 c d f o r C i ₀ 丄 ₆₅N₂₉0₂₆ S ₂： [M + 2

(17) 実施例 14

実施例 1と同様にして HMPB— PEGA r es i n (50 /xmo l ) を得、固相合成の固相として用いて、アミノ酸を縮合させてペプチドを形成した。アミノ酸の縮合は実施例 1と同様に行なった。

第 1のアミノ酸として Fmo c _P h e (96. 9mg, 0. 25 mm o 1 ) を用い、 MSNT (74. 0 m g , 0. 25mmo 1 )、 N—me t h y 1 i m i d a z o l e (1 . 9 ^ 1 , 187. 5 mo I ), DCM (1ml) によって縮合させた。

その後のァミノ基が保護されたアミノ酸は、 HOB t (33. 7mg, 0. 25 mmo l)、 D I PC I (38. 5 l , 0. 25mmo l)、 DMF (lml) によって縮合させた。

ァミノ基が保護されたアミノ酸として、 Fmo c— As n (88. 6mg, 0. 2 5mmo l )、 Fmo c— Cy s (t r t) ( 146. 4mg, 0. 25mmo l )、 Fmo c— Ly s (Bo c) (1 17. lmg, 0. 25 mm o 1 )、 Fmo c— A s n (88. 6mg, 0. 25 mm o 1 ) , Fmo c— G l y (74. 3mg, 0. 25 mm o l)、 Fmo c— Ty r ( t B u) (1 14. 9mg, 0. 25 mm o 1)、 Fmo c— Th r ( t B u) (99.4mg, 0. 25 mm o 1 ) , Fmo c 一 Ly s (Bo c) (1 17. lmg, 0. 25mmo 1 ) を用い、固相樹脂に P he— As n— Cy s (t r t) -Ly s (Bo c) 一 As n— G l y— Ty r (t Bu) 一 Th r (t Bu) —Ly s (Bo c) の 9残基ペプチドを形成させた。

DCM及び DMFを用いて洗浄した後、 9残基のペプチド 3 mo 1相当の樹脂をエツペンチューブに移した。

下記式（1 8) で表される糖鎖ァスパラギン（12mg, 6 mo 1 ) と DE PBT (3mg， 9 umo 1 ) を DMF： DMSO=4 ： 1 (20 1 ^ 1) に溶解させ、エツペンチューブに入れた。

D I PEA (1. 02 /X 1 , 6 ^mo 1 ) を加えて室温で 20時間攪拌した。 DMFで洗浄した後に、 20%ピぺリジンを用いて Fmo c基を脱保護して、固相樹脂に P h e— As n— Cy s (t r t) -Ly s (Bo c) -As n-G 1 y-Ty r ( t B u) -Th r ( t B u) -L y s (Bo c) -As n (O 1 i go s a c c h a r i d e c ha i n) の 10残基べプチドを形成させた。この 10残基ペプチドに、前記と同様に HOB t、 D I PC I、 DMFでァミノ酸を更に縮合させた。

アミノ酸として、 Fmo c— As p (1.7mg， 0.015 mm o 1 ) , Fm o c— S e r ( t B u) (1. 9mg, 0.015mmo l)、 Fmo c -G 1 y

(1. 5mg, 0.015 mm o 1 ) , Bo c—Cy s (Th z) (1.7mg, 0. 015mmo 1 ) を用いて順次縮合させた。

樹脂に Ac〇H： TFE= 1 : 1 (lml) を加え、室温で 20時間反応させた。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮して、側鎖の保護された 14残基ぺプチド（Cy s (Th z) — G l y— S e r ( t B u) -As p-As n (O 1 i go s ac ch a r i d e c ha i n) — L y s (Bo c) 一 Th r ( t B u) -Ty r ( t B u) -G 1 y-A s n -L y s (Bo c) -Cy s (t r t) -As n-P h e -COOH) (19) を得た。

得られた 14残基ペプチド（19) (11. 7mg, 3 mo 1 ) と MS 4A、ベンジルメル力プ夕ン（10.6 1， 90 /imo 1 ) を DMF溶媒中（405 M 1) アルゴン気流下一 20°Cで 1時間攪拌した後、 PyBOP (7. 8mg, 1 5 mo 1 )、 D I PEA (2.6 1， 15 /imo 1 ) を加え 2時間攪拌した。その後、反応溶液にジェチルエーテルを加え目的物を沈殿物として析出させた。この沈殿物を濾過により溶液と分離し、濾紙に残つた沈殿物をァセトニトリル 5 0%水溶液に溶かし回収した。回収した溶液を濃縮し、 95%TFA水溶液を加えて室温で 2時間攪拌した。その後凍結乾燥した。凍結乾燥品を HPLC (Ca de nz a c o l umn C I 8 75 X 4. 6 mm 展開溶媒 A : 0. 0 1 %TFA水溶液 B： 0.01 %TFA//ァセトニトリル：水 = 90 ： 10 グラジェント A： B=80 ： 20— 40 ： 60 15分流速 lml Zm i n) で精製して、式（20) で表される C末端がベンジルチオエステルであるべプチド（Cv s (Thz) 一 G l y— S e r— As p— As n (O 1 i g o s a c c h a r i d e c h a i n) — Ly s— Th r— Ty r— G l y— As n— Ly s -Cy s -As n-Phe-COSBn) を製造した。

収量 3mg

ラセミ体の生成は 2%以下であった。

E S I -MS ： C a 1 c d f o r C _{x 33}H₂₀₃ N₂₃ O ₆₇ S ₃： [M + 2H] ⁺² 1 646. 1, f ound. 1646.4.

比較例 1

PyBOPを DEPBT (1. 5mg， 5 ^mo 1 ) 又は HBTU (1. 9mg, 5umo 1 ) に替えた以外は、実施例 7と同様に操作し、ベンジルチオエステル体 Ac NH— H i s -A 1 a-A 1 a _ P h e— C O S B nを得た。 DEPBT を使用した場合の収率は 10%、：》8丁11のそれは10%未満であった。

比較例 2 反応温度を 30°Cとした以外は、実施例 9と同様にしてベンジルチオエステル体 AcNH—Cy s— Cy s—G l u— H i s— COSBnを得た。

ラセミ体の生成は 40 %であった。産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、糖鎖を有さないペプチドは勿論のこと、糖鎖、特に水酸基が保護されていない糖鎖を有する糖べプチドであっても、その糖鎖構造に影響を与えることなく、更にべプチド側鎖の保護基を維持した C末端にカルポキシル基を有するぺプチドを製造することが可能であり、更にべプチド C末端のラセミ化が殆ど生じていないチォエステル化合物を製造することができる。

得られたペプチドのチォエステル化合物を、 N末端のアミノ酸が Cy sであるぺプチドフラグメントと作用させることで高分子化することができ、単一構造の糖鎖を持つ大型の糖タンパク質の製造も可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . (A) 式（1 ) で表されるリンカ一で修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、

(B ) 希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも 1種の酸で固相とべプチドとの結合を切断して、 C末端に力ルポキシル基を有するぺプチドを製造し、

( C) 溶媒中、縮合剤の存在下、チオール化合物を— 1 0 0〜0 °Cで反応させることを特徴とするぺプチドのチォエステル化合物の製造方法。

[式中、 R ¹はアルキル基を示し、 R ²は水素原子、 C i ₄アルコキシ基を示す。 nは 1〜4の整数を示す。 ]

2 . (A) 式（1 ) で表されるリンカ一で修飾された樹脂を固相として使用し、固相合成法でペプチドを形成させ、

(B ) 希塩酸、希硫酸、蟻酸、及び酢酸から選ばれる少なくとも 1種の酸で固相とべプチドとの結合を切断することを特徴とする C末端に力ルポキシル基を有するペプチドの製造方法。

3 . C末端に力ルポキシル基を有するペプチドに溶媒中、縮合剤の存在下チオール化合物を反応させることを特徴とするペプチドのチォエステル化合物の製造方法。

4. ぺプチドの N末端アミノ酸がシスティンである請求の範囲第 1〜 3 項のいずれかに記載の製造方法。

5 . システィンのチオール基が脂溶性保護基で保護されたべプチドである請求の範囲第 4項記載の製造方法。

6. 式（1) で表されるリンカ一で修飾された樹脂が、ァミノ PEGA 樹脂のァミノ基に式（1) で表されるリンカ一が結合した樹脂である請求の範囲第 1項又は第 2項記載の製造方法。

7. (B) の工程をアルコールの存在下に行なうことを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項記載の製造方法。

8. アルコールがハロゲノアルコールである請求の範囲第 7項記載の製造方法。

9. 溶媒が、 N， N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドンから選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 1項 1又は第 3項記載の製造方法。

10. 縮合剤が、 1ーヒドロキシベンゾトリァゾ一ル Zジィソプロピルカルポジイミド又はべンゾトリァゾールー 1ーィルォキシートリスピロリジノホスホニゥムへキサフルォロホスフェート/ジイソプロピルェチルァミンである請求の範囲第 1項又は第 3項記載の製造方法。

1 1. ペプチドが糖ペプチドである請求の範囲第 1〜10項のいずれかに記載の製造方法。