WO2007074857A1 - Ｌ－グルタミンの製造法 - Google Patents

Ｌ－グルタミンの製造法 Download PDF

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WO2007074857A1
WO2007074857A1 PCT/JP2006/326023 JP2006326023W WO2007074857A1 WO 2007074857 A1 WO2007074857 A1 WO 2007074857A1 JP 2006326023 W JP2006326023 W JP 2006326023W WO 2007074857 A1 WO2007074857 A1 WO 2007074857A1
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WO
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amino acid
dna
polypeptide
seq
acid sequence
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Application number
PCT/JP2006/326023
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English (en)
French (fr)
Inventor
Mikiro Hayashi
Masaki Maeda
Yoshiyuki Yonetani
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to US12/159,156 priority patent/US8067211B2/en
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Priority to ES06843405T priority patent/ES2382207T3/es
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-glutamine.
  • Patent Document 1 As a method for producing L-glutamine by fermentation, a method using a coryneform bacterium imparted with camserine resistance (see Patent Document 1), a method using a coryneform bacterium imparted with 6 diazo-5-oxonorleucine resistance (Patent Document 2) Etc.) are known.
  • Non-patent Document 1 a coryneform bacterium with a reduced activity of glutamine synthetase / adenylyltransferase that is controlled by Adele-Ruirui
  • a method using a coryneform bacterium in which the 405th amino acid of dartamine synthetase undergoing adenylyl ⁇ substitution and a coryneform bacterium in which the activity of the ⁇ protein is reduced see Non-patent Document 2 and Patent Document 3 It has been known.
  • coryneform bacteria have a gin encoding glutamine synthetase 2 having homology with glutamine synthetase in the genome.
  • the polypeptide encoded by gln of the coryneform bacterium is highly homologous to glutamine synthetase that is not controlled by Adenylyl of Bacillus subtilis, whereas the coryneform bacterium is glutamine synthetase that is controlled by adenylation. It has been reported that the deletion of ⁇ encoding the target exhibits glutamine requirement (see Non-Patent Document 1).
  • the polypeptide encoded by gln has no dartamine synthetase activity, and so far no L-glutamine has been produced by modification of gin.
  • Patent Document 1 JP-A-55-148094
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 3-232497
  • Patent Document 3 JP 2002-300887
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 00/14241
  • Non-Patent Document 1 FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)
  • Non-Patent Document 2 FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999)
  • Non-Patent Document 3 BMC BiotechnoL, 1, 9 (2001)
  • Non-Patent Document 4 Journal of Bacteriology, 182, 2696 (2000)
  • An object of the present invention is to provide a modified glutamine synthetase 2, a DNA encoding the modified glutamine synthetase 2, a recombinant DNA containing the DNA, and a transformant having the recombinant DNA.
  • Another object of the present invention is to provide a microorganism having the DNA on a chromosome and a method for producing L-glutamine using the transformant or the microorganism.
  • the present invention relates to the following (1) to (34).
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to a coryneform bacterium, and the polypeptide A polypeptide characterized in that the amount of L-glutamine produced when a wild-type coryneform bacterium is expressed in a host cell is greater than that of the wild-type coryneform bacterium.
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 has an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than glutamic acid
  • the amino acid other than glutamic acid is a basic amino acid, as described in (2) or (3) above Polypeptide.
  • polypeptide according to (7) above which has an amino acid sequence in which the 64th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with an amino acid other than glutamic acid.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which the 64th glutamic acid from the N-terminus is substituted with an amino acid other than glutamic acid, and at least one amino acid is deleted, substituted, or added.
  • the microorganism belonging to the coryneform bacterium is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, Brevibaterium or Mycobacteria, described in any one of the above (13) to (15) DNA listed.
  • the DNA corresponding to the 192nd nucleotide sequence is a DNA having a nucleotide sequence that is a codon encoding an amino acid other than glutamic acid, and the L of the transformant obtained by introducing the DNA into a wild-type coryneform bacterium A DNA characterized in that the amount of glutamine produced is greater than that of the wild-type coryneform bacterium.
  • a recombinant DNA comprising the DNA according to any one of (12) to (22) above.
  • the polypeptide has an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 80th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is an amino acid other than glycine
  • microorganism according to any one of the above (24) to (31), wherein the microorganism belongs to the genus Corynebataterum, Brevibaterium or Mycobacteria.
  • a DNA encoding a modified glutamine synthetase 2 and a modified glutamine synthetase 2 can be obtained, and L-glutamine can be produced by a microorganism having the DNA. Further, by introducing a mutation into the gene encoding LtsA of the microorganism, it becomes possible to produce L-glutamine more efficiently.
  • polypeptide of the present invention comprises
  • polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to a coryneform bacterium, and the polypeptide It is characterized in that L-glutamine production is higher than that of wild-type coryneform bacteria when expressed in host cells using wild-type coryneform bacteria.
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 has an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid at the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than glutamic acid ,
  • microorganism according to any one of (i) to (V) above, wherein the microorganism belonging to the coryneform bacterium is a microorganism belonging to the genus Corynebataterum, Brevibataterum or Mycobacteria.
  • amino acid sequence of glutamine synthetase 2 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 above (the polypeptide according to 0,
  • the microorganism belonging to the coryneform bacterium referred to in the present invention is defined as Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974), the genus Corynebacterium, the genus Brevibacterium, Or a microorganism belonging to the genus Microbacterium.
  • orvnebacterium acetoacidophilum. Corvnebacterium acetoglutamicu and orvnebacterium cailunae.corvnebacterium glutamicum. , Microbacterium ammoniat hilum, etc.
  • Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corvnebacteriu acetoglutamicum ATC 15806, orvnebacterium callunaeAT C 15991, Corvneba cterium glutamicum ATCC13032, Corvnebacterium glutamicum ATCC13060, Corvnebacterium glutamicum ATCC Corvne bacterium lactofermentum), Corvnebacterium glutamicum ATC C14020 (formerly Brev ibacterium divaricatum), Corvnebacterium glutamicum ATCC 13869 (formerly genus Breviba cterium lactofermentum), Corvnebacterium herculis ATCC13868, Corvnebacterium lilium ATCC15990, Corvnebacteria CC 990 Examples include YS-314, Corvnebacterium diphtheriae NCTC 13129, Brevibacterium saccharolvticum ATCC14066
  • the glutamine synthetase 2 derived from the microorganism belonging to the coryneform bacterium is any glutamine synthetase 2 derived from the microorganism belonging to the coryneform bacterium, and any dartamine synthetase 2 can be used, for example, described in EP 1108790 Corynebacterium dartamicam ATCC13032 strain-derived glutamine synthetase 2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, GenBank accession number NP_738737 Corynebataterium 'Futisiens YS-314 Glutamine Synthetase 2 having a non-acid sequence; Genine Accession Number NP_940011 described in Corynebataterium diphtheria NCTC 13129 strain Glutamine Synthetase 2 Etc.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited.
  • the deletion, substitution or substitution may be performed by a known method such as a site-directed mutagenesis method described later.
  • the number is such that it can be added, and is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • one or more amino acids have been deleted, substituted or added means that there is a deletion, substitution or attachment of one or more amino acids at any position in the same sequence.
  • An amino acid to be substituted or added, which may occur at the same time, may be a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acids include L-alanin, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-sip Icin, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine , L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, L-cysteine and the like.
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G Hue-Lualanin, tyrosine
  • polypeptide of the present invention preferably has at least 70% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably 90% or more, and It is desirable to have a homology of preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the homology between the amino acid sequence and the base sequence is, for example, the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] by Karlin and Altschul, FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)].
  • BLAST Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)
  • FASTA Methodhods Enzymol., 183, 63 (1990)
  • programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol, 215. 403 (1990)] o
  • the amino acid sequence is analyzed by BL ASTX based on BLAST
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncoi.nlm.nih.gov.).
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to a coryneform bacterium wild-type protein used as a host when expressing a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added.
  • the type of coryneform bacterium refers to the type of microorganism most frequently found in the species to which the microorganism belongs, such as Corvnebacterium acetoacidophnum ATC 13870, and orvnebacterium acetogluta micumA.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is used as a host for a wild-type coryneform bacterium.
  • a DNA encoding the polypeptide is introduced into a wild-type coryneform bacterium, and the wild-type glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA of the wild-type coryneform bacterium is used.
  • the polypeptide has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and the polypeptide is wild-type.
  • the DNA encoding the polypeptide is expressed as a wild-type coryneform bacterium.
  • DNA encoding the polypeptide is introduced into Corvnebacterium glutamicum ATCC13032 which is a wild cattle strain of Corynebacterium d'artamicum, and the wild-type glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA of Corvneb acterium glutamicum ATCC13032 2
  • a transformant in which the DNA encoding the DNA is replaced by homologous recombination technology and the polypeptide is expressed, or the DNA encoding the polypeptide and a vector such as pCS299P (International Publication No.
  • a transformant obtained by transforming Corvnebacterium glutamicum ATCC13032 using a recombinant DNA consisting of is constructed.
  • the transformant and Corvnebacterium glutamicum ATCC13032 contains BYG agar medium “Glucose 10 g, Meat Ek 7 g, Peptone 10 g, Salty Sodium 3 g, Yeast Extract (Difco) 5 g, Batatagar (Difco) 18 g in water Conditioned medium) for 24 hours at 30 ° C, and each strain was seeded in a seed medium (glucose 50 g, broth 20 g, ammonium sulfate 5 g, urea 5 g, potassium dihydrogen phosphate 2 g, magnesium sulfate heptahydrate.
  • the culture broth was divided into a main culture medium [glucose 50 g, urea 2 g, ammonium sulfate 20 g, potassium dihydrogen phosphate 0.5 g, dipotassium hydrogen phosphate 0.5 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, iron sulfate.
  • the cells are removed by separation, and the amount of L-glutamine accumulated in the supernatant is quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC)
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is changed to the 64th amino acid.
  • the amino acid at the corresponding position is a homology analysis program such as BLAST and FASTA described above showing the homology between the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ. The amino acid at the position corresponding to the second amino acid Say.
  • the amino acid other than glutamic acid may be any amino acid other than glutamic acid, but is preferably alanine, glycine, norin, leucine, iso-oralicine, cysteine, methionine, tryptophan, and fein.
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 has an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid at the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than glutamic acid It is confirmed by the above method that the amount of L-glutamine produced when the polypeptide is expressed using a wild-type coryneform bacterium in a host cell is greater than that of the wild-type coryneform bacterium. Can do.
  • the polypeptide of the present invention of the above (m) to (vi) is a site-directed mutagenesis described later with respect to the DNA encoding the polypeptide of the present invention of (i) or (ii).
  • the site-specific mutation to be introduced is the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid in the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with respect to the polypeptide of the present invention of (i) or (ii) above. As long as one or more amino acids are deleted, substituted or added in any other amino acid sequence, any mutation may be used.
  • amino acid to be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as it is an amino acid other than the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid from the N-terminal end of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • One or more amino acids are deleted, substituted, or added in any position other than the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the same sequence.
  • any type and substitutable amino acids see above. Same as above.
  • polypeptides of (m) to (vi) have at least 70% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably 90% or more, It is desirable that the homology is 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the polypeptide of the present invention of (vii) above is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and When the polypeptide is expressed using a wild-type coryneform bacterium in a host cell, the amount of L-glutamine produced is greater than that of the wild-type coryneform bacterium.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-directed mutagenesis. From several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, and further preferably 1 to 5.
  • one or more amino acids have been deleted, substituted or added means that there is a deletion, substitution or attachment of one or more amino acids at any position in the same sequence.
  • the amino acid to be substituted or added regardless of whether substitution or addition occurs at the same time is not limited to the natural type and non-natural type, and the amino acids that can be substituted are the same as described above.
  • the polypeptide of the present invention (vii) above preferably has at least 70% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably 90%. As described above, it is desirable that the homology is 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the polypeptide of the present invention of the above (viii) to (xi) is the 64th glutamic acid from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 using DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can be obtained using DNA in which a codon encoding an amino acid other than dartamic acid is substituted using the site-directed mutagenesis method described below. Examples of amino acids other than glutamic acid include the above-mentioned amino acids. [0027]
  • the polypeptides (ix) to (xi) described above are bases using the site-directed mutagenesis method described below for the DNA encoding the polypeptide of the present invention (vii) or (viii).
  • Site-specific mutations to be introduced, for the polypeptides of the invention described above (vii) or (v m) N-terminal power of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 also in the amino acid sequence other than the 64 th glutamic acid Any mutation that deletes, substitutes, or adds one or more amino acids.
  • amino acid to be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as it is an amino acid other than the 64th glutamic acid from the N-terminal end of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • one or more amino acids are deleted, substituted or added means that 1 or at any position other than the 64th glutamic acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the same sequence. This means that there are deletions, substitutions or additions of multiple amino acids, and the amino acids that are substituted or added, even if deletions, substitutions, or additions occur simultaneously, may be natural or non-natural. , And the substitutable amino acids are the same as described above.
  • polypeptides of (ix) to (xi) have at least 70% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably 90% or more, It is desirable that the homology is 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the DNA of the present invention comprises
  • the codon encoding an amino acid other than glutamic acid is a codon encoding lysine; DNA described in (ii) above,
  • the coryneform bacterium microorganism belonging to the stiffness Nevada Terri ⁇ beam genus is a microorganism belonging to shake Viva vertical Riu beam genus or Mycobacterium Riu arm genus, the ( ⁇ ) ⁇ according to any one of (i v) DNA,
  • nucleotide sequence of 190 to 192 from the 5 'end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a nucleotide sequence that is a codon encoding an amino acid other than glutamic acid, as described in (i) above DNA,
  • the DNA of the present invention of (i) above is a DNA encoding the polypeptide of the present invention of (1) above.
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to coryneform bacteria one or more The amount of L-glutamine produced when a wild-type coryneform bacterium is expressed in a host cell is a polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is deleted, substituted, or added. More than wild-type coryneform bacteria Examples thereof include DNA encoding a polypeptide characterized by the above.
  • the DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium may be the coryneform bacterium described in (1) above. It is possible to mention DNA encoding glutamine synthetase 2 from the microorganism to which it belongs.
  • the DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium may be any DNA as long as it encodes glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium described in (1) above.
  • DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to coryneform bacteria includes, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 described in EP 1108790, GenBank accession number BA000035 DNA having a complementary nucleotide sequence to the 2258903 to 2260453 nucleotide sequences in the chromosomal DNA derived from Corynebataterium fiftense YS-314 described in GenBank Accession Number BX248358 Corynebataterium diphtheria chromosomal DNA derived from NCTC13129 strain! /, 32 0981-322321 Examples thereof include DNA having a base sequence complementary to the column.
  • the region corresponding to the 190th to 192nd base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is coryne
  • the homology between the base sequence of DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from microorganisms belonging to type Bacteria and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 using the above homology analysis program and parameters such as BLAST and FASTA When the two base sequences are calculated and aligned, the DNAs encoding glutamine synthetase 2 derived from the microorganism belonging to the coryneform bacterium correspond to the 190th to 192nd base sequences of SEQ ID NO: 2 on the base sequence of the sequence number 2 An area.
  • the codon encoding an amino acid other than glutamic acid encodes an amino acid other than dalutamic acid. Any codon can be used.
  • An amino acid selected from luranin, proline, lysine, histidine, arginine, aspartic acid, asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine, more preferably a basic amino acid, more preferably lysine, histidine and arginine power.
  • More than bacteria a method similar to the above, that is, introducing the DNA into a wild-type coryneform bacterium, and the DNA encoding the wild-type glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA of the wild-type coryneform bacterium Is transformed by homologous recombination technology, and a wild-type coryneform bacterium is transformed with a transformant expressing a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the DNA or a recombinant DNA containing the DNA.
  • the DNA of the present invention of the above (vi) to (viii) is obtained by using the site-directed mutagenesis method described later in DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, This is DNA obtained by substituting the nucleotide sequence 190 to 192 from the 5 ′ end of the represented nucleotide sequence with a codon encoding an amino acid other than glutamic acid.
  • the codon include a codon encoding an amino acid other than the above-mentioned glutamic acid.
  • the amount of L-glutamine produced is greater than that of the wild-type coryneform bacterium. More often, the DNA is introduced into a wild-type coryneform bacterium, and the DNA and the DNA encoding wild-type glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA of the wild-type coryneform bacterium are replaced by a homologous recombination technique.
  • a transformant expressing a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the DNA, or a recombinant DNA containing the DNA is used to transform a wild-type coryneform bacterium, and the amino acid encoded by the DNA
  • a transformant expressing a polypeptide having a sequence is obtained, and the transformant and a wild-type coryneform host cell are obtained. This can be confirmed by measuring that the amount of L-glutamine produced in the culture supernatant when cultivating the type bacterium in the medium is larger than that of the wild type coryneform bacterium. Specifically, it is as described above.
  • DNAs (ix) to (xi) above a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a DNA that can be hybridized under stringent conditions Using a part or all of the complementary strand of DNA represented by SEQ ID NO: 2 as a probe, the hybridization method or plaque 'hybridization method or Means DNA obtained by using the Southern blot hybridization method, etc. Specifically, using a filter in which colony or plaque-derived DNA is immobilized, 0.7 to 1.
  • composition of 1-fold concentrated SSC solution is 150 mmol / l sodium chloride, 15 mmol / l sodium quenate) at 65 ° C.
  • composition of 1-fold concentrated SSC solution is 150 mmol / l sodium chloride, 15 mmol / l sodium quenate
  • Hybridization is Molecular cloning, a laboratory manual, Tnird Edition, Cold pring Harbor Laoorat ory Press (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular ⁇ ⁇ Cloning 3rd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter referred to as Current 'Protocols' in' Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) This can be done according to the method described.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is at least 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more. Particularly preferred is DNA having a homology of 98% or more, most preferably 99% or more.
  • a nucleotide sequence in which a region corresponding to the 190th to 192nd nucleotide sequence from the 5 'end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a codon encoding an amino acid other than glutamic acid is In the DNA possessed, examples of the codon include a codon encoding an amino acid other than the above-mentioned glutamic acid.
  • the amount of L-glutamine produced is higher than that of the wild-type coryneform bacterium. It can be confirmed by the method described.
  • the DNA of the present invention includes, for example, DNA in which the 190th guanine from the 5 'end of the base sequence is substituted with adenine in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. it can.
  • the DNA encodes a polypeptide having an amino acid sequence in which the 64th amino acid from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with glutamic acid lysine.
  • the recombinant DNA of the present invention (xii) is a recombinant DNA consisting of the DNA of the present invention (i) to (xi) and a vector.
  • the vector include plasmids, cosmids, butterfly fuzzes and the like, and any vector can be used as long as it can be linked to the DNA of the present invention (i) to ( Xi )! /.
  • plasmids pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), pHSG 299 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), pCGl (Japanese Patent Laid-Open No.
  • pCG2 Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197
  • pCG4 Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799
  • YEpl3 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • cosmid examples include pAxCAwtit (manufactured by Futtsubon Gene)
  • butteriophage examples of the butteriophage include M13mpl8RF (manufactured by Futtsubon Gene).
  • a method according to the method of microbial force Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)] belonging to coryneform bacteria is used.
  • the chromosomal DNA that can be prepared is used as a saddle type, and a primer DNA that can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used and obtained by PCR or the like.
  • chromosomal DNA is used as a saddle type, as described above. Obtained by PCR, etc. using primer DNA that can be designed and synthesized based on the base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide having 70% homology or more.
  • a chromosomal DNA was prepared from Corynebata terumum Dartamicam ATCC13032 strain, and the DNA was used as a saddle to obtain the 5 'and 3' terminal regions of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA having the sequence can be chemically synthesized, and DNA encoding glutamine synthetase 2 can be obtained by PCR using the DNA as a primer set. Examples of DNA that can be obtained by the above method include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to coryneform bacteria synthesizes DNA having the base sequence by a known method based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Can be obtained.
  • the DNA of the present invention can be obtained by a conventional method using the DNA encoding dartamine synthetase 2 derived from the microorganism belonging to the coryneform bacterium obtained in (i) above.
  • a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added is, for example, DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is added to Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Cloning 3rd edition, Current 'Protocols' In 'Molecular' Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci It can be obtained by introducing site-directed mutagenesis using the site-directed mutagenesis method described in USA, 82, 488 (1985), etc.
  • coryneform bacterium that produces a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added is The polypeptide obtainable by the above method Using the encoded DNA, transforming a coryneform bacterium that produces wild-type glutamine synthetase 2, homologous to the DNA encoding the polypeptide obtainable by the above method and the DNA encoding the wild-type glutamine synthetase 2 It can be obtained by replacement using recombinant technology. It can also be obtained by transforming coryneform bacteria using a recombinant DNA containing a DNA encoding a polypeptide that can be obtained by the above method.
  • the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added, and the polypeptide is isolated from a wild-type coryneform bacterium.
  • Examples of the method for obtaining DNA encoding mutant glutamine synthetase 2 that produces a greater amount of L-daltamin when expressed in a host cell than that of the wild-type coryneform bacterium include the following methods.
  • the drug-containing minimal agar medium is allowed to stand at 30 ° C. for 1 to 2 days, and then a transformant that forms a colony is selected. Further, the transformant is cultured in a medium, and the glutamine concentration in the medium at the end of the culture is measured. Similarly, a transformant in which the glutamine concentration in the medium at the end of the culture is higher than the glutamine concentration detected by culturing the wild-type coryneform bacterium is selected.
  • the DNA encoding the mutant glutamine synthetase 2 possessed by the recombinant DNA held by the transformant imparts higher L-glutamine productivity to the host than wild-type coryneform bacteria.
  • the DNA of the present invention can be obtained by a technique.
  • the amino acid at the position corresponding to the 64th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is other than glutamic acid.
  • DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence substituted with an amino acid is converted into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 by the site-directed mutagenesis method described above.
  • Any codon that encodes an amino acid other than glutamic acid may be used as long as it is a codon that encodes an amino acid other than glutamic acid.
  • alanine, glycine, norin, leucine, isoleucine, cystine, methionine, tryptophan, phenylalanine, Proline, lysine, histidine, arginine, aspartic acid, asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine are also selected as amino acids, more preferably basic amino acids, more preferably lysine, histidine, and arginine are also selected.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acids are deleted, substituted or The amount of L-glutamine produced when the wild-type coryneform bacterium is expressed in a host cell and has the added amino acid sequence is higher than that of the wild-type coryneform bacterium.
  • DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used, and the above-mentioned site-specific mutagenesis method or chemical mutagen is contacted. And a method of introducing random mutations by error-prone PCR, and by comparing the amount of glutamine produced by the method described above, the DNA of the present invention can be confirmed.
  • DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which the 64th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than glutamic acid is the site-directed mutagenesis described above
  • the codon encoding the 64th glutamic acid from the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is other than glutamic acid. It can be obtained by performing base substitution so as to be a codon encoding the amino acid. Examples of the codon include a codon encoding an amino acid other than the above glutamic acid.
  • each codon encoding the amino acid is prepared. It is preferable to add a codon encoding an amino acid, ie, 3 bases, between or before and after the don.
  • the DNA of the present invention comprises, under stringent conditions, a part of or the entire complementary strand of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a probe, It can also be obtained by using a plaque hybridization method or a Southern blot hybridization method. Specifically, after performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1. Omol / 1 sodium chloride using a filter immobilizing colony or plaque-derived DNA. 0.1- to 2-fold concentration of SSC solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution consists of 150 mmol / l sodium chloride and 15 mmol / l sodium taenoate) at 65 ° C DNA that can be identified can be obtained by washing the filter.
  • Hybridization is the first edition of Molecular One Cloning 3rd edition, Current 'Protocols' In' Molecular ⁇ Biology, DNA Cloning 1: Coré Techniques, A Practical Approach, Second Edition, uxford University ( 1995) and the like. Stringent conditions can be adjusted according to the length of the probe DNA chain and the GC content, and can be set according to the method described in Molecular and Cloning 3rd Edition.
  • the region corresponding to the nucleotide sequence 190 to 192 from the 5' end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is dartamine. Confirm that the DNA has a base sequence that is a codon encoding an amino acid other than an acid, and introduce the DNA into a wild-type coryneform bacterium, and the DNA and the chromosomal DNA of the wild-type coryneform bacterium.
  • a transformant in which a DNA encoding wild-type glutamine synthetase 2 is replaced by homologous recombination technology and a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the DNA is expressed, or a recombinant DNA containing the DNA is used. And transforming a wild-type coryneform bacterium to obtain a transformant expressing a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA, and using the above-described method, the transformant and the host cell.
  • the DNA of the present invention can be obtained by confirming that the amount of L-glutamine produced in the culture supernatant when cultivating a live coryneform bacterium in a medium is larger than that of the wild-type coryneform bacterium.
  • Recombinant DNA containing the DNA of the present invention can be obtained by linking the DNA of the present invention and a vector.
  • the vector include plasmids, cosmids, butterophage and the like, and any vector can be used as long as it can be ligated with the DNA of the present invention.
  • the method for linking the DNA of the present invention and the vector include a method of enzymatically linking the DNA of the present invention and the vector using T4 DNA ligas (Takara Bio Inc.) and the like.
  • polypeptide of the present invention described in (1) above is according to the method described in Molecular 'Crowing 3rd Edition, Current' Tocol's in Molecular Biology etc., for example, by the following method: It can be produced by expressing the DNA of the present invention (2) in a host cell.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared, and the DNA fragment is appropriately expressed.
  • a recombinant DNA ligated downstream of the promoter is prepared.
  • a transformant can be prepared by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • polypeptide of the present invention can be efficiently produced by preparing DNA in which the base sequence of the DNA fragment is substituted so that it is an optimal codon for host cell expression.
  • any bacteria or yeast capable of expressing the target gene can be used.
  • an expression vector one that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be transcribed is used. Used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention is capable of autonomous replication in the prokaryotic organism, and at the same time a promoter, a ribosome binding sequence, It is preferable that the vector is composed of the DNA of the present invention, a transcription termination sequence, and U. Genes that control the promoter may be included!
  • Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all sold by Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGE MEX-1 (Promega) ), PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (JP-A 58-110600), p KYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53 , 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter may be any as long as it functions in the host cell.
  • t_promoter P
  • lac promoter P promoter
  • P promoter P promoter
  • Examples include promoters derived from E. coli and phages such as the T7 promoter.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence directly under the structural gene.
  • Host cells include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corvneba cterium, Microcterum ( Microbacterium), microorganisms belonging to the genus Pseudomonas, such as Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Escheri chia coli TB1, Serratia ficaria.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • the host cell is a fine cattle belonging to the genus Corvnebacterium, Brevibacterium, or Microbacterium, orvnebacterium acetoacidophiium , And orvnebacterium acetoglutamicum, Cor vnebacterium callunae, Corvnebacterium glutamicum, and orvnebacterium lactoferment um, Corvnebacterium herculis, Corvnebacterium lilium, Corvnebacterium melasseco la ⁇ Corvnebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium saccharolumthio, Brevibophilum microbe, Brevibophilum microbe
  • pCGl Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500
  • pCG2 Japanese Patent Laid-Open No. 58-35 197
  • any method for introducing a recombinant DNA vector any method can be used as long as it introduces DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (for example, JP-A-57-186492 and JP-A-57-18649), or Gene, ⁇ 7, 107 (1982) or Molecular & General Genetics, 168, 111. (1979), electroporation [for example, the method described in J. Bacteriology, ⁇ 75, 4096 (1993)], and the like.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEpl3 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH Examples include promoters, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF al promoter, CUP 1 promoter and the like.
  • Host cells include the genus Saccharomvces, Schlzosaccnaromvces J3 ⁇ 4, Kluweromvces, Tnchosporon, Schwanniomvces, Pichia and Pichia.
  • Microorganisms belonging to the genus Candi for example, Saccharomvces cer evisiae, Schizosaccharomvces pombe, KluYyeromYces lactis, Trichosporon ulans), Schwanniomvces alluvius, Candida utilis, and the like.
  • any method for introducing a recombinant DNA vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electopore position method [Methods EnzymoL,
  • gene expression method in addition to the expression as it is, it can be expressed as a fusion protein according to the method described in Molecular Cloning 3rd edition.
  • the polypeptide of the present invention is obtained by culturing the transformant obtained by the above method in a medium, producing and accumulating the polypeptide of the present invention in the culture, and collecting the polypeptide of the present invention from the culture. You can get it.
  • the transformant can be cultured by a normal culture method.
  • a medium for culturing the transformant a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the transformant, and capable of efficiently culturing the transformant.
  • a medium for culturing the transformant a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the transformant, and capable of efficiently culturing the transformant.
  • the carbon source for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose and starch hydrolyzate, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid, lactic acid and succinic acid can be used.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose and starch hydrolyzate
  • alcohols such as ethanol
  • organic acids such as acetic acid, lactic acid and succinic acid
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate, various inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, and Nitrogen-containing organic substances such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor and soybean hydrolyzate can be used.
  • inorganic salts include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and ammonium sulfate.
  • micronutrient sources such as piotin and thiamine can be obtained as necessary. These micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and aeration-agitation culture.
  • the culture temperature is generally 20 ° C to 42 ° C. Particularly preferred is 25 ° C to 40 ° C.
  • the pH in the medium is preferably maintained at 5-9.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • the culture period is usually 12 hours to 6 days.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • an inducible promoter for example, when cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the k £ promoter, use isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside or the like when culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using the 1m promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • polypeptide of the present invention there are a method of producing it in a host cell, a method of producing it outside the host cell, and a method of producing it on the outer membrane of the host cell, depending on the method employed.
  • the host cell can be selected and the structure of the expressed polypeptide can be altered.
  • polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention is produced in or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Roh et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)), or JP-A-5-336963, International Publication No.94 / 23021, etc.
  • the polypeptide can be actively secreted outside the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a usual enzyme isolation and purification method can be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a cell in a dissolved state, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a manton. Disrupt the cells with a Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain an insoluble form of the polypeptide as a precipitate fraction. to recover.
  • the recovered insoluble substance of the polypeptide is dissolved with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the soluble solution and reducing the concentration of the protein denaturant in the soluble solution.
  • a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide in the culture supernatant 1 is the polypeptide.
  • the culture supernatant is obtained by treating the culture by the same method such as centrifugation as described above, and the purified standard is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Goods can be obtained.
  • polypeptide examples include the polypeptide of (1) above, and more specifically, the 64th dartamine from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide in which an acid residue is substituted with a lysine residue can be mentioned.
  • microorganisms of the present invention include microorganisms that produce the polypeptide of the present invention. Any microorganism can be used as long as it is capable of producing the polypeptide of the present invention, but preferably a microorganism belonging to a coryneform bacterium, more preferably a genus Corynebacterium, a genus Brevinocterium, or a genus Microbatterium. And, more preferably, Corynebacterium dartamicam.
  • the microorganism of the present invention can be obtained by transforming a host cell according to a conventional method using the DNA of the present invention. Examples thereof include the transformant obtained in (4) above. be able to.
  • microorganisms of the present invention include microorganisms having the DNA of the present invention on chromosomal DNA.
  • the microorganism is a glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA of the microorganism used in the host, using a conventional mutation treatment method, a gene replacement method using recombinant DNA technology, a cell fusion method, a transduction method, or the like. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into. Site-specific mutations are introduced in Molecular 'Crowing 3rd Edition, Current Protocols. In Molecular ⁇ ⁇ Biology, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 ( 1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), and the like.
  • the DNA encoding glutamine synthetase 2 on the chromosomal DNA is also replaced with the DNA of the present invention obtained by the method (3) above.
  • a microorganism having the DNA of the present invention on the body can be produced.
  • the DNA of the present invention obtained by the method of (3) above cannot replicate autonomously in the host cell, and is resistant to antibiotics and the Bacillus subtilis levanciutalase gene ⁇ S [Mol. Microbiol, 6, 1195 (1992)] and introduced into the microorganism according to the method described in (4) above.
  • the recombinant plasmid cannot replicate autonomously in a host cell, the recombinant plasmid can be of the Camp bell type by selecting with the resistance of antibiotics present on the recombinant plasmid. A transformant integrated into a chromosome by homologous recombination can be obtained.
  • the ability to perform gene replacement on a chromosome by the above method is not limited to the above method, and other gene replacement methods can be used as long as they can replace a gene on a chromosome.
  • the microorganism of the present invention has the DNA of the present invention, and
  • the polypeptide is characterized in that the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 80th amino acid is an amino acid other than glycine. the microorganism according to i),
  • LtsA derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium a complementary strand of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a complementary strand of DNA consisting of a part of the DNA is used as a probe.
  • LtsA that can be obtained by PCR using the above hybridization or by using a primer DNA that can be designed from the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and using the chromosomal DNA of the coryneform bacterium as a saddle type Using the encoding DNA, Can get more.
  • LtsA derived from the microorganism belonging to the coryneform bacterium any LtsA derived from the microorganism belonging to the genus Corynebataterum may be used.
  • LtsA described in SEQ ID NO: 10 described in EP 1108790 LtsA having the following amino acid sequence can be exemplified.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is glutamine derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium described above.
  • the amino acid sequence of synthetase 2 it can be produced by a method similar to the method of producing a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added.
  • amino acids deleted, substituted or added one or more amino acids were deleted, substituted or added in the amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from the microorganism belonging to the above-mentioned coryneform bacterium. This is the same as in the case of a polypeptide having an amino acid sequence.
  • a coryneform bacterium that produces a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of LtsA derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium is obtained by the above method.
  • a DNA encoding a polypeptide that can be obtained by the above method by transforming a coryneform bacterium that produces wild-type LtsA and has the DNA of the present invention using a DNA encoding a polypeptide capable of It can be obtained by replacing the DNA encoding the wild type LtsA using homologous recombination technology.
  • the coryneform microorganism By measuring that the coryneform microorganism is sensitive to lysozyme and that the amount of glutamine produced by the coryneform microorganism is higher than that of the coryneform bacterium before introducing the LtsA mutation, the coryneform bacterium can It can be confirmed that it is a microorganism of the invention.
  • coryneform bacterium that produces a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added is lysozyme sensitive.
  • the coryneform bacterium is cultured in a medium containing the highest concentration of lysozyme capable of growing wild-type LtsA before the substitution of LtsA, its growth rate produces wild-type LtsA.
  • Coryneform bacteria in the medium It means slower than the growth rate when cultivated!
  • the microorganism of the present invention of GO or (iii) above corresponds to the 80th amino acid from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in LtsA derived from a microorganism belonging to coryneform bacteria.
  • the amino acid at the position indicated by the homology analysis program and parameters such as BLAST and FASTA described above are the homology between the amino acid sequence of LtsA derived from a microorganism belonging to the coryneform bacterium and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid other than glycine may be any amino acid as long as it is an amino acid other than glycine, but is preferably alanine, phosphorous, leucine, isoleucine, cysteine, methionine, tryptophan, phenylalanine, Proline, lysine, histidine, arginine, aspartic acid, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and glutamic acid are amino acids that can be selected, and more preferred is aspartic acid.
  • microorganism of the present invention of GO or (iii) above corresponds to the 80th amino acid from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in LtsA derived from a microorganism belonging to coryneform bacteria.
  • a DNA in which the codon encoding the amino acid at the position is replaced with a codon encoding an amino acid other than glycine using the site-directed mutagenesis method described above is constructed, and wild-type LtsA is produced using the DNA.
  • the coryneform bacterium having the DNA of the present invention by transforming the coryneform bacterium having the DNA of the present invention and substituting the DNA that can be obtained by the above method and the DNA encoding the wild-type LtsA using a homologous recombination technique. it can.
  • the coryneform microorganism is sensitive to S lysozyme and that the amount of glutamine produced by the coryneform microorganism is higher than that of the coryneform bacterium before introducing the LtsA mutation, the coryneform bacterium It can be confirmed that it is a microorganism of the present invention.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the above (iv) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of glutamine synthetase 2 derived from a microorganism belonging to the above-mentioned coryneform bacterium one or more amino acids have been deleted or replaced using the encoded DNA. It can be produced by a method similar to the method for producing a polypeptide having a substituted or added amino acid sequence. The number, position, and type of amino acids to be deleted, substituted or added are as described above.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and is the only polypeptide that is produced in a bacterial cell having the amino acid sequence.
  • the coryneform bacterium produced as Lts A of the present invention uses the DNA encoding the polypeptide that can be obtained by the above method to produce wild-type LtsA and transform the coryneform bacterium having the DNA of the present invention. It can be obtained by converting the DNA encoding the polypeptide that can be obtained by the above method and the DNA encoding the wild-type LtsA using a homologous thread replacement technique.
  • the coryneform microorganism is sensitive to lysozyme and that the amount of glutamine produced by the coryneform microorganism is higher than that of the coryneform bacterium before introducing the LtsA mutation, the coryneform microorganism is It can be confirmed that it is a microorganism of the invention.
  • the microorganism of the present invention uses a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the codon encoding the 80th glycine residue can be obtained using DNA in which the codon encoding an amino acid other than the glycine residue is substituted using the site-directed mutagenesis method described above.
  • Examples of the amino acid include amino acids other than the above glycine.
  • the microorganism of the present invention is the site-directed mutagenesis of the codon encoding the 80th glycine residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the coryneform microorganism is lysozyme-sensitive and the amount of glutamine produced by the coryneform microorganism is greater than that of the coryneform bacterium before introducing the LtsA mutation, the coryneform bacterium It can be confirmed that it is a microorganism of the invention.
  • microorganisms of the present invention may change LtsA in coryneform bacteria as described above.
  • the microorganism of the present invention can also be created by imparting the ability to produce the polypeptide of the present invention after introducing the difference.
  • the transformant obtained in (4) above or the microorganism of the present invention obtained in (5) above is cultured in a medium, and L-glutamine is produced and accumulated in the culture, and L-glutamine is produced from the culture.
  • L-glutamine can be obtained by collecting.
  • the microorganism can be cultured by a usual method for culturing a microorganism having the ability to produce L-glutamine.
  • a synthetic medium or a natural medium! / Salt can be used as long as it contains a suitable amount of carbon source, nitrogen source, inorganic salts, and the like.
  • any substance that can be assimilated by the microorganism of the present invention may be used.
  • saccharides such as dalcose, molasses, fructose, sucrose, maltose, starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, acetic acid, Organic acids such as lactic acid and succinic acid can be used.
  • Nitrogen sources include various inorganic and organic ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate, urea, and other nitrogen-containing sources.
  • Compounds, and nitrogen-containing organic substances such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor and soybean hydrolyzate can be used.
  • potassium monohydrogen phosphate potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, sodium chloride salt, magnesium sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • trace nutrient sources such as piotin, thiamine, nicotinamide, and nicotinic acid can be provided as necessary.
  • These micronutrients can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is generally preferably 20 to 42 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C.
  • the pH of the medium is preferably in the range of 5 to 9 and maintained near neutrality.
  • the pH of the medium is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, pH buffer solution, or the like.
  • the culture period is usually 12 hours to 6 days, and L-glutamine is produced and accumulated in the culture solution.
  • L-glutamine can be recovered from the culture solution obtained by removing precipitates such as bacterial cells by using a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment.
  • PCR was carried out using the chromosomal DNA as a saddle, using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), the attached buffer and the primers described below.
  • Primers used for PCR were based on the nucleotide sequence information of DNA encoding glutamine synthetase 2 derived from Corynebacterium dartamicam described in EP 1108790, and contained in the region encoding glutamine synthetase 2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • N-terminal force of the amino acid sequence of dartamine synthetase 2 represented by SEQ ID NO: 1 The region encoding the 64th glutamic acid (from 190 to 192 from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2) Region consisting of 21 bases including the first region (gaa) (base sequence from 180 to 200th from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 5 ′ of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3) DNA consisting of a nucleotide sequence in which the region encoding glutamic acid represented by SEQ ID NO: 5 is substituted with a codon (aaa) encoding lysine in the 680-700th nucleotide sequence from the end) A fragment and a DNA fragment having a base sequence of 21 bases represented by SEQ ID NO: 6 which is a complementary sequence thereof were synthesized according to a conventional method.
  • a DNA fragment was synthesized by adding a tag sequence containing an SiHI recognition sequence to the complementary sequence of the 1185th to 1204th base sequences from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the base sequence was represented by SEQ ID NO: 7 It was shown to.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 using the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 as a primer
  • the fragment and the DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 as a primer using the obtained chromosomal DNA as a saddle, two types of PCR were performed using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and the attached buffer. Each done.
  • PCR was carried out using both purified products in a saddle type and using as a primer a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • a DNA fragment of about l.Okb in which the N-terminal strength of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was replaced with the codon (gaa) coding for the 64th glutamic acid with the codon (aaa) coding for lysine was obtained. I got it.
  • the obtained about l.Okb DNA fragment was treated with ⁇ lHI, subjected to agarose gel electrophoresis, extracted and purified using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101).
  • pESB30 is a 2.6 kb IDNA fragment containing the lepanshuclase gene ⁇ S from Bacillus subtilis at the E ⁇ I cleavage site of the vector PHSG299 [Gene, 61, 63 (1987)] containing the kanamycin resistance gene [Mol. Microbiol , 6, 1195 (1992)].
  • pESB30 was cleaved with ⁇ iHI (Takara Bio), treated with alkaline phosphatase (Takara Bio), agarose gel electrophoresis, and pESB30 using GENECLEAN Kit (BIO 101).
  • LB agar medium containing 20 ⁇ g / ml kanamycin [Batatotryptone (Difco) 10 g, Yeast extract (Difco) 5 g, Sodium chloride 10 g, Pactwager (Difco) 16 g was cultured on a medium containing 1 L of water and adjusted to pH 7.0], and transformants were selected.
  • the transformed strain was cultured overnight in LB medium containing 20 g / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution by the alkaline SDS method (Molecular Cloning 3rd edition).
  • DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which the 64th glutamic acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was substituted with lysine (Glu64Lys) was obtained in the same manner as in Example 1. .
  • nucleotide sequence located upstream of the 5 'end of the nucleotide sequence encoding glutamine synthase 2 (5' of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3) DNA fragment with tag sequence including BamHI recognition sequence added to the 1st to 20th base sequence from the end) and base sequence located on the 3 'end side (the 5' end force of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is also A DNA fragment in which a tag sequence containing an EamHI recognition sequence was added to a complementary sequence of the 1825 to 1844th nucleotide sequence) was synthesized, and the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • PCR was performed using both purified products in a saddle type, using a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 as primers.
  • a promoter sequence existing upstream of the 5 ′ end of glutamine synthase 2 and a codon encoding the 64th glutamic acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in SEQ ID NO: 2 An approximately 1.9 kb DNA fragment containing a base sequence in which gaa) was replaced with a codon (aaa) encoding lysine was obtained.
  • a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which the 80th glycine from the N-terminus of the amino acid sequence of the polypeptide related to lysozyme sensitivity represented by SEQ ID NO: 10 is substituted with aspartic acid (Gly80Asp) is prepared in Example 1. And obtained in the same way. Same change It has been reported that lysozyme sensitivity is imparted by different introduction [BMC Biotechno 1. 9, 1 (2001)].
  • SEQ ID NO: 12 A DNA fragment in which a tag sequence including a ⁇ recognition sequence is added to the base sequence, and an SlHI recognition sequence is included in the complementary sequence of the 981-1000th base sequence from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • DNA fragments added with a tag sequence were synthesized, and their base sequences were shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16, respectively.
  • a DNA fragment having a sequence ability and a DNA fragment having a base sequence of 21 bases represented by SEQ ID NO: 14 which is a complementary sequence of the base sequence were synthesized according to a conventional method.
  • both purified products are in a cage shape, and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 are used as primers.
  • R went.
  • the region (ggt) encoding the 80th glycine from the N-terminus of the amino acid sequence of LtsA represented by SEQ ID NO: 10 was replaced with a codon (gat) encoding aspartic acid.
  • Okb DNA fragment was obtained.
  • This about l.Okb DNA fragment was treated with SriHI (manufactured by Takara Bio Inc.) and cloned into pESB30 in the same manner as in Example 1, and this plasmid was named pCltsA.
  • the gene coding for glutamine synthetase 2 in the chromosomal DNA of Corynebacterium dartamicam ATCC13032 by gene replacement is used to replace the 64th group from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a mutation (Glu64Lys) was introduced to replace lutamic acid with lysine.
  • the plasmid was used to transform ATCC13032 strain by electroporation according to the method of Rest et al. [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 54 1 (1999)]. Selected. One of the selected kanamycin-resistant strains. The structure of the obtained chromosome was examined by Southern nose and hybridization (Molecular 'Crowung 3rd edition). As a result, the plasmid was transformed into a chromosome by Campbell type homologous recombination. It was confirmed that it was incorporated. In these strains, wild-type and mutant glutamine synthetase 2 genes are close together on the chromosome, and a second homologous recombination is likely to occur between them.
  • the transformed strain (recombinant once) was SUC agar medium [sucrose 100 g, meat extract 7 g, peptone 10 g, salted sodium 3 g, yeast extract (manufactured by Difco) 5 g, pactwager (manufactured by Difco) ) 18 g in 1 L of water and adjusted to pH 7.2], and cultured at 30 ° C for 1 day to select colonies that grow.
  • the strain where the gene is present converts sucrose into a suicide substrate Therefore, it cannot grow on this medium [J. BacterioL, 174, 5462 (1991)].
  • strains lacking the ⁇ gene due to a second homologous recombination between two wild-type and mutant glutamine synthetase genes that are close together on the chromosome cannot grow suicide substrates and grow on this medium. can do.
  • this second homologous recombination either the wild-type gene or the mutant gene is deleted along with ⁇ . In this case, in the strain in which the wild type was deleted together, gene replacement to the mutant type occurred.
  • the chromosomal DNA of the twice-recombinant obtained in this way was prepared by the method of Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]. Using a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 as primers, using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and the attached noferer PCR was performed. The nucleotide sequences of these PCR products were determined by a conventional method, and it was determined whether the glutamine synthetase 2 gene on the chromosomal DNA of the recombinant twice was a wild type or a mutant type.
  • the gene encoding glutamine synthetase 2 in chromosomal DNA is a two-fold recombinant having a mutation (Glu64Lys) that replaces the 64th glutamic acid from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with lysine. Acquired a GS2 stock.
  • PCR was performed using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and the attached buffer. The base sequences of these PCR products were determined by a conventional method, and it was determined whether the LtsA gene on the recombinant chromosomal DNA was wild-type or mutant.
  • a gene that encodes LtsA in chromosomal DNA has a mutation (Gly80Asp) that replaces the 80th glycine with aspartate in the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the GLA2 strain which is a two-time recombinant, was obtained.
  • pGlnA2 prepared in Example 2 or pCS299P as a control was transformed into ATCC13032 strain by electroporation to obtain ATCC13032 / pGlnA2 strain and ATCC13032 / pCS2 99P strain.
  • the obtained GS2, GLA2, ATCC13032 / pGlnA2, ATCC13032 / pCS299P and the parent ATCC13032 were added to the BYG agar medium (glucose 10 g, meat extract 7 g, peptone 10 g, salted sodium 3 g, yeast Cultivation was performed at 30 ° C for 24 hours using 5 g of extract (manufactured by Difco) and 18 g of pactogaga (manufactured by Difco) in 1 L of water and adjusted to pH 7.2.
  • the seed culture solution thus obtained was added to the main culture medium [glucose 50 g, urea 2 g, ammonium sulfate 20 g, potassium dihydrogen phosphate 0.5 g, dipotassium hydrogen phosphate 0.5 g, magnesium sulfate heptahydrate.

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Abstract

 コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを生産するコリネ型細菌がＬ－グルタミン生産性を示すことを特徴とするポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、該ＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡを有する微生物、該微生物を用いたＬ－グルタミン製造法を提供するものである。

Description

L_グルタミンの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、 L グルタミンの製造法に関する。
背景技術
[0002] 発酵法による L グルタミンの製造方法としてはァザセリン耐性を付与したコリネ型 細菌を用いる方法 (特許文献 1参照）、 6 ジァゾ 5 ォキソ ノルロイシン耐性を 付与したコリネ型細菌を用いる方法 (特許文献 2参照)などが知られて ヽる。またダル タミンシンテターゼ活性を増強して L グルタミンを製造する方法としては、アデ-リ ルイ匕による制御を行なうグルタミンシンテターゼ ·アデ-リルトランスフェラーゼの活性 が低下したコリネ型細菌 (非特許文献 1、特許文献 3参照)、アデ二リルィ匕を受けるダル タミンシンテターゼの 405番目のアミノ酸が置換したコリネ型細菌および ΡΠタンパク 質の活性が低下したコリネ型細菌 (非特許文献 2、特許文献 3参照)を用いる方法が 知られている。
[0003] コリネ型細菌にはグルタミンシンテターゼをコードする の他にグルタミンシンテタ 一ゼと相同性を示すグルタミンシンテターゼ 2をコードする gin がゲノム上に存在す ることが明らかになつている。コリネ型細菌の gln にコードされるポリペプチドはバシ ラス'サチリスのアデ-リルィ匕による制御を受けないグルタミンシンテターゼに高い相 同性を示すが、コリネ型細菌はアデ-リル化による制御をうけるグルタミンシンテター ゼをコードする ΕΐηΔを欠失させるとグルタミン要求性を示すことが報告されている (非 特許文献 1参照)。コリネ型細菌にぉ 、ては gln のコードするポリペプチドはダルタミ ンシンテターゼ活性を持たず、これまでに gin の改変により L—グルタミンを生産し た例はない。
[0004] またコリネバクテリウム'ダルタミカムにおいて lisAにコードされるリゾチーム感受性に 関わるポリペプチドの活性低下によりグルタミン酸を生産することが報告されて 、る ( 非特許文献 3、非特許文献 4、特許文献 4参照)。
特許文献 1：特開昭 55-148094号 特許文献 2：特開平 3-232497号
特許文献 3：特開 2002-300887号
特許文献 4 :国際公開第 00/14241号パンフレット
非特許文献 1 : FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)
非特許文献 2 : FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999)
非特許文献 3 : BMC BiotechnoL, 1, 9 (2001)
非特許文献 4 Journal of Bacteriology, 182, 2696 (2000)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、改変されたグルタミンシンテターゼ 2、改変されたグルタミンシン テターゼ 2をコードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DN Aを保有する形質転換体、該 DNAを染色体上に有する微生物、および該形質転換 体または該微生物を用いる L—グルタミンの製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は以下の（1)〜（34)に関する。
(1)コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお いて、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプ チドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現さ せたときの L—グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とす るポリペプチド。
(2)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にぉ 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外の アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記（1)に記載のポリペプチド。
(3)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にぉ 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外の アミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ ノ酸配列を有する、上記（1)に記載のポリペプチド。
(4)グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記（2)または（3)に記載 のポリペプチド。
(5)グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記（2)または（3)に記載のポリぺプ チド。
(6)コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバタテリゥム属または マイコバクテリゥム属に属する微生物である、上記（1)〜（5)のいずれか 1つに記載 のポリペプチド。
(7)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列が配列番号 1で表されるアミノ酸配列で ある、上記（1)に記載のポリペプチド。
(8)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸がグルタミン酸 以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記（7)に記載のポリペプチド。
(9)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端から 64番目のグルタミン酸 がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換 または付加されたアミノ酸配列を有する、上記（7)に記載のポリペプチド。
(10)グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記（8)または（9)に記載 のポリペプチド。
(11)グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記（8)または（9)に記載のポリべ プチド。
(12)上記（1)〜（11)のいずれ力 1つに記載のポリペプチドをコードする DNA。
(13)コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DN Aの塩基配列にお!/、て、配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から 190〜 192番 目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであ る塩基配列を有する、上記（12)に記載の DNA。
(14)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコド ンである、上記（13)に記載の DNA。
(15)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである 、上記（13)に記載の DNA。
(16)コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバタテリゥム属また はマイコバクテリゥム属に属する微生物である上記（13)〜（15)のいずれか 1つに記 載の DNA。
(17)配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜192番目の塩基配列がグ ルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記（12)に 記載の DNA。
(18)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコド ンである、上記（17)に記載の DNA。
(19)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである 、上記（17)に記載の DNA。
(20)配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズし、かつ配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 1 90〜192番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードす るコドンである塩基配列を有する DNAであって、該 DNAを野生型のコリネ型細菌に 導入して得られる形質転換体の L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌よ り多いことを特徴とする DNA。
(21)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコド ンである、上記（20)に記載の DNA。
(22)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである 、上記（20)に記載の DNA。
(23)上記（12)〜（22)のいずれ力 1つに記載の DNAを含む組換え体 DNA。
(24)上記（23)記載の組換え体 DNAで形質転換された微生物。
(25)染色体 DNA上に上記（12)〜（22)のいずれ力 1つに記載の DNAを含有する 微生物。
(26)コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列において、 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能 力を有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする、上記（24)または（25)に 記載の微生物。
(27)ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のアミ ノ酸に相応する位置のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する ことを特徴とする、上記（26)に記載の微生物。
(28)グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、上記（27)に記載の微生物。
(29) LtsAのアミノ酸配列が配列番号 10で表されるアミノ酸配列である、上記（26) に記載の微生物。
(30)ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 N末端から 80番 目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、 上記（29)に記載の微生物。
(31)グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、上記（30)に記載の微生物。
(32)微生物がコリネバタテリゥム属、ブレビバタテリゥム属またはマイコバクテリゥム属 に属する微生物である、上記（24)〜（31)のいずれか 1つに記載の微生物。
(33)コリネバタテリゥム属に属する微生物がコリネバタテリゥム 'ダルタミカムである、 上記（32)に記載の微生物。
(34)上記（24)〜（33)の 、ずれか 1つに記載の微生物を培地に培養し、培養物中 にし グルタミンを生成蓄積させ、該培養物から L グルタミンを採取することを特徴 とする、 L グルタミンの製造法。
発明の効果
[0007] 本発明によれば、改変されたグルタミンシンテターゼ 2および改変されたグルタミン シンテターゼ 2をコードする DNAが得られ、該 DNAを有する微生物により L グルタ ミンを生産することができる。また、該微生物の LtsAをコードする遺伝子に変異を導 入することにより、さらに効率のよい L グルタミンの製造が可能になる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本願発明について詳細に説明する。
(1)本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、
(i)コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお いて、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプ チドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現さ せたときの L—グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とす るポリペプチド、
(ii)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にぉ 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外の アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記 (i)に記載のポリペプチド、
(iii)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にぉ 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外の アミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ ノ酸配列を有する、上記 (i)に記載のポリペプチド、
(iv)グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記 (ii)または (m)に記載 のポリペプチド、
(V)グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記 (ii)または (m)に記載のポリぺプ チド、
(vi)コリネ型細菌に属する微生物がコリネバタテリゥム属、ブレビバタテリゥム属または マイコバクテリゥム属に属する微生物である、上記 (i)〜 (V)のいずれか 1つに記載の ポリペプチド、
(vii)グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列が配列番号 1で表されるアミノ酸配列で ある、上記 (0に記載のポリペプチド、
(viii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸がグルタミン 酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記 (vii)に記載のポリべプチ ド、
(ix)配列番号 1で表されるアミノ酸配列にぉ 、て、 N末端力も 64番目のグルタミン酸 がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換 または付加されたアミノ酸配列を有する、上記 (vii)に記載のポリペプチド、
(X)グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記 (vm)または (ix)に記載 のポリペプチド、および
(xi)グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記 (viii)または (ix)に記載のポリべ プチド、
などをあげることができる。 [0009] 本発明でいうコリネ型細菌に属する微生物とは、 Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974)に定義される、コリネバクテリゥム（Corvnebacterium)属、 ブレビバクテリウム (Brevibacterium)属、またはミクロバクテリゥム (Microbacterium)属 に属する微生物等をいう。
具体的には、し orvnebacterium acetoacidophilum. Corvnebacterium acetoglutamicu し orvnebacterium cailunae. corvnebacterium glutamicum. Corvnebacterium here ulis、 Corvnebacterium lilium、 Corvnebacterium melassecola. Corvnebacterium therm oaminogeneS Corvnebacterium efficiens. Corvnebacterium diphtheriae. Brevibacteri um saccharolvticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevib acterium thiogenitalis、 Microbacterium ammoniat hilum等 あげること力 ^でさ
[0010] より具体的【こ ίま、 Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Corvnebacteriu m acetoglutamicum ATCし 15806、 し orvnebacterium callunaeATし C 15991、 Corvneba cterium glutamicum ATCC13032、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13060、 Corvn ebacterium glutamicum ATCC1382b
Figure imgf000008_0001
め ヽま Corvne bacterium lactofermentum)、 Corvnebacterium glutamicum ATC C14020 (旧 Brev ibacterium divaricatum)、 Corvnebacterium glutamicum ATCC 13869 (旧属穂 Breviba cterium lactofermentum)、 Corvnebacterium herculis ATCC13868、 Corvnebacterium lilium ATCC15990、 Corvnebacterium melassecola ATCC17965、 Corvnebacterium t hermoaminogenesATCC9244、 Corvnebacterium efficiens YS- 314、 Corvnebacterium diphtheriaeNCTC 13129、 Brevibacterium saccharolvticum ATCC14066、 Brevibacteri um immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium roseum ATCC13825、 Brevibacteriu m thiogenitalis ATCC19240、 Microbacterium ammoniaphilumATCC15354等をあげ ことができる。
[0011] 上記コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2としては、上記コ リネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2であれば、いずれのダル タミンシンテターゼ 2でもよぐ例えば EP 1108790に記載されており、配列番号 1で表 されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032株由来グルタ ミンシンテターゼ 2、 GenBankァクセッションナンバー NP_738737に記載されているアミ ノ酸配列を有するコリネバタテリゥム 'エフイツシエンス YS-314株由来グルタミンシンテ ターゼ 2、 GenBankァクセッションナンバー NP_940011に記載されて 、るアミノ酸配列 を有するコリネバタテリゥム ·ジフテリア NCTC 13129株由来グルタミンシンテターゼ 2等 をあげることができる。
[0012] 上記 (i)の本発明のポリペプチドにおいて、欠失、置換または付加されるアミノ酸の 数は特に限定されないが、後述の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、 置換または付加できる程度の数であり、 1個から数十個、好ましくは 1〜20個、より好 ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個である。
また、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の 位置において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換または付カ卩があることを意味し、 欠失、置換または付加が同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L アルギニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L メチォニン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン 、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0013] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン G群：フエ-ルァラニン、チロシン
上記 (i)の本発明のポリペプチドとしては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列と少な くとも 70%以上の相同性を有していることが好ましぐより好ましくは 90%以上、さらに 好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を 有していることが望ましい。
[0014] アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えば Karlin and Altschulによるアルゴリ ズム BLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)〕や FASTA [Methods Enzym ol.， 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づ いて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol, 215. 403(1990)] o BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、ノ ラメータ一は例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BL ASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score = 50、 w ordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログ ラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知で ある (http://www.ncoi.nlm.nih.gov.)。
[0015] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドを発現させる際、宿主として用いる野生型のコリネ型細菌とは、自然集団中で、そ の微生物が属する種において、最も高頻度に見られる型の微生物のことをいい、例 ば、 Corvnebacterium acetoacidophnum ATCし 13870、 し orvnebacterium acetogluta micumA丁し C1580b、 Corvnebacterium callunae ATし C15991、 Corvnebacterium gluta micum ATCC13032、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13060、 Corvnebacterium g lutamicum ATCC13826 (旧属植 Brevibacterium flavum、あ ヽま Corvnebacterium la ctofermentum)、 し orvnebactenum glutamicum ATCし 14020 (旧属種 BreviDacterium d ivaricatum)、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13869 (旧属種 Brevibacterium lacto fermentum)、 Corvnebacterium herculis ATCC13868、 Corvnebacterium lilium ATCC 15990、 Corvnebacterium melassecola ATCC 17965 ^ Corvnebacterium thermoaminog enes ATCC9244、 Brevibacterium saccharolyticumATCC 14066^ Brevibacterium imm ariophilum ATCC14068、 Brevibacterium roseum ATCC13825、 Brevibacterium thiog enitalis ATCC19240、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることが できる。
[0016] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させる方法としては、該ポリぺプ チドをコードする DNAを野生型のコリネ型細菌に導入し、該 DNAと野生型のコリネ 型細菌の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相 同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させる方法や、該ポリペプチドをコ ードする DNAを含む組換え体 DNAを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、 該ポリペプチドを発現させる方法等をあげることができる。
[0017] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させ たときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いとは、該ポリぺプ チドをコードする DNAを野生型のコリネ型細菌に導入し、該 DNAと野生型のコリネ 型細菌の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相 同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させた形質転換体や、該ポリぺプ チドをコードする DNAを含む組換え体 DNAを用いて野生型のコリネ型細菌を形質 転換し、該ポリペプチドを発現させた形質転換体の L グルタミンの生産量が該野生 型のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認することができる。
[0018] 具体的には、該ポリペプチドをコードする DNAをコリネバクテリウム'ダルタミカムの 野牛.株である Corvnebacterium glutamicumATCC13032に導入し、該 DNAと Corvneb acterium glutamicum ATCC13032の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させた 形質転換体、または該ポリペプチドをコードする DNAと、 pCS299P (国際公開第 00/6 3388晉パンフレット）等のベクターからなる組換え体 DNAを用いて Corvnebacterium glutamicum ATCC13032を形質転換した形質転換体を造成する。該形質転換体およ び Corvnebacterium glutamicumATCC13032を BYG寒天培地「グルコース 10g、肉ェ キス 7g、ペプトン 10g、塩ィ匕ナトリウム 3g、酵母エキス（ディフコ社製) 5g、バタトァガー（ ディフコ社製） 18gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地〕を用い 30°Cで 24時間培養し 、各菌株をそれぞれ種培地〔グルコース 50g、ブイヨン 20g、硫酸アンモ-ゥム 5g、尿素 5g、リン酸二水素カリウム 2g、硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g、硫酸鉄 7水和物 lmg、 硫酸銅 5水和物 0.4mg、硫酸亜鉛 7水和物 0.9mg、塩化マンガン 4水和物 0.07mg、 4ホ ゥ酸 2ナトリウム 10水和物 0.01mg、 7モリブデン酸 6アンモニゥム 4水和物 0.04mg、チ ァミン塩酸塩 0.5mg、ピオチン O.lmgを水 1Lに含み pH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 10gカ卩えた培地〕 6mlを含む試験管に植菌し、 30°Cで 12時間〜 16時間培養する。得ら れた種培養液を、それぞれ本培養培地〔グルコース 50g、尿素 2g、硫酸アンモ-ゥム 2 0g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g、硫酸鉄 7水和物 2mg、硫酸マンガン 5水和物 2.5mg、チアミン塩酸塩 0.5mg、ビ ォチン O.lmgまたは O.OOlmgを水 1Lに含み pH7.0に調整後、炭酸カルシウムを 20g加 えた培地〕 30mlを含むバッフルつき 300ml三角フラスコに 10%植菌し、 30°C、 220rpm条 件下で、糖を完全に消費しきらないように 16〜18時間培養する。得られた培養物か ら遠心分離により菌体を除去し、上清中の L グルタミンの蓄積量を高速液体クロマ トグラフィー（HPLC)により定量する。形質転換体を培養して得られる上清中の L グ ルタミンの蓄積量力 Corvnebacterium elutamicum ATCC13032を培養して得られる 上清中の L—グルタミンの蓄積量より多いことを測定することにより確認することができ る。
上記 GO〜(vi)の本発明のポリペプチドについては、コリネ型細菌に属する微生物由 来のグルタミンシンテターゼ 2にお 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端 力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸とは、コリネ型細菌に属する微生物 由来のグルタミンシンテターゼ 2が有するアミノ酸配列と配列番号 1で表されるアミノ酸 配列との相同性を上記した BLASTおよび FASTAなどの相同性解析プログラムおよび ノ メーターを用いて計算し、 2つのアミノ酸配列を整列させたとき該コリネ型細菌に 属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2が有するアミノ酸配列上で、配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を いう。
[0020] グルタミン酸以外のアミノ酸としては、グルタミン酸以外のアミノ酸であればいずれの アミノ酸であってもよいが、好ましくはァラニン、グリシン、ノ リン、ロイシン、イソ口イシ ン、システィン、メチォニン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、プロリン、リジン、ヒスチ ジン、アルギニン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレ才ニン、お よびチロシン力 選ばれるアミノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸、さらに好まし くはリジン、ヒスチジン、およびアルギニンカゝら選ばれるアミノ酸であり、最も好ましくは リジンをあげることができる。
[0021] グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列において、配列番号 1で表されるアミノ酸配 列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のァ ミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが該ポリペプチドを野生型のコ リネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生 型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
[0022] 上記 (m)〜 (vi)の本発明のポリペプチドは、上記 (i)または (ii)の本発明のポリぺプ チドをコードする DNAに対して、後述する部位特異的変異導入法を用いて塩基を欠 失、置換または付加することにより取得することができる DNAがコードするアミノ酸配 列を有するポリペプチドである。導入する部位特異的変異は、上記 (i)または (ii)の本 発明のポリペプチドに対して、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も 64番 目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ 酸が欠失、置換または付加されるのであれば、どのような変異でもよい。
[0023] 欠失、置換または付加されるアミノ酸は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末 端から 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外のアミノ酸であれば特に限定 されない。
また、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸 以外任意の位置において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換または付カ卩があるこ とを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミ ノ酸は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上 記と同様である。
[0024] 上記 (m)〜 (vi)のポリペプチドは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列と少なくとも 70 %以上の相同性を有していることが好ましぐより好ましくは 90%以上、さらに好ましく は 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有してい ることが望ましい。
上記 (vii)の本発明のポリペプチドは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にぉ 、て 、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド であり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させた ときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポ リペプチドである。
[0025] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されな 、が、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
また、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の 位置において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換または付カ卩があることを意味し、 欠失、置換または付加が同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様で ある。
[0026] 上記 (vii)の本発明のポリペプチドとしては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列と少 なくとも 70%以上の相同性を有していることが好ましぐより好ましくは 90%以上、さら に好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性 を有していることが望ましい。
上記 (viii)〜 (xi)の本発明のポリペプチドは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を コードする DNAを用いて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目 のグルタミン酸をコードするコドンを、後述する部位特異的変異導入法を用いてダル タミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに置換した DNAを用いて取得することがで きる。グルタミン酸以外のアミノ酸としては、上記のアミノ酸をあげることができる。 [0027] 上記（ix)〜（xi)のポリペプチドは、上記（vii)または（viii)の本発明のポリペプチドを コードする DNAに対して、後述する部位特異的変異導入法を用いて塩基を欠失、 置換または付加することにより取得することができる DNAがコードするアミノ酸配列を 有するポリペプチドである。導入する部位特異的変異は、上記 (vii)または (vm)の本 発明のポリペプチドに対して、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も 64番 目のグルタミン酸以外のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または 付加されるのであれば、どのような変異でもよ 、。
[0028] 欠失、置換または付加されるアミノ酸は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末 端から 64番目のグルタミン酸以外のアミノ酸であれば特に限定されない。
また、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のグルタミン酸以外任意の位置にお いて、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置 換または付加が同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天 然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様である。
[0029] 上記 (ix)〜 (xi)のポリペプチドは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列と少なくとも 70 %以上の相同性を有していることが好ましぐより好ましくは 90%以上、さらに好ましく は 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有してい ることが望ましい。
(2)本発明の DNA
本発明の DNAは、
(i)上記本発明のポリペプチドのいずれか 1つのポリペプチドをコードする DNA、
(ii)コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNA の塩基配列にお 、て、配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から 190〜 192番 目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであ る塩基配列を有する、上記 (i)に記載の DNA、
(iii)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコド ンである、上記（ii)に記載の DNA、
(iv)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、 上記（ii)に記載の DNA、
(v)コリネ型細菌に属する微生物がコリネバタテリゥム属、ブレビバタテリゥム属または マイコバクテリゥム属に属する微生物である、上記 (ϋ)〜 (iv)のいずれか 1つに記載 の DNA、
(vi)配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜192番目の塩基配列がグ ルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記 (i)に記 載の DNA、
(vii)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコド ンである、上記 (vi)に記載の DNA、
(viii)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである 、上記（vi)に記載の DNA、
(ix)配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でハイブリダィズし、かつ配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 19 0〜192番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする コドンである塩基配列を有する DNAであって、該 DNAを野生型のコリネ型細菌に導 入して得られる形質転換体の L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より 多 、ことを特徴とする DNA、
(X)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドン である、上記 ）に記載の DNA、
(xi)グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、 上記（ix)に記載の DNA、および
(xii)上記（i)〜（xi)の 、ずれ力 1つに記載の DNAを含む組換え体 DNA、 などをあげることができる。
上記（i)の本発明の DNAは、上記（1)の本発明のポリペプチドをコードする DNA であり、例えば、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有 するポリペプチドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に 用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多い ことを特徴とするポリペプチドをコードする DNAをあげることができる。
[0031] 上記 (ii)〜(v)の本発明の DNAにおいて、コリネ型細菌に属する微生物由来のグ ルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとしては、上記（1)に記載されているコリネ 型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAをあげるこ とがでさる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとし ては、上記（1)に記載されているコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシン テターゼ 2をコードする DNAであれば、いずれの DNAでもよいが、コリネ型細菌に 属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとしては、例えば EP 1108790に記載されている配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、 GenBank ァクセッションナンバー BA000035に記載されているコリネバタテリゥム 'エフイツシェン ス YS-314株由来の染色体 DNAにおいて 2258903〜2260453番目の塩基配列に相 補的な塩基配列を有する DNA、 GenBankァクセッションナンバー BX248358に記載さ れて 、るコリネバタテリゥム ·ジフテリア NCTC13129株由来の染色体 DNAにお!/、て 32 0981〜322321番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有する DNA等をあげることが できる。
[0032] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAの 塩基配列において、配列番号 2で表される塩基配列の第 190〜192番目の塩基配 列に相応する領域とは、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAが有する塩基配列と配列番号 2で表される塩基配列との相同性 を、上記した BLASTや FASTA等の相同性解析プログラムおよびパラメーターを用 いて計算し、 2つの塩基配列を整列させたとき該コリネ型細菌に属する微生物由来の グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAが有する塩基配列上で配列番号 2記載 の塩基配列の第 190〜192番目に対応する領域をいう。
[0033] 配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜192番目の塩基配列に相応 する領域において、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとしては、ダルタミ ン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよぐ好ましくはァラニン、 グリシン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、システィン、メチォニン、トリプトファン、フエ- ルァラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、 グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選ばれるアミノ酸であり、より好ま しくは塩基性アミノ酸、さらに好ましくはリジン、ヒスチジン、およびアルギニン力も選ば れるアミノ酸であり、特に好ましくはリジンをコードするコドンあげることができる。
[0034] 上記（ii)〜（V)の DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細 胞に用 、て発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より 多いことは、上記と同様な方法、すなわち該 DNAを野生型のコリネ型細菌に導入し 、該 DNAと野生型のコリネ型細菌の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相同組換え技術により置換し、該 DNAがコードするアミノ酸 配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体、または該 DNAを含む組換え体 DNAを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該 DNAがコードするアミノ酸配 列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体を取得し、該形質転換体と宿主細 胞である野生型のコリネ型細菌とを培地に培養したときの培養上清中の L ダルタミ ンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認すること ができる。
[0035] 上記 (vi)〜（viii)の本発明の DNAは、配列番号 2で表される塩基配列を有する DN Aにおいて、後述する部位特異的変異導入法を用いることにより、配列番号 2で表さ れる塩基配列の 5'末端から 190〜192番目の塩基配列をグルタミン酸以外のァミノ 酸をコードするコドンに置換した DNAである。該コドンとしては、上記のグルタミン酸 以外のアミノ酸をコードするコドンあげることができる。
[0036] 上記（vi)〜（viii)の DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主 細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌よ り多いことは、該 DNAを野生型のコリネ型細菌に導入し、該 DNAと野生型のコリネ 型細菌の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相 同組換え技術により置換し、該 DNAがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチド を発現させた形質転換体、または該 DNAを含む組換え体 DNAを用いて野生型の コリネ型細菌を形質転換し、該 DNAがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチド を発現させた形質転換体を取得し、該形質転換体と宿主細胞である野生型のコリネ 型細菌とを培地に培養したときの培養上清中の L グルタミンの生産量が該野生型 のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認することができる。具体的には上 記の通りである。
[0037] 上記 (ix)〜 (xi)の DNAにお 、て、配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基 配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとは、配 列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAの相補鎖の一部または全部をプローブと して、コ口-一.ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるい はサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味 し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定ィ匕したフィルターを用 いて、 0. 7〜1. Omol/1の塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行 つた後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/l塩 化ナトリウム、 15mmol/lクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルター を洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。ハイブリダィゼーシヨンは 、 Molecular cloning, a laboratory manual, Tnird Edition, Cold pring Harbor Laoorat ory Press (2001) (以下、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコール ズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略す）、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に己載されている方 法に準じて行うことができる。ハイブリダィズ可能な DNAとして具体的には、 BLAST や FASTA等を用いて計算したときに、配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 7 0%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以 上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0038] 上述のハイブリダィズ可能な DNAにおいて、配列番号 2で表される塩基配列の 5' 末端から 190〜192番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸 をコードするコドンである塩基配列を有する DNAにおいて、該コドンとしては、上記 のグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンをあげることができる。
該 DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発 現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上 記した方法により確認することができる。
[0039] 本発明の DNAとしては、例えば、配列番号 2で表される塩基配列にぉ 、て、該塩 基配列の 5'末端から 190番目のグァニンがアデニンに置換した DNA等をあげること ができる。該 DNAは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミ ノ酸がグルタミン酸力 リジンに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード ずる DNAである。
[0040] 上記（xii)の本発明の組換え体 DNAは、上記（i)〜（xi)の本発明の DNAとべクタ 一からなる組換え体 DNAである。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、バタテリオフ ァージ等をあげることができ、 (i)〜（Xi)の本発明の DNAと連結できるものであれば!/、 ずれのベクターでも構わない。プラスミドとしては、 pUC19 (タカラバィォ社製）、 pHSG 299 (タカラバイオ社製）、 pBR322 (タカラバイオ社製）、 pCGl (特開昭 57- 134500号）、 pCG2 (特開昭 58- 35197号）、 pCG4 (特開昭 57- 183799号）、 YEpl3 (ATCC37115)、 Y Ep24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)等をあげることができる。コスミドとしては 、 pAxCAwtit (二ツボンジーン社製)等をあげることができ、バタテリオファージとしては 、 M13mpl8RF (二ツボンジーン社製)等をあげることができる。
(3)本発明の DNAの調製
(i)コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAの 取得
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAを 取得する方法としては、コリネ型細菌に属する微生物力 斎藤らの方法 [Biochim. Bio phys.Acta, 72, 619 (1963)]に従い調製することのできる染色体 DNAを铸型として、 配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計、合成することのできるプライマー DN Aを用 Vヽて PCR等により取得することができる。
[0041] 染色体 DNAの全塩基配列が明ら力となっているコリネ型細菌に属する微生物由来 のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAを取得する方法としては、上記のように 染色体 DNAを铸型として、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド と 70%以上の相同性を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列に基づき設 計、合成することのできるプライマー DNAを用いて PCR等により取得することができる [0042] 具体的には、コリネバタテリゥム.ダルタミカム ATCC13032株から染色体 DNAを調 製し、該 DNAを铸型として、配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端および 3 '末端 領域の配列を有する DNAをィ匕学合成し、該 DNAをプライマーセットとして用いた PC Rによりグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAを取得することができる。上記方法 により取得できる DNAとしては、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA等を あげることができる。
[0043] また、配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAの一部、または全部をプローブ としたハイブリダィゼーシヨン法によって、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタ ミンシンテターゼ 2をコードする DNAを取得することができる。
さらに、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする D NAは、配列番号 2で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有す る DNAをィ匕学合成することにより取得することができる。
(ii)本発明の DNAの調製
本発明の DNAは、上記 (i)で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のダルタミ ンシンテターゼ 2をコードする DNAを用いて、常法により取得することができる。
[0044] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお ヽ て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドをコードする DNAは、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドをコードする DNAに、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3版、カレント 'プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc.N atl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、等に記載の部位特異 的変異導入法を用いて部位特異的変異を導入することにより、取得することができる
[0045] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお ヽ て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドを生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができる該ポリペプチドを コードする DNAを用いて、野生型グルタミンシンテターゼ 2を生産するコリネ型細菌 を形質転換し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードする DNAと 該野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAを相同組換え技術を用いて置 換することにより取得できる。また、上記方法により取得することができるポリペプチド をコードする DNAを含む組換え体 DNAを用いて、コリネ型細菌を形質転換すること により取得することができる。
[0046] 上記方法により取得することができる DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリ ネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型 のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお ヽ て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリ ペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときの L ダルタミ ンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多い変異型グルタミンシンテターゼ 2をコ ードする DNAの取得方法としては以下の方法もあげられる。
[0047] 上記コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DN Aに、ヒドロキシルァミンなどの化学変異剤を接触させる方法やエラー 'ブローン PCR 法によりランダム変異を導入した変異型グルタミンシンテターゼ 2遺伝子のライブラリ 一を造成する。該ライブラリーと、コリネ型細菌内で自立複製可能であり、かつコリネ 型細菌の生育を抑制する薬剤への耐性を付与する薬剤耐性遺伝子を含むプラスミド DNAを連結し、組換え体 DNAを造成後、該組換え体 DNAを用いて野生型のコリネ 型細菌を形質転換する。該形質転換体を、グルタミン要求性を示すコリネバクテリウ ム.グルタミカム ATCC13032由来 欠損株 MJ4- 26株 [FEMS Microbiology Letters , 154, 81 (1997)]を 1 X 106 cells/cm3程度含有する最小寒天培地〔グルコース 1%、 N H C1 0.4%、尿素 0.2%、 KH PO 0.1%、 K HPO 0.3%、 MgSO 0.04%、 FeSO 10mg/Lゝ M
4 2 4 2 4 4 4 nSO lmg/L、ニコチン酸 5mg/L、ピオチン 100 μ g/L、チアミン塩酸塩 5mg/L、バタ
4
トァガー（Difco) 1.6% (pH7.2)〕に 1〜10 cells/cm2になるように塗布する。該最小寒天 培地を 30°Cで 2〜3日間静置後、寒天培地に含まれるグルタミン要求株 MJ4-26株の 生育も確認できるハローをカゝきとり、組換え体 DNAを有する形質転換体のみが生育 可能な薬剤を含有する最小寒天培地にシングルコロニーを形成するように塗布する
。該薬剤含有最小寒天培地を 30°Cで 1〜2日間静置後、コロニーを形成する形質転 換体を選択する。さらに、該形質転換体を培地中に培養し、培養終了時の培地中の グルタミン濃度を測定する。同様に該野生型のコリネ型細菌を培養して検出されるグ ルタミン濃度よりも、培養終了時の培地中のグルタミン濃度が増加している形質転換 体を選択する。該形質転換体が保持する組換え体 DNAが有する変異型グルタミン シンテターゼ 2をコードする DNAは、宿主に野生型のコリネ型細菌よりも高い Lーグ ルタミン生産性を付与しており、このような手法で本発明の DNAを取得することがで きる。
[0048] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお ヽ て、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸に相応する位 置のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリべ プチドをコードする DNAは、上記した部位特異的変異導入法により、配列番号 1で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAにお 、て、配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸を コードするコドンをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとなるように塩基置 換を行うことにより取得することができる。グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコド ンとしては、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよぐ 好ましくはァラニン、グリシン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、システィン、メチォニン、 トリプトファン、フエ二ルァラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギ ン酸、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン力も選ばれるアミ ノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸、さらに好ましくはリジン、ヒスチジン、および アルギニン力も選ばれるアミノ酸であり、最も好ましくはリジンをコードするコドンあげる ことができる。
[0049] 上記方法により取得することができる DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリ ネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型 のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または 付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主 細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌よ り多 、ことを特徴とするポリペプチドをコードする DNAの取得方法としては、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAを用い、上記した 部位特異的変異導入法、化学変異剤を接触させる方法やエラー 'プローン PCRによ りランダム変異を導入する方法をあげることができ、上記した方法によりグルタミン生 産量を比較することにより本発明の DNAであることを確認できる。
[0050] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸がグルタミン酸以 外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAは、上 記した部位特異的変異導入法により、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポ リペプチドをコードする DNAにお 、て、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端 力ら 64番目のグルタミン酸をコードするコドンをグルタミン酸以外のアミノ酸をコード するコドンとなるように塩基置換を行うことにより取得することができる。該コドンとして は、上記のグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンをあげることができる。
[0051] 上記方法により取得することができる DNAがコードするポリペプチドを野生型のコリ ネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときの L グルタミンの生産量が該野生型 のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸に相応する位置 のアミノ酸以外の 1以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする DNAを調製する際には、該アミノ酸をコードするコドン以外のコドンをそのコ ドン単位で、すなわち 3塩基分を欠失させることが好ましい。また、配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外の 1 以上のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAを調 製する際には、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸を コードするコドンに含まれる塩基以外の塩基において、該塩基を含むコドンがコード するアミノ酸が別のアミノ酸に変わるように塩基を置換することが好ましい。さらに、本 発明のポリペプチドのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする DNAを調製する際には、アミノ酸をコードする各コ ドンの間、または前後にアミノ酸をコードするコドン、すなわち 3塩基分を付加すること が好ましい。
[0052] 本発明の DNAは、ストリンジ ントな条件下で、配列番号 2で表される塩基配列か らなる DNAの相補鎖の一部または全部をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼ ーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼ ーシヨン法等を用いることにより取得することもできる。具体的には、コロニーあるいは プラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. Omol/1の塩化ナト リウム存在下、 65°Cでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶 液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/l塩ィ匕ナトリウム、 15mmol/lタエン酸ナ トリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる D NAを取得することができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキユラ一'クロー-ング第 3版、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、 DNA Cloning 1: C ore Techniques, A Practical Approach, second Edition, uxford University (1995)等 に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件は、プローブ DNAの鎖長の長さや GC含量に応じて調整が可能であり、モレキユラ一'クローニン グ第 3版等に記載の方法により設定することができる。
[0053] 上述のコ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法等により取得した DNA力 配列番号 2で 表される塩基配列の 5 '末端から 190〜192番目の塩基配列に相応する領域がダル タミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する DNAであることを 確認し、さらに該 DNAを野生型のコリネ型細菌に導入し、該 DNAと野生型のコリネ 型細菌の染色体 DNA上の野生型グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAとを相 同組換え技術により置換し、該 DNAがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチド を発現させた形質転換体、または該 DNAを含む組換え体 DNAを用いて野生型の コリネ型細菌を形質転換し、該 DNAがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチド を発現させた形質転換体を取得し、上記した方法を用いて該形質転換体と宿主細胞 である野生型のコリネ型細菌とを培地に培養したときの培養上清中の L グルタミン の生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを確認することにより、本発明の DN Aを取得することができる。 [0054] 本発明の DNAを含む組換え体 DNAは、本発明の DNAとベクターとを連結するこ とにより取得することができる。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、バタテリオファー ジ等をあげることができ、本発明の DNAと連結できるものであればいずれのベクター でも構わない。本発明の DNAとベクターとを連結させる方法としては、 T4 DNA ligas e (タカラバイオ社製)等を用いて酵素的に本発明の DNAとベクターとを連結させる 方法等をあげることができる。
(4)本発明のポリペプチドの製造
上記（1)の本発明のポリペプチドは、モレキュラー 'クローユング第 3版、カレント'プ 口トコールズ ·イン.モレキュラー.バイオロジー等に記載されて 、る方法に従 、、例え ば以下の方法により、上記（2)の本発明の DNAを宿主細胞内で発現させて製造す ることがでさる。
[0055] すなわち、上記で取得された DNAを元にして、必要に応じて該ポリペプチドをコー ドする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製し、該 DNA断片を適当な発現べク ターのプロモーターの下流に連結した組換え体 DNAを作成する。該組換え体 DNA を、該発現べクタ一に適した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製する ことができる。
また該 DNA断片の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基 を置換した DNAを調製することにより、本発明のポリペプチドを効率よく製造すること ができる。
[0056] 宿主細胞としては、 目的とする遺伝子を発現できる細菌、または酵母であればいず れも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可 能な 、しは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードする DNAを 転写できる位置にプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコード する DNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同 時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列、より構成 されたベクターであることが好ま U、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/ヽ てもよい。 [0057] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガー マンハイム社より巿販）、 pKK233- 2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGE MEX-1 (Promega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600号）、 p KYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 ( 1989)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (Stratagene社製）、 pTrs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407)より調 製〕、 pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製〕、 pGHA2 [E scherichia coli IGHA2 (FERM B- 400)より調製、特開昭 60- 221091号〕、 pGKA2 [Esch erichia coliIGKA2 (FERM BP- 6798)より調製、特開昭 60- 221091号〕、 pTerm2 (米国 特許 4686191号、米国特許 4939094号、米国特許 5160735号）、 pSupex、 pUB110、 pT P5、 pC194、 pEG400 [J. BacterioL, Γ72, 2392 (1990)〕、 pGEX (Pharmacia社製）、 pET システム (Novagen社製)等をあげることができる。
[0058] プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。
例えば、 t _プロモーター（P )、 lacプロモーター、 Pプロモーター、 Pプロモーター、
tm L R
T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることがで きる。また P を 2つ直列させたプロモーター（P X 2)、 tacプロモーター、 lacT7プロモ
trp trp
一ター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いる ことができる。リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ（Shine- Dalgarno)配列と 開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いること が好ましい。本発明の組換え体 DNAベクターにおいては、本発明の DNAの発現に は転写終結配列は必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を 配置することが好ましい。
[0059] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属 (Escherichia)、セラチア属 (Serratia)、バチルス 属 (Bacillus)、ブレビバタテリゥム属 (Brevibacterium)、コリネバタテリゥム属 (Corvneba cterium)、ミクロノくクテリゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属 等に属する微生物、例えば、 Escherichia coli XL1- Blue、 Escherichia coli XL2- Blue 、 Escherichia coli DH1、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coliKY3276、 Escheric hia coliW1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No •49、 Escherichia coliW3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli GI698、 Escheri chia coli TB1、 Serratia ficaria. Serratia fonticola、 Serratia liguefaciens. Serratia marc escens. Bacillus subtilis、 Bacillus amvlolia uefaciens、 Brevibacterium ammoniagenes. Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、 Brevibacterium saccharolyticumATCC 1 4066、 Brevibacterium flavum ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentumATCC 13 869、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13032、 Corvnebacterium glutamicum ATC C13869、 Corvnebacterium acetoacidophilumATCC13870, Microbacterium ammoniap hilum ATCC15354、 Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. D— 0110等をあげること力 ^ できる。
[0060] 特に宿主細胞が、コリネバクテリゥム（Corvnebacterium)鼠、ブレビパクテリゥム（Bre vibacterium)属、またはミクロバクテリゥム (Microbacterium)属に属する微牛物である とさは、し orvnebacterium acetoacidophiium, し orvnebacterium acetoglutamicum、 Cor vnebacterium callunae, Corvnebacterium glutamicum, し orvnebacterium lactoferment um、 Corvnebacterium herculis, Corvnebacterium lilium、 Corvnebacterium melasseco la^ Corvnebacterium thermoaminogenes、 Brevibacterium saccharolvticum, Brevibact erium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium thiogenitalis, Microba
Figure imgf000028_0001
[0061] より具体的【こ ί 、 し orvneDactenum acetoacidophilum ATCし 丄 870、 Corvnebactenu m acetoglutamicum ATCし 15806、 し orvnebacterium callunae ATCし 15991、 Corvne bacterium glutamicum ATCC 13032、 Corvnebacterium glutamicum ATCC 13060、 C orvnebacterium glutamicum ATCC 13826 (旧属種 Brevibacterium flavum)、 Corvneba cterium glutamicumATCC 14020 (旧属種 Brevibacterium divaricatum)、 Corvnebacte rium glutamicumATCC 13869 (旧属種 Brevibacterium lactofermentum)、 Corynebact erium herculis ATCC 13868、 Corvnebacterium lilium ATCC 15990、 Corvnebacteriu m melassecola ATCC 17965、 Corvnebacterium thermoaminogenesATCC 9244、 ATC C 9245、 ATCC 9246および ATCC 9277、 Brevibacterium saccharolyticumATCC 140 66、 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、 Brevibacterium roseum ATCC 138 25、 Brevibacterium thio¾enitalis ATCC 19240、 Microbacterium ammoniaOhilum ATC C 15354を使用することが好ましい。
[0062] 宿主糸田胞力、上記の Corvnebacterium属、 Brevibacterium属、またま Microbacteriu
属に属する微生物であるときは、本発明の DNAを含む組換え体 DNAを作製する ために用いられるベクターとして、 pCGl (特開昭 57-134500号）、 pCG2 (特開昭 58-35 197号）、 pCG4 (特開昭 57- 183799号）、 pCGl l (特開昭 57- 134500号）、 pCG116、 pC E54、 pCBlOl (いずれも特開昭 58- 105999号）、 pCE51、 pCE52、 pCE53 [いずれも Mol ecular and General Genetics, 196, 175 (1984)]、 pCS299P (国際公開第 00/63388号 パンフレット）等を用いることが好まし 、。
[0063] 組換え体 DNAベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方 法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（例えば、特開昭 57- 18649 2および特開昭 57- 18649)、または Gene, Γ7, 107 (1982)や Molecular & General Gene tics, 168, 111 (1979)、電気穿孔法 [例えば、 J. Bacteriology, Γ75, 4096 (1993)]に記 載の方法等をあげることができる。
[0064] 酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等をあげる ことができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05プロ モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロモー ター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MF a lプロモー ター、 CUP 1プロモーター等をあげることができる。
[0065] 宿主細胞としては、サッカロマイセス (Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス (Sch lzosaccnaromvces) J¾、グリュ ベロ セス (Kluweromvces) 、トリコスホロン (Tnchosp oron)属、シヮニォミセス（Schwanniomvces)属、ピヒア（Pichia)属、キャンディダ（Candi ）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス ·セレビシェ（Saccharomvces cer evisiae 、シゾサッカロマイセス ·ポンべ (Schizosaccharomvces pombe)、クリュづベロ セス'ラクテイス (KluYyeromYces lactis)、トリコスポロン'プノレランス（Trichosporon ^ull ulans)、シヮ-才ミセス .ァノレビウス (Schwanniomvces alluvius)、キャンディダ ·ユーテ ィリス (Candida utilis)等をあげることができる。
[0066] 組換え体 DNAベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL,
194. 182 (1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]
、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,
1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
[0067] 酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得る ことができる。
遺伝子の発現方法としては、そのまま発現させる以外に、モレキュラー 'クローニン グ第 3版に記載されている方法等に準じて、融合タンパク質として発現させることがで きる。
[0068] 本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養 物中に本発明のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物より本発明のポリペプチド を採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培地としては、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭 素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地 であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ 、。
[0069] 炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シユークロース、マルトース、でんぷん加 水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機 酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、炭酸アンモ- ゥム、酢酸アンモ-ゥムなどの各種無機および有機アンモ-ゥム塩類、尿素、その他 窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン'スティープ 'リカー、大豆 加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
[0070] 無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモ-ゥム
、塩ィ匕ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。 その他、必要に応じて、ピオチン、チアミン等の微量栄養源をカ卩えることができる。こ れら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン'スティープ 'リカー、カザミノ酸等 の培地添加物で代用することもできる。
[0071] 培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に 20°C〜42°Cが好適である力 特に 25°C〜40°Cが好ましい。培地中の pHは、 5〜9 に維持することが好ましい。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿 素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常 12時間〜 6日間 である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添カ卩してもよい。
[0072] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 k£プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 1mプロモーターを用い た組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等 を培地に添カ卩してもよい。
[0073] 本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細 胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、採用す る方法に応じて、宿主細胞を選択し、発現させるポリペプチドの構造を変えることがで きる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)〕、または特開平 5 -336963号、国際公開 94/23021号パンフレット等に記載の方法を準用することにより 、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
[0074] また、特開平 2-227075号に記載されて 、る方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺 伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常 の酵素の単離精製法を用いることができる。 例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終 了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレ ンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細 胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常 の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒 による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三 菱ィ匕学社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセフ ァロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子 篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング 法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。
[0075] また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を 回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を 回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。該可溶ィ匕 液を希釈または透析し、該可溶ィ匕液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、 該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法に より該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
[0076] 本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等 の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドある 1、は該ポ リペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分 離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同 様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0077] このようにして取得されるポリペプチドとして、上記（1)のポリペプチドがあげることが でき、より具体的には配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のダル タミン酸残基がリジン残基に置換したポリペプチドをあげることができる。
(5)本発明の微生物
本発明の微生物としては、本発明のポリペプチドを生産する微生物をあげることが でき、本発明のポリペプチドを生産できる微生物であれば 、ずれの微生物でもよ 、が 、好ましくはコリネ型細菌に属する微生物、より好ましくはコリネバクテリウム属、ブレビ ノクテリウム属、またはミクロバタテリゥム属に属する微生物、さらに好ましくはコリネバ クテリウム ·ダルタミカムなどをあげることができる。
[0078] 本発明の微生物は、本発明の DNAを用いて、常法に準じて宿主細胞を形質転換 することにより取得することができ、例えば、上記 (4)で得られる形質転換体をあげる ことができる。
また、本発明の微生物としては、染色体 DNA上に本発明の DNAを有する微生物 をあげることができる。該微生物は、通常の変異処理法、組換え DNA技術による遺 伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等を用いて、宿主に使用される微生 物の染色体 DNA上のグルタミンシンテターゼ 2に部位特異的変異を導入して得るこ とができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー 'クローユング第 3版、カレントプ ロトコールズ.イン.モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、等に記載の方法に従って行うことができる。
[0079] また、相同糸且換え法を用いて、染色体 DNA上のグルタミンシンテターゼ 2をコード する DNAを上記 (3)の方法で得られる本発明の DNAで置換することによつても、染 色体上に本発明の DNAを有する微生物を作製することができる。
具体的には、上記（3)の方法で得られる本発明の DNAを、宿主細胞中では自律 複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシ ユタラーゼ遺伝子^ S[Mol. Microbiol, 6, 1195 (1992)]を有するプラスミドに組み込 み、上記 (4)記載の方法に従い微生物に導入する。
[0080] 該組換え体プラスミドは宿主細胞中で自律複製できな 、ので、該組換え体プラスミ ド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミドが Camp bellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた形質転^ ¾を取得することがで きる。
つぎに、本発明の DNAと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシユークラ一 ゼがシユークロースを自殺基質に転換することを利用した選択 [J. BacterioL, 174, 54 62 (1992)]を行うことによって、宿主染色体 DNA上のグルタミンシンテターゼ 2が本 発明の DNAに置換された株を取得することができる。
[0081] 以上の方法で、染色体上の遺伝子置換を行うことができる力 上記の方法に限らず 、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもで きる。
染色体上に本発明の DNAを有する微生物を作製する方法としては、他にも細胞 融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、 19 86年、学会出版センターに記載の方法をあげることができる。
また、本発明の微生物としては、本発明の DNAを有し、かつ
(i)コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列にお 、て、 1以上のアミ ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能 力を有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする微生物、
(ii)ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端力も 80番目のァミノ 酸に相応する位置のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有するこ とを特徴とする、上記 (i)に記載の微生物、
(iii)グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、上記 (ii)に記載の微生物、
(iv) LtsAのアミノ酸配列が配列番号 10で表されるアミノ酸配列である、上記 (i)に記 載の微生物、
(V)ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 N末端から 80番目 のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上 記 (iv)に記載の微生物、および
(vi)グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、上記 (V)に記載の微生物、 などをあげることができる。
[0082] コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAとしては、配列番号 11で表される塩基配 列を有する DNAの相補鎖、または該 DNAの一部からなる DNAの相補鎖をプロ一 ブとして用い、上記ハイブリダィゼーシヨンにより、または、配列番号 11で表される塩 基配列から設計できるプライマー DNAを用い、上記コリネ型細菌の染色体 DNAを 铸型とした PCRにより取得することができる LtsAをコードする DNAを用いて、常法に より取得することができる。
[0083] 上記コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAとしては、上記コリネバタテリゥム属 に属する微生物由来の LtsAであれば、いずれの LtsAでもよぐ例えば EP 1108790 に記載されている配列番号 10記載のアミノ酸配列を有する LtsAをあげることができ る。
コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列にお 、て、 1以上のァミノ 酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、上記のコリネ 型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお 、て、 1 以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを造 成する方法と同様な方法で造成することができる。欠失、置換または付加されたァミノ 酸の数、位置、種類に関しては上記のコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミン シンテターゼ 2のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有するポリペプチドの場合と同様である。
[0084] コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列において、 1以上のァミノ 酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産するコリネ 型細菌は、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードする DNAを用 いて、野生型 LtsAを生産し、かつ本発明の DNAを有するコリネ型細菌を形質転換 し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードする DNAと該野生型 L tsAをコードする DNAを相同組換え技術を用いて置換することにより取得することが できる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタ ミン生産量が LtsA変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定 することによって、該コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができ る。
[0085] コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列において、 1以上のァミノ 酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産するコリネ 型細菌がリゾチーム感受性を示すとは、該コリネ型細菌を、 LtsAを置換する前の野 生型 LtsAを生産するコリネ型細菌が生育できる最大濃度のリゾチームを含有する培 地で培養したとき、その生育速度が野生型 LtsAを生産するコリネ型細菌を該培地で 培養したときの生育速度より遅!、ことを意味する。
[0086] 上記 GOまたは (iii)の本発明の微生物については、コリネ型細菌に属する微生物由 来の LtsAにおいて、配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のアミ ノ酸に相応する位置のアミノ酸とは、コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAが有 するアミノ酸配列と配列番号 10で表されるアミノ酸配列との相同性を上記した BLAST および FASTAなどの相同性解析プログラムおよびパラメーターを用いて計算し、両配 列を整列させたとき該コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAが有するアミノ酸配 列上で、配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のアミノ酸に対応 する位置のアミノ酸をいう。
[0087] グリシン以外のアミノ酸としては、グリシン以外のアミノ酸であればいずれのアミノ酸 であってもよいが、好ましくはァラニン、ノ《リン、ロイシン、イソロイシン、システィン、メ チォニン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、 ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ-ン、チロシン、グルタミン酸 力も選ばれるアミノ酸であり、より好ましくはァスパラギン酸をあげることができる。
[0088] 上記 GOまたは (iii)の本発明の微生物については、コリネ型細菌に属する微生物由 来の LtsAにおいて、配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のアミ ノ酸に相応する位置のアミノ酸をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入 法を用いてグリシン以外のアミノ酸をコードするコドンに置換した DNAを造成し、該 D NAを用いて、野生型 LtsAを生産し、かつ本発明の DNAを有するコリネ型細菌を形 質転換し、上記方法により取得することができる DNAと該野生型 LtsAをコードする DNAとを相同組換え技術を用 ヽて置換することにより取得できる。該コリネ型微生物 力 Sリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量が LtsA変異 を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリ ネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。
[0089] 上記 (iv)の配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失 、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号 10で表され るアミノ酸配列をコードする DNAを用いて、上記のコリネ型細菌に属する微生物由 来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置 換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを造成する方法と同様な方法 で造成することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数、位置、種類に関 しては上記の通りである。
[0090] 配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを菌体内 で生産される唯一の Lts Aとして生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得するこ とができるポリペプチドをコードする DNAを用いて、野生型 LtsAを生産し、かつ本発 明の DNAを有するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができる ポリペプチドをコードする DNAと該野生型 LtsAをコードする DNAを相同糸且換え技 術を用いて置換することにより取得できる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示 し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量が LtsA変異を導入する前のコリネ型 細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリネ型細菌が本発明の微 生物であることを確認することができる。
[0091] 上記 (V)または (vi)の本発明の微生物は、配列番号 10で表されるアミノ酸配列をコ ードする DNAを用いて、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目の グリシン残基をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン 残基以外のアミノ酸をコードするコドンに置換した DNAを用いて取得することができ る。該アミノ酸としては、上記のグリシン以外のアミノ酸をあげることができる。
[0092] 上記 (V)または (vi)の本発明の微生物は、配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N 末端から 80番目のグリシン残基をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入 法を用いてグリシン以外のアミノ酸をコードするコドンに置換した DNAを造成し、該 変異 DNAを用いて、野生型 LtsAを生産し、かつ本発明の DNAを有するコリネ型細 菌を形質転換し、上記方法により取得することができる DNAと該野生型 LtsAをコー ドする DNAを相同組換え技術を用 ヽて置換することにより取得できる。該コリネ型微 生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量が LtsA 変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該 コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。
[0093] なお、上記 (i)〜(vi)の本発明の微生物は、コリネ型細菌に上記のように LtsAの変 異を導入した後、本発明のポリペプチドの生産能を付与することによつても、本発明 の微生物を造成することができる。
(6) L グルタミンの製造
上記 (4)で得られる形質転換体、または上記 (5)で得られる本発明の微生物を培 地に培養し、培養物中に L グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中より L グルタ ミンを採取することにより、 L -グルタミンを得ることができる。
[0094] 該微生物の培養は、 L グルタミンを生成する能力を有する微生物の通常の培養 法によって行うことができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成 培地または天然培地!/ヽずれも使用できる。
炭素源としては、本発明の微生物が資化できるものであればよぐ例えばダルコ一 ス、糖蜜、果糖、シユークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、ェタノ ールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる
[0095] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、炭酸アンモ- ゥム、酢酸アンモ-ゥムなどの各種無機および有機アンモ-ゥム塩類、尿素、その他 窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン'スティープ 'リカー、大豆 加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモ-ゥム 、塩ィ匕ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
[0096] その他、必要に応じて、ピオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄 養源をカ卩えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン ·ステ ィープ 'リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一 般に 20〜42°Cが好適であり、さらに好ましくは 30°C〜40°Cである。培地の pHは 5〜 9の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地の pHの調整は、無機あるい は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、 pH緩衝液などを用 いて行う。 [0097] 培養期間は通常 12時間〜 6日間であり、培養液中に L グルタミンが生成蓄積す る。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、ィォ ン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより L グルタミンを回収すること ができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるもの ではない。
実施例 1
[0098] 遺伝子置換用プラスミド pCglnA2の作製
配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 64番目のグルタミン酸がリジン に置換 (Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAを、 PC Rを用いる部位特異的変異法 [モレキュラー ·クローユング第 3版]を用いて次のように して取得した。
[0099] まず、コリネバタテリゥム.ダルタミクムの野生型株 ATCC13032の染色体 DNAを、斎 藤らの方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]に従って調製した。
次いで、該染色体 DNAを铸型として、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社 製）、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いて PCRを行った。 PCRに用い たプライマーは、 EP 1108790に記載されているコリネバクテリウム'ダルタミカム由来の グルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAの塩基配列情報に基づき、配列番号 2で 表されるグルタミンシンテターゼ 2をコードする領域中で、配列番号 1で表されるダル タミンシンテターゼ 2の有するアミノ酸配列の N末端力 第 64番目のグルタミン酸をコ ードする領域 (配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から 190〜 192番目の領域 、 gaa)を含む 21塩基からなる領域 (配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 18 0〜200番目の塩基配列、および配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 680 〜700番目の塩基配列）において、配列番号 5で表される該グルタミン酸をコードす る領域を、リジンをコードするコドン (aaa)に置換した塩基配列からなる DNA断片、お よびその相補配列である配列番号 6で表される 21塩基の塩基配列を有する DNA断 片を常法に従い合成した。 [0100] また、配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 167〜186番目の塩基配列に S lHI認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断片を合成し、その塩基配列を配 列番号 4に示した。
配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端から 1185〜 1204番目の塩基配列の相 補配列に S iHI認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断片を合成し、その塩基 配列を配列番号 7に示した。
[0101] 配列番号 4で表される塩基配列を有する DNA断片と配列番号 6で表される塩基配 列を有する DNA断片をプライマーとし、また配列番号 5で表される塩基配列を有す る DNA断片と配列番号 7で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーとして 、得られた染色体 DNAを铸型として、 Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製 )と添付のバッファーを用いて 2種類の PCRを各々行った。
[0102] 各々の PCRにより得られた、約 0.5kbの増幅産物（配列番号 3で表される塩基配列 の 5'末端力ゝら第 167〜700番目の塩基配列に対応する DNA断片、および第 680番 目力 1204番目に対応する DNA断片）をァガロースゲル電気泳動し、 GENECLEA N Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を铸型とし、配列番号 4で表される塩基配列を有する DNA断片と 配列番号 7で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーとして用いて PCRを 行った。この PCRにより、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 64番目 のグルタミン酸をコードするコドン (gaa)がリジンをコードするコドン (aaa)に置換された約 l.Okbの DNA断片を取得した。得られた約 l.Okbの DNA断片を ^ lHI処理し、ァガロ ースゲル電気泳動した後、 GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した
[0103] 該 DNA断片をプラスミド pESB30に挿入した。 pESB30は、カナマイシン耐性遺伝子 を有するベクター PHSG299 [Gene, 61, 63 (1987)]の E^I切断部位に、 Bacillus subtilis 由来のレパンシュクラーゼ遺伝子^ Sを含む 2.6kbの IDNA断片 [Mol. Microbiol, 6, 1195 (1992)]を連結したプラスミドである。具体的には pESB30を ^ iHI (タカラバイ ォ社製)で切断後、アルカリフォスファターゼ (タカラバイオ社製)処理を行ない、ァガ ロースゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて pESB30の BamHI 処理断片を抽出、精製した。この pESB30断片と、上記で得られた πΗΙ処理した約 1 • Okbの DNA断片を混合し、ライゲーシヨンキット verl (タカラバイオ社製)を用い、リガ ーゼ反応を行った。得られた反応産物を用い、常法 [モレキュラー 'クローユング第 3 版 1に従って Escherichia coH DH5 a (東洋紡社製)を形質転換した。
[0104] 該菌株を、 20 μ g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地 [バタトトリプトン (ディフコ社 製） 10g、酵母エキス (ディフコ社製) 5g、塩化ナトリウム 10g、パクトァガー (ディフコ社 製） 16gを水 1Lに含み、 pH7.0に調整された培地]上で培養し、形質転 ·を選択し た。該形質転換株を 20 g/mlのカナマイシンを含む LB培地で終夜培養し、得られた 培養液からアルカリ SDS法 (モレキュラー ·クロー-ング第 3版）によりプラスミドを調製 した。
[0105] 制限酵素切断解析を行 、、該プラスミドは、 pESB30に上記で得られた約 l .Okbの D NA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドを p CglnA2と命名した。
実施例 2
[0106] 遺伝子発現用プラスミド pGlnA2の造成
配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 64番目のグルタミン酸がリジン に置換 (Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAを、実 施例 1と同様の方法で取得した。
コリネバタテリゥム.グルタミクムの野生型株 ATCC13032の染色体 DNAにおいて、 グルタミンシンターゼ 2をコードする塩基配列の 5 '末端側の上流に位置する塩基配 列（配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端から 1〜20番目の塩基配列）に BamHI 認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断片、および 3 '末端側に位置する塩基配 列 (配列番号 3で表される塩基配列の 5 '末端力も第 1825〜1844番目の塩基配列） の相補配列に EamHI認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断片を合成し、その 塩基配列をそれぞれ配列番号 8、配列番号 9に示した。
[0107] 配列番号 8で表される塩基配列を有する DNA断片と配列番号 6で表される塩基配 列を有する DNA断片をプライマーとし、また配列番号 5で表される塩基配列を有す る DNA断片と配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーとして 、 ATCC13032株の染色体 DNAを铸型として、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバ ィォ社製）と添付のバッファーを用いて 2種類の PCRを各々行った。
[0108] 各々の PCRにより得られた、約 0.7kbの増幅産物（配列番号 3で表される塩基配列 の 5'末端力も第 1〜700番目の塩基配列に対応する DNA断片）、約 l.lkbの増幅産 物（配列番号 3で表される塩基配列の 5'末端力も第 680〜 1844番目の塩基配列に 対応する DNA断片）をァガロースゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit(BIO 101社製) を用いて抽出、精製した。
[0109] さらに、両精製物を铸型とし、配列番号 8で表される塩基配列を有する DNA断片と 配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーとして用いて PCRを 行った。この PCRにより、グルタミンシンターゼ 2の 5'末端側の上流に存在するプロ モーター配列と、配列番号 2において、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端 から第 64番目のグルタミン酸をコードするコドン (gaa)がリジンをコードするコドン (aaa) に置換された塩基配列を含む約 1.9kbの DNA断片を取得した。この約 1.9kbの DNA 断片を EamHl (タカラバイオ社製)で処理し、ァガロースゲル電気泳動した後、 GENE CLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。 pCS299P (国際公開第 00/63388 号パンフレット）を BamHI (タカラバイオ社製)で切断後、アルカリフォスファターゼ (タ カラバイオ社製）処理を行ない、ァガロースゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて pCS299P断片を抽出、精製した。
[0110] この pCS299P断片に上記で得られた EamHI処理した約 1.9kbの DNA断片を実施例 1と同様の方法でクローンィ匕した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、 PCS299Pに上記で得られた約 1.9kbの DNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミド を pGlnA2と命名した。
実施例 3
[0111] 遺伝子置換用プラスミド pCltsAの作製
配列番号 10で表されるリゾチーム感受性に関わるポリペプチドのアミノ酸配列の N 末端から第 80番目のグリシンがァスパラギン酸に置換 (Gly80Asp)されたアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする DNAを、実施例 1と同様の方法で取得した。同変 異の導入によりリゾチーム感受性が付与されることが報告されて 、る [BMC Biotechno 1. 9, 1 (2001)]。
[0112] コリネバタテリゥム 'グルタミクムの野生型株 ATCC13032の染色体 DNAにおける Lt sAをコードする DNAの周辺領域を示す、配列番号 12で表される塩基配列の 5'末 端から 1〜20番目の塩基配列に β ΐΗΙ認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断 片、および配列番号 12で表される塩基配列の 5'末端から 981〜1000番目の塩基 配列の相補配列に S lHI認識配列を含むタグ配列を付加した DNA断片を合成し、 その塩基配列をそれぞれ配列番号 13、配列番号 16に示した。配列番号 11で表され る LtsAをコードする領域中で、配列番号 10で現される LtsAの有するアミノ酸配列の N末端から第 80番目のグリシンをコードするコドン (配列番号 11で表される塩基配列 の 5'末端力も 238〜240番目の塩基配列、 ggt)を含む 21塩基力もなる領域 (配列番 号 11で表される塩基配列の 5'末端から 229〜249番目の塩基配列、および配列番 号 12で表される塩基配列の 5'末端力も 491〜511番目の塩基配列）において、該 グリシンをコードするコドンをァスパラギン酸をコードするコドン (gat)に置換した、配列 番号 15で表される塩基配列力もなる DNA断片、および該塩基配列の相補配列であ る配列番号 14で表される 21塩基の塩基配列を有する DNA断片を常法に従い合成 した。
[0113] 配列番号 13で表される塩基配列を有する DNA断片と配列番号 14で表される塩基 配列を有する DNA断片をプライマーとし、また配列番号 15で表される塩基配列を有 する DNA断片と配列番号 16で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーと して、 ATCC13032株の染色体 DNAを铸型として、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカ ラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて 2種類の PCRを各々行った。
[0114] 各々の PCRにより得られた、約 0.5kbの増幅産物（配列番号 12で表される塩基配列 の 5'末端から 1〜511番目の塩基配列に対応する DNA断片、および配列番号 12 で表される塩基配列の 5'末端から 491〜1000番目の塩基配列に対応する DNA断 片）をァガロースゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を铸型とし、配列番号 13で表される塩基配列を有する DNA断片 と配列番号 16で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーとして用いて PC Rを行った。この PCRにより、配列番号 10で表される LtsAが有するアミノ酸配列の N 末端から第 80番目のグリシンをコードする領域 (ggt)がァスパラギン酸をコードするコ ドン (gat)に置換された約 l.Okbの DNA断片を取得した。この約 l.Okbの DNA断片を S 里 HI (タカラバイオ社製)で処理し実施例 1と同様の方法で pESB30にクローンィ匕し、 このプラスミドを pCltsAと命名した。
実施例 4
[0115] 本発明の DNAを有する L グルタミン生産菌の造成
上記実施例 1で作製したプラスミド pCglnA2を用い、遺伝子置換法によってコリネバ クテリウム'ダルタミカム ATCC13032の染色体 DNAにおいてグルタミンシンテターゼ 2をコードする遺伝子に配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のグ ルタミン酸をリジンに置換する変異 (Glu64Lys)を導入した。
[0116] 遺伝子置換法による ATCC13032の染色体 DNAにおいてグルタミンシンテターゼ 2 をコードする遺伝子への変異の導入は、次に示すような 2回の組換え操作によって行 つた。まず、上記で作製したプラスミド pCglnA2がコリネ型細菌内では自律複製できな いことを利用して、以下の方法で、このプラスミドが相同組換えでコリネバタテリゥムグ ルタミクム ATCC13032の染色体 DNA中に組み込まれた株を選択した。
[0117] 具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法 [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 54 1 (1999)]に従って電気穿孔法にて ATCC13032株を形質転換し、カナマイシン耐性 株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの 1株力 得た染色体の構造をサ ザンノ、イブリダィゼーシヨン (モレキュラー 'クローユング第 3版）により調べた結果、プ ラスミドが Campbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確か められた。このような株では、野生型および変異型のグルタミンシンテターゼ 2遺伝子 が染色体上に近接して存在しており、その間で 2回目の相同組換えが起こりやすくな つている。
[0118] 該形質転換株（1回組換え体)を SUC寒天培地〔ショ糖 100g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩ィ匕ナトリウム 3g、酵母エキス (ディフコ社製) 5g、パクトァガー (ディフコ社製） 18 gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地〕上に塗布し、 30°Cで 1日間培養して、生育す るコロニーを選択した。 遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するの で、この培地では生育できない [J. BacterioL, 174, 5462 (1991)]。これに対し、染色体 上に近接して存在する野生型と変異型のグルタミンシンテターゼ 2遺伝子間での 2回 目の相同組み換えにより^遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地 で生育することができる。この 2回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしく は変異型遺伝子のいずれかが、 ^とともに欠失する。このとき野生型が ととも に欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
[0119] このようにして得られた 2回組換え体の染色体 DNAを、斎藤らの方法 [Biochim. Bio phys. Acta, 72, 619 (1963)]により調製し、該染色体 DNAを铸型とし、配列番号 4で 表される塩基配列を有する DNA断片と配列番号 7で表される塩基配列を有する DN A断片をプライマーとして、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付の ノ ッファーを用いて PCRを行った。これらの PCR産物の塩基配列を常法により決定 し、 2回組み換え体の染色体 DNA上のグルタミンシンテターゼ 2遺伝子が野生型で あるか変異型であるかを判定した。その結果、染色体 DNAにおいてグルタミンシンテ ターゼ 2をコードする遺伝子に、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64 番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異 (Glu64Lys)を有する 2回組換え体である GS2株を取得した。
[0120] GS2株にさらに、上記と同様の方法で pCltsAを用いて染色体 DNA上の LtsA遺伝 子に、配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のグリシンをァスパラ ギン酸に置換する変異 (Gly80Asp)を導入し、 GLA2株を取得した。宿主に GS2株を 用い、置換用のプラスミドに pCltsAを用いる以外は上記と同じ操作を行い、得られた 2回組換え体の染色体 DNAを、斎藤らの方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (19 63)]により調製し、該染色体 DNAを铸型とし、配列番号 13で表される塩基配列を有 する DNA断片と配列番号 16で表される塩基配列を有する DNA断片をプライマーと して、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて PC Rを行った。これらの PCR産物の塩基配列を常法により決定し、 2回組み換え体の染 色体 DNA上の LtsA遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。その結果 、染色体 DNAにおいて LtsAをコードする遺伝子に、配列番号 10で表されるアミノ酸 配列の N末端力も 80番目のグリシンをァスパラギン酸に置換する変異 (Gly80Asp)を 有する 2回組換え体である GLA2株を取得した。
[0121] また、実施例 2で作成した pGlnA2またはコントロールとして pCS299Pを ATCC13032 株に電気穿孔法にて形質転換し、 ATCC13032/pGlnA2株および ATCC13032/pCS2 99P株を取得した。
実施例 5
[0122] グルタミンシンターゼ 2変異株による L—グルタミン生産試験
取得した GS2株、 GLA2株、 ATCC13032/pGlnA2株、 ATCC13032/pCS299P株およ び親株である ATCC13032株を、 BYG寒天培地〔グルコース 10g、肉エキス 7g、ぺプト ン 10g、塩ィ匕ナトリウム 3g、酵母エキス (ディフコ社製) 5g、パクトァガー (ディフコ社製） 18gを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地〕を用い 30°Cで 24時間培養し、各菌株をそ れぞれ種培地〔グルコース 50g、ブイヨン 20g、硫酸アンモ-ゥム 5g、尿素 5g、リン酸二 水素カリウム 2g、硫酸マグネシウム 7水和物 0.5g、硫酸鉄 7水和物 lmg、硫酸銅 5水和 物 0.4mg、硫酸亜鉛 7水和物 0.9mg、塩化マンガン 4水和物 0.07mg、 4ホウ酸 2ナトリウ ム 10水和物 0.01mg、 7モリブデン酸 6アンモニゥム 4水和物 0.04mg、チアミン塩酸塩 0 .5mg、ピオチン O.lmgを水 1Lに含み pH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 10gカ卩えた培 地〕 6mlを含む試験管に植菌し、 30°Cで 12時間〜 16時間培養した。
[0123] 得られた種培養液を、それぞれ本培養培地〔グルコース 50g、尿素 2g、硫酸アンモ -ゥム 20g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム 7 水和物 0.5g、硫酸鉄 7水和物 2mg、硫酸マンガン 5水和物 2.5mg、チアミン塩酸塩 0.5 mg、ピオチン O.lmgまたは O.OOlmgを水 1Lに含み pH7.0に調整後、炭酸カルシウムを 2 Ogカ卩えた培地〕 30mlを含むバッフルつき 300ml三角フラスコに 10%植菌し、 30°C、 220r pm条件下で、糖を完全に消費しきらないように 16〜18時間培養した。
[0124] 培養終了後、遠心分離により培養物力 菌体を除去し、上清中の L—グルタミンお よび L—グルタミン酸の蓄積量をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（HPLC)により 定量した。また、培養終了時のそれぞれの菌体量を培養液の 660nmでの吸光度 (O D660)として測定した。結果を第 1表に示す。
[0125] [表 1] 菌株 ピオチン濃度 グルタミン グルタミン酸 0D660
(mg/1 ) (g/1 ) (g/1 )
ATCC13032 0. 1 0.0 0.0 45.2
GS2 0. 1 0.2 0.0 49. 2
ATCC13032/pCS299P 0. 1 0.0 0.0 44.3
ATCC13032/pGlnA2 0. 1 0.3 0.0 45.6
GLA2 0. 1 4.6 0.9 40. 2
ATCC 13032 0.001 0.7 2.5 38.9
GS2 0.001 2.3 0.0 38.9
ATCC13032/pCS299P 0.001 1. 1 3. 1 32.2
ATCC13032/pGlnA2 0.001 6.8 2.4 34.4
[0126] 第 1表から明らかなように、本発明の DNAを有する GS2株、 ATCC13032/pGlnA2株 の L—グルタミンの生産効率は、親株に比べ有意に向上していた。また、さらに LtsA 遺伝子に変異を導入することでピオチンを制限することなぐグルタミン生産効率が 向上した。
産業上の利用可能性
[0127] 本発明によれば、新規な L—グルタミンの製造法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
[0128] 配列番号 4一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 9一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 13—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 14一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 15—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 16—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列にお ヽ て、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチ ドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させ たときの L—グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とする ポリペプチド。
[2] グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列において、配列番号 1で表されるアミノ酸配 列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のァ ミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項 1に記載のポリペプチド。
[3] グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列において、配列番号 1で表されるアミノ酸配 列の N末端力 64番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のァ ミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたァミノ 酸配列を有する、請求項 1に記載のポリペプチド。
[4] グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項 2または 3に記載のポリ ペプチド。
[5] グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、請求項 2または 3に記載のポリペプチド。
[6] コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバタテリゥム属またはマイ コバクテリゥム属に属する微生物である、請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載のポリべ プチド。
[7] グルタミンシンテターゼ 2のアミノ酸配列が配列番号 1で表されるアミノ酸配列である、 請求項 1に記載のポリペプチド。
[8] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 64番目のアミノ酸がグルタミン酸以 外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項 7に記載のポリペプチド。
[9] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列にぉ 、て、 N末端から 64番目のグルタミン酸がグ ルタミン酸以外のアミノ酸に置換されており、さらに 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加されたアミノ酸配列を有する、請求項 7に記載のポリペプチド。
[10] グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項 8または 9に記載のポリ ペプチド。
[11] グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、請求項 8または 9に記載のポリペプチド。
[12] 請求項 1〜： L 1のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードする DNA。
[13] コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ 2をコードする DNAの塩 基配列において、配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜 192番目の 塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩 基配列を有する、請求項 12に記載の DNA。
[14] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンで ある、請求項 13に記載の DNA。
[15] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求 項 13に記載の DNA。
[16] コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバタテリゥム属またはマイ コバクテリゥム属に属する微生物である、請求項 13〜15のいずれか 1項に記載の D
[17] 配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜192番目の塩基配列がダルタミ ン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、請求項 12に記載の DNA0
[18] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンで ある、請求項 17に記載の DNA。
[19] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求 項 17に記載の DNA。
[20] 配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ント な条件でハイブリダィズし、かつ配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から 190〜 192番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコド ンである塩基配列を有する DNAであって、該 DNAを野生型のコリネ型細菌に導入 して得られる形質転換体の L グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多 いことを特徴とする DNA。
[21] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンで ある、請求項 20に記載の DNA。
[22] グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求 項 20に記載の DNA。
[23] 請求項 12〜22の!、ずれか 1項に記載の DNAを含む組換え体 DNA。
[24] 請求項 23記載の組換え体 DNAで形質転換された微生物。
[25] 染色体 DNA上に請求項 12〜22のいずれか 1項に記載の DNAを含有する微生物
[26] コリネ型細菌に属する微生物由来の LtsAのアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸 が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能力を 有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする、請求項 24または 25に記載の 微生物。
[27] ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列の N末端から 80番目のアミノ酸に 相応する位置のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを 特徴とする、請求項 26に記載の微生物。
[28] グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、請求項 27に記載の微生物。
[29] LtsAのアミノ酸配列が配列番号 10で表されるアミノ酸配列である、請求項 26に記載 の微生物。
[30] ポリペプチドが配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 N末端から 80番目の アミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求 項 29に記載の微生物。
[31] グリシン以外のアミノ酸がァスパラギン酸である、請求項 30に記載の微生物。
[32] 微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバタテリゥム属またはマイコバクテリゥム属に属 する微生物である、請求項 24〜31のいずれ力 1項に記載の微生物。
[33] コリネバタテリゥム属に属する微生物がコリネバタテリゥム 'ダルタミカムである、請求項
32に記載の微生物。
[34] 請求項 24〜33のいずれか 1項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に L グ ルタミンを生成蓄積させ、該培養物力も L—グルタミンを採取することを特徴とする、 L グルタミンの製造法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208038A (zh) * 2014-10-08 2017-09-26 Cj第制糖株式会社 用于产生l‑谷氨酰胺的微生物及使用其产生l‑谷氨酰胺的方法
WO2022163922A1 (ko) * 2021-01-26 2022-08-04 씨제이제일제당 (주) 신규한 아스파라긴 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2522737B1 (en) * 2010-01-08 2020-03-04 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd Process for production of l-amino acid
KR101947945B1 (ko) * 2018-01-25 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
CN113817627B (zh) * 2021-07-15 2023-04-28 大连医诺生物股份有限公司 一种嗜乙酰乙酸棒杆菌及以氨态氮浓度控制进行谷氨酰胺发酵的方法

Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55148094A (en) 1979-05-07 1980-11-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-glutamine by fermentation
JPS5718649A (en) 1980-07-10 1982-01-30 Chisso Corp 4-(trans-4'-alkylcyclohexylmethoxy)benzoic acid trans-4"- alkylcyclohexyl ester
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS57186492A (en) 1981-04-17 1982-11-16 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Transformation of bacterium
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS58105999A (ja) 1981-12-17 1983-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ベクタ−プラスミド
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
US5160735A (en) 1989-06-19 1992-11-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Plasminogen activator
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
WO2000014241A1 (fr) 1998-09-04 2000-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau gene
WO2000063388A1 (fr) 1999-04-19 2000-10-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouvelle aspartokinase desensibilisee
EP1108790A2 (en) 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel polynucleotides
JP2002300887A (ja) 2001-02-05 2002-10-15 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2230114C2 (ru) 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55148094A (en) 1979-05-07 1980-11-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-glutamine by fermentation
JPS5718649A (en) 1980-07-10 1982-01-30 Chisso Corp 4-(trans-4'-alkylcyclohexylmethoxy)benzoic acid trans-4"- alkylcyclohexyl ester
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS57186492A (en) 1981-04-17 1982-11-16 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Transformation of bacterium
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS58105999A (ja) 1981-12-17 1983-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ベクタ−プラスミド
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
US4686191A (en) 1981-12-25 1987-08-11 Hakko Kogyo Co., Ltd. Kyowa Recombinant plasmid containing human interferon-beta gene
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
US5160735A (en) 1989-06-19 1992-11-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Plasminogen activator
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
WO2000014241A1 (fr) 1998-09-04 2000-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau gene
WO2000063388A1 (fr) 1999-04-19 2000-10-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouvelle aspartokinase desensibilisee
EP1108790A2 (en) 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel polynucleotides
JP2002300887A (ja) 2001-02-05 2002-10-15 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌

Non-Patent Citations (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Amino San Hakko", 1986
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILLEY & SONS
"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach", 1995, OXFORD UNIVERSITY
"Molecular Cloning", vol. 10, 1982, article "Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research", pages: 6487
"Molecular Cloning", vol. 79, 1982, article "Current Protocols in Molecular Biology, Proc. Natl. Acad. Sci.", pages: 6409
"Molecular Cloning, 3rd edition, Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach", 1995, OXFORD UNIVERSITY
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 48, 1984, pages 669
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 53, 1989, pages 277
BERGEYS MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY, 1974, pages 1599
BMC BIOTECHNOL., vol. 1, 2001, pages 9
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 154, 1997, pages 81
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 173, 1999, pages 303
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 201, 2001, pages 91
GENE, vol. 11, 1982, pages 107
GENE, vol. 34, 1985, pages 315
GENE, vol. 34, 1985, pages 316
GENE, vol. 61, 1987, pages 63
GENES DEVELOP., vol. 4, 1990, pages 1288
J BACTERIOL., vol. 172, 1990, pages 2392
J BACTERIOL., vol. 174, 1992, pages 5462
J BACTERIOLOGY, vol. 153, 1983, pages 163
J BACTERIOLOGY, vol. 175, 1993, pages 4096
J MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403
J. BACTERIOL., vol. 174, 1992, pages 5462
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 182, 2000, pages 2696
LOW ET AL., PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 86, 1989, pages 8227
METHODS ENZYMOL, vol. 194, 1990, pages 182
METHODS IN ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
MOL. MICROBIOL., vol. 6, 1992, pages 1195
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
MOLECULAR AND GENERAL GENETICS, vol. 196, 1984, pages 175
NOLDEN L. ET AL.: "Glutamine synthetase of Corynebacterium glutamicum: transcriptional control and regulation of activity", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 201, 2001, pages 91 - 98, XP003015031 *
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 13, 1985, pages 4431
PAULSON ET AL., J BIOL. CHEM., vol. 264, 1989, pages 17619
PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929
PROC. NATL. ACAD. SCI, vol. 82, 1985, pages 488
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 6409
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 488
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 82, 1985, pages 4306
REST ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 52, 1999, pages 541
SAITO ET AL., BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 72, 1963, pages 619
See also references of EP1978094A4
TAKAHASHI H. ET AL.: "L-Glutamate production by lysozyme-sensitive Corynebacterium glutamicum ltsA mutant strains", BMC BIOTECHNOLOGY, vol. 1, 2001, pages 1 - 5, XP003015030, Retrieved from the Internet <URL:http://www.biomedcentral.com/1472-6750/1/9> *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208038A (zh) * 2014-10-08 2017-09-26 Cj第制糖株式会社 用于产生l‑谷氨酰胺的微生物及使用其产生l‑谷氨酰胺的方法
WO2022163922A1 (ko) * 2021-01-26 2022-08-04 씨제이제일제당 (주) 신규한 아스파라긴 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법

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