WO2007093639A1 - Vorrichtung, verfahren und kit zum nachweis von analyten in einer probe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (100) zum Nachweis von Analyten (26) in einer Probe mit - einem Basisträger (10); - einer Mehrzahl von auf dem Basisträger (10) angeordneten Sensorträgern (18), die zumindest zwei unterschiedlichen Sensorträgerpopulationen (181, 182, 183) zuordenbar sind; - wobei die Sensorträgerpopulationen (181, 182, 183) zumindest durch unterschiedliche, dem Sensorträger (18) zugeordnete Sensormoleküle (24) definiert sind, die jeweils zumindest eine messbare Spezifität für einen Analyten (26) oder eine Analytgruppe aufweisen, sodass die Population (181, 182, 183) der Sensorträger (18) eine Kodierung darstellt, die Zuordnung von Sensormolekülen (24) und/oder Analyt (26) ermöglicht. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorträger (18) untereinander kontaktlos mit einem vorbestimmten mittleren Abstand zueinander und mit einer hinsichtlich der Population (181, 182, 183) zufälligen statistischen Verteilung auf dem Basisträger (10) vorliegen, wodurch die Erfassung jeweils nur eines einzigen Individuums eines Sensorträgers (18) während der Analytik der Sensormoleküle und/oder der bindenden Analyten gewährleistet wird.

Description

Vorrichtung, Verfahren und Kit zum Nachweis von Analyten in einer Probe

Die vorliegende Erfindung betrifft eine effiziente Vorrich^¬ tung, ein preiswertes Verfahren einen Testkit und zur Detek- tion von Analyten in einer Probe sowie ein Verfahren zur Her- Stellung der Vorrichtung.

Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zum Nachweis oder zur Detektion von Analyten bekannt. Im Bereich der biologischen oder klinischen Forschung und Diagnostik können die zu untersuchenden Analyten beispielsweise Proteine, Peptide, Nu^¬ kleinsäuren, Sequenzabschnitte, Kohlenhydrate, Lipide und/oder antigene Strukturen sein.

Die Aussagekraft einer Parameteruntersuchung kann durch eine parallele Erfassung einer größeren Datenmenge aus einer einzelnen Probe - der so genannten Multiparameteranalyse oder Multiligandenanalyse - erweitert und verbessert werden. Die parallele Erfassung erfordert beispielsweise auch eine Minia^¬ turisierung, durch die die Zahl der erfassbaren Parameter und Liganden beträchtlich erhöht werden kann. Die miniaturisierte DNS-Technologie ermöglicht es, mehr als 10⁶ Parameter pro cm² zu analysieren, damit wird ein Miniaturisierungsgrad von weni^¬ ger als 10 μm²/Parameter auf einem Chip erreicht. Die zweidi^¬ mensionale Positionierung von mit den Liganden wechselwirken- den Sensormolekülen auf einem Chip, beispielsweise durch Elek- trolithographie oder andere Verfahren, wie piezoelektrische Drucktechnik, erfordern, dass für jedes Testbesteck das Positionierungsverfahren auf dem Trägermaterial für alle Sensormoleküle in gleicher Weise wiederholt werden muss, um deren regelmäßige Anordnung - den so genannten Array - auf dem Trä- ger zu gewährleisten. Die für die Mikrolithographie notwendi^¬ gen aufwändigen Verfahren eignen sich aber nur für spezielle Anwendungsbereiche, die sehr hohe Parameterzahlen bzw. -dichten erfordern, wie pharmakogenetische Untersuchungen.

Alternativ werden daher zu den genannten Verfahren im Stand der Technik auch Mikropartikel als DNS-Array beschrieben. Ein solcher Mikropartikel-Array beruht darauf, dass mehrere Sus^¬ pensionen verschiedener Mikropartikelpopulationen, die unter- schiedliche diskrete Fluoreszenzmarkierungen aufweisen, mit jeweils spezifischen Akzeptormolekülen (Sensormolekülen) konjugiert werden (Lackner et al . , 1999, Medgen 11, 16-17) . Nach der Konjugation mit den Sensormolekülen werden die einzelnen Suspensionen der verschiedenen Mikropartikelpopulationen ge- mischt und von der Mischung ein Aliquot zur Probenlösung gegeben, sodass sich Partikel von jeder Suspension im Reaktionsansatz gemischt befinden. Die nachzuweisenden Liganden aus der Probenlösung binden dann ligandenspezifisch an die entsprechenden Sensormoleküle und somit immer nur an diskrete Mikro- partikel einer bestimmten Population.

Simultan oder anschließend wird ein Rezeptorfluoreszenzfarb^¬ stoff an die Liganden gebunden, dessen Emissionswellenlänge sich ausreichend von der Emissionswellenlänge des Fluoreszenz- farbstoffes zur Markierung der Mikropartikel unterscheidet.

Die Fluoreszenz zur Identifizierung der Partikel, wie auch die Reporterfluoreszenz der an die Partikel gebundenen Liganden, wird anschließend im Durchflusscytometer analysiert.

Aus den Patentschriften US 5,326,692 und US 5,073,498 sind

Mikropartikel bekannt, die Kombinationen von Fluoreszenzfarb^¬ stoffen enthalten und die für unterschiedliche Detektionsver- fahren eingesetzt werden können. Die Kombination der Fluoreszenzfarbstoffe gestattet die gezielte Beeinflussung der Anre- gungs- und Emissionswellenlänge über den Energietransfer zwi- sehen verschiedenen, einpolymerisierten Farbstoffen. Weiterhin ist durch die Kombination verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe möglich, Mikropartikelpopulationen gezielter im Durchfluss- cytometer zu definieren.

Für das durchflusscytometrische Messverfahren werden jedoch relativ viele Mikropartikel pro Probe, ca. 5.000 - 10.000 pro Akzeptor (Smith et al . , 1998, Clin Chem 44, 2054-2056), benö^¬ tigt, um in dem Messvolumen genügend Mikropartikel einer Popu- lation erfassen zu können. Dadurch erhöhen sich die Materialkosten, was vor allem bei teuren und biochemisch schwer zu synthetisierenden Sensormolekülsubstanzen nachteilig ist.

Des Weiteren ist die relativ geringe Auflösung von Partikel- populationen mit Hilfe des Durchflusscytometers nachteilig. Nach Carson et al . (1999, J. Immunol Methods 227, 41-52) ist lediglich eine Individualisierung von 64 Partikelpopulationen mittels zweier Fluoreszenzfarbstoffe möglich. Oliver et al . (1998, Clin Chem 44, 2057-2060) beschreiben weiterhin, dass relativ lange Messzeiten von ca. 30 min bis zu 1 Stunde pro

Probe notwendig sind, um effektiv mehrere Parameter spezifisch parallel zu detektieren. Die langen Messzeiten führen zum Teil zu einer nachteiligen Modifikation der Liganden und der Fluoreszenzfarbstoffe .

In der Druckschrift WO 02/35228 werden fluoreszenzkodierte, sensormolekülbeladene Mikropartikel als Sensorträger beschrie^¬ ben, die zu einer Materialeinsparung und zur Möglichkeit des mehrmaligen Messens ein und desselben Mikropartikels führen. Durch Verwendung von Referenz- und Kodierungsfluoreszenz seitens der Mikropartikel wird eine für den Routinebetrieb erfor^¬ derliche Genauigkeit erreicht.

Die zufällige Verteilung der fluoreszenzkodierten Mikroparti- kel im Reaktionsgefäß macht jedoch ein aufwändiges Mikroskop- auswerteverfahren erforderlich, da die Mikropartikel im Pro- zess der Immobilisierung am Gefäßboden Cluster bilden oder zufällig in engem räumlichen Abstand zueinander immobilisiert werden. Dieser Nachteil macht sich besonders dann bemerkbar, wenn möglichst viele Partikel während der Kombination vieler Parameter eingesetzt werden, wobei sich zwangsläufig die Par^¬ tikeldichte erhöht.

Partikelarrays werden durch Mischen verschiedener Partikel- Stammlösungen mit definierter Spezifität hergestellt. Von die^¬ ser Mischung werden Aliquots zur Probe gegeben, was zur Folge hat, dass nur eine zufällige Anzahl von Mikropartikeln jeder Suspension zur Probe gegeben wird. Um sicher zu stellen, dass von jeder Mikropartikelsuspension tatsächlich auch ausreichend Mikropartikel in die Probe gelangt sind, müssen Aliquots der

Mischung entnommen werden, die ca. 50 Mikropartikel jeder Suspension mit entsprechender Spezifität enthält. Einer weiteren Materialeinsparung sind somit Grenzen gesetzt.

Die zufällige Verteilung der Mikropartikel im Array führt zu eng benachbarten Mikropartikeln im Array, die mit mikroskopischen Methoden, wie oben beschrieben, detektiert werden können. Andere Verfahren, die eine geringere Auflösung der Ansteuerung von Bereichen der Proben haben, können nicht einge- setzt werden. Dies trifft z.B. auf die Analyse der Mikroparti- kelarrays durch Massenspektrometrie mittels MALDI zu.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrich^¬ tung, ein effizientes Verfahren und einen Testkit bereit- zustellen, die bei kurzer Messzeit eine höhere Sensitivität erlauben, preiswert sind und im Routinebetrieb eingesetzt wer^¬ den können. Es sollen insbesondere mehrere Messverfahren zur Bestimmung einer Vielzahl von Eigenschaften des Analyten und/oder des Sensormoleküls einzeln und in Kombination einge- setzt werden können. Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zum Nachweis von Analyten in einer Probe mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst zunächst - einen Basisträger, eine Mehrzahl von auf dem Basisträger angeordneten Sensorträgern, die zumindest zwei unterschiedlichen Sensorträgerpopulationen zuordenbar sind, wobei die Sensorträgerpopulationen zumindest durch unter- schiedliche, dem Sensorträger zugeordnete Sensormoleküle definiert sind, die jeweils zumindest eine messbare Spezi^¬ fität für einen Analyten oder eine Analytgruppe aufweisen, sodass die Population der Sensorträger eine Kodierung darstellt, die eine Zuordnung von Sensormolekülen und/oder Analyt ermöglicht.

- Erfindungsgemäß liegen die Sensorträger untereinander kontaktlos mit einem vorbestimmten mittleren Abstand zueinander und mit einer hinsichtlich der Population zufälligen statistischen Verteilung auf dem Basisträger vor.

Dabei wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter "kontaktlos" eine Anordnung verstanden, bei der im Wesentlichen sämtliche Sensorträgerindividuen separiert angeordnet sind, wobei diese einen mittleren Abstand zu den jeweiligen benach- barten Sensorträgern einhalten. Da die Anordnung eines Sensorträgers auf einer bestimmten Position auf dem Basisträger einer gewissen herstellungsbedingten Ungenauigkeit unterliegt, weisen die Abstände der Sensorträger untereinander eine gewisse Streuung auf, sodass hier der geforderte Abstand als mittlerer Abstand bezeichnet wird. Ferner wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einer "zufälligen statistischen Verteilung" eine Zuordnung der einzelnen Individuen einer Sensorträgerpopulation zu einer bestimmten Basisträgerposition verstanden, die nicht exakt vorhersehbar ist, sondern den Gesetzen der Statistik unterliegt. Es kann somit nicht voraus- gesagt werden, ob auf einer bestimmten Basisträgerposition sich ein Individuum der einen oder der anderen Sensorträgerpopulation befindet.

Im Sinne der Erfindung werden ferner unter einem Analyt chemische und/oder biologische Strukturen verstanden, wobei biologische Strukturen alle Moleküle sind, die von Organismen ge^¬ bildet, aufgenommen oder abgegeben werden; unter chemischen Strukturen werden alle Verbindungen verstanden, die in der Lage sind, mit anderen Molekülen so zu wechselwirken, dass ihr Nachweis möglich ist. Eine Probe ist im Sinne der Erfindung ein durch Probenentnahme entnommenes Gut oder ein Teil bzw. eine kleine Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit physi^¬ kalisch, chemisch und/oder biologisch geprüft werden soll. Biologische Proben sind beispielsweise ein Teil oder eine kleine Menge von Serum, Blut, Urin, Atemluft, Tränenflüssig^¬ keit oder ähnlichem. Proben gemäß der Erfindung sind aber auch entnommene Teilmengen aus Abwässern, Industrieprozessrückständen, Mooren oder anderen Umweltflüssigkeiten.

Durch die kontaktlose Anordnung der Sensorträger unter Einhaltung eines Mindestabstandes zwischen den Sensorträgern wird erfindungsgemäß erreicht, dass in jedem Messpunkt einer orts^¬ aufgelösten Messung jeweils nur ein einziger Sensorträger erfasst und charakterisiert wird. Demgegenüber besteht bei der im Stand der Technik stattfindenden Clusterbildung der Sensorträger das Problem, dass häufig mehrere Individuen von Sensorträgern und deren Sensormolekülen und den mit diesen inter- agierenden Analyten erfasst werden, was zu unbrauchbaren Mischergebnissen führen kann. Dementsprechend ist besonders bevorzugt vorgesehen, den vorbestimmten Abstand zwischen zwei benachbarten Sensorträgern in Abhängigkeit von einer Ortsauflösung eines während des Analytnachweises eingesetzten Mess^¬ gerätes vorzubestimmen, insbesondere in Abhängigkeit der schwächsten Ortsauflösung bzw. Ortsgenauigkeit der vorgesehen- en Messgeräte. Gehört beispielsweise zu den vorgesehenen Ver^¬ fahren eine MALDI-Massenspektroskopie und ist die dort statt^¬ findende Laserionisation mit einer Ortsgenauigkeit von 500 μm auf dem Basisträger möglich und weist gleichzeitig die gering- ste Ortsauflösung aller angewandten Messmethoden auf, so bestimmt diese den vorbestimmten Abstand der Sensorträger. Dabei wird der Abstand so bestimmt, dass bei der MALDI-Laseranregung immer nur ein Individuum erfasst wird. Typischerweise beträgt der vorbestimmte mittlere Abstand der Sensorträger 1 bis 1000 μm, insbesondere 10 bis 500 μm, vorzugsweise 20 bis 100 μm.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung liegt der Sensorträger in einem zweidimensionalen Raster auf dem Basis- träger vor. Eine solche Anordnung ist in der Herstellung relativ einfach zu realisieren. Eine einschichtige Anordnung hat zudem den Vorteil, dass sich jede Position auf dem Basisträger durch XY-Koordinaten exakt zuordnen lässt und somit beispiel^¬ sweise mit entsprechenden computergesteuerten XY-Tischen vie- ler Analytikgeräte, die etwa bei Mikroskopen üblich sind, ge^¬ zielt ansteuern lässt. Typische zweidimensionale rasterartige Anordnungen sind etwa tetragonale oder trigonale Strukturen.

Die erfindungsgemäße kontaktlose Anordnung der Sensorträger auf dem Basisträger kann mit Vorteil auf zwei alternativen Wegen realisiert werden. Erstens kann ein Basisträger mit einer geeigneten Oberflächenstruktur verwendet werden (bzw. ein ebener Basisträger durch ein geeignetes Verfahren strukturiert werden) , wobei die Sensorträger in Kavitäten der Struk- tur angeordnet sind. Alternativ kann ein Basisträger mit ebener Oberfläche verwendet werden, wobei die erfindungsgemäße Anordnung der Sensorträger durch Verwendung einer geeigneten Lochmaske erzielt wird. Beide Varianten werden in den Ausführungsbeispielen näher erläutert. Der Basisträger kann auch derart strukturiert sein, dass er gleichzeitig als Lochmaske fungiert .

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass - neben dem spezifischen Sensormolekül - die Popula^¬ tionen der Sensorträger ferner durch mindestens eine weitere chemische und/oder physikalische Eigenschaft des Sensorträger definiert ist, die durch zumindest eine anschließende Analyse^¬ methode unterscheidbar ist. Beispielsweise handelt es sich hierbei um unterscheidbare optische Eigenschaften, insbesonde^¬ re Fluoreszenz-, Infrarot- und/oder UV-vis-Spektraleigenschaf- ten, die mit entsprechenden Spektrometern detektierbar sind; unterschiedliche, mit massenspektrometrischen Verfahren detek- tierbare Molekularmassen entweder des Sensorträgers selbst oder einem diesem zugeordneten Marker; elektrische Eigenschaften, insbesondere Leitfähigkeit und/oder Widerstand; chemische Reaktivität; Hydrophobizität ; Polarität; magnetische Eigen^¬ schaften; NMR-Spektraleigenschaften; Größe; Form und/oder stoffliche Zusammensetzung, wobei einige dieser Eigenschaften miteinander gekoppelt sein können. So kann die stoffliche Zu^¬ sammensetzung, insbesondere durch Anteile unterschiedlicher Farbstoffe (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe), Ionen, stoffliche Do^¬ tierungen mit unterschiedlichen Molekularmassen (z.B. unterschiedlichen Peptiden oder Peptidlängen) , definiert sein, wo- durch die optischen Eigenschaften, die Polaritäten bzw. die

Molekularmassen beeinflusst werden. Die Dotierungen können im Sensorträger oder an dessen Oberfläche gebunden sein und, wie z.B. im Falle von Peptiden, ebenfalls zur Bindung der Analyten aus der Probe genutzt werden. Besonders vorteilhaft werden mehrere unterscheidbare Eigenschaften in Kombination zur

Kodierung einer Sensorträgerpopulation realisiert, um somit eine Dekodierung mit unterschiedlichen Analyseverfahren zu ermöglichen. Bevorzugt ist insbesondere eine Kodierungskombi^¬ nation der Sensorträgerpopulationen aus unterschiedlichen FIu- oreszenzmarkierungen sowie unterschiedlichen Molekularmassen. Als Basisträger kommen praktisch beliebige Materialien, Gegenstände und strukturelle Ausgestaltungen in Frage, wobei die Wahl des Basisträgers maßgeblich von den eingesetzten Analyse- verfahren und den zu immobilisierenden Sensorträgern abhängt. Beispielsweise kann in struktureller Hinsicht der Basisträger planar, makro-, mikro- oder nanostrukturiert ; porös oder nicht porös; optisch transparent oder nicht transparent; leitend, halbleitend oder nicht-leitend; funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein oder mehrere dieser Eigenschaften kombi^¬ niert aufweisen. In stofflicher Hinsicht kann der Basisträger aus einem Material oder einer Kombination von Materialien bestehen, das etwa Glas, Glimmer, Metalle, Halbleitermetalle (insbesondere Silizium oder Germanium) , anorganische oder organische Polymere (insbesondere Polypropylen, Nitrozellulose oder Polyvinylidenfluorid) umfasst. Geeignete Objekte für Ba^¬ sisträger sind etwa Mikrotestplatten (insbesondere Mikrotiter- platten) , Glas- oder Glimmerplättchen, Halbleiterwafer, flexiblen Membrane, Geflechte oder Fibrillen.

Desgleichen sind für die stoffliche und strukturelle Ausge^¬ staltung der Sensorträger im Rahmen der Erfindung kaum Grenzen gesetzt, solange die kontaktlose Anordnung auf dem Basisträger gewährleistet ist. So können die Sensorträger in Form von fes- ten Partikeln, insbesondere Makro-, Mikro- und/oder Nanoparti- keln, vorliegen, wobei sich von diesen Mikropartikel für die typischen Analyseverfahren Mikropartikel am besten eigen. Es sind jedoch auch andere Konsistenzen und/oder Gestalten einsetzbar, wie z.B. hochviskose oder harte, nicht-sphärische Massen, insbesondere von Hydrogelen, welche die entsprechenden Sensormoleküle tragen und gegebenenfalls die oben genannten Kodierungsdotierungen aufweisen, beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen. Aus materieller Sicht können die Sensorträger ein polymeres, ein- oder mehrschichtiges Material aufweisen, insbesondere umfassend Polystyren, Polymethacrylate, Polyprop- ylen, Polyethylen, Copolymere, Silica, oder Mischungen oder Komposite von solchen. Dabei kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das polymere Material zumindest ein weiteres, der Kodie^¬ rung dienendes Material, beispielweise Magnetpartikel und/oder Fluoreszenzfarbstoffe, um- oder einschließt. Zudem kann das polymere Material der Sensorträger eine Oberflächenfunktiona- lisierung aufweisen, die insbesondere zur kovalenten oder nicht-kovalenten Ankopplung der Sensormoleküle dient. Eine typische Oberflächenfunktionalisierung umfasst etwa chemisch funktionelle Gruppen, insbesondere Carboxyl-, Amino-, Aldehyd- und/oder Epoxidgruppen, oder/und Oligonukleotide, Aptamere, Peptide, Lektine, Antikörper, Antigene, Kohlenhydrate oder kleine organische Verbindungen, wie Biotin oder Avidin.

Die Sensormoleküle müssen nicht zwangläufig an der äußeren

Oberfläche der Sensorträger kovalent oder nicht-kovalent ge^¬ bunden vorliegen; vielmehr können sie auch an der inneren Oberfläche, beispielsweise von Poren fixiert sein. Die Sensor^¬ moleküle sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Haptene, Antigene, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Antikörper, kleine organische Moleküle, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Li- pide und/oder Teile oder Mischungen dieser Moleküle. Entscheidend ist, dass sie geeignet sind, spezifisch mit dem Analyt zu interagieren, beispielsweise in Form eine Antigen-Antikörper- Wechselwirkung oder dergleichen. Dementsprechend kann das komplementäre Analyt aus der gleichen Gruppe stammen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere die erfindungs^¬ gemäße Anordnung der Sensorträger auf dem Basisträger kann mit zwei grundsätzlichen Herstellungsansätzen realisiert werden - einem physikalischen und einem chemischen - wobei das physikalische zumindest folgende Schritte umfasst:

Aufbringen zumindest einer Lochmaske mit einem definierten Lochraster auf einen Basisträger oder räumliche Strukturie- rung des Basisträgers, sodass jeweils Kavitäten mit einem vorbestimmten Abstand auf dem Basisträger entstehen, und

- Aufbringen einer Mischung aus einer Mehrzahl von Sensorträgern, die zumindest zwei unterschiedlichen Populationen zuordenbar sind, auf den Basisträger, sodass die Sensorträ^¬ ger sich in den Kavitäten anordnen, wobei eine Abmessung der Kavitäten und der Sensorträger relativ zueinander so bemessen sind, dass in jeder Kavität höchstens ein Sensor^¬ träger Platz findet.

Demgegenüber umfasst das chemische Herstellungsprinzip zumindest die folgenden Schritte: chemische Modifizierung des Basisträgers, sodass jeweils chemische Bindungsareale mit einem vorbestimmten Abstand auf dem Basisträger entstehen, und

- Aufbringen einer Mischung aus einer Mehrzahl von Sensorträgern, die zumindest zwei unterschiedlichen Populationen zuordenbar sind, auf den Basisträger, sodass die Sensorträ^¬ ger sich auf den Bindungsarealen anordnen, wobei eine Abmessung der Bindungsareale und der Sensorträger relativ zueinander so bemessen sind, dass auf jedem Bindungsareal höchstens ein Sensorträger Platz findet.

Demnach erfolgt gemäß dem physikalischen Ansatz eine drei- dimensional-räumliche Strukturierung in Form von Kavitäten und gemäß dem chemischen Ansatz eine chemische Strukturierung in Form von Bindungsarealen, wobei beide Ansätze das Prinzip vereint, dass die Abmessung der Kavitäten beziehungsweise der Bindungsareale nur jeweils die Anordnung eines einzigen Sen- sorträgers gestattet, wodurch die beabstandete Anordnung der Sensorträger gewährleistet wird.

Der physikalische Ansatz ist nach zwei Varianten ausführbar. Nach der ersten Variante wird eine Lochmaske verwendet, die entweder dauerhaft auf dem Basisträger verbleibt oder nach der Aufbringung der Sensorträger und - falls vorgesehen - nach ihrer Immobilisierung auf dem Basisträger entfernt werden kann. Gemäß der zweiten Variante wird eine Strukturierung einer Oberfläche des Basisträgers durchgeführt bzw. ein be- reits strukturierter Basisträger verwendet. Bei beiden physikalischen Varianten werden Kavitäten auf dem Basisträger erzeugt, die der Aufnahme der Sensorträger dienen. Gemäß dem chemischen Ansatz kann etwa der gesamte Träger chemisch oberflächenmodifiziert werden, dann eine geeignete (lithographi- sehe) Maske aufgelegt werden und mittels geeigneter Strahlung (z.B. UV) die durch die Maske nicht abgedeckten Bereiche so verändert werden, dass diese ihre Fähigkeit zur Bindung der Sensorträger verlieren. Alternativ kann auch erst die Maske aufgelegt werden, dann die nicht maskierten Bereiche des Basisträgers chemisch so modifiziert werden, dass sie die

Fähigkeit zur Bindung der Sensorträger erhalten, ehe die Maske wieder entfernt wird. Entscheidend bei allen vorstehend ge^¬ nannten Verfahren ist die relative Bemessung der Kavitä- ten/Bindungsareale und der Sensorträger zueinander, die ge- währleistet, dass maximal ein Sensorträger sich pro Kavi- tät/Bindungsareal anordnet. Dies ermöglicht die erfindungs^¬ gemäße kontaktlose Anordnung der Sensorträger auf dem Basisträger. Die Kavitäten/Bindungsareale können in allen Fällen eine beliebige Gestalt aufweisen, insbesondere eine runde oder eckige Kontur.

Ein weiterer Aspekt der Eindung betrifft eine Methode zum Nachweis eines Analyten in einer Probe. Dabei wird die erfin^¬ dungsgemäße Vorrichtung mit der den zumindest einen Analyten (potentiell) enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, wobei der Analyt mit korrespondierenden Sensormolekülen der Sensorträger interagiert und somit kovalent oder nicht-kovalent bindet. An^¬ schließend wird - gegebenenfalls nach einem oder mehreren Waschschritten zur Entfernung nicht gebundener oder überschüs- siger Probenbestandteile - zumindest eine Eigenschaft des Sen- sorträgers und/oder des Analyten gleichzeitig oder nacheinander ortsaufgelöst detektiert. Durch die erfindungsgemäße sepa^¬ rate kontaktlose Anordnung ist hierbei gewährleistet, dass bei der oder den ortsaufgelösten Untersuchung/en in jedem Mess- punkt stets nur ein Individuum der Sensorträger erfasst wird, wodurch die Methode ein hohes Maß an Genauigkeit und Zuverläs^¬ sigkeit erhält.

Es ist vorteilhaft möglich, dass nicht nur eine Identifizie- rung des Analyten erfolgt, sondern vielmehr eine komplexe

Untersuchung durchgeführt wird, die beispielsweise auch eine strukturelle Aufklärung des Analyten und/oder des Sensormole^¬ küls betrifft oder das Bindungsverhalten und andere Eigenschaften analysiert. Dies erfordert die Anwendung mehrerer analytischer Verfahren, beispielsweise Fluoreszenzspektrosko^¬ pie, Infrarotspektroskopie, UV-vis-Absorptionsspektroskopie, Ellipsometrie, Massenspektroskopie, Rasterkraftmikroskopie, Scanning-Nahfeld-Mikroskopie, Transmissions-Elektronenmikros- kopie oder Rasterelektronenmikroskopie oder die simultane oder sequentielle Kombination verschiedener dieser Verfahren. Auch für die Anwendung verschiedener, zumeist zeitlich getrennter Verfahren kommt die erfindungsgemäße Anordnung der Sensorträ^¬ ger auf dem Basisträger zugute. Diese erlaubt nämlich eine eindeutige XY-Positionsbestimmung und damit die gezielte Ansteuerung einer einmal bestimmten und einem Sensormolekül zugeordneten Position für spätere Messungen, auch wenn für ein nachfolgendes Verfahren kein spezifischer Kodierungsmarker am Sensorträger vorgesehen ist. Daneben ist aber selbstverständlich auch im Rahmen der Erfindung möglich, die Sensorträger populationsspezifisch mit einer Mehrzahl von Markern auszustatten, die jeweils für eine oder mehrere der vorgesehenen Mess- oder Analysemethoden spezifisch sind, das heißt mit dieser Methode detektierbar und unterscheidbar sind. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zum Nachweis zumindest eines Analyten in einer Probe, welcher die erfindungsgemäße Vorrichtung oder ihre Einzelkomponenten, sowie weitere Reagenzien umfasst. Dabei enthalten die Einzelkomponenten insbeson- dere den Basisträger, mindestens zwei Populationen von Sensorträgern und Sensormolekülen, letztere in freier Form oder bereits an den Sensorträgern gebundenen. Der Kit gestattet eine besonders einfache, preiswerte und flexible Durchführung des Nachweis von Analyten.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der übri^¬ gen Unteransprüche.

Im Folgenden erfolgt eine detaillierte Beschreibung der im Rahmen der Erfindung einsetzbaren Materialien, der bevorzugten Vorgehensweise zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie zum Nachweis und zur Analyse von Analyten.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Sensorträger stellen Mikropartikel dar. Mikropartikel im Sinne der Erfindung sind heterogene und/oder homogene Fraktionen aus mikroskopischen Teilchen, mit einer Größe von 1 bis 500 μm, insbesondere 1 bis 100 μm, bevorzugt 10 bis 50 μm. Die Mikropartikel können hier^¬ bei organische und/oder anorganische Bestandteile beinhalten. Die Mikropartikel können beispielsweise Polymere sein, die sich nach Emulgierung oder Grenzflächenpolymerisation auf dem einzuschließenden Material, beispielsweise einem Fluoreszenzfarbstoff, niederschlagen. Die Mikropartikel können aus PoIy- steren bzw. Polyphosphorsäure, Polyvinyl oder Polyacrylsäure- kopolymeren bestehen. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die Mikropartikel aus oxidischen Keramikpartikeln, wie beispielsweise Siliziumdioxid, Titandioxid oder anderen Me^¬ talloxiden bestehen. Die Mikropartikel können auch Nanoparti- kel, Kristalle oder Magnetide enthalten. Im Rahmen der Erfin- düng stellen jedoch auch vernetzte Polypeptide, Proteine, Nukleinsäure, Makromoleküle, Lipide, beispielsweise als Vesi- kel und ähnliches, Mikropartikel dar. Die Herstellung von Mikropartikeln wird beispielsweise in den Schriften US 6,022,564, US 5,840,674, US 5,788,991 und US 5,7543,261 offenbart. Mikropartikel als Sensorträger umfassen ebenfalls Mikropartikel, die mehrere Schichten aufweisen, wie z.B. aus einem stabilen Polymerkern umgeben von einer hydrophilen Matrix aus z.B. Hydrogel oder Polyethylenglykol .

Unter einer Sensorträgerpopulation im Sinne der Erfindung versteht man Sensorträger, die sich zumindest in Bezug auf die Sensormoleküle und damit ihre Analytspezifität nicht unter^¬ scheiden. Anders ausgedrückt, unterscheiden sich Sensorträger zweier Sensorträgerpopulationen zumindest in ihrer Analytspe- zifität. Ein bevorzugtes weiteres Unterscheidungsmerkmal von Sensorträgerpopulationen stellt die Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff oder den Fluoreszenzfarbstoffen und/oder einer weiteren messbaren Eigenschaft dar. Beispielsweise kann eine Sensorträgerpopulation aus Sensorträgern bestehen, die sich in der Fluoreszenzwellenlänge (z.B. durch rot-, gelb-, und/oder blaufluoreszierenden Fluoreszenzfarbstoffe) , der Intensität und/oder in der Fluoreszenzlebensdauer der markierenden Fluoreszenzfarbstoffen von anderen unterscheidet. Mit Vorteil ist im Rahmen der Erfindung auch möglich, die Sensorträ- gerpopulationen mit jeweils zwei oder mehr unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen zu kodieren. Hier dient ein erster Fluoreszenzmarker (Kodierungsfluoreszenz) zur Identifizierung der Population und ein zweiter Marker (Vergleichsfluoreszenz) zur Quantifizierung des Verhältnisses von Sensorträger bzw. Sensormolekül/en zu gebundenen Analytmolekülen . Eine solche

Vorgehensweise ist in WO 02/35228 beschrieben. Eine Sensorträ^¬ gerpopulation kann jedoch auch durch das Verhältnis an verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen definiert sein. Zu einer Sensorträgerpopulation können dann beispielsweise alle Sensor- träger gehören, deren Fluoreszenzmarkierung z.B. aus grünem und rotem Fluoreszenzfarbstoff im Verhältnis 1:1 besteht, wäh^¬ rend eine zweite Population die gleichen Fluoreszenzmarker aber in im Verhältnis 1:0,5 aufweist.

Fluoreszenzfarbstoffe, die der Markierung der Sensorträger dienen, sind alle Substanzen, die detektierbare Lumineszenzsignale (Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz) senden können, das heißt dass sie nach Anregung die absorbierte Energie in Form von Strahlung von gleicher oder längerer Wellenlänge wie- der abgeben. Auch anorganische oder organische lumineszenzfä^¬ hige Pigmente oder so genannte Quantum dots können als Fluo^¬ reszenzfarbstoffe im Sinne der Erfindung verwendet werden. Als Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere auch für die Kodierungs- und/oder Vergleichsfluoreszenz (s.o.), können beispielsweise eingesetzt werden: Dansylchlorid, Fluoresceinisothiocyanat , 7- Chlor-4-nitrobenzoxadiazol, Pyrenbutyrylessigsäure-anhydrid, N-Iodoacetyl-N ^x- (5-sulfonsäure-1-naphthyl) -ethylendiamin, 1- Anilinonaphthalen-8-sulfonat , 2-Toluidinonaphthalen-6-sulfo- nat, 7- (p-Methoxybenzylamino) 4-nitro-benz-2-oxa-l, 3-diazol, Formycin, 2-Aminopurinribo-nukleosid, Ethenoadenosin, Benzo- adenosin, α- und ß-Parinarsäure und/oder Δ⁹'¹¹'¹³'¹⁵Octaecatetra- ensäure, Cadmiumselenit-Kristalle einer oder unterschiedlicher Größen und andere. Als Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere auch für die Vergleichsfluoreszenz, dienen z.B. Übergangs- metallkomplexe, die folgende Substanzen enthalten: Ruthenium (II), Rhenium (I) oder Osmium und Iridium als Zentralatom und Diiminliganden; phosphoreszierende Porphyrine mit Platin, Pal^¬ ladium, Lutetium oder Zinn als Zentralatom; phosphoreszierende Komplexe der Seltenerden wie Europium, Dysprosium oder Terbi- um; phosphoreszierende Kristalle wie Rubin, Cr-YAG, Alexandrit oder phosphoreszierende Mischoxide wie Magnesiumfluorogermanat bzw. Cadmiumselenit-Kristalle, Fluorescein, Aminofluorescein, Aminomethylcoumarin, Rhodamin, Rhodamin 6G, Rhodamin B, Tetra- methylrhodamin, Ethidiumbromid und/oder Acridinorange . Als Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen für Kodierungs- und

Vergleichsfluoreszenz können insbesondere folgende Stoffe eingesetzt werden:

Ruthenium (II) - (tris-4, 7-diphenyl-l, 10-phenanthrolin) /HPTS, Ruthenium (II) - (tris-4, 7-diphenyl-l , 10-phenanthrolin) /Fluo- rescein,

Ruthenium (II) - (tris-4, 7-diphenyl-l , 10-phenanthrolin) /Rhoda- min B,

Ruthenium (II) - (tris-4, 7-diphenyl-l, 10-phenanthrolin) /Rhodamin B-octadecylester,

Ruthenium (II) - (tris-4, 7-diphenyl-l, 10-phenanthrolin) /Hexadecyl-Acridinoränge,

Europium (III) -tris-theonyl-trifluormethylacetonat/Hydroxy- methylcoumarin, Platin (II) -tetraphenylporphyrin/Rhodamin B-octadecylester,

Platin (II) -tetraphenylporphyrin/Rhodamin B,

Platin (II) -tetraphenylporphyrin/Naphtofluorescein,

Platin (II) -tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101,

Platin (II) -octaethylporphyrin/Eosin, Platin (II) -octaethylporphyrin/Thionin,

Platin (II) -octaethylketoporphyrin/Nilblau,

Cr (III) -YAG/Nilblau,

Cr (III) -YAG/Naphtofluorescein,

Aminocoumarin/Aminofluorescein, Aminocoumarin/Rhodamin 6G,

Aminocoumarin/Tetramethylrhodamin,

Aminocoumarin/Acridinoränge,

Aminofluorescein/Rhodamin 6G,

Aminofluorescein/Tetramethylrhodamin und Aminofluorescein/Ethidiumbromid.

Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise während der Herstellung der Sensorträger (z.B. Mikropartikel) einpolymeri- siert werden oder nachträglich auf die Sensorträger coimmobi- lisiert werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispiels- weise während der Herstellung der Sensorträger direkt in einem Lösungsmittel für die Sensorträger eingebracht werden. Durch die Einpolymerisierung der Fluoreszenzfarbstoffe ist es mög^¬ lich, die Menge der an die Sensorträger gebundenen Fluores- zenzfarbstoffe genau zu bestimmen. Die Fluoreszenzfarbstoffe können entweder so einpolymerisiert vorliegen, dass sie wei- testgehend inert sind oder aber mit den Analyten in Wechsel^¬ wirkung treten. Weiterhin ist der Einbau der Fluoreszenzfarbstoffe in ein Sol-Gel-Glas als Sensorträger (Mikropartikel) mit anschließendem Sieden, Pulverisieren und Dispergieren des Glases möglich. Bei der Verwendung von pulverisierten Fluoreszenzfarbstoffen, kann der Farbstoff als sensitive Schicht, beispielsweise in Form der Beschichtung der Außenseite der Sensorträger, dispergiert werden. Dies kann beispielsweise durch kovalente oder elektrostatische Bindung der Fluoreszenzfarbstoffe an die Oberfläche der Sensorträger erfolgen. Es können beispielsweise Hydroxygruppen, amphiphile Elektrolyte, Phospholipide und ionische Bestandteile genutzt werden, um Fluoreszenzfarbstoffe an die Oberfläche der Sensorträger zu binden.

Neben der Fluoreszenzkodierung der Sensorträger können auch nicht fluoreszierende Stoffe zur Kodierung der Sensorträger genutzt werden. Während die Fluoreszenzkodierung sehr gut mit- tels Fluoreszenzspektroskopie oder Scanning-Nahfeldmikroskopie detektiert werden kann, werden zur Kodierung verwendete Peptide oder kleine organische oder anorganische Moleküle bevorzugt über ihre Masse detektiert wie z.B. durch MALDI-Massenspektro- skopie. Dotierungen durch z.B. Schwermetalle lassen sich eben- falls über die Molekülmasse detektieren aber auch über Atomspektroskopie wie z.B. EDAX bei elektronenmikroskopischer Detektion .

Es ist vorgesehen, dass die Sensorträger mit Sensormolekülen konjugieren oder binden. Dafür werden an jede Population von Sensorträgern spezifische Sensormoleküle gekoppelt. Die Sen^¬ sormoleküle können funktionelle Gruppen, wie Aminogruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen, Hydroxylgruppen oder aber auch Epitope, Paratope, Kohlenhydrate, Lektine oder Oligo- oder Po- lynukleotidsequenzen sein. Epitope können beispielsweise anti- gene Determinanten sein, die mit dem antigenbindenden Teil eines Antikörpers oder mit einem Rezeptor in Wechselwirkung treten. Paratope im Sinne der Erfindung können beispielsweise die Teile eines Antikörpers sein, die spezifisch mit antigenen Strukturen interagieren . Die Sensormoleküle können kovalent, nicht kovalent, durch ionische Bindung oder andere Wechselwir^¬ kungen an die jeweilige Sensorträgerpopulation binden.

Vorzugsweise werden die Sensorträgerpopulationen an den Basis- träger immobilisiert. Durch die Immobilisierung werden die Sensorträger in einen reaktionsraumbegrenzten Zustand versetzt. Unter Immobilisierung werden im Sinne der Erfindung alle Methoden verstanden, die zur Einschränkung der Beweglichkeit der Mikropartikel auf biologischem, chemischem oder phy- sikalischem Wege führen. Dazu werden z.B. die gewünschten Suspensionen der Sensorträgerpopulationen gemischt und kleine Aliquots der Mischung mittels Dispenser auf den Basisträger pipettiert. Die Sensorträger sedimentieren im Tropfen und kontaktieren die Oberfläche des Trägers, wobei 1 bis 1.000.000, insbesondere 1 bis 100.000, bevorzugt 1 bis 10.000 und beson^¬ ders bevorzugt 1 bis 1.000 oder weniger Sensorträger einer Population, insbesondere Mikropartikel, am Basisträger zufäl^¬ lig verteilt gebunden werden können. Das Antrocknen des Tropfens auf dem Träger sollte verhindert werden, wenn sich das Trocknen der Sensormoleküle nachteilig auf die gewünschte Bin^¬ dung der Analyten auswirkt.

Die Immobilisierung der Mikropartikel an ein Träger kann direkt oder über Spacer vorgenommen werden. Spacer im Sinne der Erfindung sind alle Abstandhalter, die beispielsweise eine kurze Kohlenstoffkette zwischen Sensorträger und Basisträger ausbilden können. Es können beispielsweise hydroxilierte Ket^¬ ten eingesetzt werden, um spezifische hydrophobe Wechselwir^¬ kungen zu vermeiden. Es ist jedoch auch möglich, die Sensor- träger über die Sensormoleküle zu immobilisieren. Bei der Bindung der Sensorträger mit Hilfe von eigenen Bindungsstellen ist es möglich, die Sensormoleküle vollkommen frei zu wählen, da diese die Bindung an einen möglichen Basisträger nicht vermitteln müssen. Bei einer Immobilisierung der Sensorträger mit Hilfe der Sensormoleküle ist vorgesehen, dass die Sensormole^¬ küle die hierfür die nötigen Eigenschaften aufweisen, wie beispielsweise Molekülladung, chemisch modifizierbare Gruppen und/oder Immun- bzw. Nukleinsäure-, Hybridisierungsaffinitäten u.a. Durch die Immobilisierung der Sensorträger mit Hilfe der Sensormoleküle muss eine Immobilisierung mit Hilfe der Spacer nicht zwingend vorgenommen werden. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, dass die Sensorträger über Bindungsstellen auf ihrer Oberfläche an den Basisträger immobilisieren. Zur Beschleunigung des Immobilisierungsprozesses oder bei An- wendung von Immobilisierungs- und Mobilisierungszyklen werden bevorzugt magnetische oder paramagnetische Partikel in konti^¬ nuierlichem oder oszillierendem Magnetfeld eingesetzt.

Durch ortsspezifische Aufbringung von Funktionalisierungen zur adressierten Immobilisierung von Sensorträgern ist es möglich, auf dem Basisträger ein 2D-Array in Linien-, Kästchen- oder Punktform aufzubringen. Funktionalisierungen können Fängermoleküle umfassen die Oligonukleotide, Aptamere, Peptide, Lekti^¬ ne, Antikörper, Antigene, Kohlenhydrate bzw. definierte chemi- sehe Gruppen oder kleine organische Verbindungen Biotin oder Avidin umfassen.

Als Basisträger werden bevorzugt insbesondere Mikrotestplat- ten, Glasplättchen, Silizium, Halbleiter, flexiblen Membranen, Geflechten oder Fibrillen, insbesondere aus Polypropylen und/ oder Nitrozellulose, Glas und/oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) eingesetzt. Als Mikrotestplatten können z.B. Mikrotiterplatten eingesetzt werden. Vorteilhafterweise weisen Mikrotestplatten Maße auf, die einen Einsatz in zahlreichen Laborroutinen ge- statten. Beispielsweise sind zahlreiche Fluoreszenzmessgeräte, wie Fluoreszenzmikroskope so ausgebildet, dass Mikrotestplat^¬ ten als Standard verwendet werden können. Die Immobilisierung der Sensorträger auf spezielle Laborgefäße, beispielsweise Mikrotiterplatten, Petrischalen, Vielfachschalen, Multi-scha- len, Wannenschalen und andere Kulturgefäße und Objektträger, ermöglicht daher vorteilhaft auch die Verwendung der vorhande^¬ nen Labormittel und -gerate zum Inkubieren, Einfrieren, Lyo- philisieren und dergleichen in klinischen oder Forschungslaboratorien. Als Mikrotestplatten können beispielsweise bevorzugt Mikrotiterplatten mit transparentem, nicht fluoreszierendem Flachboden verwandt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Masken oder strukturier- te Basisträger eingesetzt, sodass die sedimentierenden Sensor- träger/Mikropartikel sich zufällig oder gezielt möglichst ein^¬ zeln in Mikrokavitäten des Basisträgers ablagern, um somit räumlich getrennt von anderen Sensorträgern gleicher oder anderer Spezifität immobilisiert werden zu können. Zur Herstel^¬ lung der Masken werden bevorzugt Spritzgussverfahren, elektro- lithographische Verfahren, Ätztechniken oder Webtechniken eingesetzt. Vorteilhaft lassen sich Netzblenden aus der Transmis^¬ sionselektronenmikroskopie oder Müllergazen unterschiedlicher Loch- und Gittersteggrößen als Maske einsetzen. Die bevorzugten Gitterstege weisen eine Dicke von 1-200 μm auf und die Lochdiagonalen/Lochdurchmesser betragen zwischen 10 und

500 μm. Haben die Partikel einen Durchmesser von 50 μm beträgt der bevorzugte Lochradius 70 μm und die Stegdicke 50 μm. Haben die Partikel einen Durchmesser von 10-15 μm beträgt der bevorzugte Lochradius 15-25 μm und die Stegdicke 30-50 μm. Netz- blenden können z.B. mit Formvar befilmt werden, wobei der Formvarfilm gleichzeitig als Basisträger in funktionalisierter oder nicht funktionalisierter Form genutzt werden kann. Es können eine oder mehrere Masken auf dem Basisträger zeitweise oder permanent befestigt oder positioniert werden.

Die Zahl der auf dem Träger zu immobilisierenden Sensorträger- populationen wird insbesondere durch die Zahl der Sensormole- külspezifitäten bestimmt, die für die Charakterisierung der Analyten erforderlich sind. Die mögliche Anzahl diskreter Po- pulationen hängt jedoch auch von den verfügbaren Farbstoffen bzw. anderer Moleküle mit diskreten Massen und Techniken zur Markierung der Sensorträger sowie von der Anzahl unterscheidbarer Farben bzw. Massen im Detektionsmessgerät ab. Beispiels^¬ weise ist es mit Vorteil möglich, mit zwei Farben/Massen ca. 60 bis 100 verschiedene diskrete Sensorträgerpopulationen her^¬ zustellen. Die Anzahl der Populationen kann durch ein genaueres Bestimmen der Fluoreszenzintensitäten/Massenverhältnisse bzw. durch eine weitere Farbe auf ca. 500 bis 1000 weitere gut unterscheidbare Sensorträgerpopulationen erhöht werden.

Erfindungsgemäß wird mindestens eine Sensorträgerpopulation mit der zu untersuchenden Probe inkubiert. Durch die Inkuba^¬ tion, der (immobilisierten) Sensorträger und der zu untersuchenden Probe ist es möglich, dass Analyten aus der Probe mit den an den Sensorträgern gebundenen Sensormolekülen interagie- ren. Wenn es sich beispielsweise bei den Sensormolekülen um gebundene Antikörper handelt, können die Analyten in Form von antigenen Strukturen an diese binden. Da die Sensormoleküle an die Sensorträger gebunden sind, wird hierdurch eine Bindung der Analyten an die Sensorträger über die Sensormoleküle ermöglicht. Vorzugsweise werden während der Inkubation der Sensorträger mit der zu untersuchenden Probe Reaktionsbedingungen geschaffen, die ein effizientes Wechselwirken zwischen den Analyten und der Sensorträgerpopulation ermöglichen. Solche Reaktionsbedingungen können z.B. eine erhöhte Temperatur und Konvektion (z.B. Schwenken oder Rühren) sein.

Vorteilhaft kann vorgesehen sein, die Analyten mit mindestens einer Reporterfluoreszenz zu markieren. Selbstverständlich ist es möglich, die Analyten vor bzw. nach der Bindung an die Sensormoleküle zu markieren. Als fluoreszierende Moleküle können beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat , Tetramethylrhodamin- isothiocyanat , Texasrot, 7-Amino-4-Methyl-Cumarin-3-Essigsäu- re, Phycoerythrin und/oder Cyanine und andere eingesetzt wer^¬ den oder antikörperkonjugierten Fluoreszenzpartikeln, die beispielsweise mit Hilfe von Antikörpern an den Analyten binden. Es ist beispielsweise möglich, die Analyten direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Durch das direkte Markieren der Analyten kann auf fluoreszenzmarkierte Antikörper oder andere markertragende Strukturen verzichtet werden. Die direk^¬ te Markierung der Liganden kann insbesondere durch Fluoreszenzfarbstoffe erfolgen, die ein Fluoreszenzsignal emittieren oder die Fluoreszenz anderer Marker gezielt quenchen. Die Ana- lyten können jedoch auch enzymmarkiert werden. Beispiele für enzymmarkierte Moleküle sind die Meerrettichperoxidase, die alkalische Phosphatase und/oder die Glucoseoxidase . Zur Mar^¬ kierung der Analyten können auch Goldpartikel oder Gold-Quan- tum-dots Verwendung finden. Es ist jedoch auch möglich, auf eine Markierung der Analyten gänzlich zu verzichten.

Der Nachweis des/der Analyten erfolgt vorteilhaft durch einen Vergleich der Fluoreszenz (en) der Sensorträgerpopulation mit der Reporterfluoreszenz und/oder den Molekülmassen der Fluo- reszenzfarbstoffe oder anderen Molekülen mit definierter

Masse. Beispielsweise können in einer fluoreszenzspektrometri- schen Bestimmung die Intensitäten der Fluoreszenzen Sensorträgerpopulation und der/des Analyten so verglichen werden, dass insbesondere sowohl die Identität der analyttragenden Sensor- trägerpopulation als auch die Anzahl der gebundenen Analyten analysiert werden kann. Somit sind beispielsweise Aussagen darüber möglich, welche Analyten an bestimmte diskrete Sensorträgerpopulationen gebunden haben und in welcher Anzahl.

Es ist ebenfalls möglich, neben der Molekülmasse die Struktur der Analyten oder von Analytkomplexen durch Rasterkraftmikroskopie, Scanning-Nahfeldmikroskopie sowie Raster- und Elektro^¬ nenmikroskopie zu analysieren. Die verschiedenen Techniken können auch sukzessive zum Einsatz kommen. Es ist ebenfalls möglich, Halbleitereffekte der Sensor- oder Basisträger oder Masken für eine elektrische Detektion heranzuziehen oder veränderte Reflektionen .

Es kann vorgesehen sein, dass die Sensorträgerfluoreszenz in ihren Parametern von den Analyten nicht beeinflusst wird oder dass sich die verschiedenen Fluoreszenzen beeinflussen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig und durch eine Quelle gemeinsam angeregt werden und durch einen Detektor gemeinsam erfasst werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Sensorträgerfluoreszenz zur

Anregung der Reporterfluoreszenz dient. Die unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe können auch separat durch verschiedene Lichtquellen wie z.B. Laser, Farbstofflaser oder LED angeregt werden .

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass mehrere Analyten gleich^¬ zeitig detektiert werden, indem die Analyten über diskrete Sensorträgerpopulationen mit jeweils individuellen Sensormolekülen beladen werden. Das parallele Erfassen von mehreren Parametern durch die gleichzeitige Detektion von verschiedenen Analyten erlaubt die Charakterisierung mehrerer Analyten mit geringem Material und Zeitaufwand.

Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die Analyten über ein Linkermolekül gebunden werden. Das Linkermolekül kann bei- spielsweise kovalent oder nicht-kovalent an den Analyten ge^¬ bunden werden. Das Linkermolekül kann die Beweglichkeit der Analyten so modulieren, dass das von dem Analyten oder von dem an den Analyten gebundenen Fluoreszenzfarbstoff emittierte Signal effizient detektierbar ist.

In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung sind die Analyten mit einem einheitlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Mit der einheitlichen Markierung der Analyten kann vor- teilhafterweise die Gesamtanzahl der an die Sensorträger gebundenen markierten Analyten bestimmt werden. Die Analyse der Analyten kann beispielsweise durch die Zuordnung in diskrete Populationen über die Markierung der Sensorträger erfolgen. Bevorzugt ist, dass die Fluoreszenzfarbstoffe und/oder Enzyme in monomerer und/oder polymerer Form vorliegen. Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise anorganische Verbindun^¬ gen, wie Verbindungen der Seltenerdmetalle oder beispielsweise Uraniumverbindungen oder organische Verbindungen sein. Es ist jedoch auch möglich, statt der Markierung durch Fluoreszenz- Substrate, chromogene Substrate zu verwenden, die insbesondere chemielumeniszieren . Zum sensitiven Nachweis der Analyten können an die Analyten auch fluoreszierende Mikropartikel binden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng ist vorgesehen, unterschiedliche Antikörper in einer serologischen Probe nachzuweisen (siehe Figur 3) . Verschiedenfarbig fluoreszierende Sensorträger werden mit jeweils unter^¬ schiedlichen Antigenen als Sensormoleküle konjugiert und über die Antigene an einen Basisträger immobilisiert. Mit Vorteil binden während der anschließenden Inkubation Antikörper als

Analyten aus einem Patientenserum an die Antigene, für die sie spezifisch sind. Die gebundenen Antikörper werden mit Hilfe eines sekundären Antikörpers nachgewiesen, der eine Reporterfluoreszenz aufweist. Für die Auswertung wird die Fluoreszenz der Sensorträger und die Reporterfluoreszenz, insbesondere für jeden Bildpunkt einer Mikrotiterplatten-Kavität , gemessen.

Die Erfindung umfasst auch einen Testkit, wobei der Testkit vorzugsweise mindestens zwei Sensorträgerpopulationen umfasst, die mit spezifischen Sensormolekülen binden können. Die bevorzugt immobilisierten Sensorträger können mit Vorteil mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffe umfassen, die sich hinsicht^¬ lich ihrer spektralen Eigenschaften und/oder ihrer Fluores- zenzlebensdauer unterscheiden. Mit dem Testkit ist mit Vorteil trotz geringer verwendeter Sensorträgerzahl eine Messgenauigkeit, die beispielsweise den Erfordernissen der klinischen Routine genügt, erreichbar. Weiterhin kann der Testkit so auf^¬ gebaut sein, dass aufgrund der immobilisierten Sensorträger die Fluoreszenzen mit Fluoreszenzscannern und/oder Fluoreszenzmikroskopen, Massenspektrometern, Rasterkraftmikroskopen, Scanning-Nahfeldmikroskopen und Elektronenmikroskopen ausgewertet werden, was beispielsweise eine hohe Messgenauigkeit und über mehrere Detektionsparameter eine hohe Informations- tiefe - beispielsweise gegenüber Durchflusscytometern - gestattet. Der Test im Sinne der Erfindung kann so aufgebaut sein, dass sich Sensorträger und Sensormolekül fest oder gelöst in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen befinden und die Fluoreszenzfarbstoffe und Reagenzien für die Immobilisierung ebenfalls separat aufbewahrt werden. Zum Nachweis eines Analy- ten erfolgt z.B. die Immobilisierung und Fluoreszenzmarkierung der Sensorträgerpopulationen und die Bindung der Sensormoleküle an die Sensorträger so, dass die immobilisierten und fluoreszenzmarkierten Sensorträgerpopulationen mit den gebundenen Sensormolekülen auf dem Basisträger in einem Reaktionsgefäß vorliegen. In dieses Gefäß wird dann die zu untersuchende Probe gegeben. Es ist jedoch auch möglich, den Kit so aufzubauen, dass bereits alle Reagenzien, die zum Nachweis des Ana- lyten erforderlich sind, in einem Reaktionsgefäß vorliegen. Mit dem erfindungsgemäßen Testkit ist es vorteilhafterweise möglich, biologische und/oder chemische Proben zu analysieren. In biologischen Proben, wie beispielsweise Serum, können molekulare Parameter zur Charakterisierung komplexer biomedizinischer Zustände wie dem Immunstatus erfasst werden oder die genetische Prädisposition für bestimmte Krankheiten oder die Erfassung und Beeinflussung der Expression. Durch die Immobilisierung der Sensorträgerpopulationen kann beispielsweise in einem sehr kurzen Zeitraum eine Probe, die nur eine geringe Anzahl von zu untersuchenden Analyten oder kompetitive Analy- ten aufweist, charakterisiert werden. Es können auch unbekannte Analyten und Analytenkomplexe nachgewiesen und strukturell analysiert werden.

Die Erfindung umfasst zur Bestimmung diagnostischer serologi- scher Parameter auch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Sensorträgerpopulationen, die mit spezifischen Sensormolekülen konjugiert sind, wie z.B. humanen oder tierischen Antikörpern gegen Infektionserreger, Antigenen, Autoantigenen und Allergenen, pharmakologisch wichtiger Bindungsstellen in Proteomen, Genomen und anderen Nukleinsäuren, wie z.B. Hormonrezeptoren, Pharmakabindungsstellen, Peptid-, Kohlenhydrat und DNA-Bindungsstellen und/oder zur Durchführung von Expressionsanalysen wichtiger Gene und ihrer Produkte, wie z.B. Tumorproteine, HLA-Antigene sowie zur Analyse von Single Nukleotide Polymor- phismen und Mutationen.

Die Vorteile der Erfindung sind z.B., dass durch die Anordnung der Sensorträgerpopulationen in einem Raster eine Verringerung der Sensorträgerzahlen möglich ist. Das führt vorteilhafter- weise im Vergleich zu durchflusscytometrischen Verfahren zu einem sparsamen Einsatz der Sensormoleküle. Der Nachweis der gebundenen Analyten über z.B. fluoreszierende Mikropartikel, Quantum dots oder lumineszierende Pigmente führt zu einer Sen- sitivität bis in den Einzelmolekülbereich. Durch die 3D-Struk- tur insbesondere poröser Partikel wird eine hohe und konstante Sensormoleküldichte erzielt, was ebenfalls zur Erhöhung der Sensitivität und Reproduzierbarkeit insbesondere im Vergleich zur Verwendung von planaren, ortskodierten 2D-Arrays beiträgt. Erfindungsgemäß kann also die Anzahl der Sensorträger, insbe- sondere Mikropartikel, pro Probe und die Dauer des Messvor^¬ gangs reduziert werden. Durch Zerstörung des Sensorträgers während einer massenspektrometrischen Analyse werden ebenfalls die Analyten, die im Inneren der Porenstruktur der Sensorträger an die Sensormoleküle gebunden haben, freigesetzt, wobei die Sensitivität des Messvorgangs erhöht wird.

Die Verwendung vorgegebener Raster macht die Verwendung einer Vergleichfluoreszenz überflüssig, da die Messfelder besonders einfach zu erkennen sind, in denen nur ein Sensorträger/Mikro- partikel immobilisiert wurde, was besonders wichtig zur Ver^¬ meidung der Überlagerung von Signalen und somit für die automatische Auswertung ist.

Durch die Immobilisierung der Mikropartikel auf standardi- sierte Träger, wie Mikrotiterplatten oder Objektträger, können beispielsweise vorhandene Laborroutinen, wie ELISA-Automaten, genutzt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 Verfahrensschritte zur Herstellung einer Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten nach einer ersten erfindungsgemäßen Ausführung;

Figur 2 Verfahrensschritte zur Herstellung einer Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten nach einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführung und Figur 3 Verfahrensschritte zur Nachweis eines Analyten unter Verwendung einer Vorrichtung nach Figur 1.

Figur 1 stellt schematisch und stark vereinfacht einzelne Schritte einer ersten erfindungsgemäßen Herstellungsvariante für eine erfindungsgemäße Vorrichtung unter Verwendung einer Lochblende dar. Dabei sind jeweils in dem unteren Teil der Teilschritte A bis D Schnittansichten nach der im oberen Teil eingezeichneten Perspektive gezeigt.

Es wird ein Basisträger 10 eingesetzt, der hier eine flächige planare Struktur aufweist und beispielsweise aus einem metal^¬ lischen oder polymeren Material bestehen kann (Figur IA) . Auf den Basisträger 10 wird eine Lochmaske 12 aufgelegt (Figur IB) , die durch ihre Stege 14 begrenzte Löcher definierter

Lochweite (bzw. Durchmesser) und mit einem definierten Mitte- Mitte-Abstand d aufweist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind hier lediglich sechs Löcher dargestellt, obwohl typische Lochmasken, wie sie beispielsweise für die Elektronenmikrosko- pie üblich sind, eine sehr viel höhere Anzahl von Löchern auf^¬ weisen, typischerweise mehrere Hundert oder Tausend Löcher. Die Löcher können neben der dargestellten eckig quadratischen Form auch rund sein oder andere Konturen aufweisen. Durch die Löcher der Lochmaske 12 werden Kavitäten 16 ausgebildet, die seitlich durch die Stege 14 der Lochmaske 12 und von unten durch die Oberfläche des Basisträgers 10 begrenzt werden.

Anschließend wird eine Mischung aus unterschiedlichen Sensorträgern 18 auf das aus Basisträger 10 und Lochmaske 12 gebil- dete Konstrukt aufgebracht und verteilt (Figur IC) . Im darge^¬ stellten Beispiel lassen sich die Individuen der Sensorträger 18 drei unterschiedlichen Sensorträgerpopulationen 18i, I8₂ und 18₃ zuordnen, die zumindest durch unterschiedliche Sensormole^¬ küle (hier nicht dargestellt) und damit Analytspezifitäten voneinander unterscheidbar sind, vorzugsweise durch weitere Eigenschaften, wie unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen, unterschiedliche magnetische Dotierungen, Molekularmassen und/oder anderen. Bei den Sensorträgern 18 handelt es sich beispielsweise um Mikropartikel, wobei auch andere Formen und Konsistenzen im Rahmen der Erfindung mit Vorteil einsetzbar sind, beispielsweise entsprechend dotierte und/oder funktiona- lisierte Hydrogele oder dergleichen. Die aufgetragene Mischung der Sensorträger 18 ist typischerweise eine Suspension.

Die Abmessungen der Kavitäten 16 einerseits, das heißt die

Seitenlängen bzw. Durchmesser der Löcher der Lochmaske 12, und die Größe bzw. Durchmesser der Sensorträger 18 andererseits sind relativ zueinander derart bemessen, dass in jeder Kavität 16 höchstens ein Sensorträger 18 Platz findet (Figur IC) . Selbst wenn über einem in einer Kavität befindlichen Sensorträger 18 sich eine zweite Sensorträgerschicht anordnet, so wird diese in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass die Sensorträger 18 ohne direkten Kontakt miteinander und mit einem Mindestabstand, welcher der Dicke der Stege 14 (Stegweite) entspricht, sowie einem mittleren Mitte-Mitte-Abstand, welcher dem Mitte-Mitte- Abstand d der Kavitäten 16 entspricht, auf dem Basisträger 10 vorliegen. Vorzugsweise ist eine Immobilisierung der Sensorträger 18 auf dem Basisträger 10 vorgesehen, die aber auch spontan erfolgen kann. Die Lochmaske 12 kann auf dem Basisträger 10 verbleiben, vor allem, wenn durch diese nachfolgende Messmethoden nicht nachteilig beeinflusst werden. In diesem Fall stellt das in Figur IC gezeigt Ergebnis die fertige Vor^¬ richtung 100 dar. Alternativ kann die Lochmaske auch entfernt werden, sodass die fertige Vorrichtung 100 durch Figur ID gezeigt wird.

Eine alternative Herstellungsvariante ist in Figur 2 schema^¬ tisch dargestellt, wobei entsprechende Elemente mit gleichen Bezugszeichen wie in Figur 1 bezeichnet sind. Hier ist in Figur 2A ein Basisträger 10 gezeigt, der dem aus Figur 1 entspricht aber eine etwas dickere Stärke aufweist. Im nächsten Schritt wird die Oberfläche des Basisträgers 10 derart struk^¬ turiert, dass Kavitäten 16 in einer zweidimensionalen raster- artigen Anordnung entstehen, die durch stechengebliebene Stege 14 des Basisträgers 10 seitlich begrenzt werden (Figur 2B) . Die Strukturierung kann beispielsweise durch Auflegen einer Maske und Materialabtrag der freiliegenden Bereiche erfolgen. Hierfür kommen mechanische Materialabtragungsverfahren, wie Sandstrahlen oder dergleichen, Teilchen- oder Elektronen- beschuss oder auch lithografische Ätzverfahren oder mechanisches Prägen in Frage. Im Ergebnis ergibt sich ein ober^¬ flächenstrukturierter Basisträger 10, der einstückig die Kavitäten 16 ausbildet.

Die Verteilung, Anordnung und gegebenenfalls Immobilisierung der Sensorträger 18 in den Kavitäten 16 entspricht dem in Figur 1 gezeigten Vorgehen. Das fertige Ergebnis ist in Figur 2C dargestellt.

Verschiedene Stufen bei dem Nachweis von Analyten unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung entsprechend Figur 1 sind in Figur 3 schematisch dargestellt. Hier sind in Figur 3A drei durch die Lochmaske 12 und den Basisträger 10 ausge- bildete Kavitäten 16 in einer Schnittansicht gezeigt. In der linken Kavität ist ein Sensorträger 18i einer ersten Popula^¬ tion, in der mittleren Kavität ein Sensorträger 18₂ einer zweiten Population und in der rechten Kavität ein Sensorträger I8₃ einer dritten Population immobilisiert. Jeder dieser Sensor- träger 18 weist einen Kern 20 auf, der beispielsweise einen oder mehrere Fluoreszenzmarker, Magnetitpartikel und/oder andere der populationsspezifischen Kodierung einer Sensorträgerpopulation I81, 18₂, 18₃ dient. Der Kern 20 jedes Sensorträgers 18 ist von einer Beschichtung 22, insbesondere aus einem poly- meren Material umhüllt. Die polymere Beschichtung 22 ist bei- spielsweise mit einer funktionellen Gruppe astgestattet, an welche jeweils ein Sensormolekül 24 gebunden oder konjugiert ist. Dabei ist für jede Sensorträgerpopulation 18i, 18₂, 18₃ ein unterschiedliches Sensormolekül 24i, 24₂, 24₃ vorgesehen, die spezifisch mit einem Analyt wechselwirken. Im Einzelnen handelt es sich bei dem ersten Sensormolekül 24i um Anti-ILl-Anti^¬ körper, der spezifisch mit humanen ILl Antigen reagiert, bei dem zweiten Sensormolekül 24₂ um Anti-IL2-Antikörper, der spezifisch mit humanen IL2 Antigen reagiert, und bei dem dritten Sensormolekül 24₃ um Anti-IL3-Antikörper, der spezifisch mit humanen IL3 Antigen reagiert. Die Immobilisierung der Sensorträger 18 an dem Basisträger 10 ist hier über die Sensormoleküle 24 realisiert.

Anschließend wird gemäß Figur 3B humanes Patientenserum, das

ILl als erstes Analyt 26i und IL3 als zweites Analyt 26₃ (nicht jedoch IL2) enthält, zugegeben, sodass dieses in Kontakt mit den Sensorträgern 18 kommt. Es kommt zu einer spezifischen Wechselwirkung zwischen den korrespondierenden Sensormolekülen 24i der ersten Sensorträgerpopulation 18i mit dem Analyt 26i und zwischen Sensormolekülen 24₃ der dritten Sensorträgerpopulation 18₃ mit dem Analyt 26₃, und somit zur nicht-kovalenten Bindung.

Im nächsten Schritt gemäß Figur 3C wird (nach entsprechenden

Waschschritten zur Entfernung nicht gebundener Komponenten der Probe) zum Nachweis der gebundenen Analyte ein Nachweisanti^¬ körper 28 zugegeben, der einen Fluoreszenzmarker aufweisen kann. Die Nachweisantikörper 28 reagieren wiederum spezifisch mit den gebundenen Analyten (ILl 26i und IL3 26₃) und binden an diese nicht-kovalent .

Die Detektion der gebundenen Analyten (ILl 26i und IL3 26₃) kann nun beispielsweise mit einem Fluoreszenzspektroskop anhand der Fluoreszenz des Nachweisantikörpers 28 erfolgen, wobei eine Zuordnung mittels der Fluoreszenz des Sensorträgers 18 bzw. dessen Kern 20 stattfindet.

Im Folgenden soll die Beschreibung anhand eines Ausführungs- beispiel veranschaulicht werden, dessen Vorgehensweise in Figur 3 bereits dargestellt wurde.

Beispiel

Nachweis unterschiedlicher humaner Interleukine

Es wurden carboxymodifizierte Polymethacrylatpartikel mit einem Durchmesser von 8 μm und mit folgenden Fluoreszenzeigen^¬ schaften unter Zugabe unterschiedlicher Mengen an Fluoreszenz- farbstoffen zum Reaktionsgemisch hergestellt:

Mikropartikelpopulation A: Fluoreszenz 1: Aminocumarin Fluoreszenz 2: 100% Rhodamin

Mikropartikelpopulation B: Fluoreszenz 1: Aminocumarin Fluoreszenz 2: 50% Rhodamin

Mikropartikelpopulation C: Fluoreszenz 1: Aminocumarin Fluoreszenz 2: 0% Rhodamin

Durch Carbodiimidkopplung wurden Antikörper gegen ILl an die Mikropartikelpopulation A, gegen IL2 an die Mikropartikelpopu^¬ lation B und gegen IL3 an die Mikropartikelpopulation C gekop^¬ pelt. Dazu werden:

1. 10 mg l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 ml Beadsuspen- sion (25 mg Bedas) gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert,

2. die Beads dreimal mit 5 ml MES-Puffer pH 5,0 gewaschen,

3. 500 μg Antikörperprotein in 1 ml 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0) gelöst und mit den aktivierten Beads unter Schütteln bei

Raumtemperatur 4 h inkubiert,

4. die Beads dreimal in MES-Puffer gewaschen und anschließend in MES-Puffer + 0,2 M Glycin 2 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, 5. die Beads dreimal in PBS gewaschen und in 1 ml PBS aufge^¬ nommen und 50 μl aliquotiert und bei -20C° bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

Um die vorbereiteten Mikropartikelpopulationen auf der Ober- fläche der Mikrotiterplatte (96er Format, Polystyrol schwarz, Flachboden transparent) zu immobilisieren, werden:

1. eine Netzblende, Gold, Lochweite 50x50 μm, Stegbreite 50 μm, Durchmesser 3 mm in die Kavität einer Mikrotest- platte gelegt und durch einen Sprengring plan fixiert,

2. je ein Aliquot der Partikelsuspensionen der verschiedenen Mikropartikelpopulationen aufgetaut und durch Pipettieren von je 2 μl jeder Suspension in destilliertes Wasser gemischt und verdünnt, so dass eine Partikeldichte von 100 Mikropartikel jeder Population pro 1 μl Wasser erreicht wird,

3. 1 μl des Gemisches in das Zentrum der Kavitäten der Mikro- testplatte (16-er Modul auf Objektträger) pipettiert und mit 10 μl PBS überschichtet, 4. die Mikropartikel der drei eingesetzten Populationen durch Inkubation bei 4 ⁰C über Nacht unter Schütteln immobilisiert .

Anschließend werden die Kavitäten mit PBS + 0,1 % Tween 20 (PBS-T) dreimal gespült. Humane Seren werden danach in einer Verdünnung von 1:100 in PBS-T in die vorbereiteten Kavitäten der Mikrotestplatte pipettiert und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert .

Anschließend werden die Kavitäten mit PBS-Tween dreimal gespült und mit einer Mischung aus Anti-ILl-, Anti-IL2- und Anti-IL3-Phycoerythrin-Konjugat , welche 1:100 in PBS-Tween verdünnt wurden, für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit PBS-T erfolgt die Fluoreszenzauswertung mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop iX81 (Olympus) . Die immobilisierten Mikropartikel werden mit einer s/w-CCD- Kamera unter Verwendung von optischen Filterpaaren für folgende Emissions- und Absorptionswellenlängen 390nm/441 nm, 480 nm/520 nm und 480 nm/578 nm nacheinander fotografiert.

Die Auswertung erfolgt dadurch, dass die Fluoreszenzintensitä^¬ ten der Partikelfluoreszenzen miteinander ins Verhältnis gesetzt werden, um die Mikropartikel der jeweiligen Population zu identifizieren. Danach werden die Reporterfluoreszenzen er- fasst, wobei sich die Reporterfluoreszenzintensität proportio^¬ nal zur Analytkonzentration verhält.

Nach erfolgter fluoreszenzspektroskopischer Messung wird der Objektträger von den Kavitäten der Mikrotitermodule getrennt der PBS-T durch Kaffee-Säure substituiert und getrocknet. Die Objektträger werden anschließend automatisch mit einem MALDI- Massenspektrometer ausgewertet. Dabei ergeben die Massenpeaks der Fluoreszenzfarbstoffe die Partikelkodierung und die Mas^¬ senpeaks der Interleukine geben Auskunft über Proben von Interleukinisoformen z.B. mit variierender Glykosylierung. Bezugszeichen

100 Vorrichtung zum Nachweis von Analyten

10 Basisträger

12 Lochmaske

14 Steg 16 Kavität/Vertiefung

18 Sensorträger

18₁ erste Sensorträgerpopulation

18₂ zweite Sensorträgerpopulation

18₃ dritte Sensorträgerpopulation 20 Kern / Kodierung

22 Polymerbeschichtung

24 Sensormolekül

24₁ Anti-ILl-Anikörper (Sensormolekül)

24₂ Anti-IL2-Anikörper (Sensormolekül) 24₃ Anti-IL3-Anikörper (Sensormolekül)

26 Analyt

26i ILl (Analyt)

26₃ IL3 (Analyt)

28 Nachweisantikörper mit Fluoreszenzmarker

d Mitte-Mitte-Abstand

Claims

Patentansprüche

1. Vorrichtung (100) zum Nachweis von Analyten (26) in einer Probe mit einem Basisträger (10), einer Mehrzahl von auf dem Basisträger (10) angeordneten Sensorträgern (18), die zumindest zwei unterschiedlichen Sensorträgerpopulationen (18i, 18₂, 18₃) zuordenbar sind, wobei die Sensorträgerpopulationen (18i, 18₂, 18₃) zumin^¬ dest durch unterschiedliche, dem Sensorträger (18) zuge^¬ ordnete Sensormoleküle (24) definiert sind, die jeweils zumindest eine messbare Spezifität für einen Analyten

(26) oder eine Analytgruppe aufweisen, sodass die Popu^¬ lation (18i, 18₂, 18₃) der Sensorträger (18) eine Kodie^¬ rung darstellt, die eine Zuordnung von Sensormolekülen (24) und/oder Analyt (26) ermöglicht, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorträger (18) untereinander kontaktlos mit einem vorbestimmten mittleren Abstand zueinander und mit einer hinsichtlich der Population (18i, 18₂, 18₃) zufälligen statistischen Verteilung auf dem Basisträger (10) vor- liegen.

2. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1, wobei die Sensorträger

(18) in einem zweidimensionalen Raster auf dem Basisträger (10) angeordnet sind.

3. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Oberfläche des Basisträgers (10) strukturiert ist und die Sensorträger (18) in Kavitäten (16) der Struktur angeordnet sind.

4. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Oberfläche des Basisträgers (10) eben ist.

5. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der vorbestimmte mittlere Abstand der Sensorträger

(18) 1 bis 1000 μm, insbesondere 10 bis 500 μm, vorzugsweise 20 bis 100 μm, beträgt.

6. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Population (18i, 18₂, 18₃) der Sensorträger (18) ferner durch mindestens eine weitere chemische und/oder physikalische Eigenschaft des Sensorträger (18) definiert ist, umfassend optische Eigenschaften, insbesondere Infra^¬ rot- und/oder UV-vis-Spektraleigenschaften; elektrische Eigenschaften, insbesondere Leitfähigkeit und/oder Widerstand; Molekularmasse; chemische Reaktivität; Hydrophobizi- tät; Polarität; magnetische Eigenschaften; NMR-Spektral- eigenschaften; Größe; Form und/oder stoffliche Zusammenset^¬ zung .

7. Vorrichtung (100) nach Anspruch 6, wobei die Population

(18i, 18₂, 18₃) der Sensorträger (18) durch unterschiedliche Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, Ionen, Dotierungen unterschiedlicher Molekularmassen, insbesondere unterschiedlichen Peptiden, definiert ist.

8. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Basisträger (10) planar, makro-, mikro- oder nanostrukturiert , porös oder nicht porös, optisch transpa- rent oder nicht transparent, leitend oder halbleitend, metallisch, funktionalisiert oder nicht funktionalisiert ist oder mehrere dieser Eigenschaften kombiniert aufweist.

9. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Basisträger (10) definierte Oberflächenareale mit unterschiedlichen chemischen oder/und physikalischen Eigenschaften aufweist.

10. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Basisträger (10) aus mindestens einem Material besteht, umfassend Glas, Glimmer, Metalle, Halbleitermetal^¬ le, anorganische oder organische Polymere, oder eine Kombi^¬ nation aus diesen.

11. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Basisträger (10) in Form von Mikrotestplatten, Glas- oder Glimmerplättchen, Halbleiterwafern, flexiblen Membranen, Geflechten oder Fibrillen vorliegt.

12. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sensorträger (18) in Form von Partikeln, insbesondere Makro-, Mikro- und/oder Nanopartikeln; oder sphärische oder nicht-sphärischen Massen, insbesondere Hydroge- len, vorliegen.

13. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sensorträger (18) ein polymeres, ein- oder mehrschichtiges Material aufweisen, insbesondere umfassend Polystyren, Polymethacrylate, Polypropylen, Polyethylen, Copolymere, Silica, oder Mischungen oder Komposite von sol^¬ chen .

14. Vorrichtung (100) nach Anspruch 13, wobei das polymere Material zumindest ein weiteres, der Kodierung der Popula- tion (18i, 18₂, 18₃) dienendes Material, insbesondere

Magnetpartikel und/oder Fluoreszenzfarbstoffe, um- oder einschließt .

15. Vorrichtung (100) nach Anspruch 13 oder 14, wobei das poly- mere Material eine Oberflächenfunktionalisierung aufweist, umfassend chemisch funktionelle Gruppen, insbesondere Car- boxyl-, Amino-, Aldehyd- und/oder Epoxidgruppen, oder/und Oligonukleotide, Aptamere, Peptide, Lektine, Antikörper, Antigene, Kohlenhydrate oder kleine organische Verbindun- gen, wie Biotin oder Avidin.

16. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sensormoleküle (24) kovalent oder nicht-kovalent an einer äußeren und/oder inneren Oberfläche der Sensorträ- ger (18) gebunden sind.

17. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sensormoleküle (24) ausgewählt sind aus der Gruppe mindestens umfassend Haptene, Antigene, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Antikörper, kleine organische Molekü^¬ le, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und/oder Teile oder Mischungen dieser Moleküle.

18. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyten (26) ausgewählt sind aus der Gruppe min^¬ destens umfassend Haptene, Antigene, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Antikörper, kleine organische Moleküle, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und/oder Teile oder Mischungen dieser Moleküle.

19. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 18 mit den Schritten

- Aufbringen zumindest einer Lochmaske (12) mit einem definierten Lochraster auf einen Basisträger (10) oder physikalische Strukturierung oder chemische Modifizie^¬ rung des Basisträgers (10), sodass jeweils Kavitäten (16) oder chemische Bindungsareale mit einem vorbestimm^¬ ten Abstand auf dem Basisträger (10) entstehen, und

- Aufbringen einer Mischung aus einer Mehrzahl von Sensor- trägem (18), die zumindest zwei unterschiedlichen Popu- lationen (18i, 18₂, 18₃) zuordenbar sind, auf den Basis^¬ träger (10), sodass die Sensorträger (18) sich in den Kavitäten (16) beziehungsweise auf den Bindungsarealen anordnen, wobei eine Abmessung der Kavitäten (16) oder Bindungsareale und der Sensorträger (18) so zueinander bemessen sind, dass in jede Kavität (16) und in jedem Bindungsareal höchstens ein Sensorträger (18) Platz fin^¬ det.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Sensorträger (18) an dem Basisträger (10) immobilisiert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Lochmaske

(12) dauerhaft auf dem Basisträger (10) verbleibt oder nach der Aufbringung und gegebenenfalls Immobilisierung der Sensorträger (18) entfernt wird.

22. Methode zum Nachweis zumindest eines Analyten (26) in einer Probe, wobei eine Vorrichtung (100) nach einem der Ansprü- che 1 bis 18 mit der das zumindest eine Analyt (26) enthal^¬ tenden Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das zumindest eine Analyt (26) mit korrespondierenden Sensormolekülen (24) der Sensorträgers (18) interagiert, dadurch gekenn^¬ zeichnet, dass zumindest eine Eigenschaft des Sensorträgers (18) und/oder des Analyten (26) gleichzeitig oder nacheinander ortsaufgelöst detektiert wird.

23. Methode nach Anspruch 22, wobei die zumindest eine Eigen^¬ schaft des Sensorträgers (18) und/oder des Analyten (26) durch Fluoreszenzspektroskopie, Infrarotspektroskopie, UV- vis-Absorptionsspektroskopie, Ellipsometrie, Massenspek^¬ troskopie, Rasterkraftmikroskopie, Scanning-Nahfeld-Mikros- kopie, Transmissions-Elektronenmikroskopie, Rasterelektro^¬ nenmikroskopie oder durch simultane oder sequentielle Kom- bination dieser Verfahren bestimmt wird.

24. Kit zum Nachweis zumindest eines Analyten (26) in einer Probe umfassend eine Vorrichtung (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder ihre Einzelkomponenten, insbesondere Basisträger (10), Sensorträger (18) und/oder Sensormoleküle (24), und weitere Reagenzien.