WO2007065933A1 - Magnetische polymerpartikel - Google Patents

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WO2007065933A1
WO2007065933A1 PCT/EP2006/069448 EP2006069448W WO2007065933A1 WO 2007065933 A1 WO2007065933 A1 WO 2007065933A1 EP 2006069448 W EP2006069448 W EP 2006069448W WO 2007065933 A1 WO2007065933 A1 WO 2007065933A1
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alkyl
group
magnetic
polymer particles
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PCT/EP2006/069448
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Roland Fabis
Sabine Jennrich
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Qiagen Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to magnetic polymer particles which have ferromagnetic, ferrimagnetic and / or superparamagnetic particles which are embedded in a crosslinked polyacrylate or poly [(alkylacrylate)] matrix, the functional groups of the general formula (I)
  • R is hydrogen or
  • Y is an alkylene group - (CH 2 ) I - and 1 is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • X is hydrogen, -OH, -O-Ci-C 6 alkyl, -OC 6 -Ci 2 aryl, -OC 7 -Ci 4 alkylene aryl with an alkylene chain consisting of 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms and a C 6 -Ci 2 aryl radical; -Ci-C 6 alkyl, -C 6 -Ci 2 aryl, heteroaryl, an imidazolyl radical optionally bonded via a -C 1 -C 6 alkylene group;
  • R 4 are hydrogen, OH, C 1 -C 6 alkyl, -OC r C 6 alkyl, C 6 -Ci 0 aryl or -0-C 6 -Ci 2 aryl ;
  • -NH 2 , -NHR 5 and R 5 are hydrogen, Ci-C 6 -alkyl and / or C 6 -C 12 -aryl;
  • Y ' is a single bond; an alkylene group - (CH 2 ) q - and q is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • w is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a three-, four- or five-tooth chelating agent, such as a nitrilotriacetic acid residue bound via its ⁇ -N, a so-called “low molecular weight”, “high molecular weight” or linear
  • Polyethyleneimine residue with a molecular weight of about 500 to 200,000 Da an amino residue, preferably a polyamine residue, spermidine, cadaverine, diethylenetriamine, spermine, 1,4-bis (3-aminopropyl) piperazine, 1 - (2-aminoethyl) piperazine,
  • R is hydrogen; or a group -YX in which Y is an alkylene group - (CH 2 ) I - and 1 is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • a and B are -NH-, a is an integer 1 or 2, and b 6;
  • X is hydrogen, -OH, -0-Ci-C 4 - alkyl, -0-C 6 -Ci 0 - aryl, -0-C 7 -Ci 4 - alkylaryl with an alkylene chain consisting of 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms and a C 6 -CiO aryl radical;
  • -NH 2 , -NHR 5 and R 5 are hydrogen, Ci-C 4 alkyl
  • R is a group -Y'X'L in which
  • Y ' is a single bond; an alkylene group - (CH 2 ) q - and q is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • R 1 , R 2 and R 3 have the meaning given above; -NH- or -N (C r C 3 alkyl) -;
  • w is an integer 1, 2, 3 or 4; a three-, four- or five-tooth chelating agent, such as a nitrilotriacetic acid residue bound via its ⁇ -N, a so-called “low molecular weight”, “high molecular weight” or linear polyethyleneimine residue with a molecular weight of preferably 500 to 200,000 Da, a polyamine residue , Spermidine, cadaverine, diethylene triamine, spermine, l, 4-bis (3-aminopropyl) piperazine, l- (2-aminoethyl) piperazine, l- (2-aminoethyl) piperidine, 1,4,10,13-tetraoxa- 7,16-diazacyclooctadecan, a carboxylic acid residue, or a bound antibody, preferably a secondary antibody, proteins, biotin, oligonucleotides or streptaviane, a poly(ethyleneimine), a so-called “
  • R is hydrogen; or a group YX in which Y is an alkylene group - (CH 2 ) I - and 1 is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • X is hydrogen, -OH, -O-Ci-C 4 alkyl, -0-C 6 -C 10 -ATyI,; a substituent of the general formula
  • R is a group Y'X'L in which
  • Y ' is a single bond; an alkylene group - (CH 2 ) q - and q is an integer 1, 2 or 3; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • Nitrilotriacetic acid residue bound via its ⁇ -N a so-called "low molecular weight", "high molecular weight” or linear polyethyleneimine residue with a molecular weight of preferably 500 to 200,000 Da
  • a polyamine residue spermidine, cadaverine, diethylene triamine, spermine, 1,4- Bis (3-aminopropyl) piperazine, 1- (2-aminoethyl) piperazine, 1- (2-aminoethyl) piperidine, 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane, a carboxylic acid residue, or a bound antibody , preferably a secondary antibody, proteins, biotin, oligonucleotides or streptavidin, IDA, DEO or DEO or TED (Tris-c arboxymethyl-ethylenediamine),
  • R is hydrogen or a group YX in which
  • Y is a single bond; an alkylene group - (CH 2 ) I - and 1 an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • X is hydrogen; a substituent of the general formula
  • R 1 , R 2 and R 3 are hydrogen; -NH 2 ; or
  • R is a group Y'X'L in which
  • Y ' is a single bond; an alkylene group - (CH 2 ) q - and q is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6; a hydroxy-substituted alkylene group of the type:
  • the present invention relates to a method for producing the magnetic polymers and a method for isolating and / or analyzing at least one biomolecule species from a sample.
  • Such magnetic particles generally comprise a magnetic or magnetizable, inorganic material which is integrated in a glass-like or polymeric matrix.
  • the surface of the magnetic particles is designed so that certain biomolecules from a sample, e.g. B. a cell lysate, can be selectively bound to this surface.
  • a sample e.g. B. a cell lysate
  • the magnetic particles with the attached biomolecules can easily be removed from the sample.
  • the biomolecules can then be eluted by appropriate treatment of the magnetic particles and thus obtained in pure form or in the enriched state.
  • Magnetic polymer particles based on polyvinyl alcohol are described in US patent application 2001/0014468 A1. These particles are produced by a process in which an aqueous polyvinyl alcohol solution which contains colloidally dispersed magnetic particles is suspended with an organic solution which contains at least two emulsifiers which are not miscible with the polymeric phase.
  • the organic solution additionally contains a water-soluble crosslinker through which the polyvinyl alcohol droplets are crosslinked while they are suspended.
  • the magnetic polymer particles obtained in this way can then be activated in accordance with their intended use or can be functionalized by means of polymeric side chains with suitable functional groups.
  • French patent application FR 2531452 A1 describes a magnetic carrier matrix which comprises a porous refractory metal oxide, inside of which ferromagnetic Particles are distributed.
  • the oxide is impregnated with a cross-linked polyamide with excess, bifunctional side groups. This matrix is used to immobilize enzymes.
  • U.S. Patent No. 4,795,698 describes magnetic polymer particles obtained by coprecipitating at least two species of transition metal ions in the presence of a polymer.
  • the polymer contains suitable coordination sites to bind the magnetic polymer precipitate.
  • the particles obtained in this way can be used for immunoassay techniques.
  • US Pat. No. 4,358,388 describes magnetic polymer particles which are produced by emulsion polymerization of a homogenized emulsion from a dispersion of magnetic particles in an organic, polymerizable phase and an aqueous phase which contains at least one emulsifier.
  • the organic phase comprises at least one aromatic vinyl compound or a mixture of at least one aromatic vinyl compound and a copolymerizable monomer, for example an alkyl acrylate or an alkyl methacrylate.
  • the ability to selectively bind one or more species of biomolecules to the surface of the magnetic polymer particles is largely determined by the type of polymer used and the functional groups present on this polymer.
  • the requirements placed on the selectivity of the immobilization reaction depend on the intended further use of the immobilized biomolecule. It is often sufficient that the immobilization merely achieves an enrichment of the desired biomolecule species; in other applications a higher selectivity is required or at least desirable in order to obtain the desired biomolecule species in the purest possible state directly or with a small number of further purification steps.
  • the magnetic polymer particles should have the highest possible binding capacity in relation to the biomolecule species to be immobilized in order to be able to design the use of the magnetic polymer particles effectively and inexpensively.
  • Another problem is to incorporate the magnetic particles into a suitable polymer matrix.
  • the segregation of the magnetic particles and the organic phase, the aggregation of the magnetic particles before or during the polymerization and the achievement of sufficient adhesion between the polymer matrix and the magnetic particles frequently pose problems.
  • magnetic polymer particles which are able to immobilize biomolecules with a sufficiently high selectivity.
  • magnetic polymer particles which can be functionalized in a variety of ways and which can be easily modified, preferably by conventional chemical processes, with ligands which can selectively immobilize biomolecules from a sample.
  • the modified polymer particles should have the highest possible binding capacity and at the same time the highest possible magnetizability in relation to the respective biomolecules.
  • the present invention therefore has the task of eliminating or at least reducing the disadvantages of the prior art discussed above.
  • the present invention relates to magnetic polymer particles, the magnetic particles selected from the group of ferromagnetic, ferrimagnetic and / or superparamagnetic particles.
  • the magnetic particles are embedded in a crosslinked polyacrylate or poly [alkyl acrylate] matrix.
  • the magnetic Polymer particles have an average particle size preferably in a range from 5 to 25 ⁇ m, particularly preferably in a range from 6 to 20 ⁇ m, very particularly preferably in a range from 10 to 15 ⁇ m, and pores with a maximum pore radius, preferably in an interval from 20 to 500 nm, particularly preferably in an interval of 30 to 400 nm and very particularly preferably in an interval of 80 to 250 nm.
  • polyacrylate or poly [(alkyl) acrylate] matrix with its functionalizable carboxyl groups or substituted and functionalizable carboxyl groups makes it possible to produce relatively large polymer particles which ensure sufficient magnetizability and, at the same time, further functionalization in a simple manner with a variety of ligands suitable for immobilizing biomolecules.
  • the polymer matrix initially has unesterified carboxy groups if free acrylic acid or an (alkyl) acrylic acid, such as methacrylic acid, has been used as the monomer to be polymerized. If the polymer matrix is to contain other functionalizable groups, correspondingly derivatized acrylic or (alkyl) acrylic acid esters - in particular methacrylic esters - can be used as monomers, the ester residue being convertible into a reactive group at least in a further step, which may be via further functionalization , in particular the covalent binding of ligands or spacer groups immobilizing in particular biomolecules to which the ligands are ultimately bound.
  • the polymer matrix of the magnetic polymer particles can have functional groups with the general structure -Y-X, where Y is a spacer and X is preferably a reactive group.
  • any group which allows a chemical reaction to bind a desired ligand to the spacer can be used as the reactive group X of the functional groups.
  • reactive groups X can be used which enable substitution reactions on the spacer, by means of which the ligand is covalently bound to the spacer.
  • the reactive groups X of the functional groups are preferably selected from the group consisting of hydrogen, hydroxy, epoxy, aryl, heteroaryl, aralkyl, imidazolyl - optionally bonded via a C 1 to C 6 alkylene bridge, C (O) H, C ( O) R, -C (O) OH, C (O) R, -NH 2 , -NHR-, azido, cyano, isocyano, -SH, -SSH, thiopyridinyl- (2- and 4-thiopyridyl, respectively ), Aryl, halogen (HaI), tresyl (2,2,2-triflourethanesulfonyl), acyl-imidazolyl and maleimidolyl or azlactyl groups.
  • epoxy groups the oxiran-2-yl group is preferred, but substituted epoxy groups can also be used in accordance with the formula shown below:
  • radicals R 1, R 2, and R 3 be selected independently from the group consisting of hydrogen, Ci-C 6 - alkyl, C 6 -C 2 - aryl - preferably Ci-C 3 -alkyl
  • C 1 -C 6 -alkyl groups are understood in particular to mean the following groups: C 1 : methyl; C 2 : ethyl; C 3 : propyl, isopropyl, C 4 : butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, C 5 : n-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl , 1,2-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, C 6 : hexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl
  • alkyl groups can optionally be substituted with one or more substituents, such as nitro group (s), amino group (s) and or one or more halogen atoms, which can be the same or different.
  • substituents such as nitro group (s), amino group (s) and or one or more halogen atoms, which can be the same or different.
  • Cycloazaalkyl groups in the context of the present invention are understood to mean 5 to 16-membered saturated ring systems with 1 to 15 - preferably 1 to 12 carbon atoms and 1 to 15 - preferably 1 to 6, particularly preferably 3 and 4 - nitrogen atoms which may optionally be substituted by one or more substituents selected from the group: lower alkyl radicals having one to six carbon atoms (Ci-C ⁇ alkyl groups), alkoxy groups with one to six carbon atoms (C 1 -C 6 alkoxy groups), nitro groups, amino groups, in turn possibly bonded to the cyclic partial structure via an alkylene group with one, two or three carbon atoms may be, and / or one or more halogen atom (s), which may be the same or different.
  • substituents selected from the group: lower alkyl radicals having one to six carbon atoms (Ci-C ⁇ alkyl groups), alkoxy groups with one to six carbon atoms (C 1 -C 6 alk
  • cycloazaalkyl systems can also have 1, 2, 3 or 4 oxygen atoms as ring members, as is the case with morpholine, for example.
  • An aryl radical having six to twelve carbon atoms (C 6 -Ci 2 aryl) is understood to mean aromatic substituents which can optionally be substituted by one or more substituents which are selected from the group: lower alkyl radicals having one to six carbon atoms (Ci-C ⁇ alkyl groups), alkoxy groups with one to six carbon atoms (Ci-C ⁇ alkoxy groups), nitro groups, amino groups and / or one or more halogen atoms, which may be the same or different.
  • Preferred aryl radicals are embodied, for example, by phenyl, or fused aromatic systems such as naphthyl, or fluorenyl or else systems such as biphenyl. The same applies to smaller aryl residues (e.g. C 6 -CiO aryl)
  • a herteroaryl radical is primarily understood to mean five or six-membered ring systems which have at least one heteroatom. Examples are embodied by pyrrolyl and furanyl or isothiazolyl on the one hand and by pyridyl, pyrazinyl or triazinyl on the other hand.
  • An aralkyl radical with 7 to 14 carbon atoms is understood to mean an aryl radical which is bonded via an alkylene bridge.
  • the aromatic partial structure and the aromatic partial structure can optionally be selected from the group: lower alkyl radicals with one to six carbon atoms (Ci-C ⁇ -alkyl groups), alkoxy groups with one to six carbon atoms (Ci-C ö - Alkoxy groups), nitro groups, amino groups and or one or more halogen atoms, which may be the same or different.
  • Aralkyl radicals having six to ten carbon atoms in the aryl radical and one to three carbon atoms in the aliphatic partial structure - are preferred according to the invention; the benzyl radical is particularly preferred.
  • Suitable reactive halogen substituents are F, Cl, Br and I, in particular Cl and Br.
  • Suitable spacers Y can be selected on the basis of synthetic considerations for providing corresponding polymerizable monomers or their commercial accessibility, or the spacer groups are selected with a view to a subsequent functionalization with an immobilizing ligand.
  • “spacer” or “spacer group” is understood to mean all chemical groups which can be bound to the carboxy groups of the polymer matrix and thus the reactive group which is bound to the spacer and which can react with the ligand to form a bond bring a distance to the polymer backbone of the matrix. By using these “spacers”, the accessibility of the reactive groups to the ligand can be improved.
  • the spacer Y of the functional group is selected from the group consisting of:
  • n [CH 2 - CH (OH) I 1n - and / or - [CH (0H) -CH 2 ] n - where m and n can independently mean an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6;
  • alkylidene glycols such as, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol;
  • a -CH 2 - spacer group (Y) in connection with epoxy-functionalized (X) polymer matrices is particularly advantageous since the carboxy group of acrylic acid can be reacted with epichlorohydrin or epibromohydrin in a particularly simple manner.
  • the use of the spacers mentioned above under point 7) is advantageous if the carboxy group of the acrylic acid monomer is esterified in a first step with epichlorohydrin or epibromohydrin and then a reactive group X or a group which contains a reactive group X via the epoxy group , is introduced.
  • the present invention relates to magnetic polymer particles which comprise ferromagnetic, ferrimagnetic or superparamagnetic particles which are embedded in a crosslinked polyacrylate or poly (alkyl) acrylate matrix.
  • the magnetic polymer particles according to this aspect can be easily obtained by functionalizing the magnetic polymer particles according to the first aspect of the present invention described above. Accordingly, the statements made above with reference to the magnetic polymer particles according to the first aspect also apply analogously to the magnetic polymer particles according to the second aspect of the invention. Accordingly, there are differences in the magnetic polymer particles with regard to the additional functionalization with the corresponding ligands described in the second aspect - in the general formula the structural feature -Y '-X' -L for R is represented.
  • imino groups -NH-
  • oxo groups -O-) or thio groups (-S-)
  • the covalent bond takes place via esterification, amide formation or other derivatization of the carboxy group known from the prior art.
  • spacers -Y with reactive groups -X, to which the ligands can be covalently bound broadens the spectrum of the possible types of binding compared to the direct binding to the carboxy groups and can improve the accessibility of the reactive group for the ligand - for example by the Switch off steric effects.
  • the ligands that can immobilize biomolecules are bound directly to the carboxy groups of the polymer matrix.
  • they are bound indirectly to the carboxy groups of the polymer matrix via spacers, the spacers having at least one of the reactive groups described above.
  • n can independently mean an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6;
  • alkylidene glycols - such as polyethylene glycol, polypropylene glycol
  • BASED bis- [b- (4-azidosalicylamido) ethyl] disulfide
  • spacers can either be bonded directly to the carboxy groups of the matrix or can also be bonded to the carboxy groups via further spacers, in particular those described in connection with the first aspect of the invention, by means of the reactive groups bonded to these spacers.
  • the ligands which can preferably immobilize biomolecules, can in particular be those ligands that can immobilize proteins, nucleic acids, oligonucleotides or primary or secondary antibodies.
  • three-, four- or five-toothed chelating agents preferably nitrilotriacetic acid residues, can be used as ligands.
  • Polyethyleneimine residues can also be used. These can be branched or unbranched.
  • residues containing amino groups for example alkylamino groups of the type - (C ⁇ ) n -NR 10 R 20 , where n is an integer in addition to 0, preferably 1, 2, 3, 4, 5 or 6, in particular 2, 3 , 4, 5 or 6, and R 10 and R 20 are independently selected from the group consisting of -H and Ci-C ⁇ alkyl, in particular Ci-C 3 alkyl, amine and / or polyamine radicals are used.
  • carboxylic acid residues, proteins, biotin, oligonucleotides, streptavidin or bound antibodies can be used.
  • the polyamines are preferably selected from the group consisting of open-chain and cyclic polyamines with 2, 3, 4, 5 or 6 amino groups.
  • the polyamines can preferably be selected from the group consisting of ethylene diamine, trimethylene diamine, tetramethylene diamine, spermidine, cadaverine, Diethylene triamine, spermine, triethylene tetramine, tetraethylene pentamine, pentaethylene hexamine, 1,4-bis (3-aminopropyl) piperazine, 1- (2-aminoethyl) piperazine, 1- (2-aminoethyl) piperidine, 1,4,10,13-tetraoxa -7,16-diazacyclooctadecane and tris (2-aminoethyl) amine and the like.
  • ferromagnetic or ferrimagnetic particles are preferably used, preferably selected from the group consisting of: 7-Fe 2 O 3 (maghemite), Cr 2 O 3 and ferrites, in particular of the type (M 2+ O) Fe 2 O 3 , the M 2+ being a divalent transition metal cation, and preferably being Fe 3 O 4 (magnetite).
  • other ferromagnetic or ferrimagnetic particles can also be used. These particles have an average particle diameter of less than 5 ⁇ m, preferably less than 1 ⁇ m, particularly preferably in a range between 0.05 and 0.8 ⁇ m, very particularly preferably in a range between 0.1 and 0.4 ⁇ m.
  • ferromagnetic or ferrimagnetic particles examples include ferromagnetic particles based on 7-Fe 2 O 3 such as Bayoxide E AB 21 (Lanxess AG, Leverkusen, Germany), ferrimagnetic magnetite available from Lanxess AG, Leverkusen, Germany, as Type Bayoxide E 8706, E 8707, E 8710 and E 8713H and from BASF AG, Ludwigshafen, Germany, as magnetic pigment 340 and magnetic pigment 345.
  • Bayoxide E AB 21 Lixess AG, Leverkusen, Germany
  • ferrimagnetic magnetite available from Lanxess AG, Leverkusen, Germany
  • Type Bayoxide E 8706, E 8707, E 8710 and E 8713H examples include BASF AG, Ludwigshafen, Germany
  • Superparamagnetic particles can also be used.
  • the superparamagnetic materials are Fe, Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , superparamagnetic ferrites,
  • di- or polyacrylates or di- or poly (alkyl) acrylates are preferably used to crosslink the polymer matrix.
  • These are preferably selected from the group consisting of ethylene glycol acrylate, ethylene glycol (alkyl) acrylates, in particular ethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol acrylates, polyethylene glycol (alkyl) acrylates, especially polyethylene glycol methacrylates, pentaerythritol tetraacrylate and pentaerythritol triacrylate, glycerol triacrylate or glyceryl tryl acrylate, glycerol tryl acrylate, glycerol tryl acrylate, glycerol tryl acrylate, its organically modified derivatives, such as 2-hydroxy-l, 4-divinylbenzene.
  • These crosslinkers have been found to be particularly suitable with regard to the acrylate or (alkyl) acrylates
  • the present invention relates to a method for producing magnetic polymer particles.
  • This method comprises the steps: a) production of a dispersion of magnetic particles in a first organic phase, wherein
  • the magnetic particles are selected from the group consisting of ferromagnetic, ferrimagnetic or superparamagnetic particles, and wherein
  • one - or more - acrylate monomer (s) selected from the group consisting of acrylic acid, (alkyl) acrylic acids or acrylates and
  • b2) comprises at least one surface-active substance
  • the magnetic polymer particles thus obtained having an average particle size preferably in the range from 5 to 25 ⁇ m, particularly preferably in the range from 6 to 20 ⁇ m, very particularly preferably in the range from 10 to 15 ⁇ m and pores with a maximum Pore radius preferably in the range from 20 to 500 nm, particularly preferably in a range from 30 to 400 nm, very particularly preferably in the range from 80 to 250 nm.
  • Magnetic polymer particles as already described above, can be obtained by this method.
  • the emulsion is preferably flushed with an inert gas before the radical polymerization in order to drive off any oxygen present in the mixture. Accordingly, the subsequent polymerization is preferably carried out under a protective gas atmosphere. Nitrogen or argon is particularly suitable as the protective gas or inert gas, nitrogen being preferred because of the lower costs. However, other protective gases, especially other noble gases such as helium or krypton, can also be used.
  • the magnetic particles are preferably ground and / or deagglomerated before or during the preparation of the dispersion. This avoids agglomeration of the primary magnetic particles and facilitates and improves dispersion and subsequent homogenization of the emulsion.
  • ultrasound techniques, stirring processes and / or grinding processes for example in a ball mill, can be used.
  • the radical polymerization is preferably carried out at a temperature of 50 ° C. or higher, preferably at a temperature between 50 ° C. and 120 ° C., preferably between 60 ° C. and 90 ° C.
  • R is H or a Ci-C 3 alkyl
  • Z is hydrogen (-H) or a group of the general formula -YX
  • the spacer can be, for example, a - (CH 2 X group - in which 1 is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6 - or a -CH 2 -CH (OH) -CH 2 - group.
  • those groups which were mentioned in connection with the magnetic polymer particles in accordance with the previously described aspects, in particular the first aspect of the invention are also suitable here.
  • the monomer in the first organic phase is selected from the group consisting of glycidyl methacrylate, (2-hydroxyethyl) methacrylate, methacrylic acid and acrylic acid, and acrylic acid derivatives of the general formula (III):
  • alkylidene glycol diacrylates or alkylidene glycol (alkyl) acrylates of the general formula (III) can be used as crosslinking agents in the process according to the invention:
  • Propylene glycol (alkyl) acrylates especially propylene glycol methacrylates
  • Polypropylene glycol acrylates polypropylene glycol (alkyl) acrylates, in particular
  • Polypropylene glycol methacrylates or a mixture thereof can be used as crosslinkers.
  • polyacrylates or poly (alkyl) acrylates with at least two, preferably with three or four, acrylate or (alkyl) acrylate groups can be used, the alkyl group preferably being selected from the group of the C 1 -C 3 -alkyl groups, and particularly is preferably methyl.
  • pentaerythritol tetraacrylate pentaerythritol tetramethacrylate
  • pentaerythritol triacrylate pentaerythritol trimethacrylate
  • glycerol triacrylate pentaerythritol trimethacrylate
  • glycerol propylate triacrylate pentaerythritol tetramethacrylate
  • pentaerythritol triacrylate pentaerythritol trimethacrylate
  • glycerol triacrylate pentaerythritol trimethacrylate
  • glycerol triacrylate glycerol trimethacrylate
  • glycerol propylate triacrylate glycerol propylate triacrylate
  • Glycerol propylate trimethacrylate or divinlybenzene and its organically modified derivatives such as e.g. 2-hydroxy-l, 4-divinylbenzene or mixtures thereof or mixtures of these compounds with other crosslinkers described above can be used.
  • compounds which are selected from the group consisting of a) aliphatic, branched or unbranched alcohols having 4 to 20 C atoms, preferably 4 to 16 C atoms and particularly preferably 4 to 8 C can be used as organic pore formers Atoms with one or more hydroxyl groups, preferably 1-3 hydroxyl groups,
  • alkylidene glycols especially ethylene glycol, glycerin, etc.
  • carbohydrates such as glucose
  • polymeric compounds whose weight average molecular weight M w is between 200 and 100000 g / mol and which are selected from the group consisting of polyalkylidene glycol derivatives, polyethyleneimine, polyvinylpyrolidone and polystyrene, or mixtures of the compounds mentioned under a), b) and c).
  • pore formers can be used which are selected from the group consisting of ethylene glycol, polyethylene glycol (Mw: 200-20000 g / mol), polypropylene glycol (Mw: 200-10000 g / mol), polyethylene glycol monoalkyl ether (Mw: 200-5000 g / mol), polyethylene glycol dialkyl ether (Mw: 200- 5000 g / mol), polyethylene glycol monoalkyl ester (Mw: 200-20000 g / mol), polyethylene glycol dialkyl ester (Mw : 200-5000 g / mol), polyethylene glycol diacid (Mw: 1000-20000 g / mol), polyethyleneimine (Mw: 200-100000 g / mol), polyvinylpyrrolidone (Mw: 10000-40000 g / mol) and / or polystyrene (Mw : 200-5000 g / mol).
  • ethylene glycol and polyethylene glycol can be used as pore formers in the present invention.
  • amino-functionalized polyethylene glycols are suitable, which are well known in the art as so-called Jeff amines.
  • Azoisobutyronitrile (AIBN), 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), and 1,1'-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile) can be used in particular as lipophilic radical initiators ) be used.
  • lipophilic radical initiators such as dibenzoyl peroxide can also be used, provided that they are sufficiently lipophilic to be incorporated into the dispersion.
  • the hydrophobic liquid used to prepare the emulsion should be chemically inert to the extent that it does not adversely affect the radical polymerization.
  • the liquid should preferably be essentially immiscible with the first organic phase, so that an emulsion of the dispersion in the first organic phase can be produced in the second organic phase. It is crucial in the selection of the systems that the polymer becomes insoluble in the system during the polymerization.
  • the hydrophobic liquid can optionally be selected from the group consisting of aliphatic or cyclic alkanes, in particular aliphatic alkanes of the general formula C 2 H 2n + 2 , where n is> 6, aliphatic and cyclic alkenes, in particular aliphatic alkenes of the general formula C 2 H 2n , where n> 6, aromatic compounds, in particular monocyclic, bicyclic or tricyclic compounds, which can be substituted by alkyl or alkene groups, in particular toluene, xylene, mineral oils, silicone oils, vegetable oils or paraffin oils, substances based on compounds from fatty acids and alcohols are based as well as mixtures of the aforementioned substances, in particular mixtures of aliphatic alkanes and aromatics.
  • the surface-active substance in the second organic phase is preferably an emulsifier selected from the group consisting of cationic, anionic and nonionic emulsifiers.
  • emulsifiers selected from the group consisting of cationic, anionic and nonionic emulsifiers.
  • sorbitan esters, ethoxylated sorbitan esters, polyoxyethylene alkylphenol ethers and other commercially available surface-active compounds or compound mixtures can be used as surface-active substances.
  • suitable surface-active substances are commercially available substances such as Tween ® (sorbitan monolaurate polyoxyethylene (20)) 20, Triton ® X 100 (?
  • Span 85 (sorbitan trioleate) (all available from Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany), Hypermer 2296 (available from Uniqema, Gouda, Holland) and similar substances.
  • Quantity ratios (percentages by weight,% by weight) added together (based on those of the reaction mixture:
  • the crosslinker is preferably introduced in a ratio of 0.1-20% by weight, preferably in a range of 0.5 to 5% by weight, particularly preferably 1-4% by weight.
  • the functionalized monomer is used in a ratio of 0.1-20% by weight, preferably 0.5
  • the magnetic material or the magnetite is introduced in a ratio of 0.1-20% by weight, preferably 0.5-5% by weight, particularly preferably 1-4% by weight.
  • the initiator or radical initiator is used in a ratio of 0-5% by weight, preferably 0.01
  • the detergent is initially introduced in a ratio of 0-20% by weight, preferably 0.1-10% by weight, particularly preferably 0.1-3% by weight.
  • the porogen is initially introduced in a ratio of 0.1-20% by weight, preferably 0.5-5% by weight, particularly preferably 1-4% by weight.
  • the resulting polymers which are suitable for the application according to the invention, advantageously have the following composition:
  • the cross-linker content is between 1-95% by weight, preferably between 10-80% by weight, particularly preferably between 20-70% by weight and very particularly preferably between 15-40% by weight. %.
  • the polymer formed from the functionalized monomer (s) according to the invention is in the magnetic particles in a proportion between 1-99% by weight, preferably between 10-80% by weight, particularly preferably between 20-70 % By weight and very particularly preferably between 30-60% by weight.
  • the magnetite or magnetic material content is between 1-95% by weight, preferably between 10-80% by weight, particularly preferably between 20-70% by weight and very particularly preferably between 30-60% by weight.
  • a further step d) is a functionalization of the magnetic polymer particles obtained by the method, in which at least one ligand which can immobilize biomolecules is bound to the polymer matrix.
  • the magnetic particles are preferably isolated and washed after the polymerization before they are further reacted, for example functionalized.
  • the particles can be isolated by simple filtration and then cleaned by washing with a solvent. Both organic and inorganic solvents such as toluene, acetone or water are suitable as solvents for washing.
  • the ligand is bound directly to the reactive groups of the functional groups of the magnetic polymer particle.
  • a spacer compound with at least two reactive groups to the functional groups of the magnetic Polymer particles are bound and then in a second step d2) the ligand, which can preferably immobilize biomolecules, are covalently bound to the magnetic polymer particles.
  • Suitable ligands and spacers are the groups described above in connection with the magnetic particles according to the invention. These can be bound to the polymer particles by appropriate compounds comprising at least two reactive groups.
  • the present invention relates to a method for isolating and / or analyzing at least one species of a biomolecule from a sample, the method comprising the steps of: a) providing a sample containing at least one biomolecule species,
  • the further step d) includes the elution of the at least one biomolecule species from the magnetic polymer particles.
  • the magnetic polymer particles produced according to the method according to the invention can thus be used for the immobilization or binding, preferably of biomolecules.
  • the biomolecule species that is bound to the magnetic particles can be selected from the group consisting of nucleic acids, oligonucleotide proteins, polypeptides, peptides, carbohydrates, lipids, and combinations thereof.
  • nucleic acids and oligonucleotides preferably plasmid DNA, genomic DNA, cDNA, PCR-DNA, linear DNA, RNA, ribozymes, aptamers, and chemically synthesized or modified nucleic acid or oligonucleotides be bound to the magnetic particles.
  • “Bound” here generally means that the biomolecule forms such a strong interaction with the magnetic polymer particles that together they can be removed from a sample under the influence of a magnetic field. These interactions can be of various types. For example, the Interactions are based on the formation of covalent bonds and / or hydrogen bonds and / or van der Waals forces.
  • the magnetic polymer particles which have been functionalized with a chelating agent as ligands, such as Ni-NTA, can be used in particular for protein purification.
  • the magnetic polymer particles which have been modified with amino group-containing ligands such as polyethyleneimine or with carboxylic acid-containing ligands can be used in particular for the isolation and purification of nucleic acids. If secondary antibodies are bound as ligands to the magnetic polymer particles, these can be used for the isolation and purification of primary antibodies.
  • the sample in which the at least one biomolecule species is contained can be relatively complex samples such as blood, tissue, cells, plant materials and the like.
  • Other samples are solutions that are obtained in the course of a purification, amplification or analysis process, for example PCR solutions.
  • magnétique particles according to the invention can be used are nucleic acid detection by means of hybridization, the binding of antibodies or organic macromolecules and the binding and detection of biomolecules or cells.
  • the magnetic particles can be used to bind, detect and purify biomolecules or cells.
  • Example 1 Synthesis of porous, hydroxy-functionalized, magnetic polymer particles
  • the particles obtained in this way are hydroxy-functionalized, macroporous and have a particle diameter of 10 to 15 m.
  • a first step 8 ml of SPAN 60 (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 31.822-1) are dissolved in 400 ml of paraffin oil (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 33.076-0). Then 5 ml of ethylene glycol dimethacrylate and 5 ml of glycidyl methacrylate (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 15-123-8), which are essentially free of inhibitors, are pipetted into a Falcon tube, and 10 ml of polyethylene glycol (MW 4600) ( Sigma-Aldrich, Aldrich Cat.No.
  • the particles obtained in this way are epoxy-functionalized, macroporous and have a particle diameter of 10 to 15 m.
  • a first step 8 ml of SPAN 60 are dissolved in 400 ml of paraffin oil (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 33.076-0). Then 3 ml of ethylene glycol dimethacrylate and 7 ml of methacrylic acid (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 39,537-4), which are essentially free of inhibitors, are pipetted into a Falcon tube and 10 ml of polyethylene glycol, MW 2000 (Sigma-Aldrich, Cat. No. 29,590-6), 0.3 g of azo-bis-2-methylpropionitrile and 7.5 g of Bayer Bayoxid E 8713 H are added.
  • This mixture is homogenized in a Polytron homogenizer at the highest level for one minute.
  • Half of the paraffin oil solution is placed in a 500 ml Nalgene bottle. Then the magnetite suspension is added and the mixture is homogenized for 120 seconds with ice cooling.
  • the other half of the paraffin oil solution is then placed under protective gas in a 1000 ml three-necked flask with a reflux condenser and KPG stirrer. It starts with a stirring speed of 500 rpm, which is increased to 600 rpm.
  • the proprietary oxide suspension is added.
  • the reaction mixture is then freed of oxygen by flushing the flask with an inert gas.
  • the reaction temperature is increased for an hour to 7O 0 C and then held overnight at 8O 0 C.
  • the particles obtained in this way are carboxy-functionalized, macroporous and have a particle diameter of 10 to 15 m.
  • the residue is then transferred to a 250 ml round-bottom flask, suspended in 100 ml of a 0.5 M solution of -N, N'-bis (carboxymethyl) lysine (synthesis according to Doebeli et al., EP 0 253 303) and overnight heated on a rotavapor.
  • the mixture is then filtered by suction and washed four times with deionized water.
  • the magnetic particles are then suspended in 50 ml of a 2% nickel sulfate solution and stirred for a further three hours. The particles are then washed three times with water with magnetic separation, resuspended and stored in 50 ml of a 100 mM acetate buffer, pH 6.0, with 20% ethanol.
  • Example 5 Chemical modification of porous, magnetic polymer particles with nitrilotriacetic acid
  • Example 6 Chemical modification of porous, magnetic polymer particles with polyethyleneimine 4 g of the polymer particles from Example 3 are suspended in 50 ml of a 10% high molecular weight polyethyleneimine solution (Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No. 40.872- 7) in water, pH 10 and transferred to a round bottom flask. Then 200 mg of N-hydroxy-sulfosuccinimide sodium salt (Sigma-Aldrich, Fluka cat. No. 56485) and 200 mg of N-3-dimethylamino-N'-propyl-carbodiimide hydrochloride (Sigma-Aldrich, Fluka cat. No. 03449) and stirred for three hours at room temperature on a Rotavapor. Then the mixture is washed six times with deionized water with magnetic separation and is finally suspended in 50 ml of deionized water.
  • a 10% high molecular weight polyethyleneimine solution Sigma-Aldrich, Aldrich Cat. No.
  • Example 8 Chemical modification of porous, magnetic polymer particles with amines
  • Example 9 Chemical modification of porous, magnetic polymer particles with amines
  • Example 10 Chemical synthesis of porous, carboxy-functionalized, magnetic polymer particles
  • the polymer suspension is washed three times with demineralized water with magnetic separation.
  • the beads are suspended in 4 ml of phosphate buffered saline and then 1 ml of a 10 mg / ml solution of sulfo-SMCC (available from Pierce, Rockford, IL, USA) in phosphate buffered saline is added.
  • the suspension is vortexed directly and then allowed to react on an end-over-end shaker for two hours.
  • the reaction product is separated from the supernatant by magnetic separation and washed twice with 100 mM phosphate buffer, pH 7.0.
  • 1 ml of an antibody solution (1 mg / mg Goat-Anti-Mouse IgG; Sigma-Aldrich, Sigma Cat.
  • Example 12 Binding of secondary antibodies to porous, magnetic polymer particles
  • the beads are then suspended in 4 ml of phosphate-buffered saline and 1 ml of a 10 mg / ml solution of sulfo-SMCC in phosphate-buffered saline is added.
  • the suspension is vortexed directly and is then allowed to react on an end-over-end shaker for two hours.
  • the reaction product is separated from the supernatant by magnetic separation and washed twice with 100 mM phosphate buffer, pH 7.0.
  • 1 ml of an antibody solution (1 mg / mg, sec. Goat-Anti-Mouse) and 1 ml of buffered saline solution are added and the mixture is allowed to react on an end-over-end shaker for two hours.
  • the supernatant is then removed from the product by magnetic deposition.
  • the magnetic particles are washed three times with phosphate-buffered saline and can be stored at -2O 0 C.
  • Example 13 Protein purification with Ni-NTA modified, porous, magnetic polymer particles (denaturing conditions)
  • 5 ml cell culture pellets (plasmid pQE 16 in E Coli, transformation and production of recombinant proteins are described in "The Qiaexpressionist", 3rd edition, QIAGEN GmbH, Hilden, 1997) are dissolved in 1 ml lysis buffer (6M guanidine HCl, 0.1 M NaH 2 PO 4 , 0.01 M Tris x HCl, 0.05% Tween® 20, pH 8.0) by pipetting up and down and shaking the tube for one hour at room temperature, then the lysate is centrifuged at 10,000 g clarified for 30 minutes and the supernatant transferred to another tube, 5 mg of the porous, magnetic polymer beads from example 4 or 5 are added to a second tube and 500 l of the clarified lysate solution are added End-over-end shakers at Incubated at room temperature.
  • 1 ml lysis buffer 6M guanidine HCl, 0.1 M NaH 2 PO 4 , 0.01 M Tris x HCl
  • wash buffer (8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris x HCl, 0.05% Tween® 20, pH 6.3) are added, the tube for one minute placed on a magnetic separator and the supernatant removed by pipetting. This wash step is repeated once with wash buffer.
  • elution buffer 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris x HCl, 0.05% Tween® 20, pH 4.5
  • 100 l of elution buffer 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris x HCl, 0.05% Tween® 20, pH 4.5
  • 100 l of elution buffer 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris x HCl, 0.05% Tween® 20, pH 4.5
  • the protein binding capacity determined using the Bradford assay, is approximately 10 g / g of magnetic particles.
  • Example 14 Concentration of viruses with polyethyleneimine-modified, porous, magnetic polymer beads
  • 1 ml of virus plasma is placed in a 2 ml Eppendorff tube. Then 200 l of a suspension of polyethyleneimine-modified particles from Example 5 in a concentration of 10 mg / ml in 200 l of RNase-free water are added. The mixture is vortexed, then incubated for 15 minutes at room temperature and then centrifuged for 2 seconds at 2,000 rpm to remove residue from particles at the top of the tubes. The particles are then magnetically separated within five minutes. The supernatant is discarded without removing any particles. Then 13.2 ml of the buffer "AL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Cat. No.
  • the filtration device is removed and discarded. Then 250 l of a Smitest Solution III (for the protein solution) containing quality standard from the RT and cRNA (carrier RNA / Roche Diagnostics) are added. It is immediately vortexed and incubated for 15 minutes at 55 0 C. Then 600 1 of isopropanol are added and mixed by turning the tube upside down 20 times. The mixture is then incubated on ice for 15 minutes, then centrifuged for 10 minutes at 4 ° C. at 15,000 rpm. The supernatant is carefully removed without resuspending the particles. 500 l of 70% ethanol are added and mixed by turning the tube upside down three times. It is centrifuged for 3 minutes at 4 ° C.
  • Smitest Solution III for the protein solution
  • cRNA carrier RNA / Roche Diagnostics
  • Example 15 Nucleic acid purification with amino-modified, porous magnetic polymer particles
  • the DNA content of the eluate can be determined by OD 32 o Measurements and polyacrylamide gel electrophoresis, or alternatively, the DNA can be eluted through a high salinity buffer (for example, 1.25 ml NaCl; 50 mM MOPS, pH 8.5, 15% isopropanol), but must then be precipitated to enable use in subsequent biochemical reactions.
  • a high salinity buffer for example, 1.25 ml NaCl; 50 mM MOPS, pH 8.5, 15% isopropanol
  • Example 16 Binding of primary antibodies to porous magnetic polymer particles modified with secondary antibodies
  • 3.4 x 10 5 / ml human CD3 + and 4.2 x 10 5 / ml CD3 suspension cells are in a solution containing 10 mM Na 2 HPO 4 , 100 mM NaCl (pH 7.5) and 10% of a fetal calf serum (FCS) mixed together. Then 3.32 x 10 6 cells are used per experiment. The mixture is incubated with CD3-specific monoclonal antibodies (mouse anti human CD3 PerCP / Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany, Cat. No. 555330) for 30 minutes without shaking.
  • CD3-specific monoclonal antibodies mouse anti human CD3 PerCP / Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany, Cat. No. 555330
  • phosphate-buffered saline (10 mM Na 2 HPO 4 , 100 mM NaCl / pH 7.5) is added and the mixture is centrifuged at 1,000 rpm. The supernatant is removed by pipetting and the particles are resuspended in 1 ml of phosphate-buffered saline. Then 200 l of a 25 mg / ml suspension of magnetic particles which have been functionalized with secondary antibodies (goat anti mouse IgG) according to Example 11 or 12 are added. The particles are incubated for 20 minutes and mixed by occasional shaking. In the next step, the tube is placed on a magnetic separator and the supernatant is transferred to a second tube. Then in a further step 20 1 mouse anti human CD3 PerCP are added and incubated for 15 minutes, washed and analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The evaluation of the recordings showed a) non-stained cells,
  • the FACS results showed a depletion of CD3-expressing Jurkat cells by at least 85% from 39.3 to 5.44%.
  • Example 17 Nucleic acid purification with carboxylate-modified, porous, magnetic polymer particles (gel extraction)
  • a 200 mg gel fragment containing 1 g DNA is added to 400 1 buffer "QX1" (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Cat. No. 20912) and mixed thoroughly for five seconds by pulse vortexing. Then 50 l of a 50 mg / ml suspension are mixed modified by carboxylate, magnetic polymer particles porous in accordance with example 3 or 10 was added and the mixture was mixed again to pulse vortexing. Thereafter, the mixture for five minutes is heated on a heating block to 5O 0 C and mixed again for 10 seconds by pulse vortexing. the particles are then separated from the supernatant by magnetic separation and the supernatant is discarded.
  • QX1 QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Cat. No. 20912
  • the suspension is thoroughly mixed by pulse vortexing for five seconds. Then the separation step is repeated and the supernatant is discarded again. This is followed by two washing steps with the buffer "PE” (QIAGEN GmbH; Hilden, Germany, cat. No. 19065) and the respective supernatants are discarded. Then the particles are simply dried by turning the tubes for 10 minutes without the magnetic separator After the drying step, 100 l of the buffer "EB” (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Cat. No. 19068) are added and the suspension is mixed for 15 seconds by pulse vortexing. The supernatant is separated from the particles using a magnetic separator and transferred to another tube. The elution step is repeated, the eluates are collected and homogenized using short pulse vortexes. The purity and amount of the purified DNA can be determined by means of gel electrophoresis and OD measurements.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Polymerpartikel, umfassend magnetische Partikel ausgesucht aus der Gruppe der ferromagnetischen, ferrimagnetischen und/oder superparamagnetischen Partikel, wobei die magnetischen Partikel in eine vernetzte Polyacrylat- oder Polyalkylacrylatmatrix eingebettet sind.

Description

Magnetische Polymerpartikel
Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Polymerpartikel, die ferromagnetische, ferrimagnetische und/oder superparamagnetische Partikel aufweisen, die in eine vernetzte Polyacrylat- oder Poly[(alkylacrylat)]matrix eingebettet sind, die funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I)
-C(=O)-M-R (I) aufweist, worin M -O-, -NH- oder -N(Ci-C6- Alkyl)-;
R Wasserstoff oder
eine Gruppe YX, in der
Y eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-CH2-CH2CH(OH)]- und/oder - CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-
-[CH2- CH(0H)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2]„- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6Hi0]-CH2-, wobei A und B unabhängig voneinander -NH-, -N(Ci-C6- Alkyl)- oder -O- und a eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sowie b eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8;
X Wasserstoff, -OH, -O-Ci-C6-Alkyl, -O-C6-Ci2-Aryl, -O-C7-Ci4-Alkylenaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoff atomen und einem C6-Ci2- Aryl-Rest; -Ci-C6- Alkyl, -C6-Ci2- Aryl, Heteroaryl, einen ggf. über eine -C1-C6- Alkylengruppe gebundenen Imidazolylrest;
C7-Ci4-Alkylaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und einem C6-Ci2- Aryl-Rest; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000003_0001
in der
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander
Wasserstoff, CrC6-Alkyl und/oder C6-Ci2- Aryl;
-CN, -NC5 -N3;
-C(=O)-R4 und R4 Wasserstoff, OH, C1-C6- Alkyl, -O-CrC6-Alkyl, C6-Ci0- Aryl oder -0-C6-Ci2- Aryl;
-NH2, -NHR5 und R5 Wasserstoff, Ci-C6- Alkyl und/oder C6-C12-Aryl;
F, Cl, Br oder I;
-SH oder -S-S-H;
2-Thiopyridyl oder 4-Thiopyridyl;
-S(=O)-CH2-CF3:
Acyl-Imidazol-, Maleinimido- oder Azlactongruppen; oder eine Gruppe Y' X' L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]O- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2]S- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6H10]-CH2-, wobei A und B unabhängig voneinander -NH-, -N(Ci-C6- Alkyl)- oder -O- und a eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sowie b eine ganze Zahle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=0)-[cyclo-C6Hio]-CH2-, worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X' eine Einfachbindung;
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-,
-CH(OH)-CH2-N(CrC6-Alkyl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=0)NH-, -
C(=O)N(Ci-C6-Alkyl)-;
-CR1R^R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH- oder -N (Ci-C6- Alkyl)-; L -C(=O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2 und u sowie v unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)W-C(=O)OH und w eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog.„low molecular weight",„high molecular weight" oder linearen
Polyethyleniminrest mit einem Molekulargewicht von etwa 500 bis 200.000 Da, einen Aminorest, vorzugsweise einen Polyaminrest, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, 1,4-Bis(3- aminopropyl)-piperazin, 1 -(2- Aminoethyl)piperazin,
l-(2-Aminoethyl)piperidin, l,4,10,13-Tetraoxa-7,16- diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide oder Streptavidin, IDA, DEO oder TED (Tris- carboxymethyl-ethylendiamin) oder
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")]
bedeuten können.
Bevorzugt werden magnetische Polymere, die funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O-, -NH- oder -N (CrC6-Alkyl)-; R Wasserstoff; oder eine Gruppe -YX, in der Y eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4,
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-,
-[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2] n- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6H10]-CH2-,
worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X Wasserstoff, -OH, -0-Ci-C4- Alkyl, -0-C6-Ci0- Aryl, -0-C7-Ci4- Alkylaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoff atomen und einem C6-CiO- Aryl- Rest;
-Ci-C6- Alkyl, -C6-Ci2- Aryl, Heteroaryl, einen ggf. über eine -C1-C6- Alkylengruppe gebundenen Imidazolylrest; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000006_0001
R1, R I22 uunndd RR33 uunnaabbhhäännggiigg voneinander
Wasserstoff, CrC3-Alkyl;
-NH2, -NHR5 und R5 Wasserstoff, Ci-C4- Alkyl;
F, Cl oder Br;
-CN, -NC; -SH oder -S-S-H;
2-Thiopyridyl oder 4-Thiopyridyl;
-S(=O)-CH2-CF3 (Tresyl); eine Acyl-Imidazol-, Maleinimido- oder Azlactongruppe; oder
R eine Gruppe -Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1,2,3,4,5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH) -]o- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-,
-[CH2- CH(0H)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6H10]-CH2-, worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X' eine Einfachbindung,
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-, -CH(OH)-CH2-, -N(Ci-C3-AIkVl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=0)NH-, -Q=O)N(C1-C3- Alkyl)-;
-CR1R2- R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben; -NH- oder -N (CrC3-Alkyl)-;
L -C(=O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2 und u sowie v unabhängig
voneinander jeweils eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)W-C(=O)OH und w eine ganze Zahl 1,2,3 oder 4; einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog.„low molecular weight",„high molecular weight" oder linearen Polyethyleniminrest mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise 500 bis 200.000 Da, einen Polyaminrest, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, l,4-Bis(3-aminopropyl)- piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperidin, 1,4,10,13- Tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide oder Streptavidin, IDA, DEO, TED (Tris- carboxymethyl-ethylendiamin),
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")] ; bedeuten können.
Besonders bevorzugt werden magnetische Polymere die funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O- oder -NH-;
R Wasserstoff; oder eine Gruppe YX, in der Y eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2,
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-;
-[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2]„- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2,
X Wasserstoff, -OH, -O-Ci-C4-Alkyl, -0-C6-C10-ATyI, ; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000009_0001
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander
Wasserstoff oder Ci-C2- Alkyl;
-NH2;
Cl oder Br;
-S(=O)-CH2-CF3; oder
R eine Gruppe Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2 oder 3; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH) -]o- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2
-[ CH2-CH2CH(OH)]-,
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X' eine Einfachbindung,
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-,
-CH(OH)-CH2-N(Ci-C3-AIkVl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=O)NH-,
-C(=O)N(CrC3-Alkyl)-;
-CR1R2- R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH-;
L -C(=O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)u]v-NH2 worin u 1 oder 2 sowie v 2; -(CH2)W-C(=O)OH und w eine ganze Zahl 1 oder 2; einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen
Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog.„low molecular weight",„high molecular weight" oder linearen Polyethyleniminrest mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise 500 bis 200.000 Da, einen Polyaminrest, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, l,4-Bis(3-aminopropyl)- piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperidin, 1,4,10,13- Tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide oder Streptavidin, IDA, DEO oder DEO oder TED (Tris -c arboxymethyl-ethylendiamin) ,
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")] bedeuten können.
Ganz besonders bevorzugt werden magnetische Polymere die funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O- oder -NH-;
R Wasserstoff oder eine Gruppe YX, in der
Y eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2_CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
-[ CH2-CH2CH(OH)]-
-[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2]„- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X Wasserstoff; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000011_0001
in der
R1, R2 und R3 Wasserstoff; -NH2; oder
R eine Gruppe Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH) -]o- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
-CH2-CH2CH(OH)- oder
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X' eine Einfachbindung,
CH(OH)-CH2-O-, -CH2-CH(OH)-O-;
-CR1R2- R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH-;
L -C(=O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)u]v-NH2 worin u 1 oder 2 sowie v 2; -(CH2)w-C(=0)0H und w eine ganze Zahl 1 oder 2; einen Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, NTA, IDA/DEO, TED, Spermin oder einen sekundären Antikörper -CH2-CH2-N -(CH2COO )[CH(COO )CH2COO")];
bedeuten können.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der magnetischen Polymere sowie ein Verfahren zur Isolierung und/oder Analyse zumindest einer Biomolekül- Spezies aus einer Probe.
In den letzten Jahren haben magnetische Partikel zunehmend Anwendung in Verfahren zur Aufreinigung, Trennung und Analyse verschiedener Biomoleküle gefunden. Solche magnetischen Partikel umfassen in der Regel ein magnetisches oder magnetisierbares, anorganisches Material, das in eine glasartige oder polymere Matrix eingebunden ist. Die Oberfläche der magnetischen Partikel ist dabei so gestaltet, dass bestimmte Biomoleküle aus einer Probe, z. B. einem Zelllysat, selektiv an diese Oberfläche gebunden werden können. Durch das Anlegen eines äußeren magnetischen Feldes an die Probe können die magnetischen Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen einfach aus der Probe entfernt werden. Anschließend können die Biomoleküle durch eine entsprechende Behandlung der magnetischen Partikel eluiert und so in reiner Form oder im angereicherten Zustand gewonnen werden.
In der US-Patentanmeldung 2001/0014468 Al werden magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol beschrieben. Diese Partikel werden durch ein Verfahren hergestellt, in dem eine wässrige Polyvinylalkohol-Lösung, die kolloid dispergierte magnetische Partikel enthält, mit einer organischen Lösung, die zumindest zwei Emulgatoren, die nicht mit der polymeren Phase mischbar sind, enthält, suspendiert wird. Die organische Lösung enthält zusätzlich einen wasserlöslichen Vernetzer, durch den die Polyvinylalkohol- Tröpfchen, während sie suspendiert sind, vernetzt werden. Die so erhaltenen magnetischen Polymerpartikel können anschließend entsprechend ihrer vorgesehenen Verwendung aktiviert, beziehungsweise durch polymere Seitenketten mit geeigneten funktionellen Gruppen funktionalisiert werden.
In der französischen Patentanmeldung FR 2531452 Al wird eine magnetische Trägermatrix beschrieben, die ein poröses Refraktärmetalloxid umfasst, in dessen Inneren ferromagnetische Partikel verteilt sind. Das Oxid ist mit einem vernetzten Polyamid mit überschüssigen, bifunktionalen Seitengruppen imprägniert. Diese Matrix wird zur Immobilisierung von Enzymen eingesetzt.
In dem US-Patent Nr. 4,795,698 werden magnetische Polymerpartikel beschrieben, die durch Copräzipitation zumindest zweier Spezies Übergangsmetallionen in der Gegenwart eines Polymers erhalten werden. Das Polymer enthält geeignete Koordinationsstellen, um das magnetische Polymerpräzipitat zu binden. Durch Auswahl geeignet funktionalisierter Polymere können die so erhaltenen Partikel für Immunassay-Techniken eingesetzt werden.
In dem US-Patent Nr. 4,358,388 werden magnetische Polymerpartikel beschrieben, die durch Emulsionspolymerisation einer homogenisierten Emulsion aus einer Dispersion magnetischer Partikel in einer organischen, polymerisierbaren Phase und einer wässrigen Phase, die zumindest einen Emulgator enthält, hergestellt werden. Die organische Phase umfasst als polymerisierbare Monomere zumindest eine aromatische Vinylverbindung oder eine Mischung aus zumindest einer aromatischen Vinylverbindung und einem copolymerisierbaren Monomer, bspw. einem Alkylacrylat oder einem Alkylmethacrylat.
Die Fähigkeit, gezielt eine oder mehrere Spezies von Biomolekülen an die Oberfläche der magnetischen Polymerpartikel zu binden, wird in erheblichem Maße durch die Art des verwendeten Polymers sowie die an diesem Polymer befindlichen funktionellen Gruppen bestimmt. Dabei hängen die Anforderungen, die an die Selektivität der Immobilisierungsreaktion gestellt werden, von der beabsichtigten weiteren Verwendung des immobilisierten Biomoleküls ab. Häufig ist es ausreichend, dass durch die Immobilisierung lediglich eine Anreicherung der gewünschten Biomolekül-Spezies erreicht wird; in anderen Anwendungen ist eine höhere Selektivität erforderlich oder zumindest wünschenswert, um direkt oder mit einer geringen Anzahl von weiteren Aufreinigungsschritten die gewünschte Biomolekül-Spezies in einem möglichst reinen Zustand zu erhalten. Weiterhin sollten die magnetischen Polymerpartikel eine möglichst hohe Bindungskapazität gegenüber der zu immobilisierenden Biomolekül-Spezies aufweisen, um den Einsatz der magnetischen Polymerpartikel effektiv und kostengünstig gestalten zu können. Prinzipiell gilt allerdings, dass eine hohe Bindungskapazität in der Regel nur mit kleinen Partikelgrößen bzw. mit einer hohen Porosität erreicht werden kann. Kleine Partikelgrößen erschweren es aber, eine ausreichende Magnetisierbarkeit der Polymerpartikel zu erreichen. Die aus dem Stand der Technik bekannten magnetischen Polymere weisen allerdings gar keine oder allenfalls nur eine sehr geringe Porosität auf, was sich auf die für die Immobilisierung zur Verfügung stehende Oberfläche nachteilig auswirkt.
Ein weiteres Problem ist es, die magnetischen Partikel in eine geeignete Polymermatrix einzuarbeiten. Insbesondere stellt die Entmischung der magnetischen Partikel und der organischen Phase, die Aggregation der magnetischen Partikel vor oder während der Polymerisation sowie die Erzielung einer ausreichenden Haftung zwischen Polymermatrix und magnetischen Partikeln häufig Probleme dar.
Somit besteht ein Bedarf an magnetischen Polymerpartikeln, die in der Lage sind, mit ausreichend hoher Selektivität Biomoleküle zu immobilisieren. Insbesondere besteht ein Bedarf an vielfältig funktionalisierbaren, magnetischen Polymerpartikeln, die einfach, vorzugsweise durch gängige chemische Verfahren, mit Liganden modifiziert werden können, die in ausreichender Selektivität Biomoleküle aus einer Probe immobilisieren können. Dabei sollten die modifizierten Polymerpartikel gegenüber den jeweiligen Biomolekülen eine möglichst hohe Bindungskapazität und gleichzeitig eine möglichst hohe Magnetisierbarkeit aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, die oben diskutierten Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen oder zumindest zu mindern.
Diese Aufgabe wird durch die magnetischen Polymerpartikel gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1 sowie dem Verfahren gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 21 gelöst. Weitere Ausführungsformen, Aspekte, Details und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung magnetische Polymerpartikel, die magnetische Partikel ausgesucht aus der Gruppe der ferromagnetischen, ferrimagnetischen und/oder superparamagnetischen Partikel.. Die magnetischen Partikel sind in eine vernetzte Polyacrylat- oder Poly[alkylacrylat]matrix eingebettet. Die Polymermatrix umfasst Carboxygruppen -C(=O)OH oder Carboxylester oder Carbons äureamidgruppen oder andere geeignete derivatisierte Carboxylstrukturen, wie in der allgemeinen Formel I beschrieben, die u.a. eine Spacergruppe Y und eine reaktive Gruppe X aufweisen können. Die magnetischen Polymerpartikel weisen eine mittlere Partikelgröße vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 25 μm, besonders bevorzugt in einem Bereich von 6 bis 20 μm, ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 15 μm sowie Poren mit einem maximalen Porenradius vorzugsweise in einem Intervall von 20 bis 500 nm, besonders bevorzugt in einem Intervall von 30 bis 400 nm und ganz besonders bevorzugt in einem Intervall von 80 bis 250 nm auf.
Durch die Verwendung der Polyacrylat- bzw. Poly[(alkyl)acrylat]matrix mit ihren funktionalisierbaren Carboxylgruppen bzw. substituierten und funktionalisierbaren, Carboxylgruppen wird es möglich, relativ große Polymerpartikel herzustellen, die eine ausreichende Magnetisierbarkeit gewährleisten, und gleichzeitig auf einfache Weise eine weitere Funktionalisierung mit einer Vielzahl zur Immobilisierung von Biomolekülen geeigneten Liganden ermöglichen.
Die Polymermatrix weist dann zunächst unveresterte Carboxygruppen auf, wenn als zu polymerisierendes Monomer die freie Acrylsäure oder eine (Alkyl)acrylsäure, wie beispielsweise Methacrylsäure, verwendet wurde. Soll die Polymermatrix andere funktionalisierbare Gruppen enthalten, so können entsprechend derivatisierte Acryl- oder (Alkyl)acrysäureester - insbesondere Methacrylester - als Monomere eingesetzt werden, wobei der Esterrest zumindest in einem weiteren Schritt in eine reaktive Gruppe überführbar ist, die ggf. über eine weitere Funktionalisierung, insbesondere die kovalente Bindung von insbesondere Biomolekülen immobilisierenden Liganden oder Spacergruppen, an welche die Liganden letztendlich gebunden werden, ermöglicht.
Dementsprechend kann die Polymermatrix der magnetischen Polymerpartikel funktionelle Gruppen mit der allgemeinen Struktur -Y-X aufweisen, wobei Y einen Spacer und X vorzugsweise eine reaktive Gruppe darstellt.
Als reaktive Gruppe X der funktionellen Gruppen kann jede Gruppe eingesetzt werden, die eine chemische Reaktion zur Bindung eines gewünschten Liganden an den Spacer erlaubt. Beispielsweise können reaktive Gruppen X verwendet werden, die Substitionsreaktionen an dem Spacer ermöglichen, durch die der Ligand an den Spacer kovalent gebunden wird. Beispiele solcher Reaktionen sind Veretherungen, Veresterungen, Amidbildungen, die Knüpfung von Iminobindungen u.a. Die reaktiven Gruppen X der funktionellen Gruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-, Epoxy-, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl, Imidazolyl - ggf. über eine Ci bis C6 Alkylenbrücke gebunden, C(O)H, C(O)R, -C(O)OH, C(O)R, -NH2, -NHR-, Azido-, Cyano-, Isocyano-, -SH, -SSH, Thiopyridinyl- (2- bzw. 4-Thiopyridyl), Aryl-, Halogen- (HaI-), Tresyl- ( 2,2,2-Triflourethansulfonyl), Acyl-Imidazolyl- und Maleinimidolyl- oder Azlactylgruppen.
Von den Epoxygruppen ist die Oxiran-2-yl-Gruppe bevorzugt, allerdings können auch substituierte Epoxygruppen gemäß der nachfolgend gezeigten Formel eingesetzt werden:
Figure imgf000017_0001
Dabei können die Reste R1, R2, und R3 unabhängig voneinander ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Ci-C6- Alkyl, C6-Ci2- Aryl - vorzugsweise Ci-C3-AIkVl
Unter Ci-C6-Alkylgruppen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Gruppen verstanden: C1: Methyl; C2: Ethyl; C3: Propyl, Isopropyl, C4: Butyl, 1- Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, C5: n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2- Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, C6: Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2- Trimethylpropyl, 1 -Ethyl- 1-methylpropyl und/oder l-Ethyl-2-methyl-propyl. Die Alkylgruppen können ggf. mit einem oder mehreren Substituenten - wie Nitrogruppe(n), Aminogruppe(n) und oder einem oder mehreren Halogenatom(n), die gleich oder verschieden sein können - substiuiert sein. Entsprechend sind niedere z.B. -Ci - C3 -Alkylreste definiert.
Unter Cycloazaalkylgruppen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung 5- bis 16- gliedrige gesättigte Ringsysteme mit 1 bis 15 - vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatom(en) und 1 bis 15 - vorzugsweise 1 bis 6, besonders bevorzugt 3 und 4 - Stickstoffatom(en) verstanden, die ggf. mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein können, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Niederalkylreste mit einem bis sechs Kohlenstoffatom(en) (Ci-Cό-Alkylgruppen), Alkoxygruppen mit einem bis sechs Kohlenstoffatom(en) (C1-C6- Alkoxygruppen), Nitrogruppen, Aminogruppen, wiederum ggf. über eine Alkylengruppe mit ein, zwei oder drei Kohlenstoffatomen an die cyclische Partialstruktur gebunden sein können, und/oder ein oder mehreren Halogenatom(e), die gleich oder verschieden sein können. Unter diesen cyclischen Systemen sind Pyrrolidin, Piperidin und Piperazin bevorzugt. Des Weiteren können die Cyloazaalkylsysteme neben Stickstoff auch 1, 2, 3 oder 4 Sauerstoffatom(e) als Ringmitglieder aufweisen, wie es zum Beispiel beim Morpholin der Fall ist.
Unter einem Arylrest mit sechs bis zwölf Kohlenstoffatomen (C6-Ci2-Aryl) werden aromatische Substituenten verstanden, die ggf. mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein können, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Niederalkylreste mit einem bis sechs Kohlenstoffatom(en) (Ci-Cό-Alkylgruppen), Alkoxygruppen mit einem bis sechs Kohlenstoffatom(en) (Ci-Cό-Alkoxygruppen), Nitrogruppen, Aminogruppen und/oder ein oder mehreren Halogenatom(e), die gleich oder verschieden sein können. Bevorzugte Arylreste werden beispielsweise durch Phenyl, oder kondensierte aromatische Systeme wie Naphthyl, oder Fluorenyl oder aber Systeme wie Biphenyl verkörpert. Analoges gilt für kleinere Arylreste (z. B . C6-CiO- Aryl)
Unter einem Herteroarylrest werden erfindungsgemäß in erster Linie fünf oder sechsgliedrige Ringsysteme verstanden, die wenigstens ein Heteroatom aufweisen. Beispiele werden durch Pyrrolyl und Furanyl oder Isothiazolyl einerseits sowie durch Pyridyl, Pyrazinyl oder Triazinyl andererseits verkörpert.
Unter einem Aralkylrest mit 7 bis 14 Kohlenstoff atomen wird ein Arylrest verstanden, der über eine Alkylenbrücke gebunden ist. Dabei können die aromatische Partialstruktur als auch die aromatische Partialstruktur ggf. mit Substituenten ausgewählt aus der Gruppe: Niederalkylreste mit einem bis sechs Kohlenstoff atom(en) (Ci-Cό-Alkylgruppen), Alkoxygruppen mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen (Ci-Cö-Alkoxygruppen), Nitrogruppen, Aminogruppen und oder einem oder mehreren Halogenatom(en), die gleich oder verschieden sein können. Aralkylreste mit sechs bis zehn Kohlenstoffatomen im Arylrest sowie einem bis drei Kohlenstoffatomen in der aliphatischen Partialstrutur - wie Benzyl oder Phenethyl - werden erfindungsgemäß bevorzugt; besonders bevorzugt ist der Benzylrest.
Als reaktive Halogensubstituenten kommen F, Cl, Br und I in Frage, insbesondere Cl und Br. Geeignete Spacer Y können aufgrund synthetischer Überlegungen zur Bereitstellung entsprechender polymerisierbarer Monomere bzw. deren kommerzieller Zugänglichkeit ausgewählt werden, oder aber die Spacergruppen werden im Hinblick auf eine nachfolgend durchzuführende Funktionialisierung mit einem immoblisierenden Liganden ausgewählt. Als „Spacer" oder „Spacergruppe" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle chemischen Gruppen verstanden, die an die Carboxygruppen der Polymermatrix gebunden werden können und somit die an den Spacer gebundene reaktive Gruppe, die mit dem Liganden unter Ausbildung einer Bindung reagieren kann, in einen Abstand zu dem Polymergerüst der Matrix bringen. Durch die Verwendung dieser„Abstandhalter" kann die Zugänglichkeit der reaktiven Gruppen für den Liganden verbessert werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Spacer Y der funktionellen Gruppe ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus:
1. -(CH2X- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeuten kann;
2. Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2_CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-
-[CH2- CH(OH)I1n- und/oder -[CH(0H)-CH2]n- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeuten können;
3. Alkylidenglycole - wie zum Beispiel Polyethylenglykol, Polypropylenglykol;
1. Mono-, Di- oder Polysaccharide;
2. Polyethylenimine;
3. Polyacrylsäuren;
4. -CH2-CH(OH)-CH2 bzw. -CH2-C(CH2OH)H-
5. -(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=0)-[cyclo-C6Hio]-CH2-, wobei A und B unabhängig voneinander eine -NH-, -N(C1-C6-AIlCyI)- oder -O- Gruppe, vorzugsweise -NH- verkörpern können, a eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 - vorzugsweise 1 oder 2 - und b eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 - vorzugsweise 6 bedeuten kann. 6. bifunktionelle und/oder trifunktionelle Crosslinker (z. B. bifunktionelle Spacer mit folgenden funktionellen Gruppen: Imidoester R-C(=NH)-OR', Hydrazide, Maleinimid, Aldehyd, Epoxide, Iodacetat, Iodacetamid, Acylimidazol, Diazoniumaryl, Halogenide, sowie photoreaktive bifunktionelle Spacer wie BASED (Bis-[b-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid);
7. Peptidspacer.
Die Verwendung einer -CH2- Spacergruppe (Y) im Zusammenhang mit Epoxy- funktionalisierten (X) Polymermatrices ist besonders vorteilhaft, da die Carboxygruppe der Acrylsäure in besonders einfacher Weise mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin umgesetzt werden kann. In ähnlicher Weise ist die Verwendung der oben unter Punkt 7) genannten Spacer vorteilhaft, wenn die Carboxygruppe des Acrylsäuremonomers in einem ersten Schritt mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin verestert wird und anschließend über die Epoxygruppe eine reaktive Gruppe X oder eine Gruppe, die eine reaktive Gruppe X enthält, eingeführt wird.
In einem weiterem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung magnetische Polymerpartikel, die ferromagnetische, ferrimagnetische oder superparamagnetische Partikel umfassen, die in eine vernetzte Polyacrylat- oder Poly(alkyl)acrylatmatrix eingebettet sind. Dabei umfasst die Polyacrylat- oder Poly[(alkyl)acrylat]matrix Gruppen vom Typ R=Y'X'L.
Die magnetischen Polymerpartikel gemäß diesem Aspekt können in einfacher Weise durch Funktionalisierung der magnetischen Polymerpartikel gemäß dem oben beschriebenen ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Demgemäß gelten die oben mit Bezug auf die magnetischen Polymerpartikel gemäß dem ersten Aspekt gemachten Ausführungen in analoger Weise auch für die magnetischen Polymerpartikel gemäß dem zweiten erfindungsgemäßen Aspekt. Unterschiede bezüglich der magnetischen Polymerpartikel ergeben sich dementsprechend hinsichtlich der im zweiten Aspekt beschriebenen zusätzlichen Funktionalisierung mit den entsprechenden Liganden - in der allgemeinen Formel das Struktumerkmal -Y' -X' -L für R dargestellt.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung sind die Bindungsgruppen X', mittels derer die Liganden an die Polyacrylat- oder Polyalkylacrylatmatrix gebunden sind, ausgesucht aus der Gruppe bestehen aus -CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)- CH2-NH-, -CH(OH)-CH2-NR-, -O-, -NH-, -NR-, -C(=O)O-, -C(=O)NH-, -C(=O)NR, und wobei R eine Ci-C3-Alkylgruppe ist. Die Liganden können somit über Iminogruppen (-NH-), Amidogruppen (-C(=O)NH-), Carboxygruppen (-C(=O)O-), Oxogruppen (-O-) oder Thiogruppen (-S-) an die Polymermatrix gebunden werden. In dem Fall, dass die Liganden direkt an die freien Carboxygruppen der Polyacrylat- bzw. Poly(alkyl)acrylatmatrix gebunden sind, erfolgt die kovalente Bindung über eine Veresterung, Amidbildung oder sonstige aus dem Stand der Technik bekannte Derivatisierung der Carboxygruppe. Die Verwendung von Spacern -Y mit reaktiven Gruppen -X, an welche die Liganden kovalent gebunden werden können, erweitert das Spektrum der möglichen Bindungstypen gegenüber der direkten Bindung an die Carboxygruppen weiter und kann die Zugänglichkeit der reaktiven Gruppe für den Liganden verbessern - z.B. durch das Ausschalten sterischer Effekte.
Dementsprechend sind in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Liganden, die Biomoleküle immobilisieren können, direkt an die Carboxygruppen der Polymermatrix gebunden. Alternativ sind sie indirekt über Spacer an die Carboxygruppen der Polymermatrix gebunden, wobei die Spacer zumindest eine der oben beschriebenen reaktiven Gruppen aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung werden als Spacer Y, an denen die Liganden über die entsprechende reaktive Gruppe X gebunden werden können, Reste verwendet, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehen aus: a) -(CH2)i- mit 1 = eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, onder 6;
b) Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
CH2-CH2CH(OH) und/oder CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)]-
-[CH2- CH(0H)]m- und/oder -[CH(0H)-CH2]n- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeuten können;
c) Alkylidenglycole - wie zum Beispiel Polyethylenglykol, Polypropylenglykol ;
d) Mono-, Di- oder Polysaccharide; e) Polyethylenimine;
f) Polyacrylsäuren;
g) -(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6H10]-CH2-,
wobei A und B unabhängig voneinander eine -NH-, -N(Ci-C6-Alkyl)- oder -O- Gruppe ist, vorzugsweise -NH-, n = 1-6 ist, vorzugsweise 1 oder 2, und m = 1-8 ist, vorzugsweise 6.
h) bifunktionelle und/oder trifunktionelle Crosslinker (z. B. bifunktionelle Spacer mit folgenden funktionellen Gruppen: Imidoester R-C(=NH)- OR', Hydrazide, Maleinimid, Aldehyd, Epoxide, Iodacetat, Iodacetamid, Acylimidazol, Diazoniumaryl, Halogenide, sowie photoreaktive bifunktionelle Spacer wie BASED (Bis-[b-(4- azidosalicylamido)ethyl]disulfid);
i) Peptidspacer
Diese Spacer können entweder direkt an die Carboxygruppen der Matrix gebunden sein oder ebenfalls über weitere Spacer, insbesondere denen, die im Zusammenhang mit dem ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurden, mittels der an diesen Spacern gebundenen reaktiven Gruppen an die Carboxygruppen gebunden sein.
Die Liganden, welche vorzugsweise Biomoleküle immobilisieren können, können insbesondere solche Liganden sein, die Proteine, Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder primäre bzw. sekundäre Antikörper, immobilisieren können. Insbesondere können als Liganden drei-, vier- oder fünfzähnige Chelatbildner, vorzugsweise Nitrilotriessigsäurereste verwendet werden. Auch können Polyethyleniminreste verwendet werden. Diese können verzweigt oder unverzweigt sein. Des weiteren können Aminogruppen-haltige Reste, beispielsweise Alkylaminogruppen vom Typ -(C^)n-NR10R20, wobei n neben 0 eine ganze Zahl ist, vorzugsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, insbesondere 2, 3, 4, 5 oder 6, und R10 und R20 unabhängig voneinander ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus -H und Ci-Cό-Alkyl, insbesondere Ci-C3-Alkyl, Amin- und/oder Polyaminreste verwendet werden. Des Weiteren können Carbonsäurereste, Proteine, Biotin, Oligonukleotide, Streptavidin oder gebundene Antikörper verwendet werden. Die Polyamine sind vorzugsweise ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus offenkettigen und cyclischen Polyaminen mit 2, 3, 4, 5 oder 6 Aminogruppen. Die Polyamine können vorzugsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, Trimethylendiamin, Tetramethylendiamin, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin, Pentaethylenhexamin, l,4-Bis(3-aminopropyl)-piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperidin, l,4,10,13-Tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan und Tris(2-aminoethyl)amin und Ähnlichen.
Als Carbonsäurereste können insbesondere Carboxyreste (-C(=O)OH) an sich, Alkylencarboxyreste (-Alkylen-C(=O)OH), wobei die Alkylbrücke eine verzweigte oder unverzweigte Ci-Ci2-Alkylgruppe, vorzugsweise eine ggf. verzeigte oder unverzweigte C2-C6-Alkylgruppe sein kann; daneben können an Aryl-Partialstrukturen gebundene Carboxygruppen (Aryl-C(=O)OH), beispielsweise Phenylcarboxygruppen, eingesetzt werden, d.h. in diesem Fall ist die o.a. Alkylenbrücke durch ein Phenylsystem ersetzt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise ferro- oder ferrimagnetische Partikel verwendet, vorzugsweise ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus: 7-Fe2O3 (Maghemit), Cr2O3 sowie Ferrite, insbesondere vom Typ (M2+O)Fe2O3, wobei das M2+ ein divalentes Übergangsmetallkation darstellt, und vorzugsweise Fe3O4 (Magnetit) sind. Andere ferro- oder ferrimagnetische Partikel können jedoch ebenfalls verwendet werden. Diese Partikel weisen einen mittleren Teilchendurchmesser von kleiner 5 μm, vorzugsweise kleiner 1 μm, besonders bevorzugt in einem Bereich zwischen 0,05 und 0,8 μm, ganz besonders bevorzugt in einem Bereich zwischen 0, 1 und 0,4 μm auf.
Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher ferro- oder ferrimagnetischer Partikel sind ferromagnetische Partikel auf der Basis von 7-Fe2O3 wie Bayoxide E AB 21 (Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland), ferrimagnetisches Magnetit erhältlich von der Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland, als Typ Bayoxide E 8706, E 8707, E 8710 und E 8713H sowie von der BASF AG, Ludwigshafen, Deutschland, als Magnetpigment 340 und Magnetpigment 345.
Darüber hinaus können auch superparamagnetische Partikel verwendet werden. Als superparamagnetische Materialien kommen Fe, Fe3O4, Fe2O3, superparamagnetische Ferrite,
Co, N, sowie binäre und/oder ternäre Verbindungen (Legierungen) in Frage.
Beispielhaft seien hier Eisenoxidkristalle mit einem Durchmesser von etwa 300Ä oder kleiner genannt. Zur Vernetzung der Polymermatrix werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Di- oder Polyacrylate oder Di- oder Poly(alkyl)acrylate verwendet. Vorzugsweise sind diese ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykolacrylat, Ethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Ethylenglykolmethacrylat, Polyethylenglykol- acrylaten, Polyethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Polyethylenglykolmethacrylaten, Pentaerythritoltetraacrylat und Pentaerythritoltriacrylat, Glycerintriacrylat, Glycerintrimetha- crylat, Glycerinpropylattriacrylat, Glycerinpropylattrimethacrylat oder auch Divinlybenzol und dessen organisch modifizierten Derivate, wie z.B. 2-Hydroxy-l,4-divinylbenzol. Diese Vernetzer haben sich im Hinblick auf die verwendeten Acrylat- bzw. (Alkyl)acrylat- Monomere als besonders geeignet herausgestellt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: a) Herstellung einer Dispersion von magnetischen Partikeln in einer ersten organischen Phase, wobei
die magnetischen Partikel ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus ferromagnetischen, ferrimagnetischen oder superparamagnetischen Partikeln, und wobei
die erste organische Phase
a.l.) ein - oder mehrere - Acrylatmonomer(e), ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, (Alkyl)acrylsäuren oder Acrylaten und
(Alkyl)acrylaten, die substituierte Carboxylgruppen vom Typ -C(=O)-O-Y-X aufweisen, wobei Y eine Spacergruppe und X eine reaktive Gruppe darstellen a.2.) zumindest einen Vernetzer mit zwei oder mehr Acrylat- oder
(Alkyl)acrylatgruppen,
a.3.) zumindest einen lipophilen Radikalstarter, und
a.4.) zumindest einen organischen Porenbildner
umfasst
b) Mischen und Homogenisieren der Dispersion in einer zweiten organischen Phase unter Ausbildung einer Emulsion, wobei
die zweite organische Phase
bl) zumindest eine flüssige hydrophobe Verbindung und
b2) zumindest eine oberflächenaktive Substanz umfasst, und
c) radikalische Polymerisation der Emulsion, wobei die so erhaltenen magnetischen Polymerpartikel eine mittlere Partikelgröße vorzugsweise im Bereich von 5 bis 25 μm, besonders bevorzugt im Bereich von 6 bis 20 μm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 10 bis 15 μm sowie Poren mit einem maximalen Porenradius vorzugsweise im Bereich von 20 bis 500 nm, besonders bevorzugt in einem Bereich von 30 bis 400 nm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 80 bis 250 nm aufweisen.
Durch dieses Verfahren können magnetische Polymerpartikel, wie sie oben bereits beschrieben wurden, erhalten werden.
Vorzugsweise wird die Emulsion vor der radikalischen Polymerisation mit einem Inertgas gespült, um so ggf. in dem Gemisch enthaltenen Sauerstoff auszutreiben. Dementsprechend wird die anschließende Polymerisation vorzugsweise unter einer Schutzgasatmosphäre durchgeführt. Als Schutzgas bzw. Inertgas kommt hier insbesondere Stickstoff oder Argon in Frage, wobei Stickstoff aufgrund der geringeren Kosten bevorzugt ist. Allerdings können auch andere Schutzgase, insbesondere weitere Edelgase wie Helium oder Krypton verwendet werden.
Vorzugsweise werden die magnetischen Partikel vor oder während der Herstellung der Dispersion gemahlen und/oder deagglomeriert. Dadurch wird eine Agglomeration der primären magnetischen Partikel vermieden und die Dispergierung sowie die nachfolgende Homogenisierung der Emulsion erleichtert und verbessert. Zum Mahlen oder Deagglomeration können Ultraschalltechniken, Rührverfahren und/oder Mahlverfahren, beispielsweise in einer Kugelmühle, verwendet werden.
Die radikalische Polymerisation wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 50 0C oder höher, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 50 0C und 120 0C, vorzugsweise zwischen 60 0C und 90 0C durchgeführt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Monomer in der ersten organischen Phase eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (II): H2C=CR' -C(=O)-OZ (H)
wobei R H- oder ein Ci-C3-Alkyl, Z Wasserstoff (-H) oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -Y-X ist und Y ein Spacer und X wie oben definiert z.B. aus der Gruppe umfassend - OH, -NH2, -C(=O)OH, Halogen (HaI-), Tresyl-, Maleinimido- und Epoxygruppen ausgesucht wird. Der Spacer kann beispielsweise eine -(CH2X- Gruppe - worin 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet - oder eine -CH2-CH(OH)-CH2- Gruppe sein. Als Spacer kommen hier ebenfalls neben allen eingangs definierten Gruppen diejenigen Gruppen in Frage, die im Zusammenhang mit den magnetischen Polymerpartikeln gemäß den vorhergehend beschriebenen Aspekten, insbesondere dem ersten Aspekt der Erfindung, genannt wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Monomer in der ersten organischen Phase ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Glycidylmethacrylat, (2-Hydroxyethyl)methacrylat, Methacrylsäure und Acrylsäure sowie Acrylsäurederivaten der allgemeinen Formel (III):
H2C=CR' C(=O)O-(CH2)CZ (III) wobei R H oder Methyl bedeuten kann und c eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 ist und Z beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend -OH, -NH2, -C(=O)OH, HaI-, Tresyl-, Maleinimido- und Epoxygruppen.
Als Vernetzer können in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehrere Alkylidenglykoldiacrylate oder Alkylidenglykol(alkyl)acrylate der allgemeinen Formel (III) verwendet werden:
H2C=CR"C(=O)O-[(CdH2dO)]e(C=O)CR'"=CH2 (IV) wobei in der Formel (IV) R und R'" unabhängig voneinander H oder ein Ci-C3-Alkyl sind und vorzugsweise R und R beide H oder Methyl sind, d eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4 - , vorzugsweise 1 oder 2 - ist und e eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 - bevorzugt eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 und besonders bevorzugt eine ganze Zahl 1, 2, 3, oder 4 ist. Insbesondere können Ethylenglykoldiacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat oder , Di[meth(acrylat)]-funktionalisierte Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole - wie z.B. Propylenglykolacrylate, Propylenglykol(alkyl)acrylate, insbesondere
Propylenglykolmethacrylate, Polypropylenglykolacrylate, Polypropylenglykol(alkyl)acrylate, insbesondere Polypropylenglykolmethacrylate oder Propylenglykolacrylate,
Propylenglykol(alkyl)acrylate, insbesondere Propylenglykolmethacrylate,
Polypropylenglykolacrylate, Polypropylenglykol(alkyl)acrylate, insbesondere
Polypropylenglykolmethacrylate oder eine Mischung daraus als Vernetzer verwendet werden. Des Weiteren können Polyacrylate oder Poly(alkyl)acrylate mit zumindest zwei, vorzugsweise mit drei oder vier, Acrylat- bzw. (Alkyl)acrylatgruppen verwendet werden, wobei die Alkylgruppe vorzugsweise ausgesucht ist aus der Gruppe der Ci-C3-Alkylgruppen, und besonders bevorzugt Methyl ist. Beispielsweise können Pentaerythritoltetraacrylat, Pentaerythritoltetramethacrylat, Pentaerythritoltriacrylat, Pentaerythritoltrimethacrylat, Glycerintriacrylat, Glycerintrimethacrylat, Glycerinpropylattriacrylat,
Glycerinpropylattrimethacrylat oder auch Divinlybenzol und dessen organisch modifizierten Derivate, wie z.B. 2-Hydroxy-l,4-divinylbenzol oder Mischungen daraus oder Mischungen dieser Verbindungen mit anderen, oben beschriebenen Vernetzern verwendet werden.
Als organische Porenbildner können insbesondere Verbindungen verwendet werden, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus a) aliphatischen, verzweigten oder unverzweigten Alkoholen mit 4 bis 20-C- Atomen, bevorzugt 4 bis 16-C- Atomen und besonders bevorzugt 4 bis 8-C- Atomen, mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, bevorzugt 1-3 Hydroxygruppen,
b) Alkylidenglykolen, insbesondere Ethylenglykol, Glycerin, etc.
c) Kohlenhydrate, wie Glukose, und
d) polymeren Verbindungen, deren massengemittelte Molekülmasse Mw zwischen 200 und 100000 g/mol liegt und die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylidenglycolderivaten, Polyethylenimin, Polyvinylpyrolidon und Polystyrol, oder Mischungen der unter a), b) und c) vorgenannten Verbindungen.
Es können insbesondere Porenbildner eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol (Mw: 200-20000 g/mol), Polypropylenglykol (Mw: 200-10000 g/mol), Polyethylenglykolmonoalkylether (Mw: 200-5000 g/mol), Polyethylenglykoldialkylether (Mw: 200- 5000 g/mol), Polyethylenglykolmonoalkylester (Mw: 200-20000 g/mol), Polyethylenglykoldialkylester (Mw: 200-5000 g/mol), Polyethylenglykoldisäure (Mw: 1000-20000 g/mol), Polyethylenimin (Mw: 200-100000 g/mol), Polyvinylpyrrolidon (Mw: 10000-40000 g/mol) und/oder Polystyrol (Mw: 200-5000 g/mol). Insbesondere können in der vorliegenden Erfindung als Porenbildner Ethylenglykol und Polyethylenglykol (Mw: 1000-6000 g/mol) verwendet werden. Daneben eignen sich Amino-funktionalisierte Polyethylenglykole, die im Stand der Technik als sog. Jeff- Amine wohl-bekannt sind.
Als lipophile Radikalstarter können insbesondere Azoisobutyronitril (AIBN), 2,2'-Azobis(2- amidinopropan)dihydrochlorid, 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), und 1,1'- Azobis(cyclohexan-l-carbonitril) verwendet werden. Es können aber auch andere Radikalstarter, wie beispielsweise Dibenzoylperoxid, verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie ausreichend lipophil sind, um in die Dispersion eingearbeitet werden zu können.
Die hydrophobe Flüssigkeit, die zur Herstellung der Emulsion verwendet wird, sollte insoweit chemisch inert sein, dass sie die radikalische Polymerisation nicht nachteilig beeinflusst. Vorzugsweise sollte die Flüssigkeit mit der ersten organischen Phase im Wesentlichen nicht mischbar sein, so dass eine Emulsion der Dispersion in der ersten organischen Phase, in der zweiten organischen Phase erzeugt werden kann. Entscheidend bei der Auswahl der Systeme ist, dass das Polymer während der Polymerisation in dem System unlöslich wird.
Die hydrophobe Flüssigkeit kann ggf. ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen oder cyclischen Alkanen, insbesondere aliphatischen Alkanen der allgemeinen Formel C2H2n+2, wobei n > 6 ist, aliphatischen und cyclischen Alkenen, insbesondere aliphatischen Alkenen der allgemeinen Formel C2H2n, wobei n > 6 ist, aromatischen Verbindungen, insbesondere monocyclischen, bicyclischen oder tricyclischen Verbindungen, die mit Alkyl- oder Alkengruppen substituiert sein können, insbesondere Toluol, Xylol, Mineralöle, Siliconöle, Pflanzenöle oder Paraffinöle, Stoffe, die auf Verbindungen aus Fettsäuren und Alkoholen basieren sowie Mischungen der vorgenannten Stoffe, insbesondere Mischungen aus aliphatischen Alkanen und Aromaten. Die oberflächenaktive Substanz in der zweiten organischen Phase ist vorzugsweise ein Emulgator, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus kationischen, anionischen und nichtionischen Emulgatoren. Beispielsweise können als oberflächenaktive Substanzen Sorbitanester, ethoxylierte Sorbitanester, Polyoxyethylen-alkylphenolether und andere kommerziell erhältliche oberflächenaktive Verbindungen oder Verbindungsgemische verwendet werden. Beispiele geeigneter oberflächenaktiver Substanzen sind kommerziell erhältliche Substanzen wie Tween® 20 (Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat), Triton®X 100 (?-Octylphenoxypolyethoxyethanol), Span 85® (Sorbitantrioleat) (alle erhältlich von Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), Hypermer 2296 (erhältlich von Uniqema, Gouda, Holland) und ähnliche Substanzen.
Als magnetische Partikel können in dem Verfahren die gleichen Partikel, wie sie oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen magnetischen Partikeln beschrieben wurden, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß werden die oben genannten Komponenten in folgenden
Mengenverhältnissen (Gewichtsprozente, Gew.-%) zusammen gegeben (bezogen auf die auf das Reaktionsgemisch:
Der Vernetzer (Cross-Linker) wird bevorzugt in einem Verhältnis von 0,1 - 20 Gew,-%, bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 - 4 Gew.-% vorgelegt.
Das funktionalisierte Monomer wird in einem Verhältnis von 0,1 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,5
- 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 - 4 Gew.-% vorgelegt.
Das magnetische Material oder der Magnetit wird in einem Verhältnis von 0,1 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,5 - 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 - 4 Gew.-% vorgelegt.
Der Initiator bzw. Radikalstarter wird in einem Verhältnis von 0 - 5 Gew.-%, bevorzugt 0,01
- 3 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,05 - 0,5 Gew.-% vorgelegt.
Das Detergenz (Surfactant) wird in einem Verhältnis von 0 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,1 - 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,1 - 3 Gew.-% vorgelegt. Das Porogen wird in einem Verhältnis von 0,1 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,5 - 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 - 4 Gew.-% vorgelegt.
Die resultierenden Polymere, die sich für die erfindungsgemäße Anwendung eignen, weisen vorteilhafter Weise folgende Zusammensetzung auf:
Der Gehalt an Cross-Linker (Vernetzer) liegt zwischen 1 - 95 Gew.-%, bevorzugt zwischen 10 - 80 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 20 - 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt zwischen 15 - 40 Gew.-%.
Die aus dem/den funktionalisiertem/ten Monomer(e) gebildeten Polymere gemäß der Erfindung liegt in den magnetischen Partikeln in einem Anteil zwischen 1 - 99 Gew.-%, bevorzugt zwischen 10 - 80 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 20 - 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt zwischen 30 - 60 Gew.-% vor.
Der Gehalt Magnetit bzw. magnetischem Material liegt zwischen 1 - 95 Gew.-%, bevorzugt zwischen 10 - 80 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 20 - 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt zwischen 30 - 60 Gew.-%.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als weiterer Schritt d) eine Funktionalisierung der durch das Verfahren erhaltenen magnetischen Polymerpartikel durchgeführt, in dem zumindest ein Ligand, der Biomoleküle immobilisieren kann, an die Polymermatrix gebunden wird. Vorzugsweise werden die magnetischen Partikel nach der Polymerisation isoliert und gewaschen, bevor sie weiter umgesetzt werden, beispielsweise funktionalisiert werden. Die Partikel können durch einfache Filtration isoliert und anschließend durch Waschen mit einem Lösemittel gereinigt werden. Als Lösemittel zum Waschen kommen sowohl organische als auch anorganische Lösemittel wie beispielsweise Toluol, Aceton oder Wasser in Frage.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Ligand direkt an die reaktiven Gruppen der funktionellen Gruppen des magnetischen Polymerpartikels gebunden. Alternativ dazu kann zur Bindung des Liganden in einem ersten Schritt dl) eine Spacerverbindung mit zumindest zwei reaktiven Gruppen an die funktionellen Gruppen der magnetischen Polymerpartikel gebunden werden und dann in einem zweiten Schritt d2) der Ligand, der vorzugsweise Biomoleküle immobilisieren kann, an die magnetischen Polymerpartikel kovalent gebunden werden.
Als Liganden und Spacer kommen beispielsweise die oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen magnetischen Partikeln beschriebenen Gruppen in Frage. Diese können durch entsprechende, zumindest zwei reaktive Gruppen umfassende Verbindungen an die Polymerpartikel gebunden werden.
Durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren sind die erfindungsgemäßen magnetischen Polymerpartikel, wie sie oben in dem ersten und zweiten Aspekt der
vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, erhältlich.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und/oder Analyse zumindest einer Spezies eines Biomoleküls aus einer Probe, das Verfahren umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer zumindest eine Biomolekül-Spezies enthaltende Probe,
b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit den erfindungsgemäßen magnetischen Polymerpartikeln, unter Bedingungen, bei denen die zumindest eine Biomolekül-Spezies an die magnetischen Polymerpartikel bindet, und
c) Abtrennung der magnetischen Polymerpartikel mit den gebundenen Biomolekülen unter Verwendung zumindest eines Magnetfeldes.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens schließt sich als weiterer Schritt d) das Eluieren der zumindest einen Biomolekül-Spezies von den magnetischen Polymerpartikeln ein.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten magnetischen Polymerpartikel können somit für die Immobilisierung - bzw. Bindung vorzugsweise von Biomolekülen verwendet werden. Dabei kann die Biomolekül- Spezies, die an die magnetischen Partikel gebunden wird, ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Oligonukleotiden Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, sowie deren Kombinationen. Insbesondere können Nukleinsäuren und Oligonukleotide, vorzugsweise Plasmid-DNA, genomische DNA, cDNA, PCR-DNA, lineare DNA, RNA, Ribozyme, Aptamere, und chemisch synthetisierte oder modifizierte Nukleinsäure oder Oligonukleotide an die magnetischen Partikel gebunden werden. Unter„gebunden" ist hier allgemein zu verstehen, dass das Biomolekül eine so starke Wechselwirkung mit den magnetischen Polymerpartikeln ausbildet, dass es zusammen nit diesen unter dem Einfluss eines Magnetfeldes aus einer Probe entfernt werden kann. Diese Wechselwirkungen können verschiedener Natur sein. Beispielsweise können die Wechselwirkungen auf der Ausbildung kovalenter Bindungen und/oder Wasserstoffbrücken-Bindungen und/oder van-der-Waals Kräften beruhen.
Die magnetischen Polymerpartikel, die mit einem Chelatbildner als Liganden, wie beispielsweise Ni-NTA, funktionalisiert wurden, können insbesondere für die Proteinreinigung verwendet werden.
Die magnetischen Polymerpartikel, die mit Aminogruppen-haltigen Liganden wie Polyethylenimin oder mit Carboxylsäure-haltigen Liganden, modifiziert wurden können insbesondere für die Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren verwendet werden. Werden sekundäre Antikörper als Liganden an die magnetischen Polymerpartikel gebunden, können diese zur Isolierung und Aufreinigung von primären Antikörpern eingesetzt werden.
Die Probe, in denen die zumindest eine Biomolekül-Spezies enthalten ist, können relativ komplexe Proben sein wie Blut, Gewebe, Zellen, pflanzlichen Materialien und ähnliches. Andere Proben sind Lösungen, die im Zuge eines Aufreinigungs-, Amplifikations-, oder Analyseverfahrens erhalten werden, beispielsweise PCR-Lösungen.
Weitere Verfahren, in denen die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel eingesetzt werden können, sind Nukleinsäure-Nachweise mittels Hybridisierung, das Binden von Antikörpern oder organischen Makromolekülen sowie das Binden und das Detektieren von Biomolekülen oder Zellen. Allgemein können die magnetischen Partikel zur Bindung, dem Nachweis und der Aufreinigung von Biomolekülen oder Zellen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren anhand verschiedener Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der weiteren Erläuterung der Erfindung und sind nicht als einschränkend zu verstehen. Beispiel 1: Synthese poröser, Hydroxy-funktionalisierter, magnetischer Polymerpartikel
In einem ersten Schritt wurden 8 ml Tween 20 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Aldrich Kat. Nr. 27,4348) in 400 ml Paraffinöl (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Aldrich Kat. Nr. 33,076-0) gelöst. Dann wurden 2 ml Ethylenglykoldimethacrylat (Sigma- Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Aldrich Kat. Nr. 33,568-1) und 9 ml Hydroxyethyl- methacrylat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Aldrich Kat. Nr. 47,702-8), die im Wesentlichen frei von Inhibitoren sind, in ein Kunststoffgefäß, vorzugsweise ein 50 ml Falcon-Rohr (BD Biosciences) pipettiert und 10 ml Polyethylenglykol, 3400, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Aldrich Kat. Nr. 20,244-4), 0,3 g Azo-bis-2-methylpropionitril (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Fluka Kat. Nr. 11630) und 7,5 g BASF-Magnetit 345 (BASF AG, Ludwigshafen, Deutschland) werden zugegeben. Diese Mischung wird dann in einem Polytron-Homogenisator für eine Minute auf der höchsten Stufe homogenisiert. Die Hälfte der Paraffinöl-Lösung wird in eine 500 ml Nalgene-Flasche gegeben. Dann wird die Magnetitsuspension zugegeben und die Mischung für 120 Sekunden unter Eiskühlung homogenisiert. Die andere Hälfte der Paraffinöl-Lösung wird unter Schutzgas in einen 1000 ml Dreihalskolben mit Rückflusskühler und KPG-Rührer gegeben. Es wird mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min begonnen, die dann auf 600 U/min gesteigert wird. Anschließend wird die Eisenoxidsuspension zugegeben. Die Reaktionsmischung wird dann durch Spülen von Schutzgas durch den Kolben von Sauerstoff befreit. Die Reaktionstemperatur wird für eine Stunde auf 7O0C erhöht und anschließend über Nacht bei 8O0C gehalten. Am nächsten Tag wird die Mischung filtriert, mit Toluol, Aceton und Wasser gespült und in einem Vakuumofen bei 5O0C getrocknet. Die so erhaltenen Partikel sind Hydroxy-funktionalisiert, makroporös und haben einen Partikeldurchmesser von 10 bis 15 m.
Beispiel 2: Synthese poröser, Epoxy-funktionalisierter, magnetischer Polymerpartikel
In einem ersten Schritt werden 8 ml SPAN 60 (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 31,822-1) in 400 ml Paraffinöl (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 33,076-0) gelöst. Dann werden 5 ml Ethylenglykoldimethacrylat und 5 ml Glycidylmethacrylat (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 15-123-8), die im wesentlichen frei von Inhibitoren sind, in ein Falcon-Rohr pipettiert, und 10 ml Polyethylenglykol (MW 4600) (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 37,300-1), 0,3 g Azo-bis- 2-Methylpropionitril und 7,5 g Bayer Bayoxid E 8710 (Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland) werden zugegeben. Diese Mischung wird für eine Minute mit einem Polytron- Homogenisator auf der höchsten Stufe homogenisiert.
Die Hälfte der Paraffinöl-Lösung wird in eine 500 ml Nalgene-Flasche gegeben. Dann wird die Magnetit- Suspension zugegeben und die Mischung für 120 Sekunden unter Eiskühlung homogenisiert. Dann wird die andere Hälfte der Paraffinöl-Lösung unter Schutzgas in einem 1000 ml Dreihalskolben mit Rückflusskühler und KPG-Rührer gegeben. Es wird mit einer Anfangsrührgeschwindigkeit von 500 U/min begonnen, die dann auf 600 U/min gesteigert wird. Dann wird die Eisenoxid-Suspension zugegeben und die Reaktionsmischung wird durch Spülen eines Schutzgases durch den Kolben von Sauerstoff befreit. Die Reaktionstemperatur wir für eine Stunde auf 6O0C erhöht und dann über Nacht bei 7O0C gehalten. Am nächsten Tag wird die Mischung filtriert und mit Toluol, Aceton und Wasser gespült und in einem Vakuumofen bei 5O0C getrocknet. Die so erhaltenen Partikel sind Epoxy-funktionalisiert, makroporös und haben einen Partikeldurchmesser von 10 bis 15 m.
Beispiel 3: Synthese poröser, Carboxy-funktionalisierter, magnetischer Polymerpartikel
In einem ersten Schritt werden 8 ml SPAN 60 in 400 ml Paraffinöl (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 33,076-0) gelöst. Dann werden 3 ml Ethylenglykoldimethacrylat und 7 ml Methacrylsäure (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 39,537-4), die im Wesentlichen frei von Inhibitoren sind, in ein Falcon-Rohr pipettiert und 10 ml Polyethylenglycol, MW 2000 (Sigma-Aldrich, Kat. Nr. 29,590-6), 0,3 g Azo-bis-2-methylpropionitril und 7,5 g Bayer Bayoxid E 8713 H werden zugegeben. Diese Mischung wird in einem Polytron- Homogenisator auf der höchsten Stufe für eine Minute homogenisiert. Die Hälfte der Paraffinöl-Lösung wird in eine 500 ml Nalgene-Flasche gegeben. Dann wird die Magnetit- Suspension zugegeben und die Mischung für 120 Sekunden unter Eiskühlung homogenisiert. Dann wird die andere Hälfte der Paraffinöl-Lösung unter Schutzgas in einen 1000 ml Dreihalskolben mit Rückflusskühler und KPG-Rührer gegeben. Es wird mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min begonnen, die auf 600 U/min gesteigert wird. Die Eigenoxid-Suspension wird zugegeben. Dann wird die Reaktionsmischung durch Spülen des Kolbens mit einem Schutzgas von Sauerstoff befreit. Die Reaktionstemperatur wird für eine Stunde auf 7O0C erhöht und dann über Nacht bei 8O0C gehalten. Am nächsten Tag wird die Mischung filtriert, mit Toluol, Aceton und Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen bei 5O0C getrocknet. Die so erhaltenen Partikel sind Carboxy-funktionalisiert, makroporös und haben einen Teilchendurchmesser von 10 bis 15 m.
Beispiel 4: Chemische Modifizierung poröser, magnetischer Polymerpartikel, mit Ni- Nitrilotriessigsäure
In einem 250 ml Rundkolben werden 5 g der porösen, magnetischen Polymerpartikel aus Beispiel 1 in 100 ml 0,5 M NatriumHydroxydlösung suspendiert. Dann werden 2 ml Epibromhydrin zugegeben und die Mischung bei 4O0C für 4 Stunden auf einem Rotavapor reagieren gelassen. Danach wird die Suspension über eine Glasabsaugungsvorrichtung filtriert und sechsmal mit entsalztem Wasser gewaschen. Dann wird der Rückstand in einen 250 ml Rundkolben überführt, in 100 ml einer 0,5 M Lösung aus -N,N'-Bis(carboxymethyl)-lysin (Synthese gemäß Doebeli et al., EP 0 253 303) suspendiert und über Nacht auf einem Rotavapor erhitzt. Danach wird die Mischung mittels Absaugung filtriert und viermal mit entsalztem Wasser gewaschen. Die magnetischen Partikel werden dann in 50 ml einer 2- %igen Nickelsulfatlösung suspendiert und für weitere drei Stunden gerührt. Danach werden die Partikel unter magnetischer Abtrennung dreimal mit Wasser gewaschen, erneut suspendiert und in 50 ml eines 100 mM Acetatpuffers, pH 6,0, mit 20% Ethanol, gelagert.
Beispiel 5: Chemische Modifikation poröser, magnetischer Polymerpartikel mit Ni- Nitrilotriessigsäure
4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 2 werden in 50 ml entsalztem Wasser in einem 250 ml Rundkolben suspendiert. Dann werden 2 g des -N,N'-Bis(carboxymethyl)-lysin-Liganden (Synthese beschrieben in Doebeli et al., EP 0 253 303) zugegeben und die Reaktionsmischung wird für zehn Stunden unter langsamem Rühren auf 6O0C erhitzt. Dann wird die Mischung viermal unter magnetischer Abtrennung mit entsalztem Wasser gewaschen. Die magnetischen Partikel werden dann in 50 ml einer 2-%igen Nickelsulfatlösung suspendiert und für weitere drei Stunden gerührt. Danach werden die Partikel dreimal unter magnetischer Abtrennung mit Wasser gewaschen, erneut suspendiert und in 50 ml eines 100 mM Acetatpuffers, pH 6,0, mit 20% Ethanol, gelagert.
Beispiel 6: Chemische Modifikation poröser, magnetischer Polymerpartikel mit Polyethylenimin 4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 3 werden in 50 ml einer 10-%igen hochmolekulargewichtigen Polyethyleniminlösung (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 40,872- 7) in Wasser, pH 10, suspendiert und in einen Rundkolben überführt. Dann werden 200 mg N-Hydroxy-Sulfosuccinimid-Natriumsalz (Sigma-Aldrich, Fluka Kat. Nr. 56485) und 200 mg N-3-Dimethylamino-N'-propyl-carbodiimid-Hydrochlorid (Sigma-Aldrich, Fluka Kat. Nr. 03449) zugegeben und für drei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Rotavapor gerührt. Dann wird die Mischung sechsmal mit entsalztem Wasser unter magnetischer Abtrennung gewaschen und wird letztlich in 50 ml entsalztem Wasser suspendiert.
Beispiel 7: Chemische Modifikation poröser, magnetischer Polymerpartikel mit Polyethylenimin
4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 2 werden in 50 ml einer 10-%igen hochmolekulargewichtigen Polyethyleniminlösung (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. 40,872- 7) in Wasser, pH 10, suspendiert und in einen Rundkolben überführt und unter Rühren für zehn Stunden auf 6O0C erhitzt. Dann wird die Mischung sechsmal mit entsalztem Wasser unter magnetischer Abtrennung gewaschen und letztlich in 50 ml entsalztem Wasser suspendiert.
Beispiel 8: Chemische Modifikation poröser, magnetischer Polymerpartikel mit Aminen
4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 3 werden in 50 ml einer 5-%igen Spermin-Lösung (Sigma-Aldrich, Fluka Kat. Nr. 85590), pH 10, suspendiert und in einen Rundkolben überführt. Dann werden 200 mg N-Hydroxy-Sulfosuccinimid-Natriumsalz (Sigma-Aldrich, s.o.) und 200 mg N-3-Dimethylamino-N'-propyl-carbodiimid-Hydrochlorid (Sigma-Aldrich, s.o.) zugegeben und für drei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Rotavapor gerührt. Die Mischung wird dann sechsmal mit entsalztem Wasser unter magnetischer Abtrennung gewaschen und letztendlich in 50 ml entsalztem Wasser suspendiert.
Beispiel 9: Chemische Modifikation poröser, magnetischer Polymerpartikel mit Aminen
4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 2 werden in 50 ml einer 5-%igen Spermin-Lösung (Sigma-Aldrich, s.o.), pH 10, in einen Rundkolben überführt und unter Rühren für zehn Stunden bei 6O0C gerührt. Dann wird die Mischung sechsmal mit entsalztem Wasser unter magnetischer Abtrennung gewaschen und letztlich in 50 ml entsalztem Wasser suspendiert.
Beispiel 10: Chemische Synthese poröser, Carboxy-funktionalisierter, magnetischer Polymerpartikel
4 g der Polymerpartikel aus Beispiel 2 werden in 50 ml einer 10-%igen 6-Aminohexansäure- Lösung (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. A4,460-6), pH 9,5, suspendiert, in einen Rundkolben überführt und für zehn Stunden unter Rühren auf 6O0C erhitzt. Die Mischung wird dann sechsmal mit entsalztem Wasser unter magnetischer Abtrennung gewaschen und letztlich in 50 ml entsalztem Wasser suspendiert.
Beispiel 11: Bindung von sekundären Antikörpern an die porösen, magnetischen Polymerpartikel
2g der magnetischen Polymerpartikel aus Beispiel 2 werden zu 50 ml einer 10-%igen Lösung von 1,6-Diaminohexan (Sigma-Aldrich, Aldrich Kat. Nr. Hl-1, 169-6) in 100 mM Natriumchlorid, pH 9,5 zugegeben und in einen 100 ml Rundkolben überführt. In einem nächsten Schritt werden 250 mg N-Hydroxysulfosuccinimid und 250 mg N-3- Dimethylamino-N'-propylcarbodiimid-Hydrochlorid zugegen. Dann wird der Kolben an einen Rotavapor überführt und die Reaktionsmischung für drei Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
Nach dem Abkühlen wird die Polymersuspension mit entsalztem Wasser dreimal unter magnetischer Abtrennung gewaschen. Die Perlen werden in 4 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und dann wird 1 ml einer 10 mg/ml Lösung von Sulfo-SMCC (erhältlich von Pierce, Rockford, IL, USA) in phosphatgepufferter Salzlösung zugegeben. Die Suspension wird direkt gevortext und dann für zwei Stunden auf einem End-Over-End- Schüttler reagieren gelassen. Das Reaktionsprodukt wird von dem Überstand durch magnetische Abtrennung abgetrennt und zweimal mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.0, gewaschen. Anschließend werden 1 ml einer Antikörper- Lösung (1 mg/mg Goat-Anti-Mouse IgG; Sigma-Aldrich, Sigma Kat. Nr. M 8642) und 1 ml phosphatgepufferte Salzlösung zugegeben und die Reaktionsmischung für zwei Stunden auf einem End-Over-End-Schüttler reagieren gelassen. Danach wird der Überstand durch magnetische Abtrennung von dem Produkt abgetrennt. Die magnetischen Partikel werden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und können bei -2O0C gelagert werden.
Beispiel 12: Bindung von sekundären Antikörpern auf poröse, magnetische Polymerpartikel
2 g der magnetischen Polymerpartikel aus Beispiel 3 werden zu 50 ml einer 10-%igen Lösung von 1,6-Diaminohexan (Sigma-Aldrich, s.o.) in 100 mM Natriumchlorid- Lösung, pH 9,5, gegeben und in einen 100 ml Rundkolben überführt. Dann wird der Kolben an einen Rotavapor überführt und die Reaktionsmischung für zehn Stunden bei 7O0C reagieren gelassen. Nach dem Abkühlen wird die Polymersuspension mit entsalztem Wasser dreimal unter magnetischer Abtrennung gewaschen. Die Perlen werden dann in 4 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und 1 ml einer lOmg/ml Lösung von Sulfo- SMCC in phospatgepufferter Salzlösung zugegeben. Die Suspension wird direkt gevortext und wird dann für zwei Stunden auf einem End- O ver-End- Schüttler reagieren gelassen. Das Reaktionsprodukt wird von dem Überstand mittels magnetischer Abtrennung abgetrennt und zweimal mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Nun wird 1 ml einer Antikörperlösung (lmg/mg, sek. Goat-Anti-Mouse) und 1 ml gepufferte Salzlösung zugegeben und die Mischung für zwei Stunden auf einem End-Over-End-Schüttler reagieren gelassen. Danach wird der Überstand durch magnetische Abscheidung von dem Produkt entfernt. Die magnetischen Partikel werden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und können bei -2O0C gelagert werden.
Beispiel 13: Proteinaufreinigung mit Ni-NTA modifizierten, porösen, magnetischen Polymerpartikeln (denaturierende Bedingungen)
5 ml Zellkultur- Pellets (Plasmid pQE 16 in E Coli, Transformation und Produktion rekombinanter Proteine werden in„The Qiaexpressionist", 3rd Edition, QIAGEN GmbH, Hilden, 1997, beschrieben) werden in 1 ml Lysepuffer (6M Guanidin HCl, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris x HCl, 0,05 % Tween® 20, pH 8,0) durch auf- und abpipettieren und schütteln des Rohres für eine Stunde bei Raumtemperatur resuspendiert. Dann wird das Lysat durch Zentrifugieren bei 10.000 g für 30 Minuten geklärt und der Überstand in ein anderes Röhrchen überführt. 5 mg der porösen, magnetischen Polymerperlen aus Beispiel 4 oder 5 werden in ein zweites Röhrchen gegeben und 500 1 der geklärten Lysatlösung werden zugegeben. Die Suspension wird für 30 Minuten auf einem End-Over-End-Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Röhrchen auf einem geeigneten Magnetscheider platziert und der Überstand wird durch Pipettieren entfernt. Im nächsten Schritt werden 500 1 Waschpuffer (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris x HCl, 0,05 % Tween® 20, pH 6,3, zugegeben), das Röhrchen für eine Minute auf einem Magnetscheider platziert und der Überstand durch Pipettieren entfernt. Dieser Waschschritt wird einmal mit Waschpuffer wiederholt. Dann werden 100 1 Elutionspuffer (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris x HCl, 0,05 % Tween® 20, pH 4,5) zugegeben, die Suspension für eine Minute auf einem End-Over-End-Schüttler inkubiert, das Röhrchen für eine Minute auf einem Magnetscheider platziert und das Eluat gesammelt. Der Elutions schritt wird wiederholt und die Eluate werden gesammelt. Die Protein-Bindungskapazität, bestimmt mit Bradford-Assay, beträgt in etwa 10 g/g magnetischer Partikel.
Beispiel 14: Konzentration von Viren mit Polyethylenimin-modifizierten, porösen, magnetischen Polymerperlen
1 ml Virusplasma wird in ein 2 ml Eppendorff-Röhrchen gegeben. Dann werden 200 1 einer Suspension von Polyethylenimin-modifizierten Partikeln aus Beispiel 5 in einer Konzentration von 10 mg/ml in 200 1 RNase-freiem Wasser zugegeben. Die Mischung wird gevortext, anschließend wird 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 2 Sekunden bei 2.000 U/min zentrifugiert, um Rückstände von Partikeln am oberen Ende der Röhrchen zu entfernen. Anschließend werden die Partikel innerhalb von fünf Minuten magnetisch abgetrennt. Der Überstand wird verworfen, ohne Partikel mit zu entnehmen. Anschließend werden 13,2 ml des Puffers„AL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19075) mit 82,9 1 Quantifizierungsstandard (für COBAS TaqMan, Roche) und Träger- RNA (in QIAamp® MinElute Vacuum Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 57714) mit 75 1 Proteaselösung (in QIAamp® MinElute Kit) und 7 ml Resuspensionspuffer (in QIAamp® MinElute Kit) gemischt.
15 1 Enzymlösung (Smitest Solution I, JSR Corporation, Ibaraki, Japan), 380 1 Proben Verdünner (Smitest Solution II), und 5 1 Fällungsmittel (Smitest Solution IV) werden zugegeben. Direkt nach der Zugabe der Smitest-Lösungen wird gevortext, um die Probe zu mischen. Anschließend wird für 30 Minuten bei 550C inkubiert und es folgt ein kurzer Zentrifugierschritt bei 2.000 U/min. Die Partikel werden durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Suspension der Partikel wird auf einen Ultrafree MC-Filter (Millipore Corporation) gegeben, das Röhrchen verschlossen und der Schanierbereich mit einer Schere durchgeschnitten. Anschließend wird eine Filtrationsvorrichtung in ein 2 ml Eppendorff-Röhrchen gegeben. Es wird drei Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert. Die Filtrationsvorrichtung wird entfernt und verworfen. Anschließend werden 250 1 einer Smitest Solution III (zur Proteinlösung), die Qualitäts Standard aus der RT und cRNA (carrier RNA / Roche Diagnostics) enthält, zugegeben. Es wird sofort gevortext und für 15 Minuten bei 550C inkubiert. Dann werden 600 1 Isopropanol zugegeben und durch 20-faches auf den Kopf drehen des Röhrchens gemischt. Anschließend wird 15 Minuten auf Eis inkubiert, dann 10 Minuten bei 40C mit 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig ohne Resuspendierung der Partikel entfernt. Es werden 500 1 70-%iges Ethanol zugegeben und durch dreifaches auf den Kopf Drehen des Röhrchens gemischt. Es wird für drei Minuten bei 40C bei 12.000 U/min zentrifugiert und anschließend 500 1 70-%iges Ethanol zugegeben und erneut durch dreifaches auf den Kopf drehen des Röhrchens gemischt. Wieder wird für drei Minuten bei 40C bei 12.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und verworfen. Anschließend wird für zehn Sekunden bei 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Partikel werden für zehn Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Die Partikel werden in 60 1 RNase-freiem Wasser resuspendiert und für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Thermomixer geschüttelt. 50 1 des Eluats werden mit 50 1 Master-Mischung der COBAS TaqMan (Roche) vereinigt und mit Realtime-PCR untersucht. Mit dieser Vorgehensweise kann man eine Reduzierung des CT- Werts im Vergleich zu nicht- aufkonzentriertem Serum, das mit MinElute aufgereinigt wurde, feststellen.
Beispiel 15: Nukleinsäureaufreinigung mit Amino-modifizierten, porösen magnetischen Polymerpartikeln
In einem 1,5 ml Eppendorff-Röhrchen werden 10 1 einer 1 mg/ml Lösung des Standardplasmids pUC 21 zu 300 1 10OmM Ammoniumacetat, pH 5,5 und 20 1 einer 100 mg/ml Suspension von Amino-modifizierten, porösen magnetischen Polymerpartikeln aus Beispiel 7 oder 8 zugegeben. Die Lösung wird gründlich durch Impuls -Wirbelung für zehn Sekunden gemischt und die DNA-Anbindung wird durch Schütteln der Röhrchen für 5 Minuten bei 1100 U/min in einem Eppendorff- Thermomixer unterstützt. Die Partikel werden von dem Überstand durch magnetische Abtrennung in einem Mikrorohr-Magnetscheider bzw. Magnetseparator, zum Beispiel einem 12-fach-Magnetsepatator (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 36912), abgetrennt und der Überstand wird verworfen. Dann werden 500 1 zweifach destilliertes Wasser zugegeben und das Röhrchen wird für zehn Sekunden impulsgevortext. Dann werden die Partikel durch magnetische Abtrennung von dem Überstand entfernt und der Überstand wird verworfen. Diese Waschabfolge wird wiederholt und der Überstand wird erneut nach der magnetischen Abtrennung verworfen. Dann werden die Partikel in 50 1„TE"-Puffer (10 mM Tris/Cl; pH 8,0, 1 mM EDTA) mit 0,1 % SDS (Natrium-dodecylsulfat, Sigma-Aldrich, Fluka Kat. Nr. 71725) suspendiert und die Suspension wird für zehn Sekunden gründlich mittels Impuls -Wirbelung gemischt. Dann wird das Röhrchen auf einen Magnetscheider platziert und der Überstand wird in ein zweites Eppendorff-Röhrchen überführt. Nach der Aufreinigung kann der DNA-Gehalt der Eluate durch OD32o-Messungen und durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese bestimmt werden. Alternativ dazu kann die DNA durch einen Puffer mit hohem Salzgehalt (zum Beispiel 1,25 ml NaCl; 50 mM MOPS, pH 8,5, 15 % Isopropanol) eluiert werden, sie muss aber anschließend ausgefällt werden, um die Verwendung in nachfolgenden biochemischen Reaktionen zu ermöglichen.
Beispiel 16: Bindung von primären Antikörpern an mit sekundären Antikörpern modifizierten, porösen magnetischen Polymerpartikeln
3,4 x 105/ml humane CD3+ und 4,2 x 105/ml CD3- Suspensionszellen werden in einer Lösung enthaltend 10 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl (pH 7,5) und 10 % eines Fetal CaIf Serums (FCS) zusammengemischt. Dann werden 3,32 x 106 Zellen pro Experiment verwendet. Die Mischung wird mit CD3-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mouse anti human CD3 PerCP / Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland, Kat. Nr. 555330) für 30 Minuten ohne Schütteln inkubiert. Danach wird 1 ml phosphatgepufferte Salzlösung (10 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl / pH 7,5) zugegeben und die Mischung bei 1.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird durch Pipettieren entfernt und die Partikel in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. Dann werden 200 1 einer 25 mg/ml- Suspension von magnetischen Partikeln, die mit sekundären Antikörpern (goat anti mouse IgG) gemäß Beispiel 11 oder 12 funktionalisiert wurden, zugegeben. Die Partikel werden für 20 Minuten inkubiert und durch gelegentliches Schütteln gemischt. Im nächsten Schritt wird das Röhrchen auf einem Magnetscheider platziert und der Überstand in ein zweites Röhrchen überführt. Anschließend werden in einem weiteren Schritt 20 1 mouse anti human CD3 PerCP zugegeben und für 15 Minuten inkubiert, gewaschen und durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysiert. Die Auswertung der Aufnahmen zeigte a) nicht angefärbte Zellen,
b) CD3 PerCP angefärbte und nicht abgetrennte Zellmischungen,
c) Zellen, die mit trennendem Antikörper inkubiert wurden, gefolgt von Inkubation mit anfärbendem Antikörper (CD3 PerCP) und
d) magnetisch abgetrennte Zellen, die mit CD3 Per CP gefärbt waren.
Die FACS-Ergebnisse zeigten eine Abreicherung von CD3 exprimierenden Jurkat-Zellen um zumindest 85 % von 39,3 auf 5,44 %.
Beispiel 17: Nukleinsäure-Aufreinigung mit Carboxylat-modifizierten, porösen, magnetischen Polymerpartikel (Gelextraktion)
Ein 200 mg Gelfragment enthaltend 1 g DNA wird zu 400 1 Puffer„QX1" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 20912) gegeben und gründlich für fünf Sekunden durch impulsvortexen gemischt. Dann werden 50 1 einer 50 mg/ml Suspension von Carboxylat- modifizierten, porösen magnetischen Polymerpartikel gemäß Beispiel 3 oder 10 zugegeben und die Mischung durch erneutes impulsvortexen gemischt. Danach wird die Mischung für fünf Minuten auf einem Heizblock auf 5O0C erhitzt und nochmals für 10 Sekunden durch impulsvortexen gemischt. Dann werden die Partikel durch magnetische Abtrennung von dem Überstand abgetrennt und der Überstand wird verworfen. Im nächsten Schritt werden 500 1 des Puffers„QX1" zugegeben und die Suspension wird gründlich durch impulsvortexen für fünf Sekunden gemischt. Dann wird der Abtrennungsschritt wiederholt und der Überstand wird erneut verworfen. Danach folgen zwei Waschschritte mit dem Puffer„PE" (QIAGEN GmbH; Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19065) und die jeweiligen Überstände werden verworfen. Dann werden die Partikel einfach durch Umdrehen der Röhrchen für 10 Minuten getrocknet, ohne dass dabei der Magnetscheider entfernt wird. Nach dem Trocknungsschritt werden 100 1 des Puffers„EB" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19068) zugegeben und die Suspension wird für 15 Sekunden durch impulsvortexen gemischt. Der Überstand wird von den Partikel mittels eines Magnetscheiders abgetrennt und in ein anderes Röhrchen überführt. Der Elutions schritt wird wiederholt, die Eluate gesammelt und durch kurze impulsvortexen homogenisiert. Mittels Gelelektrophorese und OD-Messungen kann man die Reinheit und Menge der aufgereinigten DNA bestimmen.

Claims

Patentansprüche
1. Magnetische Polymerpartikel, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen
Partikel in eine Polyacrylat- oder Poly[(alkylacrylat)]matrix eingebettet sind, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Polymerpartikel einen maximalen Porenradius in einem Bereich von 20 bis 500 nm aufweisen.
2. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein maximalen Porenradius in einem Bereich von 30 bis 400 nm aufweisen.
3. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein maximalen Porenradius in einem Bereich von 80 bis 250 nm aufweisen.
4. Magnetische Polymerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass sie eine mittlere Partikelgröße in einem Bereich von 5 bis 25 μm aufweisen.
5. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine mittlere Partikelgröße in einem Bereich von 6 bis 20 μm aufweisen.
6. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine mittlere Partikelgröße in einem Bereich von 10 bis 15 μm aufweisen.
7. Magnetische Polymerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass sie ein ferromagnetisches, ferrimagnetisches und/oder superparamagnetischen Verhalten zeigen.
8. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 7, wobei die magnetischen Partikel
ferromagnetische und/oder ferrimagnetische Partikel aus der Gruppe bestehend aus γ- Fe2O3 (Maghemit), Cr2O3
9. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 8, wobei die magnetischen Partikel ferro- oder ferrimagnetischen Partikel ausgesucht sind aus der Gruppe Ferrite, vom Typ (M2+O)Fe2O3, wobei das M2+ ein divalentes Übergangsmetallkation darstellt.
10. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Material Fe3O4 (Magnetit) ist.
11. Magnetische Polymerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Cross-Linker (Vernetzer) zwischen 1 - 95 Gew.-%, einen Gehalt an funktionalisiertem Polymer zwischen 1 - 99 Gew.-%, und einen Gehalt an magnetischem Material zwischen 1 -95 Gew.-% aufweisen.
12. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Cross-Linker (Vernetzer) zwischen 10 - 80 Gew.-%, einen Gehalt an funktionalisiertem Polymer zwischen 10 - 80 Gew.-%, und einen Gehalt an magnetischem Material zwischen 10 - 80 Gew.-% aufweisen.
13. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Cross-Linker (Vernetzer) zwischen 20 -70 Gew.-%, einen Gehalt an funktionalisiertem Polymer zwischen 20 - 70 Gew.-%, und einen Gehalt an magnetischem Material zwischen 20 -70 Gew.-% aufweisen.
14. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Cross-Linker (Vernetzer) zwischen 15 - 40 Gew.-%, einen Gehalt an funktionalisiertem Polymer zwischen 30 - 60 Gew.-%, und einen Gehalt an magnetischem Material zwischen 30 - 60 Gew.-% aufweisen.
15. Magnetische Polymerpartikel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetischen, ferrimagnetischen und/oder
superparamagnetischen Partikel in eine vernetzte Polyacrylat- oder
Poly[alkylacrylat]matrix eingebettet sind, die funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I)
-C(=O)-M-R (I) aufweist, worin M -O-, -NH- oder -N(C1-C6-AIkJrI)-;
R Wasserstoff oder eine Gruppe YX, in der
Y eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2_CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder - CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-
-[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2]„- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6Hi0]-CH2-, wobei A und B unabhängig voneinander -NH-, -N(Ci-C6- Alkyl)- oder -O- und a eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sowie b eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8;
X Wasserstoff, -OH, -O-Ci-C6-Alkyl, -O-C6-C10-Aryl, -0-C7-C14-
Alkylaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und einem C6-Ci2- Aryl-Rest;
-Ci-C6- Alkyl, -C6-Ci2- Aryl, Heteroaryl, einen über ggf. über eine -Ci-C6-Alkylengruppe gebundenen Imidazolylrest;
Cγ-Cu-Alkylaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und einem C6-Ci2- Aryl-Rest; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000046_0001
in der
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander
Wasserstoff, Ci-C6- Alkyl und/oder C6-CiO- Aryl;
-CN, -NC5 -N3;
-C(=O)-R4 und R4 Wasserstoff, OH, CrC6-Alkyl, -O-CrC6- Alkyl, C6-Ci0- Aryl oder -0-C6-Ci2- Aryl;
-NH2, -NHR5 und R5 Wasserstoff, Ci-C6- Alkyl und/oder C6-Ci0- Aryl;
F, Cl, Br oder I; -SH oder -S-S-H; 2-Thiopyridyl oder 4-Thiopyridyl; -S(=O)-CH2-CF3:
Acyl-Imidazol-, Maleinimido- oder Azlactongruppen; oder eine Gruppe Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]O- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2]S- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=O)-[cyclo-C6Hi0]-CH2-, wobei A und B unabhängig voneinander -NH-, -N(Ci-C6- Alkyl)- oder -O- und a eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sowie b eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=0)-[cyclo-C6Hio]-CH2-, worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X' eine Einfachbindung;
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-,
-CH(OH)-CH2-N(Ci-C6-Alkyl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=0)NH-, -
C(=O)N(Ci-C6-Alkyl)-;
-CR1R^R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH- oder -N (Ci-C6- Alkyl)-;
L -C(=O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2 und u sowie v unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)w-C(=0)0H und w eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6;
einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog low molecular weight, high molecular weight oder linearen Polyethyleniminrest vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von 500 bis 200.000 Da, einen Aminorest, vorzugsweise einen
Polyaminrest, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, 1,4- Bis(3-aminopropyl)-piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperazin,
l-(2-Aminoethyl)piperidin, l,4,10,13-Tetraoxa-7,16- diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide oder Streptavidin, IDA, DEO, TED oder
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")]
bedeuten können.
16. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O-, -NH- oder -N (CrC6-Alkyl)-; R Wasserstoff oder eine Gruppe -YX, in der
Y eine Alkylengruppe -(CH2X- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe
-[CH2- CH(0H)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder
4;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)- -[CH2- CH(0H)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2] n- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder
4;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=0)-[cyclo-C6Hio]-CH2-, worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X Wasserstoff, -OH, -O-Ci-C4-Alkyl, -0-C6-C10-ATyI, -0-C7-C14-
Alkylaryl mit einer Alkylenkette bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen und einem C6-Ci2- Aryl-Rest; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000049_0001
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander
Wasserstoff, C1-C3-AIkJrI;
-NH2, -NHR5 und R5 Wasserstoff, Ci-C4- Alkyl;
F, Cl oder Br;
-CN, -NC,
-SH oder -S-S-H;
2-Thiopyridyl oder 4-Thiopyridyl;
-S(=O)-CH2-CF3 (Tresyl):
Acyl-Imidazol, Maleinimido- oder Azlactongruppen; oder R eine Gruppe -Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1,2,3,4,5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]O- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-;
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(=0)-[cyclo-C6Hio]-CH2-, worin A und B -NH-, a eine ganze Zahl 1 oder 2, und b 6;
X' eine Einfachbindung,
--CCRR11RR^^RR33CCHH--OO--,, --CO-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-, -CH(OH)-CH2-, -N(Ci-C3-AIkVl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=0)NH-, -
-C(=O)N(Ci-C3-Alkyl)-;
-CR1R^R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH- oder -N (CrC3-Alkyl)-;
L -C(=O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2 und u sowie v unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4;
-(CH2)w-C(=0)0H und w eine ganze Zahl 1,2,3 oder 4; einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen
Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog„low molecular weight",„high molecular weight" oder linearen
Polyethyleniminrest vorzugswese mit einem Molekulargewicht von 500 bis 200.000 Da, einen Polyaminrest, Spermidin, Cadaverin,
Diethylentriamin, Spermin, l,4-Bis(3-aminopropyl)-piperazin, l-(2- Aminoethyl)piperazin, 1 -(2- Aminoethyl)piperidin, 1,4,10, 13-Tetraoxa- 7,16-diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide oder Streptavidin, IDA, DEO, TED oder
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")]
bedeuten können.
17. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O- oder -NH-; R Wasserstoff oder eine Gruppe YX, in der
Y eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2X- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe:
-[CH2- CH(0H)-CH2]g- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2; CH2-CH2CH(OH)- und/oder -CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-; -[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2]„-
Wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X Wasserstoff, -OH, -O-Ci-C4-Alkyl oder -O-C6-C10-Aryl, -; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000052_0001
R1, R I22 uunndd RR33 uunnaabbhhäännggiigg vvoorneinander
Wasserstoff oder Q-C2- Alkyl;
-NH2;
Cl oder Br;
-S(=O)-CH2-CF3; oder
R eine Gruppe Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2 oder 3; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe
-[CH2- CH(OH)-CH2L- und/oder -[ CH2_CH(CH2OH)-]O- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
-[ CH2-CH2CH(OH)]- oder
-[CH2- CH(0H)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2; X' eine Einfachbindung,
-CR1R^R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-CH(OH)-CH2-O-, -CH(OH)-CH2-S-, -CH(OH)-CH2-NH-,
-CH(OH)-CH2-N(Ci-C3-Alkyl)-, -O-, -C(=0)0-, -C(=O)NH-, -
C(=O)N(Ci-C3-Alkyl)-;
-NH-;
L einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen
Nitrilotriessigsäurerest über sein ε-N gebunden, einen sog low molecular weight, high molecular weight oder linearen
Polyethyleniminrest vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von 500 bis 200.000 Da, Spermidin, Cadaverin, Diethylentriamin, Spermin, l,4-Bis(3-aminopropyl)-piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperazin, l-(2-Aminoethyl)piperidin, l,4,10,13-Tetraoxa-7,16- diazacyclooctadecan, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, vorzugsweise einen sekundären Antikörper, Proteine, Biotin, Oligonukleotide oder Streptavidin
-C(=O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)u]v-NH2 und u 2 sowie v 2; -(CH2)W-C(=O)OH und w eine ganze Zahl 1 oder 2; NTA, IDA, TED oder -CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")]
bedeuten können.
18. Magnetische Polymerpartikel nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie funktionelle Gruppen der allgemeinen Formel (I) aufweisen, worin
M -O- oder -NH-; R Wasserstoff oder eine Gruppe YX, in der
Y eine Alkylengruppe -(CH2)I- und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6; eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]g- und/oder -[ CH2_CH(CH2OH)-]h- wobei g sowie h unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
-CH2-CH2CH(OH)- ;
-[CH2- CH(OH)]m- und/oder -[CH(OH)-CH2] n- wobei m sowie n unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X Wasserstoff; einen Substituenten der allgemeinen Formel
Figure imgf000054_0001
R1, R2 und R3 Wasserstoff;
-NH2;
oder eine Gruppe Y'X'L, in der
Y' eine Einfachbindung; eine Alkylengruppe -(CH2)q- und q eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, oder 6;
eine Hydroxy-substituierte Alkylengruppe vom Typ:
-[CH2- CH(OH)-CH2]!- und/oder -[ CH2-CH(CH2OH)-]O- wobei i sowie o unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
-CH2-CH2CH(OH)- oder
-[CH2- CH(OH)]r- und/oder -[CH(OH)-CH2] s- wobei r sowie s unabhängig voneinander eine ganze Zahl 1 oder 2;
X' eine Einfachbindung,
-CH(OH)-CH2-O- oder -CH2-CH(OH)-O-,
-CR1R^R3CH-O-, -O-CR^-CHR3- worin R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben;
-NH-;
L einen drei-, vier- oder fünfzähnigen Chelatbildner, wie z.B. einen
Nitrilotriessigsäurerest, einen Polyethyleniminrest, einen Aminorest, vorzugsweise einen Polyaminrest, einen Carboxylsäurerest, oder einen gebundenen Antikörper, Proteine, Biotin, Oliginukleotide, Spermin oder Streptavidin, einen sekundären Antikörper
-C(=O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)U]V-NH2 worin u 1 oder 2 sowie v 2;
-(CH2)w-C(=0)0H und w eine ganze Zahl 1 oder 2;
NTA, IDA/DEO, TED oder
-CH2-CH2-N -(CH2COO") [CH(COO )CH2COO")] ;
bedeuten können.
19. Magnetische Polymerpartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Polymermatrix mit einem Di- oder Polyacrylat oder einem Di- oder Polyalkylacrylat vernetzt ist.
20. Magnetische Polymerpartikel gemäß Anspruch 19, wobei der Vernetzer ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykolacrylaten, Ethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Ethylenglykolmethacrylaten, Polyethylenglykolacrylaten,
Polyethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Polyethylenglykolmethacrylaten oder Ethylenglykolacrylaten, Ethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere
Ethylenglykolmethacrylaten, Polyethylenglykolacrylaten,
Polyethylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Polyethylenglykolmethacrylaten Pentaerythritoltetraacrylaten und Pentaerythritoltriacrylaten oder
Propylenglykolacrylaten, Propylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere
Propylenglykolmethacrylaten, Polypropylenglykolacrylaten,
Polypropylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Polypropylenglykolmethacrylaten oder Propylenglykolacrylaten, Propylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere
Propylenglykolmethacrylaten, Polypropylenglykolacrylaten,
Polypropylenglykol(alkyl)acrylaten, insbesondere Polypropylenglykolmethacrylaten.
21. Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel umfassend die Schritte: a) Herstellung einer Dispersion von magnetischen Partikeln, die ausgesucht sind aus ferromagnetischen, ferrimagnetischen oder superparamagnetischen
Partikeln, in einer ersten organischen Phase, wobei die erste organische Phase zumindest
a.l.) ein oder mehrere Acrylatmonomer(e) ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, oder Acrylaten und Methacrylaten, die substituierte Carboxylgruppen vom Typ -C(=O)-O- Y-X aufweisen, wobei Y eine Spacergruppe und X eine reaktive Gruppe darstellen,
a.2.) zumindest einen Vernetzer, der zwei oder mehr Acrylat- oder (Alkyl)acrylatgruppen umfasst,
a.3.) zumindest einen lipophilen Radikalstarter, und
a.4.) zumindest einen organischen Porenbildner umfasst
b) Homogenisierung der Dispersion und einer zweiten organischen Phase unter Ausbildung einer Emulsion, wobei die zweite organische Phase bl) zumindest eine flüssige hydrophobe Verbindung und
b2) zumindest eine oberflächenaktive Substanz umfasst,
und
c) radikalische Polymerisation der Emulsion, wobei die so erhaltenen magnetischen Polymerpartikel eine mittlere Partikelgröße vorzugsweise im Bereich von 5 bis 25 μm, besonders bevorzugt im Bereich von 6 bis 20 μm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 10 bis 15 μm sowie einen maximalen Porenradius vorzugsweise im Bereich von 20 bis 500 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 30 bis 400 nm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 80 bis 250 nm aufweisen.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Emulsion vor der radikalischen Polymerisation mit einem Inertgas gespült wird und die radikalische Polymerisation in einer Inertgasatmosphäre durchgeführt wird.
23. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei die magnetischen Partikel vor oder während Herstellung der Dispersion gemahlen und/oder deagglomeriert werden.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die radikalische Polymerisation bei einer Temperatur zwischen 5O0C und 12O0C durchgeführt wird.
25. Verfahren gemäß einem Anspruch 24, wobei die radikalische Polymerisation bei einer Temperatur zwischen 6O0C und 9O0C durchgeführt wird.
26. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Monomer in der ersten organischen Phase eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel II ist:
H2C=CR' -C(=O)-OR (II) wobei R H- oder ein Ci-C3-AIkVl ist, und
R Wasserstoff oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -Y-X gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 darstellt
und
X bevorzugt ausgesucht ist aus der Gruppe umfassend -OH, -
NH2, -C(=O)OH, HaI-, Tresyl-, Maleinimido- und
Epoxygruppen.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei der Spacer Y eine -(CH2)i- Gruppe und 1 eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei das Monomer in der ersten organischen Phase ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Glycidlymethacrylat, (2-Hydroxyethyl)methacrylat, Methacrylsäure und Acrylsäure sowie Acrylsäurederivaten der allgemeinen Formel (III)
H2C=CR' C(=O)O-(CH2)CZ (III)
wobei
R1 H oder Methyl ist;
c = eine ganze Zahlt 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist;
Z ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend -OH, -NH2, -C(=O)OH, Halogen-, Tresyl-, Maleinimido- und Epoxygruppen.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei der Vernetzer zumindest ein Alkylidenglykoldiacrylat oder Alkylidenglykol(alkyl)acrylat der allgemeinen Formel (IV) ist:
H2C=CR"C(=O)O-[(CdH2dO)]e(C=O)CR'"=CH2 (IV) wobei in allgemeinen Formel (IV) R und R'" unabhängig voneinander H oder ein C1- C3-Alkyl sind und vorzugsweise R und R beide H oder Methyl sind, d eine ganze Zahl 1, 2, 3 oder 4 - , vorzugsweise 1 oder 2 ist und e eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 - bevorzugt eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 und besonders bevorzugt eine ganze Zahl 1, 2, 3, oder 4 ist.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass d eine ganze Zahl 1 oder 2 und e eine ganze Zahl 1,2, 3, 4 ist.
31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer Ethylenglykoldiacrylat oder Ethylenglykoldimethacrylat oder eine Mischung daraus ist.
32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer ein Polyacrylat oder Polymethacrylat mit zumindest zwei Acryl- bzw. Methacrylgruppen ist.
33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 Ibis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer ein Polyacrylat oder ein Polymethacrylat mit 3 oder 4 Acryl- bzw. Methacrylgruppen ist.
34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, Pentaerythritoltetraacrylat, Pentaerythritoltetramethacrylat, Pentaerythritoltriacrylat und Pentaerythritoltrimethacrylat oder Mischungen daraus.
35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 34, wobei der organische Porenbildner ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus
a) aliphatischen, verzweigten oder unverzweigten Alkoholen mit 4 bis 20-C-Atomen, bevorzugt 4 bis 16-C- Atomen und besonders bevorzugt 4 bis 8-C-Atomen mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, bevorzugt 1, 2 oder3 Hydroxygruppen oder b) Alkylidenglykolen, insbesondere Ethylenglykol und
c) polymeren Verbindungen, deren massengemittelte Molekülmasse Mw zwischen 200 und 100000 g/mol liegt und die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylidenglycolderivaten, Polyethylenimin, Polyvinylpyrollidon und Polystyrol.
36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 35, wobei der lipophile Radikalstarter ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Azoisobutyronitril (AIBN), 2,2'- Azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid, 2,2' -Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), und 1,1' - Azobis(cyclohexan- 1 -carbonitril) .
37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 35, wobei die hydrophobe Flüssigkeit ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen oder cyclischen Alkanen, insbesondere aliphatischen Alkanen der allgemeinen Formel C2H2n+2, wobei n > 6 ist, aliphatischen und cyclischen Alkenen, insbesondere aliphatischen Alkenen der allgemeinen Formel C2H2n, wobei n > 6 ist.
38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 35, wobei die hydrophobe Flüssigkeit eine aromatische oder heteroaromatische Verbindung ist, die mit Alkyl- oder Alkengruppen substituiert sein kann.
39. Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei die hydrophobe Flüssigkeit Toluol ist.
40. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 39, wobei die oberflächenaktive Substanz ein Emulgator ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus kationischen, anionischen und nicht-ionischen-Emulgatoren ist.
41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 40, wobei die magnetischen Partikel ferromagnetische und/oder ferrimagnetische Partikel sind.
42. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus 7-Fe2O3 (Maghemit), Cr2O3 sowie Ferriten.
43. Verfahren gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Ferrit (M2+O)Fe2O3 ist, wobei das M2+ ein divalentes Übergangsmetallkation darstellt.
44. Verfahren gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel vorzugsweise Fe3O4 (Magnetit) sind.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer (Cross-Linker) in einem Verhältnis von 0,1 - 20 Gew.-% eingesetzt wird.
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer (Cross- Linker) in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 Gew.-%, eingesetzt wird.
47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer (Cross- Linker) in einem Verhältnis von 1 bis 4 Gew.-%, eingesetzt wird.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionalisierte Monomer in einem Verhältnis von 0,1 bis 20 Gew.-% eingesetzt wird.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionalisierte Monomer in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 Gew.-% eingesetzt wird.
50. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionalisierte Monomer in einem Verhältnis bevorzugt 1 bis 4 Gew.-% eingesetzt wird.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Material in einem Verhältnis von 0,1 bis 20 Gew.-% eingesetzt wird.
52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Material in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 Gew.-% eingesetzt wird.
53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Material in einem Verhältnis von 1 bis 4 Gew.-%, eingesetzt wird.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass das der Initiator in einem Verhältnis von 0 bis 5 Gew.-% eingesetzt wird.
55. Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator in einem Verhältnis von 0,01 bis 3 Gew. -% eingesetzt wird.
56. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator in einem Verhältnis von 0,05 bis 0,5 Gew.-% eingesetzt wird.
57. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in einem Verhältnis von 0 bis 20 Gew.-% eingesetzt wird.
58. Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in einem Verhältnis von 0,1 bis 10 Gew.-% eingesetzt wird.
59. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in einem Verhältnis von 0,1 bis 3 Gew.-% eingesetzt wird.
60. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 59, dadurch gekennzeichnet, dass das Porogen in einem Verhältnis von 0,1 bis 20 Gew.-% eingesetzt wird.
61. Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, dass das Porogen in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 Gew.-% eingesetzt wird.
62. Verfahren nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass das Porogen in einem Verhältnis von 1 bis 4 Gew.-% eingesetzt wird.
63. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 62, des Weiteren umfassend den Schritt d) Funktionalisierung der magnetischen Polymerpartikel durch Bindung eines Liganden, der vorzugsweise Biomoleküle immobilisieren kann, an das magnetische Polymer.
64. Verfahren gemäß Anspruch 63, wobei zur Bindung des Liganden in einem ersten Schritt dl) eine Spacerverbindung mit zumindest zwei reaktiven Gruppen an die Carboxylgruppen der magnetischen Polymerpartikel kovalent gebunden wird und dann in einem zweiten Schritt d2) der Ligand, an die magnetischen Polymerpartikel immobilisieren kann, gebunden wird.
65. Verfahren zur Isolierung und/oder Analyse zumindest einer Biomolekül-Spezies aus einer Biomoleküle enthaltenden Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer zumindest eine Biomolekül-Spezies enthaltende Probe, b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit magnetischen Polymerpartikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, unter Bedingungen, bei denen die zumindest eine Biomolekül- Spezies an die magnetischen Polymerpartikel bindet,
c) Abtrennung der magnetischen Polymerpartikel mit den gebundenen Biomolekülen unter Verwendung zumindest eines Magnetfeldes.
66. Verfahren gemäß Anspruch 65, wobei das Verfahren den weiteren Schritt umfasst: d) Eluieren der zumindest einen Biomolekül-Spezies von den magnetischen Polymerpartikeln.
67. Verfahren gemäß Anspruch 65 oder 66, wobei die zumindest eine Biomolekül-Spezies ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Oligonukleotiden Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, sowie deren Kombinationen, und insbesondere ausgesucht ist aus Nukleinsäuren und Oligonukleotiden, vorzugsweise Plasmid-DNA, genomischer DNA, cDNA, PCR- DNA, linearer DNA, RNA, Ribozymen, Aptameren, und chemisch synthetisierten oder modifizierten Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden.
68. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 65 bis 67, wobei die die zumindest eine Biomolekül-Spezies enthaltende Probe ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Gewebe, Zellen, pflanzlichen Materialien oder Amplifikationslösungen wie PCR-Lösungen.
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