WO2007094384A1 - フラバノン誘導体を含む皮膚外用剤 - Google Patents

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WO2007094384A1
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skin
collagen
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Naoko Kida
Akihiro Tada
Akiko Kanamaru
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Pola Chemical Industries Inc.
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    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to an external preparation for skin, and more particularly to an external preparation for skin containing a flavanone derivative.
  • the present invention also relates to a method for enhancing the collagen-producing ability of fibroblasts.
  • the present invention also relates to a method for screening a substance having a wound healing effect.
  • the skin is composed of the stratum corneum, epidermis, basal layer, and dermis, and it is usually said that the structure of the dermis has a great influence on the recognized “skin” properties.
  • One of the important components of the dermis is said to be collagens that have a great influence on elasticity.
  • collagens include collagen I, collagen III, collagen IV, collagen V, collagen VII, etc., each of which plays an important function, and these are derived from procollagen produced by fibroblasts. (For example, see Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 1 It is known (see, for example, Patent Document 1).
  • plant extracts have an action of reconstructing dermal collagen fiber bundles (see, for example, Patent Document 2 and Patent Document 3).
  • an extract of hypericum perforatum is known as one having excellent dermis collagen fiber bundle reconstructing action (see, for example, Patent Document 4).
  • These terpenes and extracts have the effect of improving the collagen-producing ability of the fibroblasts themselves, and when there are collagen fiber bundles around them, the collagen fiber bundles are constructed along these fiber bundles. Can do.
  • these components lack the dermal collagen fiber bundle itself and do not exist around the fibroblasts, the collagen fiber bundle cannot be fully constructed. Therefore, the above components and extracts cannot sufficiently promote the reconstruction of collagen fiber bundles at sites where collagen fibers such as large wrinkles are missing, and have the effect of improving the above symptoms. There was a problem that it did not fully demonstrate.
  • the skin is an important biological defense tissue and also a respiratory organ, and this skin defect threatens both the defense mechanism and the respiratory function. For this reason, there is an established theory that losing 1/3 of the epidermis due to burns, etc. would be life threatening. Under such circumstances, development of a technique for promptly regenerating a defective skin site has been desired for many years.
  • components having a wound healing action for example, curcuma extract, ratatopherin and the like are known (see, for example, Patent Document 5 and Patent Document 6), and these include the action of reconstructing the dermal collagen fiber bundle structure. Hanare, because the action to regenerate the skin tissue is not enough.
  • inulins see, for example, Patent Document 7
  • collagen hydrolysates for example, Patent Document 8
  • Extra-fera ferrins see, for example, Patent Document 6
  • the wound healing action of these components has been confirmed through the expression of RNA of enzymes involved in fibroblast proliferation activity and skin tissue regeneration.
  • the phenomenon that the skin is actually regenerated by these components has not been observed at all.
  • these components have not been observed to affect the construction of a missing biological site, such as a collagen fiber bundle structure being lost by a wound.
  • farrelol is a compound having a flavanone structure and is known to be contained in various plants, and its synthesis method is already known (for example, Patent Document 9, Patent Document 10, (See Patent Document 11).
  • Patent Document 9 Patent Document 10
  • Patent Document 11 there is no known technique for inclusion in an external preparation for skin, and neither the dermis collagen fiber bundle reconstructing action nor the wound healing promoting action is known at all.
  • a screening method for a wound healing promoting effect using the migration ability of fibroblasts as an index has been devised (for example, see Non-Patent Document 5).
  • a collagen gel is prepared using fibroblasts, a defect is provided in the gel, and fibroblasts that migrate to the defect are counted.
  • the improvement of fibroblast migration is a necessary condition for promoting wound healing, it is not a sufficient condition. Therefore, even a component screened using fibroblast migration as an index is sufficient. There are things that do not show healing promoting effects.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-104921
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-29988
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-29987
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-29986
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 11-199461
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 07-196529
  • Patent Document 7 Special Table 2004-501176
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-137807
  • Patent Document 9 International Publication No. 02/092110 Pamphlet
  • Patent Document 10 European Patent Application Publication No. 122053
  • Patent Document 11 JP-A-58-21678
  • Non-patent literature l Keene et al "J. Cell Biol., 104, 611-621 (1987)
  • Non-Patent Document 2 Shimizu et al "Lab. Invest., Jun., 76 (6), 753-63 (1997)
  • Non-Patent Document 3 Vazquez F. et al, Maturitas, 25, 209-15 (1996)
  • Non-Patent Document 4 Eming S. A. et al., Hum. Gene Ther “9 (4), 529-39 (1998)
  • Non-Patent Document 5 Roman O Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm.
  • An object of the present invention is to provide an external preparation for skin that is excellent in the restructuring action of a disordered dermal collagen fiber bundle structure (hereinafter also simply referred to as “collagen fiber bundle”).
  • collagen fiber bundle a disordered dermal collagen fiber bundle structure
  • it promotes wound healing by enhancing the tissue regeneration ability of the living body, such as collagen production ability of fibroblasts existing in the dermis, in the skin defect site represented by wrinkles and wounds.
  • the issue is to provide technology.
  • Another object of the present invention is to provide a technique for regenerating skin tissue. Specifically, it is an object of the present invention to provide a technique for enhancing the ability of fibroblasts to produce collagens by acting on keratinocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance excellent in the effect of promoting wound healing.
  • the present inventors enhance the ability of fibroblasts to produce collagens and promote wound healing
  • flavanone derivative power such as farethol.
  • flavanone derivatives enhance the ability of fibroblasts to produce collagens by acting on keratinocytes.
  • cosmetics containing flavanone derivatives are excellent in the effect of improving wrinkles, and skin external medicines containing flavanone derivatives are excellent in the effect of promoting wound healing, leading to the completion of the present invention.
  • the present inventors tested the reorganization action of collagen fiber bundles by a method using a skin wound model in the process of searching for a component having an action of promoting wound healing, thereby performing wound healing. As a result, it has been found that a substance effective for promoting the above can be efficiently screened, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a first invention is a skin external preparation containing a flavanone derivative represented by the following general formula (1) and Z or a salt thereof (hereinafter also referred to as “the skin external preparation of the present invention”). It is.
  • Rl, R2, R3, R4, and R5 in the formula each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having carbon atoms:!
  • the flavanone derivative is preferably farrelol.
  • the external preparation for skin of the present invention can be used for normalizing the skin structure.
  • it is preferably used to reconstruct a disordered dermal collagen fiber bundle structure. Further, it is preferably used for promoting the regeneration of a defect site on the skin and the occlusion of the defect site by the regenerated tissue, and healing the wound. It is also preferred to use it to enhance the action of keratinocytes to increase the ability to produce fibroblast collagens.
  • the second invention is the use of the flavanone derivative represented by the general formula (1) and / or a salt thereof in the manufacture of a skin external preparation.
  • the third invention normalizes the skin structure, characterized by administering a skin external preparation containing the flavanone derivative represented by the general formula (1) and Z or a salt thereof to the skin. It is a method to do.
  • the preferred embodiment of the flavanone derivative and the preferred use of the skin external preparation in the second and third inventions are the same as in the first invention.
  • a fourth invention is a method for enhancing the action of keratinocytes to increase the ability to produce fibroblast collagens, wherein in the presence of keratinocytes and fibroblasts, the above general formula (1)
  • a preferred embodiment of the flavanone derivative is the same as in the first invention.
  • the administration may be transdermal administration.
  • the flavanone derivative and / or salt thereof is preferably contained in a skin external preparation and applied to the skin.
  • a fifth invention is a method for screening a substance having a wound healing effect, wherein normal fibroblasts of an animal are cultured in the presence of a test substance, and a collagen medium solution is added to the obtained culture.
  • the collagen gel was prepared by culturing the fibroblasts in the collagen gel in the presence of the test substance, and then the collagen gel was provided with a defect, and the collagen gel provided with the defect and the A method characterized by culturing the fibroblasts in the presence of a test substance and observing the degree of filling and contraction of the defect during the culture (hereinafter also referred to as “screening method of the present invention”). It is.
  • the degree of filling and shrinkage of the defect in the presence of the test substance and the degree of filling and shrinkage of the defect in the absence of the test substance are determined. By comparing, it is possible to screen for a test substance having an effect of promoting wound healing.
  • the test substance has an effect of promoting wound healing.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results obtained in Example 1.
  • Graph 1 shows the relationship between the number of days cultured without heparin and the number of cells
  • Graph 2 shows the relationship between the number of days cultured with heparin 0.01% and the number of cells.
  • FIG. 2 is a photograph showing the behavior of fibroblasts observed in the wound healing model of Example 2
  • FIG. 3 is a photograph showing the behavior of collagen fiber bundle construction observed in Example 3.
  • FIG. 4 is a photograph showing the state of a defective part of a collagen gel observed in Example 6.
  • FIG. 5 is a graph showing the results obtained in Experiment 1 of Example 9. The OD value (450 nm) is shown when each concentration of farrerol solution is added.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results obtained in Experiment 2 of Example 9. The growth rate of keratinocytes when each concentration of farrerol solution is added is shown.
  • FIG. 7 is a photograph showing the form of keratinocytes observed in Experiment 2 of Example 9.
  • FIG. 8 is a graph showing the results obtained in Experiment 3 of Example 9. The production amount of procollagen when each concentration of the farrerol solution is added is shown.
  • FIG. 9 is a photograph showing the state of collagen gel defect observed in Example 11. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the flavanone derivative used in the present invention is a compound represented by the general formula (1).
  • Rl, R2, R3, R4, and R5 are each independently a hydrogen atom or a carbon number:! Represents an alkyl group of ⁇ 4.
  • Rl, R2, and R4 is a hydrogen atom. Particularly preferably, all three are hydrogen atoms.
  • the alkyl group is particularly preferably a methyl group that can be exemplified by a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and the like.
  • R3 and R5 is preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably both are alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms.
  • alkyl group a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group and the like can be exemplified, and a methyl group is more preferable.
  • both are particularly preferably methyl groups.
  • flavanone derivatives examples include farellonore, methyl farrerol, dimethyl farerol, and the like.
  • Such a flavanone derivative can be synthesized from a known compound according to Japanese Patent Laid-Open No. 58-21678, but since it is also present in the plant body, it can be separated from the plant extract. It can also be manufactured.
  • Farrerol which is one of the compounds represented by the general formula (1), can be isolated and purified from an extract of a hypericum family Hypericum perforatum. An example of this manufacturing process is shown below.
  • an extract containing a flavanone derivative and a salt thereof having a concentration capable of exhibiting a target effect is used. You can also
  • the collagen fiber bundle reconstructing action of the obtained fraction containing a single component was examined, and the structure of the single component contained in the fraction having a strong action was identified by proton NMR, elemental analysis, mass spectrometry, and 13 C_NMR.
  • This ingredient was a fare palate and the yield was 3.2 mg.
  • farrelol was contained in the solvent-removed product of the 80% ethanol aqueous solution extract in an amount of about 0.006% by mass.
  • the flavanone derivative salt is not particularly limited as long as it is physiologically acceptable.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth salts such as calcium salt and magnesium salt, etc.
  • Preferred examples include metal salts, ammonium salts, triethylamine salts, triethanolamine salts, organic amine salts such as monoethanolamine salts, and basic amino acid salts such as lysine salts and alginates.
  • the flavanone derivative and the salt thereof have an action of promoting the reconstruction of the dermal collagen fiber bundle structure by fibroblasts. Specifically, the flavanone derivative migrates fibroblasts even in the absence of collagen fibers, and at the same time increases the collagen-producing ability of the fibroblasts themselves, thereby regenerating collagen fiber bundles in the defective part of the tissue. Build. It also promotes wound healing by promoting the regeneration of skin tissue at the skin defect site, and further enhancing the occlusion of the defect site by the regenerated tissue.
  • the external preparation for skin of the present invention comprises the flavanone derivative and Z or a salt thereof.
  • the flavanone derivative and Z or a salt thereof as an extract of a plant body.
  • a preferred example of the flavanone derivative is farerol.
  • the external preparation for skin of the present invention it is preferable to contain an extract of hypericum containing farrell roll.
  • the flavanone derivatives and salts thereof have an action of reconstructing the dermal collagen fiber bundle structure. Therefore, the external preparation for skin of the present invention can be used for normalizing the skin structure. “Normalizing the skin structure” means reducing the degree of destruction of the structure of the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue constituting the skin.
  • this includes, for example, reconstructing a disordered dermal collagen fiber bundle structure.
  • “Rebuilding a disordered dermal collagen fiber bundle structure” refers to constructing a dermal collagen fiber bundle structure at a site where the collagen fiber bundle structure existing in the dermis is disturbed.
  • “Dermal collagen fiber bundle structure is disordered” means that the collagen fiber bundle structure cannot maintain a normal structure.
  • the collagen fiber bundle is thin and weak, or the amount of collagen fibers is This includes a shortage, collagen fiber breakage, and collagen fiber bundle loss.
  • “normalizing the skin structure” also includes regenerating a skin defect site.
  • Defect of skin refers to a state in which the skin structure is destroyed. For example, rough skin, wrinkles, wounds, and the like occur.
  • the skin external preparation of the present invention is particularly suitable for wound healing.
  • normalizing the skin structure includes enhancing the action of increasing the ability of keratinocytes to produce fibroblast collagen.
  • the external preparation for skin of the present invention can be applied without particular limitation as long as it is applied externally to the skin.
  • cosmetics containing quasi-drugs, external preparations for skin, miscellaneous items for external use, etc. Can be illustrated.
  • a cosmetic is preferred for the purpose of improving wrinkles and mild skin roughness.
  • it is preferably used for reconstructing the disturbance of the dermal collagen fiber bundle caused by photoaging, or for regenerating a dermal collagen fiber bundle structure that has been lost due to wound or severe light damage.
  • the dosage form of the external preparation for skin of the present invention is not particularly limited, and can be a dosage form that can be usually taken by an external preparation for skin according to the purpose of use.
  • a dosage form a dosage form commonly used for basic cosmetics such as lotion, milky lotion, essence, cream, and knock is preferable.
  • leather Ointments, lotions, creams, milks, essences, etc. are preferred as dosage forms for external preparations.
  • the content of the flavanone derivative and / or salt thereof in the external preparation for skin of the present invention can be adjusted depending on the use, target, administration method, etc. of the external preparation for skin, but the preferred lower limit is 1 X 10 - 6 is the mass%, more preferably 1 X 10- 4% by weight.
  • a preferred upper limit is 1% by mass, more preferably 0.1% by mass.
  • the skin external preparation of the present invention contains an extract of a plant body containing the flavanone derivative and / or salt thereof
  • the flavanone derivative and / or salt thereof is purified to obtain the extract. It is preferable to use one having a higher concentration.
  • the skin external preparation of the present invention is a skin external preparation for reconstructing dermal collagen fiber bundles containing an unpurified hypericum extract, and other than the flavanone derivative / and / or its salt contained in the extract The flavanone derivative / and / or its salt-free les.
  • an extract obtained by purifying an extract of a plant of Hypericum so as to increase the farrerol concentration is preferable.
  • the flavanone derivative and / or concentration of a salt in a plant extract distillate is preferably 10 6 to 0.1 wt%, more preferably 10 5 to 0.01 wt%.
  • the content of the plant extract in the external preparation for skin is preferably 0.001 to 10% by mass, more preferably 0.01 to:!% By mass.
  • the external preparation for skin of the present invention may contain, in addition to the essential components, optional components usually used in external preparations for skin.
  • optional ingredients include, for example, mackerel demiana oil, avogad oil, corn oil, olive oil, rapeseed oil, sesame oil, castor oil, safflower oil, cottonseed oil, jojoba oil, palm oil, palm oil, liquid lanolin , Hardened palm oil, hardened oil, mole, hardened castor oil, beeswax, candelilla roux, carnauba wax, ibotarou, lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, jojoba oil, waxes; liquid paraffin, sugar Hydrocarbons such as quorum, pristane, ozokerite, paraffin, ceresin, petrolatum, microcrystalline wax; higher fatty acids such as oleic acid, isostearic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic
  • Organic powders such as polyethylene powder, polymethyl methacrylate, nylon powder, organopolysilane xanthomer; paraaminobenzoic acid series UV absorbers; anthranilic acid UV absorbers; salicylic acid UV absorbers; cinnamic acid UV absorbers; benzophenone UV absorbers; sugar UV absorbers; 2_ (2'-hydroxy _ 5 '_t-octyl phe Ninole) UV absorbers such as benzotriazole, 4-methoxy-1 4 '_t-butyldibenzol methane; lower alcohols such as ethanol and isopropanol; vitamin A or its derivatives, vitamins B hydrochloride, vitamin B tripalmitate, vitamin
  • Vitamin B such as conductors
  • Preferable examples include vitamins such as vitamin E acetate, vitamin E, vitamin D, vitamin H, pantothenic acid, panthetin, pyroguchi quinoline quinone and the like; and antibacterial agents such as phenoxyethanol.
  • an ingredient effective for the regeneration of skin tissue deficient due to a wound is an ingredient effective for the regeneration of skin tissue deficient due to a wound.
  • Preferred examples include antibiotics such as penicillin, fradiomycin, tetracycline or salts thereof, and bactericides such as atalinol and isodine for prevention.
  • a scar formation inhibitor such as tranilast is also preferred.
  • the content of these effective components for skin tissue regeneration is preferably 0.1 to 10% by mass.
  • the external preparation for skin of the present invention can be produced by treating the flavanone derivative and Z or a salt thereof and the optional component according to a conventional method.
  • the method for using the external preparation for skin of the present invention can be adjusted according to the application, dosage form, use site, symptom and the like of the external preparation for skin.
  • the method of enhancing the action of the keratinocytes of the present invention to increase the ability to produce fibroblast collagens is expressed by the general formula (1) in the presence of keratinocytes and fibroblasts. It is characterized by administering the indicated flavanone derivative and / or its salt.
  • the flavanone derivative and / or salt thereof used in the method of the present invention is as described in the above (A).
  • the flavanone derivative and / or salt thereof has an action of increasing the ability of fibroblasts to produce collagens by acting on keratinocytes.
  • Collagens is a concept that combines collagen and procollagen before being derived and differentiated into collagen.
  • the coexistence of keratinocytes and fibroblasts means a state in which these cells coexist in vitro or in vivo.
  • a state can be created by co-culturing these cells.
  • in vivo such a state exists in skin including the epidermis and dermis.
  • the flavanone derivative and / or salt thereof can be administered in vitro, for example, by mixing the flavanone derivative and / or salt thereof in a medium used for culturing keratinocytes and fibroblasts.
  • the lower limit is preferably 10- 8 M, more preferably 10- 7 M
  • the upper limit is preferably 10- 3 M, more preferably 10- 5 M.
  • transdermal administration is mentioned as a method of administering in vivo.
  • the method of transdermal administration is not particularly limited as long as it is a commonly used method, but a method of applying the skin external preparation containing the flavanone derivative and / or a salt thereof to the skin is preferable.
  • the external preparation for skin that can be used in the method of the present invention is the above-described external preparation for skin of the present invention, and its preference and aspect are also as described above.
  • normal fibroblasts of animals are cultured in the presence of a test substance, a collagen medium solution is prepared in the obtained culture to prepare a collagen gel, and the fibroblasts in the collagen gel are prepared.
  • the collagen gel is provided with a defect portion, the collagen gel provided with the defect portion and the test substance are allowed to coexist, and the fibroblasts are cultured. It is characterized by observing the degree of filling and shrinkage of the defect.
  • Normal animal fibroblasts used in the screening method of the present invention are not particularly limited as long as they are used in normal tests.
  • Preferred examples of animals include mice, rats, rabbits, and humans, and humans are particularly preferred because there are few differences in animal species.
  • Normal fibroblasts are non-cancerous cells that have the ability to form an ordered collagen gel.
  • Such normal fibroblasts can be collected from the oral mucosa, skin, etc., and can be used in primary culture, but some are commercially available in established cultured cell systems, Strong commercial products can also be used.
  • Preferred examples of such commercially available products include “normal human skin fibroblasts (primary culture)” manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd. and “normal human fibroblasts” manufactured by Kurabo Industries, Ltd.
  • fibroblasts normal fibroblasts of animals are also simply referred to as fibroblasts.
  • Fibroblasts are pre-cultured in advance and the number of cells is increased to an appropriate number before being used for the next culture. It is preferable.
  • the pre-culture is performed using normal cultured cell culture conditions, for example, 10% FBS-added Caro DMEM (GIBCO), etc. as a medium, 5% carbon dioxide gas flow condition at 37 ° C, 60 to 90% confluent. I'll do it until I can.
  • the cell mass obtained by pre-culture should be loosened into individual cells in the presence of 0.01-0.1% trypsin, used as a cell suspension, and used for culture in the presence of the following test substances. Is preferred. At this time, it is more preferable to have ethylenediamine tetraacetate together with trypsin.
  • the method for adding the test substance in the culture of fibroblasts in the presence of the test substance is not particularly limited, and may be added to the medium in advance or at the same time as the seeding of the cells. Alternatively, after cell seeding, the cells may be added after culturing for an appropriate time. Preferably, the cells are first seeded on a plate, cultured using a medium not containing the test substance, and then replaced with a medium containing the test substance and cultured.
  • the test substance can be added at any concentration. Preferably, in order to test the effective amount of the test substance, it is preferable to carry out the culture using a medium having various test substance concentrations.
  • the number of fibroblasts used for the culture is not particularly limited, and may be adjusted according to the size of the plate used for the culture. For example, it is preferable to adjust the number of cells to 10 3 / cm 2 to 10 5 / cm 2 .
  • the culture conditions may be normal conditions as in the preculture.
  • the culture time is not particularly limited as long as the number of cells can be increased to an appropriate number, and may be about 3 to 5 days, for example. During this time, the medium is replaced with a fresh one as necessary.
  • a cell suspension obtained by disaggregating fibroblasts obtained in the preculture into individual cells is seeded on a plate, cultured for about 24 hours, and then added with various concentrations of test substance solutions.
  • the culture is preferably performed for 3 to 5 days.
  • a collagen gel is prepared by adding a collagen medium solution to the fibroblast culture obtained above.
  • the amount of collagen medium solution to be added and the concentration of collagen in the collagen medium solution are not particularly limited as long as the collagen gel can be prepared and the fibroblasts can be dispersed in the collagen gel. .
  • the collagen medium solution for example, 0.3 to 0.8 wt% type I collagen solution, DMEM culture areas, 100 ⁇ 300MMHEPES, 2 to 4 mass 0/0 sodium bicarbonate solution, from 0.05 to 0.15 N sodium hydroxide aqueous solution, FBS, water mixed at a ratio of 4: 4: 2: 2: 1: 2: 3 Etc. can be used.
  • the amount of collagen medium solution added for example, the ratio of the collagen medium solution and the culture of fibroblasts can be 8 to 10 parts by mass :! to 2 parts by mass.
  • the fibroblasts in the prepared collagen gel are cultured in the presence of the test substance. That is, by placing the collagen gel prepared above in a medium containing the test substance, the fibroblasts in the collagen gel are cultured in suspension.
  • the concentration of the test substance in the medium used for culture may correspond to the concentration of the medium used for culturing fibroblasts in the presence of the test substance.
  • the culture time can be adjusted according to the contraction state of the collagen gel. Specifically, the culture is preferably performed until the gel is contracted to a size of about 1Z5 to 1Z10 from the time when the gel is prepared by adding the collagen solution. Such a culture time can be 3 to 5 days.
  • a defect is provided in the contracted collagen gel.
  • a defective part means a part through which a part of the collagen gel penetrates and is in a hole state.
  • the shape and size of the defect is not particularly limited as long as it is suitable for observing the change in shape.
  • a central portion of the contracted collagen gel can be punched out into a circular shape with a punch to form a donut-shaped gel.
  • a biopsy trepan with a diameter of 1 to 5 mm can be used.
  • the plate used for the culture can be selected according to the size of the collagen gel produced. For example, when the collagen gel has a diameter of about 2 to 7 mm, a 6-well plate can be selected.
  • the collagen gel is preferably fixed on the bottom surface of the tool.
  • the collagen gel can be fixed, for example, by dropping a collagen solution on the center of the well, placing the collagen gel on the well, and culturing at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the concentration of the test substance in the medium It should correspond to the concentration in the medium used for culturing the blast in the presence of the test substance.
  • Culture conditions can also be performed under normal conditions in the same manner as the culture conditions.
  • the culture period, that is, the observation period is not particularly limited, but may be 5 to 20 days.
  • the collagen remodeling action of the test substance can be determined.
  • the shape of the defect portion can be objectively recorded by a photograph or the like, and such a photograph can be compared and determined by converting it into digital image data as necessary.
  • the degree of filling and contracting the defect in the presence of the test substance is larger than the degree of filling and contracting the defect in the absence of the test substance, the test It can be determined that the substance has a wound healing promoting effect.
  • the degree of compensation and shrinkage can be evaluated by replacing them with numerical values using scores. For example, when the volume of the defect in the presence of the test substance is 85% or less, preferably 50% or less of the volume of the defect in the absence of the test substance, the test substance is wound healing. It can be determined that it has a healing promoting effect.
  • DMEM dimethyl sulfoxide
  • Fibroblasts grown to 80% confluent were dispersed with 0.05% Trypsin'EDTA. This was seeded in 96 well / plate at a concentration of 3 ⁇ 10 3 cells Zwell.
  • the concentration is 10- 6 ml / ml- DMEM of farrerol, 5x10- 7 ml / ml-DMEM , 10- 7 ml / ml- since the particular growth promoting was seen in DME M, the collagen production test follows Therefore, we decided to carry out at these three concentrations.
  • Fibroblasts grown confluently in a medium containing 10% FBS were dispersed by trypsin treatment and centrifuged.
  • the cell growth suppression was released by removing DMEM containing 4% FBS and replacing it with DMEM containing 10% FBS.
  • the farrerol 10- 6 ml / ml- D MEM, 5x10- 7 mlZml_ DMEM were manufactured create those added at 10- 7 ml / ml_DMEM concentration.
  • Graph 1 shows the cell growth effect when the farrerol solution of each concentration was added to the medium under heparin-untreated conditions and graph 2 with 0.1% heparin-treated conditions. Under either condition, cell growth was more apt to be promoted than in the DMSO addition group, which is the direction control of the group to which farrerol was added. This indicates that farrerol has a fibroblast proliferation promoting effect.
  • Biopsy Figure 2 shows a photograph of fibroblasts derived from a wound site punched with trepan.
  • 10% FBS-DMEM without heparin the group with the addition of farrerol added it, and the cells with a longer migration distance of fibroblasts moved more actively than the group.
  • 0.1% heparin / 10% FBS-DMEM and 1.0% heparin / 10% FBS-DMEM there is no difference in cell migration between the group with or without farrerol. In both cases, migration was inhibited by the action of heparin.
  • Count cells trypan blue and adjust to 1 X 10 5 cells / ml.
  • the gel is separated from the inner wall of the well with the needle of the injection needle so as not to prevent the gel from contracting.
  • a cosmetic an external preparation for skin of the present invention, was prepared according to the formulation shown below. That is, ii, mouth, and c were heated to 80 ° C., and the mouth was gradually added to emulsify with emulsification, further added with neutralization, stirred and cooled to obtain Essence 1.
  • Comparative Example 1 in which the farrelol of Essence 1 was replaced with ethanol was also produced.
  • Carbopol 1 3 8 2 0.1 (Alkyl-denaturing power Lupoxy vinyl polymer: manufactured by Goodrich)
  • ⁇ -Pemulen T R— 1 0.1 (Alkyl-modified rupoxyvinyl polymer; manufactured by Goodrich) Water 5 7. 1
  • the cosmetics of Essence 1 and Comparative Example 1 prepared above were subjected to a use test for 8 weeks. These cosmetics were used twice a day in the morning, and eyelid replicas were collected before and after the use test. Under the irradiation of light from an angle of 45 degrees, the shadow produced by the shadow was taken into the image from the microscope, binarized, the area ratio of the shadow in the field of view was determined, and the average value of this group of values was determined. The results are shown in Table 2.
  • the cosmetic preparation (essence) that is an external preparation for skin of the present invention has an excellent skin tone. It turns out that it has an improvement effect.
  • Essence 2 which is an external preparation for skin of the present invention was prepared according to the following formulation.
  • the strength ratio S was 8.2 ⁇ 3.2% before the test and 3.9 ⁇ 1.1% after the test, confirming the effect.
  • Example 3 In the same manner as in Example 2, a collagen medium solution was added to the culture obtained by culturing under each condition to prepare a collagen gel.
  • the prepared collagen gel was suspended in culture in the same medium as in 2) for 1 week.
  • Carbopol 1 3 8 2 (Alkyl-modified rupoxyvinyl polymer; manufactured by Goodrich)
  • Essence 3 and Comparative Example 2 a panel was used to examine the tissue regeneration promoting effect of the defect site due to the wound. That is, a punching die was placed on the inner side of the upper arm of the panel, and the skin was peeled off with a scalpel to produce three 1 mm X lmm parts. One site was applied with Essence 553 once a day for 5 days from the day of removal of the epidermis, and one site was applied with Comparative Example 2 once a day for 5 days from the day of removal of the epidermis. No treatment was performed. Observations were made 1 week and 2 weeks after application, and the degree of tissue regeneration at the defect site was observed. The results are shown in Table 5. From this, it can be seen that Essence 3 which is an external preparation for skin of the present invention is excellent in the tissue regeneration promoting action of the defect site. In addition, no scar formation was observed.
  • the skin external preparation 1 which is the skin external preparation of the present invention was prepared by the same method as in Example 7.
  • the skin external medicine 1 showed an excellent regeneration promoting effect on the defective skin tissue despite the presence of antibiotics.
  • WST_8 / l_Methyl PMS was added at 10 ⁇ l / well and incubated at 37 ° C for 4 hours.
  • the evaluation results by MTT are shown in the graph of Fig. 5 below.
  • the OD value was shown to increase depending on the concentration of farrerol.
  • Control 10- 5 M farrerol showed OD value twice or more. Even at 48 hours, the value was about 1.7 times that of DMSO.
  • the number of cells was small and the original OD value was low, reproducibility was confirmed at 6 X 10 3 cells / well, where the number of seeded cells was doubled. As a result, almost the same result could be obtained.
  • Figure 6 shows the cell count results.
  • the graph shows the cell growth rate when the number of cells in the control (DMSO added group) is 100%. Compared to the control, the cell growth rate tended to be suppressed in a concentration-dependent manner. Cells growth rate of the group with the addition of 10- 5 M farrerol is suppressed to 75.1 ⁇ 5.2% after 24 hours, 75.5 ⁇ 5.8% in the even 10- 6 M in other concentrations, the 10- 7 M 77.1 ⁇ The cell growth rate remained at 8.6%. In 48 hours, 10 in 5 M farrerol group with addition of the concentration of forces it hereinafter were growth rate of about 71.9 ⁇ 16.6% showed cell growth rate of about equivalent to the control group. There was no change in cell morphology (Fig. 7).
  • Day3 Seed 2.5 X 10 * cells / well in a 24 well plate.
  • fibroblasts to produce collagen can be changed via keratinocytes in a co-culture system, so that, for example, in 3D cultured skin, the properties of 3D skin are desired. It can also be applied to change the shape.
  • an external preparation for skin containing farerol (a cosmetic material: lotion) was prepared. That is, the formulation components were solubilized with stirring at room temperature to obtain a lotion.
  • this london By transdermally administering this london into murine or human skin, it is possible to increase the production amount of procollagen in the dermis of the skin, thereby increasing the amount of collagen in the dermis. This is because keratinocytes (keratinocytes) and fibroblasts coexist in the skin.
  • Hypericum extract was prepared as a test substance for screening. That is, 80 kg of an aqueous ethanol solution 101 was added to 1 kg of the above-ground dry matter of Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae) and refluxed for 4 hours with stirring. After cooling, insolubles were removed by filtration, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain 51 g of amorphous. This thing water Disperse the sample in water, charge it with Diaion HP20, wash with 51 water and then with 50% aqueous ethanol solution of 51, elute with 99% ethanol, fractionate the eluate, and extract the fraction by thin-layer chromatography. While checking by chromatography and HPLC, fractions containing the same single substance were combined, and fractions containing multiple components were purified again with chromatographic to obtain 7 fractions containing a single component.
  • the substance having a wound healing effect was screened by evaluating the collagen constructing action of each test substance using the following method. A specific procedure will be described later.
  • the final concentration of farrerol, 10- 5 M, 10- 6 M , and adjusted to 10- 7 M to observe the degree of shrinkage of the defect in each of the concentrations.
  • the result is shown in FIG. From this figure, the final concentration 10- 5 M fa Reroru, if 10- 6 M, shrinkage of the punch hole (defect) is clearly promote has been that force 10- 7 M in promoting contraction not It turns out that it is clear.
  • the collagen construct promoting effect fa Reroru, by using at least 10- 6 M of farrerol it can be seen that can exert a wound-healing promoting effect.
  • the effective concentration of a test substance having a wound healing promoting effect can be determined.
  • a collagen medium solution was prepared in the same manner as in Example 3 to prepare a collagen gel. Then, fibroblasts in the collagen gel were cultured using the medium used in 2). The concentration of the test substance in the medium corresponds to that in 2).
  • 10- 5 M, 10- 6 M, 10- 7 M Fibroblasts were cultured in medium containing Farrerol of collagen gels After making even a final concentration of 10- 5 M of each farrerol , 10- 6 M, was cultured in a medium of 10- 7 M.
  • the size of the collagen gel contracted to about 1/5 to 1/10 from the time when the collagen solution was prepared. Subsequently, the central part of the collagen gel was punched out into a donut shape using a biopsy trepan with a diameter of 3 mm to produce a “wound model”.
  • the external preparation for skin of the present invention can be applied to cosmetics, external preparations for skin and the like. Moreover, wound healing can be accelerated
  • the shape of three-dimensional skin is changed to a desired shape and applied to make artificial skin. I'll do it.
  • the screening method of the present invention can be used to screen for a substance having a wound healing promoting action suitable for an external skin medicine.

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Abstract

　大しわや創傷に代表される皮膚の欠損部位において、真皮内に存在する線維芽細胞のコラーゲン類産生能などの生体の組織再生能を高めるために、ファレロールなどのフラバノン誘導体を皮膚外用剤の有効成分として用いる。 　また、創傷治癒を促進する効果に優れる物質を効率良くスクリーニングために、皮膚の創傷モデルを用いて、コラーゲン線維束の再構築作用を試験する。

Description

明 細 書
フラバノン誘導体を含む皮膚外用剤
技術分野
[0001] 本発明は、皮膚外用剤に関し、更に詳細には、フラバノン誘導体を含有する皮膚 外用剤に関する。また、本発明は、線維芽細胞のコラーゲン産生能を増強する方法 に関する。また本発明は、創傷治癒効果を有する物質のスクリーニング方法に関する 背景技術
[0002] 皮膚は、角層、表皮、基底層、真皮から構成されており、通常、認識される「肌」の 性状において大きな影響を与えるのは真皮の構造であると言われている。この真皮 の重要構成成分の一つは、弾性などに大きな影響を与えるコラーゲン類であると言 われている。真皮にはコラーゲン類には、コラーゲン I、コラーゲン III、コラーゲン IV、 コラーゲン V、コラーゲン VII等が存し、それぞれが重要な機能を担っており、これら は線維芽細胞が産生するプロコラーゲンから派生する（例えば、非特許文献 1、非特 許文献 2、非特許文献 3を参照）。線維芽細胞によるプロコラーゲンを含むコラーゲン 類の産生能は、老化や紫外線ダメージによって低下することも知られており、この低 下が皮膚の機能の低下の原因になっている。即ち、この様に低下した線維芽細胞の コラーゲン類産生能を回復させることが、皮膚機能の回復の重要な因子となる。
[0003] 人間は年齢とともにその形態が変化し、老化の兆候を見せる。皮膚に於けるこの様 な兆候の一つにしわの形成が挙げられ、この様な兆候の形成の抑制が化粧料の大 きなテーマとなっている。この様なしわの形成の発生メカニズムの一つは、真皮コラー ゲン線維束構造の崩壊乃至はその構造の乱れであるといわれている。時に、真皮コ ラーゲン線維束構造の崩壊乃至はその構造の乱れは、部分的に真皮コラーゲン線 維束そのものの欠落を引き起こす。この状態の皮膚の部分は、創傷皮膚と類似した 構造を有するといわれており、これが俗に言う、「大じわ」である。真皮コラーゲン線維 束構造の崩壊乃至はその構造の乱れを改善するために、モノテルペン或いはトリテ ルペンなどのテルペン乃至はその誘導体により真皮コラーゲン線維束を再構築する ことが知られている（例えば、特許文献 1を参照）。又、植物の抽出物にも真皮コラー ゲン線維束再構築作用を有するものが存することが知られている（例えば、特許文献 2、特許文献 3を参照）。この様な植物の抽出物の内、真皮コラーゲン線維束再構築 作用が優れるものとしては、オトギリソゥの抽出物が知られている（例えば、特許文献 4を参照）。これらのテルペン類及び抽出物は、線維芽細胞自体のコラーゲン産生能 を向上させる作用を有し、周囲にコラーゲン線維束が存在する場合には、この線維 束に沿ってコラーゲン線維束を構築することができる。し力 ながら、これらの成分は 、真皮コラーゲン線維束自体が欠落し、線維芽細胞の周囲に存在しない場合には、 十分にコラーゲン繊維束を構築することができなレ、。従って、上記成分や抽出物は、 大じわなどのコラーゲン線維が欠落した部位にぉレ、ては、コラーゲン線維束の再構 築を十分に促進することができず、上記症状の改善効果を十分に発揮しないという 問題があった。
[0004] また、皮膚は重要な生体防御組織であるとともに、呼吸器でもあり、この皮膚の欠損 は、防御機構と、呼吸機能の両者を脅かすことになる。この為、やけどなどで表皮の 1 /3を喪うと、生命を脅かすとの定説もできあがっている。この様な状況から、欠損し た皮膚部位を速やかに再生させる技術の開発は長年にわたって望まれていた。創傷 治癒作用を有する成分としては、例えば、クルクマ抽出物、やラタトフエリンなどが知 られているが（例えば、特許文献 5、特許文献 6を参照）、これらには真皮コラーゲン 線維束構造の再構築作用はなレ、ため、皮膚組織を再生する作用は十分ではなレ、。 この様な背景において、細胞の増殖を促進し、コラーゲン産生能を高める創傷治癒 の為の素材として、ィヌリン類 (例えば、特許文献 7を参照）、コラーゲン加水分解物 類 (例えば、特許文献 8を参照）、ラ外フェリン類 (例えば、特許文献 6を参照）などが 開発されてきた。これらの成分の創傷治癒作用は、線維芽細胞の増殖活性や皮膚 組織再生に関与する酵素の RNA発現などを介して確かめられている。しかしながら 、これらの成分によって、実際に皮膚が明らかに再生されるような現象は全く観察さ れていない。更に、これらの成分は、創傷によってコラーゲン線維束構造が欠落した ような、欠損した生体部位の構築に影響を与えることは全く観察されていない。
[0005] このように、コラーゲン線維束構造の欠落などによって欠損した生体組織において 、組織を再生し、しわの改善や創傷治癒などに優れた効果を有する成分は、未だ発 見されていない。
[0006] 一方、ファレロールはフラバノン構造を有する化合物であり、種々の植物に含有さ れることが知られており、その合成方法も既に知られている（例えば、特許文献 9、特 許文献 10、特許文献 11を参照）。しかしながら、皮膚外用剤に含有させる技術は全 く知られていないし、真皮コラーゲン線維束再構築作用についても、創傷治癒促進 作用についても、全く知られていない。
[0007] また、線維芽細胞によるコラーゲン類産生能の向上に、ケラチノサイトの作用が影 響していることが、共培養による検討で知られている（例えば、非特許文献 4を参照） 。し力、しながら、ケラチノサイトに影響を与えることにより、線維芽細胞のコラーゲン類 産生能を増大するような成分は知られていなかった。
[0008] 一方、上述したィヌリン類、コラーゲン加水分解物類、ラタトフヱリン類などの創傷治 癒のための物質は、いずれも線維芽細胞のコラーゲン産生能を指標に、該コラーゲ ン産生能を高める物質としてスクリーニングされたものである。し力 ながら、線維芽 細胞のコラーゲン産生能の向上は、創傷治癒促進のための必要条件ではある力 十 分条件ではなぐコラーゲン産生能を向上させる成分であっても創傷治癒促進効果 を有しなレ、ものも存するのが現状でる。
[0009] また、線維芽細胞の遊走能を指標とした、創傷治癒促進効果のスクリーニング方法 も考案されている (例えば、非特許文献 5を参照）。この方法では、線維芽細胞を用い てコラーゲンゲルを作製し、これに欠損部を設け、この欠損部に遊走してくる線維芽 細胞を計数する。しかしながら、線維芽細胞の遊走能の向上は創傷治癒促進のため の必要条件ではあるが、十分条件ではないため、線維芽細胞の遊走能を指標にスク リーニングされた成分であっても十分な創傷治癒促進効果を示さなレ、ものも存する。
[0010] すなわち、これらのスクリーニング方法では、創傷治癒促進に必要な線維芽細胞の コラーゲン産生能を向上させる作用、及び線維芽細胞の遊走能を向上させる作用を 共に有する成分をスクリーニングすることができなかった。このような背景において、 優れた創傷治癒促進作用を有する成分を得る技術の開発が望まれていた。
[0011] 特許文献 1 :特開 2002— 104921号公報 特許文献 2 :特開 2002— 29988号公報
特許文献 3 :特開 2002— 29987号公報
特許文献 4 :特開 2002— 29986号公報
特許文献 5：特開平 11一 199461号公報
特許文献 6：特開平 07— 196529号公報
特許文献 7：特表 2004— 501176号公報
特許文献 8：特開 2003— 137807号公報
特許文献 9 :国際公開第 02/092110号パンフレット
特許文献 10 :欧州特許出願公開第 122053号明細書
特許文献 11 :特開昭 58— 21678号公報
非特許文献 l : Keene et al" J. Cell Biol., 104, 611-621 (1987)
非特許文献 2 : Shimizu et al" Lab. Invest., Jun. , 76 (6), 753-63 (1997)
非特許文献 3 : Vazquez F. et al, Maturitas, 25, 209-15 (1996)
非特許文献 4 : Eming S. A. et al., Hum. Gene Ther" 9 (4), 529-39 (1998)
非特許文献 5： Roman O Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm.
Bull. , 27 (2), 266-270 (2004)
発明の開示
[0012] 本発明は、乱れた真皮コラーゲン線維束構造 (以下、単に「コラーゲン線維束」とも いう）の再構築作用に優れる皮膚外用剤を提供することを課題とする。特に、大しわ や創傷に代表される皮膚の欠損部位において、真皮内に存在する線維芽細胞のコ ラーゲン類産生能などに代表される生体の組織再生能を高めることにより、創傷治癒 を促進する技術を提供することを課題とする。
また、本発明は、皮膚組織を再生する技術を提供することを課題とする。具体的に は、ケラチノサイトに作用することにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増強す る技術を提供することを課題とする。
また、本発明は、創傷治癒を促進する効果に優れる物質をスクリーニングする方法 を提供することを課題とする。
[0013] 本発明者らは、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増強し、創傷治癒を促進する 作用を有し、皮膚外用剤に含有させることが可能な成分を探し求めた結果、ファレ口 ールなどのフラバノン誘導体力 このような作用に優れていることを知見した。また、フ ラバノン誘導体は、ケラチノサイトに作用することにより、線維芽細胞のコラーゲン類 産生能を増強することも知見した。そして、フラバノン誘導体を含有する化粧料はし わを改善する効果に優れ、フラバノン誘導体を含有する皮膚外用医薬は創傷治癒を 促進する効果に優れることを知見し、本発明を完成するに至った。
[0014] また、本発明者らは、創傷治癒を促進する作用を有する成分を探し求める過程で、 皮膚の創傷モデルを用いた方法により、コラーゲン線維束の再構築作用を試験する ことにより、創傷治癒の促進に有効な物質を効率良くスクリーニングし得ることを知見 し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[0015] [1]第一の発明は、下記一般式（1)に表されるフラバノン誘導体及び Z又はその塩 を含有する、皮膚外用剤（以下、「本発明の皮膚外用剤」ともいう）である。
[0016] [化 1]
Figure imgf000006_0001
一般式 （ 1 )
[0017] 一般式（1)において、式中 Rl、 R2、 R3、 R4、 R5はそれぞれ独立に水素原子又は 炭素数:!〜 4のアルキル基を表す。
前記フラバノン誘導体は、好ましくはファレロールである。
[0018] [化 2]
Figure imgf000007_0001
ファ レローノレ
[0019] また、前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を 10— 6〜0. 1質量％含むオトギリソ ゥ科オトギリソゥの抽出物として含有することも好ましい形態である。
[0020] また、本発明の皮膚外用剤は、皮膚構造を正常化するために用いることができる。
特に、乱れた真皮コラーゲン線維束構造を再構築するために用いることが好ましい。 また、皮膚の欠損部位の再生及び再生組織による該欠損部位の閉塞を促進し、創 傷を治癒するために用いることが好ましい。また、ケラチノサイトの線維芽細胞コラー ゲン類産生能を増大する作用の増強のために用いることも好ましレ、。
[0021] [2]第二の発明は、皮膚外用剤の製造における前記一般式（1)に表されるフラバノ ン誘導体及び/又はその塩の使用である。
[0022] [3]第三の発明は、前記一般式（1)に表されるフラバノン誘導体及び Z又はその塩 を含む皮膚外用剤を皮膚に投与することを特徴とする、皮膚構造を正常化する方法 である。
上記第二及び第三の発明におけるフラバノン誘導体の好ましい態様及び皮膚外用 剤の好ましい用途は、第一の発明と同様である。
[0023] [4]第四の発明は、ケラチノサイトの繊維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用 を増強する方法であって、ケラチノサイトと繊維芽細胞の共存下に、前記一般式（1) に表されるフラバノン誘導体及び/又はその塩を投与することを特徴とする方法であ る。
前記フラバノン誘導体の好ましい態様は、第一の発明と同様である。 [0024] 前記投与は経皮的投与であってもよぐ具体的には、前記フラバノン誘導体及び/ 又はその塩を皮膚外用剤に含有させ皮膚に塗布することが好ましい。
[0025] [5]第五の発明は、創傷治癒効果を有する物質をスクリーニングする方法であって、 動物の正常線維芽細胞を被験物質の存在下培養し、得られた培養物にコラーゲン 培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製し、前記コラーゲンゲル内の前記線維芽細 胞を前記被験物質の存在下培養した後、該コラーゲンゲルに欠損部を設け、該欠損 部を設けたコラーゲンゲル及び前記被験物質を共存させて前記線維芽細胞を培養 し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度を観察することを特徴とする方法（ 以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう）である。
[0026] また、本発明のスクリーニング方法においては、被験物質の存在下での前記欠損 部の補填、収縮の程度と、被験物質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程 度を比較することにより、創傷治癒促進効果を有する被験物質をスクリーニングする こと力 Sできる。
具体的には、被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度が、被験物 質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度に比して大きい場合に、前記被 験物質は創傷治癒促進効果を有すると判別することができる。
図面の簡単な説明
[0027] [図 1]実施例 1で得られた結果を示す図である。グラフ 1は、へパリン未処理下での培 養日数と細胞数の関係を示し、グラフ 2は、へパリン 0. 01 %処理下での培養日数と 細胞数の関係を示す。
[図 2]実施例 2の創傷治癒モデルで観察された線維芽細胞の挙動を示す写真である
[図 3]実施例 3で観察されたコラーゲン線維束の構築の挙動を示す写真である。
[図 4]実施例 6で観察されたコラーゲンゲルの欠損部の状態を示す写真である。
[図 5]実施例 9の実験 1で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液 を添加した場合の OD値（450nm)を示す。
[図 6]実施例 9の実験 2で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液 を添加した場合のケラチノサイトの増殖率を示す。 [図 7]実施例 9の実験 2で観察されたケラチノサイトの形態を示す写真である。
[図 8]実施例 9の実験 3で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液 を添加した場合のプロコラーゲンの産生量を示す。
[図 9]実施例 11で観察されたコラーゲンゲルの欠損部の状態を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
[0028] (A)本発明で使用するフラバノン誘導体及びその塩
本発明で使用されるフラバノン誘導体は、前記一般式（1)で表される化合物である 一般式（1)において、 Rl、 R2、 R3、 R4、 R5はそれぞれ独立に水素原子又は炭素 数:!〜 4のアルキル基を表す。
前記 Rl、 R2、 R4の少なくとも 1つは、水素原子であることが好ましぐ特に好ましく は 3つ全てが水素原子である。アルキル基としては、メチル基、ェチル基、プロピル基 、ブチル基などが例示できる力 メチル基であることが特に好ましい。
[0029] また、前記 R3、 R5の少なくとも 1つは、炭素数 1〜4のアルキル基であることが好ま しぐ特に好ましくは両方とも炭素数 1〜4のアルキル基である。アルキル基としては、 メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基などが例示できる力 S、メチル基であること 力 り好ましい。特に、ともにメチル基であることが特に好ましい。
[0030] このようなフラバノン誘導体としては、例えば、ファレローノレ、メチルファレロール、ジ メチルファレロールなどが挙げられる。
[0031] この様なフラバノン誘導体は、特開昭 58— 21678号公報に従えば、既知の化合物 より合成できるが、これは植物体中にも存在するため、植物体の抽出物より、分離精 製することもできる。一般式（1)に表される化合物の一つであるファレロールはオトギ リソゥ科オトギリソゥの植物体の抽出物より単離精製することができる。この製造過程 の一例を下記に示す。勿論、植物体由来のフラバノン誘導体及び Z又はその塩を後 述する皮膚外用剤に含有させる際には、 目的とする効果を発揮し得る濃度のフラバ ノン誘導体及びその塩を含有する抽出物を用いることもできる。
[0032] <製造例 1 >
オトギリソゥ科オトギリソゥ（Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae))の地上部の 乾燥物 lkgに 80%エタノール水溶液 101をカ卩え、攪拌下 4時間還流を行った。冷却 後不溶物を濾過で除去し、減圧濃縮した後、凍結乾燥し、アモルファスを 51g得た。 このものを水に分散させ、ダイアイオン HP20にチャージし、 51の水、次いで 51の 50 %エタノール水溶液を流して洗浄し、 99%のエタノールで溶出させ、溶出分をフラク シヨネーシヨンし、フラクションを薄層クロマトグラフィーと HPLCでチェックしながら、同 一の単一物質を含むフラクションは合一させ、複数の成分を含むフラクションは再度 クロマトグラフィーで精製した。得られた単一成分を含むフラクションのコラーゲン線 維束再構築作用を調べ、この作用の強いフラクションに含まれる単一成分の構造を プロトン NMR、元素分析、質量分析、 13C_NMRより同定した。この成分は、ファレ口 ールであり、収量は 3. 2mgであった。また、ファレロールは 80%エタノール水溶液抽 出物の溶媒除去物中に約 0. 006質量％含有されてレ、た。
[0033] 前記フラバノン誘導体の塩としては、生理的に許容されるものであれば特段の制限 はなぐ例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネ シゥム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩、トリェチルアミン塩、トリエタノー ノレアミン塩、モノエタノールアミン塩等の有機アミン塩、リジン塩、アルギン酸塩等の 塩基性アミノ酸塩等が好ましく例示できる。
[0034] 上記フラバノン誘導体及びその塩は、線維芽細胞による真皮コラーゲン線維束構 造の再構築を促進する作用を有する。具体的には、前記フラバノン誘導体が、コラー ゲン線維の存しない場所でも線維芽細胞を遊走せしめ、同時に、線維芽細胞自体の コラーゲン産生能を高めることにより、組織の欠損部分にコラーゲン線維束を再構築 させる。また、皮膚の欠損部位における皮膚組織の再生を促進し、さらに再生した組 織による欠損部位の閉塞作用を高めることにより、創傷治癒を促進する。
[0035] (B)本発明の皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、前記フラバノン誘導体及び Z又はその塩を含有すること を特徴とする。例えば、植物体の抽出物として、前記フラバノン誘導体及び Z又はそ の塩を含有させること力 Sできる。前記フラバノン誘導体としては、ファレロールが好まし く挙げられる。本発明の皮膚外用剤においては、ファレルロールを含有するオトギリソ ゥ抽出物を含有させることが好ましい。 [0036] 上述したように、前記フラバノン誘導体及びその塩は、真皮コラーゲン線維束構造 を再構築する作用を有する。従って、本発明の皮膚外用剤は、皮膚構造を正常化す るために用いることができる。 「皮膚構造を正常化する」とは、皮膚を構成する表皮、 真皮、皮下組織の構造の破壊の度合いを小さくすることをいう。具体的には、例えば 、乱れた真皮コラーゲン線維束構造を再構築することを含む。 「乱れた真皮コラーゲ ン線維束構造を再構築する」とは、真皮内に存在するコラーゲン線維束構造が乱れ ている部位において、真皮コラーゲン線維束構造を構築することをいう。 「真皮コラー ゲン線維束構造が乱れている」とは、コラーゲン線維束構造が正常な構造を維持で きなくなることをレ、い、例えば、コラーゲン線維束が細く弱くなつたり、コラーゲン線維 の量が少なくなつたり、コラーゲン線維が切れたり、コラーゲン線維束が欠落したりす ること等を含む。また、「皮膚構造を正常化する」とは、皮膚の欠損部位を再生するこ とも含む。また、皮膚の欠損部位を再生し、再生組織による該欠損部位の閉塞を促 進することにより、当該欠損部位より感染が生じることを防ぎ、皮膚の防御機構、呼吸 機能を復活させることも含む。「皮膚の欠損」とは、皮膚構造が破壊された状態をいい 、例えば、肌荒れ、しわ、創傷などが生じることをいう。本発明の皮膚外用剤は、特に 創傷治癒に好適である。また、「皮膚構造を正常化する」とは、ケラチノサイトの線維 芽細胞コラーゲン産生能を増大する作用を増強することも含む。
[0037] 本発明の皮膚外用剤は、皮膚に外用で適用されるものであれば特段の限定なく応 用でき、例えば、医薬部外品を含有する化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨など が例示できる。中でも、化粧料及び皮膚外用医薬に応用することが特に好ましい。例 えば、しわの改善、軽度の肌荒れの改善などを目的とする場合には、化粧料とするこ とが好ましい。具体的には、光老化による真皮コラーゲン線維束の乱れを再構築した り、創傷や重度の光損傷で欠損した真皮コラーゲン線維束構造の再生のために使用 することが好ましい。一方、重度の肌荒れの改善や創傷治癒を目的とする場合には、 皮膚外用医薬とすることが好ましレ、。
[0038] 本発明の皮膚外用剤の剤形は特に制限されず、使用目的に応じて通常皮膚外用 剤がとり得る剤形をとることができる。例えば、化粧料の剤形としては、ローション、乳 液、エッセンス、クリーム、ノ ノクなどの基礎化粧料に常用される剤形が好ましい。皮 膚外用医薬の剤形としては、軟膏、ローション、クリーム、ミルク、エッセンスなどが好 ましい。
[0039] 本発明の皮膚外用剤における前記フラバノン誘導体及び/又はその塩の含有量 は、皮膚外用剤の用途、対象、投与方法などによって調節することができるが、好ま しい下限値は 1 X 10— 6質量％であり、より好ましくは 1 X 10— 4質量％である。好ましい 上限値は、 1質量％であり、より好ましくは 0. 1質量％である。
また、特に創傷治癒を目的とした皮膚外用医薬においては、前記フラバノン誘導体 及び/又はその塩の含有量の下限値を好ましくは 1 X 10— 6M、より好ましくは 1 X 10— 4M、上限値を好ましくは 1M、より好ましくは 0. 1Mとすることもよい。
[0040] また、本発明の皮膚外用剤に前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を含有する 植物体の抽出物を含有させる場合は、前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を精 製することにより、その濃度を高めたものを用いることが好ましい。なお、本発明の皮 膚外用剤は、精製されていないオトギリソゥ抽出物を含む真皮コラーゲン線維束再構 築用の皮膚外用剤であって、該抽出物に含まれるフラバノン誘導体/及び又はその 塩以外のフラバノン誘導体/及び又はその塩を含まなレ、ものは含まなレ、。本発明の 皮膚外用剤に用いることができる植物体の抽出物としては、オトギリソゥの植物体の 抽出物を精製してファレロール濃度を高めた抽出物が好ましく挙げられる。植物体抽 出物における前記フラバノン誘導体及び/又はその塩の濃度は好ましくは 10— 6〜0. 1質量％、より好ましくは 10— 5〜0. 01質量％である。このような植物体抽出物を用い る場合の、皮膚外用剤における植物体抽出物の含有量は、好ましくは 0. 001〜10 質量％、より好ましくは 0. 01〜：!質量％である。ここで、植物体抽出物の含有量とは
、溶媒除去物における含有量である。
[0041] 本発明の皮膚外用剤には、前記必須成分以外に、通常皮膚外用剤で使用される 任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、例えば、マ力デミアナ ッッ油、ァボガド油、トウモロコシ油、ォリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラ ヮー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、 モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロゥ、カルナゥバロウ、イボタロウ、ラノリ ン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、ス クヮラン、プリスタン、ォゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリン ワックス等の炭化水素類;ォレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パ ルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ゥンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアル コーノレ、ステアリノレアノレコーノレ、イソステアリノレアノレコーノレ、ベへニノレアノレコーノレ、オタ チルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコ ール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸へキシルデ シル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ— 2—ェチルへキシル、乳酸セチル、 リンゴ酸ジイソステアリル、ジ一 2—ェチルへキサン酸エチレングリコール、ジカプリン 酸ネオペンチルグリコール、ジ _ 2_へプチルゥンデカン酸グリセリン、トリ— 2—ェチ ルへキサン酸グリセリン、トリ— 2—ェチルへキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソ ステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ _ 2 _ェチルへキサン酸ペンタンエリトリツ ト等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフエ二ルポリシロキサン、ジ フエ二ルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オタタメチルシクロテトラシロキサン、 デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロへキサンシロキサン等の環状 ポリシロキサン；ァミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル 変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコー ン油等の油剤類;脂肪酸セッケン (ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラ ゥリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールァミンエーテル等のァニオン界面活 性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニゥム、塩化ベンザルコニゥム、ラウリルアミン オキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（2—ココィノレ — 2—イミダゾリニゥムヒドロキサイド一 1—カルボキシェチロキシ 2ナトリウム塩等）、ベ タイン系界面活性剤（アルキルべタイン、アミドべタイン、スルホベタイン等）、ァシルメ チルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノス テアレート、セスキォレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸ダリ セリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコ ール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、 P〇Eソルビタン脂肪酸 エステル類（POEソルビタンモノォレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビ タン等）、 P〇Eソルビット脂肪酸エステル類（P〇E_ソルビットモノラウレート等）、 P〇 Eグリセリン脂肪酸エステル類 (P〇E—グリセリンモノイソステアレート等）、 POE脂肪 酸エステル類（ポリエチレングリコールモノォレート、 POEジステアレート等）、 POEァ ノレキルエーテル類（p〇E2—オタチルドデシルエーテル等）、 POEアルキルフエニル エーテル類（POEノユルフェニルエーテル等）、プル口ニック型類、 ΡΟΕ·Ρ〇Ρァノレ キルエーテル類（ρ〇Ε· Ρ〇Ρ2_デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、 Ρ ΟΕヒマシ油 '硬化ヒマシ油誘導体（ΡΟΕヒマシ油、 ΡΟΕ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂 肪酸エステル、アルキルグノレコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコー ノレ、グリセリン、 1 , 3—ブチレングリコーノレ、 エリスリトーノレ、ソノレビトーノレ、キシリトーノレ 、 マノレチトーノレ、プロピレングリコーノレ、ジプロピレングリコーノレ、ジグリセリン、イソプレ ングリコール、 1， 2_ペンタンジオール、 2， 4—へキサンジオール、 1， 2—へキサン ジオール、 1， 2_オクタンジオール等の多価アルコール類；ピロリドンカルボン酸ナト リウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類;表面を処理されていても良い、マイ力、 タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケィ酸 (シリカ） 、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、；表面を処理されていても良レ、、ベン ガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無 機顔料類;表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、ォキシ塩ィヒビスマス 等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色 202号、赤色 228号、赤色 226号、 黄色 4号、青色 404号、黄色 5号、赤色 505号、赤色 230号、赤色 223号、橙色 201 号、赤色 213号、黄色 204号、黄色 203号、青色 1号、緑色 201号、紫色 201号、赤 色 204号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、ォ ルガノポリシ口キサンエラストマ一等の有機粉体類;パラァミノ安息香酸系紫外線吸収 剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤、；桂皮酸系紫外線 吸収剤、；ベンゾフエノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；2_ (2 '—ヒドロキシ _ 5' _t—ォクチルフエ二ノレ)ベンゾトリァゾール、 4—メトキシ一 4' _t—ブチルジベン ゾィルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール 類；ビタミン A又はその誘導体、ビタミン B塩酸塩、ビタミン Bトリパルミテート、ビタミン
6 6
Bジォクタノエート、ビタミン B又はその誘導体、ビタミン B 、ビタミン B 又はその誘
6 2 12 15
導体等のビタミン B類；ひ 一トコフヱロール、 /3—トコフヱローノレ、 γ—トコフヱローノレ、 ビタミン Eアセテート等のビタミン E類、ビタミン D類、ビタミン H、パントテン酸、パンテ チン、ピロ口キノリンキノン等のビタミン類等；フエノキシエタノール等の抗菌剤などが 好ましく例示できる。
[0042] 中でも、創傷治癒の促進を目的とした皮膚外用医薬に含有させる任意成分として 特に好ましいものは、創傷により欠損した皮膚組織の再生に有効な成分であり、具体 的には、微生物感染を防ぐためのペニシリン、フラジオマイシン、テトラサイクリン又は これらの塩などの抗生物質、アタリノールやイソジン等の殺菌剤などが好ましく例示で きる。また、トラニラスト等の瘢痕形成抑制剤も好ましい。これらの皮膚組織の再生に 有効な成分の含有量は 0. 1〜： 10質量％が好ましい。
[0043] 本発明の皮膚外用剤は、前記フラバノン誘導体及び Z又はその塩と前記任意成分 とを常法に従って処理することにより製造できる。
また、本発明の皮膚外用剤の使用方法は、皮膚外用剤の用途、剤形、使用部位、 症状などに応じて調節することができる。
[0044] (C)ケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強する方 法
本発明のケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強 する方法 (以下「本発明の方法」ともいう）は、ケラチノサイトと線維芽細胞の共存下に 、前記一般式（1)に表されるフラバノン誘導体及び/又はその塩を投与することを特 徴とする。
本発明の方法に使用する前記フラバノン誘導体及び/又はその塩は、上記 (A)で 説明した通りである。前記フラバノン誘導体及び/又はその塩は、ケラチノサイトに働 きかけることにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増大させる作用を有する。
「コラーゲン類」とは、コラーゲン及びコラーゲンに派生分化する前のプロコラーゲン を合わせた概念である。
[0045] ケラチノサイトと線維芽細胞の共存下とは、 in vitro又は in vivoにおいてこれらの細 胞が共存している状態をいう。例えば in vitroでは、これらの細胞を共培養することに よってこのような状態をつくることができ、 in vivoであれば、表皮及び真皮を含む皮膚 にこのような状態が存在する。 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩の投与は、 in vitroでは、例えばケラチノサ イトと線維芽細胞の供培養に用いる培地に前記フラバノン誘導体及び/又はその塩 を混在させることにより行うことができる。この場合の混在（投与）量は、培地中の濃度 で、下限値が好ましくは 10— 8Mであり、より好ましくは 10— 7Mであり、上限値が好ましく は 10— 3Mであり、より好ましくは 10— 5Mである。
また、 in vivoで投与する方法としては、経皮的投与が挙げられる。経皮的投与の方 法は、通常用いられる方法であれば特に制限されないが、前記フラバノン誘導体及 び/又はその塩を含有する皮膚外用剤を皮膚に塗布する方法が好ましい。本発明 の方法に用いることができる皮膚外用剤は、上述した本発明の皮膚外用剤であり、そ の好ましレ、態様も上述したとおりである。
[0046] (D)本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、動物の正常線維芽細胞を被験物質の存在下培養 し、得られた培養物にコラーゲン培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製し、前記コ ラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を前記被験物質の存在下培養した後、該コラー ゲンゲルに欠損部を設け、該欠損部を設けたコラーゲンゲル及び前記被験物質を共 存させて前記線維芽細胞を培養し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度 を観察することを特徴とする。
[0047] 本発明のスクリーニング方法で用いる動物の正常線維芽細胞は、通常試験に用い られるものであれば特段限定されない。動物としては、例えば、マウス、ラット、ラビット 、ヒトなどが好ましく挙げられ、動物種差が少ないことから、ヒトが特に好ましい。正常 線維芽細胞とは、癌化していない細胞であって、秩序だったコラーゲンゲルを形成さ せる能力を有しているものをいう。このような正常線維芽細胞は、口腔内粘膜や皮膚 などにより採取することができ、これを初代培養して用いることもできるが、確立した培 養細胞系で市販されているものも存し、力かる市販品を用いることもできる。このような 市販品としては、例えば三光純薬株式会社製の「正常ヒト皮膚線維芽細胞 (初代培 養）」、クラボウ株式会社製の「正常ヒト線維芽細胞」等が好ましく例示できる。
なお、以下、このような動物の正常線維芽細胞を単に、線維芽細胞ともいう。
[0048] 線維芽細胞は、予め前培養し、細胞数を適当な数に増やしてから次の培養に用い ることが好ましい。前培養は、通常の培養細胞の培養条件、例えば、 10%FBS添カロ DMEM (GIBCO社製）等を培地として、 5%炭酸ガス気流条件下、 37°Cで、 60〜9 0%コンフルェントになるまで行えばよレ、。前培養によって得られた細胞塊は、 0. 01 〜0. 1 %のトリプシンの存在下、個々の細胞にほぐして、細胞浮遊液とし、以下の被 験物質の存在下での培養に用いることが好ましい。このとき、トリプシンとともにェチレ ンジァミン四酢酸塩を存在させるとより好ましレ、。
[0049] 線維芽細胞の被験物質の存在下での培養における、被験物質の添加方法は特に 制限されず、予め培地に添加しておいてもよいし、細胞の播種と同時に添加してもよ いし、細胞の播種後、適当な時間培養した後に添加してもよい。好ましくは、まず細 胞をプレートに播種し、被験物質を含まない培地を用いて培養を行った後、被験物 質を含む培地に交換して培養する方法が挙げられる。被験物質の添加量は、任意の 濃度とすることができる。好ましくは、被験物質の有効量を試験するために種々の被 験物質の濃度を有する培地を用いて、培養を行うことが好ましい。また、培養に用い る線維芽細胞の細胞数は、特に制限されず、培養に用いるプレートの大きさに合わ せて調整すればよい。例えば、 103/cm2〜105/cm2の細胞数となるよう調整するこ とが好ましい。培養条件も前培養と同様に通常の条件で行えばよい。培養時間は、 細胞数を適当な数に増やすことができる限り特に制限されず、例えば、 3〜5日程度 を目安とすればよい。この間、必要に応じて、培地を新鮮なものに交換する。
具体的には、例えば、前培養で得た線維芽細胞を個々の細胞にほぐした細胞浮遊 液をプレートに播種し、 24時間前後培養した後、種々の濃度の被験物質の溶液を添 加し、 3〜5日培養を行うことが好ましい。
[0050] 次に、上記で得られた線維芽細胞の培養物にコラーゲン培地溶液を加えることによ りコラーゲンゲルを作製する。加えるコラーゲン培地溶液の量、及びコラーゲン培地 溶液中のコラーゲンの濃度は、コラーゲンゲルを作製することができ、コラーゲンゲル 中に線維芽細胞を分散させることができる範囲であれば特に制限されなレ、。コラーゲ ン培地溶液としては、例えば、 0. 3〜0. 8質量％タイプ Iコラーゲン溶液、 DMEM培 地、 100〜300mMHEPES、 2〜4質量0 /0炭酸水素ナトリウム溶液、 0. 05〜0. 15 N水酸化ナトリウム水溶液、 FBS、水を 4 : 4 : 2 : 2 : 1 : 2 : 3程度の比率で混合したもの などを用いることができる。コラーゲン培地溶液の添加量としては、例えば、コラーゲ ン培地溶液と線維芽細胞の培養物の割合を、 8〜： 10質量部：:!〜 2質量部とすること ができる。
[0051] 次に、作製したコラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を、前記被験物質の存在下で 培養する。すなわち、前記で作製したコラーゲンゲルを前記被験物質を含む培地中 に置くことにより、コラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を浮遊培養する。
培養に用いる培地における被験物質の濃度は、前記被験物質の存在下での線維 芽細胞の培養に用いた培地の濃度に対応させればよい。培養時間は、コラーゲンゲ ルの収縮状況により調節することができる。具体的には、ゲルの大きさがコラーゲン 溶液を添加してゲルを作製した時点より 1Z5〜1Z10程度のサイズまで収縮した時 点まで培養することが好ましい。このような培養時間として 3〜5日間を目安とすること ができる。
[0052] 次に、収縮したコラーゲンゲルに欠損部を設ける。欠損部とは、コラーゲンゲルの一 部が貫通し、穴の状態となっている部分をいう。欠損部の形状及び大きさは、形状の 変化を観察するのに適していればよぐ特に制限されなレ、。例えば、収縮したコラー ゲンゲルの中央部分をパンチで円状に打ち抜いて、ドーナツ状のゲルとすることがで きる。このようなパンチによる打ち抜きには、例えば直径 l〜5mmの生検トレパンを用 レ、ることができる。
なお、このようなコラーゲンゲルの損傷モデルの作製方法は、 Roman O' Leary, Ma rk Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27 (2), 266-270 (2004)に開示 されている。
[0053] 次に、欠損部を設けたコラーゲンゲルを被験物質の存在下に置レ、て、コラーゲンゲ ルに含まれる線維芽細胞の培養を行う。培養に用いるプレートは、作製したコラーゲ ンゲルの大きさに合わせて選択することができる。例えば、コラーゲンゲルの直径が 2 〜7mm程度の場合には、 6ゥエルのプレートを選択することができる。また、コラーゲ ンゲルはゥヱル底面に定着させることが好ましい。コラーゲンゲルの定着は、例えば、 ゥエルの中央部分にコラーゲン溶液を滴下し、そこにコラーゲンゲルを乗せて 37°Cで 15分間培養することにより行うことができる。培地中の被験物質の濃度は、前記線維 芽細胞の被験物質の存在下での培養に用いた培地における濃度に対応させればよ レ、。培養条件も、前記培養条件と同様に通常の条件で行うことができる。培養期間、 すなわち観察期間は特に制限されないが、 5〜20日を目安とすればよい。
[0054] 上記培養の間、コラーゲンゲルの欠損部の補填、収縮の程度を観察する。この観 察結果を記録することにより、被験物質のコラーゲン再構築作用を判定することがで きる。例えば、欠損部の形状は、写真などにより客観的に記録することができ、この様 な写真を、必要に応じてデジタル画像データに変換するなどして、比較、判定するこ とができる。具体的には、被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度が 、被験物質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度に比して大きい場合に 、前記被験物質は創傷治癒促進効果を有すると判別することができる。また、補填、 収縮の程度をスコアなどを用いて、数値に置き換えて評価することもできる。例えば、 被験物質の存在下での前記欠損部の体積が、被験物質の非存在下での前記欠損 部の体積の 85%以下、好ましくは 50%以下である場合に、前記被験物質は創傷治 癒促進効果を有すると判別することができる。
この様な方法で被験物質の創傷治癒促進効果を評価することにより、線維芽細胞 の遊走を促進するのみで線維芽細胞のコラーゲン産生を促進しない物質や、線維芽 細胞のコラーゲン産生を促進するのみで線維芽細胞の遊走 (移動）を促進しない物 質を除外することができ、損傷治癒に有効な物質のスクリーニングをより効率化できる 実施例 1
[0055] ファレロールの真皮コラーゲン線維束再構築作用につレ、て、 in vitroの実験で確か めた。即ち、へパリン添加培地中で線維芽細胞をコラーゲンゲル内培養すると、細胞 が産生するコラーゲン線維がダメージを受け、強固なコラーゲン線維束が形成されな レ、ことを利用し、このへパリン添カ卩系にファレロールを共存させ、コラーゲン線維のダ メージの軽減の程度を調べた。手技は以下に示す。
[0056] <使用細胞および試薬類 >
•正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
• 10%FBS添加 DMEM (GIBCO) •WST- 8/1 -Methyl PMS (Cell Counting Kit— 8：同仁化学研究所） 尚、ファレロールはジメチルスルホキシド（DMSO)に溶解して用いた。
[0057] MTTアツセ一にてファレロールの毒性を試験し、へパリン添加系へのファレロール の添加ドーズを求めた。
<プロトコ一ノレ >
1. 80%confluentに増殖した線維芽細胞を 0. 05%Trypsin'EDTAで分散した。 これを 96well/plateに 3 X 103cellsZwellの濃度で播種した。
2. 24時間後、濃度調製したファレロールを lOml/wellずつ添カ卩した (n = 8)。
3.ファレロール添加 24時間後、 48時間後、 72時間後に WST_ 8/l _Methyl P MSを lOmlZwellで添カロ、 37°Cで 4時間インキュベートした。
4.測定波長 450nm、参考波長 650nmで吸光度を測定した。
ぐ結果 >
検討したいずれの濃度においても顕著な細胞毒性は確認されなかった。逆に、ファ レロールを添加する事で細胞増殖を促進する効果が確認された。特に、ファレロール の濃度が 10— 6ml/ml— DMEM、 5x10— 7ml/ml—DMEM、 10— 7ml/ml— DME Mにおいて特に増殖促進が見られたことから、以下のコラーゲン産生試験は、この 3 つの濃度で行うこととした。
[0058] 上記の結果を元にへパリン添加系を用いて、ファレロールのコラーゲン産生促進作 用について試験を行った。
<使用細胞および試薬類 >
•正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
• HEPARIN (SIGMA： H _ 3149)
•DMEM (GIBCO)
•FBS
<プロトコ一ノレ >
1. 10%FBSを含む培地で confluentに増殖した線維芽細胞をトリプシン処理により 分散させ、遠心分離を行った。
2.上清を除去して 10%FBSを含む DMEMに再懸濁し、線維芽細胞を 12 well pla te (4. 5cmVwell)に 3 X 103cells/cm2で播種した。
3.細胞播種 4時間後に、上清の DMEMを除去し、 0. 4%FBSを含む DMEMに交 換して細胞増殖抑制条件下にて 72時間培養を行った（37°C、 5% CO )。
4. 0. 4%FBSを含む DMEMを除去して 10%FBSを含む DMEMに交換すること で、細胞増殖抑制を解除した。この時の培養条件はへパリンによる影響を見るため、 100/oFBS _DMEM、 0. 1%へパリン ZlO%FBS_DMEM、 1. 0%へパリン Zl 0%FBS— DMEM (各 n= 3)とした。さらに、ここにファレロールを 10— 6ml/ml— D MEM、 5x10— 7mlZml_ DMEM、 10— 7ml/ml_DMEM濃度で添加したものを作 製した。
ぐ結果 >
結果を図 1のグラフに示した。グラフ 1はへパリン未処理条件、グラフ 2は 0. 1%へ パリン処理条件で、各濃度のファレロール溶液を培地に加えた場合の細胞増殖効果 を示している。何れの条件においても、ファレロールを添加した群の方力 コントロー ルである DMSO添加群よりも細胞増殖が促進される傾向が示された。これより、ファ レロールに線維芽細胞増殖促進作用が存することがわかる。
実施例 2
ファレロールが細胞増殖促進作用を持つことが上記の実験によって確認された。さ らに、ファレロールの線維芽細胞の移動能への影響を確認するため、三次元コラー ゲンゲルを生検トレパンで打ち抜レ、て作製した「創傷治癒モデル」を用レ、て、創傷部 位から派生する線維芽細胞の挙動をファレロール添加群と未添加群で比較した。 <使用細胞および試薬類 >
•正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
• 10%FBS添加 DMEM (GIBCO)
•コラーゲン培地溶液 (05% typel collagen： 5 X DMEM： 200mM HEPES： 2.2%NaHCO
： 0. IN NaOH： FBS：水を 4 : 4 : 2 : 2 : 1 : 2 : 3の割合で混合)
'生検トレパン (先端径 Φ 3· 0mm)
<プロトコール >
1)実施例 1のプロトコールの 4で得た線維芽細胞の培養物とコラーゲン培地溶液を 1 ： 9 (体積）の割合で混合してコラーゲンゲルを作製し、 10%FBS培地で 1週間浮遊 培養した。
2)ゲルの大きさがコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した時点から 1 / 5〜： 1 / 10程度のサイズまで収縮したら、直径 3mmの生検トレパンでゲルの中央 部分を打ち抜いた。
3) 6well plateを準備し、ゥヱルの中央にコラーゲン溶液を 15 μ 1滴下し、そこに打ち 抜いた三次元コラーゲンゲルを乗せて 10分間インキュベートした（37°C、 5% CO )
2
4)滴下したコラーゲンが固まり、三次元コラーゲンゲルがゥエルの底面に接着したら 、 10%FBS _DMEM、 0. 1%へパリン/ 10%FBS _DMEM、 1. 0%へパリン/ 10 %FBS _ DMEMを 3ml/wellで添加した。
5)さらに、 4)の各培養条件にファレロールを 10— 6mlZml_DMEMで添加した群を 作製した。
<結果 >
「創傷治癒モデル」を作製してから 24時間後の線維芽細胞の挙動を観察した。生検 トレパンで打ち抜いた創傷部位から派生した線維芽細胞の写真を図 2に示した。へ パリンを添加していない 10%FBS— DMEMにおいては、ファレロールを添加した群 の方が添加してレ、なレ、群よりも線維芽細胞の移動距離が長ぐ細胞が活発に動レ、て いる傾向があった。一方、 0. 1%へパリン/ 10%FBS— DMEM、 1. 0%へパリン/ 10%FBS— DMEMにおいては、ファレロールを添加した群と添加していない群の 間に、細胞移動の差は見られず、両方ともへパリンの作用によって移動が抑制されて いた。
これより、ファレロールは、へパリンの線維芽細胞の移動能への影響を抑制するの ではなぐ線維芽細胞に直接作用し、細胞の移動能を高めることが推察できる。 実施例 3
下記に示す手順に従って、へパリンの添加によるコラーゲン線維束の構築阻害を 抑制する作用の有無をファレロールについて調べた。結果を図 3に示す。ファレロー ルはへノ^ンのコラーゲン線維束構築阻害を抑制し、以て、真皮コラーゲン線維束再 構築作用を発揮することがわかる。 <プロトコール >
05% typel collagen： 5 X DMEM： 200mM HEPES： 2.2%NaHCO： 0. IN NaOH： FBS：水 を 4:4:2:2: 1:2: 3の割合で混合し、コラーゲン溶液を作製する。 （冷やしながら行う）
I
コラーゲン溶液:水 =9: 1の割合で混合し、下層コラーゲン溶液を作製する。
I
48穴プレートに下層コラーゲン溶液を 100 μ 1/wellづっ分注する。
I
CO インキュベーター内で固める。 （15min位）
I
NHDFを定法に従い回収する。
I
(細胞をセルストレイナーにてバラバラにする。 )
I
細胞をカウントし（トリパンブルー）、 1 X 105cells/mlに調整する。
I
コラーゲン溶液：細胞浮遊液 = 9： 1 (体積）の割合で混合し、 300 μ 1/wellずつ分注す る。
(細胞が不均一にならないよう、時々混ぜながら作業する。 (final IX 104cells/ml))
I
CO インキュベーター内で 4時間静置。
I
注射針の針でゲルを wellの内壁から離し、ゲルの収縮を妨げないようにする。
I
1.8% Heparin/ 10% FBS— DMEMを 500 μ 1/well添カロ。 (final 1% H印 arin/well)
I
ファレロール (DMSOに溶解)を 0.9 μ 1/well添カロ。（1000倍希釈）
I COインキュベーター内にて培養。 （5日間）
I
SEM観察の試料とする。
実施例 4
[0062] 下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料 (エッセンス）を作製 した。即ち、ィ、口、ハを 80°Cに加熱し、ィに攪拌下徐々に口を加え乳化し、更にハを 加え中和し、攪拌冷却してエッセンス 1を得た。同様に操作して、エッセンス 1のファレ ロールをエタノールに置換した比較例 1も作製した。
[0063] [表 1] 表 1
成^ 質量％
：
スクヮラン 5
P O E ( 2 0〉 ベへ二ルェ一テル 1
ベへニルアルコール 2
ソルビタンセスキステアレ一ト 1 . 5 ベヘン酸 0. 5 □
1， 3—ブタンジオール 8
1 , 2—へキサンジオール 4
フエノキシエタノール 0. 5
「カーボポール 1 3 8 2」 0. 1 (アルキル変性力ルポキシビ二ルポりマ一：グッドリツチ社製〉
Γぺムレン T R— 1」 0. 1 (アルキル変性力ルポキシビ二ルポリマー；グッドリツチ社製） 水 5 7. 1
0. 1 %ファレロールエタノール溶液 0. 1 水酸化カリウム 0. 1 水 — ― 2 0
Ιί Γ0 0
<試験例 1 >
1群 5名、 2群計 10名の 40〜50歳のパネラーを用いて、上記で作製したエッセンス 1及び比較例 1の化粧料について 8週間の使用テストを行った。これらの化粧料を朝 晚 2回連日使用してもらい、使用テストの前後で目尻のレプリカを採取した。斜め 45 度からの光の照射下、シヮによってできる陰影を顕微鏡から画像に取り込み、二値化 を行い、視野における陰影の面積比を求め、この値の群の平均値を求めた。結果を 表 2に示す。これより、本発明の皮膚外用剤である化粧料 (エッセンス）は優れたシヮ 改善効果を有することがわかる。
[0065] [表 2] 表 2
サンプル 平均陰影面積比率 (%)―
gま U i sil後
エッセンス 1 6. 8±2. 3 3. 3±0. 9 比較例 1 7. 1土2. 8 5. 7± 1. 6 実施例 5
[0066] <試験例 2>
エッセンス 1と同様に下記処方に従って本発明の皮膚外用剤であるエッセンス 2を 作製した。このものを試験例 1の方法で評価したところ、試験前のシヮ面積比が 8.2 ±3.2%であったもの力 S、試験後 3.9±1.1%となっており、効果が確認された。
[0067] [表 3] 表 3
成分 質量％ スクヮラン 5
POE (20) ベへニルエーテル 1
ベへニルアルコール 2
ソルビタンセスキステアレート 1. 5
ベヘン酸 0. 5
□
1 , 3—ブタンジオール 8
1 , 2—へキサンジオール 4
フエノキシエタノール 0. 5
Γ力一ポポール 1382」 0. 1
(アルキル変性力ルポキシビ二ルポリマー；グッドリツチ社製）
Γぺムレン TR— 1」 0. 1
(アルキル変性カルボキシビ二ルポリマー：グッドリツチ社製）
水 57. 1
0. 00196ファレロールエタノール溶液 0. 1
水酸化カリウム 0. 1
水 20
計 ΓΟΟ 実施例 6
コラーゲンゲルをパンチして欠損部を設けた「創傷による皮膚組織欠損モデル」を 用いて、ファレロールの欠損部位の組織再生促進作用を調べた。手順を以下に示す 。この結果は図 4に示す。この図より、ファレロールの終濃度が 10— 5M、 10— 6Mであれ ば、パンチ穴の収縮は明瞭に促進されている力 10— 7Mでは収縮の促進が不明瞭で あることがわかる。これより、本発明の皮膚外用剤に於いて、ファレロールの下限値は 10— 6Mが好ましレ、ことがわかる。
1) 80%コンフルェントに増殖した正常ヒト線維芽細胞を 0. 05%Trypsin'EDTAで 分散した。これを 3 X 105cells/25cm2で播種した。
2) 24時間後に、ファレロール（Farrerol ;終濃度 10— 5M、 10— 6M、 10— 7M)および DM S〇を添加した培地に交換し、 4日間培養した。
3)それぞれの条件での培養により得た培養物に、実施例 2と同様にコラーゲン培地 溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製した。作製したコラーゲンゲルを、 2)の培養条件 と同様の培地で 1週間浮遊培養した。すなわち 2)で、 10— 5M、 10— 6M、 10— 7Mのファ レロールを含む培地で培養した線維芽細胞は、コラーゲンゲル作製後も、それぞれ ファレロール終濃度が 10— 5M、 10— 6M、 10— 7Mの培地を用いて培養した。
4)ゲルの大きさがコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した時点より 1 / 5〜： 1 / 10程度のサイズまで収縮したら、直径 3mmの生検トレパンでゲルの中央 部分をドーナツ状に打ち抜き、「創傷モデル」を作製した。
5) 6ゥエルプレートを準備してゥエルの中央部分に 5 μ ΐのコラーゲンを滴下し、そこに 創傷モデルのコラーゲンゲルを乗せて 37°Cで 15分間インキュベートした。
6)適下したコラーゲンが固まりゲルがゥエルの底面に接着したら、 3)と同条件の培地 を 3ml加えて、「創傷による皮膚組織欠損モデル」として培養を行った。その後、コラ 一ゲンゲルの創傷部位がふさがってレ、く過程を目視観察した。
実施例 7
[0069] 下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料 (エッセンス）を作製 した。即ち、ィ、口、ハを 80°Cに加熱し、ィに攪拌下徐々に口を加え乳化し、更にハを 加え中和し、攪拌冷却してエッセンス 3を得た。同様に操作して、エッセンス 3のファレ ロールをエタノールに置換した比較例 2も作成した。
[0070] [表 4] 表 4
成分 質量％ スクヮラン 5
Ρ Ο Ε ( 2 0 ) ベへ二ルェ一テル 1
ベへニルアルコール 2
ソルビタンセスキステアレート 1 - ベヘン酸 0.
Π
1， 3—ブタンジォ一ル 8
1， 2—へキサンジオール 4
フエノキシエタノール 0. 5
「カーボポール 1 3 8 2」 0. 1 (アルキル変性力ルポキシビ二ルポリマー；グッドリツチ社製）
Γぺ厶レン T R—1 J 0. 1 (アルキル変性力ルポキシビ二ルポリマー；グッドリツチ社製〉
水 5 7 . 1 製造例 1の 8 0 %エタノール水溶液抽出物 0 - 1 酸化カリウム 0. 1 水 2 0
ft 1 0 0
[0071] <試験例 3 >
エッセンス 3と比較例 2とを用いて、パネラーを用いて創傷による欠損部位の組織再 生促進作用を検討した。即ち、パネラーの上腕内側部に、抜き型を当て、メスで表皮 をはぎ取り、 1mm X lmmの部位を 3つ作製した。 1部位はエッセンス 553を表皮を除去 した日より 5日間、 1日 1回塗布し、 1部位は比較例 2を表皮を除去した日より 5日間、 1日 1回塗布し、残る 1部位は何の処置もしなかった。塗布後 1週間及び 2週間に観 察を行い、欠損部位の組織再生の度合いを観察した。結果を表 5に示す。これより、 本発明の皮膚外用剤であるエッセンス 3は欠損部位の組織再生促進作用に優れるこ とがわかる。又、瘢痕の生成も全く観察されなかった。
[0072] [表 5]
表 5
検体 1週間後の;観察結畢 2週 後の観察結墨 エッセンス 1 殆ど欠損部'位が馳 正常 ϋ位とかわらず 比較例 1 瘡蓋が存し、 一部欠損が残る 殆ど欠損部位が修復 無処置 瘡蓋が存じ、 一部欠損が残る 殆ど欠損部位が修復 実施例 8
<試験例 4> 下記に示す処方に従って、実施例 7と同様の方法により、本発明の皮膚外用剤で ある皮膚外用医薬 1を作製した。試験例 3と同様の評価を行ったところ、皮膚外用医 薬 1は、抗生物質が共存するにもかかわらず、優れた欠損皮膚組織の再生促進作用 を示していた。
[0074] [表 6]
表 6
成分 質量％ スクヮラン 5
P O E ( 2 0 ) ベへ二ルェ一テル 1
ベへニルアルコール 2
ソルビタンセスキステアレート 1 . 5 ベヘン酸 0 - 5 Q
1， 3—ブタンジオール 8
1， 2—へキサンジォ一ル 4
フエノキシエタノール 0. 5
Γ力一ポポール 1 3 8 2」 0 - 1 (アルキル変性カルボキシビ二ルポリマー；グッドリツチ社製）
Γぺムレン T R— 1」 0. 1 (アルキル変性カルボキシビ二ルポリマ一；グッドリツチ社製） 水 5 6. 1 硫酸フラジオマイシン 1
製造例 1の 8 096エタノール水溶液抽出物 0 - 1 水酸化カリウム 0. 1 水 2 0
If Γ0 0 実施例 9
[0075] 以下に示す手順に従って、ファレロールのケラチノサイトに対する作用を検討した。
[0076] <実験 1：ファレロールのケラチノサイトに対する細胞毒性評価 >
〔使用細胞および試薬類〕
•正常ヒト表皮角化細胞 （クラボウ株式会社製）
•Humedia KG2 (GIBCO社製）
•WST-8/l-Methyl PMS (Cell Counting Kit_8:同仁化学研究所株式会社製） 〔サンプノレ調製〕
DMSOに溶解された 10— 2 Mファレロールを DMSOで希釈して、濃度調整したファレ口 ールのサンプルを作製した。 〔プロトコール〕
1) 80%confluentに増殖した正常ヒト表皮角化細胞を 0.05%Trypsin' EDTAで分散した。 これを 96 well/plateに 3 X 103 cells/ well, 6 X 103cells/wellの 2条件の細胞濃度で播 種した。
2) 24時間後、濃度調製したファレロールのサンプノレを 100 μ 1 /wellずつ添カ卩した (η= 8)。
3)サンプル添加 24時間後、 48時間後に WST_8/l_Methyl PMSを 10 μ 1/wellで添加 し、 37°Cで 4時間インキュベートした。
4)測定波長 450 nm、参考波長 650 nmで吸光度（〇D値）を測定した。
ぐ結果 >
MTTによる評価結果を以下の図 5のグラフに示す。 OD値はファレロールの濃度依 存的に増加することが示された。 3 X 103 cells/ wellの 24時間においては、コントロー ルである DMSOに比較して 10— 5Mファレロールは 2倍以上の OD値を示した。 48時間に おいても DMSOに比べて 1.7倍程度の値を示した。し力し、細胞数が少なく元々の OD 値が低かったため、播種細胞数を倍にした 6 X 103cells/wellにおいて再現性を確認 した。その結果、ほぼ同様の結果を得ることができた。
一方、 目視評価においては、 DMSOに比較してファレロール添加群における細胞 増殖が促進されている印象を受けなかった。
<実験 2 :ファレロールのケラチノサイトに対する細胞増殖効果（直接評価） > 〔使用細胞および試薬類〕
•正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ株式会社製）
•Humedia KG2 (GIBCO社製）
〔プロトコール〕
1)正常ヒト表皮角化細胞を 6 X 103 cells/mlに調製し、これを 96 well/plateに lmlずつ 播種した。
2) 24時間後に上清を除去して、 DMSOで濃度調製したファレロールのサンプルをカロ えた培地を lmlずつ添加した。
3)サンプル添加 24時間後、 48時間後、 72時間後に細胞を 0.05%Trypsin' EDTAで分 散し、これを血球計算盤を用いてセルカウントした。なお、実験 1では WST-8での評 価を細胞数の指標としたが、この方法はミトコンドリア内の脱水素酵素に作用して間 接的に細胞数を評価する方法であることから、本検討では直接的に細胞数を測定し た。
〔結果〕
セルカウントの結果を図 6に示す。グラフは、コントロール（DMSO添加群）の細胞数 を 100%とした場合の細胞増殖率で示している。コントロールと比較して、濃度依存的 に細胞増殖率は抑制される傾向が示された。 10— 5Mファレロールを添加した群の細 胞増殖率は 24時間後で 75.1 ± 5.2%に抑制され、その他の濃度においても 10— 6 Mで は 75.5 ± 5.8%、 10— 7Mでは 77.1 ± 8.6%の細胞増殖率に留まっていた。 48時間後では、 10— 5 Mファレロールを添加した群では約 71.9 ± 16.6%の増殖率であった力 それ以 下の濃度においてはコントロール群と同等程度の細胞増殖率を示した。また、細胞 形態においては変化は認められなかった（図 7)。すなわち直接評価による結果は、 WST-8による間接的な細胞数の評価とは一致しな力つた。この結果より、ファレロー ルはケラチノサイト 1細胞当りのミトコンドリア内のクェン酸回路の反応を促進している こと力 S推測される。従って、クェン酸回路の反応時に生じる NADHの作用により、次の 反応段階である酸化的リン酸化反応も促進されることが予想され、その結果細胞内 のエネルギー源となる ATPの生成、すなわちエネルギー代謝能が亢進してレ、る可能 性が示唆される。
<実験 3：表皮角化細胞を介した線維芽細胞への影響の検討 >
〔概要〕
表皮角化細胞と線維芽細胞との間に何らかの相互作用がある力 \また共培養にお いてファレロールが線維芽細胞に対して作用するかを見出すためにプロコラーゲン 産生量を指標とした評価を実施した。方法は Eming SA et al.， Hum. Gene. Ther., 9 ( 4)， 529-39 (1998)に記載の方法に準じた。
〔使用細胞および試薬類〕
•正常ヒト表皮角化細胞 （クラボウ株式会社製）
•Humedia KG2 (クラボウ株式会社製） •正常ヒト線維芽細胞 （クラボウ株式会社製）
•DMEM (GIBCO社製）
•PIP EIA Kit (タカラバイオ株式会社製）
〔プロトコール〕
1)表皮角化細胞
Dayl ： 24ゥエルプレートに 3 X 104cells/ well播種する。
Day6 ： PBSで洗浄後、 DMEM + 2%FBSに培地交換し、ファレロール（10— 6 M、 10— 7M 、 10— 8 M、 DMSO)を添カロする。
Day7 ：培養上清を採取
2)線維芽細胞
Day3 ： 24ゥエルプレートに 2. 5 X 10* cells/ well播種する。
Day7 ： PBSで洗浄後、表皮角化細胞の培養上清 (900 μ 1)を添加して 48時間培養 する。
Day9 ： PBS及び無血清 DMEMで洗浄後、無血清 DMEM500 μ 1に培地交換し、 2時 間培養し、培養上清を回収し、遠心上清（15000卬 m、 5sec)のプロコラーゲン量を下 記の方法に従って、測定した。
〔プロコラーゲン産生量の定量〕
1)標準抗体液を 100 μ 1ずつプレートの各ゥエルに加えた後、あらかじめ調製した各 濃度の PIP標準液（320、 160、 80、 40、 20、 10 /i 1/ml :検体の希釈は DMEMで実施した )および検体を 20 / lずつマイクロピペットで 2連ずつ加え、 37°Cで 3時間反応する。 （ 第一次反応）
2)反応液を捨て、 PBSで 4回洗浄後、 Substrate Solution(TMBZ)を 100 μ 1ずつ 8連ピ ペットで各ゥエルにカ卩え、室温 (20°C〜30°C)で 15分反応させる。 （第二次反応）
3) Stop solutionを 100 ずつ、 Substrate Solutionを入れた順番に各ゥヱルに加え反 応を停止させた後よく混和する。
4)培地を対照としてゼロ調節し、波長 450nmで吸光度をプロットして標準曲線を作成 し、検体の吸光度から対応する PIP濃度を読み取る。
〔結果〕 結果を図 8に示す。ファレロールの濃度依存的にプロコラーゲン産生量が有意に増 カロした。一方、線維芽細胞培養時にファレロールを添加して、その後表皮角化細胞 の培養上清を添加した方法で評価した別の系では、プロコラーゲンの産生量に大き な変化が見られなかった。このことから、ファレロールが線維芽細胞に対して直接的 にプロコラーゲン産生増加を促す作用は小さいと考えられる。従って、ファレローノレは 表皮角化細胞に作用して、表皮角化細胞が線維芽細胞のコラーゲン類の産生を高 める作用を増大させていると判断できる。この様に、共培養系で角化細胞を介して線 維芽細胞のコラーゲン産生能を変化させることができるので、例えば、三次元培養皮 膚などに於いて、三次元皮膚の性状を、望む形に変化させることにも応用できる。 実施例 10
[0079] 下記に示す処方に従って、ファレロールを含有する皮膚外用剤（ィ匕粧料：ローショ ン)を作製した。即ち、処方成分を室温で攪拌可溶化しローションを得た。このローン ヨンをネズミやヒトの皮膚に経皮投与することにより、皮膚真皮におけるプロコラーゲン の産生量を増やすことができ、以て、真皮内のコラーゲン量を増大させることができる 。これは、皮膚には角化細胞（ケラチノサイト）と線維芽細胞が共存するためである。
[0080] [表 7]
表 7
Figure imgf000032_0001
実施例 11
<被験物質の作製 >
スクリニーングの被験物質として、オトギリソゥの抽出物を作製した。即ち、オトギリソ ゥ科オトギリソゥ（Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae))の地上部の乾燥物 lkg に 80%エタノール水溶液 101をカ卩え、攪拌下 4時間還流を行った。冷却後不溶物を 濾過で除去し、減圧濃縮した後、凍結乾燥し、アモルファスを 51g得た。このものを水 に分散させ、ダイアイオン HP20にチャージし、 51の水、次いで 51の 50%エタノール 水溶液を流して洗浄し、 99%のエタノールで溶出させ、溶出分をフラクシヨネーシヨン し、フラクションを薄層クロマトグラフィーと HPLCでチェックしながら、同一の単一物 質を含むフラクションは合一させ、複数の成分を含むフラクションは再度クロマトダラ フィ一で精製し、単一成分を含むフラクションを 7本得た。
[0082] くスクリーニング例 >
上記で得られた単一成分を含むフラクションを被験物質として、以下の方法を用い て、各被験物質のコラーゲン構築作用を評価することにより、創傷治癒効果を有する 物質をスクリーニングした。具体的な手順は後述する。
動物の線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをパンチして欠損部を設けた「創傷モデ ノレ」を用いて、被験物質存在下での欠損部の補填、収縮の程度を観察した。手順を 以下に示す。試験物質のうち、最も欠損部の補填、収縮の程度が最も大き力、つたも のについて、単一成分の構造をプロトン NMR、質量分析、 13C— NMRより同定した ところ、ファレロールであった。なお、上記抽出物からのファレロールの収量は 3. 2m gであった。ファレロールは 80%エタノール水溶液抽出物の溶媒除去物中に約 0. 0 06質量％含有されていた。
更に、ファレロールの終濃度を、 10— 5M、 10— 6M、 10— 7Mに調節して、それぞれの濃 度における欠損部の収縮の程度を観察した。この結果を図 9に示す。この図より、ファ レロールの終濃度が 10— 5M、 10— 6Mであれば、パンチ穴（欠損部）の収縮は明瞭に促 進されている力 10— 7Mでは収縮の促進が不明瞭であることがわかる。これより、ファ レロールのコラーゲン構築促進効果は、ファレロールを少なくとも 10— 6M用いることで 、創傷治癒促進効果を発揮しうることがわかる。この様に本発明のスクリーニング方法 によれば、創傷治癒促進作用を有する被験物質の有効濃度を求めることもできる。
[0083] <手順 >
1)前培養により、 80。/oコンフルェントに増殖した正常ヒト線維芽細胞を 0. 05%Tryp sin'EDTAで分散した。これを 3 X 105cells/25cm2 (1 X 104cells/cm2)でプレー トに播種した。
2) 24時間培養した後、ファレロール（Farrerol ;終濃度 10— 5M、 10— 6M、 10— 7M)およ び DMSOを添加した培地に交換し、 4日間培養した。
3)得られた培養物に、実施例 3と同様にコラーゲン培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲル を作製した後、 2)で使用した培地を用いてコラーゲンゲル内の線維芽細胞を培養し た。培地における被験物質の濃度は、 2)の培地における濃度に対応させた。すなわ ち 2)で、 10— 5M、 10— 6M、 10— 7Mの Farrerolを含む培地で培養した線維芽細胞は、 コラーゲンゲル作製後も、それぞれファレロールの終濃度が 10— 5M、 10— 6M、 10— 7M の培地で培養した。
4) 1週間の培養後、コラーゲンゲルの大きさがコラーゲン溶液をカ卩えた時点より 1/5 〜1/10程度のサイズまで収縮した。続いて、直径 3mmの生検トレパンでコラーゲン ゲルの中央部分をドーナツ状に打ち抜き、「創傷モデル」を作製した。
5) 6ゥヱルプレートを準備してゥヱルの中央部分に 5 μ 1のコラーゲン溶液を滴下し、 創傷モデルのコラーゲンゲルを乗せて 37°Cで 15分間インキュベートし、コラーゲンゲ ルをゥエルの底面に接着させた。
6)続いて、各ゥエルに、 2)の培地と同じ培地を 3mlずつ加えて、前記コラーゲンゲル に含まれる線維芽細胞の培養を 7日行った。この培養の期間中、コラーゲンゲルの創 傷部位がふさがつていく過程を目視観察した。
産業上の利用の可能性
本発明の皮膚外用剤は、化粧料や皮膚外用医薬などに応用できる。また、本発明 の皮膚外用剤を用いて、創傷治癒を促進することができる。
また、本発明の線維芽細胞コラーゲン産生能の増強方法を用いて、例えば、三次 元培養皮膚などに於いて、三次元皮膚の性状を望む形に変化させ、人工皮膚を作 ることにち応用でさる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いて、皮膚外用医薬に好適な創傷治癒促 進作用を有する物質をスクリーニングすることができる。

Claims

請求の範囲 下記一般式（1)に表されるフラバノン誘導体及びノ又はその塩を含有する、皮膚 外用剤。
[化 1]
Figure imgf000035_0001
一般式 （ 1 )
(但し、式中 Rl、 R2、 R3、 R4、 R5はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数 1〜4の アルキル基を表す。 )
前記フラバノン誘導体が、ファレロールであることを特徴とする、請求項 1に記載の 皮膚外用剤。
[化 2]
Figure imgf000035_0002
ファ レロ一ノレ
[3] 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を 10— 6〜0· 1質量％含むオトギリソゥ科ォ トギリソゥの抽出物を含有することを特徴とする、請求項 1又は 2に記載の皮膚外用剤
[4] 皮膚構造を正常化するためのものであることを特徴とする、請求項:!〜 3の何れか 一項に記載の皮膚外用剤。
[5] 前記皮膚構造の正常化が、乱れた真皮コラーゲン線維束構造の再構築であること を特徴とする請求項 4に記載の皮膚外用剤。
[6] 前記皮膚構造の正常化が、皮膚の欠損部位の再生であることを特徴とする、請求 項 4に記載の皮膚外用剤。
[7] 前記皮膚構造の正常化が、皮膚の欠損部位の再生及び再生組織による該欠損部 位の閉塞の促進であることを特徴とする、請求項 4に記載の皮膚外用剤。
[8] 皮膚の欠損が創傷によるものである、請求項 6又は 7に記載の皮膚外用剤。
[9] 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩の含有量が、 1 X 10— 6〜1質量％であるこ とを特徴とする、請求項 1〜8の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
[10] 前記皮膚構造の正常化が、ケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増 大する作用の増強であることを特徴とする、請求項 4に記載の皮膚外用剤。
[11] ケラチノサイトの繊維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強する方法で あって、ケラチノサイトと繊維芽細胞の共存下に、一般式（1)に表されるフラバノン誘 導体及び/又はその塩を投与することを特徴とする方法。
[化 3]
Figure imgf000037_0001
(但し、式中 Rl、 R2、 R3、 R4、 R5はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数 1〜4の アルキル基を表す。 )
一般式 (1)
[12] 前記フラバノン誘導体は、ファレロールであることを特徴とする、請求項 11に記載の 方法。
[13] 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩の投与量は、 10— 8M以上w;ra - であることを特 徴とする、請求項 11又は 12に記載の方法。
[14] 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を含むオトギリソゥ抽出物を投与す 1ること を特徴とする、請求項 11〜： 13の何れか一項に記載の方法。
[15] 前記投与は、経皮的投与であることを特徴とする、請求項 11〜： 14の何れか一項に 記載の方法。
[16] 前記フラバノン誘導体及び/又はその塩を含む皮膚外用剤を皮膚に塗布すること を特徴とする、請求項 15に記載の方法。
[17] 前記コラーゲン類は、プロコラーゲンであることを特徴とする請求項 11〜： 16の何れ か一項に記載の方法。
[18] 動物の正常線維芽細胞を被験物質の存在下培養し、得られた培養物にコラーゲン 培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製し、前記コラーゲンゲル内の前記線維芽細 胞を前記被験物質の存在下培養した後、該コラーゲンゲルに欠損部を設け、該欠損 部を設けたコラーゲンゲル及び前記被験物質を共存させて前記線維芽細胞を培養 し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度を観察することを特徴とする創傷 治癒効果を有する物質のスクリーニング方法。
[19] 更に、動物の正常線維芽細胞を被験物質の非存在下培養し、得られた培養物にコ ラーゲン培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製し、前記コラーゲンゲル内の前記 線維芽細胞を被験物質の非存在下培養した後、該コラーゲンゲルに欠損部を設け、 該欠損部を設けたコラーゲンゲルを被験物質の非存在下に置いて前記線維芽細胞 を培養し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度を観察することを含むスクリ 一ユング方法であって、
被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度が、被験物質の非存在下 での前記欠損部の補填、収縮の程度に比して大きい場合に、前記被験物質は創傷 治癒促進効果を有すると判別することを特徴とする、請求項 18に記載のスクリーニン グ方法。
[20] 被験物質の存在下での前記欠損部の体積が、被験物質の非存在下での前記欠損 部の体積の 85%以下である場合に、前記被験物質は創傷治癒促進効果を有すると 判別することを特徴とする、請求項 19に記載のスクリーニング方法。
[21] 前記正常線維芽細胞はヒト由来のものであることを特徴とする、請求項 18〜20の 何れか一項に記載のスクリーニング方法。
[22] 前記欠損部が、パンチによる打ち抜きによって生じたものであることを特徴とする、 請求項 18〜21の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
[23] 次の工程を有することを特徴とする、請求項 19〜22の何れか一項に記載のスクリ 一ユング方法。
(1)個々にほぐした動物の正常線維芽細胞を被験物質を含有する培地及び被験物 質を含有しなレ、培地で培養する。
(2) (1)で得た培養物にコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製する。
(3) (1)と同じ培地を用いて、（2)のコラーゲンゲル内に含まれる正常線維芽細胞の 浮遊培養を行う。
(4)コラーゲンゲルの大きさがコラーゲン培地溶液をカ卩えてコラーゲンゲルを作製し た時点の 1Z5〜1/10前後のサイズまで収縮したら、パンチによりコラーゲンゲルの 中央部分を打ち抜レ、て欠損部を作製する。
(5)プレートのゥエルにコラーゲン溶液を滴下し、そこに（4)で作製したコラーゲンゲ ルを乗せて培養し、コラーゲンゲルをゥエルの底面に接着させる。
(6) (1)と同じ培地を用いて、前記コラーゲンゲルを培養し、該培養の間、前記欠損 部の補填、収縮の程度を観察する。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010215532A (ja) * 2009-03-13 2010-09-30 Ands Corporation コラーゲンゲル収縮促進剤
JP2014507132A (ja) * 2010-12-30 2014-03-27 エイボン プロダクツ インコーポレーテッド 皮膚におけるダイニンの調節

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8298584B2 (en) * 2008-12-30 2012-10-30 Collagen Matrix, Inc. Biopolymeric membrane for wound protection and repair
EA201171219A1 (ru) * 2009-04-07 2012-05-30 Холланд Калорз Н.В. Концентрат добавки для полимеров
CN103012348B (zh) * 2012-12-19 2015-04-08 苏薇薇 一种6,8位取代柚皮素衍生物及其应用
CN104758190B (zh) * 2014-01-03 2018-04-20 伽蓝（集团）股份有限公司 一种含有二氢黄酮类衍生物的皮肤外用剂组合物
CN112089638B (zh) * 2014-01-07 2023-05-12 香港大学 抑制黑色素合成的组合物
KR101965032B1 (ko) * 2016-05-25 2019-04-02 경북대학교 산학협력단 물레나물 추출물을 포함하는 화장료 조성물
CN115364039B (zh) * 2022-09-28 2023-07-25 佛山天韵化妆品科技有限公司 一种痤疮皮肤修复组合物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11315008A (ja) * 1998-03-03 1999-11-16 Shiseido Co Ltd 抗老化剤
JP2002029986A (ja) * 2000-07-19 2002-01-29 Pola Chem Ind Inc 真皮コラーゲン線維束再構築剤及びそれを含有する組成物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7000180A (ja) * 1969-01-10 1970-07-14
US5288485A (en) * 1989-08-31 1994-02-22 Kao Corporation Vasodilating agent
NZ299379A (en) * 1995-10-27 1997-04-24 Unilever Plc Topical flavanone-containing composition
US5665367A (en) * 1996-09-27 1997-09-09 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Skin care compositions containing naringenin and/or quercetin and a retinoid
EP1104672A1 (de) * 1999-12-02 2001-06-06 Laboratoires Serobiologiques(Societe Anonyme) Kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen
US20030125264A1 (en) * 2001-12-29 2003-07-03 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Methods For Treating Wounds
JP4801563B2 (ja) * 2006-11-06 2011-10-26 ポーラ化成工業株式会社 乳化剤形の化粧料

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11315008A (ja) * 1998-03-03 1999-11-16 Shiseido Co Ltd 抗老化剤
JP2002029986A (ja) * 2000-07-19 2002-01-29 Pola Chem Ind Inc 真皮コラーゲン線維束再構築剤及びそれを含有する組成物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUOKA E. ET AL.: "Otogiriso-zoku Shokubutsu no Seibun Kenkyu (1st report), Otogiriso no Kagaku Seibun ni Tsuite", JOURNAL OF TOHOKU PHARMACEUTICAL UNIVERSITY, vol. 51, 2004, pages 41 - 48, XP003017132 *
O'LEARY R. ET AL.: "Fucoidan Modulates the Effect of Transforming Growth Factor (TGF)-beta1 on Fibroblast Proliferation and Wound Repopulation in in Vitro Models of Dermal Wound Repair", BIOL. PHARM. BULL., vol. 27, no. 2, 2004, pages 266 - 270, XP003017133 *
See also references of EP1987810A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010215532A (ja) * 2009-03-13 2010-09-30 Ands Corporation コラーゲンゲル収縮促進剤
JP2014507132A (ja) * 2010-12-30 2014-03-27 エイボン プロダクツ インコーポレーテッド 皮膚におけるダイニンの調節

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