TWI485156B - 胜肽硫酯體之製造方法 - Google Patents

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Description

胜肽硫酯體之製造方法
本發明係有關於胜肽硫酯體之製造方法。
在蛋白質的合成上，已知有生物合成、化學合成、無細胞合成等各種方法。在生物合成方法中係藉由利用大腸桿菌等的細胞內部，將對以合成為目的之蛋白質進行編碼的DNA導入細胞內部來表現而製得蛋白質。化學合成係藉由將胺基酸以有機化學方式依序結合來合成目的蛋白質。又，無細胞合成則利用存在於大腸桿菌等各種細胞內的酵素等，以無細胞方式來合成蛋白質。此等方法可依據蛋白質的使用目的、尺寸、或所附加之性質等來適當地分開使用或組合。
為了在胺基酸序列的中間部分合成均勻地具有糖鏈或脂質等特定修飾的蛋白質，現今係採用有預先使用以糖鏈或脂質等修飾的胺基酸，對其周邊的胜肽鏈進行化學合成的方法。
作為對胜肽鏈進行化學合成的方法主要是採用固相合成法。然而，由固相合成法所得之胜肽鏈一般上為短鏈，最長也只是50個殘基左右而已。
因此，為了合成具修飾之長鏈的胜肽鏈，主要是採用分別調製短胜肽鏈後再將此等來連接的方法。作為胜肽鏈連接方法雖報導有各種方法，但廣泛採用的方法之其中之一係為自然化學連接法(Native Chemical Ligation，NCL法)。已知NCL法即使是無保護之這些胜肽鏈彼此也可進行，為用於在連接部位(ligation部位)上生成天然醯胺鍵(胜肽鍵)之有用的方法(例如專利文獻1)。NCL法係為C末端上具有α羧基硫酯部分之第1胜肽、與N末端上具有半胱胺酸殘基之第2胜肽的化學選擇反應，半胱胺酸之側鏈的硫醇基(SH基，亦稱為硫氫基)與硫酯基的羰基碳選擇性地進行反應，再經由硫醇交換反應即生成硫酯鍵初期中間體。此中間體自發性地進行分子內重排(intramolecular rearragement)而在連接部位上提供天然醯胺鍵之結合，另一方面使半胱胺酸側鏈硫醇再次產生。
此方法為能夠僅使用無保護之胜肽在緩衝溶液中進行混合，而經由胜肽鍵將兩個胜肽鏈連接的方法。NCL法即使為如胜肽般具有多數官能基之化合物彼此間的反應，亦可選擇性地將其中一者的胜肽C末端與另一者的胜肽N末端連接。由此觀點而言，為了對蛋白質進行化學合成，重要的是如何來利用NCL法。
然而，NCL法之利用上的問題點為：可舉出調製所需之C末端上具有α羧基硫酯部分的胜肽硫酯體來作為原料。胜肽硫酯的調製法雖報導有各種方法，惟一般上可分類成基於固相合成法的兩種類型。
第一種為在樹脂上建構胜肽硫酯的方法。此方法能夠從來自建構胜肽後之樹脂將胜肽鏈切斷而製得胜肽硫酯(e.g. Boc固相合成法、Fmoc固相合成法)。第二種為在硫酯經由相等的連接子(linker)將胜肽鏈建構於固相上的方法(Safety Catch linker,Fujii Method,Dawson Method,Mercapto propanol method,Kawakami method,Danishefsky method,Hojo method,Aimoto method,etc.)。該方法為將透過連接子進行適當處理所建構的胜肽鏈C末端活性化後，對胜肽鏈進行硫解(thiolysis)而製得硫酯的方法(非專利文獻1)。
即使在這些之外，亦報導有由固相合成對側鏈進行保護，並合成僅C末端之羧基為如游離之類的保護胜肽後，再以適當的縮合條件進行硫酯化之方法(例如專利文獻2)。以上任何方法皆為已確立之方法，並且在過去的各種蛋白質合成中被採用。然而，任一種方法皆受限於固相合成法之故，因此能夠合成出來的胜肽硫酯體的尺寸便會受到限制。再者，在使用連接子的方法中，必須對非天然胺基酸衍生物或特別的衍生物進行其他方式之化學合成，因而其步驟未必稱得上是簡便。
在解決採用固相合成法之硫酯化的限制的方法上既有內含肽法(Intein法)(非專利文獻2)。此為可製得藉由細胞進行生物合成之聚胜肽片段作為硫酯體的方法。在Intein法中，係藉由利用在特定蛋白質序列所產生之蛋白質剪接(splicing)功能進行胜肽鏈的硫酯化而製得聚胜肽鏈作為硫酯體。此方法的有用之處在於可製得長鏈的胜肽硫酯。藉由將此方法與化學合成法組合，即使是到目前為止被認為是難以合成之如大型被修飾蛋白質亦可被合成(非專利文獻3)。表現聚胜肽鏈所得之方法業已作成大量研究，充分被確立為生物學上的基本技術。
然而，在採用Intein法時不僅使聚胜肽表現，為了使蛋白質剪接發揮功能則需要有作為標的之胜肽序列，又所表現之內含肽複合蛋白質必須折疊而取得固有的三維結構。因此，藉由進行表現的聚胜肽序列未必能製得胜肽硫酯，通常伴隨著充分條件的最佳化，作業上的煩雜便會跟隨而至。
另一方面，作為胜肽的切斷方法，已知有使化合物與胜肽中之半胱胺酸殘基的SH基反應，藉此在上述半胱胺酸殘基的位置處切斷胜肽鏈的方法(非專利文獻4、5)、或使用連接子切斷結合於固相上之胜肽的方法(非專利文獻6、7)。又，已知有使用溴化氰(CNBr)切斷甲硫胺酸(methionine)殘基之C末端之一側的胜肽鍵的方法。然而，此等並非為製得胜肽片段作為硫酯體的方法。
【先前技術文獻】
【專利文獻1】國際公開WO96/34878號
【專利文獻2】國際公開WO2007/114454號
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Ingenito et al.,J. Am. Chem. Soc. 1999,121,11369－11374
【非專利文獻2】Schwartz et al.,CHEM. COMMUN.,2003 2087－2090
【非專利文獻3】Muir,Annu. Rev. Biochem. 2003. 72：249－289
【非專利文獻4】Stark GR,Methods of Enzymology,1977,47,129－132.
【非專利文獻5】Nakagawa et al.,J. Am. Chem. Soc. 1994,116,5513－5514
【非專利文獻6】Sola et al.,J. Chem. Soc.,Chem. Commun.,1993,1786－1788
【非專利文獻7】Pascal et al.,Tetrahedron Letters,1994,Vol.35,No.34,6291－6294
在如上述背景技術所示之胜肽硫酯化法中，係僅限於對可進行硫酯化之胜肽進行固相合成的胜肽鏈、或作為蛋白質剪接之標的之胜肽鏈。此為該任何方法皆需要有非天然胺基酸衍生物、連接子、特定三維結構等之故。
因此，本發明之課題在於提供一種將聚胜肽鏈以化學方式轉換成胜肽硫酯體的新穎方法。
本發明者等人考量到須有將胜肽序列中的天然胺基酸殘基作為標的，選擇性地使胜肽C末端活性化的方法。只要為此種方法，即使是以生物合成等任何方法所得之胜肽，亦可選擇性地使胜肽鏈活性化而進行硫酯化。
因此，本發明者等人著眼於天然胺基酸中作為特殊含硫胺基酸之半胱胺酸殘基。爾後發現：如下圖所示在半胱胺酸殘基的硫醇基上導入－C(=X)－R1 基，對此，在有機溶劑中使具有以－NH－C(=Y)NHR3 表示之脫離基的化合物反應，藉此在半胱胺酸殘基之N末端側的胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，上述胜肽鍵則被切斷且C末端之一側的胜肽片段被切除。更進一步發現透過下述與硫醇的交換反應：藉由使硫醇化合物與附加有此－NH－C(=Y)NHR3 基的胜肽鏈在緩衝溶液中反應，對鍵結有－NH－C(=Y)NHR3 基的羰基碳而言便鍵結有上述硫醇的硫醇基，上述－NH－C(=Y)NHR3 基則脫離，即可轉換成胜肽硫酯。
作為上述一例，具體而言，首先在半胱胺酸殘基的硫醇基上導入硫代甲酸酯(thionoformate)基。然後對此，硫代甲酸酯基在有機溶劑中使N－乙醯胍(N－acetyl guanidine)反應，在半胱胺酸殘基的N末端側發生胜肽鏈的切斷，即製得對C末端進行N－乙醯胍化反應的胜肽鏈。再者，使此N－乙醯胍化反應之胜肽鏈在緩衝溶液中與硫醇R4 －SH反應，即轉換為胜肽硫酯。
又發現由上述所得之對C末端進行N－乙醯胍化反應之胜肽鏈及胜肽硫酯體可利用於NCL法中。
【化1】
即，本發明具體而言提供以下[1]～[14]。
[1]一種方法，為胜肽硫酯體的製造方法，係包含以下步驟(a)～(c)：
(a)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使由以下式(I)：
【化2】
[式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基]
表示之化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；
(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)：
【化3】
[式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基]
表示之化合物B與上述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，再切斷上述胜肽鍵，以製得比被切斷之上述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟；以及
(c)藉由使硫醇與上述第2中間體反應，再使C末端的－NH－C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
[2]如上述[1]所述之方法，其中，X為硫原子。
[3]如上述[1]或[2]所述之方法，其中，R1 為－O－C6 芳基。
[4]如上述[1]至[3]中任一項所述之方法，其中，R2 為鹵素原子、取代或非取代之－S－C6-10 芳基。
[5]如上述[1]至[4]中任一項所述之方法，其中，Y為NH基。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所述之方法，其中，R3 為乙醯基。
[7]如上述[1]至[6]中任一項所述之方法，其中，在上述步驟(C)中，上述硫醇為由以下式(III)：
R4 －SH　(式III)
[式中，R4 為由取代或非取代之苯甲基、取代或非取代之芳基、及取代或非取代之烷基所選擇之任一種基團]
表示之硫醇。
[8]如上述[1]至[7]中任一項所述之方法，其中，胜肽鏈為重組蛋白質。
[9]如上述[1]至[8]中任一項所述之方法，其中，胜肽鏈為含有精製用標記物之重組蛋白質。
[10]一種聚胜肽之製造方法，係包含將以上述[1]至[9]中任一項所述之方法而得的胜肽硫酯體、與N末端上具有半胱胺酸的胜肽鏈藉由連接法結合的步驟。
[11]一種方法，為用於上述[1]至[9]中任一項所述之胜肽硫酯體的製造方法的第2中間體的製造方法，包含以下步驟(a)或(b)：
(a)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使由以下式(I)：
【化4】
[式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基]
表示之化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；
(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)：
【化5】
[式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基]
表示之化合物B與上述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，再切斷上述胜肽鍵，以製得比被切斷之上述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟。
[12]一種胜肽鏈，其在C末端上具有－NH－C(=Y)NHR3 基，[式中，Y為氧原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基]。
[13]一種聚胜肽之製造方法，係包含將上述[12]所述之C末端上具有－NH－C(=Y)NHR3 基的胜肽鏈、與N末端上具有半胱胺酸的胜肽鏈藉由連接法結合之步驟。
[14]一種方法，為除去附加於重組蛋白質之C末端之一側的精製用標記物的方法，係包含以下步驟(a)～(c)：
(a)在C末端上含有精製用標記物之重組蛋白質中，藉由使由以下式(I)：
【化6】
[式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基]
表示之化合物A與半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；
(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)：
【化7】
[式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基]
表示之化合物B與上述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，再切斷上述胜肽鍵，以製得比被切斷之上述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟；以及
(c)藉由使硫醇與上述第2中間體反應，再使C末端的－NH－C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
根據本發明，提供一種將聚胜肽鏈以化學方式轉換成胜肽硫酯體的新穎方法。
就本發明之方法，即使不具有在習知硫酯化法中必需之非天然胺基酸衍生物、連接子或特定三維結構等的胜肽鏈上亦可進行硫酯化。因此，即使為經由生物合成等所得之長鏈聚胜肽片段，亦可簡易地進行硫酯化。
再者，藉由將本發明之方法與習知胜肽合成法併用，即便是到目前為止難以合成之在胜肽一部分上具有修飾的長鏈胜肽，例如對不具有修飾之部分採用易於合成較長鏈之生物合成(生合成)法來製造片段，對具修飾之部分採用固相合成法來製造片段，再將該等片段連接，藉此即可簡便地製造。
更具體而言，只要為糖鏈之修飾，藉由僅對包含附加有天然結合型糖鏈之胺基酸的片段進行化學合成，對其他部分經由生物合成來調製，再以本案之方法進行硫酯化並予以連接，即可簡便地製造更為長鏈之糖鏈胜肽。
又，經由連接子將糖鏈等後續附加於胜肽鏈之方法為週知，其即使在生物合成之長鏈胜肽上亦可進行糖鏈之後續附加。然而，此經由連接子之糖鏈結合方法係利用特定之胺基酸或結構來結合糖鏈等。因此，例如當糖鏈於胜肽中存在多個可結合之部位時，亦可透過在經由生物合成製得長鏈胜肽後，從長鏈胜肽切割出僅含所要求之結合部位的胜肽片段並附加糖鏈，使用本案之硫酯化方法對該糖鏈附加胜肽片段進行硫酯化，再與其餘部分重新連接，而較習知更為簡便且部位選擇性地附加糖鏈。
再者，在生物合成中即使全長蛋白質正常地表現，在胜肽片段在細胞中仍會有錯誤處(miss)，亦可能被分解等而未正常地表現。也可對全長蛋白質進行生物合成後，切割出僅欲修飾之部分的片段進行必要的修飾等處理，並且使用本案方法對被修飾胜肽片段進行硫酯化，再與其餘部分重新連接，而可製得所要求之被修飾蛋白質。
如以上所述，本發明之胜肽硫酯化方法在蛋白質的整體合成中係為有用。
以下就本發明之較佳實施型態進行說明。
本發明提供一種方法，為新穎胜肽硫酯體之製造方法，係包含以下步驟(A)～(C)：
(A)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使由以下式(I)：
【化8】
[式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基。]
表示之化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；
(B)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)：
【化9】
[式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基。]
表示之化合物B與上述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，再切斷上述胜肽鍵，以製得比被切斷之上述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟；以及
(C)藉由使硫醇與上述第2中間體反應，再使C末端的－NH－C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
本發明中所謂「胜肽」只要是2個以上的胺基酸經由醯胺鍵結合者並無特殊限定，包含週知胜肽與新穎胜肽、以及胜肽變體(peptide variant)。在本發明中一般而言亦使被稱為「蛋白質」的物質包含於胜肽中。又，本發明中亦使「聚胜肽」同樣地包含於胜肽中。用於本發明之方法的胜肽鏈既可為天然蛋白質，也可為經由生物合成、化學合成或無細胞合成等方法所得之胜肽鏈。
本發明中「胜肽變體」係包含胜肽之自然變異體、轉譯後修飾體或以人工修飾(artificially modified)之化合物。作為此種修飾可例舉如胜肽的一個或多個胺基酸殘基之烷基化(alkylation)、醯基化(例如乙醯化)、醯胺基化(例如胜肽C末端之醯胺基化)、羧基化(carboxylation)、酯形成、雙硫鍵形成、糖基化(glycosylation)、脂質化、磷酸化、氫氧化、標記成分之結合等。
本發明中「胺基酸」係指以其最廣之意義來使用，不僅含天然胺基酸例如絲胺酸(Ser)、天門冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、賴胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩胺醯胺(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)，亦含胺基酸突變體及衍生物之類的非天然胺基酸。只要是該行業人士考量該廣泛定義可理解：作為本說明書中的胺基酸，可例舉如L－胺基酸、D－胺基酸、胺基酸突變體及衍生物等經化學修飾之胺基酸；正白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等在生物體內不作為蛋白質之構成材料的胺基酸；及具有該行業人士所週知之胺基酸的特性且以化學方式合成的化合物等。
本發明中經硫酯化之胜肽鏈，只要是含有半胱胺酸殘基的胜肽鏈並無特殊限定，並未限定於例如胜肽鏈之來源或合成方法、尺寸等。又，亦可具修飾或保護基。
本發明中使用之胜肽鏈所含的半胱胺酸殘基數並無特殊限定，惟能夠以半胱胺酸殘基作為標的來切斷胜肽鏈。因此，依據具有半胱胺酸殘基之處所，雖有必要對最終所合成之蛋白質的基本骨架進行設計，但只要是該行業人士即可輕易地完成此種設計。又，亦可在含有多個半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，僅於所要求之半胱胺酸殘基的位置處進行硫酯化，並亦可預先將所要求之半胱胺酸殘基以外的半胱胺酸殘基以保護基等先予保護，以免使其餘半胱胺酸殘基受到反應的影響。作為此種保護基的例子可例舉Acm基等。
又，本發明中所使用之胜肽鏈亦可於N末端側具有脂溶性的保護基。作為較佳之保護基可例舉乙醯(Ac)基等醯基、叔丁氧羰(Boc)基、9－芴甲氧羰(Fmoc)基、芳氧羰(Alloc)基等含有羰基之基團、芳基、苯甲基等，惟並非限定於此等。
用於本發明之方法的胜肽鏈可為天然蛋白質，亦可為經由生物合成、化學合成或無細胞合成等方法所得之胜肽鏈，惟較佳為菌體、或在細胞內表現之重組蛋白質。重組蛋白質只要以人為方式在菌體內或細胞內表現，則既可含有與天然蛋白質相同之胜肽序列，也可含有具突變或精製用標記物等修飾之胜肽序列。
本發明中所採用之重組蛋白質可由該行業人士所週知之方法來調製。例如可在重組載體(vector)上導入標的基因而表現。作為本發明中所採用之重組載體，只要是能夠對宿主細胞進行轉型(轉化transform)者即可，可依據宿主細胞使用大腸桿菌用質粒(plasmid)、枯草桿菌用質粒、酵母用質粒、反轉錄病毒(retrovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、桿狀病毒(baculovirus)等動物病毒載體等。較佳在此等中具有可於其宿主細胞中適當表現蛋白質之啟動子(promoter)等的控制序列。又，作為宿主細胞只要是能夠在重組載體表現外來基因的物質即可，一般而言可使用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。
作為將重組載體移入宿主細胞的方法，可使用一般上常用的方法，例如大腸桿菌的情況可利用氯化鈣法或電穿孔(electroporation)法、酵母的情況可利用氯化鋰法或電穿孔法。又動物細胞之轉化可採用電穿孔等物理方法、核糖體(ribosome)法或磷酸鈣法等化學方法、或反轉錄病毒等病毒載體來進行。作為轉化體(transformant)之宿主細胞的培養型態可考量宿主之營養生理學上的性質來選擇培養條件。
本發明中所使用之胜肽較佳經過精製，胜肽的精製方法可依平常之一般精製來進行。例如為重組蛋白質時，則對表現本發明中所使用之重組蛋白質的菌體或細胞進行培養後，以週知方法收集菌體或細胞，使其懸浮於適當的緩衝液中，再藉由超音波、溶菌酶(lysozyme)及/或凍結融解等破壞菌體或細胞後，以離心分離或過濾調製胜肽的粗萃取液。在緩衝液中亦可含有尿素或鹽酸胍等蛋白質變性劑或Triton X－100TM等界面活性劑。如此般所得之萃取液、或含於培養上清液中之胜肽的精製可由週知精製方法來進行。例如能夠藉由適當選擇、組合親和層析法(affinity chromatography)、離子交換層析法、濾紙(filter)、超過濾(ultrafiltration)、凝膠過濾(gel filtration)、電泳、鹽析、透析等來進行胜肽的分離、精製。
又，為使重組蛋白質的精製簡單化，亦可預先在表現載體上組入精製用標記物。作為精製用標記物的例子，可例舉如His標記物、GST標記物、Myc標記物、FLAG標記物、麥芽糖結合蛋白(MBP)等。本發明中由於對比配置於胜肽鏈內之Cys更靠N末端之一側進行硫酯化，並在胜肽之C末端之一側上附加精製用標記物於精製後進行硫酯化，藉此，比胜肽鏈中之Cys更靠C末端之一側即連帶標記物被切除，而可高效率地製得胜肽硫酯體。因可藉由將Cys之位置配置於胜肽鏈上所要求之位置，故本發明之方法可使用於除去C末端之一側之標記物。
因此，採用本發明係使用於胜肽硫酯體的製造方法，又除去附加於重組蛋白質之C末端之精製用標記物的方法，也進一步包含於本發明中。
本發明中，所謂「胜肽硫酯體」(以下有時亦僅記載為「硫酯體」)係指在C末端上具有羧基硫酯部分(－C=O－SR)的胜肽。本發明中所使用之胜肽硫酯體，只要是能夠產生與其他硫醇基交換之反應的硫酯體並無特殊限定。R基可例舉如下述R4 所例示之基團。
本發明之方法首先(A)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基，而進行製造第1中間體的步驟。
本發明中化合物A係由以下式(I)表示。
【化10】
式中，X為硫原子或氧原子，但較佳為硫原子。
R1 及R2 則作為脫離基，在下述步驟(A)之反應條件下，只要是相較於被取代之原子或原子團，其親核性(nucleophilicity)較低且具有脫離功能者並無特殊限定，惟R1 及R2 為各自相異的脫離基較佳。作為R1 及R2 ，具體而言可例舉鹵素原子、取代或非取代之－O－烷基、取代或非取代之－O－烯基、取代或非取代之－O－炔基、取代或非取代之－O－芳基、取代或非取代之－O－雜芳基(heteroaryl groups)、取代或非取代之－S－烷基、取代或非取代之－S－烯基、取代或非取代之－S－炔基、取代或非取代之－S－芳基、或取代或非取代之－S－雜芳基。作為R1 及R2 更佳可例舉下述組合：R1 係從由取代或非取代之－O－C6-10 芳基、及取代或非取代之－S－C1-8 烷基構成之群組中所選擇的脫離基，及R2 係從由鹵素原子、取代或非取代之－S－C1-8 烷基、取代或非取代之－S－C6-10 芳基構成之群組中所選擇的脫離基。
本發明中「烷基」係指自脂肪族碳氫化合物(烴)除去任意一個氫原子所衍生之一元基團，具有含氫及碳原子之烴基(hydrocarbyl)或碳氫化合物的部分集合。烷基係包含直鏈狀或支鏈狀的結構。作為本發明之烷基較佳可例舉碳原子數為1至8的烷基。再者，「C1-8 烷基」係表示碳原子數為1至8的烷基，具體例可例舉甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。
本發明中「烯基」係指具有至少一個雙鍵的一元基團。根據雙鍵及取代基的配置，雙鍵於幾何學上的型態係可取得反側(Entgegen,E)或同側(Zusammen,Z)、順式(cis)或反式(trans)的配置。烯基係包含直鏈狀或支鏈狀。作為本發明之烯基較佳可例舉碳原子數為2至8的烯基。「C2-8 烯基」係表示碳原子數為2至8的烯基，具體例可例舉乙烯基(vinyl)、烯丙基(allyl)、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
本發明中「炔基」係指具有至少一個叁鍵的一元基團。炔基係包含直鏈狀或支鏈狀的炔基。作為本發明之炔基較佳可例舉碳原子數為2至8的炔基。「C2-8 炔基」係表示碳原子數為2至8的炔基，具體例可例舉乙炔基、1－丙炔基、2－丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
本發明中「芳基」係指芳香性之碳氫化合物環基。作為本發明之芳基較佳可例舉碳原子數為6至10的芳基。「C6-10 芳基」係表示碳原子數為6至10的芳基，具體而言可例舉如苯基、1－萘基、2－萘基等。
本發明中「雜芳基」係指自雜芳環除去一或兩個任意位置之氫原子所衍生之一元或二元基團。本發明中「雜芳環」係指在構成環之原子中含有一或多個雜原子的芳香性環，較佳為5－9元環。環既可為單環，亦可為與苯環或單環雜芳環縮合之雙環式雜芳基。具體例可例舉呋喃基(furanyl)、苯硫基(thiophenyl)、吡咯基(pyrrolyl)、苯並呋喃基(benzofuranyl)、噻吩聯二苯基(benzothiophenyl)、吲哚基(indolyl)、吡啶基、喹啉基等。
上述脫離基所具有之取代基的種類、個數、取代位置並無特殊限定，惟作為取代基可例舉如烷基、烯基、烷氧基、芳基、甲醯基、羰基、羧基、烷羧基、烷氧羰基、鹵素、磺酸基、或硝基等。
作為本發明之化合物A，更具體而言可舉出
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
等。
又，亦可採用使MPAA((4－羧甲基)苯硫酚)與上述
【化15】
【化16】
所反應之下述硫代甲酸酯化試劑
【化17】
【化18】
如下圖所示，藉由使本發明之化合物A與胜肽中的半胱胺酸殘基反應，即可製得在半胱胺酸殘基中之SH基上鍵結有－C(=X)－R1 基的第1中間體。
【化19】
本發明中步驟(A)較佳在酸性條件下，特佳在pH3～5下進行。反應較佳在緩衝液與乙腈的混合溶劑中、0～50℃、最好為15～25℃下進行約0.1～3小時、最好為10分鐘～1小時，但未限定於此。
次之，在本發明之方法中進行(B)於有機溶劑中，藉由使化合物B與上述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，再切斷上述胜肽鍵，以製得比被切斷之上述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟。
本發明中，化合物B係由以下式(II)表示。
【化20】
式中，Y為氧原子、NH基、或硫原子，R3 為氫原子、醯基、或烷氧羰基。
本發明中「醯基」係指自羧酸的羧基除去OH基的原子團。作為本發明之醯基較佳可例舉碳原子數為1－4之醯基。具體而言可例舉如乙醯基、丙醯基、丁醯基(butyroyl)等。
本發明中「烷氧基」係指鍵結有「烷基」之氧基(oxy)。本發明之烷氧基可為直鏈狀亦可為支鏈狀。作為本發明之烷氧基，較佳可例舉碳原子數為1至14之直鏈狀烷氧基或碳原子數為3至14個之支鏈狀烷氧基。具體而可例舉如甲氧基、乙氧基、n－丙氧基、異丙氧基、n－丁氧基、2－甲基－2－丙氧基、n－戊氧基、n－己氧基等。
又，「C2-n 烷氧羰基」係指具有C1-(n-1) 之烷氧基的羰基。作為本發明之烷氧羰基，較佳可例舉碳原子數為2至15之烷氧羰基。具體而言可例舉如甲氧羰基、乙氧羰基、正丙氧羰基、異丙氧羰基、正丁氧羰基、2－甲基－2－丙氧羰基、正戊氧羰基、正己氧羰基等。
作為醯基較佳可例舉乙醯基。作為烷氧羰基較佳可例舉叔丁氧羰基(Boc基)。
作為本發明之化合物B，更具體而言可例舉
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
等。
本發明中步驟(B)較佳在有機溶劑的存在下進行。有機溶劑較佳為溶解性高且親核性低的物質。作為此種有機溶劑可例舉如二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二噁烷(dioxane)等。反應較佳在0～50℃、最好為15～25℃下進行約1～24小時、最好為5～10小時，但未限定於此。
如下圖所示，藉由在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成胜肽鍵的羧基上附加－NH－C(=Y)NHR3 基，則在半胱胺酸殘基之N末端側胜肽鏈即被切斷。
【化25】
此外，當胜肽側鏈上具有胺基時，在進行本發明之步驟(B)前亦可在側鏈之胺基上導入脂溶性保護基。作為脂溶性保護基可例舉如9－芴甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、芳氧羰(Alloc)基等含有羰基之基團、乙醯(Ac)基等醯基、芳基、苯甲基等保護基，但並未特別限定於此等。
在導入脂溶性保護基方面，例如在導入Fmoc基時可藉由添加9-芴甲基－N－琥珀醯亞胺基碳酸酯(9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate)與碳酸氫鈉進行反應而導入。反應可於0～50℃、較佳為室溫下進行約1～5小時左右，但未限定於此。
步驟(B)中可製得比被切斷之胜肽鏈的切斷部更靠N末端側的胜肽片段作為下述式(1)之第2中間體。
【化26】
本發明之胜肽硫酯體的製造方法係進一步包含(C)藉由使硫醇與上述第2中間體反應，再使C末端的－NH－C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
在步驟(B)後，使用於步驟(C)之第2中間體可經分離也可不經分離。
就較佳之型態而言，在上述步驟(C)中係使用由以下式(III)表示之硫醇。
R4 －SH　(式III)
R4 只要不阻礙硫醇交換反應，且為在羰基碳上的取代反應中作為脫離基的基團並無特殊限定。R4 較佳為從取代或非取代之苯甲基、取代或非取代之芳基及取代或非取代之烷基中選擇的任何一種基團，更佳為從取代或非取代之苯甲基、取代或非取代之C6-10 芳基及取代及非取代之C1-8 烷基中選擇的任何一種基團。更具體而言，可從苯甲硫醇(benzyl mercaptan)等苯甲基型的脫離基、硫酚(thiophenol)、4-(羧甲基)-硫酚等芳基型的脫離基、2-巰基乙磺酸(2-mercaptoethanesulfonic acid)基、3-巰基丙醯胺等烷基型的脫離基等來選擇。此等脫離基所具有之取代基的種類、個數、取代位置並無特殊限定。
透過步驟(C)的進行，第2中間體即如下圖完全地轉換成硫酯體。
【化27】
可將如上述般所製得之胜肽硫酯體、與胜肽或被修飾胜肽中在N末端上包含具有－SH基之胺基酸殘基的胜肽(或被修飾胜肽)使用連接法來予以連接。因此，本發明仍又提供一種包含將經由本發明之方法所得之胜肽硫酯體、與在N末端上具有半胱胺酸之胜肽鏈透過連接法來結合之步驟的聚胜肽之製造方法。
又，亦可將以上述步驟(B)所得之第2中間體取代上述胜肽硫酯體而使用於連接法中。
本發明中所謂「連接法」不僅包含專利文獻1中所述之自然化學連接法(Native Chemical Ligation，NCL法)，亦包含對含有非天然胺基酸、胺基酸衍生物(例如蘇胺酸衍生物A、保護甲硫胺酸、附加糖鏈胺基酸等)之胜肽應用上述自然化學連接法的場合。經由連接法，可製造於連接部位上具有天然醯胺鍵(胜肽鍵)的胜肽。
採用連接法的連接可於胜肽-胜肽間、胜肽-被修飾胜肽間、被修飾胜肽-被修飾胜肽間的任一種來進行。
再者，本說明書中所使用之用語係為用以說明特定實施型態所使用者，並非意圖限定發明。
又，本說明書中所使用之用語「包含」，除與文脈中意義明顯相異之場合外，係指具有所記述之存在事項(部件、步驟、要素、數字等)，且除具有所記述之存在事項外、並不排除所具有所記述之存在事項外的其他可能存在之事項(部材、步驟、要素、數字等)。
只要沒有不同之定義，此處所使用之所有用語(含技術用語及科學用語)係具有與從事本發明所屬之技術的該行業人士所廣泛理解的意思相同者。此處所使用之用語，只要沒有明示相異定義，否則應作為具有與本說明書及相關技術領域中的意義之整合的意義來解釋，不應就理想化或過度形式化的意義來解釋。
本發明之實施型態雖有參照模式圖的同時進行說明的場合，但為模式圖時，為了明確說明亦有延伸表現的場合。
「第一」、「第二」等用語係為了表現各種要素而使用，但可理解該等要素不應受到其等用語的限定。該等用語係僅為了將一個要素與其他要素區分而使用，例如，可將第一要素記為「第二要素」，同樣將「第二要素」記為「第一要素」，而未脫離本發明之範圍。
以下，參照實施例更詳細說明本發明。惟，本發明可依各種型態而具體化，不應作為限定此處所記載之實施例來解釋之。
【實施例】 實施例1.　硫代甲酸酯基的導入 (MPAA苯基硫代甲酸酯的合成) 【化28】
將MPAA((4－羧甲基)硫酚)(98mg，0.583mmol)、硫代氯甲酸苯酯(Phenyl chloro thionoformate)(103μL，0.76mmol)溶於二氯甲烷(400μL)中，在室溫下攪拌1小時。1小時後，在室溫下將反應溶液以氯仿2.0mL稀釋，加入飽和小蘇打(碳酸氫鈉)水1.0mL，並將此混合物以氯仿萃取、洗淨。將氯仿層以飽和食鹽水洗淨，以硫酸鎂乾燥後進行減壓濃縮即製得黄色透明的漿(syrup)狀殘留物。將此作為後續之硫代甲酸酯化試劑(MPAA苯基硫代甲酸酯)來使用(MW：305.3，無MS數據)。
(採用MPAA苯基硫代甲酸酯試劑之硫代甲酸酯基的導入)
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaXaa Cys Gly－OH(序列識別號：1)，Xaa=Lys(序列識別號：2)，Ser(序列識別號：3)，Asp(序列識別號：4)，Ala(序列識別號：5)，Val(序列識別號：6)，crude(Lys，Ser，Asp，Ala，Val之混合物)，6mg)溶於pH5.5之緩衝溶液(1.0mL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)後，添加溶於乙腈(230μL)之MPAA苯基硫代甲酸酯(15μL)全部量。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨，使用HPLC進行精製即製得標的化合物。反應為HPLC之結果，係以定量方式進行。
(Xaa=Lys，ESIMS calcd[M+H]+ 818.3，found[M+H]+ 818.4).
(Xaa=Ser，ESIMS calcd[M+H]+ 777.3，found [M+H]+ 777.3).
(Xaa=Asp，ESIMS calcd[M+H]+ 805.3，found[M+H]+ 805.3).
(Xaa=Ala，ESIMS calcd[M+H]+ 761.3，found[M+H]+ 761.3).
(Xaa=Val，ESIMS calcd[M+H]+ 789.3，found[M+H]+ －－－).
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaXaa Cys Gly－OH(序列識別號：1)，Xaa=Ser(序列識別號：3)，Phe(序列識別號：8)，Leu(序列識別號：7)，crude(Ser，Phe，Leu之混合物)，10mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(2.0mL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(700μL)之MPAA苯基硫代甲酸酯(5μL)。1.5小時後以Et2 O將反應溶液洗淨，使用HPLC進行精製即製得標的化合物。反應為HPLC之結果，為定量方式。
(Xaa=Ser，ESIMS calcd[M+H]+ 777.3，found[M+H]+ 777.3).
(Xaa=Leu，ESIMS calcd[M+H]+ 803.4，found[M+H]+ 803.3).
(Xaa=Phe，ESIMS calcd[M+H]+ 837.4，found[M+H]+ 837.3).
無拘鄰接於半胱胺酸之N末端側的胺基酸的種類，皆可在半胱胺酸之－SH基上導入硫代甲酸酯基。
實施例2. N－乙醯脈基化(N-acetyl guanidylation)反應 【化29】
(以Xaa=Ala，Leu，Phe，Ser，Lys來實施)
(Xaa=Ala之場合)
將Ac－Val Tyr AlaAla Cys(C(S)OPh)Gly－OH(序列識別號：9)(0.2mg，0.28μmol)溶於250mM之N－乙醯胍/DMSO溶液(260μL)。2小時後以Et2 O將化合物沉澱、洗淨。使用HPLC對標的物進行精製即製得作為標的之N－乙醯胍體(Ac－Val Tyr Ala Ala－NHC(NH)NHAc(序列識別號：10))(回收率80%，計算自HPLC面積強度)。
(ESIMS calcd[M+H]+ 548.3，found[M+H]+ 548.4)
(Xaa=Ler或Phe之場合)
將Ac－Val Tyr AlaLeu Cys(C(S)OPh)Gly－OH(序列識別號：11)(0.1mg，0.12μmol)、Ac-Val Tyr AlaPhe Cys(C(S)OPh)Gly－OH(序列識別號：12)(0.1mg，0.12μmol)之混合物溶於250mM之N－乙醯胍/DMSO溶液(100μL)。4.5小時後以Et2 O將化合物沉澱、洗淨。使用HPLC對標的物進行精製，即製得作為標的之N－乙醯胍體(Ac－Val Tyr Ala Leu－NHC(NH)NHAc(序列識別號：13)、及Ac－Val Tyr Ala Phe－NHC(NH)NHAc(序列識別號：14))(回收率80%，計算自HPLC面積強度)。
(Xaa=Leu，ESIMS calcd[M+H]+ 590.3，found[M+H]+ 590.3).
(Xaa=Phe，ESIMS calcd[M+H]+ 624.3，found[M+H]+ 624.3).
(Xaa=Ser之場合)
將Ac－Val Tyr AlaSer Cys(C(S)OPH)Gly－OH(序列識別號：15)(0.2mg，0.26μmol)溶於250mM之N－乙醯胍/DMSO溶液(100μL)。3.5小時以Et2 O將化合物沉澱、洗淨。使用HPLC對標的物進行精製，即製得作為標的之N－乙醯胍體(Ac－Val Tyr Ala Ser－NHC(NH)NHAc(序列識別號：16))(回收率70%，來自HPLC面積強度)。
(Xaa=Lys之場合)
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaLys Cys(C(S)OPH)Gly－OH(序列識別號：17)，0.lmg)溶於含有Boc2 O(0.3mg)、三乙胺(0.14μL)之DMSO(30μL)。1.5小時後將反應溶液以Et2 O沉澱、洗淨。將所得之殘留物溶於250mM之N－乙醯胍/DMSO溶液(100μL)。2.5小時後，使用HPLC對標的物進行精製，即製得作為標的之N－乙醯胍體(Ac－Val Tyr AlaLys(Boc) －NHC(NH)NHAc(序列識別號：18))(回收率70%，計算自HPLC面積強度)。
無拘鄰接於半胱胺酸之N末端側的胺基酸的種類，確認具有對硫代甲酸酯化之半胱胺酸殘基之N末端側胜肽鍵的胍反應性。
實施例3.　24aa胜肽之硫酯化 【化30】
將胜肽(H2 N－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly－OH(序列識別號：19)(crude(未精製))適量(推定為1mg左右)溶於pH5.0之緩衝溶液(300μL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈之(100μL)MPAA苯基硫代甲酸酯(1μL)全部量。50分鐘後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的化合物(H2 N－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly－OH(序列識別號：20))。此外，預先以Acm保護第3位之Cys，以勿使其受到硫代甲酸酯試劑的影響。
(ESIMS calcd[M+2H]2+ 1553.8，[M+3H]3+ 1035.8，found[M+2H]2+ 1552.9，[M+3H]3+ 1035.7))
將胜肽(H2 N－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly－OH(序列識別號：20)，ca. 0.3mg)溶於含有Boc2 O(0.4mg)、三乙胺(0.03μL)之DMSO(20μL)。1.5小時後將反應溶液以Et2 O沉澱、洗淨。將所得之殘留物溶於250mM之N－乙醯胍/DMSO溶液(50μL)。2.5小時後，使用HPLC對標的物進行精製即製得作為標的之N－乙醯胍體(BocHN－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly－NHC(NH)NHAc(序列識別號：21))。
(ESIMS calcd[M+2H]2+ 1546.8，[M+3H]3+ 1031.5，found[M+2H]2+ 1547.0，[M+3H]3+ 1031.4))
將24aa胜肽(BocHN－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly－NHC(NH)NHAc(序列識別號：21)，ca. 0.1mg>)溶於含有MESNa(sodium 2－sulfanylethanesulfonate)(1mg，2% v/v)之pH7.05的緩衝溶液(0.2M磷酸、6M胍，50μl)。3.5小時後，使用HPLC對標的物進行精製即製得硫酯體(BocHN－Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly－SCH2 CH2 SO3 (序列識別號：22))(回收率不明，在HPLC上約70%)。
(ESIMS calcd[M+2H]2+ 1567，3，found[M+2H]2+ 1566.8).
實施例4.　採用硫代氯甲酸苯酯試劑(chlorothionoformate reagent)之硫代甲酸酯基的導入
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaAla Cys Gly－OH(序列識別號：5)，6mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(961μL，0.2M N a2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(320μL)之硫代氯甲酸苯酯(6.5μL)。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的之硫代甲酸酯化胜肽(序列識別號：9)(6.4mg，88% )。
(Xaa=Ala，ESIMS calcd [M+H]+ 761.3，found[M+H]+ 761.3).
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaLeu Cys Gly－OH(序列識別號：7)，3.4mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(510μL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(170μL)之硫代氯甲酸苯酯(3.5μL)。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的之硫代甲酸酯化胜肽(序列識別號：11)(3.8mg，92%)。
(Xaa=Leu，ESIMS calcd[M+H]+ 803.4，found[M+H]+ 803.3).
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaPhe Cys Gly－OH(序列識別號： 8)，5.1mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(729μL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(243μL)之硫代氯甲酸苯酯(5.0μL)。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的之硫代甲酸酯化胜肽(序列識別號：12)(5.1mg，84%)。
(Xaa=Phe，ESIMS calcd[M+H]+ 837.4，found[M+H]+ 837.3).
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaSer Cys Gly－OH(序列識別號：3)，4.9mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(766μL，0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(265μL)之硫代氯甲酸苯酯(5.2μL)。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的之硫代甲酸酯化胜肽(序列識別號：15)(5.5mg，92%)。
(Xaa=Ser，ESIMS calcd[M+H]+ 777.3，found[M+H]+ 777.3).
將胜肽(Ac－Val Tyr AlaLys Cys Gly－OH(序列識別號：2)，5.5mg)溶於pH5.0之緩衝溶液(810μL 0.2M Na2 HPO4 ，6M Gn－HCl)，添加溶於乙腈(270μL)之硫代氯甲酸苯酯(5.5μL)。1小時後以Et2 O將反應溶液洗淨。使用HPLC進行精製即製得標的之硫代甲酸酯化胜肽(序列識別號：17)(6.1mg，94%)。
(Xaa=Lys，ESIMS calcd[M+H]+ 818.3，found[M+H]+ 818.4).
採用硫代氯甲酸苯酯試劑亦可製得與實施例1中所得之物質相同之經硫代甲酸酯化後的胜肽鏈。因此，自採用硫代氯甲酸苯酯試劑來導入硫代甲酸酯基的胜肽鏈而言，亦可明瞭：藉由使用與上述實施例1及3中導入硫代甲酸酯基之胜肽鏈相同的方法進行N－乙醯胍化，接著進行硫酯化即可製得胜肽硫酯體。
【產業上利用之可能性】
根據本發明，係提供一種將聚胜肽鏈以化學方式轉換成胜肽硫酯體的新穎方法。
就本發明之方法，即使不具有在習知硫酯化法中所必需之非天然胺基酸衍生物、連接子或特定三維結構等的胜肽鏈上亦可進行硫酯化，且即便為經由生物合成等所得之長鏈聚胜肽片段，亦可簡易地進行硫酯化。因此，本發明之胜肽硫酯化方法係可利用於蛋白質的整體合成中。
<110>　大塚化學股份有限公司
<120>　胜肽硫酯體之製造方法
<130>　OCKP0903
<160>　22
<170>　PatentIn version 3.1
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<223>　具有乙醯基之Val
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<222>　(24)..(24)
<223>　Gly having thioester group
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Claims (13)

  1. 一種方法，為胜肽硫酯體的製造方法，其特徵為包含以下步驟(a)~(c)：(a)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使由以下式(I)： 〔式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基〕表示之化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)： 〔式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基〕表示之化合物B與所述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加-NH-C(=Y)NHR3 基，再切斷所述胜肽鍵，以製得比被切斷之所述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟；以及(c)藉由使硫醇與所述第2中間體反應，再使C末端的-NH-C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中， X為硫原子。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，R1 為-O-C6 芳基。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，R2 為鹵素原子、取代或非取代之-S-C6-10 芳基。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，Y為NH基。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，R3 為乙醯基。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，在所述步驟(C)中，所述硫醇為由以下式(III)：R4 -SH (式III)[式中，R4 為由取代或非取代之苯甲基、取代或非取代之芳基、及取代或非取代之烷基所選擇之任一種基團]表示之硫醇。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，胜肽鏈為重組蛋白質。
  9. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，胜肽鏈為含有精製用標記物之重組蛋白質。
  10. 一種聚胜肽之製造方法，其特徵為包含將以申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之方法而得的胜肽硫酯體、與N末端上具有半胱胺酸的胜肽鏈藉由連接法結合的步驟。
  11. 一種方法，為用於申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之胜肽硫酯體的製造方法的第2中間體的製造方法，其特徵為包含以下步驟(a)或(b)：(a)在具有半胱胺酸殘基的胜肽鏈中，藉由使由以下式(I)：【化4】 〔式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基〕表示之化合物A與上述半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)： 〔式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基〕表示之化合物B與所述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加-NH-C(=Y)NHR3 基，再切斷所述胜肽鍵，以製得比被切斷之所述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟。
  12. 一種聚胜肽之製造方法，其特徵為包含C末端上具有-NH-C(=Y)NHR3 基的胜肽鏈，[式中，Y為氧原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基]、與N末端上具有半胱胺酸的胜肽鏈藉由連接法結合之步驟。
  13. 一種方法，為除去附加於重組蛋白質之C末端之一側的精製用標記物的方法，其特徵為包含以下步驟(a)~(c)：(a)在C末端上含有精製用標記物之重組蛋白質中，藉由使由以下式(I)：【化6】 〔式中，X為硫原子或氧原子，R1 及R2 為脫離基〕表示之化合物A與半胱胺酸殘基的硫醇基反應使R2 脫離，以製造第1中間體的步驟；(b)在有機溶劑中，藉由使由以下式(II)： 〔式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3 為氫原子、醯基或烷氧羰基〕表示之化合物B與所述第1中間體反應，而在半胱胺酸殘基之N末端側與相鄰之胺基酸之間形成有胜肽鍵的羧基上附加-NH-C(=Y)NHR3 基，再切斷所述胜肽鍵，以製得比被切斷之所述胜肽鍵更靠N末端側之胜肽片段作為第2中間體的步驟；以及(c)藉由使硫醇與上述第2中間體反應，再使C末端的-NH-C(=Y)NHR3 基與硫醇基進行交換，以對第2中間體之C末端進行硫酯化的步驟。
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