JP2009529864A - 核酸の分析方法 - Google Patents
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Abstract
核酸を分画し、アダプターを結合し、核酸を増幅する段階、およびイン・ビトロ転写段階を含んでなる、核酸の分析方法。上記発明は、ＤＮＡマイクロマトリックスの使用による生物のゲノム分析の分野に適用される。
Description
本発明は、分子生物学の分野に関する。詳細には、本発明の目的は、遺伝子の配列およびコピー数の両方に関する生物のゲノムにおける変動の存在を決定することに用いることができる核酸の分析方法である。
ゲノム中の遺伝子のコピー数の変化の分析に現在用いられている手法の一つは、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）として知られている方法であり、これにより、ＤＮＡの喪失、複製および一つの細胞から別の細胞へのトランスロケーションなど細胞で起こる大きな染色体変化を検出することができる。
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップとも呼ばれる）の開発により、これらは急速にゲノムマッピング研究に統合されてゆき、その結果、ゲノムＤＮＡの比較分析における一層良好な分解能および感度レベル、およびより大きな再生能が得られ、個々の遺伝子レベルでの変化を確実に検出することができる。
ＤＮＡマイクロアレイ技術は用途が広いため、トランスクリプトミクス（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）、遺伝学およびエピゲネティクス（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）の分野で応用されている。従って、バルクの平行分析を行うことができるようにするためＲＮＡおよびＤＮＡ試料を標識する様々な方法が開発された。
理論的には、シグナル強度分布の差は、ハイブリダイズした試料がＲＮＡであるかまたはＤＮＡであるかによってＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズするときに観察されるものである。細胞では、遺伝子は特異的に発現するので、総ＲＮＡの試料に見出される様々な種類のＲＮＡは４の次数の大きさまでの発現レベルの差を示すことができる。結果として、標識ＲＮＡまたはＲＮＡ試料のハイブリダイゼーションシグナルは、マイクロアレイ表面上のプローブについて同様な範囲のシグナル強度（すなわち、４の次数の大きさ）をカバーする。
一方、個々の試料における反復ＤＮＡまたはＤＮＡの複製または欠失断片は除いて、ゲノムＤＮＡ試料における様々なＤＮＡ断片の普及率は同一であり、従ってマイクロアレイ表面上の様々なプローブ間のシグナル強度の変動は実質的に小さくなり且つ様々なＤＮＡ断片の標識効率における小さな変動または様々な標識断片とマイクロアレイ上のプローブとの間のハイブリダイゼーション効率の変動に限定されることが期待される。
しかしながら、全ゲノムおよびサブゲノムのハイブリダイゼーションの様々な公表された方法から得られるシグナル分布の分析は、マイクロアレイ表面のプローブについてのシグナル強度分布が、プローブ選択手続きに万全の注意を払ったとしても遺伝子発現分析で得られるのと同様であることを示している。
ゲノム研究に用いられている標識法としては、
ＤＮアーゼＩを用いるゲルの断片化、および標識ＵＴＰを用いる末端トランスフェラーゼによる末端標識(Borevitz et al., 2003.「ゲノム複合体におけるシングル・フィーチャー多形(single-feature polymorphisms)の大量同定」Genome Research 13:513-523; Winzeler et al., 1998.「酵母ゲノムの直接対立変動走査」Science 281 :1194-97)、
標識dNTPを用いる(場合によっては制限酵素により消化してより小さな断片を生成した後)プライマーによるランダム標識(Pollack et al., 1999.「cDNAマイクロアレイを用いるDNAコピー数変化のゲノム広域分析」Nature Genetics 23: 41-46)、
1種類以上の制限酵素による消化、アダプター結合およびアダプターを主体とするプライマーを用いる増幅の後、標識ＵＴＰを用いる末端トランスフェラーゼによる末端標識によるサブゲノムの増幅(Maitra et al., 2005.「培養したヒト胚幹細胞におけるゲノム変化」Nature Genetics 37(10): 1099-1103)、
1種類以上の制限酵素による消化、アダプター結合および一方の末端で標識したアダプターを主体とするプライマーを用いる増幅によるサブゲノムの増幅
が挙げられる。
ＤＮアーゼＩを用いるゲルの断片化、および標識ＵＴＰを用いる末端トランスフェラーゼによる末端標識(Borevitz et al., 2003.「ゲノム複合体におけるシングル・フィーチャー多形(single-feature polymorphisms)の大量同定」Genome Research 13:513-523; Winzeler et al., 1998.「酵母ゲノムの直接対立変動走査」Science 281 :1194-97)、
標識dNTPを用いる(場合によっては制限酵素により消化してより小さな断片を生成した後)プライマーによるランダム標識(Pollack et al., 1999.「cDNAマイクロアレイを用いるDNAコピー数変化のゲノム広域分析」Nature Genetics 23: 41-46)、
1種類以上の制限酵素による消化、アダプター結合およびアダプターを主体とするプライマーを用いる増幅の後、標識ＵＴＰを用いる末端トランスフェラーゼによる末端標識によるサブゲノムの増幅(Maitra et al., 2005.「培養したヒト胚幹細胞におけるゲノム変化」Nature Genetics 37(10): 1099-1103)、
1種類以上の制限酵素による消化、アダプター結合および一方の末端で標識したアダプターを主体とするプライマーを用いる増幅によるサブゲノムの増幅
が挙げられる。
これらの方法はいずれも3-4の次数の大きさにわたって分布した、すなわち現在使用されているスキャナーの全検出範囲内のシグナルを生成する。この変動は標識法、表面上のプローブの熱力学的特性の差、または走査工程の変動によって完全に説明することはできず、従って標識法で見られる変動によって引き起こされるものでなければならないが、このシグナル強度分布が起こる理由は未だ不明である。
この理由により、シグナル強度範囲の振幅の減少を目指して標識法を改良する試みが行われてきた(Lieu et al., 2005.「アレイを機材とする相対ゲノムハイブリダイゼーションのためのDNA標識系の開発」J. Biom. Tech. 16:104-111)。
広範囲にわたるシグナル強度の分布は、
シグナル対ノイズ比が最低シグナル範囲に減少すると、小部分のシグナルは分析には不十分な性質のものである。スペクトルの下端のシグナル強度は更に標識ＤＮＡを（一定限界まで）加えることによって改良することができるが、これにより高い方のシグナルは飽和に向かって移動し、定量能はこれらの点について失われ、
ＤＮＡマッピングなどの幾つかの応用では、ＤＮＡ試料のバルク分析を行うことができることが望ましいので、単一試料をコントロールと比較して分析する代わりに、幾つかの試料の混合物を分析して、正の参照試料と負の参照試料と比較して混合物におけるハイブリダイゼーションのレベルが混合物に含まれる試料にシグナルが存在する頻度を反映するようにする。典型的には、正の参照試料のシグナルの百倍希釈物を反映するシグナルを検出できるのが望ましい。例えば、検出可能なシグナルが６０〜６００００の範囲にあれば、正の参照シグナルは少なくとも６０００の値に到達し、負の参照シグナルは６０をかなり下回る残留値となる。これらの応用では、総てのシグナル強度は、最低の明らかに検出可能なシグナルの１００倍とスキャナーの線形範囲内の最高の検出可能なシグナルとの間で構成される。現行のＤＮＡ標識法を用いれば、この基準により大半のプローブが除去されるのであり、バックグラウンドノイズの１００倍より大きな強度のプローブは比較的少ないからであり、
遺伝子（例えば、ＣＧＨ）のコピー数の変動の分析などの他の応用では、スペクトルの中央で最高信頼性で複製および欠失を同定することができるため、最も頻繁に観察されるコピー数に対応するシグナルを得ることが望ましい
という幾つかの実際的結果を有する。
シグナル対ノイズ比が最低シグナル範囲に減少すると、小部分のシグナルは分析には不十分な性質のものである。スペクトルの下端のシグナル強度は更に標識ＤＮＡを（一定限界まで）加えることによって改良することができるが、これにより高い方のシグナルは飽和に向かって移動し、定量能はこれらの点について失われ、
ＤＮＡマッピングなどの幾つかの応用では、ＤＮＡ試料のバルク分析を行うことができることが望ましいので、単一試料をコントロールと比較して分析する代わりに、幾つかの試料の混合物を分析して、正の参照試料と負の参照試料と比較して混合物におけるハイブリダイゼーションのレベルが混合物に含まれる試料にシグナルが存在する頻度を反映するようにする。典型的には、正の参照試料のシグナルの百倍希釈物を反映するシグナルを検出できるのが望ましい。例えば、検出可能なシグナルが６０〜６００００の範囲にあれば、正の参照シグナルは少なくとも６０００の値に到達し、負の参照シグナルは６０をかなり下回る残留値となる。これらの応用では、総てのシグナル強度は、最低の明らかに検出可能なシグナルの１００倍とスキャナーの線形範囲内の最高の検出可能なシグナルとの間で構成される。現行のＤＮＡ標識法を用いれば、この基準により大半のプローブが除去されるのであり、バックグラウンドノイズの１００倍より大きな強度のプローブは比較的少ないからであり、
遺伝子（例えば、ＣＧＨ）のコピー数の変動の分析などの他の応用では、スペクトルの中央で最高信頼性で複製および欠失を同定することができるため、最も頻繁に観察されるコピー数に対応するシグナルを得ることが望ましい
という幾つかの実際的結果を有する。
しかしながら、現行の方法によれば、ほとんどの点は低シグナル強度であると思われ、シグナル強度で観察された変化の解釈が困難である。このことは、例えばBarrett et al.によって公表された研究などの文献に公表されたデーターを分析するときに見ることができる(Barrett MT et al.「オリゴヌクレオチドマイクロアレイと総ゲノムＤＮＡを用いる相対ゲノムハイブリダイゼーション」Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Dec 21; 101(51):17765-70)。
この研究グループは、フェノール／クロロホルム精製に加えて抽出試薬として Trizol(Invitrogen,米国)を用いてヒト試料からゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ １０ｎｇを、ポリメラーゼφ２９を用いるＰＣＲによって増幅した。その後、この増幅したＤＮＡを２種類の制限酵素ＡｌｕＩおよびＲｓａＩで３７℃で２時間のインキュベーション時間で消化した。試料を消化したＤＮＡ ６μｇで標識し、Bioprime Labeling Kit(Invitrogen,米国)で精製し、上記会社が推奨する段階に従って蛍光発色団Ｃｙ３またはＣｙ５で標識したヌクレオチドを加えた。
ハイブリダイゼーションの前に、標識試料を１００℃で１．５分間変性し、３７℃で３０分間インキュベーションした。試料をAgilent Technologiesの推奨に従ってハイブリダイズし、マイクロアレイ上の参照試料と試験試料を６５℃で一晩インキュベーションした。次に、マイクロアレイをAgilentの方法に従って洗浄し、Agilent 2565AA DNAマイクロアレイスキャナーを用いて走査した。
この公表文献のＤａｔａｓｅｔ １４に対応するＤＮＡをグラフに表したものは図５Ａおよび５Ｂに示されており、後に記載される方法で行ったデーター分析は表１に示されている。プラットホームの技術実験散乱（すなわち、様々なプローブから得られた全データーセットの散乱ではなく、反復点のシグナルレベルの散乱）を評価できるようにするため、オリゴヌクレオチドはコントロールとして働くこの文書で用いたマイクロアレイで数回反復した。特に、コントロールとして用いるプローブは、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＥＸＯ１、ＦＬＪ２２１１６、ＩＦ２、ＣＰＳ１、ＳＴ３ＧＡＬＶＩ、ＦＬＪ２０４３２、ＨＰＳ３、ＡＲＨＨ、ＳＰＰ１、ＤＫＦＺｐ７６２Ｋ２０１５、ＣＥＮＰＥ、ＣＣＮＡ２、ＥＳＭ１、ＮＬＮ、ＫＩＡＡ０３７２、ＬＯＸ、ＲＡＤ５０、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ、ＦＬＪ２０３６４、ＦＬＪ２０６２４、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＦＬＪ１１７８５、ＦＬＪ１１７８５、ＬＯＸＬ２、ＷＲＮ、ＲＡＤ５４Ｂ、ＣＭＬ６６、ＨＡＳ２、ＭＧＣ５２５４、ＭＬＡＮＡ、ＣＯＬ１３Ａ１、ＡＤ２４、ＬＭＯ２、ＣＤ６９、ＬＯＣ５１２９０、ＦＬＪ２１９０８、ＭＧＣ５５８５、ＫＮＴＣ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＭＧＣ５３０２、ＢＡＺ１Ａ、ＡＮＤ−１、ＨＩＦ１Ａ、ＩＦＩ２７、ＦＡＮＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＰＭＡＩＰ１、ＨＭＣＳ、ＳＴＣＨ、ＳＥＲＰＩＮＤ１、およびＮＳＢＰ１である。これら総てのプローブは、１０回反復した。
表１のデーターから分かるように、プローブシグナルはコントロールが示した散乱の５倍を上回る散乱を示し、実験の技術的実行にはよらない真の散乱があることを示している。更に、プローブに対応するシグナルは、グラフ（図５Ａ、緑色チャンネルおよび赤色チャンネルで得られたシグナル散乱のグラフ）の対角線に沿って、より大きな頻度で低シグナル強度で（図５Ｂ、シグナル分布を反映するヒストグラム）分布していることが線図により観察される。これらの結果は、標識方法とこの公表文献で用いられた表面上のプローブの集合体に対するハイブリダイゼーションの特定の組合せは、望ましくない変動性を誘導して、用いる結果の一部の信頼性に影響を及ぼす可能性があることを示している。
本発明では、ＤＮＡ分画化、アダプター結合、およびＲＮＡポリメラーゼを用いる試料のイン・ビトロ転写を伴う工程を含んでなるゲノムＤＮＡの分析方法を記載する。この工程では、ＲＮＡ断片のセットを生成し、これらのＲＮＡ断片は分析を行うＤＮＡ断片と同等であり且つ分析を行うためにＤＮＡマイクロアレイのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたものである。試料の標識は、場合によってはこの段階で行うことができる。本発明による方法は、分析試料のシグナル強度における変動性を有意に減少させることができる。
本発明の目的は、
ａ） ゲノムＤＮＡ試料を断片化し、
ｂ） 得られたＤＮＡ断片の両端に、生成した両端と適合する特異的アダプター（結合したアダプターの少なくとも１個が機能性プロモーター配列を含む）を結合し、
ｃ） 特異的アダプターを主体とするプライマーを用いて、得られた断片を増幅し、
ｄ） ヌクレオチドの混合物（ｒＮＴＰｓ）を用いてアダプターに含まれるプロモーター配列から転写を開始することができるＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅したＤＮＡ断片をイン・ビトロ転写し、
ｅ） ＤＮＡマイクロアレイのオリゴヌクレオチドへハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした断片を検出し、および
ｆ） 分析を行った様々な試料からのシグナルを定量的に比較する
工程を含んでなる核酸の分析方法を提供することである。
ａ） ゲノムＤＮＡ試料を断片化し、
ｂ） 得られたＤＮＡ断片の両端に、生成した両端と適合する特異的アダプター（結合したアダプターの少なくとも１個が機能性プロモーター配列を含む）を結合し、
ｃ） 特異的アダプターを主体とするプライマーを用いて、得られた断片を増幅し、
ｄ） ヌクレオチドの混合物（ｒＮＴＰｓ）を用いてアダプターに含まれるプロモーター配列から転写を開始することができるＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅したＤＮＡ断片をイン・ビトロ転写し、
ｅ） ＤＮＡマイクロアレイのオリゴヌクレオチドへハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした断片を検出し、および
ｆ） 分析を行った様々な試料からのシグナルを定量的に比較する
工程を含んでなる核酸の分析方法を提供することである。
図１は、本発明の方法を構成する段階の一例を図解表示したものである。
ゲノムＤＮＡ試料の断片化は、例えば塩酸、水酸化ナトリウム、ヒドラジンなどによる処理のような化学的方法、イオン化放射線による処理、超音波処理などの物理的方法、または例えば制限酵素などのエンドヌクレアーゼによる消化のような酵素的方法によって行うことができる。本発明の一態様では、断片化は少なくとも１種類の制限酵素を用いる消化によって行われる。本発明のもう一つの態様では、断片化は２種類の制限酵素を用いる消化によって行われる。
本発明の方法は、任意の生物から単離したゲノムＤＮＡの任意の試料の分析であって、ゲノム変異の存在の研究が望まれる場合に用いることができる。上記方法は、取り分けシングル・フィーチャー多形(single-feature polymorphisms)の大量同定（ＳＦＰ）、相対ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）であって、遺伝子または遺伝子またはその断片の欠失または遺伝子またはその断片の２以上のコピーの存在を判断することができるもの、個体の分析または大量分離分析(bulked segregant analysis)による遺伝子マッピング、一塩基多型（ＳＮＰ）の同定、トランスポゾンの局在化、クロマチン免疫沈降法(ChiP-on-chip)などに応用することができる。
マイクロアレイまたはＤＮＡマイクロアレイという用語は、固形基質上に固定された多数のオリゴヌクレオチドの集合体であって、それぞれのオリゴヌクレオチドが既知の位置に固定されており、多数のオリゴヌクレオチドを別々に検出することができるものを表す。基質は固形または多孔質、平面または非平面、一体または分散型でよい。本発明の方法によってハイブリダイゼーションおよび検出を行うＤＮＡマイクロアレイは、任意の方法によって寄託されたオリゴヌクレオチドまたはイン・シテュー（in situ）フォトリソグラフィーまたは任意の他の方法によって合成されたオリゴヌクレオチドを用いて製造することができる。
プローブという用語は、固形基質上に固定されたオリゴヌクレオチドであって、分析を行う核酸のハイブリダイゼーションを行うものを表す。
本発明の一態様では、ハイブリダイズした断片の検出は、ＤＮＡマイクロアレイに含まれるＤＮＡプローブ上のハイブリダイズした試料の量を直接定量することによって行う。上記の直接定量は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、走査型透過顕微鏡法（ＳＴＭ）または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、インピーダンス、電圧または電流の測定などの電気化学的方法、または共焦点および非共焦点顕微鏡法、赤外顕微鏡法、蛍光、ルミネッセンス、化学ルミネッセンスの検出、または吸光度、反射率または透過率の検出、および一般的には任意の表面分析法などの手法を用いて行うことができるが、これらに限定されない。
本発明のもう一つの態様では、ハイブリダイズした断片の検出は、分析を行う断片に組込まれた標識要素の検出によって行われる。特に、標識は、蛍光発色団のような直接検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体、ビオチンまたはハプテンのような後の反応によって間接的に可視化することができる標識を組込んでいるヌクレオチド類似体、または当業者に知られている任意の他の種類の直接または間接核酸標識の組込みによってイン・ビトロ転写中に起こる。詳細には、標識は、直接標識のためのＣｙ３−ＵＴＰ、Ｃｙ５−ＵＴＰ、またはフルオレセイン−ＵＴＰまたは間接標識のためのビオチン−ＵＴＰを用いて行うことができる。
機能性プロモーター配列という表現は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されることができ且つそこから転写を開始することができるヌクレオチド配列を表す。一般的には、それぞれのＲＮＡポリメラーゼは特異配列を認識し、そのためアダプターに包含される機能性プロモーター配列は、用いられているＲＮＡポリメラーゼによって選択される。ＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の目的は、本発明の核酸の分析方法を行うのに必要な試薬、酵素、および添加剤を含んでなる、キットを提供することでもある。
本発明のもう一つの目的は、本発明の核酸の分析方法を行うのに必要な試薬、酵素、添加剤、およびプローブを有するＤＮＡマイクロアレイを含んでなる、キットを提供することである。
本発明は、現在用いられている生物のゲノムにおける変動を検討する目的でＤＮＡマイクロアレイを用いることによる核酸の分析方法の改良に基づいている。ＤＮＡの調製がＲＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片のイン・ビトロ転写を含んでなる段階と関連しているとき、ＤＮＡマイクロアレイに含まれるプローブにハイブリダイズするためのシグナルは、他の手段によって得られまたは標識されたＤＮＡ断片が直接ハイブリダイズするときより強く且つ均質性が高いことが観察された。ランダムと思われる他の標識法により様々な標識断片の標識および／またはハイブリダイゼーション効率が著しく歪められることを考えれば、この結果は予想されなかったものであり、更に本発明がこの歪みを減少させまたは除去する理由は現在知られていない。
本発明の方法における改良点を現在一般に用いられている他の方法と比較して判断するために、参照パラメーターとして分析試料のシグナル強度散乱対ハイブリダイゼーションコントロールのシグナル強度散乱を用いた。
例えば、（所定の標識に対応する）スキャナーのそれぞれの読み取りチャンネルについて、シグナル強度の相対散乱率を値の組の標準偏差と上記値の平均との比として計算した。本発明の実施例では、Ｃｙ３による標識（緑色チャンネル）とＣｙ５による標識（赤色チャンネル）に対応するデーターが示されている。この計算は実験に含まれるプローブとコントロールの両方について行い、プローブシグナルの相対散乱率（relative percentage scatter）とコントロールシグナルの相対散乱率との比を計算することもできた。この方法では、コントロールの散乱度がハイブリダイゼーションの固有変動性の指標であることを考えれば、コントロールの散乱度に対するプローブの散乱度を反映している値が求められる。更に、それぞれの点のシグナル強度とそれ自身のバックグラウンドノイズの平均比を、もう一つの参照値として処理した。これら総ての計算において、標準化の任意の近似は総ての値に同様に影響するので、この比は事実上一定のままとなることが期待される。
２つの試料のシグナル強度の比較分析を行うには、マイクロアレイのそれぞれのプローブに対するハイブリダイゼーションから得られた強度値を、通常は第一の試料からの値を表す値をｘ軸上におよび第二の試料についての対応する値をｙ軸上に表す対数散乱プロットで表す。プロット対角線は、所定のプローブが両方の試料に対して同じ値を示す点によって表される。２つの同一試料を比較するときには、点は対角線上に理想的に配置されるはずである。しかしながら、実験的には、対角線に対して点のある程度の散乱（すなわち、対角線に対して直角の散乱）、またはその結果、２つの同一試料の強度値の比の散乱が起こることが観察される。この散乱は、それぞれのプローブについて１つの試料からのデーターの再現性の程度を示しており、表面上の様々なプローブについての２つの試料からのシグナルの比に基づいて計算した所定の標準偏差と関連している。
更に、上記散乱プロットにおいて、それぞれのプローブに対するハイブリダイゼーションシグナルは対角線に沿って（または対角線に平行に）分布しており、上記分布は試料のシグナル強度に対して固有のものである。この散乱は試料中の様々な断片の検出効率の変動を反映しており、これは表面上の様々な核酸断片のハイブリダイゼーション効率の変動と組み合わせたハイブリダイゼーション（適用可能ならば、標識を包含する）のための様々な核酸断片の調製のための方法の効率の変動によって与えられる。全シグナル強度範囲にわたるこの分布は、試料のプローブの強度の標準偏差をこの試料についての総てのプローブの強度の平均値で割った比として定義される相対標準偏差と関連している。これらの強度の相対標準偏差は、試料の総てのプローブの組またはコントロールとして作用する反復プローブの組について計算することができる。従って、試料の強度の標準偏差をコントロールの強度の標準偏差によって割った比は、ハイブリダイゼーション（適用可能ならば、標識を包含する）のための様々な核酸断片の調製のための方法の効率の変動および表面上の様々な核酸断片のハイブリダイゼーション効率の変動の試料の総シグナル強度散乱に対する寄与を反映する。
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションによって得られる試料からのシグナル強度の散乱を減少させる核酸断片の調製方法を記載する。
本発明の一態様では、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションおよび検出は、元の核酸における総ての分析断片が同数のコピーに存在するときには、試料のプローブのシグナル強度の相対散乱とコントロールのシグナル強度の相対散乱の比は４未満であり、好ましくは３未満であり、更に好ましくは２未満であり、更に一層好ましくは１．５未満であるという要件を満たしている。
対角線に沿ったハイブリダイゼーションシグナルの強度を制御する方法の一つは、ハイブリダイズした試料の量を変化させることにより、ハイブリダイズした試料の量が増加すれば、シグナルも増加するようにすることである。この方法では、最大および最小シグナルを調整して、それらがスキャナーの検出範囲内に収まるようにすることができる。しかしながら、適用される試料の量の変化はシグナル分布プロフィールに影響を及ぼさず、試料量を増加して低強度シグナルまたは分析のノイズレベルによって画定された検出閾値を下回るシグナルの強度を上げることは、高強度シグナルが飽和領域に入る結果となる。本発明の分析方法を適用すると、試料のプローブのシグナル強度が均質になるだけでなく、平均的シグナル強度も増加するので、分析におけるシグナル／ノイズ比が改善される。
本発明の方法では、ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズした試料はＲＮＡからなり、他の方法と比較して相当の利点を有する。第一に、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用はＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用より強く、これが平均シグナル強度の増加が見られた１つの理由である可能性がある。第二に、一本鎖ＲＮＡはマイクロアレイ表面上のプローブへのハイブリダイゼーション用の溶液に存在する相補性分子と全く競合せず、ＤＮＡマイクロアレイ表面に含まれるプローブへのハイブリダイゼーションの程度が大きくなる。
従って、本発明は、現在用いられている方法よりも感度、シグナル／ノイズ比および再現性が良好な複雑なゲノムにおける変動の同定のための核酸の新規な分析方法を提供する。
以下に、本発明の方法の幾つかの非制限的実施例を説明する。
実施例１：イン・ビトロ転写段階なしにＣｙ３およびＣｙ５蛍光発色団で標識したプライマーを用いる増幅による標識による酵母ゲノムＤＮＡの分析
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、酵母の1種類であるSaccharomyces cerevisiaeから抽出した。酵母培養物の菌体を、遠心分離により沈澱させ、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁させた後、２０％ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、酵母の1種類であるSaccharomyces cerevisiaeから抽出した。酵母培養物の菌体を、遠心分離により沈澱させ、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁させた後、２０％ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ精製
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＤＮＡ消化およびアダプター結合
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
ＤＮＡ増幅
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)1Uとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。この場合に、プライマーの一つでＳａｃＩアダプターに特異的なものを標識した。この方法では、標識の組込みはＰＣＲで進行したＤＮＡ増幅として行った。ＰＣＲは２回平行して行い、一方ではプライマーが５’末端上の蛍光色素Ｃｙ３ １分子を含み、他方ではプライマーが蛍光色素Ｃｙ５を含むようにした。
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)1Uとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。この場合に、プライマーの一つでＳａｃＩアダプターに特異的なものを標識した。この方法では、標識の組込みはＰＣＲで進行したＤＮＡ増幅として行った。ＰＣＲは２回平行して行い、一方ではプライマーが５’末端上の蛍光色素Ｃｙ３ １分子を含み、他方ではプライマーが蛍光色素Ｃｙ５を含むようにした。
マイクロアレイのハイブリダイゼーション
Ｃｙ３で標識した試料からのＤＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料からのＤＮＡ ０．７５μｇと組合せ、９８℃で５分間変性した後、ハイブリダイゼーションした。このＤＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、マイクロアレイのハイブリダイゼーションをAgilent Technologies, USAの推奨に従って行った。このハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃での一晩インキュベーションの後、周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物をマイクロアレイのオリゴヌクレオチドで除去する。次いで、マイクロアレイを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
Ｃｙ３で標識した試料からのＤＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料からのＤＮＡ ０．７５μｇと組合せ、９８℃で５分間変性した後、ハイブリダイゼーションした。このＤＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、マイクロアレイのハイブリダイゼーションをAgilent Technologies, USAの推奨に従って行った。このハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃での一晩インキュベーションの後、周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物をマイクロアレイのオリゴヌクレオチドで除去する。次いで、マイクロアレイを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
それぞれの蛍光発色団についてのシグナル強度の読み取りから得られるデーターのグラフを図２に示す。シグナル強度は、微分表現分析実験で得られ、試料の標識に変動性があることを示しているものと同様に、グラフ対角線に沿って分布していることが観察された。
更に、これらのデーターを、定量分析を行う目的で処理した。シグナルの相対散乱率を、実験に含まれるプローブおよびコントロールの両方についてそれぞれの群の値の標準偏差と上記値の平均値の比として計算した。また、プローブからのシグナルの相対散乱率とコントロールからのシグナルの相対散乱率の比も計算した。この値はコントロールの散乱と比較してプローブの散乱の程度を反映している。それぞれの点におけるシグナル強度とそれ自身のバックグラウンドの強度の平均比も、同様に計算した。結果を、表２にまとめている。
これらの結果は、試料の標識における変動性により、プローブのシグナルは実験に含まれるコントロールのほぼ５倍の散乱を示すことを示している。
実施例２：イン・ビトロ転写段階による標識による酵母ゲノムＤＮＡの分析
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、酵母の１種類であるSaccharomyces cerevisiaeから抽出した。酵母培養物の菌体を、遠心分離により沈澱させ、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁させた後、２０％ ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、酵母の１種類であるSaccharomyces cerevisiaeから抽出した。酵母培養物の菌体を、遠心分離により沈澱させ、ＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁させた後、２０％ ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ精製
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＤＮＡ消化およびアダプター結合
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
ＤＮＡ増幅
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)１Ｕとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)１Ｕとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。
イン・ビトロ転写
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ ２．５μｇを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Ambion,米国)４０ＵおよびｒＮＴＰ ７．５ｍＭを加えることによってＳａｃＩアダプターに含まれるプロモーター配列からＲＮＡへのイン・ビトロ転写を行い、試料を３７℃で一晩インキュベーションした。この反応は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ (Perkin-Elmer,米国)を標識したヌクレオチドとして用いて、平行して２回行った。転写の後、ＤＮＡをＤＮアーゼＩ (Ambion,米国)２Ｕを用いて３７℃にて３０分間処理することによって除去した。標識生成物は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ(商品名)カラム(Ambion,米国)を用いて精製した。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ ２．５μｇを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Ambion,米国)４０ＵおよびｒＮＴＰ ７．５ｍＭを加えることによってＳａｃＩアダプターに含まれるプロモーター配列からＲＮＡへのイン・ビトロ転写を行い、試料を３７℃で一晩インキュベーションした。この反応は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ (Perkin-Elmer,米国)を標識したヌクレオチドとして用いて、平行して２回行った。転写の後、ＤＮＡをＤＮアーゼＩ (Ambion,米国)２Ｕを用いて３７℃にて３０分間処理することによって除去した。標識生成物は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ(商品名)カラム(Ambion,米国)を用いて精製した。
マイクロアレイのハイブリダイゼーション
Ｃｙ３で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇと組合せ、マイクロアレイオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションした。このＲＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、Agilent Technologiesによって推奨されているチップに装填した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃で一晩行った。次いで、マイクロアレイを周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物を除去した。次に、チップを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
Ｃｙ３で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇと組合せ、マイクロアレイオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションした。このＲＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、Agilent Technologiesによって推奨されているチップに装填した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃で一晩行った。次いで、マイクロアレイを周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物を除去した。次に、チップを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
それぞれの蛍光発色団についてのシグナル強度の読み取りから得られるデーターのグラフを図３に示す。シグナル強度はプロット対角線の上の部分に集まっており、これは、シグナルが対角線の長さに沿って分布している実施例１で観察されたものより標識が均質であることを示している。
更に、これらのデーターを、実施例１に記載したように、定量分析を行う目的で処理した。結果を、表３にまとめている。
これらの結果は、標識段階を本発明によるイン・ビトロ転写によって行うときには、プローブに対応するシグナルは、実験１に記載したようにこの段階を行わないときに起こるものとは対照的な同じ実験におけるコントロールと同様の散乱を示すことを示している。シグナル散乱におけるこの改良により、ゲノムレベルで幾らかの変化を示す可能性がある試料の検出が一層容易になる。
実施例３：イン・ビトロ転写段階による標識によるコメゲノムＤＮＡの分析
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、コメの種類であるOryza sativa sp. japonica Nipponbareから抽出した。液体窒素で凍結した植物の葉組織を、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ（Retsch GmbH,ドイツ）でホモジナイズした。均質化によって生じる溶解物をＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁した後、２０％ ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分に混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡは、コメの種類であるOryza sativa sp. japonica Nipponbareから抽出した。液体窒素で凍結した植物の葉組織を、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ（Retsch GmbH,ドイツ）でホモジナイズした。均質化によって生じる溶解物をＤＮＡ抽出溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）６００μｌに再懸濁した後、２０％ ＳＤＳ ４０μｌを加え、全体を十分に混合し、６５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、冷酢酸カリウム２００μｌを加え、インキュベーションを氷上で１５分間継続した。次に、混合物を遠心分離機で４℃にて１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、イソプロパノール６００μｌを上清４００μｌに加えた。ＤＮＡを１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することによって沈澱させた後、沈殿物を７０％エタノール２００μｌで洗浄し、乾燥させた。沈殿物をＴＥ １００μｌに溶解した。
ＤＮＡ精製
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを試料に加え、これを３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液１００μｌを加え（２％（重量／容量）ＣＴＡＢ；２００ｍＭ Ｔｒｉｓ；５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５，２Ｍ ＮａＣｌ）、６５℃で１５分間インキュベーションした後、ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）２００μｌを加えた。混合物を微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清２００μｌをイソプロパノール１８０μｌで沈澱させた。これを微量遠心分離機で１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノール１００μｌで洗浄し、風乾した。最後に、沈殿物を水５０μｌに溶解した。
ＤＮＡ消化およびアダプター結合
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
全ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、ＳａｃＩ(Fermentas,リトアニア)およびＭｓｅＩ(New England Biolabs,米国)を用いて３７℃で３時間インキュベーションして消化した。消化によって生成したＤＮＡ断片に対して、ＳａｃＩ酵素の付着末端と適合性のＳａｃＩアダプターとＭｓｅＩの付着末端と適合性のＭｓｅＩアダプターを、Ｔ４リガーゼ緩衝液(Fermentas,リトアニア)中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas,リトアニア)と周囲温度にて４時間インキュベーションして結合させた。
ＤＮＡ増幅
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)１Ｕとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。
ＳａｃＩ／ＭｓｅＩ断片を、７２℃で２分間；９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で９０秒間および７２℃で１０分間の３４サイクルのサイクルプログラムを用いる１ｘＴａｑ緩衝液、１．５ｎＭ ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas,リトアニア)１Ｕとの反応においてアダプターの配列に基づいて２種類の特異的プライマーをそれぞれ２００ｎＭの濃度で用いるＰＣＲによって増幅した。
イン・ビトロ転写
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ ２．５μｇを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Ambion,米国)40UおよびｒＮＴＰ ７．５ｍＭを加えることによってＳａｃＩアダプターに含まれるプロモーター配列からＲＮＡへのイン・ビトロ転写を行い、試料を３７℃で一晩インキュベーションした。この反応は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ(Perkin-Elmer,米国)を標識したヌクレオチドとして用いて、平行して２回行った。転写の後、ＤＮＡをＤＮアーゼＩ(Ambion,米国)２Ｕを用いて３７℃にて３０分間処理することによって除去した。標識生成物は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ(商品名)カラム(Ambion,米国)を用いて精製した。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ ２．５μｇを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Ambion,米国)40UおよびｒＮＴＰ ７．５ｍＭを加えることによってＳａｃＩアダプターに含まれるプロモーター配列からＲＮＡへのイン・ビトロ転写を行い、試料を３７℃で一晩インキュベーションした。この反応は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ(Perkin-Elmer,米国)を標識したヌクレオチドとして用いて、平行して２回行った。転写の後、ＤＮＡをＤＮアーゼＩ(Ambion,米国)２Ｕを用いて３７℃にて３０分間処理することによって除去した。標識生成物は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ(商品名)カラム(Ambion,米国)を用いて精製した。
マイクロアレイのハイブリダイゼーション
マイクロアレイオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせるために、Ｃｙ３で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇと組合せた。このＲＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、Agilent Technologiesによって推奨されているチップに装填した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃で一晩行った。次いで、マイクロアレイを周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Triton(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物を除去した。次に、チップを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
マイクロアレイオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせるために、Ｃｙ３で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇをＣｙ５で標識した試料ＲＮＡ ０．７５μｇと組合せた。このＲＮＡ混合物に、２ｘハイブリダイゼーション溶液(Agilent,米国)１００μｌを加え、Agilent Technologiesによって推奨されているチップに装填した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブンで６０℃で一晩行った。次いで、マイクロアレイを周囲温度で６ｘＳＳＣおよび０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ(Agilent,米国)、および４℃で０．１ｘＳＳＣおよび０．００５％ Triton(Agilent,米国)の溶液により洗浄し、過剰のハイブリダイゼーションしていない転写物を除去した。次に、チップを２０００ｒｐｍにて７分間遠心分離して乾燥し、最後にマイクロアレイにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドのシグナル強度をＡｘｏｎ ４０００Ｂスキャナーで検出した。
それぞれの蛍光発色団についてのシグナル強度の読み取りから得られるデーターのグラフを図４Ａに示す。実施例２に見られるように、シグナルはこの場合にもプロット対角線の上の部分に集まっており、シグナルの散乱の程度が小さいことを示している。更に、図４Ｂは（Ｃｙ３に対応する）緑色チャンネルでのシグナル強度分布のヒトスグラムを示しており、正規分布が見られ、ほとんどの点は強度範囲内の中央位置（約１８０００〜１９０００強度単位）にあり、残りの点はこの中央位置より上および下に対称的に配置されている。
この場合にも、これらのデーターを、実施例１に記載したように、定量分析を行う目的で処理した。結果を、表４にまとめている。
この場合には、マイクロアレイ表面上で２２３回反復したオリゴヌクレオチドＯＲＹ＿Ｃ１＿Ｘ８０、ＯＲＹ＿Ｃ２＿Ｘ７０、ＯＲＹ＿Ｃ３＿Ｚ８０およびＯＲＹ＿Ｃ４＿Ｚ７０を内部コントロールとして用いた。
これらの結果により、実施例２で分析した酵母ゲノムより遙かに複雑なコメなどのゲノムを分析ときに、本発明の方法を適用した後にイン・ビトロ転写を伴う標識段階を含まない標識方法を用いると、一層良好な結果が得られることが確かめられる。
Claims (12)
- ａ）ゲノムＤＮＡの試料を断片化し、
ｂ）得られたＤＮＡ断片の両端に、生成した両端と適合する特異的アダプター（結合したアダプターの少なくとも１個が機能性プロモーター配列を含む）を結合し、
ｃ）特異的アダプターを主体とするプライマーを用いて、得られた断片を増幅し、
ｄ）ヌクレオチドの混合物（ｒＮＴＰ）を用いてアダプターに含まれるプロモーター配列から転写を開始することができるＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅したＤＮＡ断片をイン・ビトロ転写し、
ｅ）ＤＮＡマイクロアレイオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした断片を検出し、
ｆ）分析した様々な試料からのシグナルを定量的に比較する
ことを含んでなる、ゲノム変異を研究するための核酸の分析方法。 - 分析したＤＮＡ試料がゲノム変異の存在の研究が望まれている任意の生物から単離されたゲノムＤＮＡ試料である、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- ゲノムＤＮＡ試料の断片化を、化学的方法、物理的方法または酵素的方法によって行う、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- ゲノムＤＮＡ試料の断片化を少なくとも１種類の制限酵素による消化、好ましくは２種類の制限酵素による消化によって行う、請求項３に記載の核酸の分析方法。
- ハイブリダイゼーションおよび検出を行うＤＮＡマイクロアレイが固形基質上の複数の固定されたオリゴヌクレオチドの集合体を含んでなり、それぞれのオリゴヌクレオチドが既知の位置に固定されて多くのオリゴヌクレオチドのそれぞれに対するするハイブリダイゼーションが別々に検出されるようになっており、基質は固形または多孔質、平面または非平面、一体または分散型であることができ、ＤＮＡマイクロアレイは、任意の方法により寄託されたオリゴヌクレオチドまたはフォトリソグラフィーまたは任意の他の方法によってイン・シテューで合成されたオリゴヌクレオチドを用いて製造することができる、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- ハイブリダイズした断片の検出を、蛍光発色団のような直接検出可能な標識を含むヌクレオチド類似体、ビオチンまたはハプテンのような後の反応によって間接的に可視化することができる標識を組込んでいるヌクレオチド類似体、または任意の他の種類の核酸標識の組込みによってイン・ビトロ転写中に分析される断片に組込まれた標識を検出することによって行う、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- 標識を含むヌクレオチド類似体が、直接標識のためのＣｙ３−ＵＴＰ、Ｃｙ５−ＵＴＰ、またはフルオレセイン−ＵＴＰまたは間接標識のためのビオチン−ＵＴＰである、請求項６に記載の核酸の分析方法。
- ハイブリダイズした断片の検出を、ＤＮＡマイクロアレイに含まれるＤＮＡプローブ上のハイブリダイズした試料の量を直接定量することによって行い、上記直接定量は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、走査型透過顕微鏡法（ＳＴＭ）または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、インピーダンス、電圧または電流の測定などの電気化学的方法、または共焦点および非共焦点顕微鏡法、赤外顕微鏡法、蛍光、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、吸光度、反射率または透過率の検出などの光学的方法が挙げられるがこれらに限定されない手法によって行うことができる、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- イン・ビトロ転写工程で用いられるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなど、これらに限定されない群から選択される、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- 試料プローブのシグナル強度の相対散乱とコントロールのシグナル強度の相対散乱の比が４未満であり、好ましくは３未満であり、更に好ましくは２未満であり、更に一層好ましくは１．５未満である条件を満たす、請求項１に記載の核酸の分析方法。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸の分析方法を行うのに必要な試薬、酵素、および添加剤を含んでなる、キット。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸の分析方法を行うのに必要な試薬、酵素、添加剤、およびＤＮＡマイクロアレイを含んでなる、キット。
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