WO2007088024A1 - Gewinnung von glucosinolaten aus exsudaten von capparales - Google Patents

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WO2007088024A1
WO2007088024A1 PCT/EP2007/000788 EP2007000788W WO2007088024A1 WO 2007088024 A1 WO2007088024 A1 WO 2007088024A1 EP 2007000788 W EP2007000788 W EP 2007000788W WO 2007088024 A1 WO2007088024 A1 WO 2007088024A1
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glucosinolates
plant
plants
glucosinolate
exudates
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PCT/EP2007/000788
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Iryna Smetanska
Monika Schreiner
Dietrich Knorr
Angelika Krumbein
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Institut für Gemüse & Zierpflanzenbau e.V.
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    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to the technical environment of phytochemicals, especially pharmaceutically valuable compounds produced in plants, which can be used as a drug or nutritional supplement.
  • the present invention relates to a process for obtaining at least one glucosinolate from a root exudate from plants of the order Capparales and the glucosinolates thus obtained and their use for nutritional supplementation or as a pharmaceutical.
  • Plants are a valuable source of phytochemicals or secondary metabolites, many of which can be used as dietary supplements in so-called “fuctional foods” as well as starting or raw material compounds for pharmaceutically active compounds and beneficial compounds (Mulabagal and Tsay Borisjuk et al., 1999).
  • Secondary metabolites are traditionally derived from vegetable waste material that is not suitable for human consumption, such as broccoli or cauliflower stalks, outer cabbage leaves, and turnip greens that are mechanically minced In this plant material, there are often very low levels of phytochemicals, so large amounts of starting material must be used, therefore, procedures have been developed to remove secondary metabolites from individual plant organs For example, secondary metabolites can be obtained from plant exudates.
  • Glucosinolates and their hydrolyzed products are pharmacologically and nutritionally interesting because of their health benefits, particularly their anticancer properties (Talalay and Fahrey, 2001, Zhang, 2001).
  • Glucosinolates are a group of plant compounds found in the order of Capparales, which includes the agriculturally important vegetables of the Brassicaceae family.
  • Glucosinolates consist of a ⁇ -D-thioglucose-reduced group, a sulfonated oxime residue and a variable side chain derived from amino acids (Kneer et al., 1999).
  • glucosinolates Based on the chemical structure of their side chains, the glucosinolates are classified into various classes such as aliphatic glucosinolates, aromatic glucosinolates and indol glucosinolates (Bennett et al., 1994, Vallejo et al., 2003).
  • WO 98/27806 A1 describes a Brassica plant which contains an artificially produced glucosinolate content reduced compared to the wild-type plant.
  • High levels of glucosinolates are considered undesirable because of their toxic byproducts because they negatively affect the enzyme myrosinase.
  • Myrosinase is the enzyme that is released on digestion of the Brassica plant and catalyzes the degradation of the glucosinolates to glucose, thiocyanates, isothiocyanates and nitriles.
  • WO 94/19929 A2 also relates to Brassica plants with reduced glucosinolate content.
  • Brassica seeds are produced with a reduced glucosinolate content of a maximum of 3.4 mmol per gram of seed. These seeds can be used particularly suitably as animal feed and are advantageous there, because less degradation products of the glucosinolates reduce the nutritional value of the animal feed. The reduction of glucosinolates takes place by targeted intervention in their Biosyntheseweg.
  • WO 2004/089065 A1 describes a Brassica plant with increased glucosinolate content, due to the anticancerogenic properties of glucosinolates is sought.
  • Disclosed is a method for producing Brassica plants with increased glucosinolate content in edible plant parts such as broccoli, cauliflower and cabbage. To obtain the glucosinolates, all above-ground parts of plants are harvested, destroyed and disrupted mechanically and enzymatically.
  • a disadvantage is the low glucosinolate content in aboveground plant parts of Brassica plants.
  • FR 2 819 376 A1 describes Brassica plants with an increased content of glucosinolates.
  • the plants are created by targeted crossing and breeding.
  • For the isolation of glucosinolates, the plants are harvested, destroyed and disrupted.
  • a disadvantage of this method is the destruction of the starting plant, so that always new plant material must be provided.
  • WO 99/52345 A1 likewise describes a method for producing a Brassica plant with an increased content of anticancerogenic glucosinolate derivatives.
  • the glucosinolates are obtained from freeze-dried material.
  • a particular disadvantage is that the glucosinolate content in aboveground plant parts of Brassica plants is relatively low.
  • the present invention relates to a method for obtaining at least one glucosinolate from a root exudate of at least one plant of the order Capparales, comprising the steps:
  • the invention relates to the glucosinolates obtained by the process according to the invention and their use for supplementation, as a starting or raw material for food supplements (functional food) or as a pharmaceutical.
  • Fig. 1 shows a graph of the glucosinolates obtained from root exudates from beet plants (Brassica rapa) after 30 days of growth in the hydroponic system.
  • Fig. 2 shows the aliphatic, aromatic and indole glucosinolates which were exuded in 30 days from the beet plants (Brassica rapa) grown in the hydroponic system. Dark bars: aliphatic Glucosinolates, light gray bars: aromatic glucosinolates; medium gray bars: indol glucosinolates; Meanings of the abbreviations as in FIG. 1.
  • Fig. 3 shows the kinetics of glucosinolate exudation on beet plants (Brassica rapa, var. Rapifera, subvar pigmeae teltowiensis) grown in the hydroponic system.
  • Fig. 3a without elicitors
  • Fig. 3b with elicitors
  • the present invention relates to a method for obtaining at least one glucosinolate from a root exudate of at least one plant of the order Capparales, comprising the steps:
  • the inventors of the present invention believe that the increased sulfur content of the nutrient solution, along with the administered elicitors, combinatorially stimulates the plant to produce increased glucosinolate.
  • the process according to the invention has the particular advantage that the plant does not have to be harvested and destroyed in order to obtain the glucosinolates. Rather, the glucosinolates can be obtained continuously from one and the same plant from the root exudates. Thus, this method is inexpensive, because no new vegetable starting material - as in the methods of the prior art - must be provided to obtain the glucosinolates.
  • the glucosinolate expression is increased by using the nutrient solution according to the invention with increased sulfur content together with the elicitors, especially in the roots of the plants.
  • the term "increased sulfur content” means a sulfur content that is higher than in a simple Hoagland solution
  • a sulfur content of between about 300 mg / l to about 1000 mg / l is an "elevated sulfur content”.
  • exudate from roots or "root exudate” means the predominantly liquid excreta of the living plant root.
  • the exudates are mainly derived from the plant root. so that they can be collected and their ingredients concentrated and analyzed.
  • elicitor refers to triggering, specific substances.
  • Elicitors are substances of plant origin that induce a defense system or a defense response. They induce hypersensitive responses, lignin and protective proteins.
  • elicitors are understood as meaning, in particular, salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MJ).
  • the glucosinolates are aliphatic glucosinolates, aromatic glucosinolates and / or indol glucosinolates. All glucosinolates have a ⁇ -D-thioglucose reduced group, a sulfonated oxime moiety and a variable side chain derived from amino acids.
  • the aliphatic glucosinolates are derived in particular from the amino acids methionine, alanine, VaNn, leucine and isoleucine.
  • the aromatic glucosinolates are derived in particular from tyrosine and phenylalanine as the basic amino acid.
  • the indol glucosinolates may be derived in particular from tryptophan.
  • the aliphatic glucosinolates are selected from the group consisting of progoitrin, gluconapine, gluconaziferin, glucobrassicanapine; sinigrin; Glucoalysin and glucoraphanin; the indol glucosinolates are selected from the group consisting of 4-hydroxyglucobrassicin, 4-methoxy-glucobrassicin, neoglucobrassicin and glucobrassicin; and the aromatic glucosinolate is selected from the group consisting of gluconasturtiin and glucotropaeolin.
  • Indol glucosinolates especially glucobrassicin and its derivatives are preferred because they are particularly useful as anticancer agents.
  • the aromatic glucosinolates gluconasturtiin and glucotropaeolin are believed to be potent anti-carcinogens and, therefore, are also preferred.
  • the aliphatic glucosinolate 4-methylsulfinylbutylisothiocyanate induces the detoxification of enzymes such as quinone reductase and glutathione transferase, both of which act to suppress cancer cells.
  • the roots are primary and / or secondary roots of the plant.
  • the primary root has rhizodermis, a primary cortex, an endodermis, a pericardium with lateral roots for secondary growth of thickness, and a periderm, radial vascular bundles and a cortex around the central cylinder.
  • Secondary roots are roots that originate from the shoot rather than the primary root. Both types of roots are particularly suitable for the invention because they have an increased content of advantageous glucosinolates.
  • the plant root In addition to functioning as an organ for nutrient uptake, the plant root is also able to secrete a variety of compounds into the root environment. In one-year plant species, 30 to 60% of the photosynthetically fixed carbon is brought into the roots, and the considerable proportion of up to 70% of this carbon can be released into the rhizosphere via the root. In addition to the extraction of plant organs, substances can also be obtained from exudates of plants. Root exudates are particularly advantageous here. For commercial use, some secondary metabolites can be recovered by continuous rhizosphere secretion from the roots of hydroponic (see below) grown plants.
  • the glucosinolates are obtained from the roots of living plants, preferably by rhizone secretion.
  • the use of roots of living plants has the particular advantage that the starting material is used continuously can.
  • the plants can be continuously used in the present invention. If one and the same plant is used over several weeks or months for the production of glucosinolates, this is particularly environmentally friendly and economical.
  • the plant used in the method according to the invention is a plant of the order Capparales.
  • the plant may be further selected from the group consisting of Capparaceae, Brassicaceae, Resedaceae and Tropaeolaceae.
  • Examples of the members of the family Brassicaceae are Brassica (cabbage), Sinapis (mustard), Raphanus (radish), Lepidium (cress), Cardaha (arrow cress), Capsella (shepherd's purse), Camelina (camelina), Arabis (goose cress) , Cardaminopsis (foam cress), Nasturdium (watercress), Rorippa (marsh cress), Erysimum (Schöterich), Arabidopsis (thin wall) and Sisymbrium (Rauke).
  • Brassica rapa has proven to be particularly advantageous.
  • the variety Brassica rapa L. var. Teltow can be used particularly well.
  • water-based systems are suitable as soil-free systems, so that the glucosinolates can be obtained from the root exudates.
  • the roots are constantly supplied with nutrients via moistened air.
  • the nutrient solution is sprayed as wet dust at short intervals, usually at intervals of a few minutes.
  • the solution is taken from a storage tank and administered to the plants by a pump through an extremely accurate timer in very short cycles ranging from a few seconds to a few minutes.
  • the aeroponic system is provided with at least one spraying device.
  • the roots are kept in a film or mist of nutrient solution that ensures nearly 100% relative humidity to prevent the plant roots from drying out.
  • the nutrient solution can be pumped with a two-stage centrifugal pump. First, the liquid is pumped from the storage tank via a filter on the plant bed, from where it flows back into the tank.
  • the aeroponic system is equipped with at least one defensor.
  • the rotating Defen- forms Sor a very fine moisture mist.
  • the water particles are in the order of about 5 - 10 microns. It is particularly advantageous if the pump is turned on every 15 minutes and then followed by 30 minutes of rest.
  • the plants are advantageously cultured in the hydroponic or aeroponic system.
  • Borisjuk (1999) suggests growing plants for exudates in hydroponic systems.
  • the inventors of the present invention have made the observation that an aeroponic system is excellent because the amount of water in the system can be minimized. In this way it is possible to obtain a comparatively high exudate concentration from the beginning, so that the recovery of the glucosinolates from the exudates can take place via less complicated purification and concentration steps.
  • the aeroponic system is particularly economical because the operating costs are lower.
  • a hydroponic system is used with a floating platform, preferably in the form of a polystyrene plate, with the plants anchored directly in the floating platform, which floats on the surface of the nutrient solution.
  • the hydroponic system can be aerated by means of a compressor which produces air bubbles through the nutrient solution at a flow rate of approximately 100 ml / min, on each of the approximately ten ventilation tubes.
  • the nutrient solution is an approx. 1.5-fold to approx. 3-fold concentrated Hoagland solution, an approximately 2-fold concentrated Hoagland solution being particularly preferred.
  • the sulfur content of the Hoagland solution must be significantly increased in order to obtain optimal yields of glucosinolates.
  • the sulfur (S) is added as sulfate (SO 4 ) directly to the Added nutrient solution.
  • the salts MgSO 4 , ZnSO 4 and / or CuSO 4 are suitable. It is also possible to use K 2 SO 4 , Na 2 SO 4 and / or FeSO 4 .
  • the nutrient solution has the following constituents, based on 1 l:
  • the MgSO 4 x 7 H 2 O amount can be varied in the wide range from about 339.3 mg to about 1000 mg.
  • the nutrient solution has the following constituents, based on 1 l:
  • the 1, 5-fold to about 3-fold concentrated Hoagland solution can be supplemented with additional sulfur, advantageously in the form of MgSO 4 .7H 2 O.
  • the nutrient solution contains about 984.6 mg of MgSO 4 ⁇ 7 H 2 O, based on 1 liter of liquid.
  • advantageous elicitors are glucosinolate-influencing elicitors.
  • Elicitors mimic the effects of stressors, such as the infestation of pathogens and pests, thereby activating the plant's biochemical defense system, leading to quantitative and qualitative changes in the profile of the plant's secondary metabolites.
  • Elicitors also affect gene expression and therefore can be used as molecular tools to modify the glucosinolate profiles of the plant.
  • Salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MJ) act as signaling molecules induced by pathogen attack or mechanical injury to the plant.
  • the use of either salicylic acid and / or methyl jasmonate can greatly alter the glucosinolate content in the plants, in particular greatly accumulate it.
  • These elicitors initiate signaling cascades that induce various defense responses, such as cell wall enhancement, induction of PR proteins, or the synthesis of secondary metabolites, such as glucosinolates, by influencing the expression of genes involved in glucosinolate synthesis.
  • Salicylic acid and methyl jasmonate effectively increase the content of indole, aliphatic and aromatic glucosinolates in species of the order Capparales.
  • the use of the elicitors salicylic acid and methyl jasmonate is particularly advantageous for plants of the species Brassica rapa, wherein the combined application has proven particularly useful.
  • the elicitor (s) are administered together with the nutrient solution.
  • the nutrient solution contains both a desired concentration of sulfur and the elicitors or the elicitor, so that only a single nutrient solution must be used, which is also used in only one single step. A complicated switching on and off of different nutrient solutions or interval switching can be avoided in this way.
  • the method according to the invention for obtaining glucosinolates from root exudates comprises the additional step of purifying and concentrating the glucosinolates. Because the glucosinolates are continuously released from the plant via the root exudates into the surrounding nutrient solution medium, the purification and recovery of the glucosinolates is very simple. For example, an HPLC can be used.
  • the present invention relates to the glucosinolates obtained by the method according to the invention.
  • the glucosinolates are particularly suitable as dietary supplements, as raw materials for functional food or as pharmaceuticals.
  • Fig. 1 shows the overall yield of glucosinolates in exudates of beet plants (Brassica rapa). The yield increased from 2.3 mg / plant to 7.8 mg / plant.
  • the abbreviations used are as follows: 1 H - Hoagland solution, 2H - double concentrated Hoagland solution, 2H2S - double concentrated Hoagland solution plus double sulfur, 2H2S-SA 0 - double concentrated Hoagland solution plus double sulfur plus salicylic acid applied at the beginning , 2H2S-MJ 0 - 2 times concentrated Hoagland solution plus 2 times increased sulfur plus methyl jasmonate, applied initially, 2H2S-SA 25 - 2 times concentrated Hoagland solution plus 2 times increased sulfur plus salicylic acid, applied on 25th day of the experiment.
  • Fig. 2 shows the distribution of the aliphatic, aromatic and indole glucosinolates in plants grown for 30 days in the hydroponic system.
  • the increase in the amount of nutrient increased the amount of aliphatic and aromatic glucosinolates while the amount of indol glucosinolates remained approximately the same.
  • additional sulfur increased the yield of aliphatic glucosinolates.
  • Administration of salicylic acid on the 25th day of plant growth did not substantially alter the content of aliphatic glucosinolates.
  • Gluconasturtiin was the only aromatic glucosinolate identified in beet plants (Brassia rapa). Its content in the exudates was increased 2-fold in a double concentrated Hoagland solution compared to a single concentrated Hoagland solution, and the concentration of the aromatic glucosinolate was reduced with additional addition of sulfur.
  • the addition of salicylic acid and methyl jasmonate at the beginning of the culture increases the content of gluconasturtiin by 50 to 70% compared to 2H2S. This was also the case with administration of salicylic acid on the 25th day of the experiment.
  • the method according to the invention is particularly suitable for obtaining high indole glucosinolates, which can be used particularly advantageously in cancer therapy, as a dietary supplement or as a source or raw material for functionnal food.
  • Fig. 3 shows the kinetics of rhizosphere secretion, in particular the kinetics of glucosinolates in exudates of plants grown in the hydroponic system.
  • the exudation kinetics studies showed that the exudated glucosinolates content in the first 10 days of the experiment did not change. was significantly influenced by the nutrient concentration (Fig. 3 - left side). Over the next 10 days, the exudate glucosinolate content increased in those plants treated with initial Hoagland solution (1 H) as well as those treated with the modified, twice concentrated Hoagland solution (2H).
  • the content of glucosinolates exuded in the period between the 10th and the 15th as well as between the 15th and the 20th day of the experiment was 2.1 and 1.9 times more, respectively, than the control in the same Period.
  • the intensity of exudation decreased for salicylic acid treated plants as well as for methyl jasmonate treated plants toward the end of growth.
  • the herbal response to elicitor administration is a one-time event that occurs during the first days after treatment and then gradually decreases.
  • FIG. 4 shows the results of an experiment performed parallel to FIG. 3b, with the difference that the plants were grown in the aeroponic system.
  • the treatment with elicitors shown to be an enhancer is shown.
  • kung glucosinolate led to rhizone secretion compared to the control.
  • Examination of exudation kinetics of secondary roots showed that the increase in glucosinolate content in exudates after administration of both elicitors was already observed immediately after the start of the experiment.
  • the highest level of excreted glucosinolates was measured immediately after treatment, while the glucosinolate content decreased at the end of the experiment (day 30).
  • the glucosinolate content exuded from the plants during the first ten days after the treatment was 2.1 mg / plant, which was 3.1 times greater than the values of the control. Between the 10th and the 15th day as well as between the 15th and 20th day, the glucosinolate content dropped to 1.5 mg / plant and was thus only 2.0 or 1.8 times the value of the control , For the next five days, it was almost at the value of control. During the last five days of plant growth in this treatment, the glucosinolate content reached a level of 1.0 mg / plant which was 0.2 mg / plant below that of the control.
  • the plants exuded 1.6 mg / plant of glucosinolate, which was 2.4-fold above control values.
  • the content of glucosinolates exuded during the period between the 10th and 15th as well as the 15th and 20th day of the experiment was 1.6 mg / plant. These values are 2.2 and 1.9 times the value of the control over the same time period.
  • the plants exuded after the salicylic acid treatment 1, 4 mg glucosinolate / plant, so that the value 1, 2-fold or 1, 3 -fold above the control.
  • the beet seeds were grown in Grodan rockwool planting cubes (5 cm wide x 5 cm deep x 5 cm high) placed in standard greenhouse plastic dishes (52 cm wide x 35 cm deep x 7 cm high).
  • the seeds were watered with semi-concentrated Hoagland solution over moisture systems placed above the plant culture. They were pre-germinated until the roots of the seedlings emerged about 2 to 4 cm from the bottom of the cubes. This was the case after about 15 to 20 days with 2 leaves and a root weight of about 3 g.
  • the cubes were then inserted at intervals of 10 x 11 cm into the holes of polystyrene plates (1 m x 1 m in size, 4.5 cm thick), which were then inserted into the aeroponic or hydroponic systems.
  • both aeroponic and hydroponic systems have been used.
  • the floating systems are advantageous because the pH and nutritional value of the water can be easily measured and the desired levels maintained.
  • the risk of pest infestation and the occurrence of diseases on the plants is significantly reduced.
  • the casting of the plants according to a pouring plan is eliminated.
  • aeroponic systems were used in the present experiments with the aim of minimizing the amount of water used in the system, which makes exudate extraction easier. In this way, the aeroponic system can be operated very economically.
  • three different systems were installed, namely an aeroponic system with a spray device, an aeroponic system with a mist atomizer or a defensor, and a hydroponic system.
  • the spray device of the aeroponic system was designed in the specific example as spray nozzles.
  • H - Hoagland solution 5H - 1.5-fold concentration of the Hoagland solution; H - double concentration of Hoagland solution; 2S - double sulfur concentration; SA 0 - salicylic acid, applied on the 1st day; MJ - methyl jasmonate, applied on the 1st day; SA- I5 - salicylic acid, applied on the 15th day; SA 2 O - salicylic acid, applied on the 20th day; SA 25 - salicylic acid, applied on the 25th day.
  • the plants are supplied with nutrients through humidified air.
  • the roots are in the growth chamber, where they were sprayed at short intervals, usually at intervals of a few minutes, with the moisture mist of the nutrient solution.
  • the solution was taken directly from its storage tank via a pump and sprayed on the plant roots. The pump was precisely timed so that the spray cycles lasted from just a few seconds to a few minutes.
  • the roots were kept in a mist of nutrient solution.
  • the mist of the nutrient solution contains a relative humidity of nearly 100% and effectively prevents the plant roots from drying out.
  • the aeroponic system with spray nozzles of the type Dan Fogger 7800, Dan Sprinklers, Kibbutz Dan Israel was used.
  • the nutrient solution was pumped from the storage tank via a Bitron 15 filter (type G15T8, Oase, Berlin, Germany) to the seedbed using the two-stage centrifugal pump CH-60 (model AA-CVBV, Grundfos, Erkrath, Israel). From there, the excess nutrient solution could be returned to the storage tank.
  • the aeroponic system with spray nozzles was used continuously, ie the nutrient solution became constant and continuous without intervals sprayed on the plant roots.
  • This use of the aeroponic system is uncommon, but the inventors of the present invention have found that the root of beet is very sensitive to the occurrence of a lack of water.
  • the pressure of the pump was 2 bar, with 4 bar usually being used in the prior art.
  • the inventors of the present invention have found that the pressure used in the prior art results in mechanical damage to the beet roots.
  • the Defensor type aeroponic system used in the present invention contained the Type 505 Defensor, WMH Walter Meier Holding, Pfäffikon, Germany.
  • the rotating or rotating atomizer formed the finest mist of nutrient solution.
  • the size of the water particles in the sprayed nutrient mist is about 5 to 10 microns.
  • the Defensor (Type 505) itself contains a rotating gyro (centrifuge), a room containing dry air, a rotating plate, and a moisture ring that releases the moist air to the outside as a finely atomised moisture spray (aerosol).
  • the plants were located directly in the floating platform that floated on the surface of the nutrient solution.
  • the hydroponic system was vented by a compressor (Model 40A-10011, Hiblo, Germany). The compressor blew air through the nutrient solution at a flow rate of about 100 ml / min. All in all There were 10 ventilation tubes, all operated simultaneously.
  • the plants were grown with an exposure of 12 hours corresponding to the daytime from 8 o'clock in the morning to 8 o'clock in the evening and hv 400 ⁇ mol / m 2 s.
  • Quantum sensors (Model Li-190 SZ, LI-COR Lincoln, California, USA) were used to measure the photosynthetic or active radiation. When the natural radiation outside the greenhouse exceeded 450 ⁇ mol / m 2 s, the plants were shaded by louvers placed above them.
  • SRG 140 Philips, Germany lamps were used which promote plant growth with light that has a natural spectrum. The lamps were placed 1.5 m above the growth or cultivation systems and covered approximately 2 m 2 of surface area per lamp.
  • the air temperature in the greenhouse was 16 C C during the day and 12 C during the night. In the root zone, the temperature exceeded the air temperature by about 1 to 2 ° C. The greenhouse was ventilated when the temperatures exceeded the above values.
  • the humidity in the greenhouse reached 60%. It was by the fog system HNS (type 7, Osberma, Engelsmün, Germany) with HNS Nozzles (type 07.1, Osberma, Engelsmün, Germany).
  • the temperature and humidity in the greenhouse were determined and recorded with deaerators, type 77001 (Henrich Zeiseniss Wassertechnik, Herrsching, Germany).
  • the temperature in the root zones within the aeroponic systems was determined and recorded with the psychrometer PT 100 (type WTE 10, Geraberg GmbH, Geraberg, Germany).
  • the temperature, exposure and humidity conditions in the growth chamber were controlled with RAM CC 600 equipment (Type DT 500, Ltd Rowville, Victoria, Australia). The measurements were made once a minute and the average mean was stored once per hour. All of the above conditions were maintained constant throughout the vegetative period.
  • the samples were first filtered using paper filters (N 604, Schleicher and Schuell, Dassel, Germany). The exudate samples were analyzed by scale-up ultrafiltration and reverse osmosis in the tangential flow filtration system (ProScale System with Helicon-RO-4 SpiN). ralwickelmodule, which processes a Nanomax-95 membrane, obtained from Millipore GmbH, Eschborn, Germany). The samples were then transferred to 600 ml glass bottles (Christ, Osterode am Harz, Germany), frozen at -28 ° C. and freeze-dried.
  • the method of making the exudate samples used in the invention requires fewer steps than the conventional method of producing above-ground plant material.
  • the classical manufacturing processes include the steps of cleaning, freezing and freeze-drying, milling and extracting the required compounds.
  • an additional process step was introduced into the process for preparing the exudate samples for HPLC.
  • the additional step includes the prefiltration and the concentration of the liquid. Nevertheless, the conventional steps of grinding and extracting the plant material are avoided, so that the method according to the invention has advantages over the prior art.
  • Desulfoglucosinolate analysis was performed by HPLC (Merck HPLC Pump L-7100, DAD Detector L-7455, AS-7200 Automated Sample Processing and D-7000 HPLC Manager Software) using a Spherisorb ODS2 column (5 ⁇ m, 250 x 4 mm). A gradient of 0-20% acetonitrile in water for 2 to 34 minutes followed by 20% acetonitrile in water until 40 minutes and then 100% acetonitrile for 10 minutes. elected until the 50th minute. The determination was carried out at a flow rate of 1.3 ml / min and a wavelength of 229 nm. Sinigrin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufmün, Germany) and glucotropaeolin (AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) were used as standards.
  • the individual glucosinolates were identified by comparing their retention times (retention times) with individual glucosinolates in the rapeseed oilseeds (BCR-190C and BCR-367R) used as standard reference materials.
  • Glucosinolate content was calculated using Sinigrin as the internal standard and the response factor of each compound versus sinigrin.
  • the determination of glucosinolates was performed twice and the concentrations of glucosinolates were expressed as mg exuded glucosinolates per plant.
  • the data show the dynamics of glucosinolate content in both plants and exudates during the experiment as well as in the exudates collected during the 30-day experiment.
  • the glucosinolates found in turnips are shown in Table 2.
  • the respective glucosinolate content was calculated over the respective peak areas using sinigrin as the internal standard and the response factor of each compound relative to sinigrin.
  • the content of glucosinolates in exudates of a plant was calculated by the following formula:
  • VoI volume of solution in the system in I NpI: amount of plants in the system per plant C: content of individual deslufoglucosinolaten in the solution of the
  • Nis amount of internal standard in mg / 1
  • the fresh weight, the dried material, the total weight and the individual glucosinolate contents in plants and exudates were calculated using descriptive statistics and analysis of variance.
  • the inventors have first selected a nutrient solution which ensures sufficient growth of the plants of Brassica rapa. This solution was modified according to the invention to increase the glucosinolate content in plants as well as in exudates.
  • the Hoagland solution was chosen as the starting nutrient solution for the growth of beet (Brassica rapa). Table 3 shows the ingredients of the Hoagland solution and its modifications.
  • the salts can be prepared and stored as two individual solutions (A and B). Immediately before use, the two solutions are combined.
  • the nutrient content of the starting Hoagland solution was increased because the inventors of beets (Brassica rapa) grown in Hoagland solution have observed yellowing of the leaves (chlorosis). Due to this fact, the nutrient concentration in the Hoagland solution was increased, taking care to maintain a balance between the individual components.
  • the beet plants needed high amounts of sulfur in a balanced ratio to nitrogen. This increased sulfur requirement of plants of the family Brassicaceae was surprising and was observed and analyzed in the context of this invention. The inventors therefore have a double concentra- Hoagland solution containing a 2-fold increased sulfur concentration was prepared and used.
  • the elicitors used were salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MJ).
  • Both substances were purchased from Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufmün, Germany.
  • the elicitors were added to the nutrient solution at the beginning of plant growth in the aeroponic systems, although in previous studies (Van Dam et al., 2003), treatment of the leaves with elicitors showed the glucosinolate content in the shoot, but not in the roots increased.
  • the total glucosinolate content as well as the content of individual aliphatic, aromatic and indole glucosinolates was determined quantitatively in the leaves, primary roots, secondary roots and exudates of plants of the order Capparales, in particular beet plants (Brassica rapa).
  • Progyrin, gluconapine, gluconapoleiferin and glucobrasscianapine were determined as representatives of the aliphatic glucosinolates.
  • Gluconasturtiin was determined as a representative of the aromatic glucosinolates.
  • Prominent representatives of indol glucosinolates were 4-hydroxyglucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin, neoglucobrassicin and glucobasicin.
  • the total content of glucosinolates in plants and their exudates after 30 days was 22.1 mg / plant for the control treatment and was about one third for treatment with the elicitoids.
  • the glucosinolate content found in exudates increased from 4.6 mg / plant (control) to 7.8 and 7.3 mg / plant for salicylic acid and methyl jasmonate treatments, respectively.
  • the inventors believe that the increase in glucosinolates in the exudates is due to the release of plant defense products triggered by the addition of the elicitor.
  • Aromatic glucosinolates gluconasturtiin
  • the aliphatic glucosinolates were the major class of glucosinolates in beet plants (Brassica rapa) and exudates of the control at 12.2 mg / plant, while the levels of the aromatic and indol glucosinolates were 3.0 and 6.6 mg / plant, respectively (Table 4).
  • the present results show that Brassica rapa has a glucosinolate profile comprising butenyl and pentenyl glucosinolates and their hydroxylated homologues. Progoitrin is the most commonly identified in the turnip aliphatic Glucosi- phenolate.
  • gluconapoleiferin and glucobrassicanapine were 2.0 and 1.2 mg / plant for the control, respectively. These values were not affected by salicylic acid treatment. However, methyl jasmonate treatment increased the gluconapoleiferin content to 1.3 mg / plant, while the methyl jasmonate treatment increased the glucobrassicanapine content to 2.4 mg / plant in the plants and the exudates.
  • Gluconapine control 0.5 aD ⁇ 0.2 0, 1 a ⁇ 0 1 0.7 a ⁇ 0.3 0, 4 b ⁇ 0, 0 1.3 a + 0.6 1.7 "+ 0.6
  • Brassica rapa's Gls-elong genes regulate the formation of elongases, leading to chain elongation of synthesized glucosinolates.
  • the ratio of butenyl to pentenyl glucosinolates in plants and exudates changed dramatically under the influence of salicylic acid and methyl jasmonate. The ratio was 1.1.
  • Table 6 Relationship between the subclasses of aliphatic glucosinolates in plants and exudates (mg / plant)
  • Butenyl Glucosinolates Gluconapine and Progoitrin Pentenyl Glucosinolates: Glucobrassicanapine and Gluconapoleiferin Hydroxyalkenyl Glucosinolates: Progoitrin and Gluconapoleiferin Alkenyl Glucosinolates: Glucobrassicanapine and Gluconapine 9.3 Aromatic glucosinolates
  • Gluconasturtiin was the only aromatic glucosinolate detectable in Brassica rapa. Its content reached values of 3.0 mg / plant in control plants and exudates and increased to 7.8 (2.6-fold) after a salicylic acid treatment and even to 9.1 mg / plant (3.0-fold). after a methyl jasmonate treatment (Table 4). This increase is remarkable especially in primary roots of the plants. There, the level of the gluconasturtiin glucosinolate increased from 0.6 mg / plant to 3.4 mg / plant after salicylic acid treatment and to 3.8 mg / plant after methyl jasmonate treatment.
  • the gluconasturtiin content was 1.1 mg / plant and increased to 1, 8 and 1.9 mg / plant after the administration of salicylic acid and methyl jasmonate, respectively. This represents a 60% or 70% increase compared to the control.
  • aromatic glucosinolates were detectable in the leaves only after administration of the elicitors (SA: 0.4 mg / plant and MJ: 0.6 mg / plant). This observation suggests that the elicitors cause the appearance of glucosinolates in organs in which they were not previously present.
  • the inventors further suggest that the increase in aromatic glucosinolates in all plant parts after administration of the elicitors can be explained by the induction of CYP79A2, which converts phenylalanine into aromatic aldoximes and is uniformly expressed in leaves and roots.
  • the indole glucosinolates found in Brassica rapa are 4-hydroxyglucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin and neoglucobrassicin. These are derivatives of glucobrassicin after it has undergone hydroxylation and methoxylation.
  • salicylic acid and methyl jasmonate administration also induced a specific increase in the levels of indolglucosinolate (Table 7).
  • the elicitors affected the various indole glucosinolates to different extents.
  • Salicylic acid increased the levels of glucobrassicin, 4-methoxy-glucobrassicin and neoglucobrassicin in plants much more than methyl jasmonate. In the plants and the exudates for the control, 1.3 mg / plant glucobrassicin and 3.3 mg / plant neoglucobrassicin were observed.
  • glucobrassicin content was increased from 0.4 mg / plant (control) to 0.7 mg / plant (SA treatment) and 0.9 mg / plant (MJ treatment).
  • SA treatment 0.7 mg / plant
  • MJ treatment 0.9 mg / plant
  • neoglucobrassicin was the most prevalent indole glucosinolate. Its content reached 2.6 mg / plant in the plants, whereas it was found in the exudates in an amount of 0.7 mg / plant. It was also influenced most by the two elicitors used. In plants treated with salicylic acid, its content increased to 3.4 mg / plant, while its content under methyl jasmonate treatment even increased to 3.6 mg / plant, each in comparison to the control.
  • the inventors of the present invention explain the various actions of the elicitors on the individual glucosinolates by their biological function within the defense reaction that occurs through interaction between the plant and the herbivore or plant and the microorganism.
  • Salicylic acid and / or methyl jasmonate treatment stimulated the rhizone secretion of glucosinolates.
  • the plant response to the elicitor administration occurred mainly during the first days after treatment, followed by a gradual decrease.
  • the present invention in particular the method according to the invention is suitable for selectively producing desired glucosinolates in high concentration.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte: (a) Anzucht der Pflanze in einem erdfreien System; (b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt; (c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors; (d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze. Daneben betrifft die Erfindung die nach dem Verfahren gewonnenen Glucosinolate sowie deren Verwendung zur Nahrungsergänzung, als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Functional Food oder als Pharmazeutikum.

Description

Gewinnung von Glucosinolaten aus Exsudaten von Capparales
Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Umfeld der sekundären Pflanzenstoffe, insbesondere in Pflanzen erzeugte pharmazeutisch wertvolle Verbindungen, die als Arzneimittel oder Nahrungsergänzung verwendet werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat aus Pflanzen der Ordnung Capparales sowie die derart gewonnenen Glucosinolate und deren Verwendung zur Nahrungsergänzung oder als Pharmazeutikum.
Hintergrund der Erfindung
Pflanzen sind eine wertvolle Quelle für sekundäre Pflanzenstoffe bzw. sekundäre Metabolite, von denen viele als Nahrungsergänzung in so genanntem „fuctional food" ebenso wie als Ausgang- oder Rohstoffverbindungen für pharmazeutisch aktive Verbindungen (Pharmaceuticals) und gesundheitsfördernde Verbindungen verwendet werden können. (Mulabagal und Tsay, 2004; Borisjuk et al., 1999). Die Gewinnung von sekundären Metaboliten erfolgt herkömmlich aus pflanzlichem Rest- bzw. Abfallmaterial, das nicht für den Verzehr geeignet ist. Beispiele hierfür sind Brokkoli- oder Blumenkohlstiele, äußere Kohlblätter und Rübengrün, das mechanisch zerkleinert und aufgeschlossen wird, um die gewünschten Pflanzeninhaltsstoffe zu extrahieren. In diesem Pflanzenmaterial sind oft nur sehr geringe Konzentrationen an sekundären Pflanzenstoffen, so dass große Mengen Ausgangsmaterial verwendet werden müssen. Deshalb wurden Verfahren entwickelt, um sekundäre Metabolite aus einzelnen Pflanzenorganen zu extrahieren. Beispielsweise können sekundäre Metabolite aus Exsudaten von Pflanzen erhalten werden. Aufgrund ihrer gesundheitsfördernden Wirkungen, insbesondere ihrer antikanzerogenen Eigenschaften sind Glucosinolate und ihre hydrolysierten Produkte pharmakologisch und ernährungsphysiologisch interessant (Talalay und Fahrey, 2001 ; Zhang, 2001 ). Glucosinolate sind eine Gruppe von pflanzlichen Verbindungen, die in der Ordnung der Capparales, zu der die landwirtschaftlich wichtigen Gemüsepflanzen der Familie Brassicaceae gehören, gefunden werden. Glucosinolate bestehen aus einer ß-D-Thioglucose reduzierten Gruppe, einem sulfonier- ten Oximrest und einer variablen Seitenkette, die von Aminosäuren abgeleitet ist (Kneer et al., 1999). Basierend auf der chemischen Struktur ihrer Seitenketten werden die Glucosinolate in verschiedene Klassen wie aliphatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und Indolglucosinolate eingeteilt (Bennett et al., 1994; Vallejo et al., 2003).
Die WO 98/27806 A1 beschreibt eine Brassica Pflanze, die einen künstlich erzeugten, gegenüber der Wildtyp Pflanze erniedrigten Glucosinolat Gehalt enthält. Hohe Mengen an Glucosinolaten werden aufgrund ihrer toxischen Nebenprodukte als unerwünscht erachtet, weil sie das Enzym Myrosinase negativ beeinflussen. Myrosinase ist jenes Enzym, das bei Aufschluss der Brassica Pflanze freigesetzt wird und den Abbau der Glucosinolate zu Glucose, Thiocyanaten, Isothiocyanaten und Nitrilen katalysiert.
Die WO 94/19929 A2 betrifft ebenfalls Brassica Pflanzen mit verringertem Glucosinolat Gehalt. Es werden Brassica Samen mit einem reduzierten Glucosinolat Gehalt von maximal 3,4 mmol pro Gramm Samen erzeugt. Diese Samen können besonders geeignet als Tierfutter verwendet werden und sind dort vorteilhaft, weil weniger Abbauprodukte der Glucosinolate den Nährwert des Tierfutters verringern. Die Verringerung der Glucosinolate erfolgt durch gezielten Eingriff in deren Biosyntheseweg.
Die WO 2004/089065 A1 beschreibt eine Brassica Pflanze mit erhöhtem Glucosinolat Gehalt, der aufgrund der antikanzerogenen Eigenschaften der Glucosinolate angestrebt wird. Offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung von Brassica Pflanzen mit erhöhtem Glucosinolat Gehalt in essbaren Pflanzenteilen, wie beispielsweise Brokkoli, Blumenkohl und Kohl. Zur Gewinnung der Glucosinolate werden alle o- berirdischen Pflanzenteile geerntet, zerstört und mechanisch sowie enzymatisch aufgeschlossen. Nachteilig ist der geringe Glucosinolat Gehalt in oberirdischen Pflanzenteile der Brassica Pflanzen.
Die FR 2 819 376 A1 beschreibt Brassica Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Glucosinolaten. Die Pflanzen entstehen durch gezielte Kreuzung und Züchtung. Für die Isolierung der Glucosinolate werden die Pflanzen geemtet, zerstört und aufgeschlossen. Nachteilig an diesem Verfahren ist die Zerstörung der Ausgangspflanze, so dass stets neues Pflanzenmaterial bereitgestellt werden muss.
Die WO 99/52345 A1 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Brassica Pflanze mit erhöhtem Gehalt an antikanzerogenen Glucosinolat Derivaten. Die Glucosinolate werden aus gefriergetrocknetem Material gewonnen. Nachteilig ist insbesondere, dass der Glucosinolat Gehalt in oberirdischen Pflanzenteilen von Brassica Pflanzen relativ gering ist.
Somit besteht ein Bedarf an einem wirksamen Verfahren zur Gewinnung von Glucosinolaten aus Pflanzen der Ordnung Capparales, bei dem die Ausgangspflanze bei der Gewinnung der Glucosinolate nicht zerstört werden muss. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch das Bereitstellen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurze- lexudaten mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales gelöst, das in den Patentansprüchen angegeben ist und das im Folgenden detaillierter beschrieben wird.
Zusammenfassung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte:
(a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System;
(b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt;
(c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors;
(d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.
Daneben betrifft die Erfindung die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Glucosinolate sowie deren Verwendung zur Nahrungsergänzung, als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Nahrungsergänzungsmittel (functional food) oder als Pharmazeutikum.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt eine Graphik der Glucosinolate, die aus Wurzelexsudaten aus Rübenpflanzen (Brassica rapa) nach 30 Tagen Wachstum im hydroponischen System gewonnen wurden. 1 H - Hoagland Lösung, 2H - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung, 2H2S - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, 2H2S-SA0 - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen (appliziert) am Anfang, 2H2S-MJ0 - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Methyljasmonat, aufgetragen am Anfang, 2H2S-SA25 - zweifach konzetrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen (appliziert) am 25. Tag des Experiments.
Fig. 2 zeigt die aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate, die in 30 Tagen von den Rübenpflanzen (Brassica rapa), die im hydroponischen System angezogen wurden, exsudiert wurden. Dunkle Balken: aliphatische Glucosinolate, hellgraue Balken: aromatische Glucosinolate; mittelgraue Balken: Indolglucosinolate; Bedeutungen der Abkürzungen wie in Fig. 1.
Fig. 3 zeigt die Kinetik der Glucosinolat Exsudation an Rübenpflanzen (Brassica rapa, var. rapifera, subvar. pigmeae teltowiensis), die im hydropoischen System angezogen wurden. Linke Seite, Fig. 3a: ohne Elicitoren, rechte Seite, Fig. 3b: mit Elicitoren; C = Kontrolle (= 2H2S - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, ohne Elicitoren Behandlung); Bedeutung der Abkürzungen wie in Fig. 1.
Fig. 4 zeigt die Dynamik des Gesamt Glucosinolat Gehalts in Exsudaten der Rübenpflanze (Brassica rapa, var. rapifera, subvar. pigmeae teltowiensis). SA: Salicylsäure, MJ: Methyljasmonat.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte:
(a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System;
(b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt;
(c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors;
(d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem wissenschaftlichen Befund, dass bei Anzucht (=Kultuvierung) einer Pflanze der Ordnung Capparales in einem erdlosen (= erdfreien) System, der eine spezielle Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt verabreicht wird, durch Stimulation der Glucosinolat Bildung bzw. Ausbildung über Elicitoren Glucosinolate aus Wurzelexsudaten auf einfache Weise und in hoher Konzentration gewonnen werden können. Außerdem muss die Pflanze zur Ge- winnung der Glucosinolate nicht zerstört werden, so dass es sich um ein nicht destruktives Verfahren handelt.
Ohne durch irgendeine Theorie gebunden oder eingeschränkt zu sein, nehmen die Erfinder der vorliegenden Erfindung an, dass der erhöhte Schwefelgehalt der Nährlösung zusammen mit den verabreichten Elicitoren kombinatorisch die Pflanze zu einer erhöhten Glucosinolat Bildung stimuliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den besonderen Vorteil, dass die Pflanze zur Gewinnung der Glucosinolate nicht geerntet und zerstört werden muss. Vielmehr können die Glucosinolate kontinuierlich aus ein und derselben Pflanze aus den Wurzelexsudaten gewonnen werden. Damit ist dieses Verfahren kostengünstig, weil kein neues pflanzliches Ausgangsmaterial - wie in den Verfahren des Standes der Technik - zur Gewinnung der Glucosinolate bereitgestellt werden muss. Daneben ist die Glucosinolat Expression durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt zusammen mit den Elicitoren gerade in den Wurzeln der Pflanzen erhöht. Dadurch wird die Gewinnung der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten besonders interessant, so dass auf aufwändigen Aufschluss und die Isolierung der Glucosinolate - wie im Stand der Technik beschrieben - aus den oberirdischen Pflanzenteilen verzichtet werden kann.
So wie hier verwendet bedeutet der Begriff „erhöhter Schwefelgehalt" einen Schwefelgehalt, der höher liegt als in einfacher Hoagland Lösung. Insbesondere ist ein Schwefelgehalt von zwischen ca. 300 mg/1 bis ca. 1.000 mg/l ein „erhöhter Schwefelgehalt".
So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Exsudat aus Wurzeln" bzw. "Wurzelexsudat" die vorwiegend flüssigen Ausscheidungsprodukte der lebenden Pflanzenwurzel. Die Exsudate werden von der Pflanzenwurzel vorwiegend kontinuier- lich abgegeben, so dass sie aufgefangen und ihre Inhaltsstoffe konzentriert und analysiert werden können.
Der Begriff "Elicitor" bzw. "Elicitoren" bezeichnet auslösende, spezifische Substanzen. "Elicitoren" leitet sich von Lat.: Elegere = Auslesen, Auswählen ab. Elicitoren sind Substanzen pflanzlichen Ursprungs, die ein Abwehrsystem bzw. eine Abwehrantwort induzieren. Sie induzieren hypersensitive Antworten, Ligninbildung sowie schützende Proteine können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Elicitoren insbesondere Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) verstanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Glucosinolate ali- phatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und/oder Indolglucosinolate. Alle Glucosinolate weisen eine ß-D-Thioglucose reduzierte Gruppe, eine sulfonier- te Oximeinheit und eine variable Seitenkette, die von Aminosäuren abgeleitet ist, auf. Die aliphatischen Glucosinolate sind insbesondere von den Aminosäuren Methionin, Alanin, VaNn, Leucin und Isoleucin abgeleitet. Die aromatischen Glucosinolate stammen insbesondere von Tyrosin und Phenylalanin als der grundliegenden Aminosäure ab. Die Indolglucosinolate können insbesondere von Tryptophan abgleitet sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die aliphatischen Glucosinolate ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Progoitrin, Gluconapin, Glucona- poleiferin, Glucobrassicanapin; Sinigrin; Glucoalyssin und Glucoraphanin; die Indolglucosinolate sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4-Hydroxy- Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und Glucobrassicin; und das aromatische Glucosinolat ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gluconasturtiin und Glucotropaeolin.
Indolglucosinolate, insbesondere Glucobrassicin und seine Derivate sind bevorzugt, weil sie besonders gut als Antikrebsmittel eingesetzt werden können. Auch von den aromatischen Glucosinolaten Gluconasturtiin und Glucotropaeolin wird angenommen, dass sie starke antikanzerogene Stoffe sind, weshalb sie ebenfalls bevorzugt sind. Das aliphatische Glucosinolat 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat (als Derivat von Glucoalyssin) induziert die Entgiftung von Enzymen, wie Chinon- reduktase und Glutathiontransferase, die beide in der Unterdrückung von Krebszellen wirken.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Wurzeln primäre und/oder sekundäre Wurzeln der Pflanze. Die primäre Wurzel weist eine Rhizo- dermis, eine primäre Rinde, eine Endodermis, einen Perizykel mit Seitenwurzeln für ein sekundäres Dickenwachstum sowie ein Periderm, radiale Leitbündel sowie eine Rinde um den Zentralzylinder auf. Sekundäre Wurzeln sind Wurzeln, die dem Spross und nicht der Primärwurzel entspringen. Beide Arten von Wurzeln sind für die Erfindung in besonderer Weise geeignet, weil sie einen erhöhten Gehalt an vorteilhaften Glucosinolaten aufweisen.
Neben der Funktion als Organ für die Nährstoffaufnahme ist die Pflanzenwurzel auch in der Lage eine Vielzahl von Verbindungen in die Wurzelumgebung auszuscheiden. In einjährigen Pflanzenspezies wird 30 bis 60 % des photosynthetisch fixierten Kohlenstoffs in die Wurzeln gebracht, und der beachtliche Anteil von bis zu 70 % dieses Kohlenstoffs kann über die Wurzel in die Rhizosphäre abgegeben werden. Neben der Extraktion von Pflanzenorganen können Stoffe auch aus Exsudaten von Pflanzen erhalten werden. Besonders vorteilhaft sind hier Wurzelexsudate. Für die kommerzielle Verwendung können manche sekundäre Metabolite durch kontinuierliche Rhizosekretion aus den Wurzeln von hydroponisch (siehe unten) angezogenen Pflanzen gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Gluco- sinolate aus den Wurzeln lebender Pflanzen, vorzugsweise durch Rhizosekretion gewonnen. Die Verwendung von Wurzeln von lebenden Pflanzen besitzt den besonderen Vorteil, dass das Ausgangsmaterial kontinuierlich verwendet werden kann. Im Gegensatz zu vielen Verfahren des Standes der Technik, in denen grünes Pflanzenmaterial verwendet wird, das mechanisch und/oder enzymatisch aufgeschlossen und durch die Glucosinolat Gewinnung verbraucht wird, können die Pflanzen in der vorliegenden Erfindung ständig weiter verwendet werden. Wenn ein und dieselbe Pflanze über mehrere Wochen bzw. Monate für die Gewinnung von Glucosinolaten verwendet wird, ist dies besonders umweltfreundlich und wirtschaftlich. Vorzugsweise wird das Verfahren der Rhizosekretion verwendet, bei dem gewünschte sekundäre Pflanzenstoffe (= Metabolite) in das umgebende Medium abgegeben wird, was insbesondere Vorteile bei der anschließenden Reinigung und Gewinnung des segregierten Stoffes besitzt.
In einer weiteren Ausführungsform ist die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Pflanze eine Pflanze der Ordnung Capparales. Die Pflanze kann ferner ausgewählt sein, aus der Gruppe bestehend aus Capparaceae, Brassicaceae, Resedaceae und Tropaeolaceae.
Beispiele der Mitglieder der Familie Brassicaceae (= Kreuzblütler) sind Brassica (Kohl), Sinapis (Senf), Raphanus (Rettich), Lepidium (Kresse), Cardaha (Pfeilkresse), Capsella (Hirtentäschel), Camelina (Leindotter), Arabis (Gänsekresse), Cardaminopsis (Schaumkresse), Nasturdium (Brunnenkresse), Rorippa (Sumpfkresse), Erysimum (Schöterich), Arabidopsis (Schmalwand) und Sisymbrium (Rauke).
Als besonders vorteilhaft hat sich die Rübe, Brassica rapa erwiesen. Besonders gut kann die Varietät Brassica rapa L. var. Teltow verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem erdlosen (=erdfreien) System durchgeführt. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, das erdfreie System als aeroponisches oder hydroponisches System auszugestalten. AIs erdfreie Systeme eignen sich insbesondere wasserbasierte Systeme, so dass die Glucosinolate aus den Wurzelexsudaten gewonnen werden können. Im aero- ponischen System werden die Wurzeln ständig über angefeuchtete Luft mit Nährstoffen versorgt. Die Nährstofflösung wird als feuchter Staub in kurzen Intervallen, für gewöhnlich Intervalle von wenigen Minuten, aufgesprüht. Die Lösung wird von einem Vorratstank entnommen und durch eine Pumpe über einen extrem genauen Timer in sehr kurzen Zyklen, die von wenigen Sekunden bis einigen Minuten reichen, an die Pflanzen verabreicht.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist das aeroponische System mit mindestens einer Sprühvorrichtung versehen. In diesem System werden die Wurzeln in einem Film bzw. Nebel aus Nährlösung gehalten, der nahezu 100 % relative Luftfeuchtigkeit sicherstellt, um das Austrocknen der Pflanzenwurzeln zu verhindern. Besonders vorteilhaft kann eine Sprühvorrichtung des Typs Dan Fogger 7800, Dan Sprinklers, Kibbutz Dan, Israel verwendet werden. Insbesondere kann die Nährstofflösung mit einer zweistufigen Zentrifugalpumpe gepumpt werden. Zunächst wird die Flüssigkeit von dem Vorratstank über einen Filter auf das Pflanzenbett gepumpt, von wo aus sie in den Tank zurückfließt.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die Nährlösung konstant über die Sprüher aufzusprühen. Dieses Vorgehen ist nicht typisch für ein aeroponisches System, das mit einer Sprühvorrichtung ausgestattet ist, die für gewöhnlich mit Intervallen in Minutenabständen arbeiten. Es hat sich jedoch aufgrund der Wurzelstrukturen als vorteilhaft erwiesen, den Wassergehalt nicht durch ein Intervall abzusenken. Der Druck der Pumpe beträgt vorteilhafterweise 2 bar, was um ca. die Hälfte gegenüber Werten aus dem Stand der Technik erniedrigt ist. Dieser niedrige Pumpendruck hat sich als vorteilhaft für die Wurzeln erwiesen, die durch höheren Pumpendruck mechanisch beschädigt werden können.
In einer alternativen Ausführungsform ist das aeroponische System mit mindestens einem Defensor ausgestattet. Vorteilhafterweise bildet der rotierende Defen- sor einen sehr feinen Feuchtigkeitsnebel. Die Wasserpartikel liegen in der Größenordnung von ca. 5 - 10 μm. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Pumpe alle 15 Minuten angeschaltet wird und sich danach 30 Minuten Ruhephase anschließen.
Die Pflanzen werden vorteilhafterweise im hydroponischen oder aeroponischen System kultiviert. Borisjuk (1999) schlägt vor, Pflanzen für Exsudate in hydroponischen Systemen anzuziehen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch die Beobachtung gemacht, dass sich ein aeroponisches System hervorragend eignet, weil die Menge an Wasser im System minimiert werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, eine von Beginn an vergleichsweise hohe Exsudatkonzentration zu erhalten, so dass die Gewinnung der Glucosinolate aus den Exsudaten über weniger aufwändige Reinigungs- und Konzentrationsstufen erfolgen kann. Somit ist das aeroponische System besonders wirtschaftlich, weil die Betriebskosten geringer sind.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein hydroponisches System mit einer schwimmenden Plattform, vorzugsweise in Form einer Styroporplatte verwendet, wobei die Pflanzen direkt in der schwimmenden Plattform verankert sind, die auf der Oberfläche der Nährstofflösung schwimmt. Das hydroponische System kann mit Hilfe eines Kompressors belüftet werden, der Luftblasen durch die Nährstofflösung in einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 100 ml/min, an jeder der ca. zehn Belüftungsröhren realisiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nährlösung eine ca. 1 ,5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung, wobei eine ca. 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung besonders bevorzugt ist.
Es hat sich insbesondere herausgestellt, dass der Schwefelgehalt der Hoagland Lösung deutlich erhöht werden muss, um optimale Ausbeuten an Glucosinolaten zu erhalten. Insbesondere wird der Schwefel (S) als Sulfat (SO4) direkt zu der Nährstofflösung hinzugegeben. Insbesondere eignen sich die Salze MgSO4, ZnSO4 und/oder CuSO4. Möglich ist auch die Verwendung von K2SO4, Na2SO4 und/oder FeSO4.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 I auf:
- ca. 610 mg bis ca. 1.230 mg Ca(NO3)2;
- ca. 456,7 mg bis ca. 909,3 mg KNO3;
- ca. 23,1 mg bis ca. 46,2 mg Eisenchelat (FeChe);
- ca. 204 mg bis ca. 408 mg KH2PO4;
- ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg MgSO4 x 7 H2O;
- ca. 2,1 mg bis ca. 4,3 mg H3BO3;
- ca. 0,7 mg bis ca. 1 ,3 mg MnCI2;
- ca. 0,09 mg bis ca. 0,2 mg ZnSO4;
- ca. 0,04 mg bis ca. 0,08 mg CuSO4; sowie
- ca. 0,12 mg bis ca. 0,24 mg H2MoO4.
In dieser Ausführungsform kann die MgSO4 x 7 H2O Menge in der großen Bandbreite von ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg variiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 I auf:
- ca. 820 mg Ca(NO3)2;
- ca. 606,2 mg KNO3;
- ca. 30,8 mg FeChe;
- ca. 272 mg KH2PO4;
- ca. 492,4 mg MgSO4 x 7 H2O;
- ca. 2,9 mg H3BO3;
- ca. 0,8 mg MnCI2;
- ca. 0,1 mg ZnSO4; - ca. 0,05 mg CuSO4; sowie - ca. 0,16 mg H2MoO4.
Hierbei handelt es sich um eine 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die 1 , 5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung mit zusätzlichem Schwefel, vorteilhafterweise in Form von MgSO4 x 7 H2O ergänzt werden. Besonders bevorzugt enthält die Nährlösung ca. 984,6 mg MgSO4 x 7 H2O, bezogen auf 1 I Flüssigkeit.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden bestimmte vorteilhafte Elicitoren verwendet. Vorteilhafte Elicitoren sind glucosinolatbeeinflussende Elici- toren. Die Glucosinolat Profile können durch die physiologische Behandlung (= Applikation) mit/von Elicitoren beeinflusst werden. Elicitoren ahmen die Wirkungen von Stressfäktoren, wie den Befall von Pathogenen und Schädlingen nach und aktivieren dadurch das biochemische Verteidigungssystem der Pflanze, was zu quantitativen und qualitativen Veränderungen im Profil der sekundären Metabolite der Pflanze führt. Elicitoren beeinflussen auch die Genexpression und können deshalb als molekulare Werkzeuge verwendet werden, um die Glucosinolat Profile der Pflanze zu modifizieren.
Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) dienen als Signalmoleküle, die bei Pathogenbefall oder mechanischer Verletzung der Pflanze induziert werden. Die Anwendung von entweder Salicylsäure und/oder Methyljasmonat kann den Glucosinolat Gehalt in den Pflanzen stark verändern, insbesondere stark anreichern. Diese Elicitoren lösen Signalkaskaden aus, die verschiedene Verteidigungsantworten wie Zellwandverstärkung, Induktion von PR-Proteinen oder die Synthese von sekundären Metaboliten, wie Glucosinolaten durch Einflussnahme auf die Expression von Genen, in die Glucosinolat Synthese involviert sind, induzieren. Unter PR-Proteinen werden Pathogenese bezogene Proteine (= pathogenesis rela- ted proteins) verstanden, die in gesunden Pflanzen nicht nachweisbar sind und erst nach bestimmten Stressbedingungen akkumulieren. Darüber hinaus können Salicylsäure und Methyljasmonat wirksam den Gehalt an Indol, aliphatischen und aromatischen Glucosinolaten in Spezies der Ordnung Capparales erhöhen. Die Verwendung der Elicitoren Salicylsäure und Methyljasmonat ist insbesondere für Pflanzen der Spezies Brassica rapa vorteilhaft, wobei sich die kombinierte Anwendung besonders bewährt hat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Elicitor/werden die Elicitoren zusammen mit der Nährlösung verabreicht. Auf diese Weise enthält die Nährlösung sowohl eine gewünschte Konzentration an Schwefel als auch die Elicitoren bzw. den Elicitor, so dass nur eine einzige Nährlösung verwendet werden muss, die daneben auch nur in einem einzigen Schritt angewendet wird. Ein kompliziertes An- und Abschalten verschiedener Nährlösungen bzw. Intervallschalten kann auf diese Weise vermieden werden.
In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Glucosinolaten aus Wurzelexsudaten den zusätzlichen Schritt des Reinigens und Konzentrierens der Glucosinolate. Weil die Glucosinolate von der Pflanze kontinuierlich über die Wurzelexsudate in das umgebende Nährlösungsmedium abgegeben werden, ist die Reinigung und Gewinnung der Glucosinolate sehr einfach. Beispielsweise kann eine HPLC verwendet werden.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Glucosinolate, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden. Die Glucosinolate sind insbesondere als Nahrungsergänzungsmittel, als Ausgangs- bzw. Rohstoffe für Functional Food oder als Pharmazeutika geeignet.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
A. Detaillierte Beschreibung der Figuren Fig. 1 zeigt die Gesamtausbeute von Glucosinolaten in Exsudaten von Rübenpflanzen (Brassica rapa). Die Ausbeute stieg von 2,3 mg/Pflanze auf 7,8 mg/Pflanze. Die verwendeten Abkürzungen sind wie folgt: 1 H - Hoagland Lösung, 2H - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung, 2H2S - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, 2H2S-SA0 - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen am Anfang, 2H2S-MJ0 - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Methyljasmonat, aufgetragen am Anfang, 2H2S-SA25 - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen am 25. Tag des Experiments.
Die Zunahme der Konzentration der Nährlösung bewirkte eine Steigerung des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten auf 3,8 mg/Pflanze, was einen 1 , 8-fachen Anstieg bedeutet. Die Verwendung von zusätzlichem Schwefel führte zu einer Zunahme des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten auf 4,6 mg/Pflanze. Wurden die Elicitoren Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) zusammen mit erhöhten Mengen an Schwefel verabreicht, stiegen die maximalen Glucosinolat Mengen auf 7,8 mg/Pflanze bzw. 7,3 mg/Pflanze. Eine Verabreichung der Elicitoren zu einem späteren Zeitpunkt des Pflanzenwachstums bewirkte keine derart starken Veränderungen im Vergleich zu der Verabreichung zu Beginn des Experiments: es wurden 6,6 mg/Pflanze Glucosinolate in Exsudaten ermittelt, bei denen Salicylsäure am 25. Tag des Experiments hinzugefügt wurde (2H2S-SA25).
Fig. 2 zeigt die Verteilung der aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate bei Pflanzen, die für 30 Tage im hydroponischen System angezogen wurden. Die Zunahme der Nährstoffmenge steigerte die Menge der aliphatischen und aromatischen Glucosinolate, während die Menge an Indolglucosinolaten ungefähr gleich blieb. Zusätzlicher Schwefel steigerte vor allem die Ausbeute an aliphatischen Glucosinolaten. Die Zugabe der Elicitoren Salicylsäure und Methyljasmonat, die zu Beginn des Pflanzenwachstums hinzugefügt wurden, reduzierten den Gehalt an aliphatischen Glucosinolaten in Exsudaten. Die Verabreichung von Salicylsäu- re am 25. Tag des Pflanzenwachstums änderte den Gehalt an aliphatischen GIu- cosinolaten nicht wesentlich.
Gluconasturtiin war das einzige aromatische Glucosinolat, das in Rübenpflanzen (Brassia rapa) identifiziert wurde. Sein Gehalt in den Exsudaten war 2-fach erhöht in einer doppelt konzentrierten Hoagland Lösung im Vergleich zu einer einfach konzentrierten Hoagland Lösung, und die Konzentration der aromatischen Gluco- sinolate wurde bei zusätzlicher Gabe von Schwefel reduziert. Die Zugabe von Sa- licylsäure und Methyljasmonat zu Beginn der Kultur (SA0 und MJ0) steigert den Gehalt von Gluconasturtiin um 50 bis 70 % im Vergleich zu 2H2S. Dies war auch bei Verabreichung von Salicylsäure am 25. Tag des Experiments der Fall.
Der Gehalt der Indolglucosinolate in Exsudaten änderte sich bei Anstieg der Konzentration der Hoagland Lösung praktisch nicht, aber er stieg um ca. 1 ,5-fach nach der Verabreichung von zusätzlichem Schwefel. Beide Elicitoren, Salicylsäure und Methyljasmonat, verabreicht zu Beginn der Kultur, bewirkten einen überraschend starken Anstieg der Indolglucosinolate in Exsudaten (3,3-fach mehr als von 2H2S für SA0 und 2,8-fach mehr für MJ0). Selbst bei Gabe von Salicylsäure am 25. Kulturtag stieg der Gehalt der Indolglucosinolate immer noch auf den 1 ,8- fachen Wert im Vergleich zu 2H2S. Der deutlich überproportionale Anstieg der Indolglucosinolate bei Verabreichung von Salicylsäure oder Methyljasmonat ist überraschend und wurde von den Erfindern nicht erwartet. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Gewinnung von hohen Indolglu- cosinolaten, die besonders vorteilhaft in der Krebstherapie, als Nahrungsergän- zungsmittel oder als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Funcitonal Food verwendet werden können.
Fig. 3 zeigt die Kinetik der Rhizosekretion, insbesondere die Kinetik von Glucosi- nolaten in Exsudaten von Pflanzen, die im hydroponischen System angezogen wurden. Die Untersuchungen der Exsudationskinetiken zeigte, dass der Gehalt an exsudierten Glucosinolaten in den ersten 10 Tagen des Experiments nicht we- sentlich durch die Nährstoffkonzentration beeinflusst wurde (Fig. 3 - linke Seite). Während der nächsten 10 Tage stieg der Gehalt der exsudierten Glucosinolate in jenen Pflanzen, die mit anfänglicher Hoagland Lösung (1 H) behandelt wurden en- benso wie für jene, die mit der modifizierten, zweifach konzentrierten Hoagland Lösung behandelt wurden (2H). Zwischen dem 20. und dem 30. Tag des Versuchs stieg der Gehalt der Glucosinolate für 1 H und 2H2S, aber er fiel für 2H leicht ab. Der Anstieg des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten nach der Verabreichung beider Elicitoren wurde bereits zu Beginn des Experiments beobachtet (Fig. 3 - rechte Seite). In dem System, in dem MJ verwendet wurde, wurde der höchste Gehalt an exsudierten Glucosinolaten unmittelbar nach dem Behandlungsbeginn (3,1 -fach gesteigert gegenüber der unbehandelten Variante) gemessen, während der Gehalt gegen Ende des Experiments schnell abfiel. Während der ersten 10 Tage nach der Salicylsäure Behandlung exsudierten die Pflanzen 2,4-fach mehr Glucosinolate als die Kontrollpflanzen ("C" = 2H2S - zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel) ohne Elicitor Behandlung. Der Gehalt der Glucosinolate, die in dem Zeitraum zwischen dem 10. und dem 15. sowie zwischen dem 15. und dem 20. Tag des Experiments exsudiert wurde, betrug 2,1- bzw. 1 ,9-fach mehr als die Kontrolle im selben Zeitraum. Die Intensität der Exsudation verringerte sich für Salicylsäure behandelte Pflanzen ebenso wie für Methyljasmonat behandelte Pflanzen gegen Ende des Wachstums. Somit ist die pflanzliche Reaktion bzw. Antwort auf die Elicitoren Verabreichung eine einmalige Antwort bzw. ein einmaliges Ereignis, die/das während der ersten Tage nach der Behandlung stattfindet und anschließend schrittweise abfällt. Deshalb ist es insbesondere bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Elicitoren Behandlung mit Salicylsäure und/oder Methyljasmonat unmittelbar zu Beginn des Experiments durchzuführen, am besten den bzw. die Elicitoren zusammen mit der Nährlösung zu Beginn am Tag Null des Experiments zu verabreichen.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines zu Fig. 3b parallel durchgeführten Versuchs, mit dem Unterschied, dass die Pflanzen im aeroponischen System angezogen wurden. Insbesondere ist die Behandlung mit Elicitoren gezeigt, die zu einer Verstär- kung der Glucosinolat Rhizosekretion im Vergleich zur Kontrolle führte. Die Untersuchung der Exsudationskinetiken von sekundären Wurzeln zeigte, dass der Anstieg des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten nach der Verabreichung beider Elici- toren bereits unmittelbar nach dem Beginn des Experiments beobachtet wurde. Bei der Behandlung mit Methyljasmonat, wurde der höchste Gehalt an exsudier- ten Glucosinolaten unmittelbar nach der Behandlung gemessen, während der Glucosinolat Gehalt zum Ende des Experiments (Tag 30) abfiel. Der Glucosinolat Gehalt, der aus den Pflanzen während der ersten zehn Tage nach der Behandlung exsudiert wurde, betrug 2,1 mg/Pflanze und lag somit 3,1 -fach über den Werten der Kontrolle. Zwischen dem 10. und dem 15. Tag ebenso wie zwischen dem 15. und 20. Tag fiel der Glucosinolat Gehalt auf 1 ,5 mg/Pflanze und betrug somit nur noch 2,0- bzw. 1 , 8-fach des Werts der Kontrolle. In den nächsten fünf Tagen lag er nahezu bei dem Wert der Kontrolle. Während der letzten fünf Tage des Pflanzenwachstums bei dieser Behandlung erreichte der Glucosinolat Gehalt einen Wert von 1 ,0 mg/Pflanze, der 0,2 mg/Pflanze unter dem Wert der Kontrolle lag. Während der ersten zehn Tage nach der Salicylsäure Verabreichung exsu- dierten die Pflanzen 1 ,6 mg/Pflanze Glucosinolate, was 2,4-fach über den Werten der Kontrolle lag. Der Gehalt der Glucosinolate, die während dem Zeitraum zwischen dem 10. und dem 15. sowie dem 15. und dem 20. Tag des Experiments exsudiert wurden, betrug 1 ,6 mg/Pflanze. Diese Werte liegen 2,2- bzw. 1 , 9-fach über dem Wert der Kontrolle im selben Zeitraum. Zwischen dem 20. und dem 25. Tag sowie zwischen dem 25. und dem 30. Tag des Experiments exsudierten die Pflanzen nach der Salicylsäure Behandlung 1 ,4 mg Glucosinolate/Pflanze, so dass der Wert 1 ,2-fach bzw. 1 ,3-fach über der Kontrolle lag. Zu Beginn des Experiments bewirkte die Verabreichung von Methyljasmonat eine stärkere Zunahme des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten im Vergleich zu Salicylsäure, was nach Ansicht der Erfinder möglicherweise dadurch erklärt wird, dass Salicylsäure nicht nur die Glucosinolat Synthese sondern auch ihren Abbau durch Beeinflussung der Aktivität des Enzyms Myosinase verstärkt. B. Detaillierte Beschreibung der verwendeten Materialien und der Ergebnisse
1. Anzucht der Pflanzen
Die Rübensamen wurden in Grodan Steinwolle Pflanzwürfeln (5 cm Breite x 5 cm Tiefe x 5 cm Höhe), die in Standard Gewächshaus Plastikschalen (52 cm breit x 35 cm tief x 7 cm hoch) gesetzt wurden, angezogen. Die Samen wurden mit halbkonzentrierter Hoagland Lösung über oberhalb der Pflanzenkultur angebrachten Feuchtigkeitssystemen bewässert. Sie wurden vorgekeimt, bis die Wurzeln der Setzlinge ca. 2 bis 4 cm aus dem Boden der Würfel hervorgetreten waren. Dies war nach ca. 15 bis 20 Tagen bei 2 Blättern und einem Wurzelgewicht von ca. 3 g der Fall. Die Würfel wurden anschließend in 10 x 11 cm Abständen in die Löcher von Polystyrol Platten (1 m x 1 m groß, 4,5 cm dick) eingesetzt, die anschließend in die aeroponi- schen bzw. hydroponischen Systeme eingesetzt wurden.
2. Technische Charakteristika der aeroponischen und hydroponischen Systeme
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden sowohl aeroponische als auch hydroponische Systeme verwendet. Diese erdlosen (=erdfreien) wasserbasierten Systeme besitzen den Vorteil, dass die Nährstoffe direkt in Wasser gelöst sind und die Pflanzen die Nährstoffe zu jedem Zeitpunkt aufnehmen können. Aufgrund der ubiquitären Verfügbarkeit der gewünschten Nährstoffmenge kann die Pflanze die von ihr individuell benötigte Menge jederzeit direkt über die Wurzel aufnehmen. Außerdem sind die erdfreien Systeme vorteilhaft, weil der pH-Wert und der Nährwert des Wassers auf einfache Weise gemessen und die gewünschten Werte aufrechterhalten werden können. Die wasserbasierten Systeme steigern das Pflanzenwachstum und die Ausbeute pro Fläche gegenüber den erdhaltigen Syste- men (=Erdsystemen) deutlich. Darüber hinaus ist die Gefahr des Schädlingsbefalls sowie das Auftreten von Erkrankungen an den Pflanzen deutlich reduziert. Außerdem entfällt das Gießen der Pflanzen nach einem Gießplan. In den vorliegenden Experimenten wurden neben den hydroponi- schen Systemen auch aeroponische Systeme mit dem Ziel verwendet, die Menge des verwendeten Wassers im System maximal zu minimieren, was die Exsudat Extraktion einfacher macht. Auf diese Weise kann das aeroponische System sehr wirtschaftlich betrieben werden. Im Rahmen der Erfindung wurden drei verschiedene Systeme installiert, nämlich ein aeroponi- sches System mit einer Sprühvorrichtung, ein aeroponisches System mit einem Nebelzerstäuber oder einem Defensor und ein hydroponisches System. Die Sprühvorrichtung des aeroponischen Systems war in dem konkreten Beispiel als Sprühdüsen ausgebildet.
Die durchgeführten Experimente im aeroponischen bzw. hydroponischen System sind schematisch in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Schematische Darstellung der Experimente
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H - Hoagland Lösung; ,5H - 1.5-fache Konzentration der Hoagland Lösung; H - doppelte Konzentration der Hoagland Lösung; 2S - doppelte Schwefel-Konzentration; SA0 - Salicylsäure, appliziert am 1. Tag; MJ - Methyljasmonat, appliziert am 1. Tag; SA-I5 - Salicylsäure, appliziert am 15. Tag; SA2O - Salicylsäure, appliziert am 20. Tag; SA25 - Salicylsäure, appliziert am 25. Tag.
2.1 Aeroponisches System
In aeroponischen Systemen werden die Pflanzen mit Nährstoffen durch befeuchtete Luft versorgt. Die Wurzeln befinden sich in der Wachstumskammer, wo sie in kurzen Intervallen, für gewöhnlich Intervallen von wenigen Minuten mit dem Feuchtigkeitsnebel der Nährstofflösung besprüht wurden. Die Lösung wurde direkt aus ihrem Vorratstank über eine Pumpe entnommen und auf die Pflanzenwurzeln gesprüht. Die Pumpe wurde zeitlich präzise kontrolliert, so dass die Sprühzyklen exakt von wenigen Sekunden bis einige Minuten reichten.
2.2.1 Aeroponisches System mit Sprühdüsen
Im aeroponischen System, das mit Sprühdüsen ausgestattet ist, wurden die Wurzeln in einem Nebel aus der Nährstofflösung- gehalten. Der Nebel der Nährstofflösung enthält eine relative Luftfeuchtigkeit von nahezu 100 % und verhindert wirksam das Austrocknen der Pflanzenwurzeln. Im Rahmen der Erfindung wurde das aeroponische System mit Sprühdüsen des Typs Dan Fogger 7800, Dan Sprinklers, Kibbutz Dan Israel, verwendet. Die Nährstofflösung wurde mit der zweistufigen Zentrifugalpumpe CH-60 (Modell A-A- CVBV, Grundfos, Erkrath, Israel) von einem Speichertank über einen Bitron 15 Filter (Typ G15T8, Oase, Berlin, Deutschland) zu dem Anzuchtbett gepumpt. Von dort konnte die überschüssige Nährstofflösung zu dem Speichertank zurückgeführt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das aeroponische System mit Sprühdüsen kontinuierlich verwendet, d.h. die Nährstofflösung wurde konstant und kontinuierlich ohne Intervalle auf die Pflanzenwurzeln aufgesprüht. Diese Verwendung des aeroponi- schen Systems ist unüblich, aber die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die Rübenwurzel sehr empfindlich gegenüber einem auftretenden Wassermangel reagiert. Der Druck der Pumpe betrug 2 bar, wobei im Stand der Technik für gewöhnlich 4 bar verwendet werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch herausgefunden, dass der im Stand der Technik verwendete Druck zu einer mechanischen Schädigung der Rübenwurzeln führt.
2.1.2 Aeroponisches System mit Defensor
Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete aeroponische System mit Defensor enthielt den Defensor des Typs 505, WMH Walter Meier Holding, Pfäffikon, Deutschland. Der rotierende bzw. drehende Zerstäuber bildete feinsten Nebel aus Nährstofflösung. Die Größe der Wasserpartikel im versprühten Nährstoffnebel beträgt ca. 5 bis 10 μm. Eine Zeitschaltuhr schaltete die Pumpe (Typ 505, Axair AG, Pfäffikon, Deutschland) für 15 Minuten bei einem 30-minütigen Intervall an. Der Defensor (Typ 505) selbst enthält einen rotierenden Kreisel (Zentrifuge), einen Raum in dem sich trockene Luft befindet, eine rotierende Platte sowie einen Feuchtigkeitsring, der die feuchte Luft als fein zerstäubten Feuchtigkeitsnebel (Aerosol) nach außen abgibt.
2.2 Hydroponisches System
Im hydroponischen System mit schwimmender Plattform und einem Belüftungssystem waren die Pflanzen direkt in der schwimmenden Plattform angeordnet, die auf der Oberfläche der Nährstofflösung schwamm. Das hydroponische System wurde durch einen Kompressor (Modell 40A-10011 , Hiblo, Deutschland) belüftet. Der Kompressor blies Luft durch die Nährstofflösung in einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 100 ml/min. Insgesamt waren 10 Belüftungsröhrchen vorgesehen, die alle gleichzeitig betrieben wurden.
3. Gewächshausbedingungen für das Pflanzenwachstum
3.1 Licht
Die Pflanzen wurden mit einer Belichtung von 12 Stunden, die der Tagzeit entspricht von 8 Uhr morgens bis 8 Uhr abends und hV 400 μmol/m2s angezogen. Es wurden Quantensensoren (Modell Li-190 SZ, LI-COR Lincoln, Nebraska, USA) zum Messen der photosynthetisch wirksamen bzw. aktiven Strahlung verwendet. Wenn die natürliche Strahlung außerhalb des Gewächshauses 450 μmol/m2s überstieg, wurden die Pflanzen durch über ihnen angebrachte Jalousien bzw. Lamellen beschattet. Als künstliche Lichtquelle wurden SRG 140 (Philips, Deutschland) Lampen verwendet, die das Pflanzenwachstum mit Licht, das ein natürliches Spektrum aufweist, fördern. Die Lampen waren 1 ,5 m über den Wachstums- bzw. Kultivierungssystemen angebracht, und sie deckten ungefähr 2 m2 der Oberfläche pro Lampe ab.
3.2 Temperatur
Die Lufttemperatur im Gewächshaus betrug 16CC während des Tages und 12°C während der Nacht. In der Wurzelzone überschritt die Temperatur die Lufttemperatur um ungefähr 1 bis 2°C. Das Gewächshaus wurde belüftet, wenn die Temperaturen die oben genannten Werte überschritten.
3.3 Luftfeuchtigkeit
Die Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus erreichte 60 %. Sie wurde durch das Nebelsystem HNS (Typ 7, Osberma, Engelskirchen, Deutschland) mit HNS Düsen (Typ 07.1 , Osberma, Engelskirchen, Deutschland) erreicht. Die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus wurden mit Entlüftern, Typ 77001 (Henrich Zeiseniss Wasser Technik, Herrsching, Deutschland) bestimmt und aufgenommen. Die Temperatur in den Wurzelzonen innerhalb der aeroponischen Systeme wurde mit dem Psychrometer PT 100 (Typ WTE 10, Geraberg GmbH, Geraberg, Deutschland) bestimmt und aufgenommen. Die Temperatur, die Belichtung und die Feuchtigkeitsbedingungen in der Wachstumskammer wurden mit RAM CC 600 Ausstattung (Typ DT 500, Ltd Rowville, Victoria, Australien) kontrolliert. Die Messungen wurden einmal pro Minute durchgeführt, und der Durchschnittsmittelwert wurde einmal pro Stunde gespeichert. Die gesamten oben genannten Bedingungen wurden konstant während des vegetativen Zeitraums aufrechterhalten.
4. Herstellung der Exsudatproben
Es wurden jeweils vier Probenwiederholungen 1 I Probenlösung, welche die Pflanzenwurzelexsudate enthielt, von jedem System alle 10 Tage für das erste Experiment und alle 5 Tage beginnend am Tag 10 für das zweite und das dritte Experiment entnommen. Während der Probenentnahme wurden die Wurzeln zusätzlich mit der Lösung des Wachstums- bzw. Kultivierungssystems unter Verwendung des Kompressors (Typ 3590, Agrotop GmbH, Obertraubling, Deutschland) gewaschen. Zu der Probenlösung wurden 20 μM/l AgNO3 zugegeben, um die Zerstörung der Glucosinolate durch das Enzym Myrosinase, die ebenfalls in das Wachstumsmedium abgegeben wird, zu verhindern. AgNO3 stoppt nachweislich die Aktivität von Myrosinase. Nach der Probenentnahme wurde die Nährstofflösung in jedem System erneuert. Die Proben wurden zunächst unter Verwendung von Papierfiltern (N 604, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) gefiltert. Die Exsudatproben wurden durch Scaleup Ultrafiltration und reverse Osmose im Tangentialfluss Filtrationssystem (ProScale System mit Helicon-RO-4 Spi- ralwickelmodule, die eine Nanomax-95 Membran, erhalten von Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland) verarbeitet. Die Proben wurden anschließend in 600 ml Glasflaschen (Christ, Osterode am Harz, Deutschland) ü- bertragen, bei -28°C gefroren und gefriergetrocknet.
Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 250 bis 2000 Da wurden ausgewählt und konzentriert, und monovalente Salze wurden aus der Lösung entfernt. Das im Rahmen der Erfindung durchgeführte Verfahren zur Herstellung der Exsudatproben benötigt weniger Schritte als das herkömmliche Verfahren zur Herstellung von oberirdischem Pflanzenmaterial. Die klassischen Herstellungsverfahren umfassen die Schritte des Reinigens, Einfrierens und Gefriertrocknens, des Mahlens und des Extrahierens der benötigten Verbindungen. Im Rahmen der Erfindung wurde ein zusätzlicher Verfahrensschritt in das Verfahren zur Herstellung der Exsudatproben für die HPLC eingeführt. Der Zusatzschritt umfasst die Präfiltration und die Konzentration der Flüssigkeit. Dennoch werden die herkömmlichen Schritte des Mahlens und des Extrahierens des Pflanzenmaterials vermieden, so dass das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Stand der Technik Vorteile besitzt.
5. Glucosinolat Extraktion und Bestimmung durch HPLC
Für die Bestimmung der Glucosinolate durch HPLC wurde das HPLC Verfahren nach Krumbein et al. (2005) verwendet. Gefriergetrocknetes Probenmaterial, das aus getrockneten Substanzen von 1 I der Lösung mit Exsudaten bestand, wurde erhitzt und bei 750C für 1 min. inkubiert, mit 4 ml eines Methanol/Wassergemisches (v/v = 7:3; T = 700C) extrahiert und nach dem Hinzufügen von 1 ml 0,4 M Bariumacetat bei 400 rpm für 10 min. zentrifugiert. Der Rückstand wurde noch 2x mit 30 ml Methanol/Wassergemisch (v/v = 7:3; T = 700C) extrahiert. Das extrahierte Material wurde vereinigt und auf 10 ml aufgefüllt. Davon wurden 5 ml des Extrak- tes auf einen 250 μl DEA-Sephadex A-25 Ionenaustauscher (mit Essigsäure aktiviert, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) aufgetragen und mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser gespült. Als nächstes wurden 250 μl einer gereinigten Lösung von Arylsulfatase (Boehringer- Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgebracht und für 12 h auf dem Austauscher belassen, bevor die Desulfoverbindungen mit 5 ml doppelt destilliertem Wasser eluiert wurden. Die Desulfoglucosinolat Analyse wurde durch HPLC (Merck HPLC Pumpe L-7100, DAD Detektor L-7455, automatische Probenverarbeitung AS-7200 und HPLC Manager Software D-7000) unter Verwendung einer Spherisorb ODS2 Säule (5 μm, 250 x 4 mm) durchgeführt. Es wurde ein Gradient von 0 - 20 % Acetonitril in Wasser für 2 bis 34 min., gefolgt von 20 % Acetonitril in Wasser bis zur 40sten Minute und anschließend 100 % Acetonitril für 10 min. bis zur 50sten Minute gewählt. Die Bestimmung wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ,3 ml/min und einer Wellenlängen von 229 nm durchgeführt. Sinigrin (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) und Glucotropaeolin (AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) wurden als Standards verwendet.
Die einzelnen Glucosinolate wurden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten (Rückhaltezeiten) mit einzelnen Glucosinolaten in den Rapsölsamen (BCR- 190C und BCR-367 R), die als Standardreferenzmaterialien verwendet wurden, identifiziert. Der Glucosinolat Gehalt wurde unter Verwendung von Sinigrin als internem Standard und dem Response Faktor (Antwortfaktor) jeder Verbindung im Vergleich zu Sinigrin berechnet. Die Bestimmung der Glucosinolate wurde jeweils doppelt durchgeführt, und die Konzentrationen der Glucosinolate wurden als mg exsudierte Glucosinolate pro Pflanze ausgedrückt. Die Daten zeigen die Dynamik des Glucosinolat Gehalts sowohl in Pflanzen als auch in Exsudaten während des Versuchs ebenso wie in den Exsudaten, die während des 30 Tage andauernden Experiments gesammelt wurden. Die in Rüben (Brassia rapa) vorkommenden Glucosinolate sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Glucosinolate in Rüben
Figure imgf000029_0001
Der jeweilige Glucosinolat Gehalt wurde über die jeweiligen Peakflächen unter Verwendung von Sinigrin als internem Standard und dem Response Faktor jeder Verbindung relativ zu Sinigrin berechnet. Der Gehalt der Glucosinolate in Exsudaten einer Pflanze wurde durch die folgende Formel berechnet:
C - VoI
Cex = NpI
Cex: Gehalt an einzelnen Desulfoglucosinolaten in Exsudaten pro mg
Pflanze
VoI: Volumen der Lösung im System in I NpI: Menge der Pflanzen im System pro Pflanze C: Gehalt an einzelnen Deslufoglucosinolaten in der Lösung aus dem
Gesamtsystem in mg, wobei S RF Nis VoI'
C =
Sis RFis
S: Quadrat der Peakfläche von Desulfoglucosinolaten
Sis: Quadrat der Peakfläche des internen Standards
RF: Response Faktor von Desulfoglucosinolat
RFis: Response Faktor des internen Standards
Nis: Menge des internen Standards in mg/1
VoI': Probenvolumen in I.
Das Frischgewicht, das getrocknete Material, das Gesamtgewicht sowie die einzelnen Glucosinolat Gehalte in Pflanzen und Exsudaten wurden unter Verwendung von beschreibender Statistik und Varianzanalyse verrechnet. Der Mittelwertvergleich erfolgte nach dem Tukey's Honest Significant Diffe- rence Test (HSD, Signifikanzlevel α = 0,05). Alle statistischen Analysen wurden mit Statistica™ für Windows™ (Version 6.1 , Statstoft Inc.) durchgeführt.
7. Pflanzenwachstum bei unterschiedlicher Nährstoffversorgung
Die Erfinder haben zunächst eine Nährlösung ausgewählt, die ein ausreichendes Wachstum der Pflanzen von Brassica rapa sicherstellt. Diese Lösung wurde zur Steigerung des Glucosinolat Gehalts in Pflanzen ebenso wie in Exsudaten erfindungsgemäß modifiziert. Als Ausgangsnährlösung für das Wachstum von Rüben (Brassica rapa) wurde die Hoagland Lösung gewählt. Tabelle 3 zeigt die Bestandteile der Hoagland Lösung und ihre Modifikationen.
Tabelle 3: Hoagland Lösung und ihre Modifikationen
Bestandteile [mg/1 I] 1 H 2H 2H2S
Figure imgf000031_0001
1 H: Ausgangs Hoagland Lösung (1-fach) 2H: 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung
2H2S: 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerte Schwefelkonzentration
Die Salze können als zwei Einzellösungen (A und B) vorbereitet und gelagert werden. Unmittelbar vor dem Gebrauch werden die beiden Lösungen vereinigt.
Der Nährstoffgehalt der Ausgangs Hoagland Lösung wurde erhöht, weil die Erfinder an Rüben (Brassica rapa), die in Hoagland Lösung angezogen wurden, eine Gelbfärbung der Blätter (Chlorose) beobachtet haben. Aufgrund dieser Tatsache wurde die Nährstoffkonzentration in der Hoagland Lösung erhöht, wobei darauf geachtet wurde, dass eine Ausgewogenheit zwischen den einzelnen Bestandteilen bestehen blieb. Die Rübenpflanzen benötigten hohe Mengen an Schwefel in einem ausgewogenen Verhältnis zum Stickstoff. Dieser gesteigerte Schwefelbedarf von Pflanzen der Familie Brassicaceae war überraschend und wurde im Rahmen dieser Erfindung beobachtet und analysiert. Die Erfinder haben deshalb eine 2-fach konzent- rierte Hoagland Lösung, die eine 2-fach gesteigerte Schwefelkonzentration enthält, hergestellt und verwendet.
8. Verwendung von Elicitoren
Als Elicitoren wurden Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) verwendet. Salicylsäure wurde in einer Konzentration von 1 ,1 mg/l (= 110,0 mg/l) verwendet, während Methyljasmonat in einer Konzentration von 100 μg/l verwendet wurde. Beide Substanzen wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland bezogen. Die Elicitoren wurden zu der Nährstofflösung zu Beginn des Pflanzenwachstums in den aeroponischen Systemen gegeben, obwohl in vorhergehenden Studien (Van Dam et al., 2003) gezeigt wurde, dass eine Behandlung der Blätter mit Elicitoren den Glucosinolat Gehalt im Spross, aber nicht in den Wurzeln steigerte.
9. Ergebnisse
9.1 Gesamt Glucosinolate
Der Gesamt Glucosinolat Gehalt ebenso wie der Gehalt an individuellen ali- phatischen, aromatischen und Indolglucosinolaten wurde quantitativ in den Blättern, primären Wurzeln, sekundären Wurzeln und Exsudaten von Pflanzen der Ordnung Capparales, insbesondere Rübenpflanzen (Brassica rapa) bestimmt. Als Vertreter der aliphatischen Glucosinolate wurden Pro- goitrin, Gluconapin, Gluconapoleiferin und Glucobrasscianapin bestimmt. Gluconasturtiin wurde als Vertreter der aromatischen Glucosinolate bestimmt. Als prominente Vertreter der Indolglucosinolate wurden 4-Hydroxy- Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und GIu- cobrassicin analysiert. Der Gesamtgehalt der Glucosinolate in Pflanzen und ihren Exsudaten nach 30 Tagen betrug 22,1 mg/Pflanze für die Kontrollbehandlung, und sie war um ca. ein Drittel für die Behandlung mit den Elicito- ren Salicylsäure (Sa) und Methyljasmonat (MJ) erhöht, wobei die Werte jeweils 30,1 und 30,7 mg/Pflanze betrugen. Der Glucosinolat Gehalt, der in Exsudaten gefunden wurde, stieg von 4,6 mg/Pflanze (Kontrolle) auf 7,8 bzw. 7,3 mg/Pflanze für die Salicylsäure bzw. Methyljasmonat Behandlungen an. Die Erfinder nehmen an, das der Anstieg der Glucosinolate in den Exsudaten in der Freisetzung von Pflanzenabwehrstoffen, die durch das Zugeben des Elicitors ausgelöst werden, begründet ist.
Die Behandlung mit Salicylsäure und Methyljasmonat steigerte den Glucosinolat Gehalt in sekundären Wurzeln auf 10,2 bzw. 7,8 mg/Pflanze, was einer Steigerung von 2,1- bzw. 1 ,8-fach gegenüber der Kontrollbehandlung (4,8 mg/Pflanze) entsprach. Methyljasmonat konnte den Glucosinolat Gehalt in Blättern bis zu 6,1 mg/Pflanze (1 ,7-fach) steigern, wohingegen die Salicylsäure Behandlung zu einem niedrigeren Wert (3,6 mg/Pflanze) als in der Kontrolle führte. Die Erfinder nehmen an, dass diese Ergebnisse durch gesteigerte Expression von Genen, die in die Glucosinolat Synthese involviert sind ebenso erklärt werden können wie durch die Mobilisierung der Glucosinolate vom Spross durch Phloem Transport in die Wurzeln. Die Änderungen der metabolischen Profile der aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate, die durch Salicylsäure und Methyljasmonat Behandlungen bewirkt wurden, waren signifikanter in den Exsudaten als in den Pflanzengeweben. Die Erfinder nehmen an, dass dies auf die Elicitor induzierte Rhizosekretion, die auf einer de novo Synthese der sekundären Me- taboliten und nicht auf einem Elicitor induzierten Verlust aus den Wurzelgeweben beruht, zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zu- sammengefasst.
Tabelle 4 Glucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
Glucosi- Behand- Blätter sekundäre primäre Exsudate Pflanzen Pflanzen und nolate lung Wurzeln Wurzeln Exsudate Gesamt Kontrolle 3 ,6b + 0 ,4 4 ,8a + :0 ,1 9 ,3a + 0,2 4,6a + 0 ,6 17,7a±0,5 22,3' "±1,1
SA 3 ,oa + 0 ,1 10,2 ± 0,5 9 ,1a + 0,8 7,8b + 0 ,7 22,3b± 1,3 30,1' b±2,0
MJ 6 ,1C + 0 ,3 7 ,8b ± 1 ,5 9 ,4a + 0,2 7,3b ± 1 ,1 23,4b± 1,6 30,7' b±0,5
Alipha- Kontrolle 2 ,2a + 0 ,5 1 ,3a + 0 ,2 6 ,8C + 0,2 2,0b + 0 ,5 10,2° ±0,8 12,2' "±1,3 tische SA 1 ,8a + 0 ,1 1 ,6a + 0 ,1 3 ,5a ± 0,3 1,1a + O1 ,1 6,9a ± 0,4 8,0a ±0,5
MJ 3, ,1b + 0, A 1 ,1a + O1 ,1 4; ,2b ± 0,2 1,2at ' + 0 ,3 8,4b± 0,1 9,6b ±0,4
AromaKontrolle nnwb 1, ,2a + 0, ,1 0, ,6a ± 0,2 1,1a + 0, 1 1,9a±0,4 3,0a ±0,2 tisch SA 0, ,4a + 0, 1 2, 3b + 0, 1 3, 4b + 0,2 1,8b + 0, 3 6,1b±0,4 7,8b ±0,7
MJ 0, 6a ± 0, 1 2, 8b + 0, 6 3, 8b + 0,3 1,9b ± 0, 1 7,3c±0,7 9,1b ±0,7 lndol Kontrolle 0, 9a + 0, 3 2, 3a + 0, 3 1, 9b ± 0,1 1,5a + 0, 2 5,1a±0,7 6,6a ±0,5
2b
SA 0, 8a + 0, 2 6, 3C + 0, 3 2, ± 0,3 4,9C + 0, 4 9,3c±0,5 14,3C :±0,8
MJ 2, 5b + 0, 1 3, 9b + 0, 2 1, 3a ± 0,1 4,2b + 0, 2 7,7b±0,2 11,9fc '±0,4
Aliphatische Glucosinolate: Gluconapin, Progoitrin, Glucobrassicanapin, Gluconapoleiferin;
Aromatische Glucosinolate: Gluconasturtiin
Indolglucosinolate: Glucobrassicin, 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy- Glucobrassicin, Neoglucobrassicin
Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere für die Kontrolle die SA- und MJ-Behandlung, ebenso wie für jedes Pflanzenorgan und für die Exsudate. Die Werte, die von demselben Buchstaben gefolgt werden (a, b, c) sind nicht signifikant unterschiedlich, nnwb: nicht nachweisbar
9.2 Aliphatische Glucosinolate
Die aliphatischen Glucosinolate waren die Hauptklasse der Glucosinolate in Rübenpflanzen (Brassica rapa) und in Exsudaten der Kontrolle mit 12,2 mg/Pflanze, während der Gehalt der aromatischen und Indolglucosinolate 3,0 bzw.6,6 mg/Pflanze betrug (Tabelle 4). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Brassica rapa ein Glucosinolat Profil aufweist, das Butenyl- und Pentenylglucosinolate und ihre hydroxylierten Homologe umfasst. Progoitrin ist das am häufigsten in der Rübe identifizierte aliphatische Glucosi- nolat. Seine Konzentration erreichte 4,6 mg/Pflanze in Pflanzen und Exsudaten für die Kontrollbehandlung (Tabelle 5). Die Verabreichung von SaIi- cylsäure und Methyljasmonat erniedrigte den Progoitriη Gehalt in Pflanzen und Exsudaten auf 2,5 bzw. 2,6 mg/Pflanze. Der Progoitrin Gehalt, der in Exsudaten nach einer Methyljasmonat Behandlung gefunden wurde, war gleich zu der Kontrollbehandlung, nämlich 0,6 mg/Pflanze, während er nach einer Salicylsäure Behandlung auf 0,4 mg/Pflanze abfiel. In den Pflanzen fiel der Progoitrin Gehalt hauptsächlich auf Kosten der primären Wurzeln, was bedeutete, dass sein Gehalt in der Kontrolle 2,5 mg/Pflanze betrug, im Vergleich zu 1 ,2 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 1 ,4 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung.
Dieselben Veränderungen wurden auch für Gluconapin beobachtet, wo der Gesamtgehalt in Pflanzen und in Exsudaten 1 ,7 mg/Pflanze in der Kontrolle im Vergleich zu 1 ,1 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 1 ,3 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung erreichte (Tabelle 5).
Der Gehalt an Gluconapoleiferin und Glucobrassicanapin in beiden Pflanzen und Exsudaten betrug 2,0 bzw. 1 ,2 mg/Pflanze für die Kontrolle. Diese Werte wurden durch eine Salicylsäure Behandlung nicht beeinflusst. Jedoch steigerte eine Methyljasmonat Behandlung den Gehalt an Gluconapoleiferin auf 1 ,3 mg/Pflanze, während die Methyljasmonat Behandlung den Glucobrassicanapin Gehalt auf 2,4 mg/Pflanze in den Pflanzen und den Exsudaten steigerte. Der größte Anstieg wurde in den Blättern beobachtet, wo Gluconapoleiferin einen Wert von 0,9 mg/Pflanze und Glucobrassicanapin einen Gehalt von 1 ,1 mg/Pflanze, jeweils nach der Methyljasmonat Verabreichung im Vergleich zu 0,6 bzw. 0,1 mg/Pflanze für die Kontrolle erreichten. Die Ergebnisse der Analysen der aliphatischen Glucosinolate sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Aliphatische Glucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
GlucosiBehandBlatter sekundäre primäre Exsudate Pflanzen Pflanzen und nolate lung Wurzeln Wurzeln Exsudate
Gluconapin Kontrolle 0,5aD±0,2 0 ,1a± 0 1 0,7a ± 0,3 0 ,4b±0 ,0 1,3a + 0,6 1,7" + 0,6
SA 0,3a± 0,2 0 ,1a± 0 1 0,6a ± 0,6 0 ,1a±0 ,1 1,0a ± 0,5 1,1" ± 0,2
MJ 0,7b± i 0,2 0 ,1a± 0 1 0,3a ± 0,2 0 ,2a ± 0 ,0 1,0a ± 0,5 1,3a ± 0,5
Progoitπn Kontrolle 0,8D± 0,0 0 ,6b± 0 2 2,5D ± 0,2 0 ,6b±0: ,1 3,9° + 0,4 4,6D + 0,3
SA 0,5ab ± 0,3 0, ,5ab ± C )4 1,2" + 0,4 0; ,4a ± 0, 0 2,2ab±0,3 2,5a ± 0,4
MJ 0,4a± 0,0 0, ,2a± 0 2 1,4a + 0,4 O1 ,6b±0, ,1 2,0a ± 0,1 2,6a ± 0,3
Glucobras- Kontrolle 0,1a + 0,1 0, 1a± 0 1 0,6a + 0,1 0, ,4b ± 0, 0 0,8a ± 0,3 1,2a ± 0,3 sicanapin SA 0,3b± 0,1 0, 2a± 0 2 0,8al :0,4 0, t1a±0, 1 1,2b ± 0,0 1,3a + 0,2
MJ 1,1C±C ),4 0, 1a± 0 1 1,0b + 0,1 0, 1a±0, 1 2,2C + 0,6 2,4b + 0,3
Glucona- Kontolle 0,6a± 0,2 0, 3a± 0 2 1,0D + 0,1 0, 1a±0, 1 1,9a ± 0,0 2,0a + 0,2 poleifeπn SA 0,7a± 0,1 0, 5a± 0 4 0,6a + 0,2 0, 2a±0, 2 1,8a ±0,5 2,0a + 0,2
MJ 0,9a± 0,6 0, 1a± 0 1 1,2b + 0,5 0, 1a±0, 1 2,2b + 0,2 2,3a + 0,5
Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsaure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden.
Die Gls-elong Gene von Brassica rapa regulieren die Bildung von Elonga- se, was zur Kettenverlangerung von synthetisierten Glucosinolaten führt Dies könnte das Verhältnis von Butenyl- zu Pentenylglucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten von Brassica rapa von 2:1 in den Kontrollbehandlungen (6,2 : 3,1 mg/Pflanze) erklaren (siehe Tabelle 6) Das Verhältnis von Butenyl- zu Pentenylglucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten änderte sich jedoch dramatisch unter dem Einfluss von Salicylsaure und Methyljasmonat Das Verhältnis betrug 1,1 . 1 (3,7.3,3 mg/Pflanze) bei Salicylsaure und 0,8 : 1 (3,9 : 4,7 mg/Pflanze) bei Methyljasmonat. Die Erfinder gehen davon aus, dass die Elicitoren die Expression der Gls-elong Gene nach der Verabreichung der Elicitoren beeinflussen. Die Alkenylglucosinolate Gluco- napin und Glucobrassicanapin durchlaufen eine Hydroxylierung und damit eine Umwandlung in die Hydroxyalkenylglucosinolate Progoitrin und Gluco- napoleiferin. Das Verhältnis von Hydroxyalkenylglucosinolaten zu Alke- nylglucosinolaten betrug 2,3 : 1 für die Kontrollbehandlungen (6,6 : 2,9 mg/Pflanze). Jedoch änderte sich das Verhältnis auf 1 ,8 : 1 (4,5 : 2,5 mg/Pflanze) in Pflanzen und Exsudaten nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 1 ,4 : 1 (4,9 : 3,6 mg/Pflanze) in Pflanzen und Exsudaten nach einer Methyljasmonat Behandlung. Die Erfinder nehmen an, dass die Elicitoren die Herunterregulation der Gls-oh Gene bewirken, die den Gehalt der Alkenylglucosinolate für die Salicylsäure- und Methyljasmonat Behandlungen reduzierten und die Hydroxyalkenylglucosinolate nach der Methyljasmonat Behandlung erhöhten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammen- gefasst.
Tabelle 6: Zusammenhang zwischen den Subklassen von aliphati- schen Glucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
Behandlung Butenyl/ Pentenyl- Hydroxyalkenyl/ Alkenylglucosinolate glucosinolate
Kontrolle 6,3 : 3,2 6,6 : 2,9
SA 3,7 : 3,3 4,5 : 2,5
MJ 3,9 : 4,7 4,9 : 3,6
Butenylglucosinolate: Gluconapin und Progoitrin Pentenylglucosinolate: Glucobrassicanapin und Gluconapoleiferin Hydroxylalkenylglucosinolate: Progoitrin und Gluconapoleiferin Alkenylglucosinolate: Glucobrassicanapin und Gluconapin 9.3 Aromatische Glucosinolate
Gluconasturtiin war das einzige aromatische Glucosinolat, das in Brassica rapa nachweisbar ist. Sein Gehalt erreichte in Kontrollpflanzen und Exsudaten Werte von 3,0 mg/Pflanze und stieg auf 7,8 (2,6-fach) nach einer SaIi- cylsäure Behandlung und sogar auf 9,1 mg/Pflanze (3,0-fach) nach einer Methyljasmonat Behandlung (Tabelle 4). Dieser Anstieg ist insbesondere in primären Wurzeln der Pflanzen beachtlich. Dort stieg der Gehalt des aromatischen Glucosinolats Gluconasturtiin von Werten von 0,6 mg/Pflanze auf 3,4 mg/Pflanze nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 3,8 mg/Pflanze nach einer Methyljasmonat Behandlung. In den Exsudaten der Kontrollbehandlung betrug der Gluconasturtiin Gehalt 1 ,1 mg/Pflanze und stieg auf 1 ,8 bzw. 1 ,9 mg/Pflanze nach der Verabreichung von Salicylsäure bzw. Methyljasmonat. Dies bedeutet einen 60 bzw. 70 % Anstieg im Vergleich zu der Kontrolle.
Interessanterweise waren aromatische Glucosinolate in den Blättern nur nach Verabreichung der Elicitoren nachweisbar (SA: 0,4 mg/Pflanze und MJ: 0,6 mg/Pflanze). Diese Beobachtung lässt die Erfinder vermuten, dass die Elicitoren das Auftreten von Glucosinolaten in Organen bewirken, in denen sie zuvor nicht anwesend waren. Die Erfinder vermuten weiter, dass der Anstieg der aromatischen Glucosinolate in allen Pflanzenteilen nach der Verabreichung der Elicitoren über die Induktion von CYP79A2 erklärt werden kann, das Phenylalanin in aromatische Aldoxime umwandelt und gleichmäßig in Blättern und Wurzeln exprimiert wird.
9.4 Indolglucosinolate
In diesem Experiment betrug der Gesamtgehalt an Indolglucosinolat in den Pflanzen 5,1 mg/Pflanze und 1 ,5 mg/Pflanze in den Exsudaten für die Kontrollbehandlung (Tabelle 4). Beide Elicitoren bewirkten einen Anstieg des Indolglucosinolat Gehalts in Pflanzen (SA: 9,3 mg/Pflanze (2,2-facher Anstieg) und MJ: 7,7 mg/Pflanze (1 ,8-facher Anstieg)). Der Effekt war am deutlichsten in den sekundären Wurzeln (SA: 6,3 mg/Pflanze (2,7-facher Anstieg) und MJ: 3,9 mg/Pflanze (1 , 7-facher Anstieg)) und in den Exsudaten (SA: 4,9 mg/Pflanze (3,3-facher Anstieg) und MJ: 4,2 mg/Pflanze (2,8- facher Anstieg)) (Tabelle 4).
Die Indolglucosinolate, die in Brassica rapa vorkommen, sind 4-Hydroxy- Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin und Neoglucobrassicin. Dies sind Derivate von Glucobrassicin, nachdem es die Hydroxylierung und Me- thoxylierung durchlaufen hat. In den Experimenten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, induzierte die Salicylsäure- und Methyljasmonat Verabreichung auch einen spezifischen Anstieg des In- dolglucosinolat Gehalts (Tabelle 7). Jedoch ist es wichtig anzumerken, dass die Elicitoren die einzelnen Indolglucosinolate in unterschiedlichen Ausmaßen beeinflussten. Salicylsäure steigerte den Gehalt von Glucobrassicin, 4- Methoxy-Glucobrassicin und Neoglucobrassicin in Pflanzen sehr viel stärker als Methyljasmonat. In den Pflanzen und den Exsudaten für die Kontrolle wurden 1 ,3 mg/Pflanze Glucobrassicin und 3,3 mg/Pflanze Neoglucobrassicin beobachtet. Überraschenderweise wurden nach der Elicitoren Behandlungen sehr viel höhere Mengen beobachtet, nämlich 3,4 mg/Pflanze Glucobrassicin und 2,2 mg/Pflanze 4-Methoxy-Glucobrassicin nach Salicylsäure Behandlung und 2,6 mg/Pflanze Glucobrassicin und 1 ,3 mg/Pflanze 4-Methoxy-Glucobrassicin nach Methyljasmonat Behandlung. Der Anstieg des Glucobrassicin Gehalts fand hauptsächlich in den sekundären Wurzeln statt. Die Werte betrugen 0,3 mg/Pflanze für die Kontrolle, 2,2 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 0,9 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung. In den Exsudaten war der Glucobrassicin Gehalt von 0,4 mg/Pflanze (Kontrolle) auf 0,7 mg/Pflanze (SA Behandlung) und 0,9 mg/Pflanze (MJ Behandlung) erhöht. In Brassica rapa war Neoglucobrassicin das vorherrschendste Indolglucosi- nolat. Sein Gehalt erreichte in den Pflanzen 2,6 mg/Pflanze, während es in den Exsudaten in einer Menge von 0,7 mg/Pflanze vorkam. Es wurde auch am meisten durch die beiden verwendeten Elicitoren beeinflusst. In Pflanzen, die mit Salicylsäure behandelt wurden, stieg sein Gehalt auf 3,4 mg/Pflanze, während sein Gehalt unter Methyljasmonat Behandlung sogar auf 3,6 mg/Pflanze, jeweils im Vergleich zur Kontrolle anstieg. Dies bedeutete einen Anstieg von 31 bzw. 40 % im Vergleich zur Kontrolle. In den Exsudaten wurden nach Salicylsäure Behandlung ebenfalls große Anstiege beobachtet. Der absolute Wert lag bei 3,4 mg/Pflanze (4,9-facher Anstieg). Nach der Methyljasmonat Behandlung lag der Wert bei 2,4 mg/Pflanze, was einem 3,4-fachen Anstieg entsprach. Die höchste Zunahme an Neoglucobrassicin nach der Verabreichung von Elicitoren wurde in den sekundären Wurzeln beobachtet, wo der Gehalt 2,3 mg/Pflanze nach Salicylsäure Behandlung und 2,6 mg/Pflanze nach Methyljasmonat im Vergleich zu 1 ,7 mg/Pflanze für die Kontrolle erreichte. Es wurde kein Methoxy- Glucobrassicin in den Blättern und den primären Wurzeln der unbehandelten Pflanzen nachgewiesen, aber die Verabreichung von Elicitoren führte zu einer Anreicherung von 0,1 bzw. 0,3 mg/Pflanze jeweils in den Blättern und den primären Wurzeln nach einer Salicylsäure Behandlung und 0,1 bzw. 0,1 mg/Pflanze in den Blättern und den primären Wurzeln nach einer Methyljasmonat Behandlung. Die Erfinder nehmen an, dass dieser Befund durch die Induktion der Glucosinolat Synthese in den Blättern oder durch den Transport dieser Glucosinolate von den Wurzeln in das Phloem bewirkt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7: Indolglucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
GlucoBehandBlatter sekunprimäre Exsudate Pflanzen Pflanzen sinolate lung däre Wurzeln und
Wurzeln Exsudate Gluco- Kontrolle 0,1a±0,1 0,3a± 0,1 0,4° ±0,1 0,4a±0,1 0,9a±0.1 1,3a±0,2 brassicin SA 0,1a±0,1 2,2° ±0,1 0,4b±0,1 0,7b±0,2 2,7c±0.5 3,4c±0,3
MJ 0,5b±0,0 0,9b±0,1 0,3a±0,0 0,9b±0,1 1,7b±0.5 2,6b±0,1
4-Hydroxy- Kontrolle 0,7D ± 0,0 0,1a±0,1 0,6a±0,1 0,1a ± 0,1 1,4a±0.4 1,5a±0,6 gluco- SA 0,4a±0,2 0,7b±0,4 0,6a ± 0,2 0,2b±0,0 1,7a±0.3 1,8a±0,1a brassicin MJ 1,2c±0,0 0,1a ± 0,0 0,6a ± 0,1 0,1a±0,1 1,9a±0.2 2,0a ± 0,2a
4-Methoxy- Kontrolle nnwb 0,2a±0,1 nnwb 0,2a±0,1 0,4a ± 0.2 0,6a±0,1 gluco- SA 0,1a±0,0 1,1c±0,1 0,3b±0,0 0,6b ± 0,2 1,6b±0.2 2,2c±0,4 brassicin MJ 0,1a±0,0 0,3b ± 0,0 0,1a ± 0,0 0,8b ± 0,2 0,5a±0.1 1,3b±0,3b
Neogluco- Kontrolle 0,1a±0,1 1,7a±0,2 0,9D±0,1 0,7a±0,1 2,6a ± 0.2 3,3a±0,2 brassicin SA 0,2b±0,1 2,3b± 0,3 0,9b± 0,1 3,4C ± 0,3 3,4b ± 0.5 6,8C ± 0,2
MJ 0,7c±0,2 2,6b±0,4 0,4a ± 0,3 2,4b±0,1 3,6b ± 0.2 6,1b±0,3
Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden, nnwb = nicht nachweisbar
9.5 Anwendung von Elicitoren
Die Anwendung beider Elicitoren steigerte stark den Gehalt an aromatischen und Indolglucosinolaten (Tabelle 8). Die Wurzeln von unbehandelten Pflanzen exsudierten 0,1 mg/Pflanze Gluconasturtiin während der ersten 10 Tage nach der Behandlung, während der Wert nach der Salicylsäure Behandlung 0,3 mg/Pflanze und nach der Methyljasmonat Behandlung 0,5 mg/Pflanze erreichte. Ganz besonders stark war der Anstieg des Indolglu- cosinolat Gehalts auf 1,2 mg/Pflanze nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 1,3 mg/Pflanze nach einer Methyljasmonat Behandlung, während die Kontrolle bei 0,2 mg/Pflanze lag. Der Gehalt der exsudierten aliphati- schen Glucosinolate fiel jedoch nach den Behandlungen mit den Elicitoren im Vergleich zu der Kontrolle. Für die Salicylsäure Behandlung erreichte er 0,1 mg/Pflanze, und für die Methyljasmonat Behandlung erreichte er 0,3 mg/Pflanze, während er für die Kontrolle bei 0,5 mg/Pflanze lag. Deshalb schlussfolgern die Erfinder, dass die Elicitoren Verabreichung die einzelnen Glucosinolate unterschiedlich (= differenziert) in Exsudaten ebenso wie in Pflanzengeweben beeinflusst. Dies liefert die Möglichkeit, die Profile der Glucosinolate durch Elicitoren Verabreichung gezielt zu steuern, um den Ertrag der Glucosinolate mit den gewünschten gesundheitsfördernden Eigenschaften zu steigern. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8: Glucosinolat Gehalt in Exsudaten am 10. Tag des Experiments (mg/Pflanze)
Behandlung Gesamt aliphatisch aromatisch Indol
Kontrolle 0; ,7a ± 0, 2 o; ,5C ± 0, 1 0 ,1a ± 0; ,0 0 ,2a ± 0, 0
SA 1 ,6b ± 0, 0 0, ,1a ± 0, 0 o: ,3b ± 0, ,0 1 ,2b ± 0, 0
MJ 2, ,1C ± 0, 2 0, ,3b ± 0, 1 o; ,5c± 0, 0 1 ,3b ± 0, 1
Die Unterschiede wurden für jedes Experiment ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden.
10. Zusammenfassung
Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten, dass die Verwendung von Salicylsäure und Methyljasmonat einen starken Einfluss auf den Glucosinolat Gehalt in den Pflanzenorganen ebenso wie in den Wurzeln der Versuchspflanzen (Brassica rapa) aufwiesen. Insbesondere waren die Gehalte der aromatischen und der In- dolglucosinolate, die beide antikanzerogene Eigenschaften besitzen, stark erhöht. Beide Elicitoren verringerten den Gehalt an aliphatischen Glucosi- nolaten, insbesondere in den primären Wurzeln und in den Exsudaten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erklären die verschiedenen Wirkungen der Elicitoren auf die einzelnen Glucosinolate durch ihre biologische Funktion innerhalb der Verteidigungsreaktion, die durch Interaktion zwischen der Pflanze und dem Herbivor bzw. der Pflanze und dem Mikroorganismus stattfindet. Eine Salicylsäure- und/oder Methyljasmonat Behandlung stimulierte die Rhizosekretion von Glucosinolaten. Die Antwort der Pflanze auf die Verabreichung der Elicitoren trat hauptsächlich während der ersten Tage nach der Behandlung auf, woran sich eine graduelle Abnahme an- schloss. Damit ist die vorliegende Erfindung, insbesondere das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, gewünschte Glucosinolate in hoher Konzentration gezielt zu erzeugen. Diese Glucosinolate können anschließend aufgrund ihrer vorteilhaften gesundheitsfördernden, antikanzerogenen und anderen Eigenschaften als sekundäre Pflanzenstoffe (= Metabolite), Pharma- zeutika, Nahrungsergänzungsmittel oder Ausgangs- bzw. Rohstoffe für Functional Food verwendet werden.
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13. WO 94/19929 A2
14. WO 98/27806 A1

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte:
(a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System;
(b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt;
(c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors;
(d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Glucosinolate aliphatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und/oder Indolglucosinolate sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die aliphatischen Glucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Progoitrin, Gluconapin, Glucona- poieiferin, Glucobrassicanapin, Sinigrin, Glucoalyssin und Glucoraphanin; die Indolglucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 4- Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und Glucobrassicin; und die aromatischen Glucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gluconasturtiin und Glucotropaeolin ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wurzeln primäre und/oder sekundäre Wurzeln sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Glucosinolate aus den Wurzeln lebender Pflanzen, vorzugsweise durch Rhizo- sekretion gewonnen werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pflanze der Ordnung Capparales ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aus Capparaceae, Brassicaceae, Resedaceae und Tropaeolaceae.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erdfreie System ein aeroponisches oder hydroponisches System ist.
8. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das aeroponische System mit mindestens einer Sprühvorrichtung und/oder einem Defensor ausgestattet ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das hydroponische System ein schwimmendes hydroponisches System ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nährlösung eine ca. 1 ,5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung, vorzugsweise eine ca. 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schwefel (S) als Sulfat (SO4), insbesondere als MgSO4, ZnSO4 und/oder CuSO4.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 I aufweist:
- ca. 610 mg bis ca. 1.230 mg Ca(NO3J2;
- ca. 456,7 mg bis ca. 909,3 mg KNO3;
- ca. 23,1 mg bis ca. 46,2 mg Eisenchelat (FeChe);
- ca. 204 mg bis ca. 408 mg KH2PO4;
- ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg MgSO4 x 7 H2O;
- ca. 2,1 mg bis ca. 4,3 mg H3BO3;
- ca. 0,7 mg bis ca. 1 ,3 mg MnCI2;
- ca. 0,09 mg bis ca. 0,2 mg ZnSO4;
- ca. 0,04 mg bis ca. 0,08 mg CuSO4; sowie - ca. 0,12 mg bis ca. 0,24 mg H2MoO4.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 I aufweist:
- ca. 820 mg Ca(NO3)2;
- ca. 606,2 mg KNO3;
- ca. 30,8 mg FeChe;
- ca. 272 mg KH2PO4;
- ca. 492,4 mg MgSO4 x 7 H2O;
- ca. 2,9 mg H3BO3;
- ca. 0,8 mg MnCI2;
- ca. 0,1 mg ZnSO4;
- ca. 0,05 mg CuSO4; sowie - ca. 0,16 mg H2MoO4.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Nährlösung ca. 984,6 mg MgSO4 x 7 H2O aufweist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Elicitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyljasmonat, Salicylsäu- re, Jasmoninsäure, Chitosan und KCN.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elicito- ren, insbesondere Methyljasmonat und Salicylsäure, zusammen verabreicht werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der/die Elici- tor/en zusammen mit der Nährlösung verabreicht wird/werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zusätzlich den Schritt umfasst: (e) Reinigen und Konzentrieren der Glucosinolate.
19. Glucosinolate, erhalten durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
20. Verwendung der Glucosinolate nach Anspruch 19 zur Nahrungsergänzung oder als Pharmazeutikum.
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