WO2007088823A1 - ヒトＴＮＦ－αに対する抗体酵素およびその利用 - Google Patents

ヒトＴＮＦ－αに対する抗体酵素およびその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2007088823A1
WO2007088823A1 PCT/JP2007/051418 JP2007051418W WO2007088823A1 WO 2007088823 A1 WO2007088823 A1 WO 2007088823A1 JP 2007051418 W JP2007051418 W JP 2007051418W WO 2007088823 A1 WO2007088823 A1 WO 2007088823A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
tnf
amino acid
acid sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/051418
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Taizo Uda
Emi Hifumi
Yoshiko Okamura
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Publication of WO2007088823A1 publication Critical patent/WO2007088823A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an antibody enzyme and use thereof, and in particular, is used for the purpose of preventing or treating a disease that develops due to abnormal production of cytodynamic ins such as rheumatism and chronic obstructive pneumonia disease. It relates to an antibody enzyme capable of
  • Autoimmune diseases are pathological conditions caused by a state in which autoantibodies are produced or self-reactive lymphocytes appear (referred to as autoimmunity) due to recognition of self-components as foreign substances. It is. Specifically, the immune system usually works to protect the body by eliminating bacteria and viruses that have entered the body, but does not cause an excessive immune response against itself. In other words, the self component has acquired immune tolerance. However, in autoimmune diseases, there is some abnormality in immune tolerance, which causes the above pathological conditions
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, Hashimoto's disease, systemic lupus erythematosus, and the like.
  • RA rheumatoid arthritis
  • TNF- ⁇ of tumor necrosis factor (hereinafter also referred to as “TNF”).
  • TNF-a concentration is increased in the joint fluid of RA patients.
  • Increased concentration of TNF-a promotes the infiltration of leukocytes such as lymphocytes into inflamed sites by inducing the expression of adhesion molecules on vascular endothelial cells, and (b) acts on synovial cells.
  • the treatment method to be selected usually differs depending on the degree of progression of the pathological condition of RA.
  • a nonsteroidal anti-inflammatory drug (N SAID) is administered and simultaneously differentiated from other autoimmune diseases including collagen disease while carefully monitoring the course .
  • N SAID nonsteroidal anti-inflammatory drug
  • DMARD disease-modifying rheumatic drug
  • Surgical treatment may also be performed if daily life becomes inconvenient due to joint destruction.
  • autoimmune diseases are diseases that are generally difficult to cure. For this reason, research on diagnosis, treatment and prevention of autoimmune diseases has been conducted, but the current situation is still insufficient.
  • Patent Document 1 includes It is disclosed that an antibody molecule having specificity for human TNF-a is used in the manufacture of a medicament for treating rheumatoid arthritis or osteoarthritis mediated by TNF-a.
  • diseases that are known to be associated with abnormal production of cytodynamic ins are not limited to autoimmune diseases, such as chronic obstructive pneumonia (hereinafter also referred to as "COPD").
  • COPD chronic obstructive pneumonia
  • Patent Document 2 discloses that vertebrate brain muscarinic receptors are activated as a method for reducing inflammation caused by pro-inflammatory site force-in or inflammatory site force-in cascade.
  • methods at risk of chronic obstructive pulmonary disease mediated by an inflammatory site force in cascade or methods of inhibiting TNF release in vertebrates with the disease.
  • cytoforce-in is involved in the pathology of various diseases, and at present, development of a technique relating to treatment and prevention of diseases using site-force-in as a target molecule is required.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Gazette “Special Table 2003-535591 Publication (published December 2, 2003)”
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication “Special Table 2005-522457 Publication (Published July 28, 2005)”
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and its purpose is to be used for the purpose of preventing or treating a disease that develops due to abnormal production of cytodynamic in, such as rheumatism or COP D. It is to provide a possible antibody enzyme.
  • the present inventors have found that it is possible to produce an antibody enzyme against TNF-a, which is known to be associated with the pathology of RA and COPD.
  • the invention has been completed. That is, the present invention includes the following industrially useful inventions.
  • An antibody enzyme which is an antibody against human TNF-a or a fragment of the antibody, and which degrades the TNF-a.
  • the light chain variable region is composed of the polypeptide described in the following (a) or (b), and the heavy chain variable region is described in the following (c) or (d):
  • the light chain variable region is composed of a polypeptide that is a translation product of a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the heavy chain variable region is based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody enzyme according to (3) comprising a polypeptide that is a translation product of the gene.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody enzyme according to any one of (1) to (5), which suppresses an increase in the amount of TNF- ⁇ in a living body.
  • the antibody enzyme useful in the present invention is an antibody against human TNF-a or a fragment of the antibody, and has a configuration of degrading the TNF-s. Therefore, when administered to a living body, it has the effect of efficiently decomposing TNF- ⁇ in the living body.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of titer measurement (9 days after the first immunization) after immunization (initial) of mice with TNF-a in this example.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of titer measurement (23 days after the first immunization) after immunization of mice with TNF-a (second time) in this example.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of titer measurement (37 days after the first immunization) after immunization of mice with TNF-a (third time) in this example.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of titer measurement (52 days after the first immunization) after immunization of mice with TNF-a (fourth) in this example.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of examining the cross-reactivity of ETNF-1 to 8 antibodies with various proteins in this example.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of examining the cross-reactivity of ETNF-9-17 antibody with various proteins in this example.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the cross-reactivity of ETNF-1 to 8 antibodies with various proteins in this example.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of examining the cross-reactivity of ETNF-9-17 antibody with various proteins in this example.
  • FIG. 10 In this example, the three-dimensional structure of the heavy chain variable region of the ETNF-6 antibody was predicted. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 11 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the ETNF-6 antibody in this example.
  • FIG. 12 shows the results of predicting the three-dimensional structure of the L chain variable region of the ETNF-6 antibody in this example.
  • FIG. 13 shows the amino acid sequence of the L chain variable region of the ETNF-6 antibody in this example.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of monitoring the degradation of the peptide substrate by the L chain of the ETNF-6 antibody in this example.
  • FIG. 15 (a) is a chromatogram showing the results (after 0 hour) of analyzing the degradation products of peptide substrates by the L chain of ETNF-6 antibody over time in this example by HPLC.
  • FIG. 15 (b) is a chromatogram showing the results (after 27.7 hours) of analyzing the degradation products of the peptide substrate by the L chain of the ETNF-6 antibody over time in this example by HPLC. .
  • FIG. 15 (c) is a chromatogram showing the results (after 50.4 hours) of analysis of the degradation products of the peptide substrate by the L chain of the ETNF 6 antibody over time in this example by HPLC.
  • FIG. 15 (d) is a chromatogram showing the results (73.2 hours later) of analyzing the degradation products of peptide substrates by the L chain of ETNF-6 antibody over time in HPLC in this example. .
  • FIG. 16 is a graph showing the results of monitoring degradation of a peptide substrate by the H chain of ETNF-6 antibody in this example.
  • FIG. 17 (a) is a chromatogram showing the results (after 0.3 hours) of analyzing the degradation products of peptide substrates by the H chain of ETNF-6 antibody over time in this example by HPLC.
  • FIG. 17 (b) is a chromatogram showing the results (after 27.7 hours) of analyzing the degradation products of peptide substrates by the H chain of ETNF-6 antibody over time in this example by HPLC. .
  • FIG. 17 (c) is a chromatogram showing the results (after 50.7 hours) of analyzing the degradation products of the peptide substrate by the H chain of the ETNF 6 antibody over time in this example by HPLC.
  • FIG. 17 (d) is a chromatogram showing the results (after 58.7 hours) of analysis of the degradation products of peptide substrates by the H chain of ETNF-6 antibody over time in this Example by HPLC. .
  • FIG. 18 (b) is a diagram showing the results of monitoring the degradation of TNF- ⁇ by incubating only TNF- ⁇ in this example.
  • FIG. 18 (c) shows the results of monitoring the degradation of the ETNF-6 antibody chain by electrophoresis when only the ETNF-6 antibody chain was incubated in this example.
  • FIG. 19 (a) shows the results of monitoring the degradation of TNF- ⁇ by the L chain of ETNF-6 antibody by electrophoresis in this example.
  • FIG. 19 (b) shows the results of monitoring the degradation of TNF- ⁇ when only TNF- ⁇ is incubated in this example by electrophoresis.
  • FIG. 19 (c) is a diagram showing the results of monitoring the degradation of the L chain of the ETNF-6 antibody by electrophoresis when only the L chain of the ETNF-6 antibody is incubated in this example.
  • FIG. 20 (a) shows the results of monitoring the degradation of the control protein (myodarobin) by the L chain of ETNF-6 antibody by SDS-PAGE in this example.
  • FIG. 20 (b) shows the results of monitoring the degradation of the control protein (myoglobin) by SDS-PAGE when only the control protein (myoglobin) is incubated in this example.
  • FIG. 20 (c) shows the results of monitoring degradation of control protein (BSA) by the L chain of ETNF-6 antibody by SDS-PAGE in this example.
  • FIG. 20 (d) is a diagram showing the results of monitoring degradation of control protein (BSA) by SDS-PAGE method when only control protein (BSA) is incubated in this example.
  • FIG. 21 (a) shows the results of monitoring the degradation of the control protein (myodarobin) by the H chain of ETNF-6 antibody by SDS-PAGE in this example.
  • FIG. 21 (b) shows the results of monitoring the degradation of the control protein (myoglobin) by SDS-PAGE method when only the control protein (myoglobin) is incubated in this example.
  • FIG. 21 (c) shows the results of monitoring degradation of control protein (B SA) by the heavy chain of ETNF-6 antibody by SDS-PAGE in this example.
  • FIG. 21 (d) shows the results of monitoring degradation of the control protein (BSA) by SDS-PAGE when only the control protein (BSA) is incubated in this example.
  • the antibody enzyme according to the present invention is an antibody obtained using human TNF- ⁇ as an antigen as described later. Therefore, TNF-a, which is the antigen of the antibody enzyme of the present invention, will be described in detail below.
  • TNF-a is a site force-in discovered by William Coley at the end of the 19th century. Coley found that some cancer patients' tumors regressed or disappeared after bacterial infection. Therefore, I tried to treat cancer by administering bacteria, but I could't get a consistent result and it was not a medical treatment.
  • the active ingredient that disappears the tumor was later shown to be a complex biomolecule called LPS (endotoxin). LPS itself has anti-tumor activity. It was revealed that the serum of animals administered LPS contains factors that are toxic to cancer cells. This factor, produced from specific cells as a result of a response to LPS, is TNF (tumor necrosis factor).
  • Tumor necrosis factor is a regulatory protein in the family of site force-in family different from interferon and interleukin.
  • TNF-a and TNF- ⁇ Two types of TNF are known, TNF-a and TNF- ⁇ . Both bind to the same receptor and induce a similar broad biological response, but their homology is as low as 30% or less.
  • TNF as a tumor necrosis factor more precisely refers to TNF- ⁇ .
  • TNF—a is also known as cachectin.
  • TNF-a The main biological activities of TNF-a include phagocytic activation, promotion of direct or joint inflammation, cytotoxicity to transformed cells, IL 1, IL 6, IL 8, colony stimulation Induction of site force-in synthesis and production such as factors.
  • systemic high TNF-a induces septic shock and autoimmune diseases.
  • biologically active human TNF-a has three identical polypeptide 'subunits 3 It is a homotrimer (homotrimer) with strong rotational symmetry.
  • the monomer is biologically inert and has a molecular weight of 17.3 kDa.
  • Table 1 The characteristics of TNF- ⁇ are summarized in Table 1 below.
  • human TNF-a include homotrimers of polypeptides having the amino acid sequences registered in NCBI Accession No. CAA26669 and NP-000585! .
  • the method for obtaining human TNF- ⁇ used in the present invention is not particularly limited. For example, it can be obtained by purchasing a commercially available product. Further, it may be produced by using a conventionally known gene recombination technique or the like. For example, by incorporating a gene encoding a polypeptide having the amino acid sequence exemplified above into a vector or the like, and then introducing the gene into a suitable host cell so that it can be expressed, and purifying the polypeptide translated in the cell. Can be manufactured. Furthermore, it can be chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer or the like, or synthesized using a cell-free protein synthesis solution.
  • the TNF-a amino acid sequence exemplified above consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added, and is described above.
  • Such a polypeptide having the physiological activity of human TNF- ⁇ , in other words, mutant human TNF-a can also be used as human TNF-a.
  • the method for obtaining such mutant human TNF-a is not particularly limited. For example, site-specific mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.), PCR Obtained by introducing a point mutation into the nucleotide sequence using a method to produce a mutant protein, or using a known mutant protein production method such as a mutant strain production method by inserting a transposon. can do.
  • those peptide fragments may be used as antigens.
  • the method for obtaining such a peptide fragment is not particularly limited.
  • human TNF-a or mutant human TNF-a obtained by the method described above may be cleaved using an appropriate protease so that the desired peptide fragment can be obtained.
  • it may be produced by expressing a gene encoding a peptide fragment designed in advance by a conventionally known method as described above. It can also be chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer or the like, or synthesized using a cell-free protein synthesis solution.
  • the antibody enzyme according to the present invention may be an antibody against human TNF-a or a fragment of the antibody and an antibody enzyme having an activity of degrading the TNF- ⁇ .
  • the "antibody enzyme” is an antibody that has an enzymatic action, and among them, those that exhibit high degradation activity targeting the antigen protein are “super antibodies”. Called “enzyme”.
  • the above-mentioned “super antibody enzyme” can completely degrade the targeted protein and has an activity close to that of a natural enzyme (Super Catalytic Antibiody [I]: Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y “Uda, T” J. Biosci. Bioeng., 88 (3), 323-327 (1999)).
  • the antibody enzyme according to the present invention is an antibody having TNF- ⁇ as an antigen, and is included in the “super antibody enzyme” in order to completely decompose TNF-a.
  • the “antibody enzyme” in the present specification includes an antibody fragment that recognizes an antigen of the antibody and has an activity of degrading the antigen.
  • antibody fragment refers to each peptide chain that constitutes an antibody, for example, a light chain (hereinafter also referred to as “L chain”) or a heavy chain (hereinafter referred to as "H chain”). ”)). Furthermore, the “antibody fragment” includes peptide fragments of a partial region in each peptide chain, for example, a light chain variable region and a heavy chain variable region, and a peptide fragment containing these variable regions.
  • the antibody enzyme useful in the present invention may be a polyclonal antibody against human TNF-a, but more preferably a monoclonal antibody against human TNF-a. Thereby, an antibody enzyme having high specificity for the TNF-a can be obtained.
  • TNF-a recognized by the antibody enzyme of the present invention recognizes TNF- ⁇ derived from all other organisms. You can understand.
  • the antibody enzyme useful in the present invention is an antibody against human TNF-a or a fragment of the antibody, and at the same time has an activity of degrading the TNF- ⁇ . That is, the antibody enzyme according to the present invention has both properties as an antibody that specifically recognizes TNF- ⁇ and properties as an enzyme that cleaves and Z-decomposes the recognized TNF-a. Therefore, in an antibody having no TNF-a degrading activity, only one molecule or two molecules of TNF a bind to one antibody molecule. In the antibody enzyme of the present invention, one antibody enzyme molecule On the other hand, TNF- ⁇ repeats the reaction of being bound and decomposed next. Therefore, the ability of the antibody enzyme according to the present invention to degrade TNF-a reaches several hundred times or several thousand times that of an antibody without TNF-a degradation activity.
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition that includes the antibody enzyme according to the present invention and can suppress an increase in the amount of TNF- ⁇ in vivo.
  • the antibody enzyme according to the present invention is an antibody at the same time as an antibody, an enzyme sensor can be constructed.
  • the antibody enzyme according to the present invention has a wider range of application than ordinary antibodies that do not have antigen-degrading activity.
  • the enzyme activity of the antibody enzyme according to the present invention may be one that cleaves, cleaves or degrades TNF ⁇ derived from other organisms in addition to human TNF ⁇ .
  • the antibody enzyme useful in the present invention has a catalytic triad residue structure.
  • the “catalytic triad residue structure” means that at least three amino acid residues including serine are present in the active site. It is a structure presumed to be included and form an active center. Proteases having this catalytic triad structure are called serine proteases because they contain serine in the active site. Therefore, it can be said that the antibody enzyme according to the present invention is a kind of serine protease. If it has a structure presumed to be a catalytic triad residue, it can be predicted that it has high activity as a protease.
  • “existing in a three-dimensional structure” means that the distance force between C a between a serine residue, an aspartic acid residue, and a histidine residue or glutamic acid residue is within a range of at least 3 to 20 A, Preferably, it means 3 to: within the range of L0A.
  • the method for examining whether or not the antibody enzyme according to the present invention has the above "catalytic triad residue structure” is not particularly limited.
  • a method for actually determining the three-dimensional structure of the antibody enzyme such as a three-dimensional structure determining method by X-ray diffraction
  • the presence or absence of “catalyst triad residual structure” can be examined.
  • the protein three-dimensional structure prediction software based on the primary structure of the antibody enzyme, that is, the amino acid sequence of the antibody enzyme, the “catalytic triplet residue structure” Check for the presence or absence.
  • the antibody enzyme preferably comprises at least one of a light chain variable region and a heavy chain variable region of an antibody against the TNF-a.
  • This “variable region” is the portion of the H and L chains that make up an antibody that has both an N-terminal force and an amino acid force of about 110 residues.
  • This variable region has a variety of primary structures depending on the type of antibody, and when the antibody has an activity as an enzyme, it is highly likely that its active center is included. Therefore, if the antibody enzyme according to the present invention includes the variable region of the antibody, it can be predicted to have high activity as an enzyme.
  • the light chain variable region and the heavy chain variable region are not particularly limited as long as they are the variable regions of the light chain and heavy chain of an antibody against human TNF-a. Nah,.
  • the polypeptide constituting the light chain variable region include (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Mention is made of a polypeptide comprising an amino acid sequence in which several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added, and has an activity of recognizing the TNF-strain and degrading the TNF-strap. it can.
  • the polypeptide constituting the heavy chain variable region includes (c) a polypeptide having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2, and (d) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Mention is made of a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added, and having the activity of recognizing the TNF-s and degrading the TNF-s. be able to.
  • one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added
  • a known mutant peptide preparation such as site-directed mutagenesis.
  • the number of amino acids that can be substituted, deleted, inserted, and Z or added preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less
  • the polypeptides (b) and (d) are mutants of the polypeptides (a) and (c), respectively.
  • the “mutation” referred to here may be a naturally occurring mutation that means a mutation that is artificially introduced mainly by a known mutant protein production method.
  • the antibody enzyme according to the present invention includes, as one embodiment thereof, the TNF-
  • the antibody enzyme useful in the present invention includes the polypeptides exemplified above.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the ETNF-6 antibody, which is an antibody enzyme produced in the examples described later, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 It is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the antibody enzyme ETNF-6 antibody.
  • FIG. 13 shows the amino acid sequence of the light chain variable region of the ETNF-6 antibody
  • FIG. 11 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the ETNF-6 antibody.
  • the light chain variable region of the ETNF-6 antibody has three complementarity determining regions (hereinafter also referred to as “CDRs”), which are underlined, specifically CDR 1, CDR2, Has CDR3. That is, the light chain variable region of the ETNF-6 antibody consists of CDR1 consisting of the 24th to 38th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 54th to 60th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has CDR2 consisting of an amino acid sequence and CDR3 consisting of the 93rd to 101st amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the heavy chain variable region of the ETNF-6 antibody also has CDR1, CDR2, and CDR3 shown underlined. That is, the variable region of the heavy chain of the ETNF-6 antibody is CDR1, which is the 31st and 35th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the 50th to 66th amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • CDR3 consisting of the amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 from the 99th to the 108th amino acid sequence.
  • the antibody enzyme according to the present invention is a fragment of an antibody against human TNF-a, which contains the variable region of the antibody, recognizes TNF-a, and degrades TNF-a.
  • a fragment of an antibody having activity is included.
  • the variable region may be a heavy chain variable region or a light chain variable region.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region can be preferably used for preparing a chimeric antibody by transplanting such a variable region to an antibody of a human or other animal.
  • Examples of the antibody fragment that can be used in the present invention include any of the polypeptides (a) to (d) described above, and antibody fragments containing the amino acid sequences of these polypeptides. Can be mentioned.
  • the present invention also includes a gene encoding the antibody enzyme.
  • Specific examples of the gene according to the present invention include a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 or a gene containing these.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a gene encoding the light chain variable region of ETNF-6 antibody, which is an antibody enzyme produced in the examples described later, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the above-mentioned ETNF — A gene encoding the heavy chain variable region of antibody 6.
  • the variable region of the antibody enzyme of the present invention or the variable region incorporating the CDR thereof may be expressed as it is, but can also be expressed as a chimeric antibody enzyme linked to a gene encoding the constant region.
  • the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”. “Polynucleotide” means a polymer of nucleotides. Therefore, the term “gene” in this specification includes not only double-stranded DNA but also the sense strand and antisense strand constituting it, and each single-stranded DNA and RNA (mRNA, etc.). . Further, the above “gene” may include sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences) in addition to the sequence encoding the antibody enzyme of the present invention.
  • UTR untranslated region
  • vector sequences including expression vector sequences
  • DNA includes, for example, cDNA, genomic DNA, plasmid DNA and the like obtained by cloning DNA synthesis techniques or a combination thereof.
  • the DNA may be a “genomic” type DNA containing a non-coding sequence such as an intron which is a form contained in a eukaryotic genome, or a non-coding sequence such as a prokaryotic intron. There may be no “genomic” form of DNA.
  • plasmid DNA which is a low molecular weight circular DNA that the cell can hold separately from genomic DNA! /.
  • nucleic acid also includes any simple nucleotide and a polynucleotide having a Z or modified nucleotide strength, such as total RNA including cDNA, mRNA and hnRNA.
  • Modified nucleotides include inosin, acetylcytidine, methylcytidine, methyladenosine, and phosphate esters including methylguanosine, as well as nucleotides that can be generated by the action of ultraviolet light or chemical substances.
  • base sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C and T, respectively).
  • base sequence of a polynucleotide or polynucleotide is intended to be a sequence of deoxyribonucleotides relative to a DNA molecule or polynucleotide, and an RNA molecule or polynucleotide.
  • each thymidine deoxynucleotide (T) in the deoxynucleotide sequence identified here is the uridine (U) of the ribonucleotide. Intended to be replaced).
  • the gene for the present invention is not necessarily necessarily identical to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, and is complementary to DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • hybridization under stringent hybridization conditions means that at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity. It means that hybridization occurs only when it exists in between.
  • stringent conditions hybridization conditions
  • a hybridization solution 50% formamide, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate) After incubation at 42 ° C in 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 / z gZml of denatured sheared salmon sperm DNA
  • 5 X Denhardt's solution 10% dextran sulfate
  • 20 / z gZml of denatured sheared salmon sperm DNA
  • the hybridization is performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. Molecular Cioning'A Laboratory Manual, 2d Ed., Old Spring Harbor Laboratory (1989). There is no particular limitation. Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (ie, the less likely it is to hybridize).
  • the antibody enzyme useful for the present invention is, for example, a high-pridoma obtained by fusing spleen cells of an immunized animal such as a mouse and a fusion partner such as a mouse myeloma cell with TNF- ⁇ as an antigen peptide. It can be produced by producing a monoclonal antibody. When obtaining heavy and light chains, the obtained monoclonal antibody may be separated into a heavy chain and a light chain. When obtaining the antibody fragment of the present invention, first obtain the relevant monoclonal antibody, and then use the above-mentioned monoclonal antibody with an appropriate protease. What is necessary is just to cut
  • Monoclonal antibodies can be obtained by the usual Hypridoma method (Kohler, G. and Milstein, C,
  • trioma method human B—cell hyperidoma method (Kozbor, Immunology Today 4, 72 (1983)), EBV—hybridoma method (Monoclonal Antibodies an d Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96 (1985)).
  • the antigen peptide the above-described peptide fragment of TNF-a or TNF-a may be used.
  • the antibody enzyme of the present invention can be produced using a conventionally known gene recombination technique or the like.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the above antibody enzyme is introduced into an appropriate host cell so that it can be expressed, and the peptide translated in the cell is purified. it can.
  • the target antibody enzyme can be efficiently produced by incorporating a gene encoding the antibody enzyme together with an appropriate promoter capable of mass expression.
  • the method for producing a mutant polypeptide such as the above-mentioned polypeptide (b) or (d) is not particularly limited.
  • site-directed mutagenesis method Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.
  • PCR method for introducing point mutations into base sequences and creating mutant proteins or transposon
  • a well-known mutant protein production method such as a mutant strain production method by insertion can be used.
  • one or several bases are replaced, deleted, inserted, and Z or appended in the base sequence of the cDNA encoding the polypeptide of (b) or (d) above. It can be made by modifying.
  • a commercially available kit may be used for the production of the mutant polypeptide.
  • the method for obtaining an antibody enzyme useful in the present invention is not limited to the above-described method.
  • the antibody enzyme may be chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer or the like.
  • a polypeptide useful for the present invention may be synthesized from a gene according to the present invention using a cell-free protein synthesis solution.
  • the transformant according to the present invention is a transformant into which the gene according to the present invention has been introduced.
  • gene introduced means that the gene is introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
  • transformant means not only a cell / tissue 'organ but also an individual organism.
  • Examples of the method for producing a transformant (production method) according to the present invention include a method of transforming a recombinant expression vector containing a gene related to the present invention.
  • Plasmids, phages, cosmids, and the like can be used for the production of the above recombinant expression vectors, but are not particularly limited.
  • a manufacturing method may be performed using a known method.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the gene, and a gene obtained by incorporating this gene and the gene of the present invention into various plasmids can be used as an expression vector.
  • Strong expression vectors include, for example, phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors, and virally derived vectors (eg, bacterial plasmids, genomic phages, yeast episomes).
  • Vectors derived from yeast chromosomal elements viruses (eg, baculovirus, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, tribox virus, pseudorabies virus, and retrovirus), and combinations thereof (eg, cosmids and phagemids) Can be used.
  • viruses eg, baculovirus, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, tribox virus, pseudorabies virus, and retrovirus
  • combinations thereof eg, cosmids and phagemids
  • preferred vectors for use in bacteria include, for example, pQE70, pQE60, and pQE-9 (available from Qiagen); pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a , PNH18A, pNH46A (available from Stratagene); and ptrc99a, pKK223-3, ⁇ —233-3, pDR540, pRIT5 (available from Phrmacia).
  • pWLNEO pSV2CAT, pOG44, p XT1, and pSG
  • pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL available from Phrmacia
  • Preferred vectors for use in plants include, for example, plasmids “ ⁇ 121”, “pBI221”, “pBI101” (all manufactured by Clontech), “pTA7001”, “pTA7002” (Aoyama et al. (1997). ) Plant J. 11: 605), “pPZP211” (Hajdukiewicz et al ”Plant Mol. Biol. 25: 9 89 (1994) and the like.
  • the organism (host organism) to be transformed is not particularly limited, and various conventionally known organisms and cells derived therefrom can be preferably used.
  • suitable hosts include cells (eg, E. coli cells, Streptomyces cells, and Salmone 11a typhimurium cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9 Cell); animal cells (eg, CHO cells, COS cells, and Bowes melanoma cells); and plant cells (eg, dicotyledonous plants such as Arabidopsis thaliana, tobacco, and monocotyledonous plants such as rice and barley).
  • cells eg, E. coli cells, Streptomyces cells, and Salmone 11a typhimurium cells
  • fungal cells eg, yeast cells
  • insect cells eg, Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9 Cell
  • animal cells eg, CHO cells, COS cells, and Bowes
  • a transformant used in the present invention a transformant in which a gene used in the present invention is introduced into a host cell so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). Is mentioned.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method according to the type of the host organism can be used.
  • a conventionally known method according to the type of the host organism can be used.
  • calcium phosphate method DE AE dextran method, cationic lipid-mediated transfection method, infection method, polyethylene glycol method, electoral position method, microinjection method, particle gun method, ribosome method, and appropriate vector system
  • the introduction method etc. can be mentioned as an example
  • the transformant thus obtained can produce a polypeptide useful for the present invention.
  • These polypeptides can be extracted and purified from the transformant organism by a conventionally known method.
  • the method for extracting and producing the polypeptide is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. For example, ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, sparse It can be recovered from recombinant cell culture and purified by well known methods including aqueous interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography.
  • Antigen (TNF-a) was dissolved in PBS to prepare a 4 ⁇ g / ml antigen solution. Each of the antigen solutions was put into a 96-well immunoplate using 50 1 pipettes. Then, it was reacted at 4 ° C for a while (coating).
  • PBS-T PBS containing 0.05% Tween20
  • the washed plate was placed upside down on a Kim towel and tapped to remove moisture from the well. All wells were filled with 130% 2% gelatin / PBS and incubated at room temperature for 30-60 minutes (blocking).
  • Preparation for the primary reaction was performed during blocking. Antisera collected from immunized mice were first diluted to 1Z50, and then 7-fold 3-fold serial dilution was performed to prepare 8 dilutions per sample. In addition, serum from untreated mice was also diluted and used as a control.
  • the plate was washed twice with PBS- ⁇ to remove water.
  • Absorbance was measured with a Muno reader.
  • the titer was measured by creating a graph with the antibody dilution ratio on the X-axis and absorbance on the Y-axis.
  • two 6ml sterilization tubes and two 14ml sterilization tubes were prepared.
  • One of the 6 ml sterilization tubes was designated as A and the other as B.
  • One of the 14 ml sterilized tubes was dispensed with 3.9 ml of HCF-added HAT medium, and the other was dispensed with 2.4 ml of HCF-added HAT medium.
  • the tube in which 3.9 ml of HCF-added HAT medium was dispensed was designated as C
  • the tube in which 2.4 ml was dispensed was designated as D.
  • the cells of the well to be crawled were pipetted with a micropipette, and 50 ⁇ 1 of the suspension was added to the cage.
  • Recombinant Human TNF-a (Strathmann Biotec AG, hTNFa-1000, Lot. 090590) was used.
  • two BalbZc mice (6 weeks old female) were used as immunized animals.
  • FCA Full's complete adjuvant
  • antigen Recombinant Human TNF- ⁇
  • two luer lock syringes two injection needles (19G), and a three-way stopcock
  • FCA Reund's complete adjuvant
  • antigen Recombinant Human TNF- ⁇
  • FCA was taken slightly more than necessary, and attached to a three-way stopcock.
  • the antigen prepared at 0.5 mg / ml was taken into a syringe in the same manner as FCA and attached to a three-way stopcock.
  • the syringe connected with the three-way stopcock was also taken out with clean bench force.
  • FCA and antigen were mixed in the same manner as water in oil.
  • the two syringes were pressed alternately, and FCA and the antigen were mixed well. Then, it left still at 4 degreeC. This operation was repeated until a white emulsion was formed, and FCA and antigen were mixed.
  • the mixed solution was collected in one syringe, the syringe was removed from the three-way stopcock force, and a 25G injection needle was attached.
  • the abdomen of the mouse was disinfected by wiping with alcohol cotton, and 100 1 was administered to two sites under the abdomen. In addition, the needle was not changed every mouse.
  • the antigen dose per mouse was 50 g.
  • the first immunity was boosted about 2 weeks later. From the second round, incomplete Freund adjuvant (FIA) was used.
  • the immunization method was the same as in the first immunization, and the antigen dose per mouse was 50 g.
  • mice with sufficiently increased titers (mouse I after the third immunization, mouse II after the fourth immunization) were subjected to final immunization.
  • an antigen prepared to 0.5 mgZml with sterile PBS was administered into the mouse tail vein or intraperitoneally.
  • the immunization schedule of this example is shown in Table 2.
  • FIG. 1 to FIG. 5 show the titer measurement results of the sera collected from the immunized mice.
  • the titer increased smoothly in both mouse I and II, and increased to a titer capable of cell fusion after the third immunization (see FIG. 3).
  • the titer after the final immunization was lower than the titer after the fourth immunization, but the titer was sufficient for cell fusion (see Figure 4 and Figure 5).
  • the mouse was disinfected and dissected, and the spleen was removed.
  • the extracted spleen was transferred to a petri dish containing 5 ml of MEM medium for washing. Excess tissue such as fat adhering to the spleen was removed and washed.
  • the washed spleen was transferred to a petri dish containing 5 ml of a new MEM medium, and the spleen was first divided into three equal parts with a scraped glass plate. Spleen cells were taken out by rubbing spleens that were divided into three equal parts by rubbing two rubbed glasses one by one and putting them in a petri dish.
  • the splenocytes were poured into a filtration filter placed on a 50 ml centrifuge tube.
  • the petri dish containing the splenocytes was washed with 5 ml of MEM medium, and transferred to a centrifuge tube so that the splenocytes did not remain in the petri dish. Thereafter, the splenocytes were centrifuged at 1400 rpm for 6 minutes (first wash). While spleen cells were centrifuged, precultured myeloma cells (NS-1) were collected and transferred to a 50 ml centrifuge tube. After completion of the spleen cell centrifugation, the myeloma cells were centrifuged at 1400 rpm for 6 minutes (removal of medium).
  • the spleen cells and myeloma cells suspended as described above were centrifuged at 1400 rpm for 6 minutes (splenocytes were washed for the second time and myeloma cells were washed for the first time). After centrifugation, the spleen cells and myeloma cell supernatants are removed by aspiration and suspended in 30 ml of MEM medium. Centrifugation was performed at Orpm for 6 minutes (spleen cells were washed 3 times, myeloma cells were washed 2 times). After centrifugation, the supernatant was removed by aspiration, and the cells were suspended in 10 ml of MEM medium.
  • HAT medium was added dropwise using a 5 ml pipette. After 7 days, the medium was changed.
  • screening was performed using the supernatant of all of these wells. Screening was performed using a method in which some conditions of the titer measurement method by ELISA described above were changed. Specifically, (1) In addition to TNF, the antigen used for coating was HSA and IgG (both concentrations were 4 / z gZml). (2) Washing after coating (3) A well supernatant with confirmed colonies was placed in a 96-well U-bottom plate and diluted to 1Z2 with PBS-T for the primary reaction. (4) Antiserum during cell fusion was used as a positive control for the primary reaction, and HAT medium diluted to 1Z2 with PBS-T was used as a negative control.
  • Mouse I had 27 positive uels and Mouse II had 9 positive uels (see Table 5).
  • 14 wells of mouse I and 9 wells of mouse II were clawed by the above-mentioned limiting dilution method.
  • a sample having an absorbance of 0.1 or more with respect to TNF-a was regarded as positive.
  • a strain in which 100% positive wells were consecutively used was designated as a monoclonal antibody-producing strain against TNF-a (hereinafter also referred to as “anti-TNF- ⁇ antibody-producing hyperpridoma”).
  • the number of anti-TNF- ⁇ antibody-producing hybridomas that were finally established was 13 in mouse I and 4 in mouse pupa (17 in total). These hybridomas were designated as ETNF 1-17, and the monoclonal antibodies produced by each hybridoma were designated as ETNF-1-17 stakes.
  • Proteins include TNF-a, TNF- ⁇ , human IgA (indicated as H-IgA in FIGS. 6 and 7), human IgM (indicated as H-IgM in FIGS. 6 and 7), human IgE ( Figures 6 and 7 indicate H-IgE), human serum albumin (referred to as HSA in Figures 8 and 9), human hemoglobin (referred to as H-hemo in Figures 8 and 9), ushi Serum albumin (referred to as BSA in FIGS.
  • HSA human serum albumin
  • H-hemo human hemoglobin
  • BSA ushi Serum albumin
  • ETNF-1, 3, 7 and 9-14 antibodies showed high reaction specificity.
  • ETNF-2 and 16 antibodies cross-reacted with human IgA and IgE.
  • non-specific reactions were observed with the ETNF-8, 15, and 17 antibodies.
  • Example 2 Determination of nucleotide sequence and amino acid sequence of variable region of ETNF-6 antibody
  • the variable region of the anti-TNF- ⁇ antibody (ETNF-6 antibody) of Example 1 is encoded by the method shown below.
  • the base sequence of the gene to be determined was determined.
  • the deduced amino acid sequence of the variable region of the anti-TNF ⁇ antibody was determined from the above base sequence.
  • Anti-TNF- ⁇ antibody-producing hybridoma is 20% at a culture temperature of 37 ° C and CO concentration of 5.5%
  • the cells were cultured in IMDM medium containing FCS until 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 7 cells were obtained.
  • the cultured cell culture solution was transferred to a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 1400 rpm for 6 minutes to collect cells. After removing the medium with an aspirator, the medium was suspended in 10 ml of PBS, combined into one tube, and centrifuged again at 1400 rpm for 6 minutes. After removing the supernatant by aspiration, it was suspended again in 10 ml of PBS, and the number of cells was counted using a hemocytometer.
  • the Extraction buffer was allowed to stand in a 37 ° C incubator for about 30 minutes to completely dissolve the crystals.
  • 1.5 ml of the extraction buffer thus obtained was added to the cell pellet collected in the above (1. Culture of antibody-producing cells). The cells were then crushed by passing them through a 21G needle several times. Thereafter, 3 ml of Elution buffer was added to the disruption solution, and the cells were further disrupted. The disrupted solution thus obtained was dispensed into four RNase-free 1.5 ml microtubes. Thereafter, centrifugation was performed at room temperature (25 ° C.) and 18000 ⁇ g for 20 minutes, and the supernatant was used as a sample to be added to an oligo (dT) -cellulose spin column described below.
  • oligo (dT) -cellulose spin column resin To isolate mRNA, first suspend the oligo (dT) -cellulose spin column resin, remove the top and bottom caps, place in a 15 ml centrifuge tube, and centrifuge at 1300 rpm for 1 minute 45 seconds. The stock solution was removed. Then, a lower cap was attached, and 4 ml of the sample (supernatant) from which protein and DNA had been removed was added. Subsequently, the upper cap was firmly attached, and the oligo (dT) -cellulose spin column suspension was suspended and then mixed by inversion for 10 to 15 minutes to adsorb mRNA to the suspension. Then, upper and lower caps were attached, and centrifugation was performed at 1400 rpm for 1 to 2 minutes.
  • a microtube for quantification was prepared, and 10 1 mRNA fraction was collected, and 70 1 Elution buffer was added and diluted (1/8 dilution). Using the diluted solution, A and A were measured using an absorbance blank as an Elution Buffer.
  • RNA concentration was calculated using the following formula.
  • RNA concentration gZml A X dilution rate X 40
  • the mRNA fraction (mRNA extraction solution), which was divided into two equal parts and left on ice, was calcined with 10 parts of 3M potassium acetate, 10 parts of glycogen, 2.5 parts of 95% ethanol. Stir. Thereafter, it was placed at 30 ° C for about 40 minutes, and then centrifuged at 4 ° C and 15000 rpm for 5 minutes, and then stored at 80 ° C.
  • cDNA synthesis was performed according to the protocol of AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa). The method is shown below.
  • the mixture was added to the solution so as to be 17 1, and after mixing, annealing treatment was performed at 70 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was placed on ice, added with 1 ⁇ l of 0.25M DTT, 1 ⁇ l of RNase inhibitor, and 5 ⁇ l of 5 X Reaction buffer, and mixed well. Further, 1 ⁇ l of AMV-RT was added and stirred gently, and an extension reaction was performed at 41 ° C for 60 minutes. After the treatment time was over, put on ice to stop the reaction and store at ⁇ 30 ° C.
  • the above composition was mixed well and PCR was performed using Biometra T-GRADIENT and TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL.
  • the L chain was preheated at 95 ° C for 7 minutes, then heat denaturation was fixed at 98 ° C for 15 seconds, the extension reaction was fixed at 74 ° C for 15 seconds, and the annealing temperature was 70. C, 66. C, 62. C, 58. C, 54. C, and 50. C and 6 to 4 stages. Decrease by C and perform the Step Down method.
  • the annealing time was fixed at 15 seconds.
  • the above 3 steps were repeated 3 cycles up to 5 steps, and the 6th step was performed 10 cycles.
  • H chain is preheated at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 3 steps of heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing temperature at 50 ° C for 2 minutes, and extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. Thereafter, an extension reaction at 72 ° C was performed for 10 minutes. After completion of PCR, amplification of the antibody variable region gene was confirmed by agarose electrophoresis.
  • ligation reaction solution 2 ⁇ l of the PCR product confirmed to be amplified with the antibody variable region by agarose gel electrophoresis, 1 ⁇ l of the salt solution, and 2 ⁇ l of sterilized water, and dispense into a PCR tube on ice. Poured and stirred. Furthermore, after adding TOPO vector of 11 and gently stirring, ligation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes. Immediately after the reaction for 30 minutes, the PCR tube was placed on ice to stop the reaction. The reaction solution thus prepared is hereinafter referred to as “ligation reaction solution”.
  • the cultured colon fungus solution was spread on ampicillin ZlPTGZX-GalZLB plate medium at two concentrations of 50 1 and 100 1 and cultured at 37 ° C.
  • E. coli obtained in the above (5. Cloning of antibody variable region gene) was cultured in LB liquid medium containing ampicillin. 0.75 ml was taken from the E. coli culture, mixed with 0.2 ml of 80% glycerol, and stored at 80 ° C. as a glycerol stock of E. coli. Plasmid DNA was prepared by the alkaline SDS method using the remaining culture solution.
  • the nucleotide sequence was determined using Thermo Sequenase Cy 5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia). PCR tubes were prepared for the four types of bases A, C, G, and T, and d (N) TP / Cy5.5-dd (N) TP was dispensed 11 by 1 for each sample.
  • a DNAZ primer mix was prepared. 1.5 ⁇ g DNA prepared in 6. Preparation of Plasmid DNA, 3.5 ⁇ 1 Reaction Buffer, 1 ⁇ 1 TOP013 Reverse (4p mol / ⁇ 1) (Invitrogen), and 2 ⁇ 1 Thermo Sequenase (10 U / ⁇ 1) was mixed, and sterilized ultrapure water was added to make the total amount 31.51. Dispense 7 aliquots into the above PCR tubes and immediately place them in the Biometora thermal cycler for a reaction cycle of 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 120 seconds. The reaction was stopped by cooling at 4 ° C for 30 cycles.
  • the cDNAs encoding the variable regions of the L chain and H chain of the ETNF-6 antibody which is an anti-TNF-a antibody, must consist of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. However, it was divided.
  • the deduced amino acid sequence of the variable region of the L chain and H chain of the ETNF-6 antibody was the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • Example 2 Base sequence power determined in Example 2 Based on the estimated amino acid sequence of the variable region of ETNF-6 antibody (see SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), AbM (Oxford Molecular, Oxford, UK) We predicted the CDR structure of the loop region and the three-dimensional structure of the FR region. Based on the three-dimensional structure predicted by AbM, intermolecular force calculation was performed by InsightII / Discover3 (Molecular Simulatoin, USA) to predict a thermodynamically stable three-dimensional structure.
  • FIG. 10 and FIG. 12 are diagrams schematically showing predicted three-dimensional structures of the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody, respectively. Further, FIG. 10 and FIG. 12 describe amino acid residues (Ser, His, Asp) that are thought to constitute catalytic triad residues. In FIGS. 10 and 12, CDRs 1 to 3 of the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody are represented by ribbons.
  • FIGS. 11 and 13 show the amino acid sequences of the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody, respectively.
  • the CDR1 to CDR3 of the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody are shown in FIGS. , Underlined.
  • ETNF 6 monoclonal antibody A large amount of ETNF 6 monoclonal antibody could be obtained by administering 1 ⁇ 10 6 anti-TNF-a antibody-producing hybridomas of Example 1 to BalbZc mice pre-administered with pristane, and then collecting ascites .
  • the monoclonal antibody was purified according to the following method.
  • the antibody was purified. The operation was performed at 4 ° C. according to the description of MAPS-IV kit (manufactured by BIO-RAD / purification kit using Protein A). The following reagents are used: 0.05% NaN / PBS, Binding buffer, Elution buffer, and 2M Tris—HCl (pH 8.0)
  • Binding buffer was prepared by dissolving 47. lg of Binding buffer powder in distilled water and making up to 150 ml. At this time, using a pH meter, it was confirmed that the pH was 9 ⁇ 0.2, and when it was out of the range, the pH was adjusted with HC1 or NaOH.
  • Elution buffer was prepared by dissolving 2.3 g of Elution buffer powder in distilled water and making up to 100 ml. At this time, using a pH meter, it was confirmed that the pH was 3 ⁇ 0.2, and when it was out of the range, the pH was adjusted with HC or NaOH.
  • 2M Tris—HC1 was prepared by dissolving 12. l lg of Tris in distilled water, adjusting the pH to 8.0 with HC1, and then making up to 50 ml with distilled water.
  • Binding buffer l: 1. When insoluble matter was observed, it was removed by filtration with filter paper. Before purification, 0.05% NaN / PBS, Binding buffer, Elution buffer, and sample
  • Binding buffer 50 ml or more of Binding buffer was used to remove contaminants other than antibodies.
  • the peak portion detected here was collected as a pass-through fraction.
  • the baseline is settled after collecting the flow-through fraction, add 45 ml of Elution buffer to elute the antibody bound to the Affigel protein A when the gel surface and the liquid surface of the Binding buffer are almost the same.
  • the peak portion was fractionated as an antibody fraction.
  • the pH of each collected fraction was measured with a pH test paper and neutralized with 2M Tris-HCl (pH 8.0).
  • the antibody fraction (antibody solution) was dialyzed twice against PBS, and the purity was confirmed by SDS-PAGE. Only the high-purity fraction was collected, the protein concentration was measured with DC Protein Standard Assay (BIO-RAD), and stored frozen at a concentration of 1 mg / ml or more (concentrated if less than 1 mgZml).
  • Example 4 5 mg of the antibody solution purified in Example 4 was dialyzed twice against 50 mM Tris—HC1 buffer ( ⁇ 8.0) containing 0.15 M NaCl. The antibody solution after completion of dialysis was centrifuged using Centriprep-10 at 4 ° C and 2800 rpm, and concentrated by ultrafiltration until approximately 1 ml. Further, 5 mM of 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCl was added, and the mixture was centrifuged again to approximately 1 ml.
  • PU-2080 Plus manufactured by JASCO
  • Protein-Pak TM 300SW ⁇ 7.5 mm ⁇ 300 mm; manufactured by Waters
  • the column was equilibrated by flowing 6 M guanidine hydrochloride (pH 6.5) used for the mobile phase at a flow rate of 0.15 mlZmin for about 2 hours.
  • the sample (the antibody solution after the above reduction alkylation treatment) was provided in two or three times. Fractions corresponding to the H chain and L chain were collected. Each fraction after fractionation was dialyzed against PBS, and the H and L chains were refolded.
  • Example 6 Peptidase activity in H chain and L chain of ETNF-6 antibody
  • a protein When a protein is used as a substrate, a natural antibody enzyme has a feature of specifically degrading a target protein. However, non-specific degradation occurs in peptide substrates. There are many things to do. Therefore, the TP41-1 peptide (HN—TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD—COOH: 2 used as a substrate in the peptidase activity tests of antibody enzymes so far
  • TP41-1 peptide was weighed and dissolved in 15 mM PB (pH 6.5), and then sterilized by filtration using ultrafree MC ( ⁇ 0.22 ⁇ m, manufactured by MILLIPORE). The concentration of H chain and L chain of ETN F-6 antibody was also adjusted using 15 mM PB (pH 6.5). Finally, mix in a test tube so that the concentration of TP41-1 peptide is 120 ⁇ M, the concentration of L chain is 0.8 M, and the concentration of H chain is 0.4 M, and react at 25 ° C. It was.
  • Figures 14 and 15 (a) to 15 (d) show the results of the L chain of the ETNF-6 antibody
  • Figs. 16 and 17 (a) to 17 (d) show the H chain of the ETNF-6 antibody. Results are shown.
  • Figures 15 (a) to 15 (d) and 17 (a) to 17 (d) show the chromatograms obtained by HPLC analysis of the samples collected at each elapsed time.
  • FIG. 16 is a graph showing the amount of TP41-1 peptide at each elapsed time calculated for the chromatogram power of HPLC.
  • 15 (a) to 15 (d) show the results after 0 hour, 27.7 hours, 50.4 hours, and 73.2 hours, respectively.
  • FIGS. 17 (a) to 17 (d) show the results after 0.3 hours, 27.7 hours, 50.7 hours, and 58.7 hours, respectively.
  • the reaction time elapses, the ETNF-6 antibody
  • the peptide substrate concentration decreased. Specifically, the peptide substrate concentration is determined by the reaction initiation. The force also decreased around 27 hours after the start, with reaction time containing L chain in 73 hours (see Fig. 14 and Fig. 15 (a) to Fig. 15 (d)), and reaction time containing H chain in 59 hours. The peptide disappeared completely (see Fig. 16 and Fig. 17 (a) to Fig. 17 (d)). As the peptide substrate concentration decreased, a peak that appeared to be a fragment of the peptide appeared.
  • Both the H chain and the L chain had a biphasic degradation curve composed of an "induction period” having a slow degradation rate and an "active period” exhibiting high activity.
  • the present inventors have found that there is a biphasic degradation curve as a characteristic of a natural antibody enzyme different from that of a normal enzyme. This is presumed that during the induction period, the three-dimensional structure of the antibody changes, and that the active period appears when the antibody has a high enzyme activity.
  • the H and L chains of the ETNF-6 antibody showed the same characteristics as the natural antibody enzyme, suggesting that the H and L chains of the ETNF-6 antibody are antibody enzymes. To do.
  • Example 6 it became apparent that the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody have peptidase activity. Therefore, next, we examined whether the H chain and L chain of the ETNF-6 antibody have the ability to degrade TNF-a, an antigenic protein.
  • TNF-a used in Example 1 was used as the antigen protein.
  • the nofer is 15m
  • a myoglobin derived from horse heart SIGMA M1882-250MG
  • BSA BIO-RAD Protein Assay Standard II
  • the required amount of powder was measured, dissolved in 15 mM PB (pH 6.5), and then sterilized by filtration using Ultra Free MC ( ⁇ 0.22 m, manufactured by MILLIPORE).
  • the final concentrations in the degradation experiments were 0.9 M (15 g / ml) for myoglobin, 0.3 M (20 gZml) for BSA, 1.1 ⁇ (20 gZml) for TNF- ⁇ , and ETNF-6 antibody.
  • the L chain was 0.4 i u M (10 i u gZml), and the H chain of the antibody ETNF-6 was 0.2 ⁇ ⁇ (10 ⁇ 8 / ml).
  • a portion of the reaction solution of each protein was collected in a clean bench, and the time course of each protein was analyzed by SDS-PAGE. Tracked. The results are shown in Figs. 18 (a) to 18 (c), 19 (a) to 19 (c), 20 (a) to 20 (d), and 21 (a) to 21 ( Shown in d).
  • FIG. 18 (a) to FIG. 18 (c) and FIG. 19 (a) to FIG. 19 (c) show the reaction results of the ETNF-6 antibody H and L chains with TNF-a.
  • this narrow band was found to be a peptide bond between the 5th serine and the 6th arginine from the N-terminus of TNF-a.
  • the band appearing at 15. kDa was a fragment generated by cleaving the peptide bond between the 20th proline and the 21st glutamine from the N-terminus.
  • the band appearing at 13.3 kDa was a fragment generated by cleavage of the peptide bond between the 36th and 37th leucines from the N-terminus.
  • TNF-a is considered to have almost been degraded in 20 to 30 hours, beginning with the degradation of the ETNF-6 antibody by the H chain from around 4 hours of reaction time. From the above results, it was demonstrated that the H chain of the ETNF-6 antibody is an antibody enzyme.
  • the antibody enzyme that works in the present invention is an antibody enzyme that functions as an antibody against TNF-a and that can cleave and Z or degrade TNF- ⁇ . Can be used to efficiently decompose TNF- ⁇ . Soreyu The present invention can be used for the prevention and treatment of diseases caused by excessive production of TNF- ⁇ , such as rheumatoid arthritis and COPD. Furthermore, the present invention can be widely applied to the medical industry, pharmaceutical industry, reagent industry, medical equipment industry, food industry, etc. using TNF- ⁇ .

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　リウマチや慢性閉塞性肺炎疾患のようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素を提供することにある。ヒトＴＮＦ－αを抗原として作製された抗体またはその断片は、ＴＮＦ－αを認識するとともに、当該ＴＮＦ－αを切断および／または分解することができる抗体酵素である。

Description

明 細 書
ヒト TNF— aに対する抗体酵素およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、抗体酵素およびその利用に関するものであって、特に、リウマチや慢性 閉塞性肺炎疾患のようなサイト力インの産生異常により発症する疾患を予防または治 療する目的で用いることが可能な抗体酵素に関するものである。
背景技術
[0002] 自己免疫疾患は、自己成分が異物として認識されることにより、自己抗体が産生さ れたり、自己反応性リンパ球が出現したりする状態（自己免疫と呼ばれる）によって引 き起こされる病態である。具体的には、通常、免疫系は体の中に侵入した細菌やウイ ルスを排除して体を防御するように働くが、自己に対して過剰な免疫応答を起こさな い。つまり、自己成分は免疫寛容を獲得しているのである。しかし、自己免疫疾患で は、免疫寛容に何らかの異常が生じているため、上記のような病態が引き起こされる
[0003] 自己免疫疾患の代表的な疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、橋本病、全身 性エリマト一デスなどを挙げることができる。
[0004] 上記自己免疫疾患のうち、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis；以下、「RA」とも いう）は、多発性関節炎を主徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。 日本全国 で RA患者は 70万人とも 100万人ともいわれ、その数は高齢ィ匕に伴い年々増加する 傾向がある。また、女性の患者が圧倒的に多ぐ RA患者の 8割が女性といわれてい るが、その原因は分かっていない。
[0005] RAの病因には、遺伝、免疫異常、内分泌、環境要因などが複雑に関与していると 推測されている。しかし、はっきりとした病因は判明していない。病変の主座は関節滑 膜であるが、進行すれば軟骨'骨を侵し、関節組織の破壊や変形へと至る。多くの関 節が腫れ、そして痛みを伴い、歩くことをはじめ、日常生活動作が徐々に障害される 難病である。関節以外に皮膚、肺、腎などの全身症状も伴うことも少なくない。病理組 織学的には、リンパ球やマクロファージの炎症性細胞の浸潤、滑膜細胞の増殖など が起こるといわれている。
[0006] RAの関節液あるいは滑膜細胞を用いた研究において、 RAの病態には炎症性サ イト力インと抗炎症性サイト力インのアンバランスが原因であることが明らかにされてい る。さらに、その中心的役割をしているサイト力インは、腫瘍壊死因子 (tumour necrosi s factor;以下、「TNF」ともいう）の TNF— αであるといわれている。具体的には、 RA 患者の関節液では、 TNF- aの濃度上昇が見られる。濃度が上昇した TNF— aは 、（a)血管内皮細胞の接着分子の発現を誘導することにより、リンパ球などの白血球 が炎症部位に浸潤するのを促進し、（b)滑膜細胞に作用して、様々な炎症性サイト力 インを産生させ、（c)破骨細胞の分化'活性化を促進させることにより、関節破壊を誘 発し、（d)線維芽細胞を活性化し、線維芽細胞を増殖させるといった作用を示すこと により、関節破壊、炎症の持続'慢性ィ匕を起こすと考えられている。
[0007] RAの治療は、通常、 RA病態の病状の進行度によって選択すべき治療手段が異 なる。一般的に確定診断を下すことが困難な RA初期では、非ステロイド抗炎症薬 (N SAID)を投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他の自己免疫疾患との 鑑別を同時に行う。 RAがさらに進行し、 RAとの確定診断が下されると、 NSAIDに加 えて疾患修飾性リウマチ薬 (DMARD)を投与する。さらに、疼痛のための薬物療法 と共に関節機能の維持 '回復に対して理学療法 ·装具療法を行う。また、関節破壊に より日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
[0008] 特定疾患に指定されている疾患が多く存在することからも分かるように、自己免疫 疾患は、一般的に根治することが困難な疾患である。そのため、自己免疫疾患の診 断や治療および予防に関する研究はされて 、るが、未だ十分とは 、えな 、のが現状 である。
[0009] ところで、近年、上述したように自己免疫疾患では T細胞、 B細胞、マクロファージな ど力も様々なサイト力インが産生されていることが分力つてきた。そのため、サイトカイ ンを標的に自己免疫疾患の治療を行うことに注目が集まっており、抗サイトカイン療 法の臨床応用が既に始まっている。例えば、サイト力インと特異的に結合し、その機 能を阻害するモノクローナル抗体や、サイト力インの働きを阻害する可溶性受容体や 拮抗物（アンタゴニスト）の利用が検討されている。より具体的には、特許文献 1には、 ヒト TNF— aに対して特異性を有する抗体分子を、 TNF- aによって媒介される慢 性関節リウマチまたは骨関節炎を治療するための医薬の製造に用いることが開示さ れている。
[0010] また、サイト力インの産生異常との関連が知られている疾患は、自己免疫疾患だけ ではなぐ例えば、慢性閉塞性肺炎疾患（以下、「COPD」ともいう）についても、サイ トカインの産生異常と疾患との関連性が知られている。より具体的には、特許文献 2 には、プロ炎症性サイト力インまたは炎症性サイト力インカスケードにより引き起こされ る炎症を低減する方法として、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性ィ匕させる ことを含む、炎症性サイト力インカスケードにより媒介される慢性閉塞性肺疾患の危険 性にある力、または該疾患を有する脊椎動物において TNFの放出を阻害する方法 が開示されている。
[0011] このように、サイト力インは、様々な疾患の病態に関与しており、現在、サイト力イン を標的分子とした疾患の治療や予防に関する技術の開発が求められている。
特許文献 1：日本国公開特許公報「特表 2003 - 535591号公報（平成 15 (2003)年 12月 2日公表）」
特許文献 2：日本国公開特許公報「特表 2005 - 522457号公報（平成 17 (2005)年 7月 28日公表）」
発明の開示
[0012] 本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、リウマチや COP Dのようなサイト力インの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で 用いることが可能な抗体酵素を提供することにある。
[0013] 本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、 RAや COPDの病態との関連 性が知られている TNF— aに対する抗体酵素を製造可能であることを独自に見出し 、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を 包含する。
[0014] (1)ヒト TNF— aに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記 TNF— aを分解することを特徴とする抗体酵素。
[0015] (2)上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする（1)に記載の 抗体酵素。
[0016] (3)上記抗体酵素は、上記 TNF— aに対する抗体の軽鎖可変領域および重鎖可 変領域の少なくとも一方を含んでなることを特徴とする（1)または（2)に記載の抗体 酵素。
[0017] (4)上記軽鎖可変領域は、以下の（a)または (b)に記載のポリペプチドからなり、上 記重鎖可変領域は、以下の（c)または (d)に記載のポリペプチドからなることを特徴と する（3)に記載の抗体酵素。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— αを 認識し、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(d)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— αを 認識し、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
[0018] (5)上記軽鎖可変領域は、配列番号 3に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳 産物であるポリペプチドからなり、上記重鎖可変領域は、配列番号 4に示される塩基 配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなることを特徴とする（3)に記 載の抗体酵素。
[0019] (6)以下の（e)または (f)に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌク レオチド。
(e)配列番号 1または 2に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1または 2のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— ひを認識し 、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
[0020] (7) (1)〜（5)のいずれかに記載の抗体酵素を含み、生体内における TNF— α量 の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
[0021] (8) (6)に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。 [0022] 本発明に力かる抗体酵素は、以上のように、ヒト TNF— aに対する抗体または当該 抗体の断片であり、かつ、当該 TNF—ひを分解するという構成を備えている。それゆ え、生体に投与した際、生体内の TNF— αを効率よく分解することができるという効 果を奏する。
[0023] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであ ろう。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]本実施例において、マウスを TNF— aで免疫（初回）した後の力価測定 (初回 免疫より 9日後）の結果を示すグラフである。
[図 2]本実施例において、マウスを TNF— aで免疫（2回目）した後の力価測定 (初 回免疫より 23日後）の結果を示すグラフである。
[図 3]本実施例において、マウスを TNF— aで免疫（3回目）した後の力価測定 (初 回免疫より 37日後）の結果を示すグラフである。
[図 4]本実施例において、マウスを TNF— aで免疫 (4回目）した後の力価測定 (初 回免疫より 52日後）の結果を示すグラフである。
[図 5]本実施例において、マウスを TNF— αで免疫（最終)した後の力価測定 (マウス Iにつ 、ては、初回免疫より 43日後；マウス IIにつ 、ては初回免疫より 108日後）の結 果を示すグラフである。
[図 6]本実施例において、 ETNF—1〜8抗体の様々なタンパク質との交差反応性を 調べた結果を示すグラフである。
[図 7]本実施例にお 、て、 ETNF— 9〜 17抗体の様々なタンパク質との交差反応性 を調べた結果を示すグラフである。
[図 8]本実施例において、 ETNF—1〜8抗体の様々なタンパク質との交差反応性を 調べた結果を示すグラフである。
[図 9]本実施例にお 、て、 ETNF— 9〜 17抗体の様々なタンパク質との交差反応性 を調べた結果を示すグラフである。
[図 10]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖可変領域の立体構造を予測した 結果を示す図である。
[図 11]本実施例にお 、て、 ETNF— 6抗体の H鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図 である。
[図 12]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖可変領域の立体構造を予測した結 果を示す図である。
[図 13]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図 である。
[図 14]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖によるペプチド基質の分解をモニタ 一した結果を示すグラフである。
[図 15(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果 (0時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 15(b)]本実施例にお 、て、 ETNF - 6抗体の L鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（27. 7時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 15(c)]本実施例にお ヽて、 ETNF 6抗体の L鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（50. 4時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 15(d)]本実施例にお 、て、 ETNF - 6抗体の L鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（73. 2時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 16]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖によるペプチド基質の分解をモ- ターした結果を示すグラフである。
[図 17(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果 (0. 3時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 17(b)]本実施例にお 、て、 ETNF - 6抗体の H鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（27. 7時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 17(c)]本実施例にお 、て、 ETNF 6抗体の H鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（50. 7時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 17(d)]本実施例にお 、て、 ETNF - 6抗体の H鎖によるペプチド基質の分解産物 を HPLCにより経時的に分析した結果（58. 7時間後）を示すクロマトグラムである。
[図 18(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖による TNF— αの分解を電気 泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 18(b)]本実施例において、 TNF— αのみをインキュベートしたときの TNF— αの 分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 18(c)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の Η鎖のみをインキュベートしたときの ETNF— 6抗体の Η鎖の分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 19(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖による TNF— αの分解を電気 泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 19(b)]本実施例において、 TNF— αのみをインキュベートしたときの TNF— αの 分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 19(c)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖のみをインキュベートしたときの ETNF— 6抗体の L鎖の分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
[図 20(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖によるコントロールタンパク質 (ミ オダロビン）の分解を SDS— PAGE法によりモニターした結果を示す図である。
[図 20(b)]本実施例において、コントロールタンパク質（ミオグロビン）のみをインキュべ ートしたときのコントロールタンパク質（ミオグロビン）の分解を SDS— PAGE法により モニターした結果を示す図である。
[図 20(c)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の L鎖によるコントロールタンパク質 (B SA)の分解を SDS— PAGE法によりモニターした結果を示す図である。
[図 20(d)]本実施例において、コントロールタンパク質（BSA)のみをインキュベートし たときのコントロールタンパク質（BSA)の分解を SDS— PAGE法によりモニターした 結果を示す図である。
[図 21(a)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖によるコントロールタンパク質 (ミ オダロビン）の分解を SDS— PAGE法によりモニターした結果を示す図である。
[図 21(b)]本実施例において、コントロールタンパク質（ミオグロビン）のみをインキュべ ートしたときのコントロールタンパク質（ミオグロビン）の分解を SDS— PAGE法により モニターした結果を示す図である。
[図 21(c)]本実施例において、 ETNF— 6抗体の H鎖によるコントロールタンパク質 (B SA)の分解を SDS— PAGE法によりモニターした結果を示す図である。 [図 21(d)]本実施例において、コントロールタンパク質（BSA)のみをインキュベートし たときのコントロールタンパク質（BSA)の分解を SDS— PAGE法によりモニターした 結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定される ものではない。
[0026] < 1. TNF- a >
本発明にかかる抗体酵素は、後述するようにヒト TNF— αを抗原として得られる抗 体である。そこで、まず、本発明の抗体酵素の抗原である TNF— aについて以下詳 細に述べることとする。
[0027] TNF- aは 19世紀末に William Coleyによって発見されたサイト力インである。 Cole yは細菌感染後に何人かの癌患者の腫瘍が退縮または消失して 、ることを発見した 。そこで細菌を投与し、癌の治療を試みたがー貫した結果が得られず、医学的治療 とはなり得なカゝつた。腫瘍を消失させる活性成分は、その後、 LPS (エンドトキシン)と 呼ばれる複雑な生体分子であることが示された。 LPS自身には抗腫瘍活性を持って V、な 、。 LPSを投与された動物の血清には癌細胞に対して毒性を示す因子が含ま れることが明らかにされた。 LPSに対する反応の結果、特異的な細胞から産生される この因子が TNF (腫瘍壊死因子)である。
[0028] 腫瘍壊死因子はインターフェロン、インターロイキンとは異なるサイト力イン'ファミリ 一の調節タンパクである。 TNF- aと TNF— βとの 2種類の TNFが知られている。 両方とも同じ受容体に結合し同様の広い生物的反応を誘導するが、両者の相同性 は、 30%以下と低い。特に腫瘍壊死因子としての TNFは、より正確には TNF— αを 指す。 TNF— aはカケタチン (cachectin)としても知られている。
[0029] TNF- aの主な生物学的活性としては、食細胞の活性化、直接的または関節的 な炎症の促進、形質転換細胞に対する細胞障害、 IL 1、 IL 6、 IL 8、コロニー 刺激因子などのサイト力イン合成および産生の誘導が挙げられる。また、全身的に高 濃度な TNF— aは、敗血症ショックや、自己免疫疾患を誘導する。
[0030] また、生物学的に活性なヒト TNF— aは、 3つの同じポリペプチド 'サブユニットが 3 回転軸対称で強く結合したホモトリマー (ホモ 3量体)である。モノマーは生物学的に 不活性であり、 17. 3kDaの分子量をもつ。なお、 TNF— αの特性については、下 記の表 1にまとめている。
[0031] [表 1]
Figure imgf000010_0001
[0032] 上記ヒト TNF— aとしては、具体的には、 NCBIァクセシヨン番号 CAA26669や、 NP— 000585に登録されて!、るアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモ 3量体を挙 げることができる。
[0033] 本発明において用いるヒト TNF— αを取得する方法は特に限定されるものではな いが、例えば、市販品を購入することにより取得することができる。また、従来公知の 遺伝子組み換え技術等を用いて製造して用いてもよい。例えば、上記例示したァミノ 酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現 可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたポリペプチドを精製する等の 方法により製造することができる。さらに、市販されているペプチド合成器等を用いて 化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を利用して合成したりすることもできる
[0034] さらに、本発明においては、上記例示した TNF— aのアミノ酸配列において、 1個 または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列 からなり、かつ上述したようなヒト TNF— αの生理活性を有するポリペプチド、換言す れば、変異ヒト TNF— aをヒト TNF— aとして用いることもできる。
[0035] このような変異ヒト TNF— aの取得方法も特に限定されるものではなぐ例えば、部 位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995)他）、 PCR 法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるい はトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製 法を用いて製造することにより、取得することができる。 [0036] また、本発明においては、上述したヒト TNF— aや変異ヒト TNF— aに加えて、そ れらのペプチド断片を抗原として用いてもよい。このようなペプチド断片を得る方法も 特に限定されるものではない。例えば、上述しような方法で取得したヒト TNF— aや 変異ヒト TNF— aを適当なプロテアーゼを用いて目的とするペプチド断片が得られ るように切断すればよい。また、予め設計したペプチド断片をコードする遺伝子を上 述したように従来公知の方法で発現させることにより製造してもよい。また、市販され て ヽるペプチド合成器等を用いて化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を 利用して合成したりすることもできる。
[0037] 以上のようなヒト TNF— αやそのペプチド断片を抗原として用いることにより、後述 する本発明に力かる抗体酵素を製造することができる。
[0038] < 2.本発明にかかる抗体酵素 >
本発明にかかる抗体酵素は、ヒト TNF— aに対する抗体または当該抗体の断片で あって、かつ、当該 TNF— αを分解する活性を有する抗体酵素であればよい。
[0039] 本明細書において、「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであ り、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「ス 一パー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を 完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（Super Catalytic A ntioody [I]： Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E.， Okamoto, Y" Uda, T" J. Biosci. Bioeng., 88 (3) , 323-327 (1999)を参照）。つま り、本発明にかかる抗体酵素は、 TNF— αを抗原とする抗体であり、当該 TNF— a を完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれるものである。また、本明細書に おける「抗体酵素」には、抗体の断片であって、当該抗体の抗原を認識し、当該抗原 を分解する活性を有するものも含まれる。
[0040] また、本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体を構成する各ペプチド鎖、例え ば、軽鎖 (以下、「L鎖」ともいう）や重鎖 (以下、「H鎖」ともいう）を意味する。さらに、「 抗体の断片」には、上記各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片、例えば、軽 鎖可変領域や重鎖可変領域、およびそれら可変領域を含むペプチド断片も含まれる [0041] 本発明に力かる抗体酵素は、ヒト TNF— aに対するポリクロナール抗体であっても よいが、ヒト TNF— aに対するモノクローナル抗体であることがより好ましい。これによ り、当該 TNF— aに対する特異性の高い抗体酵素を得ることができる。
[0042] また、本発明に力かる抗体酵素が認識する TNF— aは、ヒト TNF— aに限定され るものではなぐヒト TNF— aに加えて、その他のあらゆる生物由来の TNF— αを認 識してちよい。
[0043] 本発明に力かる抗体酵素は、ヒト TNF— aに対する抗体または当該抗体の断片で あると同時に、当該 TNF— αを分解する活性を有する。すなわち、本発明にかかる 抗体酵素は TNF— αを特異的に認識する抗体としての性質と、認識した TNF— a を切断および Zまたは分解する酵素としての性質を併せ持つ。それゆえ、 TNF- a の分解活性を有さない抗体では、抗体 1分子に対して、 1分子または 2分子の TNF aが結合するだけであるが、本発明の抗体酵素では、抗体酵素 1分子に対して、 TNF— αが次力 次に結合しては分解されるという反応を繰り返す。したがって、本 発明にカゝかる抗体酵素の TNF— aを分解する能力は、 TNF— aの分解活性を有さ な 、抗体のそれの数百倍あるいは数千倍に達する。
[0044] このように、 TNF- aに対する高い分解活性を有する本発明の抗体酵素を生体に 投与することにより、 TNF- aが過剰に産生された場合であっても、 TNF- aの過 剰な蓄積を抑制することができ、 RAや COPDのような TNF— αの過剰産生が発症 の原因となる疾患の予防や治療に寄与することが期待できる。すなわち、本発明に は、本発明にかかる抗体酵素を含み、生体内における TNF— α量の増加を抑制す ることができる薬学的組成物も含まれる。
[0045] また、本発明にかかる抗体酵素は、抗体であると同時に酵素であるため、酵素セン サの構築が可能である。このように、本発明にかかる抗体酵素は、抗原の分解活性を 有さない通常の抗体よりも応用範囲が広い。なお、本発明にかかる抗体酵素の酵素 活性は、ヒト TNF α以外に、他の生物由来の TNF αをも切断および Ζまたは 分解するものであってもよ 、。
[0046] 本発明に力かる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ま 、。なお、「 触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む 3つのアミノ酸残基が活性部位に 含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことをいう。この触媒三つ組残基 構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテア一 ゼと呼ばれる。したがって、本発明にかかる抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種で あるということもできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロ テアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タン ノ ク質を切断および Zまたは分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、 その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断お よび Zまたは分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリ ン残基と、ァスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構 造上近接して存在することを明らかにした (例えば特開 2004— 97211号公報（平成 16年 4月 2日公開)参照)。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基 と、ァスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基との C a間の距離 力 少なくとも 3〜20Aの範囲内、好ましくは、 3〜： L0Aの範囲内にあることを意味す る。
[0047] 本発明にかかる抗体酵素が、上記「触媒三つ組残基構造」を有するか否かを調べ る方法は、特に限定されるものではない。例えば、 X線回折による立体構造決定法の ように、実際に当該抗体酵素の立体構造を決定する方法を用いて、「触媒三つ組残 基構造」の有無を調べることができる。また、当該抗体酵素の一次構造、すなわち当 該抗体酵素のアミノ酸配列をもとに、タンパク質の立体構造予測ソフトウェアを用いて 、当該抗体酵素の立体構造を予測することによって、「触媒三つ組残基構造」の有無 を調べることちでさる。
[0048] 上記抗体酵素は、上記 TNF— aに対する抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変 領域の少なくとも一方を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成 する H鎖および L鎖のうち、 N末端力も約 110残基のアミノ酸力もなる部分のことであ る。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素 としての活性を有する場合にその活性中心が含まれて 、る可能性が高 、。それゆえ 、本発明にかかる抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有し ていると予測できる。 [0049] 本発明にお 、て、上記軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ヒト TNF— aに対 する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域であればよぐ特に限定されるものではな 、 。上記軽鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、例えば、（a)配列番号 1に示さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および (b)配列番号 1のアミノ酸配列にお!、 て、 1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたァミノ 酸配列からなり、かつ上記 TNF—ひを認識し、当該 TNF—ひを分解する活性を有 するポリペプチドを挙げることができる。
[0050] また、上記重鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、（c)配列番号 2に示され るアミノ酸配列力 なるポリペプチド、および (d)配列番号 2のアミノ酸配列にぉ 、て、 1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ上記 TNF—ひを認識し、当該 TNF—ひを分解する活性を有するポ リペプチドを挙げることができる。
[0051] なお、本明細書において、「1個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作 製法により置換、欠失、挿入、および Zまたは付加できる程度の数 (好ましくは 10個 以下、より好ましくは 7個以下、さらに好ましくは 5個以下)のアミノ酸が置換、欠失、挿 入、および Zまたは付加されることを意味する。このように、上記 (b)および (d)のポリ ペプチドは、それぞれ、上記 (a)および (c)のポリペプチドの変異体であるといえる。 なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導 入された変異を意味する力 自然発生的に生じた変異であってもよい。
[0052] 上述したように、本発明にかかる抗体酵素は、その一実施形態として、上記 TNF—
αに対する抗体の軽鎖可変領域および Zまたは重鎖可変領域を含んでなるもので ある。したがって、本発明に力かる抗体酵素の具体例としては、上記例示したポリべ プチドを挙げることができる。なお、配列番号 1に示すアミノ酸配列は、後述する実施 例にお 、て製造した抗体酵素である ETNF— 6抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列 であり、配列番号 2に示すアミノ酸配列は、当該抗体酵素である ETNF— 6抗体の重 鎖可変領域のアミノ酸配列である。図 13に ETNF— 6抗体の軽鎖可変領域のァミノ 酸配列を、図 11に ETNF— 6抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図 13に 示すように、 ETNF— 6抗体の軽鎖可変領域は、下線を付して示す 3つの相補性決 定領域（complementarity determing region,以下「CDR」ともいう）、具体的には CDR 1、 CDR2、 CDR3を有している。すなわち、 ETNF— 6抗体の軽鎖可変領域は、配 列番号 1に示されるアミノ酸配列の 24番目から 38番目のアミノ酸配列からなる CDR1 、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 54番目から 60番目のアミノ酸配列からなる C DR2、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 93番目から 101番目のアミノ酸配列から なる CDR3を有する。
[0053] また、図 11に示すように、 ETNF— 6抗体の重鎖可変領域もまた、下線を付して示 す CDR1、 CDR2、 CDR3を有している。すなわち、 ETNF— 6抗体の重鎖可変領 域は、配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 31番目力 35番目のアミノ酸配列力 な る CDR1、配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 50番目から 66番目のアミノ酸配列か らなる CDR2、配列番号 2に示されるアミノ酸配列の 99番目カゝら 108番目のアミノ酸 配列からなる CDR3を有する。
[0054] また、本発明に力かる抗体酵素には、ヒト TNF— aに対する抗体の断片であって、 上記抗体の可変領域を含み、かつ、 TNF— aを認識し、当該 TNF— aを分解する 活性を有する抗体の断片が含まれる。上記可変領域は、重鎖可変領域であっても、 軽鎖可変領域であってもよい。また、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、か 力る可変領域をヒトその他の動物の抗体に移植してキメラ抗体を作製するために好 適に用いることができる。
[0055] 本発明において用いることが可能な抗体の断片としては、例えば、上述の（a)〜（d )のいずれかのポリペプチドや、これらのポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗体の断 片を挙げることができる。
[0056] また、本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。本発明にかかる 遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号 3または 4に示される塩基配列から なる遺伝子、またはこれらを含む遺伝子を挙げることができる。配列番号 3に示される 塩基配列は、後述する実施例において製造した抗体酵素である ETNF— 6抗体の 軽鎖可変領域をコードする遺伝子であり、配列番号 4に示される塩基配列は、上記 E TNF— 6抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子である。 [0057] 本発明にかかる遺伝子を適当な宿主に発現可能に導入することにより、本発明の 抗体酵素を宿主内で発現させることができる。また、本発明の抗体酵素の可変領域、 またはその CDRを組み込んだ可変領域は、そのまま発現させてもよいが、定常領域 をコードする遺伝子と連結してキメラ抗体酵素として発現させることもできる。
[0058] なお、本明細書にぉ 、て「遺伝子」との用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「 核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意 味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、 2本鎖 DNAのみならず、そ れを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖と 、つた各 1本鎖 DNAや RNA (mRNA 等)を包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外 に、非翻訳領域 (UTR)の配列やベクター配列 (発現ベクター配列を含む。）等の配 列を含むものであってもよ 、。
[0059] 「DNA」には、例えばクローニングゃィ匕学合成技術、またはそれらの組み合わせで 得られるような cDNAやゲノム DNA、プラスミド DNA等が含まれる。すなわち、 DNA とは、真核生物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む 「ゲノム」形 DNAであってもよいし、原核生物由来のイントロンなどの非コード配列を 含まない「ゲノム」形 DNAであってもよい。また、逆転写酵素やポリメラーゼを用いて mRNAを経て得られる cDNA、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まな！/ヽ「 転写」形 DNAであってもよい。また、細胞がゲノム DNAとは別に保持しうる低分子量 の環状 DNAである「プラスミド」形 DNAであってもよ!/、。
[0060] また、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチドおよび Zまたは修飾ヌクレオチド 力もなるポリヌクレオチド、例えば cDNA、 mRNAおよび hnRNAを含む全 RNA等が 含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、ァセチルシチジン、メチルシチジン、メ チルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の 作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
[0061] 「塩基配列」との用語は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デォキシリボヌクレオ チド (それぞれ A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレ ォチドまたはポリヌクレオチドの「塩基配列」は、 DNA分子またはポリヌクレオチドに 対してのデォキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そして RNA分子またはポリヌクレ ォチドに対してのリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび U)の対応する配列（ここで特定さ れるデォキシヌクレオチド配列における各チミジンデォキシヌクレオチド (T)は、リボヌ クレオチドのゥリジン (U)によって置き換えられる）を意図する。
[0062] また、本発明に力かる遺伝子は、配列番号 3または 4に示される塩基配列と必ずし も同一である必要はなぐ配列番号 3または 4に示される塩基配列からなる DNAと相 補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下でハ イブリダィズし、かつ、 TNF—ひを認識し、当該 TNF—ひを分解する活性を有する 抗体酵素をコードする遺伝子であってもよ ヽ。
[0063] 上記「ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下でハイブリダィズ」するとは、少 なくとも 90%の同一性、好ましくは少なくとも 95%の同一性、最も好ましくは少なくとも 97%の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダィゼーシヨンが起こることを 意味する。 「ストリンジェントなノ、イブリダィゼーシヨン条件」の具体的な例として、例え ば、ハイブリダィゼーシヨン溶液（50%ホルムアミド、 5 X SSC (150mMのNaCl、 15 mMのクェン酸三ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンハート液 、 10%硫酸デキストラン、および 20 /z gZmlの変性剪断サケ精子 DNAを含む）中に て 42°Cでー晚インキュベーションした後、約 65°Cにて 0. 1 X SSC中でフィルターを 洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダィゼーシヨンは、 J.Sambroo k et al. Molecular Cioning'A Laboratory Manual, 2d Ed.,し old Spring Harbor Laborat ory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定さ れるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高 くなる (すなわち、ノ、イブリダィズし難くなる)。
[0064] < 3.本発明にかかる抗体酵素の製造方法〉
本発明に力かる抗体酵素は、例えば、 TNF— αを抗原ペプチドとして、免疫したマ ウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融 合させてなるハイプリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造する ことができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖 とに分離すればよい。また、本発明の抗体の断片を得る場合には、まず該当するモノ クローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを 用いて目的とする抗体の断片が得られるように切断すればよい。また、ファージデイス プレイ法で得られる抗体であってよ!/、。
[0065] モノクローナル抗体の取得は通常のハイプリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C,
Nature 256, 495-497(1975))、トリオ一マ法、ヒト B—細胞ハイプリドーマ法（Kozbor, I mmunology Today 4, 72(1983))、 EBV—ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies an d Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77- 96(1985))等により行なわれる。
[0066] また、上記抗原ペプチドには、上述した TNF— aまたは TNF— aのペプチド断片 を用いればよい。
[0067] さらに、アミノ酸配列が明らかになつている抗体酵素については、従来公知の遺伝 子組み換え技術等を用いて本発明の抗体酵素を製造することができる。この場合、 上記抗体酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発 現可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製する等の 方法を用いることができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターと ともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率 よく製造することができる。
[0068] また、上述の（b)または（d)のポリペプチドのように、変異型のポリペプチドを作製す る方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘 発法（Hashimoto- Gotoh, Gene 152,271- 275(1995)他）、 PCR法を利用して塩基配列 に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入 による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。 これら方法を用いることによって、上記（b)や（d)のポリペプチドをコードする cDNA の塩基配列において、 1または数個の塩基が置換、欠失、挿入、および Zまたは付 カロされるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異型のポリべ プチドの作製には、市販のキットを利用してもよい。
[0069] さらに、本発明に力かる抗体酵素の取得方法は、上述に限定されるものではなぐ 例えば、市販されて ヽるペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよ い。また別の方法としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかか る遺伝子から本発明に力かるポリペプチドを合成してもよ ヽ。 [0070] く 4.本発明にかかる形質転換体〉
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかる遺伝子が導入された形質転換体 である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法 (遺伝子操作 技術）により、対象細胞 (宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また 、上記「形質転換体」とは、細胞 ·組織 '器官のみならず、生物個体を含む意味である
[0071] 本発明に係る形質転換体の作製方法 (生産方法）は、本発明にカゝかる遺伝子を含 む組換え発現ベクターを形質転換する方法を挙げることができる。
[0072] 上記組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用い ることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用い て行えばよい。
[0073] ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなぐ宿主 (ホスト)細胞中で発 現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確 実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にか 力る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればょ ヽ 。力かる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスべク ター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、ェピソ一ムベクター、及びウィルス由 来ベクター（例えば、細菌プラスミド、ノ クテリオファージ、酵母ェピソ一ム、酵母染色 体エレメント、ウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィル ス、アデノウイルス、トリボックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、及びレトロウイルス）、 並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド)を利 用可能である。
[0074] より具体的には、細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、 pQE70 、 pQE60、及び pQE—9 (Qiagenから入手可能）； pBSベクター、 Phagescriptベクタ 一、 Bluescriptベクター、 pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A (Stratageneか ら入手可能）；並びに ptrc99a、 pKK223— 3、 ρΚΚ233— 3、 pDR540、 pRIT5 (Ph rmaciaから入手可能）が含まれる。
[0075] また、好ましい真核生物ベクターの中には、 pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 p XT1、及び pSG (Stratageneから入手可能）；並びに pSVK3、 pBPV、 pMSG、及び pSVL (Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
[0076] 植物における使用に好ましいベクターの中には、例えば、プラスミド「ρΒΙ121」、「p BI221」、「pBI101」（いずれも Clontech社製）、「pTA7001」、「pTA7002」(Aoyam aら (1997) Plant J. 11:605)、「pPZP211」（Hajdukiewicz et al" Plant Mol. Biol. 25:9 89(1994)などが含まれる。
[0077] また、形質転換の対象となる生物 (宿主生物)も特に限定されるものではなぐ従来 公知の各種生物およびそれら由来の細胞を好適に用いることができる。適切な宿主 の代表的な例としては、菌体（例えば、 E. coli細胞、 Streptomyces細胞、及び Salmone 11a typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、 Drosophila S2細胞及び Spodoptera Sf9細胞）；動物細胞（例えば、 CHO細胞、 COS細胞、及 び Bowes黒色腫細胞）；並びに植物細胞（例えばシロイヌナズナ、タバコなどの双子 葉植物、イネ、ォォムギなどの単子葉植物）が挙げられる。
[0078] 本発明にカゝかる好ま ヽ形質転換体としては、本発明にカゝかる遺伝子を、公知の 遺伝子工学的手法 (遺伝子操作技術）により、宿主細胞に発現可能に導入した形質 転換体が挙げられる。
[0079] さらに、形質転換する方法についても特に限定されるものではなぐ宿主生物の種 類に応じた従来公知の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、 DE AEデキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフエクシヨン法、感染法、ポリエチレ ングリコール法、エレクト口ポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、パーティクル ガン法、リボソーム法、適切なベクター系を用いた導入法等を例に挙げることができる
[0080] このようにして得られる形質転換体は、本発明に力かるポリペプチドを産生すること ができる。これらポリペプチドは、従来公知の方法により、当該形質転換体生物から 抽出、精製することができる。
[0081] 当該ポリペプチドを抽出、製造する方法は、特に限定されるものではなぐ従来公 知の方法を用いることができる。例えば、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰 イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎 水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、ヒドロキシァパタ イトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組 換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。
[0082] なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなぐ特許請求の範囲 に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された 技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲 に含まれる。
実施例
[0083] 本発明について、実施例および図 1〜図 21 (d)に基づいてより具体的に説明する 力 本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱すること なぐ種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、実施例における抗体 の力価、抗体産生細胞（ハイブリドーマ）のクローニングは以下の方法に従って行つ た。
[0084] 〔ELISAによる力価測定〕
抗原 (TNF- a )を PBSに溶解し、 4 μ g/mlの抗原溶液を調整した。 96穴ィムノプ レートに上記抗原溶液を 50 1ずつォクタピペットを用いて入れた。その後、 4°Cで一 晚反応させた (コーティング)。
[0085] 翌日、プレートを室温に戻し、ィムノウォッシャーを用いて 0. 05%の Tween20を含 む PBS (以下、「PBS— T」ともいう）でプレートを 2回洗浄した。洗浄したプレートをキ ムタオルの上に逆さに置き、軽く叩いてゥエルの中の水分を除去した。全てのゥエル に 2%ゼラチン/ PBSを 130 1ずつ入れ、 30〜60分間、室温でインキュベーション した（ブロッキング）。
[0086] ブロッキングの間に、一次反応の準備を行った。免疫マウスから採血を行った抗血 清をまず 1Z50に希釈し、そこから 3倍連続希釈を 7点行い、 1サンプルにっき 8種類 の希釈液を作製した。また、未処理マウスの血清も同様に希釈を行い、コントロールと して使用した。
[0087] ブロッキング後、 PBS— Τでプレートを 2回洗浄し、水分を除去した。その後、ブロッ キング中に作製したそれぞれの血清希釈液を 50 1ずつゥエルに入れ、 60分間イン キュベーシヨンした（一次反応)。
[0088] 一次反応後、 PBS— Tでプレートを 2回洗浄し、水分を除去した。次に、 PBS— Tで 希釈調製したアルカリフォスファターゼ (ALP)標識抗マウス抗体を 50 μ 1ずつゥエル に入れ、 60分間室温でインキュベーションした（二次反応)。
[0089] 二次反応後、 PBS— Τでプレートを 2回洗浄し、水分を除去した。次に、 ALP基質 タブレットを ALP基質緩衝液で溶かし、各ゥエルに 100 1ずつ入れ、 30分間インキ ュベーシヨンした。インキュベーション後、 λ =405nm、 λ =620nmに設定したィ
1 2
ムノリーダーで吸光度を測定した。 X軸に抗体の希釈割合 (Dilution)、 Y軸に吸光度 をとつたグラフを作成し、力価を測定した。
[0090] 〔限界希釈法によるクローニング〕
まず、 6ml滅菌チューブおよび 14ml滅菌チューブを各 2本ずつ用意した。 6ml滅 菌チューブの一方を A、もう一方を Bとした。 14ml滅菌チューブの一方には HCF添 加 HAT培地を 3. 9ml分注し、もう一方には HCF添加 HAT培地を 2. 4ml分注した 。 HCF添加 HAT培地を 3. 9ml分注したチューブを C、 2. 4ml分注したチューブを Dとした。
[0091] クローユングしたいゥエルの細胞をマイクロピペットでピペッティングし、その懸濁液 力ら 50 μ 1を Αに人れた。
[0092] これとは別に、上記懸濁液から 50 μ 1を採取し、トリパンブルー 50 μ 1と混合した後、 血球計算盤で細胞数をカウントした。その計測した結果を用いて、最終的な細胞濃 度が 2 X 103個/ mlになるように、必要量の HAT培地を Bに入れた。
[0093] 次に、上記 Aに lmlの HAT培地をカ卩え、そこ力 100 μ 1を上記 Βに移し、よくピぺ ッティングを行った。その後 Βから 100 1を採取し、それを Cに移し、ピペッティングを 行った。その後、 C力も 600 1を採取し、それを Dに移し混合した。このようにして得 られた Cおよび Dに入った細胞懸濁液をそれぞれ 100 μ 1ずつ 96穴プレートに分注し 、インキュベーターで培養を開始した。 7日後に培地の添加を行い、その後は、 3日ご とに培地の交換を行った。
[0094] 7日目を過ぎたあたり力もコロニーのチェックを行 、、コロニーが形成されたゥエルの スクリーニングを行った。スクリーニングの結果、同じプレート内で TNF— aに対して 最も反応が高いシングルコロニーをクローユングした。コロニーが形成されたゥエルが 全て陽性になるまで、上記の方法でスクリーニングとクローユングとを繰り返し行った
[0095] 〔実施例 1：抗 TNF— a抗体の製造〕
(1.マウスの免疫）
免疫に用いた抗原タンパクとして、 Recombinant Human TNF- a (Strathmann Biote c AG社製, hTNFa-1000,Lot.090590)を用いた。また、免疫する動物として、 BalbZc マウス (雌 6週齢)を 2匹用いた。
[0096] まず、クリーンベンチ内に FCA (Freund' s complete adjuvant)、抗原（Recombinant Human TNF- α )、ルアーロック式シリンジを 2本、注射針（19G)を 2本、および三方 活栓を用意した。上記シリンジに注射針をセットし、 FCAを必要量より少し多めにとり 、三方活栓に取り付けた。 0. 5mg/mlに調製した抗原を FCAと同様にシリンジにと り、三方活栓に取り付けた。三方活栓で繋いだシリンジをクリーンベンチ力も取り出し 、抗原側、 FCA側それぞれのシリンジ先端に残った空気を抜いた後に、 water in oil の要領で FCAと抗原とを混合した。 2本のシリンジをそれぞれ交互に押し、 FCAと抗 原とをよく混合した。その後、 4°Cで静置した。 白い乳液状になるまでこの操作を繰り 返し、 FCAと抗原とを混合した。
[0097] 次に、片方のシリンジに混合した溶液を集め、シリンジを三方活栓力も外し 25Gの 注射針を取り付けた。マウスの腹部をアルコール綿で拭いて消毒し、腹部皮下の 2箇 所に 100 1ずつ投与した。なお、注射針はマウスごとに交換しな力つた。また、マウ ス 1匹あたりの抗原投与量は 50 gであった。
[0098] 免疫注射から 10日後にマウスの採血を行い、上述の手順で、 ELISA法により力価 測定を行った。
[0099] 初回免疫力も約 2週間後に追加免疫を行った。 2回目からは不完全フロイントアジ ュバント (FIA)を用いた。免疫方法は初回免疫と同様とし、マウス 1匹あたりの抗原投 与量は 50 gとした。追加免疫から 10日後、眼窩静脈叢より採血を行い、 ELISA法 により力価測定を行った。
[0100] 同様の方法で、マウス Iには、さらにもう 1回追加免疫 (合計 3回目免疫）を行い、力 価測定を行った。また、マウス IIについては、さらに 2回追加免疫 (合計 4回目免疫）を 行った。
[0101] 追加免疫後、力価が十分上がったマウス（3回目免疫後のマウス I、 4回目免疫後の マウス II)に最終免疫を行った。最終免疫は滅菌 PBSで 0. 5mgZmlに調製した抗 原をマウス尾静脈または腹腔内に投与した。なお、本実施例の免疫スケジュールを 表 2に示す。
[0102] [表 2]
表 2 免疫スケジュール
Figure imgf000025_0001
[0103] 上記のように免疫したマウス力 採取した血清の力価測定結果を図 1〜図 5に示す 。図 1〜図 5に示すように、マウス I、 IIともに順調に力価が上がり、 3回目免疫後には 細胞融合が可能な力価まで上がった（図 3を参照)。マウス IIについては、最終免疫 後の力価は、 4回目免疫後力価よりも落ちていたが、細胞融合するのに十分な力価 を保っていた（図 4および図 5を参照）。
[0104] こうして得られた免疫マウスを用いて、最終免疫の 3〜4日後に後述の細胞融合を 行った。
[0105] (2.細胞融合）
上記免疫マウスの首を切断することにより全採血を行った。採取した血液は 4°Cに 一晚静置後、翌日、 3000rpm、 4°Cで、 10分間遠心分離を行うことにより、血清を回 収し、力価測定を行った。その結果を表 3に示す。
[0106] [表 3]
表 3 最終免疫後のマウス力価
Figure imgf000026_0001
[0107] 次に、上記マウスを消毒して解剖後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を洗浄用 ME M培地が 5ml入ったシャーレに移した。脾臓に付着して ヽる脂肪などの余分な組織 を取り除き、洗浄した。洗浄した脾臓を新しい MEM培地が 5ml入ったシャーレに移 し、擦りガラス板で脾臓をまず 3等分した。擦りガラスを 2枚合わせて、 3等分にした脾 臓を 1つずつ擦りながら脾細胞を取り出し、シャーレに入れた。
[0108] 次に、上記脾細胞を、 50ml遠心チューブの上にのせたろ過フィルターに注いだ。
さらに上記脾細胞が入って 、たシャーレを 5mlの MEM培地で共洗 、し、上記脾細 胞がシャーレに残らないよう遠心チューブに移した。その後、上記脾細胞を 1400rp mで 6分間遠心分離した（1回目の洗浄)。脾細胞の遠心分離を行っている間に、予 め培養して 、たミエローマ細胞（NS— 1)を回収し、 50mlの遠心チューブに移した。 上記脾細胞の遠心分離が終了後、上記ミエローマ細胞を 1400rpmで 6分間遠心分 離した (培地の除去)。
[0109] 1回目の洗浄を終えた脾細胞の上清をァスピレーターで吸引除去し、 30mlの ME M培地をピペッティングしながら加え、ペレットをほぐした。上記ミエローマ細胞につ Vヽても同様に上清を吸引除去し、 30mlの MEM培地で懸濁した。
[0110] 上記のように懸濁した脾細胞およびミエローマ細胞を 1400rpmで 6分間遠心分離 した (脾細胞は 2回目の洗浄、ミエローマ細胞は 1回目の洗浄)。遠心分離終了後、脾 細胞およびミエローマ細胞の上清を吸引除去し、 30mlの MEM培地で懸濁後、 140 Orpmで 6分間遠心分離を行った (脾細胞は 3回目の洗浄、ミエローマ細胞は 2回目 の洗浄)。遠心分離後、上清を吸引除去し、 10mlの MEM培地に細胞を懸濁した。
[0111] 次に、脾細胞およびミエローマ細胞のそれぞれの懸濁液について、血球計算盤を 用いて細胞数をカウントした。その後、表 4に示すように、細胞数の比が脾細胞:ミエ口 一マ細胞 = 5 : 1になるように、必要なミエローマ細胞数を脾細胞が入った遠心チュー ブに移した。
[0112] [表 4]
表 4 細胞融合
Figure imgf000027_0001
[0113] 脾細胞およびミエローマ細胞の混合懸濁液を十分に撹拌後、 1400rpmで 6分間 遠心分離を行い、上清を除去した。上清除去後、遠心チューブを軽く叩きつけて、ぺ レットをほぐした。その後、ペレットの入った遠心チューブを激しく振り続けながら、 lm 1の PEGを 1分間かけて 1滴ずつゆつくりとカ卩えた。 PEGを添加後、さらに 1分間遠心 チューブを振り続けた。その後、遠心チューブを振り続けながら、 1mlの MEM培地を 1分間かけて加えた。再度、同様に lmlの MEM培地を 1分間かけてカ卩えた。次に、 遠心チューブを振り続けながら、 7mlの MEM培地を 3〜4分間かけてゆっくり加えた 。その後、 SOOrpmで 6分間遠心分離を行い、上清を吸引除去した。上清除去後、遠 心チューブを叩きつけてペレットをほぐした。その後、まず、 5mlの HAT培地をペレツ トに勢いよく吹き付け、ペレットを崩した。次に、マウス Iでは 33ml、マウス Πでは 57ml の HAT培地をピペッティングせずにカ卩えた。この細胞懸濁液を滅菌処理済の 96穴 プレートに 100 1ずつ播き、 37°Cの COインキュベーターで培養開始した。 3
2 〜4日 後に HAT培地を 5mlのピペットを用いて 2滴ずつ添カ卩した。そして、 7日後には培地 の交換を行った。
[0114] 細胞融合後の 7日目頃力もコロニー確認を行ったところ、最終的にマウス Iおよびマ ウス IIともに全てのゥエルでコロニー形成が確認された。すなわち、細胞融合効率は 1
00%であった (表 4を参照)。
(3.スクリーニングおよびクローユング）
そこで、それら全てのゥエルの上清を用いて、スクリーニングを行った。スクリーニン グは、上述した ELISA法による力価測定の方法の一部条件を変更した方法を用い て行った。変更点は、具体的には、（1)コーティングに使用する抗原を TNF ひの 他に、 HSAおよび IgG (濃度はどちらも 4 /z gZmlとした）を用いた、（2)コーティング 後の洗浄は行わず、ァスピレートのみを行った、（3)コロニーが確認できたゥエルの 上清を 96穴 U底プレートに入れ、 PBS—Tで 1Z2に希釈したものを一次反応に用 いた、（4)一次反応の陽性コントロールとして細胞融合時の抗血清を、陰性コント口 ールとして、 PBS— Tで 1Z2に希釈した HAT培地を用いた点である。一次スクリー ユングの結果、マウス Iでは陽性ゥエル数が 27ゥエル、マウス IIでは陽性ゥエル数は 9 ゥエルであった（表 5を参照）。そのうち、マウス Iの 14ゥエル、マウス IIの 9ゥエルにつ いて、上述の限界希釈法によるクローユングを行った。なお、 TNF— aに対して吸光 度が 0. 1以上のものを陽性とした。また、限界希釈法によるクローユングの結果、陽 性ゥエル 100%が 2回連続した株を、 TNF- aに対するモノクローナル抗体産生株（ 以下、「抗 TNF— α抗体産生ハイプリドーマ」ともいう）とした。
[0115] その結果、最終的に確立した抗 TNF— α抗体産生ハイブリドーマはマウス Iで 13 株、マウス Πで 4株の計 17株となった（表 5を参照）。これらのハイプリドーマを ETNF 1〜17とし、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を ETNF— 1〜17杭 体とした。
[0116] [表 5]
表 5 ヒト T N F 抗体産生細胞のスクリーニング状況
Figure imgf000028_0001
[0117] 次に、上記抗体 ETNF— 1〜17抗体について、 Iso Strip マウスモノクローナル抗 体ァイソタイピングキットを用いてアイソタイプ決定を行った。結果を表 6に示す。
[表 6]
表 6 各 E T N F抗体のアイソタイプ
Figure imgf000029_0001
[0119] (4.タンパク質との交差反応試験）
上記抗 TNF— α抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いて、 ETNF—1〜17 抗体の各種タンパクに対する反応性を ELISA法によって調べた。タンパク質には、 T NF— a、 TNF— β、ヒト IgA (図 6および図 7では H— IgAと表記する）、ヒト IgM (図 6および図 7では H— IgMと表記する）、ヒト IgE (図 6および図 7では H— IgEと表記す る）、ヒト血清アルブミン（図 8および図 9では HSAと表記する）、ヒトヘモグロビン（図 8 および図 9では H— hemoと表記する）、ゥシ血清アルブミン（図 8および図 9では BS Aと表記する）、 Keyhole Lympet Hemocyanine (図 8および図 9では KLHと表記する） を用いた。図 6〜図 9に示すように、 ETNF— 1、 3〜7、 9〜14抗体は高い反応特異 性を示した。 ETNF— 2および 16抗体はヒト IgAおよび IgEに対して交差反応した。 また、 ETNF— 8、 15、および 17抗体には非特異的な反応が認められた。
[0120] 〔実施例 2 : ETNF— 6抗体の可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列の決定〕 以下に示す方法で、実施例 1の抗 TNF— α抗体 (ETNF— 6抗体)の可変領域を コードする遺伝子の塩基配列を決定した。さらに、上記塩基配列から、当該抗 TNF α抗体の可変領域の推定アミノ酸配列を決定した。
[0121] (1.抗体産生細胞の培養） 抗 TNF— α抗体産生ハイブリドーマは、培養温度 37°C、 CO濃度 5. 5%で 20%
2
FCSを含む IMDM培地で 1 X 107〜5 X 107細胞が得られるまで培養した。培養後 の細胞培養液を 50ml遠心チューブに移し、 1400rpmで 6分間遠心分離すること〖こ より、細胞を回収した。培地をァスピレーターにて除去後、 10mlの PBSに懸濁し、 1 つのチューブにまとめて再度 1400rpmで 6分間遠心分離を行った。上清を吸引除 去後、再度 10mlの PBSに懸濁して血球計算盤を使用し細胞数をカウントした。
[0122] カウント後、 1 X 107〜5 X 107細胞分の細胞懸濁液を採取し、再度 1400rpmで 6 分間遠心分離を行った。上清を除去後、ペーパータオル上で逆さにし完全に液を切 つた。ァスピレートが不十分であれば、再度遠心し、マイクロピペットで残った PBSを 除去した。
[0123] (2. mRNAの抽出と精製）
mRNAの抽出 ίま QuickPrep mRNA purirfcation Kit mershampharmacia biotect) を用いて、推奨プロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
[0124] まず、 Extraction bufferを 37°Cのインキュベーターに約 30分間静置し、結晶を完全 に溶解させた。こうして得られた Extraction buffer 1. 5mlを上記（1.抗体産生細胞の 培養）で回収した細胞のペレットに添カ卩した。そして、 21Gの針に数回通すことで細 胞を破砕した。その後、その破砕溶液に 3mlの Elution bufferを加え、さらに細胞を破 砕した。こうして得られた破砕溶液を RNase freeの 1. 5mlマイクロチューブ 4本に分 注した。その後、室温（25°C)、 18000 X gで、 20分間遠心分離を行い、その上清を 後述の oligo(dT)- cellulose spin columnに添カ卩するサンプルとした。
[0125] mRNAの単離は、まず、 oligo(dT)- cellulose spin columnの榭脂を懸濁し、上下の キャップを外して 15ml遠心チューブにセットし、 1300rpmで 1分 45秒間遠心分離を 行って保存液を除去した。そして、下キャップを装着し、タンパク質および DNAが除 去された上記サンプル (上清）を 4ml添加した。その後、上キャップをしつかりと取り付 け、 oligo(dT)-cellulose spin columnの榭脂を懸濁した後、 10〜15分間、転倒混和し 、榭脂に mRNAを吸着させた。そして、上下のキャップを装着し、 1400rpmで、 1〜 2分間遠心分離を行った。その後、上のキャップを取り、 RNase freeのマイクロピペット を使用し、上清を除去した。そこに、 3mlの High-salt bufferを添カ卩し、緩やかに 2分間 ほど混和した。その後、上キャップを装着し、 1400rpmで 2分間遠心分離を行い、上 清を除去した。さらにこの操作を 2回繰り返した。
[0126] 次に、 3mlの Low-salt bufferを添カ卩して緩やかに 1〜2分間程度懸濁した後、キヤッ プを装着し、 15mlチューブに入れ、 1400rpmで、 2分間遠心分離を行った。そして 、生じた上清を除去した。その後、下のキャップを外し、スピンカラムの表面が平らに なるように、 3mlの Low-salt bufferを壁に添わせながら回し入れた。その後、 15mlチ ユーブに設置し、 1300rpmで、 2分間遠心分離を行った。
[0127] 次に、新しい 15ml遠心チューブを用意し、 mRNA回収用の 1. 5mlマイクロチュー ブ 2個の蓋をノ、サミで切断後、遠心チューブに重ねて入れ、溶出用チューブとした。 溶出用チューブにカラムを入れ、そこに 65°Cに加熱していた 0. 25mlの Elution buffe rを回し入れるように添カ卩した。その後、 1300rpmで、 2分間遠心分離を行った。この 操作を 2回繰り返した。溶出液は、 mRNA画分として 1. 5mlマイクロチューブ 2本に 回収し、氷上に静置した。別に定量用のマイクロチューブを準備し、 10 1の mRNA 画分を取り、 70 1の Elution bufferをカ卩え、希釈した (1/8希釈)。その希釈した溶液 を用いて、吸光度ブランクを Elution Bufferとして、 A および A を測定した。なお、
260 280
セルは測定前に予め、塩酸:メタノール = 1： 1の溶液に 1時間ほど浸し、 RNase free にし、 DEPC処理水で洗浄しておいた。また、 RNAの濃度は下記式を用いて算出し た。
[0128] RNAの濃度 gZml) =A X希釈率 X 40
260
次に、 2等分され、氷上に静置しておいた mRNA画分 (mRNA抽出溶液）に、 lZ 10量の 3M酢酸カリウム、 1Z50量のグリコーゲン、 2. 5倍量の 95%エタノールをカロ えて攪拌した。その後、 30°Cに約 40分間置き、その後、 4°C、 15000rpmで、 5分 間遠心分離した後、 80°Cで保存した。
[0129] なお、実験に用いたガラスおよび金属類 (実験器具）には、 240°Cで 2時間乾熱滅 菌したものを用い、プラスチック類の実験器具には RNase freeおよび DNase freeのも のを用いた。
[0130] (3. mRNAからの First strand cDNAの合成）
— 80°Cでエタノール沈澱の状態で保存していた mRNAを取り出し、 4°C、 15000r pmで 10分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去した。
[0131] その後、 1mlの氷冷した 75%エタノール（予め DEPC処理水で調製し、— 30°Cに 用意しておいた。）をペレットのない側からそっと加えてリンスし、 4°C、 15000rpmで 10分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、 15分 間真空乾燥を行 \ 0. 2 μ &/ μ 1となるように DEPC処理水を添加し 1時間静置し 溶解した。溶解後、確認のために、 mRNA溶液を DEPC処理水で A = 1前後にな
260
るように希釈し吸光度を測定した。 cDNAの合成は AMV Reverse Transcriptase First -strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)のプロトコールに準じて行った。以下にその方 法を示す。
[0132] RNase freeの 0. 2mlマイクロチューブに mRNA 2 μ g分の mRNA溶液を添カ卩した 。そのチューブに pd(T) primer (0. 5 μ g/ml)を 2 μ 1、 DEPC処理水を mRNA溶
12-18
液と合わせて 17 1となるように添加し、混合後、 70°Cで 10分間アニーリング処理を 行った。その後、氷上に置き、 0. 25M DTTを 1 μ 1、 RNase inhibitorを 1 μ 1、 5 X Rea ction bufferを 5 μ 1添加し、よく混合した。更に AMV— RTを 1 μ 1添カ卩し緩やかに攪 拌し、 41°Cで 60分間伸長反応を行った。処理時間終了後氷上に置き、反応を止め 、 — 30°Cに保存した。
[0133] (4. PCRによる抗体可変領域遺伝子の増幅）
Mouse Ig primer Kit (Novagen 、 NovaTaq Hot Start DNA Polymerase Kit (Novag en)を使用し、上記（3. mRNAからの First strand cDNAの合成）で得られた cD NAから、抗体遺伝子可変領域の増幅を行った。
[0134] まず、抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、 Positive Control, Neg ative Control, primerの本数分準備した PCRチューブのそれぞれに、 37. 25 μ 1の 滅菌超純水、 0. 5 1の 3， 一 Primer (最終濃度 5pmol)、 3 μ 1の 25mM MgCl (最終
2 濃度 1. 5mM)、 l ^ lO lOmM dNTPs (最終濃度 0. 2mM)、 5 1の 10 X NovaTaq Hot Start Buffer (最終濃度 1 X )、 0. 25 μ 1の NovaTaq Hot Start DNA Polymerase ( 最終濃度 1. 25U)をサンプルの本数 + 0. 5のスケールで混合した。）をカ卩えて、そこ に、 1 μ 1の 5，—Primer (最終濃度 5pmol)、 2 1の cDNA溶液を添カ卩した。なお、 Po sitive し ontroliま Mouse Ig primer Kitに付属のものを使用し、 Negative Controlに【ま 滅菌超純水を使用した。
[0135] 以上の組成物をよく混合し、 Biometra社 T- GRADIENT、 TaKaRa社 PCR Thermal cy cler PERSONALを使用し PCRを行った。反応条件として、 L鎖は 95°Cで 7分間のプ レヒート後、熱変性を 98°Cで 15秒間、伸長反応を 74°Cで 15秒間に固定し、ァニーリ ング温度を 70。C、 66。C、 62。C、 58。C、 54。C、および 50。Cと 6段階に 4。Cずつ下げ、る Step Down法を行った。なお、アニーリング時間は、 15秒間に固定した。上記の 3ステ ップを 5段階まで 3サイクルずつ行い、 6段階目を 10サイクル行った。 H鎖は 95°Cで 1 0分間のプレヒート後、熱変性を 94°Cで 1分間、アニーリング温度 50°Cで 2分間、伸 長反応を 72°Cで 2分間の 3ステップを 40サイクル行った後、 72°Cの伸長反応を 10分 間行った。 PCR終了後、ァガロース電気泳動により、抗体可変領域遺伝子の増幅を 確認した。
[0136] (5.抗体可変領域遺伝子のクローニング）
クローニングは、 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)を用いて、以下のようにして行 つた o
[0137] ァガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測される DNAの増幅を確認した PC R産物を 2 μ 1、 salt Solutionを 1 μ 1、および滅菌水を 2 μ 1、氷上にて PCRチューブに 分注し攪拌した。さら〖こ、 1 1の TOPO vectorを添加し緩やかに攪拌後、 30分間、室 温でライゲーシヨン反応させた。 30分間の反応後直ちに、上記 PCRチューブを氷上 に置き、反応を止めた。このようにして調製された反応液を以下「ライゲーシヨン反応 液」と称する。
[0138] 使用直前に 80°Cのフリーザーから One Shot TOP10 Chemically Competent E. c oli (Invitrogen)を取り出し氷上で溶解した。そこに、氷上に置いていた上記ライゲー シヨン反応液を 2 1カ卩え、氷上で 30分間インキュベーションし、コンビテントセル間に DNAを拡散させた。反応終了後、 42°Cで 45秒間、熱ショックを与えて DNAを取り 込ませ、氷上に戻し、 2分間静置した。そこに、予め、室温に戻しておいた 250 1の SOC培地をクリーンベンチ内でカ卩え、振盪（200rpm)しながら 37°Cで 1時間培養し た。
[0139] 1時間の培養中に、予め準備しておいたアンピシリンを含む LBプレート培地 1枚に 対し、 100 μ 1の lOOmM IPTGストックと、 20 μ 1の 50mgZml X— Galを塗り広げ、 15〜30分間乾燥させた。
[0140] 培養終了後、アンピシリン ZlPTGZX— GalZLBプレート培地に、培養後の大腸 菌液を 50 1、および 100 1の 2種類の濃度で塗り広げ、 37°Cでー晚培養した。
[0141] 翌日、形質転換後の青 Z白判定により DNA断片力 Sインサートされていると考えら れる白コロニーを 12コロニー選択し、偽陽性を除くため、さらに画線培養を行った。 画線培養では、形質転換後の大腸菌を培養したのと同様にアンピシリン ZIPTGZX — GalZLBプレート培地を使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、 37°Cでー晚培養した。
[0142] (6.プラスミド DNAの調製）
上記（5.抗体可変領域遺伝子のクローユング)で得られた大腸菌をアンピシリンを 含む LB液体培地で培養した。大腸菌培養液から 0. 75mlを取り、 0. 2mlの 80%グ リセロールと混合し、大腸菌のグリセロールストックとして一 80°Cで保存した。プラスミ ド DNAは残りの培養液を用いてアルカリ SDS法により調製した。
[0143] 残りの約 5. 25mlの培養液を 1. 5mlマイクロチューブ 6本に移し、 12000rpmで 1 分間、遠心分離して集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。そこに、 Solution l (50mM D—グルコース、 25mM Tris— HC1、 lOmM EDTA、 pH8. 0)を 100 1カロえてボ ルテックスにかけよく懸濁した。
[0144] そこに、 Solution II (0. 2M NaOH、 1% (w/v) SDS)を 200 μ 1加えて転倒混和 後、氷中に 5分間置き、 Solution ΠΙ (3Μ酢酸カリウム、 2Μ酢酸）を 150 1カ卩え、緩や かに撹拌した後、氷上に 5分間置いた。
[0145] そして、 4°C、 15000rpmで、 10分間遠心分離を行った後、沈殿が入らない様に注 意しながら上清を採り、新しい 1. 5mlマイクロチューブに移した。このとき得られ上清 と等量のフエノール ·クロ口ホルムを加えて攪拌した後、 4°C、 15000rpmで、 2分間 遠心分離した。さらに同じ作業を繰り返し、 2回のフエノール'クロ口ホルム処理を行つ た後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移した。そこに、 2. 5倍等量の氷冷エタ ノールをカ卩えて上下に振って攪拌し、— 70°Cで 5分間静置した。そして、 4°C、 1500 Orpmで、 10分間遠心分離を行った後、上清を除去した。そして、氷冷 70%エタノー ルを lmlカ卩え、ペレットをリンスし、 4°C、 15000rpmで 10分間遠心分離を行い、上清 を除去し、 15分間真空乾燥した。
[0146] 乾燥終了後、 45 μ 1の TE ( 10mM Tris— HC1、 ImM EDTA)緩衝液に、ペレット を溶解し、 RNase A溶液（5mgZml RNase A、 lOmM Tris— HC1、 15mM NaCl、 pH7. 5)を 5 /z lカ卩えた (終濃度：50 /ζ 8Ζπι1)。その後、 2本のチューブの溶液を 1本 のチューブにまとめ、 37°Cで 1時間反応させた。
[0147] 反応終了後、 2Z3等量の PEG ( 13% (wZv) PEG6000、 0. 8M NaCl)を入れ、 氷上に 1時間以上置いた。その後、 4°C、 15000rpmで、 15分間遠心分離を行い、 上清を除去した。そこに、 70%エタノールを lmlカ卩えてリンスし、 4°C、 15000rpmで 、 10分間遠心分離を行った。
[0148] 上清を除去後、真空乾燥し、 1サンプルにっき 50 μ 1の滅菌水に溶解し、 1本のチュ ーブにまとめプラスミド溶液とした。そして、ァガロース電気泳動によるバンド比較にて サンプルの DNA濃度を推測した。
[0149] (7.塩基配列の決定）
Thermo Sequenase Cy 5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用い て、塩基配列の決定を行った。 A、 C、 G、および Tの 4種類の塩基用に、 PCRチュー ブを用意し、 d(N)TP/Cy5.5- dd(N)TPを各サンプル分、 1 1ずつ分注した。
[0150] 次に、 DNAZプライマーミックスの調製を行った。（6.プラスミド DNAの調製）で調 製された 1. 5 μ gの DNA、 3. 5 μ 1の Reaction Buffer, 1 μ 1の TOP013 Reverse (4p mol/ μ 1) (Invitrogen)、および 2 μ 1の Thermo Sequenase ( 10U/ μ 1)を混合し、さ らに滅菌超純水を添カ卩して全量が 31. 5 1となるようにした。これを上記の PCRチュ ーブに 7 ΐずつ分注し、すみやかに Biometoraサーマルサイクラ一にセットし、 95°C で 30秒間、 58°Cで 30秒間、および 72°Cで 120秒間の反応サイクルを 30サイクル行 い、 4°Cで冷却し反応を停止させた。
[0151] 反応終了後、サンプルを PCRチューブから 1. 5mlのマイクロチューブに移し、 20 mgZmlグリコーゲンを 1 μ 1、 7. 5Μ酢酸アンモ-ゥムを 2 μ 1、および 98%エタノー ルを 30 1添カ卩し、よく混合した。 10分間氷上で静置した後、 12000rpmで 20分間 遠心分離した。その後、キムワイプ上でデカンテーシヨンにより上清を除去し、 70%ェ タノールを 200 1添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして 12000rp mで 10分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットを使用し、上清を丁寧に除去 した。そして、遮光してペレットを乾燥させ、 6 μ 1の Loading Dyeに溶解し、 72°Cで、 3 分間熱処理を行い、 LONG-READ TOWER™ System (Amersham Pharmacia Biotech .)に各 2 1ずつローデイングし、解析を行った。得られた塩基配列は、
DNASISソフトウェアを使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
[0152] その結果、抗 TNF— a抗体である ETNF— 6抗体の L鎖および H鎖の可変領域を コードする cDNAは、それぞれ、配列番号 3および配列番号 4に示される塩基配列か らなることが分力つた。また、 ETNF— 6抗体の L鎖および H鎖の可変領域の推定アミ ノ酸配列は、配列番号 1および配列番号 2に示されるアミノ酸配列であった。
[0153] 〔実施例 3 : ETNF— 6抗体の可変領域の立体構造予測〕
実施例 2で決定した塩基配列力 推定した ETNF— 6抗体の可変領域のアミノ酸 配列（配列番号 1および配列番号 2を参照）をもとに、 AbM (Oxford Molecular, Oxfo rd、 UK)により目的抗体 CDR領域のループ構造と FR領域の立体構造を予測した。 AbMで予測された立体構造をもとに、 InsightII/Discover3 (Molecular Simulatoin、 US A)により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
[0154] さらに、 PPC Protein AdviSer (FQS、 Japan)を用いて、立体構造中のセリンプロテア ーゼの触媒三つ組み残基を構成する Ser、 Hisおよび Aspの残基群を探索した。そ の結果を図 10〜図 13に示す。
[0155] 図 10および図 12は、それぞれ ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖の予測立体構造 を模式的に示す図である。また、図 10および図 12には、触媒三つ組残基を構成す ると思われるアミノ酸残基（Ser、 His, Asp)が記載されている。また、図 10および図 1 2では、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖のそれぞれの CDR1〜3をリボンで表現し ている。
[0156] 図 11および図 13は、それぞれ、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖のアミノ酸配列を 示すものであり、 ETNF— 6抗体のH鎖ぉょびL鎖それぞれのCDR1〜3には、下線 が付されている。
[0157] 図 10および図 11に示すように、 H鎖については、 His35— Ser99の C a間は 7. 1 2A、 His35— AsplOlの C a間は 9. 87Aと空間的に近い位置で 3残基が CDR部 分に存在すると予測された。その結果、これら 3つのアミノ酸残基は、触媒三つ組残 基様構造を構成すると考えられる。
[0158] また、図 12および図 13に示すように、 L鎖については、触媒三つ糸且残基を構成す ると思われるアミノ酸残基（Ser、 His, Asp)は、 CDR部分に存在していないと予測さ れた。し力 、 His80— Ser67の C a間は 7. 98A、 His80— Asp85の C a間は 12. 63 A、 His80— Asp86は 10. 36 Aと 3残基が空間的に近い位置に存在すると予測 された。
[0159] また、現在見出されている天然型抗体酵素のトリプシンや当研究室で見出された抗 体酵素の触媒三つ組残基 (Ser、 His, Asp)の距離と比較したところ、これらと同じよ うに ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖では、 Hisと Serとの距離は 10A以内、 Hisと A spとの距離は 15 A以内であった (表 7を参照)。
[0160] [表 7]
表 7 触媒三つ組残基 (Ser, H i s, Asp)の距離の比較
Figure imgf000037_0001
[0161] これらの結果をこれまでの本発明者らによる多くの研究成果 (例えば、 Appl. Bioche m. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immuno 1. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003);化学工業、 5 4, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004);科学、 75(11), 1254-1 259(2005)を参照）に照らして考察したところ、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖は、 抗体酵素であることが示唆された。 [0162] 〔実施例 4： ETNF 6モノクローナル抗体の大量取得と精製〕
予めプリスタンを投与した BalbZcマウスに実施例 1の抗 TNF— a抗体産生ハイブ リドーマを 1 X 106個投与後、腹水を採取することにより、 ETNF 6モノクローナル抗 体を大量に取得することができた。また、モノクローナル抗体の精製は、以下の方法 に従って行った。
[0163] (1.塩析）
腹水約 8mlを同量の PBSで希釈後、濾紙を使用して濾過してフイブリンを除去した 。これを 2本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニゥムを ドロップワイズでカ卩えた。これを氷中で 30分間静置し、その後、 4°C、 lOOOOrpmで、 10分間遠心分離した。デカンテーシヨンにより上清を除去し、ペレットを 6mlの PBS に溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモ-ゥムを添加して、塩析し、ペレットを 6ml の PBSに溶解した。これを、 1本のチューブに合わせ、 PBSに対して 2回透析した。
[0164] (2.カラム精製）
透析終了後、抗体の精製を行った。操作は MAPS-Πキット（BIO- RAD社製/ Protein Aを使った精製キット)の説明に従い、 4°Cで行った。使用する試薬として、 0. 05%N aN /PBS, Binding buffer, Elution buffer、および 2M Tris— HCl (pH8. 0)を以下
3
のようにして調製した。 0. 05%NaN ZPBSは、 0. lgの NaNを 200mlの PBSに
3 3
溶解した。 Binding bufferは、 47. lgの Binding buffer粉末を蒸留水に溶解し、 150ml にメスアップして調製した。この時、 pHメーターを用い、 pHが 9 ±0. 2であることを確 認し、範囲外である時は HC1または NaOHで pHを調整した。 Elution bufferは 2. 3g の Elution buffer粉末を蒸留水に溶解し、 100mlにメスアップして調製した。この時、 p Hメーターを用い、 pHが 3 ±0. 2であることを確認し、範囲外である時は HCほたは NaOHで pHを調整した。 2M Tris— HC1は、 12. l lgの Trisを蒸留水に溶解し、 H C1で pHを 8. 0に調整した後、蒸留水で 50mlにメスアップした。
[0165] 透析終了後、上記の塩析済みの腹水を、腹水： Binding buffer= l: l . 2になるように 希釈した。不溶物が認められる時には、濾紙で濾過して取り除いた。また、精製操作 前に、 0. 05%NaN /PBS, Binding buffer,および Elution buffer,並びにサンプル
3
(上記腹水の濾液)を脱気した。 [0166] ァフィゲルプロテイン Aを充填し、カラムを上記 Binding bufferで洗浄した。 UV 280 nmの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記 Binding bufferでゲルを 洗浄した。流速を 0. 2mlZminに調節し、ゲル表面と Binding bufferの液面とがほぼ 一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
[0167] 次に、 50ml以上の Binding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで 検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースライ ンが落ち着いたら、ゲル表面と Binding bufferの液面とがほぼ一致したところで、 45ml の Elution bufferを添カ卩し、ァフィゲルプロテイン Aに結合した抗体を溶出させ、ピーク 部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、 pH試験紙で pHを測定 し、 2M Tris-HCl(pH8. 0)で中和した。上記抗体画分 (抗体液）は、 PBSに対し て 2回透析した後、 SDS— PAGEで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し 、 DCプロテインスタンダードアツセィ（BIO-RAD)でタンパク濃度を測定し、 lmg/ml 以上の濃度で（lmgZml未満の場合は濃縮して)凍結保存した。
[0168] 〔実施例 5： ETNF 6抗体の重鎖 (H鎖)および軽鎖 (L鎖)の分離 ·精製〕
実施例 4で精製した ETNF— 6抗体を用いて、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖の 分離精製を以下に示す方法に従い、行った。
[0169] (1.限外濾過）
実施例 4で精製した抗体溶液 5mg分を 0. 15M NaClを含む 50mM Tris— HC1 緩衝液 (ρΗ8. 0)に対して 2回透析した。透析の終了後の抗体溶液を、セントリプレツ プ— 10を用いて、 4°C、 2800rpmで遠心分離し、約 lmlになるまで限外濾過により 濃縮した。さらに、 5mlの 0. 15M NaClを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH8. 0) を加え、約 lmlになるまで再び遠心分離した。この操作を再度行い、限外濾過による 濃縮後、 0. 15M NaClを含む 50mM Tris— HC1緩衝液 (pH8. 0)で抗体溶液を 2 . 7mlに調整し、褐色瓶に入れ以下の実験に使用するまで低温で保存した。
[0170] (2. ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖の分離）
まず、 0. 15M NaClを含む 50mM 1¾5—1« 1緩衝液（ 118. 0)、 1M Tris溶液 、および上記抗体溶液 2. 7mlをそれぞれ脱気した。 2M 2 メルカプトエタノール（ 以下、「2— ME」ともいう）と、 0. 15M NaClを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH8 . 0)とを抗体溶液にカロえ、ピペッティングで軽く撹拌したのち、 lM Tris溶液で pH8 . 0に調整し、窒素封入を行った。その後、インキュベーター内で、 15°C、 3時間スタ 一ラーで撹拌しながら還元反応を行った。還元反応後、上記抗体溶液に脱気した 0. 6Mョードアセトアミド溶液を 600 1加え混合した。その後、 1M Tris溶液で pH8. 0 に調整した。そして、 15°Cで、 15分間撹拌しながらアルキル化反応を行った。次に、 ディスクフィルター（0. 2 m)を使用し、上記抗体溶液から粒子の除去を行った。セ ントリプレップ— 10を用いて、液量が約 0. 5mlになるまで濃縮した。
[0171] (3.サイズ排除 HPLCによる ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖の精製）
ETNF 6抗体の H鎖および L鎖の精製は、上記のようにして得られた還元アルキ ルイ匕処理後の抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより行った。
[0172] サイズ排除クロマトグラフィーシステムとして、 PU— 2080 Plus (JASCO社製）を用 いた。また、カラムには、 Protein- Pak™300SW ( φ 7. 5mm X 300mm ; Waters製）を 用いた。上記カラムの平衡ィ匕は、移動相に用いる 6M塩酸グァ-ジン (pH6. 5)を、 0. 15mlZminの流速で、約 2時間流すことにより行った。サンプル（上記還元アルキ ル化処理後の抗体溶液）は、 2〜3回に分けて供した。 H鎖および L鎖に相当する画 分を分取した。分取後の各画分は PBSに対して透析を行い、 H鎖および L鎖を Refol dingした。バッファーを 15mM PBに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収 した。 DCプロテインスタンダードアツセィ (BIO-RAD)で H鎖および L鎖の濃度を測定 した後、 SDS— PAGEで純度を確認して 4°Cで保存した。このようにして調製した H 鎖および L鎖の液量と濃度とを表 8に示す。
[0173] [表 8]
表 8 タンパク定量の結果と液量
Figure imgf000040_0001
〔実施例 6 : ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖におけるぺプチダーゼ活性〕 天然型抗体酵素は、タンパク質を基質として用いる場合には標的タンパク質を特異 的に分解するという特徴を持つ。しかし、ペプチド基質においては、非特異的に分解 することが分力つている。そこで、これまでの抗体酵素のぺプチダーゼ活性試験で基 質として用いてきた TP41— 1 peptide(H N— TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD— COOH： 2
2
lmer、配列番号 5)を使用して ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖が上記ペプチドに対 する分解能を有するか検討した。
[0175] 実験操作は全てクリーンベンチ内で行 ヽ、使用する試験管、緩衝液などは、すべて 滅菌処理を行った後、使用した。
[0176] 粉末の TP41-1 peptideを必要量はかり、 15mM PB (pH6. 5)に溶解した後に、ゥ ルトラフリー MC ( φ 0. 22 μ m、 MILLIPORE製)を使って、濾過滅菌した。また、 ETN F— 6抗体の H鎖および L鎖についても、 15mM PB (pH6. 5)を用いて濃度を調整 した。最終的に、 TP41-1 peptideの濃度が 120 μ M、 L鎖の濃度が 0. 8 M、 H鎖の 濃度が 0. 4 Mになるように試験管内で混合し、 25°Cで反応させた。
[0177] 反応の経時時間ごとに、反応液の一部をクリーンベンチ内で採取し、ウルトラフリー C3( φ 0. 5 m、 MILLIPORE製)で除粒子した。これを逆相 HPLCで分析することに より、ペプチド基質の濃度変化を経時的に追跡した。逆相 HPLCの分析条件には、 p uresil C 18カラム (Waters製）を使用した。移動相には 0. 08%TFAを含む 13%ァセ トニトリルを用い、流速 0. 5mlZmin、モニター波長 214nm、分析温度を 40°Cとした 。その結果を、図 14、図 15 (a)〜図 15 (d)、図 16、および図 17 (a)〜図 17 (d)に示 す。図 14および図 15 (a)〜図 15 (d)は ETNF— 6抗体の L鎖の結果を、図 16および 図 17 (a)〜図 17 (d)は、 ETNF— 6抗体の H鎖の結果を示す。また、図 15 (a)〜図 1 5 (d)および図 17 (a)〜図 17 (d)は、各経時時間で採取したサンプルの HPLC分析 により得られたクロマトグラムを示し、図 14および図 16は、それらの HPLCのクロマト グラム力 算出した各経時時間における TP41-1 peptide量をグラフに示したものであ る。なお、図 15 (a)〜図 15 (d)はそれぞれ、 0時間後、 27. 7時間後、 50. 4時間後、 73. 2時間後の結果を示す。また、図 17 (a)〜図 17 (d)はそれぞれ、 0. 3時間後、 2 7. 7時間後、 50. 7時間後、 58. 7時間後の結果を示す。
[0178] 図 14、図 15 (a)〜図 15 (d)、図 16、および図 17 (a)〜図 17 (d)に示すように、反 応時間が経過するにつれ、 ETNF— 6抗体の H鎖または L鎖を含む反応液では、ぺ プチド基質の濃度の減少が見られた。具体的には、ペプチド基質の濃度は、反応開 始後 27時間ごろ力も減少していき、 L鎖を含む反応液では 73時間で（図 14および図 15 (a)〜図 15 (d)を参照）、 H鎖を含む反応液では 59時間で完全にペプチドが消失 した（図 16および図 17 (a)〜図 17 (d)を参照)。また、ペプチド基質の濃度の減少に 伴い、当該ペプチドの分解断片と思われるピークも出現した。
[0179] また、この H鎖および L鎖はどちらも、分解速度の遅い「誘導期」と高活性を示す「活 性期」とからなる 2相性の分解曲線を描いていた。本発明者らは、これまでの研究に おいて、通常の酵素の特性とは異なる天然型抗体酵素の特性として、 2相性の分解 曲線があることを見出している。これは、上記誘導期において抗体の立体構造に変 化が起こり、抗体の酵素活性が高い構造に変化することにより、活性期が現れると推 測されている。
[0180] このように、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖が天然型抗体酵素と同様の特性を示 したことは、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖が抗体酵素であることを示唆するもので ある。
[0181] 〔実施例 7 : ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖における抗原分解能〕
実施例 6に示すように、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖はぺプチダーゼ活性を有 することが明ら力となった。そこで、次に ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖が、抗原タ ンパクである TNF— aを分解する能力を有するか否かの検討を行った。
[0182] 抗原タンパクには、実施例 1で用いた TNF— aを用いた。まず、ノ ッファーを 15m
M PB (pH6. 5)に交換した。続いて、濃度を 600 gZmlに調整した後、濾過滅菌 して用いた。
[0183] また、コントロールタンパクとしてゥマ心臓由来のミオグロビン（SIGMA M1882-250M G)、および BSA (BIO-RAD Protein Assay Standard II)についても、同様に分解試 験を行った。ミオグロビンおよび BSAは、粉末を必要量測り取り、 15mM PB (pH6. 5)に溶解後、ウルトラフリー MC ( φ 0. 22 m、 MILLIPORE製）により濾過滅菌した。 分解実験における終濃度は、それぞれミオグロビンが 0. 9 M (15 g/ml)、 BSA が 0. 3 M (20 gZml)、TNF— αが 1. 1 Μ (20 gZml)、 ETNF— 6抗体の L鎖が 0. 4 iu M (10 iu gZml)、ぉょびETNF— 6抗体のH鎖が0. 2 ^ Μ (10 ^ 8/ ml)とした。 [0184] 反応時間 4、 8、 12、 24時間、 48時間、および 74時間において、各タンパク質の反 応液の一部をクリーンベンチ内で分取し、各タンパク質の経時変化を SDS— PAGE で追跡した。その結果を、図 18 (a)〜図 18 (c)、図 19 (a)〜図 19 (c)、図 20 (a)〜図 20 (d)、および図 21 (a)〜図 21 (d)に示す。図 18 (a)〜図 18 (c)および図 19 (a)〜 図 19 (c)は、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖と TNF— aとの反応結果を示すもの である。
[0185] まず、図 18 (b)〖こ示すように、ネガティブコントロールである TNF— aのみの反応 液では、 17. OkDaに太いバンドが検出され、このバンドは 74時間経過しても変化は みられなかった。
[0186] 一方、図 18 (a)に示すよう〖こ、 ETNF— 6抗体の H鎖と TNF— aとの反応液では、 反応開始直後力 TNF— αの太いバンドの上部が薄くなり、下部の 16. 8kDaのバ ンドが鮮明になってきた。また、反応時間 4時間では、 15. OkDaおよび 13. 3kDa付 近に TNF— αの分解断片と思われるバンドが出現した。反応時間が 8時間、 16時間 と経過するにつれて、 16. 8kDaのバンドは強くなり、かつ、 13. 3kDaのバンドおよ びその下に、このフラグメントがさらに断片化されたと思われる複数のバンドが出現し てきた。反応時間 48時間では、もとの 17. OkDaの太いバンドは細くなり、 16. 8kDa のバンドのみが明らかに強く検出された。
[0187] N末端アミノ酸配列の結果、この細いバンドは TNF— aの N末端から 5番目のセリ ンと 6番目のアルギニンとの間のペプチド結合が切断されたものであることが判明した 。また、 15. OkDaに現れるバンドは、 N末端から 20番目のプロリンと 21番目のグルタ ミンとの間のペプチド結合が切断されて生じる断片であった。さらに、 13. 3kDaに現 れるバンドは、 N末端から 36番目のロイシンと 37番目のロイシンとの間のペプチド結 合が切断されて生じる断片であった。つまり、 TNF- aは反応時間 4時間あたりから 、 ETNF— 6抗体の H鎖による分解がはじまり、 20〜30時間でほとんど分解されたも のと考えられる。以上の結果から、 ETNF— 6抗体の H鎖は抗体酵素であることが実 証された。
[0188] 図 19 (a)〜図 19 (c)に示すように、 ETNF— 6抗体の L鎖についても同様の分解傾 向が見られ、 ETNF— 6抗体の L鎖においても抗原分解活性が見られた。 [0189] なお、本実施例において、 H鎖単独あるいは L鎖単独では時間と共に自己消化を 起こし、いくつかの抗体酵素は、自己消化により生じる断片と結びついて多量体を形 成して 、た（図 18 (c)および図 19 (c)を参照）。
[0190] 次に、コントロールタンパクのミオグロビンのみの反応液では、図 20 (b)に示すよう に、 18. OkDaにバンドが認められ、このバンドは 74時間経過しても変化は見られな かった。 L鎖とミオグロビンとの反応液では、図 20 (a)に示すように、高分子側と低分 子側に若干バンドが見られたが、ミオグロビンには変化が見られな力つた。また、 L鎖 のみの反応液でも、図 19 (c)に示すように、同様のバンドが見られた。このため、これ らのバンドは、ミオグロビンの分解断片ではなぐ L鎖由来の断片であると考えられる。
[0191] また、 ETNF— 6抗体の L鎖と BSAと反応の結果でも、図 20 (c)に示すように、 8時 間ごろ力 若干 BSAより低分子側のバンドが濃くなつていた。しかし、 BSAと思われ るバンドには変化は見られなかったことから、 ETNF— 6抗体の L鎖は、 BSAの分解 活性を有さないと考えられる。
[0192] また、 H鎖についても L鎖と同様に、図 21 (a)および図 21 (b)に示すように、にミオ グロビンには変化が見られなかった。さらに、 BSAと H鎖との反応液では、図 21 (c) に示すように、 L鎖と同様に 8時間ごろ力 若干 BSAより低分子側のバンドが濃くなつ ていた。しかし、これらのバンドもまた、 H鎖由来の分解断片であると考えられる（図 1 8 (c)および図 21 (c)を参照）。以上の結果より、 ETNF— 6抗体の H鎖および L鎖は 、 TNF— αを特異的に分解する活性を有する抗体酵素であることが明らかとなった。
[0193] なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなぐ特許請求の範囲 に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開 示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例につ 、ても本 発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許 文献の全てが、本明細書中にぉ 、て参考として援用される。
産業上の利用の可能性
[0194] 以上のように、本発明に力かる抗体酵素は、 TNF— aに対する抗体として機能し、 かつ、 TNF— αを切断および Zまたは分解することができる抗体酵素であるため、 当該抗体酵素を用いることにより、効率よく TNF— αを分解することができる。それゆ え、本発明は、関節リウマチや COPDのように TNF— αの過剰産生により引き起こさ れる疾患の予防や治療に利用することができる。さらに、本発明は、 TNF— αを利用 する医療業、製薬産業、試薬産業、医療機器産業、食品産業等に幅広く応用するこ とがでさる。

Claims

請求の範囲
[1] ヒト TNF— aに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記 TNF— aを 分解することを特徴とする抗体酵素。
[2] 上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項 1に記載 の抗体酵素。
[3] 上記抗体酵素は、上記 TNF— aに対する抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変 領域の少なくとも一方を含んでなることを特徴とする請求項 1または 2に記載の抗体 酵素。
[4] 上記軽鎖可変領域は、以下の（a)または (b)に記載のポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、以下の（c)または (d)に記載のポリペプチドからなることを特 徴とする請求項 3に記載の抗体酵素。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— αを 認識し、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(d)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— αを 認識し、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
[5] 上記軽鎖可変領域は、配列番号 3に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物 であるポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、配列番号 4に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物 であるポリペプチドからなることを特徴とする請求項 3に記載の抗体酵素。
[6] 以下の（e)または (f)に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレ ォチド。
(e)配列番号 1または 2に示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1または 2のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記 TNF— αを認 識し、当該 TNF— αを分解する活性を有するポリペプチド。
請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の抗体酵素を含み、生体内における TNF— 量の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
請求項 6に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
PCT/JP2007/051418 2006-01-31 2007-01-29 ヒトＴＮＦ－αに対する抗体酵素およびその利用 WO2007088823A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-023665 2006-01-31
JP2006023665A JP4861019B2 (ja) 2006-01-31 2006-01-31 ヒトＴＮＦ−αに対する抗体酵素およびその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007088823A1 true WO2007088823A1 (ja) 2007-08-09

Family

ID=38327396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/051418 WO2007088823A1 (ja) 2006-01-31 2007-01-29 ヒトＴＮＦ－αに対する抗体酵素およびその利用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4861019B2 (ja)
WO (1) WO2007088823A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2011096395A1 (ja) * 2010-02-04 2013-06-10 株式会社クレハ 多層延伸成形物の製造方法
EP3836966A4 (en) * 2018-08-17 2022-06-08 Ab Studio Inc. CATALYTIC ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019311557A1 (en) * 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989010754A1 (en) * 1988-05-04 1989-11-16 Igen, Inc. Therapeutic methods using catalytic antibodies
WO1992016553A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 New York University Monoclonal and chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US5654407A (en) * 1993-03-05 1997-08-05 Bayer Corporation Human anti-TNF antibodies
WO2004009805A1 (ja) * 2002-07-19 2004-01-29 Japan Science And Technology Agency 新規抗体酵素生産方法、新規抗体酵素、およびその利用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4316194B2 (ja) * 2002-07-15 2009-08-19 独立行政法人科学技術振興機構 活性化抗体酵素および活性化抗体酵素の製造方法
JP4330947B2 (ja) * 2002-07-19 2009-09-16 独立行政法人科学技術振興機構 ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼに対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用したヘリコバクター・ピロリ菌感染患者の治療薬と感染予防剤
JP4330948B2 (ja) * 2003-02-27 2009-09-16 独立行政法人科学技術振興機構 ケモカインレセプターｃｃｒ−５に対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ｈｉｖ薬剤

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989010754A1 (en) * 1988-05-04 1989-11-16 Igen, Inc. Therapeutic methods using catalytic antibodies
WO1992016553A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 New York University Monoclonal and chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US5654407A (en) * 1993-03-05 1997-08-05 Bayer Corporation Human anti-TNF antibodies
WO2004009805A1 (ja) * 2002-07-19 2004-01-29 Japan Science And Technology Agency 新規抗体酵素生産方法、新規抗体酵素、およびその利用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENDLY B. ET AL.: "Murine Monoclonal Antibodies Defining Neutralizing Epitopes on Tumor Necrosis Factor", HYBRIDOMA, vol. 6, no. 4, 1987, pages 359 - 370, XP008032284 *
SHIMAMOTO Y. ET AL.: "Monoclonal antibodies against human recombinant tumor necrosis factor: prevention of endotoxic shock", IMMUNOLOGY LETTERS, vol. 17, 1988, pages 311 - 318, XP003016601 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2011096395A1 (ja) * 2010-02-04 2013-06-10 株式会社クレハ 多層延伸成形物の製造方法
EP3836966A4 (en) * 2018-08-17 2022-06-08 Ab Studio Inc. CATALYTIC ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007202444A (ja) 2007-08-16
JP4861019B2 (ja) 2012-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2731507C1 (ru) Gla домены в качестве нацеливающих агентов
JP2023002562A (ja) 抗ｔｌ１ａモノクローナル抗体の中和
CN102430117A (zh) 抑制补体激活的修饰的蛋白酶
JP6169495B2 (ja) 妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するための方法およびシステム
AU2008201773A8 (en) von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease
JP2003527067A (ja) Ａｃｒｐ３０（３０ｋｄの脂肪細胞補体関連タンパク質）の相同体ａｃｒｐ３０ｒ１ｌ
US20070154474A1 (en) Human Prostate Specific G-Protein Receptor HPRAJ70
WO1998033920A2 (en) Tissue factor pathway inhibitor-3
AU2016321146C1 (en) ApoA-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
EP3595703A1 (en) Recombinant mature complement factor i
CN106581643B (zh) 白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用
WO2007088823A1 (ja) ヒトＴＮＦ－αに対する抗体酵素およびその利用
JP2003512856A (ja) ウテログロビン様ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体
WO2024056097A1 (zh) 基于nkg2d的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用
KR20100123857A (ko) 항ａｄａｍ－１５항체 및 그의 이용
JP2003514525A (ja) メタロプロテアーゼファミリーのヒト酵素
JP2007202443A (ja) ケモカインレセプターｃｃｒ５のｎ末端領域に対する抗体酵素
JP2004500810A (ja) Ｉｌ−６様ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体
JP2002500045A (ja) ヒトウロテンシンｉｉ
WO2010105446A1 (zh) 抗人肿瘤坏死因子受体α单抗及其应用
JP2004507211A (ja) Ａｄａｍポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体
US20200199196A1 (en) Mutant tumor necrosis factor receptor (tnfr) ligands and methods of making and using same
You et al. Molecular cloning, expression, bioinformatics analysis and bioactivity characterization of TNF13B (BAFF) gene in bat (Vespertilio superans Thomas)
JP2001500386A (ja) インテグリンリガンドであるヒトＭｉｎｄｉｎ
WO2006013923A1 (ja) 自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07707649

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)