WO2007083807A1

WO2007083807A1 - Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド

Info

Publication number: WO2007083807A1
Application number: PCT/JP2007/050967
Authority: WO
Inventors: Akira Yamada; Kyogo Itoh; Michio Sata; Shigeru Yutani
Original assignee: Green Peptide Co., Ltd.
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2007-07-26
Also published as: CN101370517B; US20100292138A1; JPWO2007083807A1; EP1982728A4; CN101370517A; JP5133706B2; EP1982728A1

Abstract

　以下の配列： YLLPRRGPRL（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ－Ａ２４またはＡ３スーパータイプを有する患者においてＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物が開示される。本発明はまた，配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ－Ａ２４またはＡ３スーパータイプを有する患者におけるＨＬＡ－Ａ２４またはＡ３スーパータイプ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を検査するための組成物を提供する。

Description

明細書

c型肝炎ウィルス由来ペプチド

技術分野

[0001] 本発明は C型肝炎ウィルス関連疾患の治療に関する。

背景技術

[0002] C型肝炎ウィルス (HCV)は，フラビウィルス科に属する 1本鎖 RNAウィルスであり，世界の人口の約 3%が C型肝炎ウィルス (HCV)に対してセロポジティブであると見積られている (World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence. W kly. Epidemiol. Re 1997; 72(46):341- 344)。 HCV感染の急性期はしばしば無症状であるが，セロポジティブの個人の約 70%は慢性感染を発症し，感染した患者は進行性の肝臓病，例えば，慢性肝炎，肝硬変，および肝細胞癌に罹患しやすい（ Alter HJ, Seeff LB., Semin Liver Dis. 2000; 20(1):17— 35; Shimotohno, K., Semin. Cancer Biol. 2000;10:233-240)。 HCV感染の現在の治療法はリバビリンと組み合わせたインターフェロン（IFN)— αであり，最近では，ポリエチレングリコール修飾型の IFN— αが用いられている。しかし，持続性の応答は，治療した患者の約 5 0%にしか見られない（Manns MP, et al, Lancet. 2001; 358:958- 965)。さらに重要なことには，抗ウィルス療法は，感染者の大部分が居住するほとんどの発展途上国では利用できない。したがって，新たな治療法の開発が必要とされている。

[0003] HCV感染後の肝細胞傷害の病因メカニズムはまだよくわ力つていないが，多くの証拠から，ウィルス特異的細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)が HCV感染後の肝臓障害に重要な役割を果たしている力もしれないことが示されている（Chang KM, et al., Springer Semin Immunopathol. 1997; 19:57-68)。一方， CTLは，感染の間にウイルスの広がりを制限しウィルスを排除するのに有効であると考えられている（Kurokoh chi K, et al., J Virol. 1996; 70:232- 240)。したがって，ワクチンによる CTL誘導は， HCV感染に伴う疾患の管理の有望な戦略であろう。さらに，コストが低いことおよび保存が容易であることから， CTL誘導を指向したペプチドワクチンの開発が求められている。 [0004] 本発明者らは，先に， HCV感染者の多くから HCV由来のペプチドと反応性を有する IgGが検出されること，およびこれらのペプチドが対応する HLA型を有する HCV 患者の末梢血単核球 (PBMC)力ペプチド特異的 CTLを誘導しうることを見出した。さらに， HCV由来ペプチドの投与により， HLA— A2の多くの症例でペプチドによる免疫賦活作用やウィルス量の低下が認められることを見いだした (Takao Y et al. , Microbiol. Immunol, 48(7), 507-517, 2004 (非特許文献 1) ;WO2005/028503 ( 特許文献 1)；特願 2005-310203 (特許文献 2) )。

[0005] しかし，これらのペプチドに対して CTLを誘導できない症例もなお存在するため，当該技術分野においては，このような患者に適用しうるさらに別のペプチドが求められている。特に， HLA— A24は HLA— A2に次いで頻度が高いため， A24の患者に適用することができるペプチドが必要とされている。また， HLA-A11, HLA-A 31および HLA— A33,ならびに HLA— A0301および HLA— A6801は，類似する抗原結合モチーフを共有しており，したがって， HLA— A3スーパータイプとして分類される（Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112- 1120 :非特許文献 2)。これまでに， HCV由来の HLA— A3スーパータイプ拘束性抗原ペプチドに関する報告はない。

[0006] 本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれか力本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。

特許文献 1： WO2005/028503

特許文献 2：特願 2005-310203

非特許文献 l :Takao Y et al., Microbiol. Immunol, 48(7), 507-517, 2004 非特許文献 2 : Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は， HLA (ヒト白血球抗原； Human Leukocyte Antigen)— A24および A3 スーパータイプの HCV感染者に適用することができる， HCV関連疾患の治療法を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0008] 本発明は，以下の配列：

YLLPRRGPRL (配列番号 1)

で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する， HLA— A24または A3スーパータイプを有する患者において HCV関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた，配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドを有効成分として含有する， HLA— A24または 3スーパータイプを有する患者における HLA—A24または A3スーパータイプ拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導を検査するための組成物を提供する。

[0009] 本明細書において用いる場合，「HCV関連疾患」とは， C型肝炎ウィルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。 HCV関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変力肝癌への進行である。

[0010] 本発明にかかるペプチド (YLLPRRGPRL (配列番号 1) )は， HCVコアタンパク質の配列に由来し，本明細書において「ペプチド C35— 44」とも称される。このペプチドは， HLA—A2陽性者末梢血よりウィルス排除に有効な細胞傷害性 T細胞 (CTL)を強力に誘導できることが報告されている。本発明においては，驚くべきことに，このべプチド C35— 44は，従来法で解離定数を計算した場合， HLA— A24または Al lときわめて低、結合活性しかな、ことが示されて、るにもかかわらず，本発明者らにより HLA—A24または A3スーパータイプ陽性の患者からも CTLを誘導しうることが見いだされた。 HLA—A2陽性者を対象としたワクチンでは日本人患者の約 40%しかカバーできな力つたが， HLA—A24陽性者および A3スーパータイプ陽性者にも適用可能であることを明らかにした本発明により，日本人のほぼ 100%の患者がぺプチドワクチン療法の対象となる。このため，患者の HLA型や患者血清中の抗体価が不明な場合でも，本発明のペプチドを使用することができる。さらに，ペプチド C35— 4 4は， HCV— lbや HCV— 2a等の種々の遺伝子型の HCVにも広く保存されて!、るため，多数の HCV感染者に適用することが可能である。

図面の簡単な説明 [0011] [図 1]図 1は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性を示す。

[図 2]図 2は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性を示す。

[図 3]図 3は，各種ペプチドの HLA結合能の比較を示す。

[図 4]図 4は， C35— 44ペプチドの HLA— A3スーパータイプへの結合能を示す。

[図 5]図 5は， C35— 44ペプチドで誘導した CTLの MHC拘束性を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明は， HCVに感染した HLA— A24, HLA— Al l, HLA— A31,および HL A— A33を有する患者の治療に用いることができる免疫原性 HCV由来ペプチドを有効成分として含有するワクチンを提供する。以下の実施例に示されるように，本発明においては，ペプチド C35—44が HLA—A24陽性 HCV感染者末梢血単核球（PB MC)よりペプチド特異的 CTLを誘導したことが見いだされた。さらに， MHC分子との結合実験により，このペプチド C35— 44が HLA— A24と結合することが確認された。また， HCV関連疾患を有する HLA— Al l, HLA— A31または HLA— A33を有する HCV感染血漿中からペプチド C35— 44に反応性の IgG抗体が検出された。また，このペプチドは HLA— A31および A33陽性 HCV感染者の PBMCからぺプチド特異的 CTLを誘導した。

[0013] 本発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチド (HCVペプチド）は， C型肝炎ウィルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み， C型肝炎ウィルス感染者の血中抗体により認識されることができる。好ましくは，本発明に係る C型肝炎ウィルス由来ペプチドは , CTLを誘導することができ，このようにして誘導された CTLは， HCV感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。

[0014] 本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原べプチドとして所望の作用効果を奏するためには，その N末端側および C末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがつて，例えば，本発明にかかるペプチドの N末端側および Zまたは C末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。

[0015] 本発明に係る HCVペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。

[0016] 目的とするペプチドをィ匕学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ぺプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質ィ匕学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法 ,ァフィユティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。

[0017] 一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローユングした目的のアミノ酸配列をコードする DNA断片を適当な発現べクタ一に組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウィルスべクターなどを用いることができる。

[0018] このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法， DEAEデキストラン法，リポフエクチン法，エレクト口ポレーシヨン法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。

[0019] 本発明のペプチドは， HCV関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物 ,すなわちペプチドワクチンとして有用である。 C型肝炎ウィルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および Zまたは担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（

PBS) ,蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。

[0020] ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。か力る医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して 1日当たり，ペプチド量として 0. l— 10mgが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ケ月に 1回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンやリバビリンなどの抗ウィルス剤とを併用してもよい。

[0021] 本発明に力かる C型肝炎ウィルス由来ペプチドを投与する前に，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性もしくは CTLの存在を測定してもよヽ。ここで，「抗 HCV抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドが，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体により認識されることを、う。

[0022] HCV関連疾患の治療効果の確認は， HCV関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を， ELISA 等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また， HCV RNA の量を RT— PCR等の慣用の方法により測定することにより，ウィルス量をモニターすることがでさる。

[0023] 本発明のペプチドはまた， HCV関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的な ELISA法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを 96ゥエルなどの慣用の ELISAプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液力も調製した血清を適宜希釈してプレートの各ゥエルにカ卩えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体 (例えばゥサギ抗ヒト抗体)を加える。 IgGを検出することが望まれる場合には， γ鎖特異的抗ヒ HgGを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し ,検出可能なように標識した抗体 (例えば抗ゥサギ IgG)を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ピオチン，放射線ィ匕合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のぺプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより， HCV関連疾患の進行の予測を行うことができる。

[0024] このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の 1つとして xMAP技術がある。これは， Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。

[0025] また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原 (または抗体)を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原 (または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（20〜30分以内）に結果を得ることができる。

[0026] HLA— A24を有する HCV感染者にぉ、て HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞が誘導されて、るかどうかは， HCV感染者力も末梢血単核細胞 (PBMC)を調製し，本発明のペプチドとともに培養した後，同じペプチドをパルスした C1R—A24細胞ゃ HLA— A24陽性の HCV感染細胞 (株)などに対する反応性を， IFN— γ産生を指標として，あるいは⁵¹ Cr遊離反応で調べることにより検査することができる。 HLA -Al l, HLA— A31または HLA— A33についても同様である。また，誘導された C TLの MHC拘束性は MHCクラス I, CD8に対するモノクローナル抗体による抑制実験で，ペプチド特異性は，対応するペプチドで感作した被標識標的細胞による抑制実験 (コールド ·ターゲット ·インヒビシヨン実験)で確認することができる。具体的には，後述の実施例 1に記載される方法により測定することができる。

[0027] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2006-14000および 2006-220542号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

[0028] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。

実施例 1

[0029] ペプチド C35— 44によるペプチド特異的 CTL誘導およびペプチド刺激 PBMCの細朐傷害活件

碰

HLA— A24または HLA— A3スーパータイプを有する HCV感染者を被験者とした。これらの被験者は，いずれもヒト免疫不全ウィルス (HIV)に感染していないことを確認した。末梢血単核細胞（PBMC)を得るためには， 20mlの末梢血を採取し，フィコールーコンレー密度勾配遠心分離により PBMCを調製した。すべてのサンプルは実験に用いるまで低温保存した。なお，本試験実施に当たっては，久留米大学医療に関する倫理委員会の事前承認を得，力つ被験者力の文書による事前の同意を得ている。 HCV感染者の PBMCにおける HLA— Al l, HLA— A31,および HLA — A33分子の発現は，以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した:抗 H LA— Al lモノクローナル抗体（mAb) (Cat # 0284HA; One Lambda Inc. , Ca noga, CA) ,抗 HLA— A31mAb (Cat # 0273HA;One Lambda) ,および抗 H LA— A33mAb (Cat # 0612HA;One Lambda)。

[0030] 細胞株

使用した細胞株 C1R—A24は HLA—A24を発現する C1Rリンパ腫のサブラインである（Dr. M. Takiguchi, Kumamoto University, Japan)。この細胞は， 10%FC S (牛胎児血清）および 500 /z gZmlのハイグロマイシン B (Gibco BRL, New York, NY, USA)を補充した RPMI— 1640培地で維持した。また，細胞株 C1R— Al 1, C1R-A31,および C1R— A33は，それぞれ HLA—A1101, HLA— A3101,および HLA—A3303遺伝子をトランスフエタトし、恒常的に当該抗原を発現するように榭立された C1Rリンパ腫のサブラインである。これらのサブラインにおける HLA—A1 1, HLA-A31,および HLA— A33分子の発現は先に報告されている（Takedatsu H, et al., Clinical Cancer Research 2004; 10: 1112- 20)。これらの細胞株は 10%FCSを含む RPMI1640 (Invitrogen)中で維持した。

[0031] ペプチド

ペプチド C35— 44 (YLLPRRGPRL (配列番号 1) )および陽性対照として， HLA— A24結合モチーフを有するインフルエンザウイルス (Flu)由来ペプチド（RFYIQMCT EL (配列番号 2) ) , EBV由来ペプチド (TYGPVFMCL (配列番号 3) ) ,および陰性対照として HIV由来ペプチド (RYLRDQQLL (配列番号 4) )を用いた。 HLA— A3スーパータイプに結合する対照ペプチドとしては，インフルエンザ (Flu)ウィルス由来べプチド（NVKNLYEKVK (配列番号 5) ) ,ェプスタインバーウィルス（EBV)由来ぺプチド (AVFDRKSDAK (配列番号 6) ) ,チロシナーゼ関連蛋白質 2 (TRP2)由来ペプチド (LLGPGRPYR (配列番号 7) ) ,および HIV由来ペプチド（RLRDLLLIVTR (配列番号 8) )を用いた。すべてのペプチドは， BIOSYNTHESIS (Lewisville, TX, USA) , SynP ep (Dublin, CA, USA)または Biologica Co. (Nagoya, Japan)から購入し， 90%以上の純度であった。ペプチドは， lOmgZmlの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO) に溶解して― 20°Cで保存した。

[0032] 統計学

統計学的分析は，スチューデント t検定を用いて行った。 Pく 0. 05の値を統計学的に有意とした。

[0033] ペプチド特異的 IgGの検出

最初に， HCVに感染した 12名の A3スーパータイプを有する被験者の血清の 1： 1 00希釈サンプルを用いて，ペプチド特異的 IgGのレベルを測定した。血漿 (または血清）中のペプチド特異的 IgGのレベルは，先に記載された方法にしたがってルミネッタス（登録商標）法により測定した（Komatsu N. et al., Scand J Clin Lab Invest, 64, 535-546, (2004))。簡単には， 200 Lの血漿（1 : 100希釈）を 25 Lのぺプチド結合カラーコードビーズ（Luminex Corp. (Austin, TX) )とともに 96ゥエルフィルタープレート（MABVN1250 ;Millipore Corp. , Bedford, MA)中で，プレート振盪器で室温にて 2時間インキュベートした。 2時間後，プレートを 0. 05% Tw een 20— PBSで洗浄し， 100 Lのピオチン化ャギ抗ヒト IgGとともにプレート振盪器で室温にて 1時間インキュベートした。次に，プレートを洗浄し， 100 Lのストレプトァビジン— PE (5 μ g/ml)をゥエルにカ卩え，プレート振盪器で室温にて 30分間ィンキュペートした。蛍光強度 (FI)をルミネックス (登録商標）により測定し，ペプチド特異的抗体のレベルを求めた。 15名の健康なドナーの血漿を負対照として用いた。力ットオフ FI値は，健康なドナーの FI値の平均 + 2SDより高い値として決定した。

[0034] その結果， C35— 44ペプチドに対して反応性の IgGが， 12名の被験者中 7名の血漿において検出された。これに対し，このペプチドは， 15名の健康なドナーのいずれ力もの血漿にも反応性ではなかった。被験者における， C35— 44ペプチドに対して反応性である平均 IgGのレベルは，それぞれ健康なドナーに比べて統計学的に有意に高かった。

[0035] HCVi¾¾者の PBMCからのペプチド特異的 CTLの誘導

ペプチド C35— 44が HLA— A24, HLA— Al l, HLA— A31,もしくは HLA— A 33を有する HCV感染者の PBMC力ペプチド特異的 CTLを誘導しうる力否かを調ベた。 PBMCをインビトロで HCV由来ペプチドまたは対照ペプチドとともに培養した後，対応するペプチドをパルスした C1R—A24, C1R-A11, C1R—A31,または C1R— A33細胞に対する反応性を IFN— γ産生を指標として調べた。

[0036] ペプチド特異的 CTLを検出するためのアツセィは，先に報告されている方法にしたカ^、，若干の改変をカ卩えた（Hida N et al" Cancer Immunol Immunother 2002;

51: 219-28) o簡単には， HLA— A24陽性の HCV感染者の PBMC (1 X 10⁵細胞 Zゥエル）を U底 96ウェルマイク口カルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark )で 200 μ 1の培養液中で， 10 μ lZmlの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は 4重に行った。培養液は， 45%RPMI1640, 45%AIM— V培地（Gibco— BRL , Gaithersburg, MD, USA) , 10%FCS, lOOU/mlのインターロイキン— 2 (IL - 2) ,および 0. ImM MEM非必須アミノ酸溶液（Gibco— BRL)からなるものであつた。 3日ごとに培養液の半分を除去し，ペプチド (20 gZml)を含む新たな培地に置き換えた。培養の第 15日に，培養細胞の半分を，ペプチド C35— 44でパルスした C1R—A24細胞で刺激し，残りの半分の細胞は対照 HIVペプチドでパルスした C 1R—A24細胞で刺激した。 18時間のインキュベートの後，上清を回収し， ELISAにより IFN— yのレベルを測定した。

[0037] その結果，ペプチド C35— 44を用いた場合， HLA— A24陽性 HCV感染者の 5名中 3名の PBMCから，ペプチドに反応性の CTLが誘導された（表 1)。表中，数字は I FN - γのレベル（ng/ml)である。

[0038] [表 1]

[0039] 次に， C35—44ペプチドが HLA—A3スーパータイプ拘束性 CTLを誘導しうるか否かを調べた。 HLA—A2および HLA—A3スーパータイプ陽性の HCV感染者の P BMCを，インビトロで C35— 44ペプチドまたは対照ペプチドで刺激して，対応するペプチドをパルスした T2 (HLA— A2を有する）， C1R-A11 , C1R-A31 , C1R — A33細胞に応答した IFN— γ産生について調べた。その結果， C35— 44ぺプチドは， HLA— Al l陽性 HCV感染者 (0Ζ7) , HLA— A31陽性 HCV感染者（1/2 ) ,および HLA— A33陽性 HCV感染者（1Z2)の PBMCからペプチド反応性 CTL を誘導した。

[0040] これらの知見は， C35— 44ペプチドが HLA— Al l , HLA— A31または HLA— A 33を有する HCV感染者の PBMCにおいてペプチド特異的 CTLを誘導しうることを示す。

[0041] HCVの C35—44ペプチドが HLA—A2拘束性 CTLを誘導しうることは既に知られている（Takao Y et al., Microbiol. Immunol, 48(7), 507-517, 2004 ;特願 2005 -310203) o上述の結果は，この C35— 44が従来法で解離定数を計算した場合 HLA -A24, HLA— Al l, HLA— A31および HLA— A33ときわめて低い結合活性しか示さないにもかかわらず， HLA—A24, HLA-A11, HLA—A31または HLA — A33陽性の HCV感染者からも CTLを誘導しうることを示す。

[0042] ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活件

ペプチドで刺激した PBMCを，標準的な 6時間の⁵¹ Cr—放出アツセィにより，対応するペプチドまたは HIVペプチドのいずれかで予めパルスした C1R— A24, Al l, A31または A33細胞に対する細胞傷害活性にっ、て調べた。ゥエルあたり 2000個の⁵¹ Cr標識細胞をエフェクター細胞とともに，所定のエフェクター Z標的細胞比で 96 丸底ゥエルプレートで培養した。特異的⁵¹ Cr—放出は，以下の式にしたがって計算した：（試験群 c. p. m. —自然放出 c. p. m. )。自然放出はエフェクター細胞なしでィンキュペートした標的細胞の上清により決定した。総放出は， 1% Triton— X(Wak o Pure Chemical Industries, Osaka, Japan とともにインキュベートした標的細胞の上清により決定した。いくつかの実験においては，培養の最初に， lO ^ g/m 1の抗 HLA—クラス I (W6/32：マウス IgG2a) ,抗 HLA— DR (L243：マウス IgG2a ) ,抗 CD4 (NU—THZl :マウス IgGl) ,抗 CD8 (NU—TSZC :マウス IgG2a) ,または抗 CD14 (H14：マウス IgG2a)モノクローナル抗体をゥエルに加えた。

[0043] HCVペプチド C35— 44とともに培養した HLA—A24, HLA— Al l, HLA -A3 1または HLA— A33陽性 HCV感染者の PBMCは，このペプチドを予め負荷した C 1R-A24, Al l, A31または A33細胞に対して細胞傷害活性を示すことができたが， HIVペプチドにつ!/、ては示さなかつた（図 1および 2)。

[0044] さらに，ペプチド C35— 44でパルスした C1R— A24, Al l, A31または A33細胞に対する細胞傷害活性は， HLA—クラス I (W6/32)または CD8モノクローナル抗体 (mAb)により阻害されるが，試験した HLA—クラス II (DR— 1) , CD4または CD1 4mAbでは阻害されな力つた。このことは，ペプチド特異的細胞傷害活性は主として CD8+T細胞により HLA—クラス I拘束性に発現することを示す（図 1および 2)。

[0045] 以上の結果より，ペプチド C35—44は HLA—A24, HLA—Al l, HLA—A31, または HLA— A33陽性の HCV関連疾患患者に対するペプチド免疫療法に有用であることが示された。

実施例 2

[0046] C35— 44ペプチド HLA—A24. HLA—A11. 111^\—八31ぉょび111^\ー八33 の結合アツセィ

C35— 44ペプチドが HLA—A24, HLA—Al l, HLA—A31および HLA—A3 3と結合するか否かにっ、て， MHC分子との直接結合アツセィを用いて調べた。

[0047] 細胞株

RMA細胞株は C57BLZ6 (H— 2b)由来の Rauscher virusによってトランスフォームしたリンフォーマ細胞株であり， RMA—Sはその TAP欠損突然変異株である（Lj unggren HG, and Karre K: J Exp Med, 162, 1745, 1985)。 RMA—S— A * 2402/Kb は， HLA— A * 2402遺伝子の a 1と a 2ドメインとマウス H— 2Kb分子由来の a 3,膜通過および細胞内ドメイインをコードする A* 2402ZKbキメラ遺伝子を RMA—S細胞に移入したマウスリンフォーマ細胞株である（Dr. Takasu (Researc h Institute of Dainippon bumitomo Pharma Co. Ltd., Osaka, Japan)より供与) 。一方， RMA—S— A水 0301, —A水 1101, —A水 3101, —A水 3303糸田胞株【ま ,マウス由来の TAP— 1を欠損した RMA—S細胞株細胞にヒトの HLA— A* 0301 , —A* 1101, —A * 3101, A* 3303遺伝子を導入して榭立した。

[0048] 験法

1¾^八ー3—八* 2402 1^)または1¾^八ー3—八* 0301, —A* 1101, —A* 3 101, —A* 3303細胞株は， TAP欠損株であるためペプチドと複合体を作れない。従って，通常の培養条件では MHC分子が細胞表面に安定に存在できない。この性質を利用して，本実験ではペプチド C35—44が HLA—A24, HLA—Al l, HLA —A31および HLA—A33に結合するか否かを調べた。すなわち， 26°Cで培養した 1^^八ー3—八* 2402 1^)または1¾^八ー3 *八0301, *A1101, *A3101, * A3303細胞株（この条件では MHC分子は細胞膜上に存在しえる）にペプチド C35 —44を加え， 37°Cで培養することにより細胞表面上の MHC分子がどの程度消失するかをフローサイトメーターで測定した (Townsend A, et al.， Cold Spring Harb S ymp Quant Biol, 1, 299-308, 1989)。具体的には，以下の手順で実験を行った。

1. RMA-S— A * 2402ZKbを 26°Cでー晚 (18- 20時間）培養

2. PBSで 1回洗浄

3.細胞（2x10°個）を 3 /z gZmlの j8 2—ミクログロブリン（Cortex Biochem, Sanlean dro, CA, USA)とペプチド（100 /z gZml)を含む OPTI— MEM (Life Technologie s)に浮遊

4. 26°C, 3時間培養

5. 37°C, 3時間培養

6. 3%FSCを含む PBSで 1回洗浄

7.抗 HLA— mAb (第 1抗体）とともに 4°Cで 30分間インキュベート

8. 3%FSCを含む PBSで 1回洗浄

9. PE (フィコエリスリン： 488 nmで効率的に励起し 578 nmの蛍光を放出するフィコピリタンパク質）—ゥサギ抗マウス IgG (第 2抗体）とともに 4°Cで 30分間インキュベート

10. 3%FSCを含む PBSで 1回洗浄

11.細胞を 1%ホルムアルデヒドを含む lmlの PBSに懸濁

12. EPICS (フローサイトメーター， Beckman Coulter社製）で測定

[0049] 結果を図 3に示す。 RMA—S—A* 2402ZKbまたは RMA—S *A0201細胞を 26°Cで培養後，ペプチドをパルスしな、で 37°Cで培養したときの平均チャネル (X— mean)はそれぞれ 10であった。 RMA— S— A* 2402ZKb細胞を 26°Cで培養後， 0. 1〜： LOO /z Mの異なる濃度のペプチド C35— 44でパルス後 37°Cで培養するとそれぞれ濃度依存性に増加した（図 3)。同じ条件下で， HLA— A2結合モチーフを有する EB— A2,あるいは HLA— A24結合モチーフを有するペプチド， NS5A— 213 2, EB— A24を陽性対照として測定し，それぞれ結合が確認された。また，陰性対照に用いたペプチド（HLA— A2には C30, NS5A2132,および EB— A24を， HLA —A24には， EB—A2および C30を用いた）はいずれも結合は認められなかった。

[0050] 以上の結果をまとめると，ペプチド C35— 44については，それぞれの陽性対照と同様にパルスするペプチド濃度に依存して蛍光強度が増加することから，ペプチド C35 44が HLA— A2あるいは A24と，それぞれ結合しうることが確認された。 [0051] 同様に， HLA— A3スーパータイプに対するペプチドの結合能を調べた。その結果 , HCV C35—44ペプチドは， HLA-A3, —A31および—A33に対して陽性対照ペプチドと同程度に結合したが， HLA— Al 1には結合しな力つた（図 4)。

実施例 3

[0052] 健常人末梢血からの C35— 44ペプチドによる HLA— A1 ^ CTLの誘導試験

ペプチド C35—44が HLA—A11を有する健常人 PBMCからペプチド特異的 CT Lを誘導しうるか否かを調べた。 PBMCをインビトロで HCV由来ペプチドまたは対照ペプチドとともに培養した後，対応するペプチドをパルスした C1R— Al l細胞に対する反応性を IFN— y産生を指標として調べた。

[0053] CTL誘導に用いるリンパ球は健常人（HD) 6例〔HLA— Al lZAl l, A2/A2, A24/A24, A2/A24, A11/A2,および Al lZA24〕を用いた。ペプチド特異的 CTLを検出するための測定は，先に報告されている方法にしたがい，若干の改変をカロえた（Hida N et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 219-28)。簡単には , HLA—A11陽性の健常人PBMC (1 X 10⁵細胞 Zゥエル）を U底 96ウェルマイク口カルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark)で 200 1の培養液中で， ΙΟ ΐΖ mlの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は 4重に行った。培養液は， 45%R PMI1640, 45%AIM—V培地（Gibco- BRL, Gaithersburg, MD, USA) , 10%FCS , lOOU/mlのインターロイキン一 2 (IL— 2) ,および 0. ImM MEM非必須アミノ酸溶液 (Gibco— BRL)からなるものであった。 3日ごとに培養液の半分を除去し，ぺプチド（20 gZml)を含む新たな培地に置き換えた。培養の第 15日に，培養細胞の半分を，ペプチド C35— 44でパルスした C1R— Al l細胞で刺激し，残りの半分の細胞は対照 HIVペプチドでパルスした C1R— Al 1細胞で刺激した。 18時間のインキュペートの後，上清を回収し， ELISAにより IFN—γのレベルを測定した。

[0054] 結果を図 5に示す。ペプチド C35— 44を用いた場合， HLA— Al l陽性健常人の 3 名中 3名の PBMCから，ペプチドに反応性の CTLが誘導された。図中，横軸の数字は IFN— γのレベル（ng/ml)である。以上の結果より，ペプチド C35— 44は HLA -Al 1拘束性にも CTLを誘導することが示された。

産業上の利用可能性 [0055] 本発明のペプチドは HCV関連疾患の治療に有用である。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の配列：

YLLPRRGPRL (配列番号 1)

で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する， HLA— A24または A3スーパータイプを有する患者において HCV関連疾患を治療するための医薬組成物。

[2] 以下の配列：

YLLPRRGPRL (配列番号 1)

で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する， HLA— A24または A3スーパータイプを有する患者における HLA— A24または A3スーパータイプ拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導を検査するための組成物。