WO2007113238A2 - Zellsensor mit multifunktionellen reaktionen zur definition von qualitätskriterien bei der herstellung von materialien - Google Patents

Zellsensor mit multifunktionellen reaktionen zur definition von qualitätskriterien bei der herstellung von materialien Download PDF

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WO2007113238A2
WO2007113238A2 PCT/EP2007/053083 EP2007053083W WO2007113238A2 WO 2007113238 A2 WO2007113238 A2 WO 2007113238A2 EP 2007053083 W EP2007053083 W EP 2007053083W WO 2007113238 A2 WO2007113238 A2 WO 2007113238A2
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Alexander Walter
Udo Leuschner
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Gerresheimer Wilden Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method of making a cell sensor system, a cell sensor system having multifunctional reactions for defining quality criteria in the preparation and evaluation of materials, and the objective assessment of cell responses in conjunction with 3D matrices and other materials.
  • Three-dimensional (3D) cultures are defined by the fact that cells, in conjunction with a specific spatial environment, form structures as found in tissues and organoids.
  • the reactions of cultured cells are dependent on the cell type, the surrounding culture medium and the material of the culture space used.
  • cells are cultivated on the bottom of a culture dish or together with a natural or artificial 3D matrix (biomaterial).
  • 3D matrix biological material
  • the cells grow on plan surfaces or materials with more or less large cavities.
  • the cells can show very different reactions.
  • Cells in conjunction with a 3D matrix show complex reactions that are unpredictable. When they come in contact with a 3D matrix, the cells initially attach themselves loosely (adhesion), form special cell anchors (adherence) when adhering, and in the optimal case remain in a more or less close interaction (affinity) for longer periods of time.
  • Adhesion and Adherence After adhesion, ie a short primary contact of cells on a 3D matrix, it is decided whether it should become a longer contact. This formation of tentative anchor structures is referred to as adherence.
  • adherence This formation of tentative anchor structures is referred to as adherence.
  • survival of cells on a 3D matrix alone is not yet a concrete statement as to whether, how long and how firmly the cultivated cells remain anchored and which tissue-specific properties are formed.
  • a good adherence is not only mediated by the cell and not only by the 3D matrix used, but is only possible in a close cooperation of both parties: The following processes take place.
  • Adherence To form contact with a 3D matrix, for example, specific integrins are formed by the cell as anchors. Therefore, for adherence to take place, there must be receptors for the anchors of the cells in the 3D matrix.
  • ECM extracellular matrix
  • the amino acid sequence of the receptors for the integrins is known.
  • Amino acid sequences are normally not included in the polymers (such as polystyrene culture dishes). Therefore, quite different molecular configurations must mimic the presence of a receptor for integrins in the polymers.
  • Mitosis On the one hand cell divisions serve to preserve cells, on the other hand, it ensures that a few cells can produce a sufficiently large mass of tissue. When using matrices for the 3D culture, it must therefore be decided whether the selected matrix really supports the cell divisions. Molecular and immunological markers, such as cell cycle-specific protein (cyclins or cyclin-dependent kinases), can be used to show how many cells are currently in the mitotic phase and in contact with a 3D matrix. Conversely, the respective result shows to what extent the 3D matrix used promotes or inhibits the multiplication of cells.
  • cyclins or cyclin-dependent kinases can be used to show how many cells are currently in the mitotic phase and in contact with a 3D matrix. Conversely, the respective result shows to what extent the 3D matrix used promotes or inhibits the multiplication of cells.
  • chondroblasts (cartilage) and osteoblasts (bones) show surprisingly high rates of cell division, while chondrocytes and osteocytes no longer show (or no long-term) division after the formation of extracellular solid.
  • chondrocytes and osteocytes no longer show (or no long-term) division after the formation of extracellular solid.
  • the cytokinesis and the interphase are in constant contact with the respective 3D matrix and do not detach. Presumably, this process is controlled by the ERK kinases (extracellular signal regulated kinases) and the MAP kinases (mitogen activated protein kinases).
  • Differentiation In the course of the culture, individual cell groups are to form communicating cell aggregates and functional tissue structures. This process of differentiation does not proceed automatically, but is controlled by a variety of different factors. These include, but are not limited to, morphogens, growth factors, hormones, nutritional milieu, and above all, a suitable 3D matrix. With the exception of the 3D matrix, each of these factors works in a more or less narrow time window. If individual factors are not or not sufficiently strong, there is a shift in the profile of differentiation. As a result, not typical, but different degrees of atypical properties are formed.
  • the dimension of the molecular interaction of cells depends not only on the culture medium but also to a large extent on the material of the 3D matrix and thus on its surface condition. Adhesion, adherence and affinity are processes that are enormously affected by the matrix of the cell-growth vessel. For example, the growth of cells on glass, polymethyl methacrylate (pMMA), polyethylene (PE), polystyrene (PS) and polycarbonate (PC) is quite different.
  • modification of the surface charge such as a plasma treatment, often improves the adhesion and the affinity for the cells.
  • the division behavior of cells can be influenced by, for example, a 3D matrix.
  • too small a porosity may inhibit mitotic activity, while larger pores may aid cell division. Too large cavities, in turn, can mean that the division of cells is no longer promoted. Which biophysical influences ultimately influence this different behavior of cells is unknown. Therefore, the design of cultural materials and the selection of the right materials are very difficult. It is not possible to predict the suitability of a material. It is completely unclear why cells settle on 3D matrices, although they have no molecular similarity to the natural extracellular matrix. Probably a whole range of different physicochemical surface parameters influence the adherence, adhesion, affinity, mitosis, spreading and differentiation of cells. Experiments on the colonization of cells on 3D matrices show that there is no standard material that would be equally suitable for all projects.
  • the method according to the invention for producing a cell sensor system is characterized by the following method steps: a) cultivation of first cells of a specific type under standardized culture conditions (control group), b) cultivation of second cells of the specific type on / in / between different materials to be tested (test group c) harvesting the cells, d) determining the gene activities of the cells of the control group and the cells of the test group, e) comparing the gene activities of the test group with the control group, f) Identification of the genes in which there is a difference in the gene activities between the control group and the test group, g) Compilation of a microarray using the identified genes with different gene activity as gene profile, whereby this ready-made microarray defines as standard for the particular cell type and h) providing third cells of the particular cell type as a cell sensor and of the microarray standard assembled in step g).
  • the method is particularly suitable for assessing the quality of materials, as well as for defining quality criteria in the production of materials.
  • the cells include the cells of the basic tissues (epithelium, muscle, nerve tissue (neurons), connective tissue) and the hematopoietic system of the healthy and diseased animal and human organism, stem cells, embryonic and adult tissues, and the derived cell lines, the healthy and the diseased animal and human organism. Also, plant cells and cell lines can be used.
  • standardized culture conditions are understood to mean culture conditions under which the respective cell types are conventionally cultivated. These are familiar to the person skilled in the art, see, for example, W.W. Minuth, R. Strehl, K. Schumacher (2005) Tissue Engineering - Essential for Daily Laboratory Work. WILEY-VCH Verlag, ISBN 3527311866. In the context of the invention, however, "standardized conditions” can also be understood as culture conditions under which the cells cultivated on a standard culture surface are stimulated to differentiate by a variety of stimuli known to the person skilled in the art.
  • “harvesting the cells” means working up the cells for subsequent determination of the gene activities.
  • the work-up depends on the level at which gene activities are to be determined.
  • the gene activities are determined at the nucleic acid level and / or at the protein level.
  • the corresponding work-up methods ie the isolation of RNA and / or protein, are known to the person skilled in the art (eg Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition).
  • the expression “determination of gene activities” in the context of the present invention refers to investigations of differential gene expression, ie the expression of various genes is examined and the expression patterns determined.
  • Gene expression refers to the entire process of converting the information contained in the gene into a protein
  • gene expression patterns are determined by using microarrays, two types of microarrays, one DNA microarray and one microarray
  • the choice of microarray depends on the softness of the genes to be determined.When gene activity is determined at the nucleic acid level, a DNA microarray is used.There are two different types of DNA microarrays, On the one hand, those based on bound cDNA and those based on synthetically produced oligonucleotides serve as probes which are applied to defined positions of a raster on glass slides, for example, regardless of the type of arrays used Cells extracted and this after any Aufreinigun gs and / or multiplication steps of the mRNA into cDNA or cRNA rewritten and labeled, for example, with fluorescent dyes, chemiluminescent labels, luminescent labels and electronic labels.
  • cDNA / cRNA pieces bind to their complementary counterpart on the array.
  • fluorescence signal is read out of each position of the microarray by means of a laser, or, if other labels are used, appropriate detection methods known to those skilled in the art are used. This pure intensity is usually normalized to include degradation effects, different extractions and other effects.
  • Oligomer-based microarrays currently use two widely used normalization methods, RMA (Robust Multiarray Analysis) or GCOS / MAS from Affymetrix. Subsequently, the normalized results are evaluated and visualized. Again, a lot of bioinformatics tools are available.
  • the Bioconductor project provides a large library of data analysis tools under GNU__R. Also applicable is the system of the company Applied Biosystems, which combines chemiluminescence with fluorescence and in which no ESTs are spotted, but 60-mer oligos. If gene expression at the protein level is to be determined, then protein microarrays are used, thus isolating proteins from the cells. Protein samples are then applied to the array. Those spots in which no interaction takes place remain empty after a washing step. The detection method then allows the distinction between spots with and without protein-protein interaction. Quantitative detection methods are also possible in which the amount of adherent protein can be determined.
  • Protein microarrays There are different types of protein microarrays, which are differentiated according to the type of interaction (antigen-antibody, enzyme-substrate, receptor-protein or general protein-protein interaction). It can also be differentiated whether proteins of the sample are fixed to the array and then tested with a variety of specific, known test proteins - or whether the test proteins are fixed in the test areas and then the reaction with the sample proteins takes place.
  • the Microarray Western method is used to detect antigens in cell lysates of different tissues or in protein fractions obtained by isoelectric focusing. The cell lysate or the protein fraction is spotted on the carrier material of the microarray, after which the antibody is applied. In each test field with antibody-antigen interaction, the antibody remains attached. Antibody fields are then detected as in the Western blot.
  • Antibody Microarrays The antibodies are fixed (spotted) and then the sample is applied to the array.
  • Antigen Microarrays A different antigen is fixed on each test area of the array. If the sample contains the corresponding specific antibody, it will adhere to the test area. This allows the reaction to a variety of antigens or allergens to be tested simultaneously.
  • fusion proteins are fixed on the array to detect protein-protein interactions.
  • the fusion protein allows reliable fixation on the array with the first part without disturbing the interacting ability of the other part of the protein.
  • the applied protein will only adhere to those test areas where interaction occurs.
  • a potential advantage compared to DNA microarrays is the faster on-site analysis of samples, since one can do without the often necessary amplification of genetic material as well as the hybridization.
  • whole genome microarrays are used for step d) of the method.
  • microarrays which can be used to search specifically for individual functions or functional groups of the cell in a broader or narrower range.
  • Such functional groups include functions such as cell cycle, nuclear reactions, cell attachment to surfaces, cell stress, formation of the typical cytoskeleton, signal transduction, and / or apoptosis.
  • a variety of groups of active or inactive genes and proteins can be identified, the functions of which are known in the context currently being investigated. In addition, however, the analysis with many groups of genes and proteins that one would not have expected in this context.
  • individual gene or protein activities may prove to be material-specific.
  • the histiotypic differentiation profile can be recorded.
  • a modified material can be arranged between these two extremes and further optimized if necessary.
  • microarray technology allows for the first time to produce gene profiles for individual cell types under culture conditions and to compare them with a corresponding control. It can be objectively determined which materials cause typical and which atypical reactions in the cells. In this context, not only individual properties, but a whole cell biological spectrum of reactions can be read, ranging from unsuitable, less suitable to suboptimal and optimal.
  • Cell cycle microarrays are designed so that the expression profiles of genes involved in the control of cell growth and division can be determined and found in common databases known to those skilled in the art, such as Mouse Genome Informatics: http: // www.informatics.jax.org, or in the following databases: wwwgenecards.org; gdb.org.
  • the expression profiles of genes are determined which encode, for example, cyclins and their associated cytokine-dependent kinases (CDKs), CDK inhibitors, CDK phosphatases and cell cycle checkpoint molecules involved in the control of cell growth and division.
  • CDKs cytokine-dependent kinases
  • Signal transduction microarrays are designed so that the expression profiles of genes can be determined which control cell processes by extracellular ligands, ligand receptors and intracellular signal modulators. These can be found in common databases, such as the Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, or in the following databases: wwwgenecards.org; gdb.org.
  • these may be selected from the group comprising: Ca 2+ / NFAT signaling pathways, cAMP / Ca 2+ signaling pathways, DNA damage signaling pathways, EGF / PDGF signaling pathways, hypoxia signaling pathways, G proteins and signaling molecules, glucocorticoid signals, G protein coupled Receptors, growth factors, immunological signaling pathways, insulin signaling pathways, JAK / STAT signaling pathways, MAP kinase signaling pathways, NF ⁇ B signaling pathways, nitrite oxide, Notch signaling pathways, nuclear receptors and co-regulators, p53 signaling pathways, PI3K-AKT signaling pathways, TGFß BMP signaling pathways, ToII-like receptor signaling pathways, Wnt signaling pathways.
  • Apoptosis microarrays are designed to determine the expression profiles of genes encoding key ligands, receptors, intracellular modulators, and transcription factors involved in the regulation of programmed cell death. These can be found in the common databases known to those skilled in the art, such as e.g. Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, or in the following databases: wwwgenecards.org; gdb.org.
  • These can be found in the common databases known to the person skilled in the art. such as the Mouse Genome Informatics: hüp: //www.informatics.jax.org, or in the following databases: wwwgenecards.org; gdb.org.
  • the factor of the difference in expression is at least three.
  • a preferred embodiment of the invention provides for the standard microarray the following genes, if the particular cells are e.g. 3T3-L1 fibroblasts are: pyruvate carboxy lase, stearoyl coenzyme A desaturase 1, fatty acid binding protein 5, glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, apolipoprotein D, fatty acid binding protein 4, apolipoprotein C-1, A-dipsin, Lipin 1, adinectin, lipase, angiotensinogen, resistin, CD36 antigen, fibromodulin, procollagen lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, tissue inhibitor of metalloproteinase 4, lumican and clusterin.
  • 3T3-L1 fibroblasts are: pyruvate carboxy lase, stearoyl coenzyme A desaturase 1, fatty acid binding protein 5, glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1,
  • the materials to be tested are long-chain organic molecules, standard plastic materials and biodegradable materials.
  • the materials to be tested are 3D matrix materials.
  • a tested 3D matrix material is preferably provided in step h) of the method according to claim 1 together with the cells of the particular cell type as cell sensor and the microarray standard assembled in step g) as part of the cell sensor system.
  • This 3D matrix material is preferably a material which supports the differentiation of the cells of the specific type and thus can function as the "golden standard.”
  • the 3D matrix material is preferably polystyrene foamed with CO 2 are used as "golden standard" in connection with 3T3-L1 fibroblasts and the standard microarray defined above.
  • the invention relates to a cell sensor system having multifunctional reactions for defining quality criteria in the manufacture of materials and for assessing the quality of materials consisting of cells and the standard method (s) created by the method for the particular type of cell.
  • microarray s
  • the standard microarrays are DNA arrays and / or protein arrays.
  • the cell sensor system comprises a tested 3D matrix.
  • This 3D matrix usually consists of long-chain organic molecules, standard plastic materials and biodegradable materials.
  • the 3D matrix which is part of the cell sensor system is a 3D matrix which supports the differentiation of the cells of the specific type and thus can function as a "golden standard.”
  • the 3D matrix material is preferably CO 2 foamed polystyrene This material can be used, for example, as a "golden standard" in connection with 3T3-L1 fibroblasts and the standard microarray defined above.
  • a cell If a cell comes into contact with a 3D matrix, it takes sensitive signals from its surroundings. Adhesion, adherence, affinity, mitosis, spreading as well as differentiation of the cells are thereby triggered or supported. These signals must pass from the outside of the cell via the plasma membranes into the cell interior.
  • the ERK system is involved, which influences the manifold processes for nucleotide synthesis, gene expression and protein synthesis, which are subsequently controlled by the MAP kinases.
  • One of these key enzymes for DNA or RNA synthesis is, for example, carbamyl phosphate synthase II (CPS II).
  • the ERK / MAP kinase-mediated mitosis of cells is controlled by the CDK family (cyclin dependent protein kinases). Activated are the cyclin D1 protein and its partner Cdk4, which forms a complex. If this complex is phosphorylated, it can cancel out the mitotic inhibition present in the cell. This, in turn, releases the transcription factor E2F, thereby increasing the transcription of genes that support mitosis and spreading through DNA replication.
  • CDK family cyclin dependent protein kinases
  • extracellular signals can have important influences on mitosis and many other important cell biological functions inside cells. These include, in addition to signals of morphogens or growth factors, the osmolarity of the culture medium, the stress created by the flow of a fluid or by hydrostatic pressure, and finally the surface and the internal space of a 3D matrix.
  • cell anchors e.g., integrins
  • the matricellular proteins such as trombospondin or SPARC (osteonectin) have yet another important importance for the formation and maintenance of cell functions.
  • they can modulate the production of extracellular matrix proteins and, on the other hand, they influence the efficacy of growth factors through the formation of additional receptors.
  • this very complex regulatory mechanism can only arise if the cell recognizes a suitable anchoring on the offered 3D matrix. Only this makes it possible to trigger further diverse cell biological functions via extracellular and cellular signaling cascades.
  • These reactions of cells can be used technically. Cells can thus be used as a highly sensitive sensor. The very complex cell biological reactions can be examined and presented with the help of a standard microarray.
  • this cell sensor system With the help of this cell sensor system then materials can be examined. This is done using a control and a material to be tested, such as a modification of polystyrenes used to make an improved culture dish.
  • a material to be tested such as a modification of polystyrenes used to make an improved culture dish.
  • a defined cell population is cultured in a defined culture medium for a defined period of time.
  • the quality of the material to be tested is determined by the cell biological reactions of the cells, which are incubated in conjunction with the respective material.
  • the cells act as sensors on the respective material and signal a band spectrum between a positive and a negative development.
  • the signal from the cell sensor is complex, so even individual experimental leads of the cell say nothing about their actual instantaneous overall status. For this reason, as far as possible all possible gene reactions and protein expressions must be recorded. This is possible via the microarray technique.
  • the chips used are constructed from a multiplicity of information channels, thus representing a transmitter and amplifier function of cell biological function expressions of the cells. With the aid of an appropriate scanner technique and software, it is finally determined which dimension the gene activity and protein activity at the time the measurement has. From step to step of a planned material modification can be checked with the presented cell sensor, whether the same or completely different gene groups are up-regulated or down-regulated. Analogously, it can be examined with each material modification, which genes or proteins are increased or decreased active, or are formed.
  • the phases of adhesion, adherence, affinity, spreading and differentiation can be objectively analyzed analytically.
  • the data can be collected for the first time in the corresponding time windows of the processes described above.
  • a cell-grown material can have very different properties at the beginning, in the middle, and at the end of a trial.
  • the reason for this is that the cells produce extracellular matrix depending on the material used and thereby change the surface of the material in a positive or negative sense.
  • the chip technology allows the possibility of simultaneously testing a multitude of thousands of genes and hundreds of proteins with a single cell sample.
  • the following cells and cell lines are preferably used as cell sensors in the cell sensor system according to the invention: the cells of the basic tissues (epithelium, muscle, nerve tissue (neurons), connective tissue) and of the hematopoietic system of the healthy and diseased animal and human organism, stem cells, embryonic and adult. ne tissue, as well as the derived cell lines, the healthy and diseased animal and human organism. Also, plant cells and cell lines can be used. The said cells and cell lines are also used in the other aspects of the invention, such as e.g. the method of manufacturing a cell sensor system, the method of evaluating materials, the use of cells, and the kit.
  • a preferred embodiment of the invention provides as a cell sensor 3T3-L1 fibroblasts.
  • the microarray of the cell sensor system contains the following gene profile: pyruvate carboxylase, stearoyl-coenzyme A desaturase 1, fatty acid binding protein 5, glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, apolipoprotein D, fatty acid binding protein 4, apolipoprotein C-1, adipsin, lipin 1, adinectin, lipase, angiotensinogen, resistin, CD36 antigen, fibromodulin, procollagen lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1, tissue inhibitor of metalloproteinase 4, lumican and clusterin.
  • the invention provides a method for evaluating materials, which is characterized by the following method steps: a) cultivation of first cells of a specific type under standardized culture conditions (control group), b) cultivation of second cells of the specific type on / in / between different materials to be tested (test group), c) harvesting the cells, d) determining the gene activities, e) comparing the gene activities of the test group with the control group, f) identifying the genes that show a difference in gene activities g) compilation of a microarray using the identified genes with different gene activity as gene profile, whereby this ready-made microarray is defined as standard for the particular cell type, and h) cultivation of third cells of the particular cell type under standardized Culture condition (control group), i) cultivation of fourth cells of the particular kind on different materials to be tested (test group), j) harvesting the cells, k) determining the gene activities of the cells of the control group and the cells of the test group using the standard microarray.
  • the method has been developed such that only the steps h-k are performed.
  • the cultivation of cells as a control group in step h) of the method according to the invention takes place on an already tested 3D material.
  • this 3D matrix supports the differentiation of the cells of the particular type and can thus be defined as a "golden standard”.
  • the cell sensor system according to the invention is used in the methods for assessing materials.
  • the invention contemplates the use of cells to assess the quality of materials based on cell biological responses of the cells.
  • the cells and cell lines already mentioned above are used.
  • the invention relates to the use of microarrays for the preparation of a standard for use in a cell sensor system.
  • the invention provides a kit comprising the cell sensor system, medium and one or more 3D matrices of the invention.
  • the suitability of a 3D matrix to grow high quality cells with a natural gene expression pattern can be analyzed using microarrays. Depending on the cell type and culture conditions used, different gene expression patterns can be observed.
  • the creation of a cell sensor system is illustrated by 3T3-L1 fibroblasts. These cells were used to validate a polystyrene open cell foam structure. This cell line is a precursor to fat cells. The cells can develop into fat cells by adding suitable differentiation media. The cells were cultured in the 3D structure and as a control group in standard cell culture dishes.
  • RNA RNA contained in the cells.
  • microarrays were prepared to validate the degree of differentiation and thus the quality of the cells on the substrate to be tested. Altogether so 22690 genes could be examined.
  • Two different programs were used to evaluate the microarrays: RMA (Robust Multiarray Analysis) and a program from the manufacturer Affymetrix (GCOS 1.2 software). Only the genes for which both programs gave positive or negative differences in expression were further investigated. Of interest were only genes in which a change by at least a factor of 3 occurred both in comparison with the Affymetrix- and with the RMA software.
  • RMA Robust Multiarray Analysis
  • the gene expression pattern of uninduced cells was compared after 5 weeks of culture on standard culture surfaces (2D) and in a 3D matrix (3D).
  • the cells cultured in the 3D matrix show elevated levels of expression in fat-typical genes such as adipsin or lipin 1, which suggests an increased differentiation in the 3D structure.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/ in/ zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor.

Description

Zellsensor mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien
Beschreibung
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, ein Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung und Beurteilung von Materialien und die objektive Beurteilung von Zellreaktionen in Verbindung mit 3D-Matrices und anderen Materialien.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Dreidimensionale (3D) Kulturen sind dadurch definiert, dass Zellen in Verbindung mit einer speziellen räumlichen Umgebung Strukturen bilden, wie sie in Geweben und organoiden Gebilden gefunden werden.
Die Reaktionen von kultivierten Zellen sind dabei abhängig vom Zelltyp, vom umgebenden Kulturmedium und von dem Material des verwendeten Kulturraumes. Im einfachsten Fall werden dazu Zellen auf dem Boden einer Kulturschale oder zusammen mit einer natürlichen oder artifiziellen 3D-Matrix (Biomaterial) kultiviert. Die Zellen wachsen dabei je nach Kulturstrategie auf planen Oberflächen oder Materialien mit mehr oder weniger großen Hohlräumen. Je nach verwendetem Material können die Zellen dabei ganz unterschiedliche Reaktionen zeigen. Zellen in Verbindung mit einer 3D-Matrix zeigen komplexe Reaktionen, die nicht vorhersehbar sind. Beim Kontakt mit einer 3D-Matrix lagern sich die Zellen zuerst locker an (Adhäsion), bilden beim Anhaften spezielle Zellanker aus (Adhärenz) und bleiben im optimalen Fall über längere Zeiträume hinweg in mehr oder weniger enger Interaktion (Affinität) verbunden. Aufgrund der speziellen räumlichen Umgebung können bei den Zellen ganz unterschiedliche zellbiologische Reaktionen beobachtet werden. Das Spektrum reicht von Zellteilung (Mitose), Überwuchern der 3D-Matrix (Spreading) bis hin zur Bildung von typischen (Differenzierung) aber auch von atypischen (Dedifferenzierung) Gewebestrukturen. Die Kulturen lassen sich zudem nicht über beliebig lange Zeiträume halten. Deshalb sind in diesem Zusammenhang auch Vorgänge zur Apoptose, Nekrose und Degeneration wichtige zellbiologische Vorgänge.
Die verschiedenen Stadien der Zell-/ Gewebekultur sind folgendermaßen charakterisiert: Adhäsion und Adhärenz: Nach einer Adhäsion, also einem kurzen Primärkontakt von Zellen auf einer 3D-Matrix entscheidet sich, ob daraus ein längerer Kontakt werden soll. Dieses Ausbilden von vorläufigen Ankerstrukturen wird als Adhärenz bezeichnet. Das Verbleiben von Zellen auf einer 3D-Matrix allein ist allerdings noch keine konkrete Aussage darüber, ob, wie lange und wie fest die kultivierten Zellen verankert bleiben und welche gewebespezifischen Eigenschaften dabei ausgebildet werden. Eine gute Adhärenz wird nicht allein von der Zelle und nicht allein von der jeweilig verwendeten 3D-Matrix vermittelt, sondern ist nur in einer engen Kooperation von beiden Beteiligten möglich: Dabei finden folgende Vorgänge statt.
Adhärenz: Zur Kontaktbildung mit einer 3D-Matrix werden von der Zelle zum Beispiel spezifische Integrine als Anker ausgebildet. Damit eine Adhärenz stattfinden kann, müssen deshalb in der 3D-Matrix Rezeptoren für die Anker der Zellen vorhanden sein. Von der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) kennt man in den meisten Fällen die Aminosäuresequenz der Rezeptoren für die Integrine. Bei den verwendeten Polymermaterialien der verschiedenen Kulturartikel ist jedoch unbekannt, wie die Rezeptoren für die jeweiligen Integrinanker der unterschiedlichen Zelltypen aufgebaut sind. Aminosäuresequenzen sind normalerweise in den Polymeren (wie z.B. Kulturschalen aus Polystyrene) nicht enthalten. Deshalb müssen ganz andere Molekülkonfigurationen das Vorhandensein eines Rezeptors für Integrine in den Polymeren imitieren. (Valenick LV et al., Experimental Cell Research 309: 48-55, 2005) Affinität: Wenn Zellen sich zum definitiven Bleiben auf einem Material entschließen und daraufhin typische Eigenschaften entwickeln, dann wird dieser Vorgang entscheidend durch das verwendete Material und seine Oberflächenbeschaffenheit beeinflusst. Gesteuert wird dieser Vorgang dadurch, dass die Zellen zum Beispiel über Integrinanker interaktiv mit einer 3D- Matrix verbunden sind. Deshalb werden bei 3D-Kulturen möglichst optimierte 3D-Matrices verwendet, um experimentell eine Nachahmung der natürlichen Interaktionsformen anzustreben. Aus eigenem Interesse wird man deshalb 3D-Matrizen mit einer hohen Affinität für die jeweiligen Zellen verwenden. Man kann davon ausgehen, dass nur solche 3D-Matrices auch eine optimale räumliche und funktionelle Entwicklung der reifenden Gewebestrukturen unterstützen.
(Kofidis et al., Medical Engineering & Physics 26: 157-163, 2004)
Mitose: Zellteilungen dienen einerseits zum Erhalt von Zellen, andererseits wird damit sichergestellt, dass sich aus wenigen Zellen eine genügend große Masse an Gewebe bilden kann. Bei der Verwendung von Matrices für die 3D-Kultur muss deshalb entschieden werden, ob die ausgesuchte Matrix auch wirklich die Zellteilungen unterstützt. Mit molekularbiologischen und immunologischen Markern, wie zum Beispiel für zellzyklusspezifische Protein (Cycline oder cyclin-abhängige Kinasen), lässt sich zeigen, wie viele Zellen sich gerade in der Mitosephase und in Kontakt mit einer 3D-Matrix befinden. Das jeweilige Resultat zeigt umgekehrt, in welchem Ausmaß die verwendete 3D-Matrix die Vermehrung von Zellen fördert bzw. hemmt.
Viele Daten zeigen, dass das Mitoseverhalten im Organismus bis zu der Ebene der darin befindlichen Gewebe und Subpopulationen an Zellen spezifisch gesteuert ist. So weisen zum Beispiel im Dünndarm die Epithelzellen der Zotte eine sehr hohe Erneuerungsrate auf, während die enterochromaffinen Zellen und Paneth'schen Körnerzellen in den unmittelbar benachbarten Krypten eine sehr viel niedrigere Mitoseaktivität zeigen. Hier wird an einer einzelnen Zellgrenze entschieden, dass das Epithel der Zotten innerhalb von zwei bis drei Tagen erneuert wird, während in den Krypten über viele Monate keine Teilungen zu beobach- ten sind. Solche zellbiologischen Unterschiede gibt es auch bei den Bindegewebszellen. Chondroblasten (Knorpel) und Osteoblasten (Knochen) zum Beispiel zeigen erstaunlich hohe Zellteilungsraten, während nach der Ausbildung einer extrazellulären Festsubstanz Chondrozyten und Osteozyten keine (oder über lange Zeiträume keine) Teilung mehr zeigen. (Gruber et al., Musculoskeletal Disorders 1 : 1 , 2000) - A -
Spreading: Die Erfahrung zeigt, dass sich viele Zellen problemlos vermehren lassen, wenn sie auf dem glatten Boden einer Kulturschale anhaften. Wird den Zellen jedoch eine SD- Matrix mit einem unterschiedlichen Rauhigkeitsgehalt angeboten, so sind neben der Mitose weitere komplexe Zellreaktionen zu erkennen. Das mögliche Spektrum reicht vom völligen Einwachsen der Zellen in den kleinsten Winkel jeder Rauhigkeit bis zur Abrundung aller Zellen und damit zur völligen Ablehnung der Oberfläche des verwendeten Materials. Verwendet man eine für die Zellen attraktive 3D-Matrix, so ist schon nach relativ kurzer Zeit zu beobachten, dass die gesamte Oberfläche und die zur Verfügung stehenden Binnenräu- me mit Zellen besiedelt sind. Zudem wachsen die Zellen in unterschiedlichen Schichten aufeinander. Diese massive Ausbreitung von teilungswilligen Zellen wird als Spreading bezeichnet. Die jetzt überall vorkommenden Zellen zeigen jedoch ganz unterschiedliche Funk- tionszustände. Das Spektrum reicht von unterschiedlichen Stadien der Mitose bis hin zur typischen Interphase mit festen Kontakten der Zellen zueinander und zur angebotenen 3D- Matrix.
Bemerkenswert ist, dass die Zellen beim Spreading während der gesamten Mitosephase, der Zytokinese und der Interphase in stetigem Kontakt mit der jeweiligen 3D-Matrix stehen und sich nicht ablösen. Vermutlich wird dieser Vorgang über die ERK-Kinasen (extracellular signal regulated kinases) und die MAP-Kinasen (mitogen activated protein kinases) gesteu- ert.
(Vouret-Craviari V et al., J Cell Science 1 17 : 4559-4569, 2004)
Differenzierung: Aus einzelnen Zellen sollen im Laufe der Kultur kommunizierende Zellverbände und daraus funktionelle Gewebestrukturen entstehen. Dieser Vorgang der Differenzie- rung verläuft nicht automatisch, sondern wird durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Faktoren gesteuert. Dazu gehören unter anderem Morphogene, Wachstumsfaktoren, Hormone, Ernährungsmilieu und vor allem eine geeignete 3D-Matrix. Mit Ausnahme der 3D-Matrix wirkt jeder dieser Faktoren in einem mehr oder weniger engen Zeitfenster. Treten einzelne Faktoren nicht oder nicht stark genug auf, so kommt es zur Verschiebung im Profil der Differenzie- rung. Infolge dessen bilden sich nicht typische, sondern unterschiedliche Grade an atypischen Eigenschaften. (Batorsky et al., Biotechn Bioeng 92: 492-500, 2005) Die Dimension der molekularen Interaktion von Zellen hängt neben dem Kulturmedium in hohem Maße auch entscheidend vom Material der 3D-Matrix und damit von seiner Oberflächenbeschaffenheit ab. Die Adhäsion, die Adhärenz und die Affinität sind Vorgänge, die durch die Matrix des Zellwachstumsgefäßes enorm beeinflusst werden. Zum Beispiel ist das Wachstum von Zellen auf Glas, Polymethylmetacrylat (pMMA), Polyethylen (PE), Polystyrol (PS) und Polycarbonat (PC) ganz unterschiedlich. Hier kann durch eine Modifikation der O- berflächenladung, wie zum Beispiel einer Plasmabehandlung, oft die Adhäsion und die Affinität für die Zellen verbessert werden. Auch kann das Teilungsverhalten von Zellen, durch zum Beispiel eine 3D-Matrix, beeinflusst werden. Eine zu kleine Porosität kann zum Beispiel eine Mitoseaktivität hemmen, während größere Poren die Teilung von Zellen unterstützen können. Zu große Hohlräume wiederum können bedeuten, dass die Teilung von Zellen nicht weiter gefördert wird. Welche biophysikalischen Einflüsse letztendlich dieses unterschiedliche Verhalten von Zellen beeinflussen, ist unbekannt. Daher sind das Design von Kulturmat- rices und die Auswahl der richtigen Materialien sehr schwierig. Voraussagen der Eignung eines Materials sind nicht möglich. Es ist völlig unklar, warum sich Zellen auf 3D Matrices ansiedeln lassen, obwohl diese keinerlei molekulare Ähnlichkeit mit der natürlichen extrazellulären Matrix haben. Wahrscheinlich beeinflussen eine ganze Reihe von verschiedenen physikochemischen Oberflächenparametern die Adhärenz, die Adhäsion, die Affinität, die Mitose, das Spreading und die Differenzierung von Zellen. Experimente zur Besiedlung von Zellen auf 3D-Matrizen zeigen, dass es kein Einheitsmaterial gibt, welches für alle Vorhaben gleich gut geeignet wäre. Vielmehr erweist sich, dass jede Zellart sehr spezifische Anforderungen hat und deshalb eine 3D-Matrix ganz individuell ausgewählt und abgestimmt sein muss. So braucht eine Matrix, die optimal für Leberparenchymzellen geeignet ist, nicht automatisch auch für insulinproduzierende Zellen die erste Wahl zu sein. Für Bindegewebszel- len ist eine solche Matrix höchst wahrscheinlich sogar völlig ungeeignet.
Aus dem vorhergesagten wird ersichtlich, wie bedeutend das Material für das Wachstum ist. Bei der Neuentwicklung einer 3D-Matrix kann ihre Eignung nicht vorhergesagt werden. Deshalb müssen bei jeder Neuentwicklung auch immer neue Experimente durchgeführt werden, um die wirkliche Eignung zu erfahren. Objektive Kriterien zur Beurteilung des Materials, insbesondere einer 3D-Matrix, fehlen jedoch. Die Zellen können je nach angebotener 3D-Matrix einerseits mit erwünschter Differenzierung und andererseits mit unerwünschter Dedifferen- zierung sehr sensitiv reagieren. Ein großes ungelöstes Problem in diesem Zusammenhang ist, dass Zellen bei Besiedlung einer 3D-Matrix mit guter Affinität nicht automatisch alle funk- tionellen Eigenschaften eines Gewebes entwickeln, sondern in einem mal mehr oder einem mal weniger unreifen Zwischenzustand der Differenzierung verharren können.
Erfahrungsgemäß weiß man, wie lange eine Zelllinie oder eine Primärkultur benötigt, um einen konfluenten Zellrasen auf der Oberfläche einer Kulturschale aus Polystyren zu bilden. Wird z.B. ein Teil des Schalenbodens mit einem ungeeigneten Polymer, wie zum Beispiel Poly(2-Hydroxyethylmetacrylat) beschichtet, so nimmt die Zahl der anhaftenden Zellen drastisch ab. Ein konfluenter Monolayer von Zellen bildet sich dann nicht mehr aus. Das Beispiel zeigt, wie sensitiv Zellen reagieren können, wenn sie mit einer neuen Oberfläche zusammen treffen.
Die Analysemethoden der Eignung eines zweidimensionalen Materials, wie dem Boden einer Kulturschale, sind vielfältig, jedoch bei 3D-Matrices sehr beschränkt. Zwar ist anhand des Adhäsionsverhaltens von Zellen mit optischen Methoden recht schnell zu erkennen, wie gut oder schlecht die Zellen die Oberfläche einer verwendeten 3D-Biomatrix akzeptieren. Allerdings handelt es sich dabei nur um eine vage Abschätzung, da allein das Wachstumsverhalten und die Zahl der Zellen keine weitere Information zur zellbiologischen Qualität der Verankerung auf einer 3D-Matrix liefert. Zudem können in der Tiefe einer 3D-Matrix keine Aussagen getroffen werden. Die Reaktionen von Zellen in Kontakt mit einer 3D-Matrix wurden bisher immer sehr vage registriert. Dazu gehört zum Beispiel die Bestimmung der Zellzahl, die Vitalität, der Nachweis einzelner Proteine mit einem Antikörper oder die Bildung eines sezernierten Moleküls. Darüber hinaus gibt es kaum eine Aussage, was sonst noch an molekularen Funktionen in der jeweiligen Zellpopulation im dreidimensionalen Raum geschieht.
Während das Funktions- und damit auch das Differenzierungsprofil von zweidimensionalen Kulturen sehr gut mit bisherigen Analysemethoden untersucht werden kann, müssen bei dreidimensionalen Kulturen ganz neue Techniken angewendet werden. Der Grund dafür ist dass die Zellen in einer 3D-Matrix aufgrund der Schicht dicke z.B. morphologisch nicht mehr erkennbar und für physiologische Ableitungen nicht mehr erreichbar sind. Dagegen ist bei zweidimensionalen Kulturen ein direkter Zugang zu den Zellen möglich. Aus diesem Grund müssen für dreidimensionale Kulturen ganz andere Analysemethoden angewendet werden, die die vielfältigen komplexen Reaktionen von Zellen im Binnenraum einer 3D-Matrix exakt wieder spiegeln. Die Erfassung der Eignung eines Materials als Kulturraum, insbesondere eines SD-Matrix- Materials, anhand einer Vielzahl objektiver Parameter in einer angemessenen Zeit ist bisher nicht möglich.
Es ist somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Sensorsystems bereitzustellen, mit welchem ein großes Spektrum komplexer zellbiologischer Reaktionen in Verbindung mit einem Material erfasst werden kann.
Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Sensorsystem zur Erfassung der komplexen Zellreaktionen bereitzustellen, welches erstmals eine objektive Beurteilung von Zellreaktionen in Verbindung mit 3D-Matrizen und anderen Materialien erlaubt.
Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Beurteilung von Materialien bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden durch das in Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, das in Patentanspruch 16 definierte Zellsensorsystem und das im Patentanspruch 22 definierte Verfahren zur Beurteilung von Materialien gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der Beschreibung näher erläutert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems zeichnet sich durch folgende Verfahrensschritte aus: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/ in/ zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Mic- roarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor sowie des in Schritt g) zusammengestellten Microarray-Standards.
Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Beurteilung der Qualität von Materialien, sowie zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien.
Verwendet werden können sämtliche bekannten Zellen als auch Zelllinien. Die Zellen umfassen die Zellen der Grundgewebe (Epithel, Muskel, Nervengewebe (Neuronen), Bindegewebe) und des hematopoietischen Systems des gesunden und des kranken tierischen und menschlichen Organismus, Stammzellen, embryonal und erwachsene Gewebe, sowie die daraus abgeleiteten Zelllinien, des gesunden und kranken tierischen und menschlichen Organismus. Auch pflanzliche Zellen und Zelllinien können verwendet werden.
Im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden unter "standardisierten Kulturbedingungen" Kulturbedingungen verstanden, unter denen die jeweiligen Zellarten herkömmlich kultiviert werden. Diese sind dem Fachmann geläufig, siehe zum Beispiel auch W.W. Minuth, R. Strehl, K. Schumacher (2005) Tissue Engineering - Essential for Daily Laboratory Work. WILEY-VCH Verlag, ISBN 3527311866. Unter „standardisierten Bedingungen" können im Zusammenhang der Erfindung aber auch Kulturbedingungen verstanden werden, unter denen die auf einer Standard Kulturoberfläche kultivierten Zellen durch verschiedenste, dem Fachmann bekannten Stimuli zur Differenzierung angeregt werden.
Ferner wird unter "Ernten der Zellen" das Aufarbeiten der Zellen für die nachfolgende Bestimmung der Genaktivitäten verstanden. Die Aufarbeitung hängt dabei davon ab, auf wel- eher Ebene die Genaktivitäten bestimmt werden sollen. Vorteilhafterweise werden die Genaktivitäten auf der Nukleinsäureebene und/oder auf der Proteinebene bestimmt. Die entsprechenden Aufarbeitungsmethoden, d.h. die Isolierung von RNA und/oder Protein sind dem Fachmann bekannt (z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 3. Auflage). Der Ausdruck "Bestimmung von Genaktivitäten" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf Untersuchungen der differenziellen Genexpression, d.h. die Expression verschiedener Gene wird untersucht und die Expressionsmuster bestimmt. Als „Ge- nexpression" wird der gesamte Prozess des Umsetzens der im Gen enthaltenen Information in ein Protein bezeichnet. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Genexpressionsmuster durch Verwendung von Microarrays bestimmt. Man unterscheidet zwei Arten von Microarrays, zum einen DNA-Microarrays und zum anderen Protein- Microarrays. Die Wahl des Microarrays hängt davon ab, auf weicher Ebene die Genaktivitä- ten bestimmt werden sollen. Werden die Genaktivitäten auf Nukleinsäureebene bestimmt, so wird ein DNA-Microarray verwendet. Es gibt zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche die auf gebundener cDNA beruhen und solche die auf synthetisch hergestellten Oligonukleotiden beruhen. Diese dienen als Sonden, die an definierte Positionen eines Rasters z.B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von der Art der verwen- deten Arrays, wird RNA zunächst aus den zu untersuchenden Zellen extrahiert und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen, chemilumineszenten Markierungen, lumineszenten Markierungen und elektronischen Markierungen markiert. Diese werden dann mit den DNA-Microarrays hybridisiert. Hierbei binden markierte cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Nach der Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen, bzw. werden bei Verwendung anderer Markierungen entsprechende, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren herangezogen. Diese reine Intensität wird üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden gute Extraktio- nen und andere Effekte mit einzurechnen. Für Oligomer basierte Microarrays gelangen derzeit zwei weit verbreitete Normaliserungsmethoden zur Anwendung, zum einen RMA (Robust Multiarray Analysis) oder GCOS/MAS der Firma Affymetrix. Anschließend werden die normalisierten Ergebnisse ausgewertet und visualisiert. Auch hierzu steht wieder eine Menge von bioinformatorischen Tools zur Verfügung. So etwa Genesis für die Datenanalyse und Visualisierung. Weiterhin steht mit dem Bioconductor Projekt eine große Bibliothek an Werkzeugen für die Datenanalyse unter GNU__R zur Verfügung. Auch anwendbar ist das System der Firma Applied Biosystems, welches Chemolumineszenz mit Fluoreszenz kombiniert und bei dem keine ESTs gespottet sind, sondern 60er-mer-Oligos. Soll die Genexpression auf Proteinebene bestimmt werden, so werden Protein-Microarrays verwendet und somit Proteine aus den Zellen isoliert. Proteinproben werden dann auf das Array aufgebracht. Jene Spots, in denen keine Interaktion stattfindet, bleiben nach Durchführung eines Waschschritts leer. Die Detektionsmethode erlaubt anschließend die Unterschei- düng zwischen Spots mit und ohne Protein-Protein Interaktion. Es sind auch quantitative Detektionsverfahren möglich, in denen die Menge an haftendem Protein bestimmt werden kann.
Es gibt verschieden Arten von Protein-Microarrays, welche nach der Art der Interaktion (Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Protein oder allgemeine Protein-Protein In- teraktion) unterschieden werden. Es kann auch differenziert werden, ob Proteine der Probe am Array fixiert werden und dann mit einer Vielzahl von spezifischen, bekannten Testproteinen geprüft wird - oder ob die Testproteine in den Testflächen fixiert werden und dann die Reaktion mit den Probenproteinen erfolgt. Die Microarray Western Methode dient zum Nachweis von Antigenen in Zelllysaten ver- schiedener Gewebe oder in durch isoelektrische Fokussierung gewonnenen Proteinfraktionen. Das Zelllysat oder die Proteinfraktion wird auf dem Trägermaterial des Microarrays gespottet, danach wird der Antikörper aufgebracht. In jedem Testfeld mit Antikörper-Antigen Interaktion bleibt der Antikörper haften. Felder mit Antikörper werden dann wie beim Western Blot detektiert. Antikörper Microarrays: Die Antikörper werden fixiert (gespottet) und dann die Probe auf das Array aufgebracht.
Antigen Microarrays: Auf jeder Testfläche des Arrays wird ein anderes Antigen fixiert. Enthält die Probe den dazugehörigen, spezifischen Antikörper, bleibt dieser an der Testfläche haften. Damit kann die Reaktion auf eine Vielzahl von Antigenen oder Allergenen gleichzeitig getestet werden.
Bei Proteindomänen Microarrays werden Fusionsproteine auf dem Array fixiert um Protein- Protein Interaktionen nachzuweisen. Das Fusionsprotein ermöglicht die zuverlässige Fixierung auf dem Array mit dem ersten Teil ohne die interaktionsfähigkeit des anderen Proteinteils zu stören. Das aufgebrachte Protein bleibt nur an jenen Testflächen haften, an denen es zu einer Interaktion kommt.
Ein möglicher Vorteil gegenüber DNA-Microarrays ist die schnellere Vor-Ort-Analyse von Proben, da man auf die oft notwendige Amplifikation genetischen Materials sowie die Hybridisierung verzichten kann. Vorzugsweise werden whole Genome Microarrays für den Schritt d) des Verfahrens verwendet. Auch können Microarrays verwendet werden, mit denen in einem weiteren oder engeren Spektrum gezielt nach einzelnen Funktionen oder Funktionsgruppen der Zelle gesucht werden kann. Solche Funktionsgruppen umfassen Funktionen wie zum Beispiel Zellzyklus, Re- aktionen am Zellkern, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts, Signaltransduktion und/oder Apoptose. Je nach verwendetem Microarray können dadurch eine Vielzahl an Gruppen von aktiven oder inaktiven Genen und Proteinen identifiziert werden, deren Funktionen im derzeit untersuchten Zusammenhang bekannt sind. Hinzu kommt jedoch die Analyse mit vielen Gruppen von Genen und Proteinen, die man in diesem Zusammenhang gar nicht vermutet hätte. Je nach Hoch- oder Herunterregulierung der Genaktivität bzw. Proteinsynthese bei einem getesteten Material können sich dabei individuelle Gen- bzw. Proteinaktivitäten als materialspezifisch erweisen.
Auf diese Weise kann erstmals ein großes Spektrum der komplexen zellbiologischen Reakti- onen von Zellen in Verbindung mit einem Material objektiv erfasst werden:
1 . Im positiven Fall eines Materialtests kann damit das histiotypische Differenzierungsprofil erfasst werden.
2. Im negativen Fall kann damit eine atypische Entwicklung wie eine Dedifferenzierung ermittelt werden. 3. Zwischen diesen beiden Extremen kann ein modifiziertes Material eingeordnet und wenn nötig weiter optimiert werden.
Da die Oberfläche der verwendeten Materialien wie zum Beispiel der Boden einer Kulturschale aus Polysterene nicht die Informationssequenzen wie die natürliche ECM besitzt, können mit der Microarray-Technik erstmals Genprofile für einzelne Zellarten unter Kulturbedingungen erarbeitet und mit einer entsprechenden Kontrolle verglichen werden. Dabei kann objektiv festgestellt werden, welche Materialien typische und welche atypische Reaktionen in den Zellen hervorrufen. In diesem Zusammenhang lassen sich nicht nur einzelne Eigenschaften, sondern ein ganzes zellbiologisches Spektrum an Reaktionen ablesen, das von nicht geeignet, weniger geeignet bis suboptimal und optimal reicht.
Im Hinblick auf die verschiedenen Funktionsgruppen werden bevorzugt folgende Microarrays ausgewählt: Zellzyklus-Microarrays sind derart gestaltet, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche in der Kontrolle von Zellwachstum und Teilung involviert sind und in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden sind, wie z.B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Daten- banken: wwwgenecards.org; gdb.org. Bevorzugt werden die Expressionsprofile der Gene bestimmt, welche z.B. Cycline und ihre assoziierten cyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), CDK-Inhibitoren, CDK-Phosphatasen und Zellzykluscheckpointmoleküle codieren, die in der Kontrolle von Zellwachstum und Teilung involviert sind.
Signaltransduktions-Microarrays sind dergestalt, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche Zellprozesse durch extrazelluläre Liganden, Ligandenrezep- toren und intrazelluläre Signalmodulatoren kontrollieren. Diese sind in den gängigen Datenbanken zu finden, wie z.B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org. Bevorzugt können diese ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend: Ca2+ /NFAT Signalwege, cAMP/Ca2+ Signalwege, DNA-Damage Signalwege, EGF/PDGF Signalwege, Hypoxie Signalwege, G-Proteine und Signalmoleküle, Glukokorticoide Signale, G-Protein gekoppelte Rezeptoren, Wachstumsfaktoren, immunologische Signalwege, Insulin-Signalwege, JAK/STAT-Signalwege, MAP-Kinase-Signalwege, NFκB-Signalwege, Nitrit Oxid, Notch-Signalwege, Kernrezeptoren und Co-Regulatoren, p53-Signalwege, PI3K-AKT-Signalwege, TGFß BMP-Signalwege, ToII- Like-Rezeptorsignalwege, Wnt-Signalwege.
Apoptose-Microarrays sind so gestaltet, dass die Expressionsprofile von Genen bestimmt werden können, welche Schlüssel-Liganden, Rezeptoren, intrazelluläre Modulatoren und Transkriptionsfaktoren codieren, die in der Regulation des programmierten Zelltods involviert sind. Diese sind in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden, wie z.B. der Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org.
Die Microarrays der anderen Funktionsgruppen - Reaktionen am Zellzyklus, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts - umfassen entsprechend die Expressionsprofile von Genen, die in der entsprechenden Funktionsgruppe involviert sind. Diese sind in den gängigen, dem Fachmann bekannten Datenbanken zu finden, wie z.B. der Mouse Genome Informatics: hüp://www.informatics.jax.org, oder in den folgenden Datenbanken: wwwgenecards.org; gdb.org.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nur die Gene identifiziert, bei denen ein Expressionsunterschied von mindestens Faktor zwei vorliegt. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens drei.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht für den Standard-Microarray die folgen- den Gene vor, wenn die bestimmten Zellen z.B. 3T3-L1 Fibroblasten sind: Pyruvat Carboxy- lase, Stearoyl-Coenzym A desaturase 1 , Fatty acid binding protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1 , Apolipoprotein D, Fatty acid binding protein 4, Apolipoprotein C-1 , A- dipsin, Lipin 1 , Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1 , Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
Bei den zu testenden Materialien handelt es sich um langkettige organische Moleküle, um Standardkunststoffmaterialien und bioabbaubare Materialien. Vorzugsweise handelt es sich bei den zu testenden Materialien um 3D Matrixmaterialien. Vorzugsweise wird ein getestetes 3D Matrixmaterial in einer weiteren Ausführungsform im Schritt h) des Verfahrens gemäß Anspruch 1 zusammen mit den Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor und dem im Schritt g) zusammengestelltem Microarray-Standard als Teil des Zellsensorsystems bereit gestellt. Bei diesem 3D Matrixmaterial handelt es sich vorzugsweise um ein Material, welches die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art unterstützt und somit als „Golden Standard" fungieren kann. Bevorzugt handelt es sich bei dem 3D Matrixmaterial um mit CO2 aufgeschäumtes Polystyrol. Dieses Material kann z.B. als „Golden Standard" im Zusammenhang mit 3T3-L1 Fibroblasten und den dafür oben definierten Standard-Microarray verwendet werden.
Die obigen Ausführungen und Definitionen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren gelten auch im Zusammenhang mit den folgenden weiteren Aspekten der Erfindung, insbesondere dem Zellsensorsystem, dem Verfahren zur Beurteilung von Materialien, der Verwendung von Zellen zur Beurteilung der Qualität von Materialien, der Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem, sowie dem erfindungsgemäßen Kit.
Neben dem zuvor beschriebenen Verfahren betrifft die Erfindung ein Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien und zur Beurteilung der Qualität von Materialien, welches aus Zellen besteht und dem/den nach dem Verfahren für die bestimmte Zellart erstelltem/erstellten Standard- Microarray(s). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Standard-Microarrays DNA- Arrays und/oder Proteinarrays.
Vorzugsweise umfasst das Zellsensorsystem eine getestete 3D Matrix. Diese 3D-Matrix besteht üblicherweise aus langkettigen organischen Molekülen, Standardkunststoffmaterialien und bioabbaubaren Materialien. Vorzugsweise handelt es sich bei der 3D Matrix, die Teil des Zellsensorsystems ist, um eine 3D Matrix, die die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art unterstützt und somit als „Golden Standard" fungieren kann. Bevorzugt handelt es sich bei dem 3D Matrixmaterial um mit CO2 aufgeschäumtes Polystyrol. Dieses Material kann z.B. als „Golden Standard" im Zusammenhang mit 3T3-L1 Fibroblasten und den dafür oben definierten Standard-Microarray verwendet werden.
Gelangt eine Zelle in Kontakt mit einer 3D-Matrix, so nimmt sie sensitiv Signale aus ihrer Umgebung war. Ausgelöst bzw. unterstützt werden dadurch die Adhäsion, die Adhärenz, die Affinität, die Mitose, das Spreading aber auch die Differenzierung der Zellen. Diese Signale müssen von der Außenseite der Zelle über die Plasmamembranen in das Zellinnere gelangen. Involviert ist dabei unter anderem das ERK-System, welches die vielfältigen Vorgänge zur Nucleotidsynthese, Genexpressionen und Proteinsynthese beeinflusst, die im Folgenden dann von den MAP-Kinasen gesteuert werden. Eines dieser Schlüsselenzyme für die DNA- beziehungsweise RNA-Synthese ist zum Beispiel die Carbamylphosphatsynthase Il (CPS II). Inkubationen von Kulturen mit epidermalem Wachstumsfaktor haben zum Beispiel gezeigt, dass die ERK-/MAP-Kinasen Phosphatgruppen auf die CPS Il übertragen. Diese Phosphory- lierung kann durch PRPP (Phosphorribosylphosphat) beschleunigt werden, was zu einer erhöhten Nukleotidsynthese (DNA) und damit zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität (Proteinsynthese) führt. Das Signal von den zellulären MAP-Kinasen führt zu einer Erhöhung der Genexpression, indem Rapid Response Gene innerhalb von Minuten aktiviert werden. Dies wiederum geschieht über eine Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und die Phosphorylie- rung von Histonproteinen. Dadurch bedingt kommt es zu einer Konfigurationsänderung an den Histonmolekülen, wodurch die DNA für die mRNA-Bildung und damit die weitere Proteinbildung aktiviert wird.
Die über ERK-/MAP-Kinasen vermittelte Mitose von Zellen wird über die Familie der CDK (cyclin dependent protein kinases) gesteuert. Aktiviert werden das Cyclin D1-Protein und sein Partner Cdk4, wodurch sich ein Komplex bildet. Wird dieser Komplex phosphoryliert, so kann es die in der Zelle vorliegende Mitosehemmung aufheben. Dies wiederum setzt den Transkriptionsfaktor E2F frei, wodurch es zum Anstieg der Transkription von Genen kommt, die über die DNA-Replikation Mitose und Spreading unterstützen.
Anhand dieses Beispiels ist ersichtlich, dass extrazelluläre Signale wichtige Einflüsse auf die Mitose und viele andere wichtige zellbiologischen Funktionen im Innern von Zellen haben können. Dazu gehören neben Signalen von Morphogenen beziehungsweise Wachstumsfak- toren, die Osmolarität des Kulturmediums, der Stress, der durch das Fliessen einer Flüssigkeit oder durch hydrostatischen Druck entsteht, und schließlich auch die Oberfläche und der Binnenraum einer 3D-Matrix.
Wenn sich Zellen in Verbindung mit einer 3D-Matrix optimal entwickeln sollen, dann werden sehr spezifische Eigenschaften der Wachstumsoberfläche und des Binnenraumes benötigt, da letztendlich nur sie eine optimale Affinität und Chancen für eine weitere Entwicklung der Zelle bieten. Vermittelt werden diese Vorgänge über Zellanker (z.B. Integrine), die die Information in das Zellinnere weiterleiten.
Neben den Integrinen haben die matrizellulären Proteine, wie zum Beispiel Trombospondin oder SPARC (Osteonectin) noch eine weitere wichtige Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung der Zellfunktionen. Einerseits können sie die Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix modulieren und andererseits haben sie Einfluss auf die Wirksamkeit von Wachstumsfaktoren durch die Bildung zusätzlicher Rezeptoren. Dieser sehr vielschichti- ge Regulationsmechanismus kann allerdings nur dann entstehen, wenn die Zelle eine geeignete Verankerung auf der angebotenen 3D-Matrix erkennt. Erst dies ermöglicht die Auslösung weiterer vielfältiger zellbiologischer Funktionen über extrazelluläre und zelluläre Signalkaskaden. Diese Reaktionen von Zellen können technisch genutzt werden. Zellen können somit als hochsensibler Sensor eingesetzt werden. Die sehr komplexen zellbiologischen Reaktionen können mit Hilfe eines Standard-Microarrays untersucht und dargestellt werden. Mit Hilfe dieses Zellsensorsystems können dann Materialien untersucht werden. Verwendet werden dazu eine Kontrolle und ein zu testendes Material, wie zum Beispiel eine Modifikation von Polystyrene, das zur Herstellung einer verbesserten Kulturschale verwendet wurde. Zum Testen dieses Materials wird eine definierte Zellpopulation in einem definierten Kulturmedium für einen definierten Zeitraum kultiviert. Die Qualität des zu testenden Materials wird über die zellbiologischen Reaktionen der Zellen festgestellt, die in Verbindung mit dem jeweiligen Material inkubiert werden. Dabei fungieren die Zellen als Sensor auf dem jeweiligen Material und signalisieren ein Bandspektrum zwischen einer positiven und negativen Entwicklung.
Das Signal des Zellsensors ist vielschichtig, deshalb sagen auch einzelne experimentelle Ableitungen der Zelle nichts über ihren wirklichen momentanen Gesamtstatus aus. Aus die- sem Grund müssen möglichst alle möglichen Genreaktionen und Proteinexpressionen er- fasst werden. Dies ist über die Microarray-Technik möglich. Die verwendeten Chips sind aus einer Vielzahl von Informationskanälen aufgebaut, stellen somit einen Übermittler- und gleichzeitiger Verstärkerfunktion (Transducer und Amplifyer) der zellbiologischen Funktionsäußerungen der Zellen dar. Mit Hilfe einer entsprechenden Scannertechnik und Software wird schließlich ermittelt, welche Dimension die Genaktivität und Proteinaktivität zum Zeitpunkt der Messung hat. Von Schritt zu Schritt einer geplanten Materialmodifizierung kann mit dem vorgestellten Zellsensor überprüft werden, ob gleiche oder ganz andere Gengruppen hochreguliert oder herunterreguliert werden. Analog dazu kann mit jeder Materialmodifizierung untersucht werden, welche Gene oder Proteine vermehrt oder vermindert aktiv sind, beziehungsweise gebildet werden. Erstmals können damit die Phasen die Adhäsion, Adhärenz, Affinität, Spreading und Differenzierung objektiv analytisch erfasst werden. Zudem können die Daten erstmals in den entsprechenden Zeitfenstern der oben geschilderten Abläufe erhoben werden. Dies bedeutet, dass ein mit Zellen bewachsenes Material am Anfang, in der Mitte und am Ende eines Versuches ganz andere Eigenschaften haben kann. Der Grund dafür ist, dass die Zellen in Abhängigkeit vom verwendeten Material extrazelluläre Matrix produzieren und dadurch die Oberfläche des Materials im positiven oder negativen Sinn verändern. Auf diese Weise kann mit Hilfe eines Proteinchips zum Beispiel nach Materialeigenschaften gesucht werden, welche die Zellen zur Bildung von extrazellulären Matrixproteinen stimulieren. Die Chiptechnologie bildet die Möglichkeit, dass mit einer einzigen Zellprobe gleichzeitig eine Vielzahl von Tausenden von Genen und Hunderten an Proteinen getestet werden. Dadurch werden Gene und Proteine sichtbar, an die in diesem Zusammenhang nicht gedacht oder als nicht relevant erachtet wurden. Somit muss für jede Zellart ein spezifischer Standard nach dem erfindungsgemäßen Verfahren definiert werden. Entsprechend dieses Standards können verbesserte oder schlechtere Materialien sicher erkannt und ohne subjektive Einflüsse evaluiert werden. Zudem können Risiken von beliebigen Biomaterialien zum ersten Mal objektiv mit der Microarray-Technik erfasst werden. Erstmals wird es dadurch möglich sein, die Dimension der Interaktion von Zellen im Zusammenhang mit einem Biomaterial molekularbiologisch zu definieren. Mit dem vorgestellten Zellsensorsystem wird es möglich sein, die Kultur von Zellen auf beliebigen Materialien objektiv zu beurteilen. Dies kann von den Herstellern von Kulturartikeln als entscheidender Vorteil genutzt werden:
1. Dies gilt für die Modifizierung von bisher verwendeten Materialien.
2. Dies gilt für die Neuentwicklung von Materialien.
3. Dies gilt für die Qualitätssicherung einzelner Chargen.
4. Dies gilt für die Zertifizierung von Produkten anhand von Microarray-Daten.
5. Dies gilt für die Identifizierung nachgeahmter Produkte.
Folgende Zellen und Zelllinien finden bevorzugt als Zellsensoren in dem erfindungsgemäßen Zellsensorsystem Anwendung: Die Zellen der Grundgewebe (Epithel, Muskel, Nervengewebe (Neuronen), Bindegewebe) und des hematopoietischen Systems des gesunden und des kranken tierischen und menschlichen Organismus, Stammzellen, embryonal und erwachse- ne Gewebe, sowie die daraus abgeleiteten Zelllinien, des gesunden und kranken tierischen und menschlichen Organismus. Auch pflanzliche Zellen und Zelllinien können verwendet werden. Die genannten Zellen und Zelllinien finden auch Anwendung in den anderen Aspekten der Erfindung, wie z.B. dem Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, dem Verfahren zur Beurteilung von Materialien, der Verwendung von Zellen, sowie dem Kit.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht als Zellsensor 3T3-L1 Fibroblasten vor.
Verwendet man beim Testen von 3D-Matrices Zelllinien, so muss man zudem berücksichtigen, dass mit jedem Experiment eine Selektion der Zellen mit den besten Affinitätseigen- schatten erreicht werden kann. Werden für die Subkultivierung immer nur diejenigen Zellen verwendet, die eine starke Affinität zur jeweiligen 3D-Matrix zeigen, so werden durch den Selektionsdruck besser haftende Zellen erzeugt. Dabei werden allerdings alle Zellen aus dieser Population verloren, die keine so guten Adhäsionseigenschaften haben. Man kann damit zum Beispiel Zellklone erhalten, die eine immer bessere Affinität für eine 3D-Matrix zeigen. Dieser Effekt ist jedoch für das objektive Testen von Materialien nicht erwünscht. Deshalb müssen die Versuche immer mit Zellen der gleichen Uridentität durchgeführt werden.
In einer noch spezielleren Ausführungsform enthält das Microarray des erfindungsgemäßen Zellsensorsystems folgendes Genprofil: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A desatu- rase 1 , Fatty acid binding protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1 , Apolipoprotein D, Fatty acid binding protein 4, Apolipoprotein C-1 , Adipsin, Lipin 1 , Adinectin, Lipase, Angio- tensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5- Dioxygenase 1 , Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung von Materialien bereit, welches durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten KuI- turbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/ in/ zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung von der Genaktivitäten, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Mic- roarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Kultivierung dritter Zellen der bestimmten Zellart unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), i) Kultivierung von vierten Zellen der bestimmten Art auf verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), j) Ernten der Zellen, k) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe unter Verwendung des Standard-Microarrays.
Erfindungsgemäß ist das Verfahren derart weitergebildet worden, dass nur noch die Schritte h-k durchgeführt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform findet die Kultivierung von Zellen als Kontrollgruppe im Schritt h) des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einem bereits getestetem 3D Material statt. Vorzugsweise unterstützt diese 3D Matrix die Differenzierung der Zellen der bestimmten Art und kann somit als „Golden Standard" definiert werden.
Erfindungsgemäß wird in die Verfahren zur Beurteilung von Materialien das erfindungsgemäße Zellsensorsystem eingesetzt.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung von Zellen zur Beurteilung der Qualität von Materialien anhand der zellbiologischen Reaktionen der Zellen vor. Bevorzugt werden die oben bereits genannten Zellen und Zelllinien verwendet.
In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung die Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Kit vor, das das erfindungsgemäße Zellsensorsystem, Medium und eine oder mehrere 3D-Matrices umfasst.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens näher erläutert.
Beispiel
3T3-L1 Zellsensorsvstem - 3T3-L1 Zellsensor mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von Materialien und zur Beurteilung der Qualität von Materialien. Die Eignung einer 3D Matrix zur Züchtung von qualitativ hochwertigen Zellen mit natürlichem Genexpressionsmuster kann mit Hilfe von Microarrays analysiert werden. Je nach Zelltyp und verwendeten Kulturbedingungen können unterschiedliche Genexpressionsmuster beobachtet werden. In diesem Ausführungsbeispiel wird die Erstellung eines Zellsensorsystems anhand von 3T3-L1 Fibroblasten dargestellt. Diese Zellen wurden zur Validierung einer offenporigen Schaumstruktur aus Polystyrol verwendet. Diese Zelllinie stellt eine Vorstufe zu Fettzellen dar. Die Zellen können sich durch Zugabe von geeigneten Differenzierungsmedien zu Fettzellen entwickeln. Die Zellen wurden in der 3D Struktur und als Kontrollgruppe in Standard Zellkulturschalen kultiviert. Nach einer Kulturdauer von 1 , 3 und 5 Wochen wurden die Zellen lysiert und die in den Zellen enthaltene RNA isoliert. Ausgehend von dieser RNA wurden Microarrays angefertigt um den Differenzierungsgrad und damit die Qualität der Zellen auf dem zu testenden Substrat zu validieren. Insgesamt konnten so 22690 Gene untersucht werden. Zur Auswertung der Microarrays wurden 2 verschiedene Programme angewandt: RMA (Robust Multiarray Analysis) und ein Programm vom Hersteller Affymetrix (GCOS 1.2 Software). Ausschließlich die Gene, für die beide Programme positive oder negative Expressionsunterschiede ergaben, wurden weiter untersucht. Von Interesse waren nur Gene, bei denen eine Veränderung um mindestens den Faktor 3 auftrat und zwar sowohl beim Vergleich mit der Affymetrix- sowie mit der RMA-Software.
Material und Methoden:
Gesamt RNA wurde für die weitere Microarrayanalyse mit einem Oligonukleotid GeneChip® Mouse Genome 430A 2.0 Array (Affymetrix) gemäß der Herstellerangaben isoliert. In Kürze, 5 μg Gesamt RNA wurde verwendet, um Biotin-markierte cRNA zu synthetisieren und 10 μg fragmentierter cRNA wurden mit den GeneChips für 16 Stunden bei 45°C hybridisiert. Die GeneChips wurden gewaschen, wie empfohlen markiert und mit dem GeneArray Scanner, gesteuert durch die Affymetrix GCOS 1.2 Software, gescannt. Die unbearbeiteten Gen- Expressions Daten wurden mit a) dem Affymetrix GCOS 1.2 Software Modul gemäß der Hersteller-Empfehlungen und b) durch die Robust Multiarray Analysis (RMA) (Irizarry, 2003#3) bearbeitet und normalisiert.
Gene, die reproduzierbar eine größer als 1 ,3-fache Regulation zeigten, wurden für die weitere Analyse verwendet.
Ergebnisse: Die Gene des Fett-Stoffwechsels, die Expressionsunterschiede aufwiesen sind in der Tabelle 1 zusammengefasst, die Gene der extrazellulären Matrix (ECM) in der Tabelle 2.
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Tabelle 1 : Wichtigste Faktoren des Fett-Stoffwechsels, die Expressionsunterschiede aufweisen
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Tabelle 2: Wichtigste Faktoren der ECM, die Expressionsunterschiede aufweisen
Ausgehend von dieser ersten Filterung kann ein speziell auf diesen Zelltyp konfektionierter Microarray angefertigt werden, der nur die relevanten Gene enthält. Nachfolgend sind exemplarisch einige Vergleichsgruppen wiedergegeben:
1. Es wurde das Genexpressionsmuster von nicht induzierten Zellen nach 5 Wochen Kulturdauer auf Standard Kulturoberflächen (2D) und in einer 3D Matrix (3D) verglichen. Die in der 3D Matrix kultivierten Zellen zeigen erhöhte Expressionsniveaus bei fetttypischen Genen wie Adipsin oder Lipin 1 , was auf eine verstärkte Differenzierung in der 3D Struktur schließen lässt.
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2. Zur Verifizierung der Ergebnisse aus 1. wurden die auf der Standard Kulturoberfläche (2D) kultivierten Zellen durch einen hormonellen Stimulus zur Differenzierung zu Fettzellen ange- regt. Die bei den differenzierten Zellen exprimierten Gene decken sich größtenteils mit den exprimierten Genen der in der 3D Kultur gezüchteten Zellen.
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Damit konnte gezeigt werden, dass alleine die Kultivierung von 3T3-L1 Fibroblasten in der zu testenden 3D Matrix ohne weitere äußere Stimuli zu einem verbesserten Differenzierungsverhalten führt. Ohne den Einsatz der Arraytechnologie wäre dieser Nachweis nicht möglich oder mit ungemein mehr Aufwand verbunden gewesen. Will man nun weitere Materialien auf diese Eigenschaft hin testen, reicht es aus einen speziell auf den verwendeten Zelltyp und die relevanten Gene hin ausgerichteten Array zu verwenden.

Claims

Zellsensor mit multifunktionellen Reaktionen zur Definition von Qualitätskriterien bei der Herstellung von MaterialienPatentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Zellsensorsystems, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/ in/ zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Mic- roarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Bereitstellung dritter Zellen der bestimmten Zellart als Zellsensor sowie des in Schritt g) zusammengestellten Microarray-Standards.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Materialien 3D-Matrixmaterialien sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der im Schritt g) zusammengestellte Microarray als Standard für die bestimmte Zellart und das verwendete 3D Matrixmaterial definiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass ein 3D Material zusammen mit den Zellen der bestimmten Zellart und dem Microarray als Zellsensorsystem im Schritt h) bereitgestellt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass das 3D Material mit CO2 aufgeschäumtes Polystyrol ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten von Genen aus dem zellspezifischen Genom bestimmt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass für den Schritt d) whole Genome Microarrays verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten von Funktionsgruppen von Genen bestimmt werden, ausgewählt aus Gruppen von Genen der Funktionen Zellzyklus, Reaktionen am Zellkern, Bindung der Zelle an Oberflächen, Zellstress, Bildung des typischen Zytoskeletts, Signaltrans- duktion, Apoptose.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten auf Nukleinsäureebene und/oder auf Proteinebene bestimmt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten durch Verwendung der Microarray-Technik bestimmt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Chip und/oder Protein-Chip verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens 2 beträgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor des Expressionsunterschiedes mindestens 3 beträgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die bestimmte Zellart 3T3-L1 Fibroblasten sind.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass für den Standard-Microarray für 3T3-L1 Fibroblasten folgende Gene verwendet wer- den: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym A desaturase 1, Fatty acid binding protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1, Apolipoprotein D, Fatty acid binding protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procollagen-Lysin 2-Oxoglutarat 5- Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
16. Zellsensorsystem mit multifunktionellen Reaktionen, bestehend aus:
Zellen einer bestimmten Zellart
Microarray(s) mit den nach dem Verfahren 1 speziell für die verwendete Zellart erstellten Genprofilen.
17. Zellsensorsystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellsensorsystem eine 3D Matrix umfasst.
18. Zellsensorsystem nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die 3D Matrix aus mit CO2 aufgeschäumtem Polystyrol besteht.
19. Zellsensorsystem nach einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Microarray(s) ein DNA-Array und/oder ein Proteinarray ist/sind.
20. Zellsensorsystem nach einem der Ansprüche 16-19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen 3T3-L1 Fibroblasten sind.
21. Zellsensorsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Microarray folgendes Genprofil enthält: Pyruvat Carboxylase, Stearoyl-Coenzym
A desaturase 1 , Fatty acid binding protein 5, Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase 1 , Apolipoprotein D, Fatty acid binding protein 4, Apolipoprotein C-1, Adipsin, Lipin 1, Adinectin, Lipase, Angiotensinogen, Resistin, CD36 Antigen, Fibromodulin, Procolla- gen-Lysin 2-Oxoglutarat 5-Dioxygenase 1, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4, Lumican und Clusterin.
22. Verfahren zur Beurteilung von Materialien, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung von ersten Zellen einer bestimmten Art unter standardisierten Kulturbedingungen (Kontrollgruppe), b) Kultivierung von zweiten Zellen der bestimmten Art auf/ in/ zwischen verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), c) Ernten der Zellen, d) Bestimmung der Genaktivitäten, e) Vergleich der Genaktivitäten der Testgruppe mit der Kontrollgruppe, f) Identifikation der Gene, bei denen ein Unterschied in den Genaktivitäten zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe vorliegt, g) Zusammenstellung eines Microarrays unter Verwendung der identifizierten Gene mit unterschiedlicher Genaktivität als Genprofil, wobei dieser konfektionierte Mic- roarray als Standard für die bestimmte Zellart definiert wird, und h) Kultivierung dritter Zellen der bestimmten Zellart unter standardisierten Kulturbe- dingungen (Kontrollgruppe), i) Kultivierung von vierten Zellen der bestimmten Art auf verschiedenen zu testenden Materialien (Testgruppe), j) Ernten der Zellen, k) Bestimmung der Genaktivitäten der Zellen der Kontrollgruppe und der Zellen der Testgruppe unter Verwendung des Standard-Microarrays.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Materialien 3D-Matrixmaterialien sind.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt h) die Kultivierung der Kontrollgruppe auf einem 3D Matrixmaterial erfolgt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 23-24, dadurch gekennzeichnet, dass das 3D Material mit CO2 aufgeschäumtes Polystyrol ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-25, dadurch gekennzeichnet, dass nur noch die Schritte h-k durchgeführt werden.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-26, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellsensorsystem gemäß einem der Ansprüche 16-21 verwendet wird.
28. Verwendung von Zellen zur Beurteilung der Qualität von Materialien anhand der zellbiologischen Reaktionen der Zellen.
29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen 3T3-L1 Fibroblasten sind.
30. Verwendung von Microarrays zur Herstellung eines Standards zur Verwendung in einem Zellsensorsystem.
31. Kit, umfassend das Zellsensorsystems einer der Ansprüche 15-19, Medium und eine 3D-Matrix.
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