WO2007104816A2 - Método de análisis de ácidos nucleicos - Google Patents

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Tamara Maes
Elena Aibar Duran
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Oryzon Genomics, S.A.
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    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors

Definitions

  • the present invention is framed in the field of molecular biology.
  • the present invention aims at a method of nucleic acid analysis that can be used to determine the presence of variations in the genome of an organism, both at the level of alterations in the sequence and the number of copies of a gene.
  • CGH comparative genomic hybridization
  • DNA microarrays also called DNA chips or microarrays
  • DNA chips DNA chips
  • DNA microarray technology has applications in the fields of transcriptomics, genetics and epigenetics. In this sense, different protocols have been developed for the mapping of RNA and DNA samples to be able to carry out massive analyzes in parallel.
  • RNA or DNA differences in the distribution of the signal intensities should be observed when a hybridization with DNA microarrays is carried out depending on whether the hybridized sample is RNA or DNA.
  • genes are expressed in a way differential, so that the different RNA species found in a sample of total RNA may have differences in expression levels of up to 4 orders of magnitude. Consequently, the hybridization signals of labeled RNA or RNA samples cover a similar range of signal intensities (that is, about 4 orders of magnitude) for the probes that are on the surface of the microarray.
  • the prevalence of the different DNA fragments in a genomic DNA sample is identical, so it would be expected that the variation in the intensity of the signal between the different probes of the surface of the microarray was substantially smaller and that it was limited to small variations in the efficiency of mareaje of the different DNA fragments or to variations in the efficiency of hybridization between the different labeled fragments and the probes in the surface of The microarray.
  • mapping protocols that have been used for genome studies include:
  • the detectable signals are in the range between 60 and 60000, the positive reference signal should reach a value of at least 6000, and the negative reference sample should have a residual value clearly below 60.
  • all signal intensities should be between 100 times the minimum clearly detectable signal and the highest detectable signals within the linear range of the scanner. Using the current DNA mapping protocols, this criterion eliminates most of the probes, because there are relatively few probes with an intensity greater than 100 times the background noise.
  • This research group extracted genomic DNA from human samples using Trizol (Invitrogen, USA) as an extraction reagent in addition to purifications by phenol-chloroform. 10 ng of this DNA was amplified by PCR using ⁇ 29 polymerase. This amplified DNA was then digested with two restriction enzymes, AIuI and Rsal, with an incubation time of 2 hours at 37 ° C. Sample mapping led to Use 6 ⁇ g of digested and purified DNA with the "Bioprime labelling kit" (Invitrogen, USA) by adding a nucleotide labeled with Cy3 or Cy5 fluorophores, following the steps recommended by that commercial house.
  • the labeled samples were denatured at 100 0 C for 1 5 minutes and incubated at 37 0 C for 30 minutes. Samples were hybridized using Agilent Technologies recommendations and incubating the sample and reference sample on Ia Ia microarray at a temperature of 65 0 C place overnight. The microarrays were then washed according to the Agilent protocol and scanned using an Agilent 2565AA DNA microarray scanner.
  • the probes used as controls are: ITGB3BP, EXO1, FLJ22116, IF2, CPS1, ST3GALVI, FLJ20432, HPS3, ARHH, SPP1, DKFZp762K2015, CENPE, CCNA2, ESM1, NLN, KIAA0372, LOX, RAD50204, FLX204, FLX204, FLX204 FLJ20624, SERPINE1, FLJ11785, FLJ11785, LOXL2, WRN 1 RAD54B, CML66, HAS2, MGC5254, MLANA, COL13A1, AD24, LMO2, CD69, LOC51290, FLJ21908, MGC5585, KNTC1, TNFRSF1-1, MGAZ5H1-B, MGAZ5H1-B, MGAZ5-1, BAZZ1-1, MGAZ5-B1, BAZZ1-1 , IFI27, FANCA, BRCA1, PMAIP1, HMCS, STCH
  • a method for the analysis of genomic DNA which comprises a fractionation of the DNA, the ligation of adapters and a stage of in vitro transcription of the samples using RNA polymerase.
  • RNA polymerase a set of RNA fragments equivalent to the DNA fragments to be analyzed are generated, these RNA fragments being hybridized with the oligonucleotides of the DNA microarray to carry out the analysis.
  • the sampling of the samples can optionally be carried out.
  • the method of the present invention allows to significantly reduce the variability in the signal intensities of the analyzed samples.
  • the present invention aims at a method of nucleic acid analysis comprising the steps:
  • RNA polymerase capable of initiating the transcription from the promoter sequence contained in the adapters using a mixture of nucleotides (rNTPs)
  • Figure 1 shows a diagram of an example of the steps that make up the method of the invention.
  • Fragmentation of a genomic DNA sample can be carried out by chemical methods, such as treatment with hydrochloric acid, sodium hydroxide, hydrazine, etc .; physical methods, including treatment with ionizing radiation, sonication, etc. or enzymatic methods, such as digestion with endonucleases, such as restriction enzymes.
  • the fragmentation is carried out by digestion with at least one restriction enzyme.
  • fragmentation is carried out by digestion with two restriction enzymes.
  • the method of the present invention can be used to analyze any sample of genomic DNA isolated from any organism in which it is desired to study the presence of variations in the genome.
  • Said method can be applied, among others, for the large-scale analysis of single-feature polymorphisms (SFP), comparative genomic hybridization (CGH) that allows to determine the deletion of a gene or a fragment thereof or the presence of two or more copies of a gene or fragments thereof, genetic mapping based on individual analysis or by "bulked segregant analysis", identification of single nucleotide point mutations (SNP), location of transposons, ChIP -on-chip ("Chromatin immunoprecipitation on chip”), etc.
  • SFP single-feature polymorphisms
  • CGH comparative genomic hybridization
  • SNP single nucleotide point mutations
  • ChIP -on-chip ChIP -on-chip
  • microarray or DNA microarray refers to a collection of multiple oligonucleotides immobilized on a solid substrate, where each oligonucleotide is immobilized in a known position so that the hybridization with each of the Multiple oligonucleotides can be detected separately.
  • the substrate can be compact or porous, flat or non-flat, unitary or distributed.
  • the DNA microarrays on which the hybridization and detection is carried out in the method of the present invention can be made with oligonucleotides deposited by any mechanism or with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism.
  • probe refers to the oligonucleotides immobilized on the solid substrate with which the hybridization of the nucleic acids to be analyzed takes place.
  • the detection of the hybridized fragments is carried out from the direct quantification of the amount of hybridized sample on the DNA probes contained in the DNA microarray.
  • direct quantification can be carried out by techniques that include, but are not limited to, atomic force microscopy (AFM), tunnel effect microscopy (STM) or scanning electron microscopy (SEM); electrochemical methods, such as impedance, voltage or amperage measurement; optical methods, such as confocal and non-confocal microscopy, infrared microscopy, fluorescence detection, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflectance or transmittance and, in general, any surface analysis technique.
  • AFM atomic force microscopy
  • STM tunnel effect microscopy
  • SEM scanning electron microscopy
  • electrochemical methods such as impedance, voltage or amperage measurement
  • optical methods such as confocal and non-confocal microscopy, infrared microscopy, fluorescence detection, luminescence, chemiluminescence, absorb
  • the detection of the hybridized fragments is carried out by means of the detection of a tide incorporated into the fragments to be analyzed.
  • the marking takes place during the in vitro transcription stage by incorporating nucleotide analogs containing directly detectable dips, such as fluorophores, nucleotide analogs that incorporate dips that can be indirectly visualized in a subsequent reaction, such as biotin or haptens, or any other type of direct or indirect nucleic acid mapping known to a person skilled in the art.
  • the marking can be performed using Cy3-UTP, Cy5-UTP or fluorescein-UTP for direct marking or biotin-UTP for indirect marking.
  • RNA polymerase refers to a nucleotide sequence that can be recognized by an RNA polymerase and from which the transcription can be initiated.
  • each RNA polymerase recognizes a specific sequence, by Therefore, the functional promoter sequence included in the adapters is chosen according to the RNA polymerase used.
  • RNA polymerase include, but are not limited to, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase and SP6 RNA polymerase.
  • the present invention also aims at a kit comprising the appropriate reagents, enzymes and additives for carrying out the method of nucleic acid analysis of the invention.
  • the present invention also aims at a kit comprising the DNA reagents, enzymes, additives and microarrays with the appropriate probes for carrying out the method of nucleic acid analysis of the invention.
  • the present invention is based on the improvement of nucleic acid analysis methods through the use of DNA microarrays for the study of variations in the genome of an organism that are currently used. It was observed that when the DNA preparation was coupled with an in vitro transcription step of the DNA fragments amplified by PCR using an RNA polymerase, the hybridization signal with the probes contained in the DNA microarray was more intense and more homogeneous that when the DNA fragments obtained or labeled by other means were hybridized directly. Given that other methods of allegedly random marking produce a very notable bias in the efficiency of marking and / or hybridization of the different labeled fragments, this result was unexpected, and in fact the reasons why the present invention reduces or eliminates this bias are So far unknown.
  • the dispersion of the signal intensities presented by the analyzed samples with respect to the dispersion of the signal intensities of the signals was taken as a reference parameter hybridization controls.
  • the relative percentage of signal strength dispersion was calculated as the ratio between the standard deviation of the set of values and the average of said values.
  • the data corresponding to the mapping with Cy3 (green channel) and the mapping with Cy5 (red channel) are shown. This calculation was carried out both for the probes and for the controls included in the experiment, which allowed also calculating the ratio between the relative dispersion percentage of the signals of the probes with respect to the relative dispersion percentage of the control signals. In this way a value is obtained that reflects the degree of dispersion of the probes with respect to the dispersion of the controls, since this is indicative of the intrinsic variability of the hybridization.
  • the values of the intensities obtained from Ta hybridization are usually represented with each probe contained in the microarray in a logarithmic base scatter plot reflecting the values of the First sample on the X axis and the corresponding values of the second sample on the Y axis.
  • the diagonal of the graph is represented by those points at which a given probe has the same value for both samples.
  • the points should be located on the diagonal.
  • Said dispersion is indicative of the degree of reproducibility of the data of a sample for each probe and has a certain standard deviation associated, calculated based on the ratio of signals from the two samples to the different probes on the surface.
  • the hybridization signals for each of the probes are distributed along the diagonal (or parallel to the diagonal), said intrinsic distribution of the intensity of the signals being in a sample.
  • This dispersion reflects the variation in the efficiency of the detection of the different fragments in a sample, which is given by the combination of the variation in the efficiency of the preparation protocol of the different nucleic acid fragments for hybridization (including, where appropriate , marking) and of the variation in the efficiency of the hybridization of the different fragments of nucleic acids on the surface.
  • This distribution over the entire range of signal intensities has a relative standard deviation associated, defined by the ratio of the standard deviation of the intensities of the probes of a sample divided by the average of the intensities of all probes for this sample.
  • the relative standard deviation of the intensities can be calculated for all the probes in the sample, or for a set of repeated probes that function as controls.
  • the relationship between the standard deviation of the intensities of the sample divided by the ratio of the standard deviation of the intensities of the controls will therefore reflect the contribution of the variation in the efficiency of the protocol of preparation of the different nucleic acid fragments for hybridization. (including, where appropriate, marking) and of the variation in the efficiency of the hybridization of the different fragments of nucleic acids on the surface, to the total dispersion of the intensity of the signals of a sample.
  • the present invention describes a protocol for the preparation of nucleic acid fragments that reduces the dispersion of the intensity of the signals of a sample obtained by hybridization with DNA microarrays.
  • the hybridization with DNA microarrays and the detection meets the requirement that, when in the original nucleic acid all the analyzed fragments were present in the same number of copies, the relationship between the relative dispersion of the intensities of signal of the probes of the sample with respect to the relative dispersion of the signal intensities of the controls is less than 4, preferably less than 3, more preferably less than 2, even more preferably less than 1, 5.
  • One of the ways to control the intensity of the hybridization signals along the diagonal is by varying the amount of hybridized sample, so that the greater the amount of hybridized sample, the greater the signal. In this way, the maximum and minimum signals can be adjusted to be included within the detection range of the scanner.
  • the variation of the amount of sample applied does not affect the profile of the distribution of the signals: increasing the amount of the sample to raise the intensity of low intensity signals or below the detection threshold defined by the noise level of the analysis, will result in intense signals entering the saturation zone.
  • the application of the method of analysis of the present invention results in a homogenization of the signal intensities of the probes of a sample, but also in an increase of the average signal intensity, and therefore improves the signal to noise ratio of the analyzes.
  • the sample that hybridizes with the DNA microarray is constituted by RNA, which entails some advantages in relation to other methods.
  • the RNA-DNA interaction is stronger than the DNA-DNA interaction, this being a reason for the observation of the increase in the intensity of the average signal.
  • the simple RNA chain does not find competition on the part of complementary molecules present in solution for the hybridization on the probes of the surface of the microarray, with which a greater degree of hybridization is obtained with the probes contained in the surface of the DNA microarray.
  • the present invention provides a new method of nucleic acid analysis for the identification of variations in complex genomes with better sensitivity, signal-to-noise ratio and reproducibility than the protocols currently used.
  • Figure 1 presents a detailed scheme of an example of the steps comprising the method of the invention when two restriction enzymes are used for the digestion of the DNA sample.
  • Figure 2 shows the graphical representation, on a logarithmic scale, of the results obtained after the analysis of yeast genomic DNA with the method as described in example 1, that is, with the marking of the samples during the amplification stage by PCR and without carrying out the stage of in vitro transcription. It is observed that the signal intensity values have a distribution along the diagonal of the graph.
  • Figure 3 shows the graphical representation, on a logarithmic scale, of the results obtained after the analysis of yeast genomic DNA with the method of the invention including an in vitro transcription step, as described in example 2. It observes that the signal intensity values show a lower distribution range when a tidal stage is carried out in accordance with the method of the present invention.
  • Figure 4A shows the graphical representation, on a logarithmic scale, of the results obtained after the analysis of rice genomic DNA with the method of the invention, as described in example 3. It is also observed that the signal intensity values show a lower distribution range when the method of the present invention is applied.
  • Figure 4B shows the histogram corresponding to the frequency of the signal intensities obtained in example 3 for the green channel, corresponding to the Cy3 mapping. It is observed that the samples have a normal distribution.
  • Figure 5A shows the graphical representation, on a logarithmic scale, of the data corresponding to the DataSet14 of the work of Barrett et al described above. It is observed that the signal intensity values have a distribution along the diagonal of the graph.
  • Figure 5B shows the histogram corresponding to the frequency of the signal intensities for these same data for the green channel, corresponding to the Cy3 mapping. It is observed that a greater significant dispersion of the signal intensity and a higher frequency at low signal intensities is obtained.
  • Example 1 genomic analysis of yeast genomic DNA by amplification with primers labeled with the fluorophores Cy3 and Cy5 without in vitro transcription stage.
  • Genomic DNA was extracted from a species of yeast, Saccharomyces cerevisiae.
  • the yeast culture cells were precipitated by centrifugation, resuspended in 600 ⁇ l of DNA extraction solution (100 mM Tris-HCI; 50 mM
  • Total genomic DNA (2 ⁇ g) was digested with Sacl (Fermentas, Lithuania) and Msel (New England Biolabs, USA) in an incubation time of 3 hours at 37 0 C.
  • Sacl Fermentas, Lithuania
  • Msel New England Biolabs, USA
  • Sacl / Msel fragments were amplified by PCR using two specific primers based on the sequence of the adapters, at a concentration of 200 nM each, in a reaction with 1x Taq buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 200 nM dNTP, 1 U of Taq polymerase (Fermentas, Lithuania) using the following cycle program: 2 min at 72 0 C; 2 min at 94 0 C; 34 cycles of 3Os at 94 0 C, 3Os at 56 0 C, 9Os at 72 0 C and 10 min at 72 0 C. In this case, one of the two primers, the specific one for the Sacl adapter, was marked.
  • This hybridization consisted of an incubation at 6O 0 C overnight in a hybridization oven and subsequent washing with solutions 6 x SSC, 0.005% Triton (Agilent, USA) at room temperature, and 0.1 x SSC, 0.005% Triton (Agilent, USA) at 4 0 C in order to eliminate the excess of non-hybridized transcripts with the oligonucleotides of the microarray. Then the microarray was dried by centrifugation at 2000 rpm for 7 minutes and, finally, the intensity signals of each oligonucleotide in the microarray were detected with the Axon 4000B scanner.
  • Example 2 genomic analysis of yeast genomic DNA with an in vitro transcription step.
  • Genomic DNA was extracted from a species of yeast, Saccharomyces cerevisiae.
  • the yeast culture cells were precipitated by centrifugation, resuspended in 600 ⁇ l of DNA extraction solution (100 mM Tris-HCI; 50 mM
  • Total genomic DNA (2 ⁇ g) was digested with Sacl (Fermentas, Lithuania) and Msel (New England Biolabs, USA) in an incubation time of 3 hours at 37 0 C.
  • Sacl Fermentas, Lithuania
  • Msel New England Biolabs, USA
  • Sacl / Msel fragments were amplified by PCR using two specific primers based on the sequence of the adapters, at a concentration of 200 nM each, in a reaction with 1 x Taq buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 200 nM dNTP , 1 U of Taq polymerase (Fermentas, Lithuania), using the following cycle program: 2 min at 72 0 C; 2 min at 94 0 C; 34 cycles of 3Os at 94 ° C, 3Os at 56 0 C, 9Os at 72 0 C and 10 min at 72 0 C.
  • RNA amplified by PCR 2.5 ⁇ g was used to carry out the in vitro transcription to RNA from a promoter sequence contained in the Sacl adapter by adding 40 U of T7 RNA polymerase (Ambion, USA) and 7, 5 mM rNTPs, and incubating the samples at 37 0 C place overnight. This reaction was carried out in duplicate in parallel with Cy3-dUTP or Cy5-dUTP (Perkin-Elmer, USA) as labeled nucleotides. After the transcription, the DNA was removed by treatment with
  • RNA labeled with Cy3 and 0.75 ⁇ g of sample RNA labeled with Cy5 were combined to be hybridized on the oligonucleotides of the microarray.
  • Example 3 Genomic DNA analysis of rice with dizziness through an in vitro transcription stage.
  • Genomic DNA was extracted from rice, Oryza sativa sp. Japan Nipponbare.
  • the leaf tissue of the plant frozen in liquid nitrogen was fragmented in a Mixer Mili homogenizer (Retsch GmbH, Germany).
  • the lysate resulting from the homogenization was resuspended in 600 ⁇ l of DNA extraction solution (100 mM Tris-HCI; 50 mM EDTA pH 8), 40 ⁇ l of 20% SDS was added, mixed well and incubated 10 minutes at 65 At 0 C, 200 ⁇ l of cold potassium acetate was added, and it was re-incubated 15 minutes on ice.
  • Total genomic DNA (2 ⁇ g) was digested with Sacl (Fermentas, Lithuania) and Msel (New England Biolabs, USA) in an incubation time of 3 hours at 37 0 C.
  • Sacl Fermentas, Lithuania
  • Msel New England Biolabs, USA
  • Sacl / Msel fragments were amplified by PCR using two specific primers based on the sequence of the adapters, at a concentration of 200 nM each, in a reaction with 1 x Taq buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 200 nM dNTP , 1 U of Taq polymerase (Fermentas, Lithuania), using the following cycle program: 2 min at 72 0 C; 2 min at 94 0 C; 34 cycles of 3Os at 94 ° C, 3Os at 56 0 C, 9Os at 72 0 C and 10 min at 72 0 C.
  • RNA amplified by PCR 2.5 ⁇ g was used to carry out the in vitro transcription to RNA from a promoter sequence contained in the Sacl adapter by adding 40 U of T7 RNA polymerase (Ambion, USA) and 7, 5 mM rNTPs, and incubating the samples at 37 0 C place overnight. This reaction was carried out by duplicated in parallel with Cy3-dUTP or Cy5-dUTP (Perkin-Elmer, USA) as labeled nucleotides. After the transcription, the DNA was eliminated by treatment with 2 U of DNase I (Ambion, USA) at 37 0 C for 30 minutes. The labeled products were purified using MEGAclear TM columns (Ambion, USA).
  • RNA labeled with Cy3 and 0.75 ⁇ g of sample RNA labeled with Cy5 were combined to be hybridized on the oligonucleotides of the microarray.
  • Figure 4A The data obtained from the reading of the signal intensities for each of the fluorophores were plotted as shown in Figure 4A. As observed in example 2, the signals were also grouped in the upper part of the diagonal of the graph, indicating the little dispersion thereof.
  • Figure 4B shows the histogram of the distribution of the signal intensities of the green channel (corresponding to the Cy3 mapping) in which a normal distribution can be observed, with a majority of points that are in a central position of the Intensity range (around 18000-19000 intensity units) and the rest that are symmetrically distributed above and below this central position.
  • the oligonucleotides ORY_C1_X80, ORY_C2_X70, ORY_C3_Z80 and ORY_C4_Z70 repeated 223 times on the surface of the microarray were used as internal controls.

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Abstract

Método de análisis de ácidos nucleicos, que comprende las etapas de fraccionamiento del ácido nucleico, ligación de adaptadores y amplificación del ácido nucleico y una etapa de transcripción in vitro. Dicha invención tiene aplicación en el campo del análisis genómico de organismos mediante el uso de micromatrices de ADN.

Description

MÉTODO DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
MEMORIA DESCRIPTIVA
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca en el campo de Ia biología molecular. En particular, Ia presente invención tiene por objeto un método de análisis de ácidos nucleicos que puede ser utilizado para determinar Ia presencia de variaciones en el genoma de un organismo, tanto a nivel de alteraciones en Ia secuencia como de número de copias de un gen.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Actualmente, una de las técnicas utilizadas para analizar cambios en el número de copias de un gen en un genoma es el método conocido como hibridación genómica comparativa (CGH, comparative genomic hybridization), que permite detectar grandes cambios cromosómicos que tienen lugar en las células incluyendo Ia pérdida, duplicación y transubicación de ADN de un cromosoma a otro.
Con el desarrollo de las micromatrices de ADN (también denominadas chips o microarrays de ADN), éstas han sido rápidamente integradas en los estudios de mapeo genómico, con Io que se obtienen unos mejores niveles de resolución y sensibilidad en el análisis comparativo de ADN genómico y una mayor capacidad de reproducción que permiten Ia detección fiable de alteraciones a nivel individual en los genes.
Gracias a su versatilidad, Ia tecnología de micromatrices de ADN presenta aplicaciones en los campos de Ia transcriptómica, Ia genética y Ia epigenética. En este sentido, se han desarrollado distintos protocolos para el mareaje de las muestras de ARN y ADN para poder llevar a cabo análisis masivos en paralelo.
Teóricamente, deberían observarse diferencias en Ia distribución de las intensidades de señal cuando se lleva a cabo una hibridación con micromatrices de ADN según si Ia muestra hibridada es ARN o ADN. En una célula, los genes se expresan de forma diferencial por Io que las distintas especies de ARN que se encuentran en una muestra de ARN total pueden presentar diferencias en los niveles de expresión de hasta 4 órdenes de magnitud. En consecuencia, las señales de hibridación de muestras de ARN o aRNA marcadas cubren un rango de intensidades de señal similar (es decir, de unos 4 órdenes de magnitud) para las sondas que se encuentran en Ia superficie de Ia micromatriz.
Por contra, aparte del ADN repetitivo o de fragmentos de ADN duplicados o ausentes en muestras individuales, Ia prevalencia de los diferentes fragmentos de ADN en una muestra de ADN genómico es idéntica, por Io que se esperaría que Ia variación de Ia intensidad de Ia señal entre las distintas sondas de Ia superficie de Ia micromatriz fuese sustancialmente menor y que estuviera limitada a pequeñas variaciones en Ia eficiencia de mareaje de los distintos fragmentos de ADN o a variaciones en Ia eficiencia de hibridación entre los diferentes fragmentos marcados y las sondas en Ia superficie de Ia micromatriz.
Sin embargo, el análisis de Ia distribución de señales que se obtienen a partir de los distintos protocolos publicados de hibridación de genoma completo o de subgenoma revela que Ia distribución de las intensidades de señal para las sondas de Ia superficie de Ia micromatriz se asemeja a Ia que se obtiene en los análisis de expresión génica, incluso cuando se tiene un cuidado absoluto en el procedimiento de selección de sondas.
Los protocolos de mareaje que se han utilizado para estudios del genoma incluyen:
- fragmentación del genoma utilizando DNasa I y mareaje en los extremos con transferasa terminal usando UTP marcado (Borevitz et al., 2003. Large-scale identification of single-feature polymorphisms in complex genomes. Genome Research 13:513-523; Winzeler et al., 1998. Direct allelic variation scanning of the yeast genome. Science 281 :1194-97).
- mareaje al azar con cebadores (opcionalmente tras digestión con un enzima de restricción para generar fragmentos más pequeños) utilizando dNTPs marcados (Pollack et al., 1999. Genome-wide analysis of ADN copy-number changes using cDNA microarrays. Nature Genetics 23: 41-46). - amplificación subgenómica mediante digestión con uno o varios enzimas de restricción, ligación de un adaptador y amplificación utilizando cebadores basados en el adaptador, seguido del mareaje en los extremos con transferasa terminal usando UTP marcado (Maitra et al., 2005. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nature Genetics 37(10): 1099-1103).
- amplificación subgenómica mediante digestión con uno o varios enzimas de restricción, ligación de un adaptador y amplificación utilizando cebadores marcados en un extremo basados en el adaptador.
Todos estos protocolos generan señales distribuidas sobre 3-4 órdenes de magnitud, es decir, en el rango de detección total de los escáneres utilizados actualmente. Hasta el momento se desconocen los motivos por los cuales se produce esta distribución en las intensidades de señal, aunque esta variación no se puede explicar completamente por el método de mareaje, por diferencias en las características termodinámicas de las sondas sobre Ia superficie, o por variaciones en el proceso de escaneado y, por Io tanto, deben ser causadas por desviaciones producidas en el método de mareaje.
Por este motivo, se han hecho algunos intentos para mejorar el método de mareaje encaminados a disminuir Ia amplitud del rango de intensidades de señal (Lieu et al., 2005. Development of a DNA-labeling system for array based comparative genomic hybridization. J. Biom. Tech. 16:104-111 ).
La distribución de las intensidades de señal en un rango amplio tiene varias consecuencias en Ia práctica:
- dado que Ia relación señal/ruido de fondo empeora en el rango más bajo de señal, una fracción de las señales pierde calidad para el análisis. La intensidad de señal en el extremo inferior del espectro puede mejorarse añadiendo (hasta un cierto límite) más ADN marcado, pero esto hace que las señales más altas se muevan hacia Ia saturación y se pierda Ia capacidad cuantitativa para estos puntos. - para algunas aplicaciones, incluyendo el mapeo de ADN, es deseable poder llevar a cabo análisis masivos de muestras de ADN, de forma que en lugar de realizar el análisis de una única muestra en comparación con un control, el análisis se realiza sobre una mezcla de varias muestras de tal manera que el nivel de hibridación en Ia mezcla refleja, en comparación con una muestra referencia positiva y con una muestra referencia negativa, Ia frecuencia de Ia presencia de una señal en Ia muestra que contiene Ia mezcla. Típicamente, sería deseable poder detectar una señal que reflejase una dilución de cien veces de Ia señal de Ia muestra referencia positiva. Si, por ejemplo, las señales detectables se encuentran en el rango entre 60 y 60000, Ia señal de referencia positiva debería alcanzar un valor de al menos 6000, y Ia muestra referencia negativa debería tener un valor residual claramente por debajo de 60. Para estas aplicaciones, todas las intensidades de señal deberían estar comprendidas entre 100 veces Ia señal mínima claramente detectable y las señales detectables más altas dentro del rango lineal del escáner. Utilizando los protocolos actuales de mareaje de ADN, este criterio elimina Ia mayoría de las sondas, porque hay relativamente pocas sondas con una intensidad mayor que 100 veces el ruido de fondo.
- para otras aplicaciones, incluyendo el análisis de las variaciones en el número de copias de un gen (como por ejemplo Ia CGH), es deseable obtener en el centro del espectro Ia señal correspondiente al número de copias más frecuentemente observado para permitir Ia identificación de duplicaciones o deleciones con Ia máxima fiabilidad.
Sin embargo, con los protocolos actuales Ia mayoría de puntos aparecen a intensidades de señal bajas, Io que dificulta Ia interpretación de los cambios observados en las intensidades de señal. Esto puede observarse al analizar los datos publicados en Ia literatura como, por ejemplo, el trabajo publicado por Barrett y colaboradores (Barrett MT et al. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proc Nati Acad Sci U S A. 2004 Dec 21 ; 101 (51 ): 17765-70).
Este grupo de investigación extrajo ADN genómico de muestras humanas usando Trizol (Invitrogen, USA) como reactivo de extracción además de purificaciones por fenol- cloroformo. 10 ng de este ADN fue amplificado por PCR usando polimerasa φ29. Después este ADN amplificado fue digerido con dos enzimas de restricción, AIuI y Rsal, con un tiempo de incubación de 2 horas a 37°C. El mareaje de las muestras se llevó a cabo con 6 μg de ADN digerido y purificado con el kit "Bioprime labelling kit" (Invitrogen, USA) añadiendo un nucleótido marcado con los fluoróforos Cy3 o Cy5, siguiendo los pasos recomendados por dicha casa comercial.
Antes de Ia hibridación, las muestras marcadas fueron desnaturalizadas a 1000C durante 1 ,5 minutos e incubadas a 370C durante 30 minutos. Las muestras se hibridaron usando recomendaciones de Agilent Technologies e incubando Ia muestra referencia y Ia muestra problema sobre Ia micromatriz a una temperatura de 650C toda Ia noche. Las micromatrices fueron después lavadas según el protocolo de Agilent y escaneadas usando un escáner Agilent 2565AA DNA microarray scanner.
La representación gráfica de los datos correspondientes al Dataset 14 de esta publicación se muestran en las figuras 5A y 5B y el análisis de los datos realizado según se describe posteriormente se recogen en Ia Tabla 1. Para poder estimar Ia dispersión experimental técnica de Ia plataforma (es decir, Ia dispersión de los niveles de señal de un punto repetido, no Ia dispersión del conjunto total de datos obtenidos de las diferentes sondas), se han tomado como controles los oligonucleótidos repetidos varias veces en Ia micromatriz usada en este documento. En particular, las sondas usadas como controles son: ITGB3BP, EXO1 , FLJ22116, IF2, CPS1 , ST3GALVI, FLJ20432, HPS3, ARHH, SPP1 , DKFZp762K2015, CENPE, CCNA2, ESM1 , NLN, KIAA0372, LOX, RAD50, RAB6KIFL, FLJ20364, FLJ20624, SERPINE1 , FLJ11785, FLJ11785, LOXL2, WRN1 RAD54B, CML66, HAS2, MGC5254, MLANA, COL13A1 , AD24, LMO2, CD69, LOC51290, FLJ21908, MGC5585, KNTC1 , TNFRSF11 B, MGC5302, BAZ1A, AND-1 , HIF1A, IFI27, FANCA, BRCA1 , PMAIP1 , HMCS, STCH, SERPIND1 y NSBP1. Todas estas sondas están repetidas 10 veces.
Tabla 1
Figure imgf000006_0001
Como puede observarse a partir de los datos de Ia Tabla 1 , las señales de las sondas presentaban una dispersión de más de 5 veces Ia dispersión mostrada por los controles, ¡lustrando que hay una dispersión real no debida a Ia ejecución técnica del experimento. Además, gráficamente se observa que las señales correspondientes a las sondas se distribuyen a Io largo de Ia diagonal del gráfico (Figura 5A, gráfica de dispersión de las señales obtenido en el canal verde y el canal rojo) con una mayor frecuencia a intensidades de señal bajas (Figura 5B, histograma que refleja Ia distribución de las señales). Estos resultados indican que Ia particular combinación del protocolo de mareaje y Ia hibridación con Ia colección de sondas sobre Ia superficie utilizada en esta publicación introduce una variabilidad no deseable que puede afectar Ia fiabilidad de parte de los resultados usados.
En Ia presente invención se describe un método para el análisis de ADN genómico que comprende un fraccionamiento del ADN, Ia ligación de adaptadores y una etapa de transcripción in vitro de las muestras utilizando ARN polimerasa. En esta etapa se generan un conjunto de fragmentos de ARN equivalentes a los fragmentos de ADN a analizar, siendo estos fragmentos de ARN los que se hibriden con los oligonucleótidos de Ia micromatriz de ADN para llevar a cabo el análisis. En esta etapa puede llevarse a cabo optativamente el mareaje de las muestras. El método de Ia presente invención permite reducir significativamente Ia variabilidad en las intensidades de señal de las muestras analizadas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene por objeto un método de análisis de ácidos nucleicos que comprende las etapas:
a) fragmentación de una muestra de ADN genómico,
b) ligación, en los extremos de los fragmentos de ADN obtenidos, de adaptadores específicos compatibles con los extremos generados donde al menos uno de los adaptadores ligados contiene una secuencia promotora funcional,
c) amplificación de los fragmentos obtenidos utilizando cebadores específicos basados en los adaptadores, d) transcripción in vitro de los fragmentos de ADN amplificados con una ARN polimerasa capaz de iniciar Ia transcripción a partir de Ia secuencia promotora contenida en los adaptadores utilizando una mezcla de nucleótidos (rNTPs),
e) hibridación con los oligonucleótidos de Ia micromatriz de ADN y detección de los fragmentos hibridados, y
f) comparación cuantitativa de las señales de diferentes muestras analizadas.
En Ia figura 1 se muestra un esquema de un ejemplo de las etapas que conforman el método de Ia invención.
La fragmentación de una muestra de ADN genómico puede llevarse a cabo por métodos químicos, como por ejemplo tratamiento con ácido clorhídrico, hidróxido sódico, hidracina, etc.; métodos físicos, incluyendo tratamiento con radiación ionizante, sonicacion, etc. o métodos enzimáticos, como por ejemplo digestión con endonucleasas, tales como enzimas de restricción. En una realización de Ia invención, Ia fragmentación se realiza mediante digestión con al menos un enzima de restricción. En otra realización de Ia invención, Ia fragmentación se realiza mediante digestión con dos enzimas de restricción.
El método de Ia presente invención puede utilizarse para analizar cualquier muestra de ADN genómico aislada a partir de cualquier organismo en el que se desee estudiar Ia presencia de variaciones en el genoma. Dicho método puede aplicarse, entre otros, para el análisis a gran escala de polimorfismos de característica única (SFP, single-feature polymorphisms), hibridación genómica comparativa (CGH) que permite determinar Ia deleción de un gen o un fragmento del mismo o Ia presencia de dos o más copias de un gen o fragmentos del mismo, mapeo genético a base de análisis de individuos o por "bulked segregant analysis", identificación de mutaciones puntuales de un solo nucleótido (SNP, single nucleotide polymorphisms), localización de trasposones, ChIP-on-chip ("Chromatin immunoprecipitation on chip"), etc.
El término micromatriz o micromatriz de ADN se refiere a una colección de múltiples oligonucleótidos inmovilizados sobre un sustrato sólido, donde cada oligonucleótido está inmovilizado en una posición conocida de forma que Ia hibridación con cada uno de los múltiples oligonucleótidos se puede detectar por separado. El sustrato puede ser compacto o poroso, plano o no plano, unitario o distribuido. Las micromatrices de ADN sobre las que se lleva a cabo Ia hibridación y detección en el método de Ia presente invención pueden ser elaboradas con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.
El término sonda se refiere a los oligonucleótidos inmovilizados sobre el sustrato sólido con los que tiene lugar Ia hibridación de los ácidos nucleicos a analizar.
En una realización de Ia invención, Ia detección de los fragmentos hibridados se lleva a cabo a partir de Ia cuantificación directa de Ia cantidad de muestra hibridada sobre las sondas de ADN contenidas en Ia micromatriz de ADN. Dicha cuantificación directa se puede llevar a cabo mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía de efecto túnel (STM) o microscopía electrónica de barrido (SEM); métodos electroquímicos, como medida de impedancia, voltaje o amperaje; métodos ópticos, como microscopía confocal y no confocal, microscopía de infrarrojos, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia o transmitancia y, en general, cualquier técnica de análisis de superficies.
En otra realización de Ia invención, Ia detección de los fragmentos hibridados se lleva a cabo mediante Ia detección de un mareaje incorporado en los fragmentos a analizar. En particular, el mareaje tiene lugar durante Ia etapa de transcripción in vitro mediante Ia incorporación de análogos de nucleótidos que contienen mareajes detectables directamente, tales como fluoróforos, análogos de nucleótidos que incorporan mareajes que pueden ser visualizados indirectamente en una reacción posterior, tales como biotina o haptenos, o cualquier otro tipo de mareaje de ácidos nucleicos directo o indirecto conocido para un experto en Ia materia. En particular, el mareaje puede realizarse utilizando Cy3-UTP, Cy5-UTP o fluoresceína-UTP para el mareaje directo o biotina-UTP para el mareaje indirecto.
El término secuencia promotora funcional se refiere a una secuencia de nucleótidos que puede ser reconocida por una ARN polimerasa y a partir de Ia cual se puede iniciar Ia transcripción. En general, cada ARN polimerasa reconoce una secuencia específica, por Io que la secuencia promotora funcional comprendida en los adaptadores se elige de acuerdo con Ia ARN polimerasa que se utilice. Ejemplos de ARN polimerasas incluyen, pero no se limitan a, T7 ARN polimerasa, T3 ARN polimerasa y SP6 ARN polimerasa.
La presente invención también tiene por objeto un kit que comprende los reactivos, enzimas y aditivos apropiados para llevar a cabo el método de análisis de ácidos nucleicos de Ia invención.
Asimismo, Ia presente invención también tiene por objeto un kit que comprende los reactivos, enzimas, aditivos y micromatrices de ADN con las sondas apropiados para llevar a cabo el método de análisis de ácidos nucleicos de Ia invención.
La presente invención se basa en Ia mejora de los métodos de análisis de ácidos nucleicos mediante el uso de micromatrices de ADN para el estudio de variaciones en el genoma de un organismo que se emplean en Ia actualidad. Se observó que cuando a Ia preparación de ADN se acoplaba una etapa de transcripción ¡n vitro de los fragmentos de ADN amplificados por PCR utilizando una ARN polimerasa, Ia señal de hibridación con las sondas contenidas en Ia micromatriz de ADN era más intensa y más homogénea que cuando se hibridaban directamente los fragmentos de ADN obtenidos o marcados por otros medios. Dado que otros métodos de mareaje supuestamente aleatorios producen un sesgo muy notable en Ia eficiencia de mareaje y/o hibridación de los diferentes fragmentos marcados, este resultado era inesperado, y de hecho los motivos por los que Ia presente invención reduce o elimina este sesgo son de momento desconocidos.
Para determinar Ia mejora del método de Ia presente invención en relación con otros métodos comúnmente utilizados en Ia actualidad, se tomó como parámetro de referencia Ia dispersión de las intensidades de señal que presentan las muestras analizadas respecto a Ia dispersión de las intensidades de señal de los controles de hibridación.
Por ejemplo, para cada canal de lectura del escáner (correspondiente a un mareaje determinado) se calculó el porcentaje relativo de dispersión de las intensidades de señal como Ia relación entre Ia desviación estándar del conjunto de valores y Ia media de dichos valores. En los ejemplos de Ia presente invención se muestran los datos correspondientes al mareaje con Cy3 (canal verde) y al mareaje con Cy5 (canal rojo). Este cálculo se realizó tanto para las sondas como para los controles incluidos en el experimento, Io que permitió calcular también Ia relación entre el porcentaje relativo de dispersión de las señales de las sondas respecto al porcentaje relativo de dispersión de las señales de los controles. De esta forma se obtiene un valor que refleja el grado de dispersión de las sondas respecto a Ia dispersión de los controles, ya que ésta es indicativa de Ia variabilidad intrínseca de Ia hibridación. Por otra parte, también se consideró como valor de referencia el promedio de Ia relación entre Ia intensidad de señal de cada punto respecto a Ia intensidad de su propio ruido de fondo. En todos estos cálculos se puede esperar que cualquier aproximación de normalización afectará a todos los valores de forma similar, dejando Ia relación más o menos invariable.
Para llevar a cabo el análisis comparativo de las intensidades de señal de dos muestras, se suele representar los valores de las intensidades obtenidos a partir de Ta hibridación con cada sonda contenida en Ia micromatriz en una gráfica de dispersión en base logaritmica reflejando los valores de Ia primera muestra en el eje X y los valores correspondientes de Ia segunda muestra en el eje Y. La diagonal de Ia gráfica viene representada por aquellos puntos en los que una sonda determinada presenta un mismo valor para ambas muestras. Cuando se comparan dos muestras idénticas, idealmente, los puntos deberían estar situados sobre Ia diagonal. Sin embargo, experimentalmente se observa que se produce una cierta dispersión de los puntos con respecto a Ia diagonal (es decir, una dispersión perpendicular a Ia diagonal), o por tanto una dispersión de Ia relación de los valores de intensidad de dos muestras idénticas. Dicha dispersión es indicativa del grado de reproducibilidad de los datos de una muestra para cada sonda y tiene asociada una determinada desviación estándar, calculada en base a Ia relación de señales de las dos muestras para las diferentes sondas sobre Ia superficie.
Por otra parte, en Ia gráfica de dispersión descrita anteriormente, las señales de hibridación para cada una de las sondas se distribuyen a Io largo de Ia diagonal (o paralelo a Ia diagonal), siendo dicha distribución intrínseca de Ia intensidad de las señales en una muestra. Esta dispersión refleja Ia variación en Ia eficiencia de Ia detección de los diferentes fragmentos en una muestra, que viene dada por Ia combinación de Ia variación en Ia eficiencia del protocolo de preparación de los diferentes fragmentos de ácidos nucleicos para hibridación (incluyendo, en su caso, mareaje) y de Ia variación en Ia eficiencia de Ia hibridación de los diferentes fragmentos de ácidos nucleicos sobre Ia superficie. Esta distribución a Io largo de todo el rango de intensidades de señal tiene asociada una desviación estándar relativa, definida por Ia relación de Ia desviación estándar de las intensidades de las sondas de una muestra dividida por el promedio de las intensidades de todas las sondas para esta muestra. La desviación estándar relativa de las intensidades se puede calcular para el conjunto de todas las sondas de Ia muestra, o para un conjunto de sondas repetidas que funcionan como controles. La relación entre Ia desviación estándar de las intensidades de Ia muestra dividida por Ia relación de Ia desviación estándar de las intensidades de los controles reflejará por tanto Ia contribución de Ia variación en Ia eficiencia del protocolo de preparación de los diferentes fragmentos de ácidos nucleicos para hibridación (incluyendo, en su caso, mareaje) y de Ia variación en Ia eficiencia de Ia hibridación de los diferentes fragmentos de ácidos nucleicos sobre Ia superficie, a Ia dispersión total de Ia intensidad de las señales de una muestra.
La presente invención describe un protocolo de preparación de fragmentos de ácidos nucleicos que reduce Ia dispersión de Ia intensidad de los señales de una muestra obtenidos mediante su hibridación con micromatrices de ADN.
En una realización de Ia invención, Ia hibridación con micromatrices de ADN y Ia detección cumple el requisito de que, cuando en el ácido nucleico original todos los fragmentos analizados estaban presentes en el mismo número de copias, Ia relación entre Ia dispersión relativa de las intensidades de señal de las sondas de Ia muestra respecto a Ia dispersión relativa de las intensidades de señal de los controles es menor que 4, preferentemente menor que 3, más preferentemente menor que 2, aún más preferentemente menor que 1 ,5.
Una de las formas de controlar Ia intensidad de las señales de hibridación a Io largo de Ia diagonal es variando Ia cantidad de muestra hibridada, de manera que a mayor cantidad de muestra hibridada, mayor señal. De esta forma se pueden ajustar las señales máxima y mínima para que estén incluidas dentro del rango de detección del escáner. No obstante, Ia variación de Ia cantidad de muestra aplicada no afecta el perfil de Ia distribución de las señales: incrementando Ia cantidad de Ia muestra para subir Ia intensidad de señales poco intensas o por debajo del umbral de detección definido por el nivel de ruido del análisis, tendrá por consecuencia que señales intensas entrarán en Ia zona de saturación. La aplicación del método de análisis de Ia presente invención resulta en una homogenización de las intensidades de señal de las sondas de una muestra, pero también en un aumento de Ia intensidad del señal promedio, y mejora por tanto Ia relación señal ruido de los análisis.
En el método de Ia presente invención Ia muestra que se híbrida con Ia micromatriz de ADN está constituida por ARN, Io que comporta algunas ventajas en relación a otros métodos. Por un lado, Ia interacción ARN-ADN es más fuerte que Ia interacción ADN- ADN, pudiendo ser esto una razón para Ia observación del aumento de Ia intensidad de Ia señal promedio. Por otro lado, Ia cadena simple de ARN no encuentra competencia por parte de moléculas complementarias presentes en solución para Ia hibridación sobre las sondas de Ia superficie de Ia micromatriz , con Io que se obtiene un mayor grado de hibridación con las sondas contenidas en Ia superficie de Ia micromatriz de ADN.
Por Io tanto, Ia presente invención proporciona un nuevo método de análisis de ácidos nucleicos para Ia identificación de variaciones en genomas complejos con unas mejores sensibilidad, relación señal/ruido de fondo y reproducibilidad que los protocolos utilizados actualmente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 presenta un esquema detallado de un ejemplo de las etapas que comprende el método de Ia invención cuando se utilizan dos enzimas de restricción para Ia digestión de Ia muestra de ADN.
La figura 2 muestra Ia representación gráfica, a escala logarítmica, de los resultados obtenidos tras el análisis de ADN genómico de levadura con el método según se describe en el ejemplo 1 , es decir, con el mareaje de las muestras durante Ia etapa de amplificación por PCR y sin llevar a cabo Ia etapa de transcripción in vitro. Se observa que los valores de intensidad de señal presentan una distribución a Io largo de Ia diagonal del gráfico.
La figura 3 muestra Ia representación gráfica, a escala logarítmica, de los resultados obtenidos tras el análisis de ADN genómico de levadura con el método de Ia invención incluyendo una etapa de transcripción in vitro, según se describe en el ejemplo 2. Se observa que los valores de intensidad de señal muestran un menor rango de distribución cuando se lleva a cabo una etapa de mareaje de acuerdo con el método de Ia presente invención.
La figura 4A muestra Ia representación gráfica, a escala logarítmica, de los resultados obtenidos tras el análisis de ADN genómico de arroz con el método de Ia invención, según se describe en el ejemplo 3. También se observa que los valores de intensidad de señal muestran un menor rango de distribución cuando se aplica el método de Ia presente invención. La figura 4B muestra el histograma correspondiente a Ia frecuencia de las intensidades de señal obtenidas en el ejemplo 3 para el canal verde, correspondiente al mareaje con Cy3. Se observa que las muestras presentan una distribución normal.
La figura 5A muestra Ia representación gráfica, a escala logarítmica, de los datos correspondientes al DataSet14 del trabajo de Barrett y colaboradores descrito anteriormente. Se observa que los valores de intensidad de señal presentan una distribución a Io largo de Ia diagonal del gráfico. La figura 5B muestra el histograma correspondiente a Ia frecuencia de las intensidades de señal para estos mismos datos para el canal verde, corresponiente al mareaje con Cy3. Se observa que se obtiene una mayor importante dispersión de Ia intensidad de las señales y una mayor frecuencia a intensidades de señal bajas.
EJEMPLOS
A continuación se describen algunos ejemplos no limitativos del método de Ia presente invención.
Ejemplo 1 : análisis de ADN genómico de levadura con mareaje mediante amplificación con cebadores marcados con los fluoróforos Cy3 y Cy5 sin etapa de transcripción in vitro. Preparación del ADN
Se extrajo el ADN genómico a partir de una especie de levadura, Saccharomyces cerevisiae. Se precipitaron las células del cultivo de Ia levadura mediante centrifugación, se resuspendieron en 600 μl de solución de extracción de ADN (100 mM Tris-HCI; 50 mM
EDTA pH 8), se añadieron 40 μl de SDS 20%, se mezcló bien y se incubó 10 minutos a
65° C, se añadieron 200 μl de acetato de potasio frío y se incubó 15 minutos en hielo.
Después se centrifugó a 40C a 16000 rpm durante 15 minutos en microcentrifuga y se añadieron 600 μl de isopropanol a 400 μl de sobrenadante. El ADN se precipitó mediante centrifugación a 16000 rpm durante 15 min, el precipitado se lavó con 200 μl de etanol
70% y se dejó secar. Se disolvió el precipitado en 100 μl de TE.
Purificación del ADN
Se añadieron 2 μl de RNasa 10 mg/ml a Ia muestra, se incubó durante 15 minutos en el baño a 370C. Se añadieron 100 μl de solución CTAB (2% peso/volumen CTAB= bromuro de hexadeciltrimetil amonio; 200 mM Tris; 50 mM EDTA pH 7.5, 2M NaCI), y después de una incubación de 15 minutos a 650C, se añadieron 200 μl de CHCI3:alcohol isoamílico 24:1. Se centrifugó durante 5 minutos en Ia microcentrifuga a 15000 rpm y se precipitaron 200 μl del sobrenadante con 180 μl de isopropanol. Se centrifugó en Ia microcentrifuga a 15000 rpm durante 10 minutos, el precipitado se lavó con 100 μl de etanol al 70% y se dejó secar al aire. El precipitado se disolvió finalmente en 50 μl de agua.
Digestión de ADN y ligación de adaptadores
Se digirió el ADN genómico total (2 μg) con Sacl (Fermentas, Lituania) y Msel (New England Biolabs, USA) en un tiempo de incubación de 3 horas a 370C. A los fragmentos de ADN generados tras Ia digestión, se ligaron el adaptador Sacl compatible con el extremo cohesivo del enzima Sacl y el adaptador Msel compatible con el extremo cohesivo Msel mediante Ia T4 ADN ligasa (Fermentas, Lituania) en el tampón T4 ligasa buffer (Fermentas, Lituania) en un tiempo de incubación de 4 horas a temperatura ambiente. Amplificación de ADN
Se amplificaron los fragmentos Sacl/Msel mediante PCR usando dos cebadores específicos basados en Ia secuencia de los adaptadores, a una concentración 200 nM cada uno, en una reacción con tampón 1x Taq, 1 ,5 mM de MgCI2, 200 nM de dNTP, 1 U de Taq polimerasa (Fermentas, Lituania) usando el siguiente programa de ciclos: 2 min a 720C; 2 min a 940C; 34 ciclos de 3Os a 940C, 3Os a 560C, 9Os a 720C y 10 min a 720C. En este caso, uno de los dos cebadores, el específico para el adaptador Sacl, estaba marcado. De esta manera Ia incorporación de mareaje se realizó a medida que tenía lugar Ia amplificación de ADN en Ia PCR. Se llevó a cabo Ia PCR por duplicado en paralelo de forma que en un caso el cebador contenía una molécula de fluorocromo Cy3 en el extremo 5' mientras que en el otro contenía el fluorocromo Cy5.
Hibridación sobre micromatriz.
Se combinaron 0.75 μg de ADN de Ia muestra marcada con Cy3 y 0.75 μg de ADN de Ia muestra marcada con Cy5 y se desnaturalizaron a 980C durante 5 minutos antes de ser hibridadas. A esta mezcla de ADN se Ie añadió 100 μl de solución de hibridación 2x (Agilent, USA) y se híbrido sobre Ia micromatriz siguiendo las recomendaciones de Ia casa comercial Agilent Technologies, USA. Esta hibridación consistió en una incubación a 6O0C durante toda una noche en un horno de hibridación y en lavados posteriores con soluciones 6 x SSC, 0.005% Tritón (Agilent, USA) a temperatura ambiente, y 0,1 x SSC, 0.005% Tritón (Agilent, USA) a 40C con el fin de eliminar el exceso de transcritos no hibridados con los oligonucleótidos de Ia micromatriz. A continuación Ia micromatriz fue secada mediante una centrifugación a 2000 rpm durante 7 minutos y, finalmente, las señales de intensidad de cada oligonucleótido en Ia micromatriz fueron detectadas con el escáner Axon 4000B.
Los datos obtenidos a partir de Ia lectura de las intensidades de señal para cada uno de los fluoróforos se representaron gráficamente tal como se muestra en Ia figura 2. Se observa una distribución de las intensidades de señal a Io largo de Ia diagonal del gráfico, de forma similar a Io que se obtendría en un experimento de análisis de expresión diferencial, Io que indica que existe una variabilidad en el mareaje de las muestras. Por otra parte, estos datos se procesaron para llevar a cabo un análisis cuantitativo. Se calculó el porcentaje relativo de dispersión de las señales, tanto para las sondas como para los controles incluidos en el experimento, como Ia relación entre Ia desviación estándar para cada grupo de valores y Ia media de dichos valores. También se calculó Ia relación entre el porcentaje relativo de dispersión de las señales de las sondas respecto al porcentaje relativo de dispersión de las señales de los controles. Este valor refleja el grado de dispersión de las sondas respecto a Ia dispersión de los controles. Asimismo, se calculó el promedio de Ia relación entre Ia intensidad de señal de cada punto respecto a Ia intensidad de su propio ruido de fondo. Los resultados se recogen en Ia Tabla 2.
Tabla 2
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Los resultados muestran que debido a Ia variabilidad en el mareaje de las muestras, las señales de las sondas muestran una dispersión de hasta casi 5 veces con relación a Ia dispersión que presentan los controles incluidos en el experimento.
Ejemplo 2: análisis de ADN genómico de levadura con mareaje mediante una etapa de transcripción in vitro.
Preparación del ADN
Se extrajo el ADN genómico a partir de una especie de levadura, Saccharomyces cerevisiae. Se precipitaron las células del cultivo de Ia levadura mediante centrifugación, se resuspendieron en 600 μl de solución de extracción de ADN (100 mM Tris-HCI; 50 mM
EDTA pH 8), se añadieron 40 μl de SDS 20%, se mezcló bien y se incubó 10 minutos a
65° C, se añadieron 200 μl de acetato de potasio frío y se incubó 15 minutos en hielo.
Después se centrifugó a 40C a 16000 rpm durante 15 minutos en microcentrifuga y se añadieron 600 μl de isopropanol a 400 μl de sobrenadante. El ADN se precipitó mediante centrifugación a 16000 rpm durante 15 min, el precipitado se lavó con 200 μl de etanol 70% y se dejó secar. Se disolvió el precipitado en 100 μl de TE.
Purificación del ADN
Se añadieron 2 μl de RNasa 10 mg/ml a Ia muestra, se incubó durante 15 minutos en el baño a 370C. Se añadieron 100 μl de solución CTAB (2% peso/volumen CTAB= bromuro de hexadeciltrimetil amonio; 200 mM Tris; 50 mM EDTA pH 7.5, 2M NaCI), y después de una incubación de 15 minutos a 650C, se añadieron 200 μl de CHCI3:alcohol isoamílico 24:1. Se centrifugó durante 5 minutos en Ia microcentrífuga a 15000 rpm y se precipitaron 200 μl del sobrenadante con 180 μl de isopropanol. Se centrifugó en Ia microcentrífuga a 15000 rpm durante 10 minutos, el precipitado se lavó con 100 μl de etanol al 70% y se dejó secar al aire. El precipitado se disolvió finalmente en 50 μl de agua.
Digestión de ADN y ligación de adaptadores
Se digirió el ADN genómico total (2 μg) con Sacl (Fermentas, Lituania) y Msel (New England Biolabs, USA) en un tiempo de incubación de 3 horas a 370C. A los fragmentos de ADN generados tras Ia digestión, se ligaron el adaptador Sacl compatible con el extremo cohesivo del enzima Sacl y el adaptador Msel compatible con el extremo cohesivo Msel mediante Ia T4 ADN ligasa (Fermentas, Lituania) en el tampón T4 ligasa buffer (Fermentas, Lituania) en un tiempo de incubación de 4 horas a temperatura ambiente.
Amplificación de ADN
Se amplificaron los fragmentos Sacl/Msel mediante PCR usando dos cebadores específicos basados en Ia secuencia de los adaptadores, a una concentración 200 nM cada uno, en una reacción con tampón 1 x Taq, 1 ,5 mM de MgCI2, 200 nM de dNTP, 1 U de Taq polimerasa (Fermentas, Lituania), usando el siguiente programa de ciclos: 2 min a 720C; 2 min a 940C; 34 ciclos de 3Os a 94° C, 3Os a 560C, 9Os a 720C y 10 min a 720C. Transcripción in vitro
Se utilizaron 2,5 μg de ADN amplificado por PCR para llevar a cabo Ia transcripción in vitro a ARN a partir de una secuencia promotora contenida en el adaptador Sacl mediante Ia adición de 40 U de T7 ARN polimerasa (Ambion, USA) y 7,5 mM de rNTPs, e incubando las muestras a 370C toda Ia noche. Esta reacción se llevó a cabo por duplicado en paralelo con Cy3-dUTP o bien Cy5-dUTP (Perkin-Elmer, USA) como nucleótidos marcados. Tras Ia transcripción, se eliminó el ADN mediante tratamiento con
2 U de DNasa I (Ambion, USA) a 370C durante 30 minutos. Los productos marcados fueron purificados usando columnas MEGAclear™ (Ambion, USA).
Hibridación sobre micromatriz
Se combinaron 0,75 μg de ARN de muestra marcada con Cy3 y 0.75 μg de ARN de muestra marcada con Cy5 para ser hibridadas sobre los oligonucléotidos de Ia micromatriz. A esta mezcla de ARN se Ie añadió 100 μl de solución de hibridación 2 x (Agilent, USA) y se cargó en el chip tal y como recomienda Ia casa comercial Agilent Technologies. La hibridación tuvo lugar a 6O0C durante toda una noche en un horno de hibridación: Después se lavó Ia micromatriz con soluciones 6 x SSC, 0.005% Tritón (Agilent, USA) a temperatura ambiente, y 0,1 x SSC, 0,005 % Tritón (Agilent, USA) a 40C para eliminar el exceso de transcritos no hibridados. Acto seguido el chip fue secado mediante una centrifugación a 2000 rpm durante 7 minutos y finalmente, las señales de intensidad de cada oligonucleótido en Ia micromatriz fueron detectadas con el escáner Axon 4000B.
Los datos obtenidos a partir de Ia lectura de las intensidades de señal para cada uno de los fluoróforos se representaron gráficamente tal como se muestra en Ia figura 3. Se observa que las intensidades de señal se agrupan en Ia parte superior de Ia diagonal del gráfico, Io que indica que el mareaje es más homogéneo que el que se observaba en el ejemplo 1 , donde las señales se distribuían a Io largo de Ia diagonal.
Por otra parte, los datos se procesaron para llevar a cabo un análisis cuantitativo tal como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se recogen en Ia Tabla 3. Tabla 3
Figure imgf000020_0001
Estos resultados indican que cuando se lleva a cabo una etapa de mareaje mediante transcripción in vitro según el método de Ia presente invención, las señales correspondientes a las sondas presentan una dispersión similar a Ia que presentan los controles del mismo experimento, a diferencia de Io que ocurre cuando no se realiza esta etapa, tal como se ha descrito en el experimento 1. Esta mejora en Ia dispersión de las señales permite que se puedan detectar más fácilmente aquellas muestras que puedan presentar alguna alteración a nivel genómico. Además, también se obtiene una mejor relación señal/ruido de fondo.
Ejemplo 3: análisis de ADN genómico de arroz con mareaje mediante una etapa de transcripción in vitro.
Preparación de ADN
Se extrajo el ADN genómico a partir del arroz, Oryza sativa sp. japónica Nipponbare. Se fragmentó el tejido de hoja de Ia planta congelado en nitrógeno líquido en un homogenizador Mixer Mili (Retsch GmbH, Alemania). El lisado resultante de Ia homogenización se resuspendió en 600 μl de solución de extracción de ADN (100 mM Tris-HCI; 50 mM EDTA pH 8), se añadieron 40 μl de SDS 20%, se mezcló bien y se incubó 10 minutos a 650C, se añadieron 200 μl de acetato de potasio frío, y se volvió a incubar 15 minutos en hielo. Después se centrifugó a 40C a 16000 rpm durante 15 minutos en microcentrifuga, se añadieron 600 μl de isopropanol a 400 μl de sobrenadante. El ADN se precipitó mediante centrifugación a 16000 rpm durante 15 minutos, el precipitado se lavó con 200 μl de etanol al 70% y se dejó secar. Se disolvió el precipitado en 100 μl de TE. Purificación del ADN
Se añadieron 2 μl de RNasa 10 mg/ml a Ia muestra y se incubó durante 15 minutos en el baño a 370C. Se añadieron 100 μl de solución CTAB (2% peso/volumen CTAB= bromuro de hexadeciltrimetil amonio; 200 mM Tris; 50 mM EDTA pH 7.5, 2M NaCI), y después de una incubación de 15 minutos a 650C se añadieron 200 μl de CHCI3:alcohol isoamílico
24:1. Se centrifugó 5 minutos en Ia microcentrífuga a 15000 rpm y se precipitaron 200 μl del sobrenadante con 180 μl de isopropanol. Se centrifugó en Ia microcentrífuga a 15000 rpm durante 10 minutos, el precipitado se lavó con 100 μl de etanol al 70% y se dejó secar al aire. El precipitado se disolvió finalmente en 50 μl de agua.
Digestión de ADN y ligación de adaptadores
Se digirió el ADN genómico total (2 μg) con Sacl (Fermentas, Lituania) y Msel (New England Biolabs, USA) en un tiempo de incubación de 3 horas a 370C. A los fragmentos de ADN generados tras Ia digestión, se ligaron mediante Ia T4 ADN ligasa (Fermentas, Lituania) en el tampón T4 ligasa buffer (Fermentas, Lituania) en un tiempo de incubación de 4 horas a temperatura ambiente, el adaptador Sacl compatible con el extremo cohesivo del enzima Sacl y el adaptador Msel compatible con el extremo cohesivo Msel.
Amplificación de ADN
Se amplificaron los fragmentos Sacl/Msel mediante PCR usando dos cebadores específicos basados en Ia secuencia de los adaptadores, a una concentración 200 nM cada uno, en una reacción con tampón 1 x Taq, 1 ,5 mM de MgCI2, 200 nM de dNTP, 1 U de Taq polimerasa (Fermentas, Lituania), usando el siguiente programa de ciclos: 2 min a 720C; 2 min a 940C; 34 ciclos de 3Os a 94° C, 3Os a 560C, 9Os a 720C y 10 min a 720C.
Transcripción in vitro
Se utilizaron 2,5 μg de ADN amplificado por PCR para llevar a cabo Ia transcripción in vitro a ARN a partir de una secuencia promotora contenida en el adaptador Sacl mediante Ia adición de 40 U de T7 ARN polimerasa (Ambion, USA) y 7,5 mM de rNTPs, e incubando las muestras a 370C toda Ia noche. Esta reacción se llevó a cabo por duplicado en paralelo con Cy3-dUTP o bien Cy5-dUTP (Perkin-Elmer, USA) como nucleótidos marcados. Tras Ia transcripción, se eliminó el ADN mediante tratamiento con 2 U de DNasa I (Ambion, USA) a 370C durante 30 minutos. Los productos marcados fueron purificados usando columnas MEGAclear™ (Ambion, USA).
Hibridación sobre micromatriz
Se combinaron 0,75 μg de ARN de muestra marcada con Cy3 y 0.75 μg de ARN de muestra marcada con Cy5 para ser hibridadas sobre los oligonucléotidos de Ia micromatriz. A esta mezcla de ARN se Ie añadió 100 μl de solución de hibridación 2 x (Agilent, USA) y se cargó en el chip tal y como recomienda Ia casa comercial Agilent Technologies. La hibridación tuvo lugar a 6O0C durante toda una noche en un horno de hibridación: Después se lavó Ia micromatriz con soluciones 6 x SSC, 0.005% Tritón (Agilent, USA) a temperatura ambiente, y 0,1 x SSC, 0,005 % Tritón (Agilent, USA) a 40C para eliminar el exceso de transcritos no hibridados. Acto seguido el chip fue secado mediante una centrifugación a 2000 rpm durante 7 minutos y finalmente, las señales de intensidad de cada oligonucleótido en Ia micromatriz fueron detectadas con el escáner Axon 4000B.
Los datos obtenidos a partir de Ia lectura de las intensidades de señal para cada uno de los fluoróforos se representaron gráficamente tal como se muestra en Ia figura 4A. Tal como se observaba en el ejemplo 2, las señales también se agrupaban en Ia parte superior de Ia diagonal del gráfico, indicando Ia poca dispersión de las mismas. Por otra parte, Ia figura 4B muestra el histograma de Ia distribución de las intensidades de señal del canal verde (correspondiente al mareaje con Cy3) en el que puede observarse una distribución normal, con una mayoría de puntos que se encuentran en una posición central del rango de intensidades (alrededor de 18000-19000 unidades de intensidad) y el resto que se encuentran simétricamente repartidos por arriba y por debajo de esta posición central.
En este caso, los datos también se procesaron para llevar a cabo un análisis cuantitativo tal como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se recogen en Ia Tabla 4. Tabla 4
Figure imgf000023_0001
En este caso se utilizaron como controles internos los oligonucleótidos ORY_C1_X80, ORY_C2_X70, ORY_C3_Z80 y ORY_C4_Z70 repetidos 223 veces sobre Ia superficie de Ia micromatriz.
Estos resultados confirman que cuando se analiza un genoma como el del arroz, mucho más complejo que el de Ia levadura analizado en el ejemplo 2, se obtienen mejores resultados aplicando el método de Ia presente invención que cuando se lleva a cabo un método de mareaje que no incluya una etapa de mareaje mediante transcripción in vitro.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de análisis de ácidos nucleicos para el estudio de variaciones en el genoma caracterizado porque comprende las etapas:
a) fragmentación de una muestra de ADN genómico,
b) ligación, en los extremos de los fragmentos de ADN obtenidos, de adaptadores específicos compatibles con los extremos generados donde al menos uno de los adaptadores ligados contiene una secuencia promotora funcional,
c) amplificación de los fragmentos obtenidos utilizando cebadores específicos basados en los adaptadores,
d) transcripción ¡n vitro de los fragmentos de ADN amplificados con una ARN polimerasa capaz de iniciar Ia transcripción a partir de Ia secuencia promotora contenida en los adaptadores utilizando una mezcla de nucleótidos (rNTPs),
e) hibridación con los oligonucleótidos de Ia micromatriz de ADN y detección de los fragmentos hibridados, y
f) comparación cuantitativa de las señales de diferentes muestras analizadas.
2. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia muestra de ADN analizada es una muestra de ADN genómico aislada a partir de cualquier organismo en el que se desee estudiar Ia presencia de variaciones en el genoma.
3. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia fragmentación de una muestra de ADN genómico se lleva a cabo por métodos químicos, métodos físicos o métodos enzimáticos.
4. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 3, caracterizado porque Ia fragmentación de una muestra de ADN genómico se realiza mediante digestión con al menos un enzima de restricción, preferentemente mediante digestión con dos enzimas de restricción.
5. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque las micromatrices de ADN sobre las que se lleva a cabo Ia hibridación y detección están constituidas por una colección de múltiples oligonucleótidos inmovilizados sobre un sustrato sólido, donde cada oligonucleótido está inmovilizado en una posición conocida de forma que Ia hibridación con cada uno de los múltiples oligonucleótidos se puede detectar por separado, donde el sustrato puede ser compacto o poroso, plano o no plano, unitario o distribuido, y donde las micromatrices de ADN pueden ser elaboradas con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.
6. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia detección de los fragmentos hibridados se lleva a cabo mediante Ia detección de un mareaje incorporado en los fragmentos a analizar durante Ia etapa de transcripción in vitro mediante Ia incorporación de análogos de nucleótidos que contienen mareajes detectables directamente, tales como fluoróforos, análogos de nucleótidos que incorporan mareajes que pueden ser visualizados indirectamente en una reacción posterior, tales como biotina o haptenos, o cualquier otro tipo de mareaje de ácidos nucleicos.
7. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 6, donde el análogo de nucleótido que contiene el mareaje es Cy3-UTP, Cy5-UTP o fluoresceína-UTP para el mareaje directo o biotina-UTP para el mareaje indirecto.
8. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia detección de los fragmentos hibridados se lleva a cabo a partir de Ia cuantificación directa de Ia cantidad de muestra hibridada sobre las sondas de ADN contenidas en Ia micromatriz de ADN, donde dicha cuantificación directa se puede llevar a cabo mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía de efecto túnel (STM) o microscopía electrónica de barrido (SEM); métodos electroquímicos, como medida de impedancia, voltaje o amperaje, o métodos ópticos, como microscopía confocal y no confocal, microscopía de infrarrojos, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia o transmitancia.
9. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia ARN polimerasa que se utiliza en Ia etapa de transcripción in vitro se elige del grupo que incluye, pero no se limita a, T7 ARN polimerasa, T3 ARN polimerasa y SP6 ARN polimerasa.
10. Método de análisis de ácidos nucleicos según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque cumple el requisito de que Ia relación entre Ia dispersión relativa de las intensidades de señal de las sondas de Ia muestra respecto a Ia dispersión relativa de las intensidades de señal de los controles es menor que 4, preferentemente menor que 3, más preferentemente menor que 2, aún más preferentemente menor que 1 ,5.
11. Kit que comprende los reactivos, enzimas y aditivos apropiados para llevar a cabo el método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Kit que comprende los reactivos, enzimas, aditivos y micromatrices de ADN con las sondas apropiados para llevar a cabo el método de análisis de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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