WO2010150730A1 - ペプチドチオエステル体の製造方法 - Google Patents

ペプチドチオエステル体の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010150730A1
WO2010150730A1 PCT/JP2010/060443 JP2010060443W WO2010150730A1 WO 2010150730 A1 WO2010150730 A1 WO 2010150730A1 JP 2010060443 W JP2010060443 W JP 2010060443W WO 2010150730 A1 WO2010150730 A1 WO 2010150730A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
peptide
thiol
nhr
cysteine residue
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/060443
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
康宏 梶原
亮 岡本
泉 坂本
一之 石井
Original Assignee
大塚化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to BRPI1016151-1A priority Critical patent/BRPI1016151B1/pt
Application filed by 大塚化学株式会社 filed Critical 大塚化学株式会社
Priority to DK10792048.0T priority patent/DK2450364T3/en
Priority to CN201080028424.9A priority patent/CN102803286B/zh
Priority to CA2766040A priority patent/CA2766040C/en
Priority to RU2012102519/04A priority patent/RU2529998C2/ru
Priority to JP2011519878A priority patent/JP5730197B2/ja
Priority to EP10792048.0A priority patent/EP2450364B1/en
Priority to AU2010263701A priority patent/AU2010263701B2/en
Priority to US13/379,832 priority patent/US8642725B2/en
Priority to SG2011089158A priority patent/SG176300A1/en
Priority to KR1020127001146A priority patent/KR101676515B1/ko
Publication of WO2010150730A1 publication Critical patent/WO2010150730A1/ja
Priority to US14/162,642 priority patent/US9127041B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide thioester.
  • a protein is obtained by introducing into a cell and expressing DNA encoding a protein intended for synthesis using the inside of a cell such as Escherichia coli. Chemical synthesis synthesizes a target protein by organically coupling amino acids in order.
  • cell-free synthesis proteins are synthesized cell-free using enzymes or the like present in various cells such as Escherichia coli. These methods can be appropriately used or combined according to the purpose of use of the protein, the size, the properties to be added, and the like.
  • a method of chemically synthesizing a peptide chain is used.
  • a solid phase synthesis method is mainly used.
  • the peptide chain obtained by the solid phase synthesis method is generally a short chain and is about 50 residues at the longest.
  • NCL method Native Chemical Ligation
  • the NCL method is a chemoselective reaction between a first peptide having an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminus and a second peptide having a cysteine residue at the N-terminus.
  • Group also referred to as sulfhydryl group
  • sulfhydryl group reacts selectively with the carbonyl carbon of the thioester group, and a thioester bond initial intermediate is formed by a thiol exchange reaction.
  • This intermediate spontaneously undergoes intramolecular rearrangement to give a natural amide bond at the linking site while regenerating the cysteine side chain thiol.
  • This method is a technique in which two peptide chains can be linked via a peptide bond simply by mixing in a buffer solution using an unprotected peptide.
  • the NCL method can selectively link one peptide C-terminal and the other peptide N-terminal, even if the reaction is between compounds having many functional groups such as peptides. From this point, it is important how to use the NCL method to chemically synthesize proteins.
  • the first is a method of constructing a peptide thioester on a resin.
  • a peptide thioester can be obtained together with the cleavage of the peptide chain from the resin after the peptide construction (eg, Boc solid phase synthesis method, Fmoc solid phase synthesis method).
  • the second is a method of constructing a peptide chain on a solid phase via a linker equivalent to a thioester (Safety Catching linker, Fujii method, Dawson method, Mercaptoprophetol method, Kawakami method, Kawakami method). method, etc.).
  • This method is a method for obtaining a thioester by thiolysis of a peptide chain after activating the constructed C-terminal of the peptide chain by performing an appropriate treatment with a linker (Non-patent Document 1).
  • Intein method is a method that solves the limitation of thioesterification by solid phase synthesis (Non-patent Document 2). This is a method by which polypeptide fragments biosynthesized by cells can be obtained as thioesters.
  • a peptide chain is thioesterified by utilizing a protein splicing function that occurs in a specific protein sequence, and a polypeptide chain is obtained as a thioester form.
  • the useful point of this method is that a long-chain peptide thioester can be obtained.
  • Non-patent Document 3 Methods for expressing and obtaining polypeptide chains have already been extensively studied and are well established as basic biological techniques.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 A method for cleaving peptides bound to a solid phase by using them is known (Non-Patent Documents 6 and 7). Also known is a method of cleaving a peptide bond on the C-terminal side of a methionine residue using cyanogen bromide (CNBr). However, these are not methods for obtaining peptide fragments as thioesters.
  • the peptide thioesterification method as shown in the background art is limited to peptide chains obtained by solid phase synthesis of peptides capable of thioesterification and peptide chains that are targets for protein splicing. This is because each method requires a non-natural amino acid derivative, a linker, a specific three-dimensional structure, and the like.
  • an object of the present invention is to provide a novel method for chemically converting a polypeptide chain into a peptide thioester.
  • the present inventors considered that a method for selectively activating the peptide C-terminus by targeting a natural amino acid residue in the peptide sequence was necessary. If it is such a method, even if it is a peptide obtained by what kind of methods, such as biosynthesis, a peptide chain can be activated selectively and thioesterification can be performed.
  • a cysteine residue that is a special sulfur-containing amino acid among natural amino acids.
  • a compound having a leaving group represented by 3 a —NH—C ( ⁇ Y) NHR 3 group is added to the carboxyl group of the peptide bond on the N-terminal side of the cysteine residue, and the peptide bond is cleaved. And found that the C-terminal peptide fragment was excised.
  • a thionoformate group was first introduced into the thiol group of a cysteine residue.
  • the thionoformate group By reacting the thionoformate group with N-acetylguanidine in an organic solvent, the peptide chain is cleaved at the N-terminal side of the cysteine residue, and the C-terminal is converted to N-acetylguanidide.
  • the obtained peptide chain was obtained. Further, this N-acetylguanidated peptide chain reacted with thiol R 4 -SH in a buffer solution to convert it into a peptide thioester.
  • the present inventors have found that the peptide chain obtained by the above and having a C-terminal converted to N-acetylguanidide and a peptide thioester can be used in the NCL method.
  • a method for producing a peptide thioester comprising the following steps (a) to (c): (A) In the peptide chain having a cysteine residue, the thiol group of the cysteine residue has the following formula (I): [Where: X is a sulfur atom or an oxygen atom, R 1 and R 2 are leaving groups.
  • the first intermediate has the following formula (II): [Where: Y is an oxygen atom, a sulfur atom, or an NH group, R 3 is a hydrogen atom, an acyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • the thiol is represented by the following formula (III); R 4 —SH (Formula III) [Wherein, R 4 represents any one group selected from a substituted or unsubstituted benzyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, and a substituted or unsubstituted alkyl group. ]
  • the first intermediate has the following formula (II): [Where Y is an oxygen atom, a sulfur atom, or an NH group, R 3 is a hydrogen atom, an acyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • a peptide chain having [13] Production of a polypeptide comprising the step of linking a peptide chain having a —NH—C ( ⁇ Y) NHR 3 group at the C-terminus and a peptide chain having a cysteine at the N-terminus according to the ligation method as described in [12] Method.
  • a method for removing a purification tag added to the C-terminal side of a recombinant protein comprising the following steps (a) to (c): (A) In a recombinant protein containing a purification tag at the C-terminus, the thiol group of the cysteine residue has the following formula (I): [Where: X is a sulfur atom or an oxygen atom, R 1 and R 2 are leaving groups.
  • the first intermediate has the following formula (II): [Where: Y is an oxygen atom, a sulfur atom, or an NH group, R 3 is a hydrogen atom, an acyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • a novel method for chemically converting a polypeptide chain into a peptide thioester is provided.
  • thioesterification is possible even in a peptide chain not having a non-natural amino acid derivative or linker or a specific tertiary structure, which is necessary for a conventional thioesterification method. Therefore, even a long polypeptide fragment obtained by biosynthesis or the like can be easily thioesterified.
  • the modification is a sugar chain
  • a fragment containing an amino acid to which a naturally linked sugar chain is added is chemically synthesized, the other part is prepared by biosynthesis, and thioesterified by the method of the present application, By linking, a longer-chain sugar chain peptide can be easily produced.
  • a method of adding a sugar chain or the like to a peptide chain via a linker is known, and this can be added to a biosynthesized long chain peptide.
  • this sugar chain binding method via a linker uses a specific amino acid or structure to bind sugar chains and the like.
  • a peptide fragment containing only the desired binding site is excised from the long peptide and Add a chain, thioesterify the glycosylated peptide fragment using the thioesterification method of the present application, and relink it with the remaining part to add a sugar chain more easily and site-selectively than in the past. You can also.
  • the full-length protein in the case of a peptide fragment, it may be recognized as a mistake in the cell and may not be normally expressed, such as being degraded.
  • biosynthesizing the full-length protein cut out only the fragment of the part to be modified, perform the necessary modification, etc., and then thioesterify the modified peptide fragment using the method of the present application, It is also possible to obtain the desired modified protein by religation.
  • the peptide thioesterification method of the present invention is useful in general protein synthesis.
  • the present invention is a method for producing a novel peptide thioester, which comprises the following steps (a) to (c):
  • the first intermediate has the following formula (II): [Where Y is an oxygen atom, a sulfur atom, or an NH group, R 3 is a hydrogen atom, an acyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • the “peptide” is not particularly limited as long as two or more amino acids are bonded by an amide bond, and includes known peptides, novel peptides, and peptide variants.
  • a protein is also included in a peptide.
  • polypeptide is also included in the peptide.
  • the peptide chain used in the method of the present invention may be a natural protein or a peptide chain obtained by a method such as biosynthesis, chemical synthesis or cell-free synthesis.
  • the “peptide variant” includes a natural variant of a peptide, a post-translational modification, or an artificially modified compound.
  • modifications include, for example, alkylation, acylation (eg acetylation), amidation (eg peptide C-terminal amidation), carboxylation, ester formation of one or more amino acid residues of the peptide , Disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, phosphorylation, hydroxylation, binding of labeling components, and the like.
  • the “amino acid” is used in its broadest sense, and is a natural amino acid such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine ( Ala), tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), proline (Pro) as well as unnatural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids in the present invention for example, L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, ⁇ -alanine, ornithine, etc. It will be understood that amino acids that are not constituents of proteins in vivo; and chemically synthesized compounds that have amino acid properties known to those skilled in the art.
  • the peptide chain to be thioesterified is not particularly limited as long as it is a peptide chain containing a cysteine residue.
  • the origin, synthesis method, size, etc. of the peptide chain are not particularly limited.
  • the number of cysteine residues contained in the peptide chain used in the present invention is not particularly limited, but the peptide chain is cleaved targeting the cysteine residue. Therefore, although it is necessary to design the basic skeleton of the protein to be finally synthesized depending on the position having a cysteine residue, such a design can be easily made by those skilled in the art.
  • thioesterification is performed only at the position of the desired cysteine residue, so that the remaining cysteine residues are not affected by the reaction.
  • the cysteine residue may be protected with a protecting group or the like in advance. Examples of such protecting groups include Acm groups.
  • the peptide chain used in the present invention may have a fat-soluble protective group on the N-terminal side.
  • Preferred protecting groups include acyl groups such as acetyl (Ac) group, carbonyl-containing groups such as t-butyloxycarbonyl (Boc) group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, and allyloxycarbonyl (Alloc) group. , Allyl group, benzyl group and the like, but are not limited thereto.
  • the peptide chain used in the method of the present invention may be a natural protein, or may be a peptide chain obtained by a method such as biosynthesis, chemical synthesis or cell-free synthesis. Alternatively, it is a recombinant protein expressed in cells.
  • a recombinant protein may have the same peptide sequence as a natural protein as long as it is artificially expressed in cells or cells, or has a peptide sequence with modifications such as mutation and purification tags It may be.
  • the recombinant protein used in the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the gene of interest can be introduced into a recombinant vector and expressed.
  • the recombinant vector used in the present invention is not limited as long as it can transform a host cell.
  • a plasmid for E. coli, a plasmid for Bacillus subtilis, a plasmid for yeast, a retrovirus, a vaccinia virus, Animal virus vectors such as baculovirus are used.
  • These preferably have a control sequence such as a promoter capable of appropriately expressing the protein in the host cell.
  • any host cell that can express a foreign gene with a recombinant vector may be used.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like are used.
  • a commonly used method may be used.
  • a calcium chloride method or an electroporation method in the case of Escherichia coli, a calcium chloride method or an electroporation method, and in the case of yeast, a lithium chloride method or an electroporation method.
  • the poration method can be used.
  • Animal cells can be transformed using physical methods such as electroporation, chemical methods such as the liposome method and calcium phosphate method, or viral vectors such as retroviruses.
  • the culture form of the host cell as a transformant may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host.
  • the peptide used in the present invention is preferably purified.
  • the method for purifying the peptide can be performed by ordinary general purification.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, After disrupting cells or cells by ultrasonic waves, lysozyme and / or freeze-thawing, a crude peptide extract is prepared by centrifugation or filtration.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the peptide contained in the thus obtained extract or culture supernatant can be purified by a known purification method.
  • peptide separation and purification can be performed by appropriately selecting and combining affinity chromatography, ion exchange chromatography, filter, ultrafiltration, gel filtration, electrophoresis, salting out, dialysis and the like.
  • a purification tag can be incorporated into the expression vector.
  • the purification tag include His tag, GST tag, Myc tag, FLAG tag, and maltose binding protein (MBP).
  • MBP maltose binding protein
  • a purification tag is added to the C-terminal side of the peptide, and thioesterification is performed after purification, whereby Cys in the peptide chain is obtained.
  • the C-terminal side is truncated together with the tag, and a peptide thioester can be obtained efficiently.
  • the method of the present invention can also be used for removing the C-terminal tag. Therefore, a method for removing the purification tag added to the C-terminal of the recombinant protein using the method for producing a peptide thioester of the present invention is also included in the present invention.
  • a “peptide thioester form” refers to a peptide having a carboxythioester moiety (—C ⁇ O—SR) at the C-terminus.
  • the peptide thioester used in the present invention is not particularly limited as long as it is a thioester that can undergo an exchange reaction with other thiol groups. Examples of the R group include groups exemplified by the following R 4 .
  • X is a sulfur atom or an oxygen atom, preferably a sulfur atom.
  • R 1 and R 2 are particularly limited as long as the leaving group has a nucleophilic property lower than the substituted atom or atomic group under the reaction conditions in the following step (a) and has a function of being eliminated. Although not preferred, R 1 and R 2 are preferably different leaving groups.
  • R 1 and R 2 include a halogen atom, a substituted or unsubstituted —O-alkyl group, a substituted or unsubstituted —O-alkenyl group, a substituted or unsubstituted —O-alkynyl group, substituted or unsubstituted Substituted -O-aryl group, substituted or unsubstituted -O-heteroaryl group, substituted or unsubstituted -S-alkyl group, substituted or unsubstituted -S-alkenyl group, substituted or unsubstituted -S- Examples thereof include an alkynyl group, a substituted or unsubstituted —S-aryl group, and a substituted or unsubstituted —S-heteroaryl group.
  • R 1 is a substituted or unsubstituted -O-C 6-10 aryl group, and is selected from the group consisting of substituted or unsubstituted -S-C 1-8 alkyl group leaving group
  • R 2 is a halogen atom, a substituted or unsubstituted -S-C 1-8 alkyl group, leaving selected from the group consisting of substituted or unsubstituted -S-C 6-10 aryl group The combination which is group is mentioned.
  • an “alkyl group” is a monovalent group derived by removing an arbitrary hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon, and represents a hydrocarbyl or hydrocarbon subset containing hydrogen and carbon atoms.
  • the alkyl group includes a linear or branched structure.
  • the alkyl group of the present invention is preferably an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • the “C 1-8 alkyl group” refers to an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms. Specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, and a heptyl group. Group, octyl group and the like.
  • the “alkenyl group” is a monovalent group having at least one double bond. Depending on the arrangement of the double bond and the substituent, the geometric form of the double bond can take an
  • E an
  • tszanmen (Z) tszanmen
  • the alkenyl group includes a straight chain or a branched chain.
  • the alkenyl group of the present invention is preferably an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms.
  • the “C 2-8 alkenyl group” refers to an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms.
  • the “alkynyl group” is a monovalent group having at least one triple bond.
  • the alkynyl group includes a linear or branched alkynyl group.
  • the alkynyl group of the present invention is preferably an alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms.
  • “C 2-8 alkynyl group” means an alkynyl group having 2 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, butynyl group, pentynyl group, hexynyl group. , Heptynyl group, octynyl group and the like.
  • the “aryl group” means an aromatic hydrocarbon cyclic group.
  • the aryl group of the present invention is preferably an aryl group having 6 to 10 carbon atoms.
  • the “C 6-10 aryl group” refers to an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, and specific examples include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, and the like.
  • a “heteroaryl group” means a monovalent or divalent group derived from one or two hydrogen atoms at any position from a heteroaryl ring.
  • the “heteroaryl ring” means an aromatic ring containing one or more heteroatoms in the atoms constituting the ring, preferably a 5-9 membered ring.
  • the ring may be a monocyclic ring or a bicyclic heteroaryl group fused with a benzene ring or a monocyclic heteroaryl ring.
  • furanyl group thiophenyl group, pyrrolyl group, benzofuranyl group, benzothiophenyl group, indolyl group, pyridyl group, quinolinyl group and the like.
  • the type, number, and substitution position of the substituents in the above-mentioned leaving group are not particularly limited.
  • substituents include alkyl groups, alkenyl groups, alkoxy groups, aryl groups, formyl groups, carbonyl groups, carboxyl groups, and alkyl groups.
  • examples include a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, a halogen, a sulfonyl group, and a nitro group.
  • step (a) is preferably carried out under acidic conditions, particularly preferably at pH 3-5.
  • the reaction is preferably performed in a mixed solvent of buffer and acetonitrile at 0 to 50 ° C., preferably 15 to 25 ° C., for about 0.1 to 3 hours, preferably 10 minutes to 1 hour, but is not limited thereto. .
  • compound B is represented by the following formula (II).
  • Y is an oxygen atom, an NH group, or a sulfur atom
  • R 3 is a hydrogen atom, an acyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • acyl group means an atomic group obtained by removing an OH group from a carboxyl group of a carboxylic acid.
  • the acyl group of the present invention is preferably an acyl group having 1-4 carbon atoms. Specifically, an acetyl group, a propionyl group, a butyroyl group, etc. are mentioned, for example.
  • the “alkoxy group” means an oxy group to which an “alkyl group” is bonded.
  • the alkoxy group of the present invention may be linear or branched.
  • the alkoxy group of the present invention is preferably a linear alkoxy group having 1 to 14 carbon atoms or a branched alkoxy group having 3 to 14 carbon atoms.
  • methoxy group, ethoxy group, n-propyloxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, 2-methyl-2-propyloxy group, n-pentyloxy group, n-hexyloxy group, etc. Can be mentioned.
  • the “C 2-n alkoxycarbonyl group” means a carbonyl group having a C 1- (n-1) alkoxy group.
  • the alkoxycarbonyl group of the present invention is preferably an alkoxycarbonyl group having 2 to 15 carbon atoms. Specifically, for example, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, n-propyloxycarbonyl group, isopropoxycarbonyl group, n-butoxycarbonyl group, 2-methyl-2-propyloxycarbonyl group, n-pentyloxycarbonyl group, Examples thereof include an n-hexyloxycarbonyl group.
  • the acyl group an acetyl group is preferable.
  • the alkoxycarbonyl group is preferably a tert-butoxycarbonyl group (Boc group).
  • the step (b) is preferably performed in the presence of an organic solvent.
  • the organic solvent preferably has high solubility and low nucleophilicity. Examples of such an organic solvent include DMSO, DMF, dioxane, and the like.
  • the reaction is preferably carried out at 0 to 50 ° C., preferably 15 to 25 ° C. for about 1 to 24 hours, preferably 5 to 10 hours, but is not limited thereto.
  • a lipophilic protecting group may be introduced into the side chain amino group before performing the step (b) of the present invention.
  • the fat-soluble protecting group include carbonyl-containing groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, allyloxycarbonyl (Alloc) group, acetyl (Ac) group, etc.
  • Protecting groups such as an acyl group, an allyl group, and a benzyl group are not particularly limited thereto.
  • the fat-soluble protecting group for example, when introducing the Fmoc group, 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate can be added and reacted.
  • the reaction may be performed at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours, but is not limited thereto.
  • a peptide fragment on the N-terminal side of the cleaved portion of the cleaved peptide chain can be obtained as the second intermediate of the following formula (1).
  • the method for producing a peptide thioester of the present invention further comprises (c) reacting the second intermediate with a thiol to exchange a C-terminal —NH—C ( ⁇ Y) NHR 3 group with a thiol group. To thioesterify the C-terminus of the second intermediate.
  • the second intermediate used in step (c) may or may not be isolated after step (b).
  • a thiol represented by the following formula (III) is used in the step (c).
  • R 4 —SH (Formula III) R 4 is not particularly limited as long as it does not inhibit the thiol exchange reaction and becomes a leaving group in the substitution reaction on the carbonyl carbon.
  • R 4 is any one group selected from a substituted or unsubstituted benzyl group, a substituted or unsubstituted aryl group and a substituted or unsubstituted alkyl group, more preferably a substituted or unsubstituted group.
  • benzyl-type leaving groups such as benzyl mercaptan, aryl-type leaving groups such as thiophenol and 4- (carboxymethyl) -thiophenol, 2-mercaptoethanesulfonic acid groups, and 3-mercaptopropion. It can be selected from alkyl-type leaving groups such as acid amides. There are no particular limitations on the type, number, and substitution position of the substituents that these leaving groups have.
  • step (c) the second intermediate is completely converted into a thioester as shown in the following figure.
  • the peptide thioester obtained as described above is linked to a peptide (or modified peptide) containing an amino acid residue having an —SH group at the N-terminus, among peptides or modified peptides, using a ligation method.
  • this invention also provides the manufacturing method of polypeptide including the process of couple
  • the “ligation method” is not limited to the natural chemical ligation method described in Patent Document 1 (Native Chemical Ligation, NCL method), but also non-natural amino acids, amino acid derivatives (eg, threonine derivative A, protected methionine). And the case where the above-mentioned natural chemical ligation method is applied to a peptide containing a glycosylated amino acid or the like). A peptide having a natural amide bond (peptide bond) at the linking site can be produced by the ligation method.
  • Ligation using a ligation method can be performed at any of peptide-peptide, peptide-modified peptide, and modified peptide-modified peptide.
  • the target product was purified by HPLC, and the target N-acetylguanidide (Ac-Val Tyr Ala Leu-NHC (NH) NHAc (SEQ ID NO: 13) and Ac-Val Tyr Ala Phe-NHC ( NH) NHAc (SEQ ID NO: 14)) was obtained (yield 80%, calculated from HPLC area intensity).
  • Xaa Leu, ESIMS calcd [M + H] + 590.3, found [M + H] + 590.3).
  • (Xaa Phe, ESIMS calcd [M + H] + 624.3, found [M + H] + 624.3)
  • the target product was purified by HPLC to obtain the target N-acetylguanidide (Ac-Val Tyr Ala Lys (Boc) -NHC (NH) NHAc (SEQ ID NO: 18)). (Yield 70%, calculated from HPLC area intensity).
  • 24aa peptide (BocHN-Leu Ile Cys (Acm) Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys (Boc) Glu Ala Glu Asn Ir ThrChr ThrChr ThrC 0.1 mg>) was dissolved in pH 7.05 buffer solution (0.2 M phosphoric acid, 6 M guanidine, 50 ⁇ l) containing MESNa (sodium 2-sulfanylethansulfonate) (1 mg, 2% v / v).
  • MESNa sodium 2-sulfanylethansulfonate
  • a novel method for chemically converting a polypeptide chain into a peptide thioester is provided.
  • the method of the present invention enables thioesterification even in non-natural amino acid derivatives and linkers necessary for conventional thioesterification methods, or in peptide chains that do not have a specific tertiary structure. Even the obtained long polypeptide fragment can be easily thioesterified. Therefore, the peptide thioesterification method of the present invention can be used in general protein synthesis.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】本発明は、ペプチド鎖を化学的にペプチドチオエステル体へと変換する新規な方法を提供することを課題とする。 【解決手段】本発明者らは、ペプチド鎖において、システイン残基に注目した。そして、システイン残基のチオール基に、－Ｃ（＝Ｘ）－Ｒ１基を導入し、これに対して、有機溶媒中で－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３で表わされる脱離基を有する化合物を反応させることで、システイン残基のＮ末端側のペプチド結合のカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が付加し、前記ペプチド結合が切断され、Ｃ末端側のペプチド断片が切除されることを見出した。さらに、この－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が付加したペプチド鎖に緩衝溶液中にてチオールを反応させることで、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が結合しているカルボニル炭素に対して、前記チオールのチオール基が結合し、前記－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が脱離するというチオール交換反応により、ペプチドチオエステルへと変換できることを見出した。

Description

ペプチドチオエステル体の製造方法
　本発明は、ペプチドチオエステル体の製造方法に関する。
　タンパク質の合成には、生合成、化学合成、無細胞合成など種々の方法が知られている。生合成方法では、大腸菌等の細胞内を利用して、合成を目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内に導入し発現させることにより、タンパク質を得る。化学合成は、アミノ酸を有機化学的に順番に結合させることにより、目的のタンパク質を合成する。また、無細胞合成は、大腸菌などの各種細胞内に存在する酵素等を利用して、無細胞的にタンパク質を合成する。これらの方法は、タンパク質の使用目的や、サイズ、付加する性質等によって適宜、使い分けられたり、組み合わせられる。
　アミノ酸配列の中間部分に、糖鎖や脂質などの特定の修飾を均一に有するタンパク質を合成するためには、現在のところ、あらかじめ糖鎖や脂質などで修飾されたアミノ酸を用いて、その周辺のペプチド鎖を化学合成する方法が用いられている。
　ペプチド鎖を化学合成する方法としては、主に固相合成法が用いられる。しかし固相合成法によって得られるペプチド鎖は、一般的に短鎖であり、長くとも５０残基程度である。
　このため修飾を有する長鎖のペプチド鎖を合成するためには、短いペプチド鎖を別々に調製後、これらを連結する方法が主に用いられている。ペプチド鎖連結手法としては様々な手法が報告されているが、広く用いられている方法の一つが天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）である。ＮＣＬ法は、無保護のペプチド鎖同士でも行うことができ、連結部位(ライゲーション部位)に天然アミド結合(ペプチド結合)を生成するための有用な方法であることが知られている(例えば、特許文献１)。ＮＣＬ法は、Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドとＮ末端にシステイン残基を有する第２のペプチドとの化学選択反応であり、システインの側鎖のチオール基（ＳＨ基、スルフヒドリル基ともいう）がチオエステル基のカルボニル炭素に選択的に反応し、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して、連結部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。
　この方法は、無保護のペプチドを用い緩衝溶液中で混合するのみで、ペプチド結合を介して二つのペプチド鎖を連結することのできる手法である。ＮＣＬ法はペプチドのように数多くの官能基を有した化合物同士の反応であっても、選択的に一方のペプチドＣ末端と他方のペプチドＮ末端を連結することができる。このような点から、タンパク質を化学合成するためにはいかにＮＣＬ法を利用するかが重要になる。
　しかしＮＣＬ法の利用における問題点として、原料として必要な、Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するペプチドチオエステル体の調製が挙げられる。ペプチドチオエステルの調製法には様々な方法が報告されているが、一般に固相合成法を基盤とした、二つのタイプに分類することができる。
　一つ目は、樹脂上にペプチドチオエステルを構築する方法である。この方法はペプチド構築後樹脂からのペプチド鎖の切断とともにペプチドチオエステルを得ることができる（ｅ．ｇ．　Ｂｏｃ固相合成法、Ｆｍｏｃ固相合成法）。二つ目は、チオエステルに等価なリンカーを介してペプチド鎖を固相上に構築する方法である（Ｓａｆｅｔｙ　Ｃａｔｃｈ　ｌｉｎｋｅｒ，Ｆｕｊｉｉ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｄａｗｓｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｒｃａｐｔｏ　ｐｒｏｐａｎｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｋａｗａｋａｍｉ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｈｏｊｏ　ｍｅｔｈｏｄ，Ａｉｍｏｔｏ　ｍｅｔｈｏｄ，ｅｔｃ．）。この方法は、リンカーによって適切な処理を行い構築したペプチド鎖Ｃ末端を活性化した後、ペプチド鎖をｔｈｉｏｌｙｓｉｓすることでチオエステルを得る方法である（非特許文献１）。
　これら以外にも固相合成によって側鎖が保護されＣ末端のカルボキシル基のみが遊離であるような保護ペプチドを合成した後に、適当な縮合条件にてチオエステル化する方法も報告されている（例えば、特許文献２）。いずれの方法も確立された方法であり、過去の様々なタンパク質合成において用いられてきた。しかし、いずれの手法も、固相合成法の制限に束縛されるため、合成できるペプチドチオエステル体のサイズが制限されてしまう。さらに、リンカーを用いる手法では非天然型のアミノ酸誘導体や、特別な誘導体を別途化学合成しなければならず、必ずしもその手順は簡便であるとはいえない。
　固相合成法によるチオエステル化の制限を解決した方法にＩｎｔｅｉｎ法がある（非特許文献２）。これは細胞により生合成されたポリペプチドフラグメントをチオエステル体として得ることのできる方法である。Ｉｎｔｅｉｎ法では特定のタンパク質配列で起こるタンパク質スプライシング機能を利用することで、ペプチド鎖のチオエステル化を行い、ポリペプチド鎖をチオエステル体として得る。この方法の有用点は長鎖のペプチドチオエステルを得ることができる点である。この手法と化学合成法との組み合わせによって、これまで合成することが困難と考えられてきたような大型の被修飾タンパク質でも合成が可能になってきた（非特許文献３）。ポリペプチド鎖を発現し、得る方法はすでに膨大な研究が成されており、生物学の基本技術として十分確立されている。
　しかし、Ｉｎｔｅｉｎ法を用いる場合は、ポリペプチドを発現させるのみではなく、タンパク質スプライシングを機能させるために、標的となるペプチド配列が必要であり、また必ず発現したインテイン複合タンパク質がフォールディングし、固有の三次元構造をとらなければならない。このため、発現させるポリペプチド配列によっては、必ずしもペプチドチオエステルが得られず、常に十分な条件の最適化が伴い、作業的な煩雑さが付随する。
　一方、ペプチドの切断方法としては、ペプチド中のシステイン残基のＳＨ基に化合物を反応させることにより前記システイン残基の位置でペプチド鎖を切断する方法や（非特許文献４、５）、リンカーを用いて固相に結合しているペプチドを切断する方法が知られている（非特許文献６、７）。また、臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いて、メチオニン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する方法が知られている。しかし、これらはペプチド断片をチオエステル体として得る方法ではない。
国際公開ＷＯ９６／３４８７８号 国際公開ＷＯ２００７／１１４４５４号
Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， １１３６９－１１３７４ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， ＣＨＥＭ． ＣＯＭＭＵＮ．， ２００３ ２０８７－２０９０ Ｍｕｉｒ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００３． ７２：２４９－２８９ Ｓｔａｒｋ ＧＲ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９７７， ４７， １２９－１３２． Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９４， １１６， ５５１３－５５１４ Ｓｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９３， １７８６－１７８８ Ｐａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９４， Ｖｏｌ．３５， Ｎｏ．３４， ６２９１－６２９４
　上記背景技術に示されるような、ペプチドチオエステル化法では、チオエステル化できるペプチドが固相合成されたペプチド鎖や、タンパク質スプライシングの標的となるペプチド鎖に限られる。これはいずれの手法も非天然型のアミノ酸誘導体や、リンカー、特定の三次元構造等を必要とするためである。
　そこで、本発明は、ポリペプチド鎖を化学的にペプチドチオエステル体へと変換する新規な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、ペプチド配列中の天然のアミノ酸残基を標的として、選択的にペプチドＣ末端を活性化する方法が必要であると考えた。このような方法であれば、生合成等のどのような方法で得られたペプチドであっても、選択的にペプチド鎖を活性化し、チオエステル化を行うことが可能である。
　そこで、本発明者らは、天然型アミノ酸の中でも特殊な含硫アミノ酸であるシステイン残基に注目した。そして、下記の図に示すように、システイン残基のチオール基に、－Ｃ（＝Ｘ）－Ｒ１基を導入し、これに対して、有機溶媒中で－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３で表わされる脱離基を有する化合物を反応させることで、システイン残基のＮ末端側のペプチド結合のカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が付加し、前記ペプチド結合が切断され、Ｃ末端側のペプチド断片が切除されることを見出した。さらに、この－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が付加したペプチド鎖に緩衝溶液中にてチオール化合物を反応させることで、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が結合しているカルボニル炭素に対して、前記チオールのチオール基が結合し、前記－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基が脱離するというチオールとの交換反応により、ペプチドチオエステルへと変換できることを見出した。
　上記の一例として、具体的には、まずシステイン残基のチオール基にチオノフォルメート基を導入した。そして、このチオノフォルメート基に対して有機溶媒中でＮ－アセチルグアニジンを反応させることで、システイン残基のＮ末端側でペプチド鎖の切断が生じ、Ｃ末端がＮ－アセチルグアニジド化されたペプチド鎖を得た。さらに、このＮ－アセチルグアニジド化されたペプチド鎖は緩衝溶液中にてチオールＲ４－ＳＨと反応し、ペプチドチオエステルへと変換した。
　また、上記で得られた、Ｃ末端がＮ－アセチルグアニジド化されたペプチド鎖、および、ペプチドチオエステル体が、ＮＣＬ法に利用可能であることを見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　即ち、本発明は、具体的には以下の〔１〕～〔１４〕を提供するものである。
〔１〕
　ペプチドチオエステル体の製造方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、
　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、
　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程；及び
　（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程
を含む、方法。
〔２〕
　Ｘが硫黄原子である前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕
　Ｒ１が、－Ｏ－Ｃ６アリール基である前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕
　Ｒ２が、ハロゲン原子または置換もしくは非置換の－Ｓ－Ｃ６－１０アリール基である前記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
　ＹがＮＨ基である、前記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
　Ｒ３が、アセチル基である、前記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
　前記工程（ｃ）において、前記チオールが以下の式（ＩＩＩ）；
Ｒ４－ＳＨ　　（式ＩＩＩ）
[式中、Ｒ４は、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換のアリール基、および、置換もしくは非置換のアルキル基から選択されるいずれか一つの基である。]
で表わされるチオールである、前記〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
　ペプチド鎖が、組換えタンパク質である、前記〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
　ペプチド鎖が、精製用タグを含む組換えタンパク質である、前記〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
　前記〔１〕から〔９〕のいずれかにに記載の方法で得られたペプチドチオエステル体と、Ｎ末端にシステインを有するペプチド鎖をライゲーション法により結合する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
〔１１〕
　前記〔１〕から〔９〕のいずれかにに記載のペプチドチオエステル体の製造方法に用いる第２中間体の製造方法であって、以下の工程（ａ）または（ｂ）：
（ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、
　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 [式中、
　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程
を含む、方法。
〔１２〕
　Ｃ末端に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基
[式中、Ｙは酸素原子またはＮＨ基であり、
　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。]
を有するペプチド鎖。
〔１３〕
　前記〔１２〕に記載の、Ｃ末端に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を有するペプチド鎖と、Ｎ末端にシステインを有するペプチド鎖をライゲーション法により結合する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
〔１４〕
　組換えタンパク質のＣ末端側に付加された精製用タグを除去する方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）Ｃ末端に精製用タグを含む組換えタンパク質において、システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、
　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、
　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程；及び
　（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程
を含む、方法。
　本発明により、ポリペプチド鎖を化学的にペプチドチオエステル体へと変換する新規な方法が提供された。
　本発明の方法は、従来のチオエステル化法に必要な、非天然型のアミノ酸誘導体やリンカー、または、特定の三次構造等を有さないペプチド鎖においてもチオエステル化が可能である。したがって、生合成などにより得られた長鎖のポリペプチド断片であっても、容易にチオエステル化することが可能となった。
　さらに、本発明の方法を従来のペプチド合成法と併用することにより、これまで合成が困難であったペプチドの一部分に修飾を有する長鎖ペプチドであっても、例えば、修飾を有さない部分は比較的長鎖を合成しやすい生合成法を用いてフラグメントを作成し、修飾を有する部分は固相合成法を用いてフラグメントを作成し、これらを連結することによって簡便に製造することが可能である。
　より具体的には、修飾が糖鎖であれば天然結合型の糖鎖を付加したアミノ酸を含む断片のみを化学合成し、その他の部分を生合成により調製して、本願の方法でチオエステル化し、連結することで、より長鎖の糖鎖ペプチドを簡便に製造可能である。
　また、リンカーを介してペプチド鎖に糖鎖等を後付けする方法が公知であり、これは生合成した長鎖ペプチドにも糖鎖の後付けが可能である。しかし、このリンカーを介した糖鎖結合方法は、特定のアミノ酸や構造を利用して糖鎖等を結合させるものである。したがって、例えば、糖鎖が結合可能な部位がペプチド中に複数存在する場合には、生合成により長鎖ペプチドを得た後に、所望の結合部位のみを含むペプチドフラグメントを長鎖ペプチドから切り出して糖鎖を付加し、本願のチオエステル化方法を用いて当該糖鎖付加ペプチドフラグメントをチオエステル化し、残りの部分と連結し直すことで、従来と比較してより簡便に部位選択的に糖鎖を付加することもできる。
　さらに、生合成においては、全長のタンパク質は正常に発現されても、ペプチドフラグメントの場合は細胞中でミスであると認識され、分解されるなど正常に発現されないこともありうる。全長タンパク質を生合成した後に、修飾をしたい部分のフラグメントのみを切りだして、必要な修飾等の処理を行ったうえで、本願の方法を用いて被修飾ペプチドフラグメントをチオエステル化し、残りの部分と連結し直し、所望の被修飾タンパク質を得ることも可能である。
　以上のように、本発明のペプチドチオエステル化方法は、タンパク質の合成全般において有用である。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
　本発明は、新規なペプチドチオエステル体の製造方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 [式中、
　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。]
で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 [式中、
　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。]
で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程；及び
　（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程
を含む、方法を提供する。
　本発明において、「ペプチド」とは、２以上のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されず、公知ペプチド及び新規ペプチド並びにペプチド改変体を含む。一般にタンパク質と呼ばれるものも、本発明においてはペプチド中に含むものとする。また、本発明においては「ポリペプチド」も、同様にペプチド中に含むものとする。本発明の方法に用いられるペプチド鎖は、天然のタンパク質であってもよいし、生合成、化学合成または無細胞合成等の方法によって得られたペプチド鎖であってもよい。
　本発明において、「ペプチド改変体」とは、ペプチドの自然変異体、翻訳後修飾体、又は人工的に改変した化合物を含む。そのような改変としては、例えば、ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化(例えばアセチル化)、アミド化(例えば、ペプチドのＣ末端のアミド化)、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
　本発明において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ser）、アスパラギン（Asn）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、アラニン（Ala）、チロシン（Tyr）、グリシン（Gly）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、グルタミン（Gln）、トレオニン（Thr）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、プロリン（Pro）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本発明におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。
　本発明で、チオエステル化されるペプチド鎖は、システイン残基を含むペプチド鎖であれば、特に限定されない。例えば、ペプチド鎖の由来や合成方法、サイズ等は特に限定されない。また修飾や保護基を有していてもよい。
　本発明で使用されるペプチド鎖が含むシステイン残基数は特に限定されないが、システイン残基を標的としてペプチド鎖が切断される。したがって、システイン残基を有する箇所に応じて、最終的に合成するタンパク質の基本骨格を設計する必要があるが、当業者であればこのような設計は容易になし得る。また、複数個のシステイン残基を含むペプチド鎖において、所望のシステイン残基の位置のみでチオエステル化を行い、残りのシステイン残基が反応の影響を受けないように、所望のシステイン残基以外のシステイン残基をあらかじめ保護基等で保護しておいてもよい。このような保護基の例としてはＡｃｍ基などが挙げられる。
　また、本発明で使用されるペプチド鎖は、Ｎ末端側に脂溶性の保護基を有していてもよい。好ましい保護基としては、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等のカルボニル含有基、アリル基、ベンジル基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の方法に用いられるペプチド鎖は、天然のタンパク質であってもよいし、生合成、化学合成または無細胞合成等の方法によって得られたペプチド鎖であってもよいが、好ましくは菌体もしくは細胞内で発現された組換えタンパク質である。組換えタンパク質は人為的に菌体内もしくは細胞内で発現させる限り、天然のタンパク質と同じペプチド配列を有するものであってもよいし、変異や精製用のタグなどの修飾を有するペプチド配列を有するものであってもよい。
　本発明で用いる組換えタンパク質は、当業者に公知の方法によって調製が可能である。例えば、組換えベクターに目的の遺伝子を導入して発現させることができる。本発明で用いる組換えベクターとしては、宿主細胞を形質転換し得るものであればよく、宿主細胞に応じて大腸菌用のプラスミド、枯草菌用のプラスミド、酵母用のプラスミド、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。これらには、その宿主細胞にてタンパク質を適切に発現させ得るプロモーター等の制御配列を有しているものが好ましい。また、宿主細胞としては、組換えベクターにて外来性遺伝子を発現できる物であればよく、一般的には、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
　宿主細胞に組換えベクターを移入する方法としては、一般的に常用されている方法を用いればよく、例えば、大腸菌の場合は塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法、酵母の場合は塩化リチウム法やエレクトロポレーション法が利用できる。また、動物細胞の形質転換は、エレクトロポレーション等の物理的方法、あるいは、リポソーム法やリン酸カルシウム法等の化学的方法、あるいはレトロウイルス等のウイルスベクターを用いて行なうことができる。形質転換体である宿主細胞の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。
　本発明で使用されるペプチドは、精製されていることが好ましい。ペプチドの精製方法は通常の一般的な精製により行うことができる。たとえば、組換えタンパク質であれば、本発明で使用される組換えタンパク質を発現する菌体あるいは細胞を培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりペプチドの粗抽出液を調製する。緩衝液中には、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ－１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた抽出液、あるいは培養上清中に含まれるペプチドの精製は、公知の精製方法によって行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過、ゲルろ過、電気泳動、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、ペプチドの分離、精製を行うことが可能である。
　また、組換えタンパク質の精製を容易にするために、発現ベクターに精製用タグを組み込んでおくこともできる。精製用タグの例としては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）などが挙げられる。本発明においては、ペプチド鎖内に配置されたＣｙｓよりＮ末端側をチオエステル化することから、ペプチドのＣ末端側に精製用タグを付加して精製後にチオエステル化することで、ペプチド鎖中のＣｙｓよりＣ末端側はタグごと切り捨てられ、効率よくペプチドチオエステル体を得ることができる。Ｃｙｓの位置をペプチド鎖上の所望の位置に配置することで、本発明の方法をＣ末端側のタグの除去に使用することも可能である。
　従って、本発明のペプチドチオエステル体の製造方法を用いて、組換えタンパク質のＣ末端に付加された精製用タグを除去する方法もまた、本発明に含まれる。
　本発明において、「ペプチドチオエステル体」（以下、単にチオエステル体と記載することもある）とはＣ末端にカルボキシチオエステル部分（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）を有するペプチドをいう。本発明で用いられるペプチドチオエステル体は、他のチオール基と交換反応を起こすことのできるチオエステル体であれば、特に限定されない。Ｒ基としては、例えば、下記のＲ４に例示される基が挙げられる。
　本発明の方法は、まず、（ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に化合物Ａを反応させることにより、第１中間体を作製する工程を行う。
　本発明において、化合物Ａは以下の式（Ｉ）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　式中、Ｘは硫黄原子または酸素原子であるが、好ましくは硫黄原子である。
　Ｒ１及びＲ２は、脱離基として、下記工程（ａ）の反応条件下において、置換される原子又は原子団よりも求核性が低く、脱離される機能を有するものであれば特に限定されないが、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ異なる脱離基であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２として具体的には、ハロゲン原子、置換もしくは非置換の－Ｏ－アルキル基、置換もしくは非置換の－Ｏ－アルケニル基、置換もしくは非置換の－Ｏ－アルキニル基、置換もしくは非置換の－Ｏ－アリール基、置換もしくは非置換の－Ｏ－ヘテロアリール基、置換もしくは非置換の－Ｓ－アルキル基、置換もしくは非置換の－Ｓ－アルケニル基、置換もしくは非置換の－Ｓ－アルキニル基、置換もしくは非置換の－Ｓ－アリール基、または、置換もしくは非置換の－Ｓ－ヘテロアリール基が挙げられる。Ｒ１及びＲ２としてより好ましくは、Ｒ１が置換もしくは非置換の－Ｏ－Ｃ６-１０アリール基、および、置換もしくは非置換の－Ｓ－Ｃ１－８アルキル基からなる群より選ばれる脱離基、および、Ｒ２が、ハロゲン原子、置換もしくは非置換の－Ｓ－Ｃ１－８アルキル基、置換もしくは非置換の－Ｓ－Ｃ６-１０アリール基からなる群より選ばれる脱離基、である組み合わせが挙げられる。
　本発明において、「アルキル基」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基であり、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素の部分集合を有する。アルキル基は、直鎖状または分岐鎖状の構造を含む。本発明のアルキル基として好ましくは、炭素原子数が１から８のアルキル基が挙げられる。なお、「Ｃ１－８アルキル基」とは、炭素原子数が１から８のアルキル基を示し、具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
　本発明において、「アルケニル基」とは、少なくとも１個の二重結合を有する１価の基である。二重結合および置換基の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニル基は、直鎖状または分岐鎖状を含む。本発明のアルケニル基として好ましくは、炭素原子数が２から８のアルケニル基が挙げられる。「Ｃ２－８アルケニル基」とは、炭素原子数が２から８のアルケニル基を示し、具体例としては、ビニル基、アリル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
　本発明において、「アルキニル基」とは、少なくとも１個の三重結合を有する、１価の基である。アルキニル基は、直鎖状または分岐鎖状のアルキニル基を含む。本発明のアルキニル基として好ましくは、炭素原子数が２から８のアルキニル基が挙げられる。「Ｃ２－８アルキニル基」とは、炭素原子数が２から８のアルキニル基を示し、具体例としては、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等が挙げられる。
　本発明において、「アリール基」とは、芳香族性の炭化水素環式基を意味する。本発明のアリール基として好ましくは、炭素原子数が６から１０のアリール基が挙げられる。「Ｃ６－１０アリール基」とは、炭素原子数が６から１０のアリール基を示し、具体的には、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。
　本発明において、「ヘテロアリール基」とは、ヘテロアリール環から任意の位置の水素原子を１または２個のぞいて誘導される１価または２価の基を意味する。本発明において、「ヘテロアリール環」とは、環を構成する原子中に１または複数個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環を意味し、好ましくは５－９員環である。環は単環であってもよいし、ベンゼン環または単環ヘテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリール基であってもよい。具体例としては、フラニル基、チオフェニル基、ピロリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチオフェニル基、インドリル基、ピリジル基、キノリニル基などが挙げられる。
　上述の脱離基が有する置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、置換基として、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アリール基、ホルミル基、カルボニル基、カルボキシル基、アルキルカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン、スルホニル基、または、ニトロ基などが挙げられる。
　本発明の化合物Ａとして、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 などを挙げることができる。
　また、上記の、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 にＭＰＡＡ（（４－カルボキシメチル）チオフェノール）を反応させた下記のチオノフォルメート化試薬、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 を用いることも可能である。
　本発明の化合物Ａをペプチド中のシステイン残基に反応させることによって、下記図のようにシステイン残基中のＳＨ基に－Ｃ（＝Ｘ）－Ｒ１基が結合した、第１中間体を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　本発明において、工程（ａ）は、酸性条件下が好ましく、特にｐＨ３～５で行うことが好ましい。反応は、緩衝液とアセトニトリルの混合溶媒中、０～５０℃、好ましくは１５～２５℃で、約０．１～３時間、好ましくは１０分～１時間行うのが好ましいが、これに限定されない。
　次いで、本発明の方法では、（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程を行う。
　本発明において、化合物Ｂは以下の式（ＩＩ）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　式中、Ｙは酸素原子、ＮＨ基、または、硫黄原子であり、Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。
　本発明において、「アシル基」とは、カルボン酸のカルボキシル基からＯＨ基を除いた原子団を意味する。本発明のアシル基として、好ましくは炭素原子数が１－４のアシル基が挙げられる。具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基等が挙げられる。
　本発明において、「アルコキシ基」とは、「アルキル基」が結合したオキシ基であることを意味する。本発明のアルコキシ基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。本発明のアルコキシ基として、好ましくは炭素原子数が１から１４の直鎖状アルコキシ基または炭素原子数が３から１４個の分岐鎖状アルコキシ基が挙げられる。具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、２－メチル－２－プロピルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－へキシルオキシ基等を挙げることができる。
　また、「Ｃ２－ｎアルコキシカルボニル基」とは、Ｃ１－（ｎ－１）のアルコキシ基を有するカルボニル基であることを意味する。本発明のアルコキシカルボニル基として、好ましくは炭素原子数が２から１５のアルコキシカルボニル基を挙げることができる。具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロピルオキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、２－メチル－２－プロピルオキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、ｎ－へキシルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
アシル基として、好ましくは、アセチル基が挙げられる。また、アルコキシカルボニル基として好ましくはtert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）が挙げられる。
　本発明の化合物Ｂとして、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 などを挙げることができる。
　本発明において、工程（ｂ）は、有機溶媒の存在下において行うのが好ましい。有機溶媒は溶解性が高く、かつ、求核性が低いものが好ましい。このような有機溶媒としては、例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジオキサン等を挙げることができる。反応は、０～５０℃、好ましくは１５～２５℃で、約１～２４時間、好ましくは５～１０時間行うのが好ましいが、これに限定されない。
　システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加することにより、下記図のように、システイン残基のＮ末端側でペプチド鎖が切断される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　なお、ペプチドの側鎖にアミノ基を有する場合には、本発明の工程（ｂ）を行う前に、側鎖のアミノ基に脂溶性の保護基を導入してもよい。脂溶性保護基としては、例えば、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等のカルボニル含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
　脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良いが、これに限定されない。
　工程（ｂ）においては、切断されたペプチド鎖の切断部よりもＮ末端側のペプチド断片を下記式（１）の第２中間体として得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　本発明のペプチドチオエステル体の製造方法は、さらに、（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程を含む。
　工程（ｃ）に用いる第２中間体は、工程（ｂ）の後に単離されていても、単離されていなくてもよい。
　好ましい態様において、前記工程（ｃ）には、以下の式（ＩＩＩ）で表わされるチオールが用いられる。
Ｒ４－ＳＨ　　（式ＩＩＩ）
　Ｒ４は、チオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素上での置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されない。好ましくは、Ｒ４は、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換のアリール基および置換もしくは非置換のアルキル基から選択されるいずれか一つの基であり、より好ましくは置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換のＣ６－１０アリール基、および、置換もしくは非置換のＣ１－８アルキル基から選択されるいずれか一つの基である。より具体的には、ベンジルメルカプタン等のベンジル型の脱離基、チオフェノール、４-(カルボキシメチル)-チオフェノール等のアリール型の脱離基、２-メルカプトエタンスルホン酸基、３-メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型の脱離基等から選択することができる。これらの脱離基が有する置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されない。
　工程（ｃ）を行うことにより、第２中間体は、下記図のように完全にチオエステル体へと変換される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　上述のようにして得られたペプチドチオエステル体は、ペプチド又は被修飾ペプチドのうち、－ＳＨ基を有するアミノ酸残基をＮ末端に含むペプチド(又は被修飾ペプチド)と、ライゲーション法を用いて連結することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により得られたペプチドチオエステル体と、Ｎ末端にシステインを有するペプチド鎖をライゲーション法により結合する工程を含む、ポリペプチドの製造方法もまた、提供する。
　また、上記ペプチドチオエステル体の代わりに、前記工程（ｂ）で得られた第２中間体を、ライゲーション法に使用することも可能である。
　本発明において、「ライゲーション法」とは、特許文献１に記載の天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法)のみならず、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体(例えば、トレオニン誘導体Ａ、保護メチオニン、糖鎖付加アミノ酸等)を含むペプチドについて、上記天然型化学的ライゲーション法を応用する場合をも含む。ライゲーション法により、連結部位に天然アミド結合(ペプチド結合)を有するペプチドを製造することができる。
　ライゲーション法を用いた連結は、ペプチド-ペプチド間、ペプチド-被修飾ペプチド間、被修飾ペプチド-被修飾ペプチド間の、いずれにおいても行うことができる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
実施例１．チオノフォルメート基の導入
（ＭＰＡＡフェニルチオノフォルメートの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
ＭＰＡＡ（（４－カルボキシメチル）チオフェノール）（９８ｍｇ，０．５８３ｍｍｏｌ）、フェニルクロロチオノフォルメート（Ｐｈｅｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｏ　ｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ）（１０３μＬ，０．７６ｍｍｏｌ）、をジクロロメタン（４００μＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。１時間後、反応溶液を室温にてクロロフォルム２．０ｍＬで希釈し、飽和重曹水１．０ｍＬを加え、この混合物をクロロフォルムにて抽出洗浄した。クロロフォルム層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に減圧濃縮し、黄色透明のシラップ状の残さを得た。これを以降のチオノフォルメート化試薬（ＭＰＡＡフェニルチオノフォルメート）として用いた（ＭＷ：３０５．３，ＭＳ　データなし）。
（ＭＰＡＡフェニルチオノフォルメート試薬によるチオノフォルメート基の導入）
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｘａａ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１），Ｘａａ＝Ｌｙｓ（配列番号：２），Ｓｅｒ（配列番号：３），Ａｓｐ（配列番号：４），Ａｌａ（配列番号：５），Ｖａｌ（配列番号：６），ｃｒｕｄｅ（Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｖａｌの混合物），６ｍｇ）をｐＨ５．５の緩衝溶液（１．０ｍＬ，０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ　Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解した後、アセトニトリル（２３０μＬ）に溶解したＭＰＡＡフェニルチオノフォルメート（１５μＬ）を全量加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い、目的化合物を得た。反応はＨＰＬＣの結果、定量的に行われていた。
（Ｘａａ＝Ｌｙｓ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８１８．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８１８．４）．
（Ｘａａ＝Ｓｅｒ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３）.
（Ｘａａ＝Ａｓｐ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０５．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０５．３）．
（Ｘａａ＝Ａｌａ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７６１．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７６１．３）．
（Ｘａａ＝Ｖａｌ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７８９．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　－－－）．
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｘａａ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１），Ｘａａ＝Ｓｅｒ（配列番号：３），Ｐｈｅ（配列番号：８），Ｌｅｕ（配列番号：７），ｃｒｕｄｅ（Ｓｅｒ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕの混合物），１０ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（２．０ｍＬ，０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ　Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（７００μＬ）に溶解したＭＰＡＡフェニルチオノフォルメート（５μＬ）を加えた。１．５時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い、目的化合物を得た。反応はＨＰＬＣの結果、定量的であった。
（Ｘａａ＝Ｓｅｒ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３）．
（Ｘａａ＝Ｌｅｕ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０３．４，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０３．３）．
（Ｘａａ＝Ｐｈｅ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８３７．４，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８３７．３）．
　システインのＮ末端側に隣接するアミノ酸の種類に関わらず、システインの－ＳＨ基にチオノフォルメート基が導入された。
実施例２．Ｎ－アセチルグアニジル化反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 （Ｘａａ＝Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｌｙｓで実施）
（Ｘａａ＝Ａｌａの場合）
Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：９）（０．２ｍｇ，０．２８μｍｏｌ）を２５０ｍＭ　Ｎ－アセチルグアニジン／ＤＭＳＯ溶液（２６０μｌ）に溶解した。２時間後Ｅｔ２Ｏにて化合物を沈殿、洗浄した。ＨＰＬＣにて目的物を精製し目的とするＮ－アセチルグアニジド体（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：１０））を得た（収率８０％、ＨＰＬＣ面積強度より計算した）。
（ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　５４８．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　５４８．４）
（Ｘａａ＝ＬｅｕまたはＰｈｅの場合）
Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１１）（０．１ｍｇ，０．１２μｍｏｌ）、Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１２）（０．１ｍｇ，０．１２μｍｏｌ）の混合物を２５０ｍＭ　Ｎ－アセチルグアニジン／ＤＭＳＯ溶液（１００μＬ）に溶解した。４．５時間後Ｅｔ２Ｏにて化合物を沈殿、洗浄した。ＨＰＬＣにて目的物を精製し、目的とするＮ－アセチルグアニジド体（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｅｕ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：１３）、および、Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｈｅ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：１４））を得た（収率８０％、ＨＰＬＣ面積強度より計算した）。
（Ｘａａ＝Ｌｅｕ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　５９０．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　５９０．３）．
（Ｘａａ＝Ｐｈｅ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　６２４．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　６２４．３）
（Ｘａａ＝Ｓｅｒの場合）
Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１５）（０．２ｍｇ，０．２６μｍｏｌ）を２５０ｍＭ　Ｎ－アセチルグアニジン／ＤＭＳＯ溶液（１００μＬ）に溶解した。３．５時間後Ｅｔ２Ｏにて化合物を沈殿、洗浄した。ＨＰＬＣにて目的物を精製し目的とするＮ－アセチルグアニジド体（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：１６））を得た（収率７０％、ＨＰＬＣ面積強度より）
（Ｘａａ＝Ｌｙｓの場合）
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１７），０．１ｍｇ）をＢｏｃ２Ｏ（０．３ｍｇ），トリエチルアミン（０．１４μＬ）を含んだＤＭＳＯ（３０μＬ）に溶解した。１．５時間後反応溶液をＥｔ２Ｏで沈殿、洗浄した。得られた残さを２５０ｍＭ　Ｎ－アセチルグアニジン／ＤＭＳＯ溶液（１００μｌ）に溶解した。２．５時間後、ＨＰＬＣにて目的物を精製し目的とするＮ－アセチルグアニジド体（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：１８））を得た（収率７０％、ＨＰＬＣ面積強度より計算した）。
　システインのＮ末端側に隣接するアミノ酸の種類に関わらず、チオノフォルメート化されたシステイン残基のＮ末端側ペプチド結合へのグアニジンの反応性があることが確認された。
実施例３．２４ａａペプチドのチオエステル化
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
ペプチド（Ｈ２Ｎ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：１９）（ｃｒｕｄｅ（未精製））、適当量（推定１ｍｇ程度）をｐＨ５．０の緩衝溶液（３００μＬ，０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ　Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（１００μＬ）に溶解したＭＰＡＡフェニルチオノフォルメート（１μＬ）を全量加えた。５０分後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的化合物（Ｈ２Ｎ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：２０））を得た。なお、第３位のＣｙｓは、チオノフォルメート試薬の影響を受けないように、あらかじめＡｃｍにより保護した。
（ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１５５３．８，［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１０３５．８，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１５５２．９，［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１０３５．７））
　ペプチド（Ｈ２Ｎ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（Ｃ（Ｓ）ＯＰｈ）Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：２０），ｃａ．　０．３ｍｇ）をＢｏｃ２Ｏ（０．４ｍｇ），トリエチルアミン（０．０３μＬ）を含んだＤＭＳＯ（２０μＬ）に溶解した。１．５時間後反応溶液をＥｔ２Ｏで沈殿、洗浄した。得られた残さを２５０ｍＭ　Ｎ－アセチルグアニジン／ＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）に溶解した。２．５時間後、ＨＰＬＣにて目的物を精製し目的とするＮ－アセチルグアニジド体（ＢｏｃＨＮ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：２１））を得た。
（ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１５４６．８，［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１０３１．５，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１５４７．０，［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１０３１．４））
　２４ａａペプチド（ＢｏｃＨＮ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ） Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＡｃ（配列番号：２１），ｃａ．　０．１ｍｇ>）をＭＥＳＮａ（ｓｏｄｉｕｍ　２－ｓｕｌｆａｎｙｌｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（１ｍｇ，２％　ｖ／ｖ）を含むｐＨ７．０５の緩衝溶液（０．２Ｍ　リン酸、６Ｍグアニジン，５０μｌ）に溶解した。３．５時間後、ＨＰＬＣにて目的物を精製しチオエステル体（ＢｏｃＨＮ－Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ－ＳＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３（配列番号：２２））を得た（収率不明、ＨＰＬＣ上では約７０％）。
（ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ　＋　２Ｈ］２＋　１５６７，３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１５６６．８，）
実施例４．クロロチオノフォルメート試薬によるチオノフォルメート基の導入
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：５），６ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（９６１μＬ，０．２Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（３２０μＬ）に溶解したＰｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ（６．５μＬ）を加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的のチオノフォルメート化ペプチド（配列番号：９）を得た（６．４ｍｇ，８８％）
（Ｘａａ＝Ａｌａ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７６１．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７６１．３）
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：７），３．４ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（５１０μＬ，０．２Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（１７０μＬ）に溶解したＰｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ（３．５μＬ）を加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的のチオノフォルメート化ペプチド（配列番号：１１）を得た（３．８ｍｇ，９２％）
（Ｘａａ＝Ｌｅｕ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０３．４，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８０３．３）．
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：８），５．１ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（７２９μＬ，０．２Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（２４３μＬ）に溶解したＰｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ（５．０μＬ）を加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的のチオノフォルメート化ペプチド（配列番号：１２）を得た（５．１ｍｇ，８４％）
（Ｘａａ＝Ｐｈｅ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８３７．４，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８３７．３）
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：３），４．９ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（７６６μＬ，０．２Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（２６５μＬ）に溶解したＰｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ（５．２μＬ）を加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的のチオノフォルメート化ペプチド（配列番号：１５）を得た（５．５ｍｇ，９２％）
（Ｘａａ＝Ｓｅｒ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　７７７．３）
ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ－ＯＨ（配列番号：２），５．５ｍｇ）をｐＨ５．０の緩衝溶液（８１０μＬ０．２Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，６Ｍ Ｇｎ－ＨＣｌ）に溶解し、アセトニトリル（２７０μＬ）に溶解したＰｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ（５．５μＬ）を加えた。１時間後Ｅｔ２Ｏで反応溶液を洗浄した。ＨＰＬＣにて精製を行い目的のチオノフォルメート化ペプチド（配列番号：１７）を得た（６．１ｍｇ，９４％）
（Ｘａａ＝Ｌｙｓ，ＥＳＩＭＳ　ｃａｌｃｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８１８．３，ｆｏｕｎｄ　［Ｍ＋Ｈ］＋　８１８．４）．
　クロロチオノフォルメート試薬によっても、実施例１で得られたものと同様のチオノフォルメート化されたペプチド鎖が得られた。したがってクロロチオノフォルメート試薬によりチオノフォルメート基が導入されたペプチド鎖からも、上述の実施例１および３でチオノフォルメート基を導入したペプチド鎖と同様の方法で、Ｎ－アセチルグアニジド化、次いでチオエステル化を行うことにより、ペプチドチオエステル体を得ることができることが明らかになった。
　本発明により、ポリペプチド鎖を化学的にペプチドチオエステル体へと変換する新規な方法が提供された。
　本発明の方法は、従来のチオエステル化法に必要な、非天然型のアミノ酸誘導体やリンカー、または、特定の三次構造等を有さないペプチド鎖においてもチオエステル化が可能であり、生合成などにより得られた長鎖のポリペプチド断片であっても、容易にチオエステル化することが可能である。したがって、本発明のペプチドチオエステル化方法は、タンパク質の合成全般において利用可能である。

Claims (14)

  1. 　ペプチドチオエステル体の製造方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
    で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
    　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、
    　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
    　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
    で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程；及び
    　（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程
    を含む、方法。
  2. 　Ｘが硫黄原子である請求項１に記載の方法。
  3. 　Ｒ１が、－Ｏ－Ｃ６アリール基である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　Ｒ２が、ハロゲン原子、または、置換もしくは非置換の－Ｓ－Ｃ６－１０アリール基である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　ＹがＮＨ基である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 　Ｒ３が、アセチル基である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記工程（ｃ）において、前記チオールが以下の式（ＩＩＩ）；
    Ｒ４－ＳＨ　　（式ＩＩＩ）
    [式中、Ｒ４は、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換のアリール基、および、置換もしくは非置換のアルキル基から選択されるいずれか一つの基である。]
    で表わされるチオールである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 　ペプチド鎖が、組換えタンパク質である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 　ペプチド鎖が、精製用タグを含む組換えタンパク質である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項１から９のいずれかに記載の方法で得られたペプチドチオエステル体と、Ｎ末端にシステインを有するペプチド鎖をライゲーション法により結合する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
  11. 　請求項１から９のいずれかに記載のペプチドチオエステル体の製造方法に用いる第２中間体の製造方法であって、以下の工程（ａ）または（ｂ）：
    （ａ）システイン残基を有するペプチド鎖において、前記システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、
    　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
    で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
    　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     [式中、
    　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
    　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
    で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程
    を含む、方法。
  12. 　Ｃ末端に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基
    [式中、Ｙは酸素原子またはＮＨ基であり、
    　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。]
    を有するペプチド鎖。
  13. 　請求項１２に記載のＣ末端に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を有するペプチド鎖と、Ｎ末端にシステインを有するペプチド鎖をライゲーション法により結合する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
  14. 　組換えタンパク質のＣ末端側に付加された精製用タグを除去する方法であって、以下の工程（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）Ｃ末端に精製用タグを含む組換えタンパク質において、システイン残基のチオール基に、以下の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、
    　Ｘは硫黄原子または酸素原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、脱離基である。］
    で表わされる化合物Ａを反応させることによりＲ２を脱離させ、第１中間体を作製する工程；
    　（ｂ）有機溶媒中で、前記第１中間体に以下の式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、
    　Ｙは酸素原子、硫黄原子、または、ＮＨ基であり、
    　Ｒ３は、水素原子、アシル基、または、アルコキシカルボニル基である。］
    で表わされる化合物Ｂを反応させ、前記システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸との間のペプチド結合を形成するカルボキシル基に－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基を付加し、前記ペプチド結合を切断することにより、切断された前記ペプチド結合よりもＮ末端側のペプチド断片を第２中間体として得る工程；及び
    　（ｃ）前記第２中間体にチオールを反応させて、Ｃ末端の－ＮＨ－Ｃ（＝Ｙ）ＮＨＲ３基とチオール基とを交換させることにより、第２中間体のＣ末端をチオエステル化する工程
    を含む、方法。
PCT/JP2010/060443 2009-06-26 2010-06-21 ペプチドチオエステル体の製造方法 WO2010150730A1 (ja)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011519878A JP5730197B2 (ja) 2009-06-26 2010-06-21 ペプチドチオエステル体の製造方法
DK10792048.0T DK2450364T3 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for preparing a peptide thioester
CN201080028424.9A CN102803286B (zh) 2009-06-26 2010-06-21 肽硫酯的制造方法
CA2766040A CA2766040C (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
RU2012102519/04A RU2529998C2 (ru) 2009-06-26 2010-06-21 Способ получения тиоэфира пептида
BRPI1016151-1A BRPI1016151B1 (pt) 2009-06-26 2010-06-21 processo para produção de um tioéster de peptídeo, processos para a produção de um polipeptídeo, processo para a produção de um segundo intermediário utilizado para o processo para a produção do tioéster de peptídeo e processo para a remoção de uma marca para a purificação adicionada a um lado terminal c de uma proteína recombinante
EP10792048.0A EP2450364B1 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
SG2011089158A SG176300A1 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
US13/379,832 US8642725B2 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
AU2010263701A AU2010263701B2 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
KR1020127001146A KR101676515B1 (ko) 2009-06-26 2010-06-21 펩티드 티오에스테르체의 제조방법
US14/162,642 US9127041B2 (en) 2009-06-26 2014-01-23 Process for production of peptide thioester

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009151713 2009-06-26
JP2009-151713 2009-06-26

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/379,832 A-371-Of-International US8642725B2 (en) 2009-06-26 2010-06-21 Process for production of peptide thioester
US14/162,642 Division US9127041B2 (en) 2009-06-26 2014-01-23 Process for production of peptide thioester

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010150730A1 true WO2010150730A1 (ja) 2010-12-29

Family

ID=43386499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/060443 WO2010150730A1 (ja) 2009-06-26 2010-06-21 ペプチドチオエステル体の製造方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8642725B2 (ja)
EP (1) EP2450364B1 (ja)
JP (1) JP5730197B2 (ja)
KR (1) KR101676515B1 (ja)
CN (1) CN102803286B (ja)
AU (1) AU2010263701B2 (ja)
BR (1) BRPI1016151B1 (ja)
CA (1) CA2766040C (ja)
DK (1) DK2450364T3 (ja)
RU (1) RU2529998C2 (ja)
SG (1) SG176300A1 (ja)
TW (1) TWI485156B (ja)
WO (1) WO2010150730A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047372A1 (ja) 2011-09-26 2013-04-04 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022143532A1 (zh) * 2020-12-28 2022-07-07 江苏金斯瑞生物科技有限公司 一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034878A1 (en) 1995-05-04 1996-11-07 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
WO2007043615A1 (ja) * 2005-10-14 2007-04-19 Osaka University ペプチドエステル試薬、およびそのライゲーションまたはチオエステル化合物の製造のための使用
WO2007114454A1 (ja) 2006-03-29 2007-10-11 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドのチオエステル化合物の製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2539483A (en) * 1945-03-28 1951-01-30 Simon L Ruskin Urea ascorbate and complexes containing the same and process for their manufacture
NL6513990A (ja) * 1964-10-29 1966-01-25
GB0113657D0 (en) * 2001-06-05 2001-07-25 Geneprot Inc Improved native chemical ligation with three or more components
KR101534881B1 (ko) * 2007-07-31 2015-07-07 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 펩티드의 제조방법
WO2009042668A2 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Urea-containing peptides as inhibitors of viral replication

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034878A1 (en) 1995-05-04 1996-11-07 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
WO2007043615A1 (ja) * 2005-10-14 2007-04-19 Osaka University ペプチドエステル試薬、およびそのライゲーションまたはチオエステル化合物の製造のための使用
WO2007114454A1 (ja) 2006-03-29 2007-10-11 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドのチオエステル化合物の製造方法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRASK J. ET AL.: "Fmoc solid-phase synthesis of peptide thioesters by masking as trithioortho esters", ORG. LETT., vol. 5, no. 16, 2003, pages 2951 - 2953, XP008149114 *
INGENITO ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 121, 1999, pages 11369 - 11374
JOHNSON EC. ET AL.: "Insights into the mechanism and catalysis of the native chemical ligation reaction", J. AM. CHEM. SOC., vol. 128, no. 20, 2006, pages 6640 - 6646, XP008149115 *
MUIR, ANNU. REV. BIOCHEM., vol. 72, 2003, pages 249 - 289
NAKAGAWA ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 116, 1994, pages 5513 - 5514
OKAMOTO R. ET AL.: "Efficient substitution reaction from cysteine to the serine residue of glycosylated polypeptide: repetitive peptide segment ligation strategy and the synthesis of glycosylated tetracontapeptide having acid labile sialyl-T(N) antigens", J. ORG. CHEM., vol. 74, no. 6, May 2009 (2009-05-01), pages 2494 - 2501, XP055008165 *
PASCAL ET AL., TETRAHEDRON LETTERS, vol. 35, no. 34, 1994, pages 6291 - 6294
SCHWARTZ ET AL., CHEMCOMMUN, 2003, pages 2087 - 2090
See also references of EP2450364A4
SOLA ET AL., J. CHEM. SOC. CHEM. COMMUN., 1993, pages 1786 - 1788
STARK GR, METHODS OF ENZYMOLOGY, vol. 47, 1977, pages 129 - 132

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047372A1 (ja) 2011-09-26 2013-04-04 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
CN104080796A (zh) * 2011-09-26 2014-10-01 株式会社糖锁工学研究所 适于ncl法的多肽片段的有效率的制造方法
JPWO2013047372A1 (ja) * 2011-09-26 2015-03-26 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
TWI549963B (zh) * 2011-09-26 2016-09-21 糖鎖工學研究所股份有限公司 適於ｎｃｌ法之多胜肽片段之有效率的製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20140249294A1 (en) 2014-09-04
RU2012102519A (ru) 2013-08-10
BRPI1016151B1 (pt) 2021-01-19
CN102803286B (zh) 2015-01-14
US20120178905A1 (en) 2012-07-12
CA2766040C (en) 2018-05-01
CN102803286A (zh) 2012-11-28
SG176300A1 (en) 2012-01-30
EP2450364A4 (en) 2014-07-02
TW201100445A (en) 2011-01-01
KR20120039637A (ko) 2012-04-25
BRPI1016151A2 (pt) 2016-04-19
CA2766040A1 (en) 2010-12-29
JP5730197B2 (ja) 2015-06-03
JPWO2010150730A1 (ja) 2012-12-10
US8642725B2 (en) 2014-02-04
EP2450364B1 (en) 2016-11-09
TWI485156B (zh) 2015-05-21
AU2010263701A1 (en) 2011-12-15
US9127041B2 (en) 2015-09-08
EP2450364A1 (en) 2012-05-09
DK2450364T3 (en) 2017-01-16
KR101676515B1 (ko) 2016-11-15
RU2529998C2 (ru) 2014-10-10
AU2010263701B2 (en) 2014-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI405770B (zh) Production of peptides
JP5730197B2 (ja) ペプチドチオエステル体の製造方法
US9023957B2 (en) Compound for use in peptide synthesis
JP6186278B2 (ja) Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
US20050096456A1 (en) Compounds comprising pseudo-amino acids
Pedone et al. DESIGNANDCHARACTERIZA TION OF MOLECULAR SCAFFOLDS

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080028424.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10792048

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011519878

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010263701

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010263701

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20100621

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2766040

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20127001146

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 691/CHENP/2012

Country of ref document: IN

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010792048

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010792048

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012102519

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13379832

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI1016151

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI1016151

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20111226