WO2007062443A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der relevanz von probenarray-präparaten - Google Patents

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WO2007062443A1
WO2007062443A1 PCT/AT2006/000492 AT2006000492W WO2007062443A1 WO 2007062443 A1 WO2007062443 A1 WO 2007062443A1 AT 2006000492 W AT2006000492 W AT 2006000492W WO 2007062443 A1 WO2007062443 A1 WO 2007062443A1
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Gabor MÉHES
Wolfgang Schmidt
Christopher Wrighton
Kurt Zatloukal
Harald ZÖBL
Peter Hecht
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3Dhistech Kft.
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    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the relevance of preparations of sample arrays, in particular tissue sample arrays, containing a large number of individual samples at different positions.
  • the invention relates to a device for determining the relevance of preparations of sample arrays, in particular tissue sample arrays, containing a plurality of individual samples at different positions.
  • Tissue microarrays Tissue microarrays
  • tissue sample arrays are increasingly being supplied with automatic analyzes in order to obtain important information as quickly as possible, in particular for diagnostic or therapeutic purposes.
  • US 2003/0215936 A1 describes a method and an apparatus for the fastest possible and efficient examination of such tissue sample arrays.
  • tissue sample arrays containing a plurality of individual samples.
  • combinations of different tissues of different origin are also used. fertil of the present invention in question.
  • material extracted from tissue such as proteins and nucleic acids, which are applied dropwise to a glass slide can be assayed by the present invention.
  • body fluids such as blood, saliva or the like can be analyzed by living organisms.
  • cultured cells or parts thereof but also organic or inorganic materials, which are arranged in the form of a sample array may be present as a preparation.
  • TMAs tissue microarrays
  • the number of mostly cylindrical individual samples, which are introduced into the paraffin block usually in the range of several hundred individual samples.
  • the introduced individual samples should reach as evenly as possible deep into the paraffin block.
  • it is in the production of such tissue sample arrays due to different length cylindrical individual samples or "Gores”, but also problems in introducing the specimens in the paraffin block to different depths of the samples in the paraffin block, which is why it especially in paraffin block sections in deeper regions comes that individual "Gores" only partially or not exist.
  • a statement should be made as to whether or not individual samples are present at certain points in the section.
  • An automatic scanning method in particular for biological samples, with which automatic analyzes of a large number of samples can be carried out, is described, for example, in WO 02/101635 A1.
  • a flatbed scanner is used in combination with an automatic image analysis.
  • the evaluation is aimed at sections of samples and not on sample arrays with a large number of individual samples.
  • US 2004/0136581 A1 describes a method and a device for the automatic analysis of images of a biological sample, wherein a biological sample prepared with a reagent is placed in a microscope slide and scanned optically. Also, this evaluation is not directed to sample arrays with a large number of individual samples. In addition, the samples are affected or even destroyed by the preparation.
  • WO 99/39184 A1 shows a device and a method for automatic image processing and analysis of biological samples arranged in microtiter plates. Also, this evaluation is not directed to sample arrays with a large number of individual samples.
  • the object of the present invention is therefore to provide an abovementioned method for determining the relevance of preparations, which can be carried out as quickly as possible and as far as possible without destroying the preparations.
  • the relevance control should be automatable in order to obtain information on the relevance of the preparations of the sample arrays in the shortest possible time with the lowest possible costs.
  • the disadvantages of the prior art should be avoided or at least reduced.
  • Another object of the present invention is to provide an above-mentioned device for determining the relevance of preparations of sample arrays, which allows a rapid and reliable relevance control and beyond as simple and robust as possible and inexpensive to produce.
  • the first object according to the invention is achieved in that preferably each preparation is scanned nondestructively, from the data obtained together with the positions of the individual samples on the preparation data fields of each sample of the preparation are generated, selected from each sample data field at least one parameter and this or one derived therefrom Value or a combination of parameters or values derived therefrom is compared with at least one threshold value, and the comparison value is used as a criterion for the relevance of the individual sample, and those individual samples of the preparation whose relevance is below a predetermined relevance threshold are identified as being unusable, and that the reference value together with the position of the individual sample as well as the positions of all unrecognizable individual samples are stored together with a unique identifier of the preparation.
  • the method according to the invention thus provides for subjecting any number of preparations or each preparation to a relevance check, which is made possible by the fact that the preparations are preferably examined nondestructively and thus are still available for subsequent examinations.
  • nondestructive treatment and scanning of each preparation and collection of the corresponding data is performed.
  • the positions, The given positions at which the individual samples of a sample array are to be arranged or the determined actual positions of the individual samples may be at which individual samples are present in the sample array. Due to the positions at which individual samples should or should be present, the data can be decomposed into data fields per sample and these data fields are fed to further processing.
  • At least one parameter is selected and this or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom is compared with at least one threshold value.
  • the comparative value obtained per individual sample is finally used as a criterion for the relevance of the individual sample and stored together with the position information of the individual sample of the preparation.
  • a data record which contains a relevance criterion for each individual sample of the preparation. It is important that not only an overall statement about the quality of the preparation is made, but also a statement about which individual samples are present or not. In the simplest case, this relevance criterion can be binary, ie only make a statement as to whether the individual sample is present or not.
  • Such a relevance control carried out up to each preparation also makes it possible to use those preparations for subsequent investigations in which various individual samples are not present.
  • the data obtained in the relevance control are included for the following, for example, histological examinations of the preparation, so that the data obtained from defective or non-existing individual samples can be excreted in the preparation and thus can not lead to misinterpretation. Only by means of such an additional data record, which makes a reliable statement about the relevance of the preparation, are automated analyzes of the preparations of sample arrays, in particular tissue sample arrays, possible.
  • the procedure for determining the relevance of preparations may be carried out immediately prior to the examination of the preparations or at an earlier point in time, and the data, together with further information about the preparations, may be stored in a database so that they are available for subsequent examinations. Alternatively to storing the data in one Database, these can also be stored in the so-called flat file format.
  • TMAs tissue microarrays
  • preparations with non-existent or unvaluable individual samples are suitable for subsequent investigations, since nonexistent or destroyed individual samples are clearly identified and the data resulting from subsequent investigations of such individual samples can be discarded.
  • more preparations of a sample array are available to subsequent studies without the risk of misinterpretation.
  • a combination of the nondestructive method of the present invention with other methods in which individual preparations are impaired or even destroyed is also possible, thereby providing important additional information.
  • the preparation is optically scanned by sample arrays and the resulting image is stored.
  • the preparation is not affected and is therefore still available for subsequent investigations. Therefore, theoretically, all preparations may be subjected to an assay to determine relevance without reducing the number of preparations available for subsequent studies.
  • the optical scanning is possible with very high speed and also automated, whereby many specimens can be examined in a short time.
  • the preparations can be irradiated with light and a picture of translucent light taken.
  • This simple method includes a light source and a camera or flatbed scanner that picks up the transmitted light passing through the specimen. In this way, for example, missing individual samples can be detected particularly easily. With the transmitted light method, a negative of the captured image can be made, which facilitates the detection of missing or destroyed individual samples due to contrast differences.
  • the preparations are preferably excited with light, in particular laser light, and an image of the resulting autofluorescence radiation is recorded and stored.
  • the exploitation of autofluorescence, d.i. the resulting radiation from elements excited with light of a particular wavelength is another suitable method of investigation which does not destroy the sample.
  • the autofluorescence examination is particularly suitable since, in contrast to conventional tissue specimens, paraffin causes less fluorescence radiation and thus a clear contrast between the specimen and the surrounding paraffin.
  • light sources of different wavelengths or light sources with a broader wavelength range for example mercury lamps, and various filters can be used.
  • ultraviolet lamps and three different filters having, for example, the following characteristics are employed.
  • CY3 indocarbocyanine
  • CY5 indodicarbocyanine
  • CY3 can be excited at 530 nm and emits light with a wavelength of 595 nm
  • CY5 is excited at 630 nm and emits fluorescence radiation at 680 nm.
  • the images of the preparations are preferably stored in a standardized format, for example in TIFF or JPG format. This also allows the application of existing image processing programs and does not require conversion of the data prior to the examination.
  • the image of the preparation is transformed into at least one binary image.
  • a binary image consists of a matrix of logical zeros and logical ones, from which the probability of the existence of a single sample can be determined and thus a statement about the relevance of the single sample can be made.
  • Such binary images are generated so that the parameter used is compared with one or more thresholds. If more than one para- meter, several binary images can be generated, which can be combined later in the algorithm.
  • the recorded images of the preparations can be filtered according to various aspects. Both mechanical filters, which are placed in front of the camera or the like for taking the pictures, as well as electronic filters, which are traversed by the image data, are used.
  • the fluorescence intensity can be used, which is preferably averaged over the cross-section of the single sample and used as a parameter to determine the relevance of the individual samples.
  • the fluorescence intensity in two directions in particular in the two main axis directions, can be detected via the normally circular cross section of the individual sample and a statement about the relevance of the individual sample can be made from the resulting distribution.
  • the data is compared with a predetermined threshold and then the comparison value used as a criterion for the relevance of the single sample.
  • the respective threshold value can result from empirical values or can also be determined automatically by means of standardized statistical methods, for example so-called box-plot methods.
  • the values are preferably set in proportion to the intensity of the surrounding pixels and a distribution of the fluorescence intensity over the pixels of the image is generated.
  • derived values of a parameter for example, the variability in fluorescence intensity or the like can be used.
  • the unusable individual samples of a sample of the sample array can be summed up. From this sum, a statement can be made about the number of still usable individual samples of a preparation.
  • the preparation can be classified on the basis of the determined sum of unworkable individual samples and a classification value can be stored together with a unique identifier of the preparation.
  • This important information can be used for subsequent examinations of the preparation. For example, it may be expedient to use for particularly time-consuming and cost-intensive investigations only those preparations in which no or only a very small number of individual samples are unusable, which thus have particularly high quality.
  • a preparation with a large number of unrecognizable individual samples ie a preparation of low quality, can be used and thereby provide important information.
  • the unique identifier of the preparation can be provided, for example, by an identification number, which can also be arranged in the form of a barcode next to the preparation, for example on the glass carrier. By reading the barcode, the information stored in a database about the relevance of the preparation can then be called up and used for subsequent examinations.
  • a microscopic image of the preparation can also be taken and used for relevance determination.
  • Such microscopic images may contain further interesting information.
  • the geometric shape of the individual sample can also be determined from the single sample data be used as a parameter to determine the relevance of the individual samples. For example, from the single sample data field, the contour of the individual sample can be determined by different image recognition methods and compared with the ideal shape of the individual sample, for example the circular shape. If the determined form of the individual sample is too great, it can be rejected as being unusable. For example, the introduction of cylindrical specimens into the paraffin block sometimes results in tissue sample array deformations which may distort subsequent assay results.
  • preparations are automatically processed sequentially or in parallel and the data obtained on the relevance of the individual samples of the preparations stored together with an identifier of the preparations.
  • data on the relevance of the preparations can be collected and stored after preparation of the preparations of sample arrays. These data are then available for a selection of preparations for specific subsequent examinations.
  • the theoretical positions of the individual samples on a preparation are preferably predetermined and stored. These position values can be used to generate the data fields of each individual sample of the preparation.
  • the actual positions of the individual samples on a preparation are determined from an image of the preparation. This can be done, for example, by using the so-called "Region Growing.” Using this mathematical method, certain pixels of the image, the so-called seed points, are specified by means of a random generator and a certain number of surrounding pixels are included in the calculation The intensity of the seed point is compared with the intensities of the surrounding points and included in the calculation.
  • the "Region Growing" method is particularly suitable for determining the size of surfaces, the number of surfaces, the edge length of Surfaces, to fit a curve to the edge of a surface, to calculate the center of gravity and higher moments, and the circular variance or elliptic variance.
  • the determination of the actual position of the individual samples may be carried out by applying the "region growing" method followed by a method of determining the center of the individual samples.
  • the actual positions of the individual samples can be compared with the possibly stored, theoretical positions and, if deviated, the predefined position information can be corrected accordingly.
  • the so-called "gridding” analyzes the data and maps them onto a usually rectangular grid, which can be used to counteract the fact that when making, for example, sections from sample arrays, the pattern of the individual samples is often distorted is clearly defined, relevance control can also be performed more reliably.
  • the second object according to the invention is also achieved by an abovementioned device for determining the relevance of preparations of sample arrays, in which a device for non-destructive scanning of the specimens of the specimen arrays is provided, which scanning device has a database containing the information about the positions of the specimens of the specimens and is connected to a computer unit for processing the sampled preparations and for generating data fields per individual sample and for selecting at least one parameter from each individual sample data field and for comparing this parameter or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom with at least one threshold value , and in that a device for displaying the value of the comparison of the at least one parameter or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom with the at least one Threshold as a criterion for the relevance of the single sample, and a memory for storing this relevance criterion is provided together with the position of the single sample of the preparation.
  • the scanning device is preferably formed by a light source and a device for receiving an image of the preparation.
  • the light source above the preparation and the scanning device are arranged below the preparation, so that the scanning device can detect the light transmitted through the preparation.
  • the light source and the scanning device are arranged above the preparation.
  • the recording device can be formed by a fluorescence scanner, which records the fluorescence radiation of the preparation, which was excited by a corresponding light source.
  • the light source can be formed by a laser, wherein the wavelength is adapted to the particular circumstances and the use of any fluorochromes.
  • a plurality of light sources may be provided in different wavelength ranges or else a light source which emits light in a very broad wavelength range.
  • a device for transforming the recorded image of the section into at least one binary image can be provided.
  • a filter device for filtering the recorded images of the preparations may be provided.
  • these may be filters which are arranged in front of the recording device in terms of hardware, but also filters which make a correction of the data obtained by software.
  • a microscope for receiving the preparations may be provided to provide additional information for determining relevance.
  • a device for automatic supply and removal of the preparations can be provided.
  • a magazine for receiving a plurality of preparations may be provided, from which the preparations for relevance determination are automatically removed and returned.
  • a semi-automated relevance determination of the preparations can be achieved.
  • a device for determining the actual positions of the individual samples is provided on the preparation.
  • the real position of the individual samples which often does not agree with the desired position, can be reliably determined.
  • a device for correcting the positions of the individual samples on the preparation can be provided, which is connected to a device for receiving the preparation for determining the actual positions of the individual samples.
  • Fig. 1 is a schematic diagram illustrating the preparation of sections from sample arrays
  • FIG. 2 is a plan view of an example of a section of a sample array
  • FIG. 3 is a block diagram illustrating the method for determining the relevance of preparations of sample arrays according to the present invention
  • FIGS. 4a and 4b show examples of an existing and a nonexistent or heavily damaged individual sample of a preparation
  • FIGS. 5a and 5b show the measurement results in the individual samples according to FIG Figures 4a and 4b using the fluorescence intensity as a parameter
  • Fig. ⁇ a and ⁇ b show two possible data sets of the individual samples according to Figs. 4a and 4b;
  • FIG. 7 shows the measurement result of a further embodiment of the method according to the invention utilizing autofluorescence
  • FIG. 8 shows a block diagram of an embodiment of the device for determining the relevance of preparations of sample arrays.
  • the sample array 1 shows a schematic diagram for illustrating the production of preparations 4 or sections from sample arrays 1, in particular tissue sample arrays (TMAs tissue microarrays).
  • the sample array 1 consists of a cuboid paraffin block 2 into which individual cylindrical samples 3, in particular tissue samples, are introduced. Due to the different origin of the individual samples 3, but also due to mechanical problems when introducing the individual samples 3 into the paraffin block 2, the depth of the individual samples 3 in the paraffin block 2 is different in practice.
  • the preparation of preparations 4 or sections from the sample array 1, which is preferably carried out with a microtome especially in deeper regions of the sample array 1 often missing individual samples 3 at different positions. These missing individual samples 3 on the preparations 4 are not available in subsequent histological or histopathological examinations and thus reduce the information obtained from the examinations. It is therefore very important to be able to make a statement about the relevance of the preparations 4.
  • a selection of preparations 5 or sections of the sample array 1 for quality control (QC) is used according to the prior art.
  • the preparations 5 are usually histologically stained and made a statement about the presence or absence of a single sample 3 on the preparation 5 due to color differences in the microscope image.
  • the products 5 are no longer available for other examinations after relevance control. This reduces the total number of used
  • a relevance check carried out according to the state of the art offers relatively insecure information since it is not possible to make any reliable statements about their relevance for the preparations between the randomly selected preparations 5.
  • FIG. 2 shows a plan view of a preparation 4 of a sample array 1, in which the individual samples 3 are arranged in a specific pattern, which permits an unambiguous assignment of the individual samples 3.
  • the columns are binary-coded with a part of the holes for the individual samples 3.
  • FIG. 3 shows a block diagram for illustrating the method according to the invention for determining the relevance of preparations 4 of sample arrays 1.
  • the preparations 4 are produced from the sample arrays 1 according to block 102.
  • the relevance control is initiated without destroying the preparations 4.
  • the preparations 4 of the sample arrays 1 containing a plurality of individual samples 3 are scanned non-destructively, resulting in a data field of the preparation 4.
  • the non-destructive scanning of the preparations 4 can be carried out, for example, by transmitted light and / or by the use of autofluorescence.
  • the information of the positions of the individual samples 3 on the preparation 4 is used to generate data fields of each individual sample 3 of the section 4.
  • the theoretical position of the individual sample 3 on the preparation 4 or after the comparison of the determined actual positions of the individual samples 3 on the preparation 4 with the theoretical positions (according to the "grid)
  • These individual sample data fields are now processed in accordance with block 106 such that at least one parameter is selected from the single sample data field and this or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom is compared with at least one threshold according to block 107 and the comparison value is used as the relevance criterion for the individual sample 3 and stored together with the position of the individual sample 3 of the preparation 4.
  • the result of the relevance control obtained in block 107 can be combined with results of additional examinations of the preparation 4 according to block 108 and in block 109
  • results of additional examinations of preparation 4 created in block 108, may be different, also manually performed, methods which provide additional information in block 110, and the data is stored.
  • Relevance determination creates important information which improves the interpretation of the data from the preparations 4 of the sample arrays 1 and permits a better utilization of the preparations 4.
  • FIGS. 4a and 4b show examples of autofluorescence images of two individual samples 3 of a preparation 4 of a sample array 1. These are schematic images of actual measurement results.
  • the individual sample 3 from FIG. 4 a is almost ideally circular and stands out clearly from the surrounding paraffin block 2.
  • Fig. 4a shows the image of a single sample 3 with very high quality.
  • Fig. 4b shows a severely deformed hole 5 in the paraffin block 2, in which a residue 6 of the single sample 3 or paraffin is present.
  • This single sample 3 is greatly deformed or not present and is therefore not available for subsequent investigations.
  • FIGS. 5a and 5b show a variant of a method for determining the relevance of sample array sections using the individual samples 3 according to FIGS. 4a and 4b.
  • the fluorescence intensity I is chosen as the parameter, whose distribution is evaluated as a function of the x and y axes becomes.
  • FIG. 5a shows in diagram 7 the sum of the fluorescence intensity ⁇ I as a function of the x-axis and diagram 8 the sum of the fluorescence intensity ⁇ I in the y-direction.
  • the curves of the diagrams 7 and 8 have a point of inflection which shows a local maximum of the fluorescence intensity ⁇ I substantially in the middle of the single sample 3.
  • the intensity profiles corresponding to the diagrams 7 and 8 can now be further processed, for example an average value can be formed and compared with one or more threshold values. This comparison value is used as relevance criterion for the individual sample 3 and stored together with the position information of the individual sample 3 of the preparation 4, for example in a database.
  • the intensity curves according to FIG. 5a show a particularly high quality of the individual sample 3 according to FIG. 4a.
  • the curves 7 and 8 of the fluorescence intensities I in the x and y directions in the individual sample according to FIG. 5 b are significantly different and have on the one hand a substantially lower intensity and on the other hand a course deviating significantly from the ideal case, which serves as a criterion for the relevance of the Single sample 3 can be used.
  • the course of the fluorescence intensity I has a local minimum in comparison to the individual sample 3 according to FIG. 5a. From the parameter of the fluorescence intensity I, therefore, a statement about the relevance of the individual sample 3 on the preparation 4 of the sample array 1 can be made particularly quickly and reliably.
  • FIGS. 6a and 6b show two further possible data sets of the individual samples 3 according to FIGS. 4a and 4b.
  • the autofluorescence intensity I is represented as a function of the pixel of the recording of the individual sample 3, that is to say of the individual sample data field, and different values are calculated therefrom.
  • These derived parameters such as extreme values, mean values or the like, as shown by the horizontal lines, can be used as a relevance criterion for the single sample 3.
  • the intensities I differ significantly from those according to FIG. 6 a as a function of the localization of the individual pixels of the data field of the individual sample 3.
  • Figures 6a and 6b show the results of so-called boxplot measurements.
  • the box is the rectangle determined by the quartiles, which comprises 50% of the data.
  • the length of the box shows the interquartile range. This is a measure of the variance determined by the difference of the upper and lower quarti.
  • Another quartile is the median (solid line).
  • the other horizontal lines are called whiskers whose maximum length is 1.5 times the interquartile range and can be determined from the data.
  • the top and bottom dashed lines show the extremes of the upper and lower whiskers. Values that are outside these limits are called outliers and used to determine the relevancy of the sample.
  • FIG. 7 shows a further example of a simple relevance determination according to the present method, the fluorescence intensity I being represented on a logarithmic scale as a function of the position L of the individual sample 3.
  • the dark dots indicate positions of the individual samples 3 or pixels of the image of the individual sample 3, on which material is present, and the white dots positions of the individual samples 3 without material.
  • Black dots below the manually determined threshold S indicate that material is not available for technical reasons. This is used as a criterion for the relevance of the single sample 3.
  • the determination of the threshold value S can also be determined automatically from the data of the preparation, wherein a change of the threshold value from one passage to another is possible in so-called learning systems.
  • FIG. 8 shows a block diagram of a possible device 10 for determining the relevance of preparations 4 of sample arrays 1, comprising a plurality of individual samples 3 at different positions.
  • the device 10 has a device 11 for non-destructive scanning of the preparations 4 of the sample arrays 1.
  • the scanning device 11 may be connected to a database 12, which contains information about the position of the individual samples 3 of the preparations 4.
  • the scanning device 11 is formed in particular by a light source 13, preferably a laser, and a device 14 for receiving a Image of Specimen 4.
  • a microscope 15 for taking an image of the specimens 4 may be arranged.
  • the scanning device 11 is connected to a computer unit 16, which processes the data of the scanned preparations 4 accordingly and generates data fields per individual sample 3.
  • a parameter from each individual sample data field is selected and this parameter or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom is compared with at least one threshold value and the comparison value is displayed on a display device 17, for example a screen, and in a memory 18 stored as relevance criterion together with the position of the single sample 3 of the preparation 4.
  • a device 19 for the automatic supply and removal of the preparations 4 may be provided, which preferably with a magazine 20 for receiving a plurality of preparations 4, which were removed from a corresponding bearing 21 , connected is.
  • tissue sample arrays TMAs
  • the present invention is applicable to a wide variety of sample arrays containing a plurality of individual samples.
  • Tissue Microarray Tissue Microarray
  • Each tissue sample array contains 30 individual samples of a particular organ or tissue, which are listed in the rows of the following table
  • the number of individual samples per tissue can now be determined, which is essential for subsequent examinations of these preparations is. If, on the other hand, only the number of non-existent individual samples or destroyed individual samples without their position were determined, this would provide insufficient information in the present case of a tissue microarray, since, for example, no statement can be made about which tissue type more or fewer individual samples are present.
  • the table below shows the application of the method according to the invention to two sections of a tissue sample array consisting of 450 individual samples from 15 different tissues. Each missing or destroyed individual sample is uniquely identified, so that in the end the number of usable individual samples can be determined.
  • Column 2 of the table shows the number of usable individual samples per tissue type at section no. 4 of the tissue sample array. A total of 14 of the 450 individual samples are defective and thus not usable or missing and are therefore also not available for subsequent investigations.
  • Column 3 of the table shows the result for section # 137 of the same tissue sample array. In this case, 223 out of 450 individual samples have already been destroyed or missing. This clearly shows the problem described above that many individual samples do not protrude so far into the paraffin block and thus are absent in deeper sections of the tissue sample array.
  • tissue samples from the cervix, mamma, or ovary at section No. 137 will be useful, since in this case a majority of the individual samples will be present, whereas for example only four out of 30 liver samples will be present.
  • the knowledge of the missing individual samples of a preparation can therefore be used to filter the data for subsequent automated analyzes.
  • Each individual sample of the tissue sample array usually also contains information about the patient.
  • the 30 individual samples per tissue type in the present example come from 10 different sources, for example 10 different patients.
  • the method according to the invention determines the relevance of each individual sample of the preparation, so that, for example, a statement can be made as to which type of tissue all 3 of the ideally present individual samples can be utilized or from which only 2 or only 1 or no single sample can be utilized , Of course, this information is of considerable importance for certain studies on the preparation. How the information obtained by the method according to the invention are processed, however, depends strongly on the particular application and the subsequent investigations on the preparations.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung (10) zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten (4) von Probenarrays (1), enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben (3) an verschiedenen Positionen. Zur Schaffung eines Verfahrens bzw. einer Vorrichtung (10) welche (s) möglichst rasch und vorzugsweise ohne Zerstörung der Präparate (4) durchführbar ist, ist eine Einrichtung (11) zur zerstörungsfreien Abtastung der Präparate (4) der Probenarrays (1) vorgesehen, welche mit einer die Information über die Position der Einzelproben (3) der Präparate (4) enthaltenden Datenbank (12) und mit einer Rechnereinheit (16) zur Verarbeitung der abgetasteten Präparate (4) und zur Erzeugung von Datenfeldern je Einzelprobe (3) und zur Auswahl zumindest eines Parameters aus jedem Einzelprobendatenfeld und zum Vergleich dieses Parameters oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verbunden ist, und weiters eine Einrichtung (17) zur Anzeige des Wertes des Vergleichs mit dem zumindest einen Schwellwert als Relevanzkriterium für die Einzelprobe (3), und ein Speicher (18) zum Speichern dieses Relevanzkriteriums vorgesehen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Pro- benarrav-Präparaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays, insbesondere Gewebsprobenarrays, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben an verschiedenen Positionen.
Weiters betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays, insbesondere Ge- websprobenarrays, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben an verschiedenen Positionen.
Für Diagnose- und Forschungszwecke ist es in der Medizin üblich, verschiedene Proben, beispielsweise Gewebsproben, zu sammeln und verschiedenen Untersuchungen zu unterwerfen. Im Falle von Gewebsproben, welche menschlichen oder tierischen Organismen entnommen wurden, ist es üblich, diese in Paraffin zu betten und an bestimmten ausgewählten Stellen der Gewebsprobe zylindrische Kerne (so genannte „Cores") auszustechen und in entsprechende große zylindrische Löcher eines Paraffinblockes einzubringen. Derartige Gewebsprobenarrays (tissue microarrays, TMAs) werden danach üblicherweise mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten und die Präparate beispielsweise histologisch untersucht.
Oben beschriebene Gewebsprobenarrays werden aufgrund der großen Anzahl von Schnitten und Einzelproben verstärkt automatischen Analysen zugeführt, um möglichst rasch wichtige Informationen, insbesondere für diagnostische oder therapeutische Zwecke, zu erhalten. Beispielsweise beschreibt die US 2003/0215936 Al ein Verfahren und eine Vorrichtung für die möglichst rasche und effiziente Untersuchung von derartigen Gewebsprobenarrays.
Obgleich in der nachfolgenden Beschreibung hauptsächlich auf Gewebsprobenarrays eingegangen wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Proben beschränkt, sondern bei Präparaten von verschiedensten Probenarrays, welche eine Vielzahl an einzelnen Proben enthalten, anwendbar. Neben menschlichen, tierischen und pflanzlichen Geweben kommen auch Kombinationen verschiedenster Gewebe mit unterschiedlicher Herkunft zur Anwen- düng der vorliegenden Erfindung in Frage. Ebenso kann Material, welches von Gewebe extrahiert wurde, wie z.B. Proteine und Nukleinsäuren, die tropfenweise auf einen Glasträger aufgebracht werden, mit der vorliegenden Erfindung untersucht werden. Weiters können Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder dgl. von lebenden Organismen analysiert werden. Schließlich können auch gezüchtete Zellen oder Teile davon aber auch organische oder an- organsiche Materialien, welche in Form eines Probenarrays angeordnet sind, als Präparat vorliegen.
Im Falle von TMAs (tissue microarrays) liegt die Anzahl der meist zylinderförmigen Einzelproben, welche in den Paraffinblock eingebracht werden, üblicherweise im Bereich mehrerer hundert Einzelproben. Um aus einem so genannten Zielblock möglichst viele einzelne Schnitte erhalten zu können, sollen die eingebrachten Einzelproben möglichst gleichmäßig tief in den Paraffinblock reichen. In der Praxis kommt es bei der Herstellung derartiger Gewebsprobenarrays aufgrund verschieden langer zylindrischer Einzelproben oder „Gores", aber auch zu Problemen beim Einbringen der Einzelproben in den Paraffinblock zu unterschiedlichen Tiefen der Proben im Paraffinblock, weshalb es insbesondere bei Schnitten des Paraffinblocks in tieferen Regionen dazu kommt, dass einzelne „Gores" nur teilweise oder gar nicht vorhanden sind. Für eine verlässliche Aussage der nachfolgenden Untersuchungen an den Schnitten ist es daher unerlässlich, die Relevanz der Schnitte festzustellen. Insbesondere sollte eine Aussage darüber gemacht werden können, ob an bestimmten Stellen des Schnittes Einzelproben vorhanden sind oder nicht.
Aber auch bei anderen Proben ist es von besonderer Bedeutung, eine Aussage über die Relevanz der Einzelproben am Präparat treffen zu können. Dies ist einerseits für die Verlässlichkeit der Aussagen, welche nach Analyse der Probe getroffen werden, insbesondere für Diagnosen im medizinischen Bereich, von großer Bedeutung. Andererseits stellen die Präparate einen enormen wirtschaftlichen Wert dar, der erhöht werden kann, wenn eine Aussage über die Relevanz der Einzelproben am Präparat getroffen werden kann.
Derzeit wird eine derartige Kontrolle der Relevanz von Präpara- ten in aufwändigen manuellen Verfahren an Stichproben der Präparate unter dem Lichtmikroskop vorgenommen, wobei eine Auswahl an Schnitten eines Paraffinblocks zum Zweck der Relevanzkontrolle untersucht wird. Dabei werden die zur Untersuchung herangezogenen Schnitte des Probenarrays üblicherweise histologisch eingefärbt, um fehlende Einzelproben leichter erkennen zu können. Für nachfolgende Untersuchungen stehen diese Schnitte aufgrund der Einfärbung nicht mehr zur Verfügung. Darüber hinaus liefern derartige stichprobenartige Untersuchungen keine Informationen über die tatsächliche Relevanz der Präparate zwischen den Stichproben. Diese Information würde zwar bei einer Erhöhung der Stichprobenanzahl verbessert, jedoch stehen dann umso weniger Präparate für nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung. Darüber hinaus sind die üblicherweise manuell durchgeführten Kontrollen sehr zeit- und somit kostenaufwändig.
Ein automatisches Scanverfahren insbesondere für biologische Proben, mit dem automatische Analysen einer großen Anzahl von Proben vorgenommen werden können, wird beispielsweise in der WO 02/101635 Al beschrieben. Zu diesem Zweck wird ein Flachbettscanner in Kombination mit einer automatischen Bildauswertung eingesetzt. Dabei ist die Auswertung auf Schnitte von Proben und nicht auf Probenarrays mit einer Vielzahl einzelner Proben gerichtet.
Die US 2004/0136581 Al beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatischen Analyse von Bildern einer biologischen Probe, wobei eine mit einem Reagens präparierte biologische Probe in einem Objektträger angeordnet und aoptisch abgetastet wird. Auch diese Auswertung ist nicht auf Probenarrays mit einer Vielzahl einzelner Proben gerichtet. Darüber hinaus werden die Proben durch die Präparation beeinflusst oder sogar zerstört.
Schließlich zeigt die WO 99/39184 Al eine Einrichtung und ein Verfahren zur automatischen Bildverarbeitung und -analyse von in Mikrotiterplatten angeordneten biologischen Proben. Auch diese Auswertung ist nicht auf Probenarrays mit einer Vielzahl einzelner Proben gerichtet. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Schaffung eines oben genannten Verfahrens zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten, welches möglichst rasch und möglichst ohne Zerstörung der Präparate durchführbar ist. Die Relevanzkontrolle soll automatisierbar sein, um mit möglichst geringen Kosten in möglichst kurzer Zeit Informationen über die Relevanz der Präparate der Probenarrays zu erhalten. Die Nachteile des Standes der Technik sollen vermieden oder zumindest reduziert werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer oben genannten Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays, welche eine möglichst rasche und zuverlässige Relevanzkontrolle zulässt und darüber hinaus möglichst einfach und robust aufgebaut und möglichst kostengünstig herstellbar ist.
Die erste erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, dass vorzugsweise jedes Präparat zerstörungsfrei abgetastet wird, aus den erhaltenen Daten zusammen mit den Positionen der Einzelproben auf dem Präparat Datenfelder jeder Einzelprobe des Präparats erzeugt werden, aus jedem Einzelprobendatenfeld zumindest ein Parameter ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verglichen wird, und der Vergleichswert als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe verwendet wird, und jene Einzelproben des Präparats, deren Relevanz unter einem vorgegebenen Relevanzgrenzwert liegt, als unverwertbar identifiziert werden, und dass der Vergleichswert zusammen mit der Position der Einzelprobe sowie die Positionen aller unverwertbarer Einzelproben zusammen mit einer eindeutigen Kennung des Präparats gespeichert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht somit vor, beliebig viele Präparate bzw. jedes Präparat einer Relevanzkontrolle zu unterziehen, was dadurch möglich wird, dass die Präparate vorzugsweise zerstörungsfrei untersucht werden und somit für nachfolgende Untersuchungen weiterhin zur Verfügung stehen. Zu diesem Zweck erfolgt eine zerstörungsfreieBehandlung und Abtastung jedes Präparats und ein Sammeln der entsprechenden Daten. Die Positionen, an welchen Einzelproben im Probenarray vorhanden sind können die vorgegebenen Positionen, an welchen die Einzelproben eines Pro- benarrays angeordnet sein sollen oder die ermittelten tatsächlichen Positionen der Einzelproben sein. Aufgrund der Positionen, an welchen Einzelproben vorhanden sein sollten oder sind, können die Daten in Datenfelder je Einzelprobe zerlegt werden und diese Datenfelder der weiteren Verarbeitung zugeführt werden. Für diese weitere Verarbeitung wird zumindest ein Parameter ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verglichen. Der erhaltene Vergleichswert je Einzelprobe wird schließlich als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe verwendet und zusammen mit der Positionsinformation der Einzelprobe des Präparats abgespeichert. Als Resultat des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt somit ein Datensatz vor, der für jede Einzelprobe des Präparats ein Relevanzkriterium enthält. Wichtig dabei ist, dass nicht nur eine Gesamtaussage über die Qualität des Präparats getroffen wird, sondern eine Aussage darüber, welche Einzelproben vorhanden sind oder nicht. Im einfachsten Fall kann dieses Relevanzkriterium binär sein, d.h. nur eine Aussage darüber treffen, ob die Einzelprobe vorhanden ist oder nicht. Durch eine derartige an bis zu jedem Präparat vorgenommene Relevanzkontrolle können auch solche Präparate für nachfolgende Untersuchungen herangezogen werden, bei welchen verschiedene Einzelproben nicht vorhanden sind. Die bei der Relevanzkontrolle erhaltenen Daten werden für die nachfolgenden beispielsweise histologischen Untersuchungen des Präparats miteinbezogen, so dass die erhaltenen Daten von defekten oder nicht vorhandenen Einzelproben am Präparat ausgeschieden werden können und somit nicht zu Fehlinterpretationen führen können. Erst durch einen solchen zusätzlichen Datensatz, welcher über die Relevanz des Präparats eine zuverlässige Aussage trifft, werden automatisch durchgeführte Analysen der Präparate von Probenar- rays, insbesondere Gewebsprobenarrays, möglich. Das Verfahren zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten kann unmittelbar vor der vorgenommenen Untersuchung der Präparate erfolgen oder auch zu einem früheren Zeitpunkt, und die Daten gemeinsam mit weiteren Informationen über die Präparate in einer Datenbank gespeichert werden, so dass sie für nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung stehen. Alternativ zur Speicherung der Daten in einer Datenbank können diese auch im so genannten Flatfile-Format abgelegt werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es beispielsweise bei TMAs (tissue microarrays) möglich, eine weitaus größere Anzahl an Schnitten von Probenarrays nachfolgenden Untersuchungen zu unterziehen und somit mehr Information aus häufig begrenzten Gewebsressourcen für diagnostische, therapeutische Zwecke aber auch Forschungszwecke zu gewinnen. Somit liegt ein Datensatz vor, der eindeutig die aufgrund der Relevanzkontrolle als unverwertbar erachteten Einzelproben identifiziert. Somit sind auch Präparate mit nicht vorhandenen oder unverwertbaren Einzelproben für nachfolgende Untersuchungen geeignet, da nicht vorhandene oder zerstörte Einzelproben eindeutig identifiziert sind und die aus nachfolgenden Untersuchungen resultierenden Daten derartiger Einzelproben verworfen werden können. Somit stehen mehr Präparate eines Probenarrays nachfolgenden Untersuchungen zur Verfügung, ohne dass die Gefahr von Fehlinterpretationen besteht. Eine Kombination des zerstörungsfreien erfindungsgemäßen Verfahrens mit anderen Methoden, bei welchen einzelne Präparate beeinträchtigt oder sogar zerstört werden, ist natürlich auch möglich, um dadurch wichtige zusätzliche Informationen zu erhalten.
Vorteilhafterweise wird das Präparat von Probenarrays optisch abgetastet und das erhaltene Bild gespeichert. Durch eine derartige optische Methode wird das Präparat nicht beeinflusst und steht daher für nachfolgende Untersuchungen weiterhin zur Verfügung. Daher können theoretisch alle Präparate einer Untersuchung zur Bestimmung der Relevanz unterzogen werden, ohne dass die Anzahl der für nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung stehenden Präparate reduziert wird. Darüber hinaus ist die optische Abtastung mit besonders hoher Geschwindigkeit und auch automatisiert möglich, wodurch sehr viele Präparate in kurzer Zeit untersucht werden können.
Die Präparate können mit Licht bestrahlt werden, und ein Bild des durchscheinenden Lichts aufgenommen werden. Diese einfache Methode umfasst eine Lichtquelle und eine Kamera oder einen Flachbettscanner, der das übertragene und durch das Präparat hindurch tretende Licht aufnimmt. Auf diese Weise lassen sich beispielsweise fehlende Einzelproben besonders einfach detektie- ren. Bei der Durchlichtmethode kann ein Negativ des erfassten Bildes angefertigt werden, wodurch die Detektion von fehlenden oder zerstörten Einzelproben aufgrund von Kontrastunterschieden erleichtert wird.
Alternativ oder zusätzlich zur Durchlichtmethode werden die Präparate vorzugsweise mit Licht, insbesondere Laserlicht, angeregt und ein Bild der resultierenden Autofluoreszenzstrahlung aufgenommen und gespeichert. Die Ausnützung der Autofluoreszenz, d.i. die resultierende Strahlung von Elementen, welche mit Licht bestimmter Wellenlänge angeregt werden, ist eine andere geeignete Untersuchungsmethode, welche die Probe nicht zerstört. Gerade im Fall der Untersuchung von Präparaten von Gewebsprobenarrays, bei welchen üblicherweise einzelne, kreisförmige Proben in Paraffin gebettet sind, eignet sich die Autofluoreszenzuntersuchung besonders, da Paraffin im Gegensatz zu üblichen Gewebsproben weniger Fluoreszenzstrahlung hervorruft und somit ein deutlicher Kontrast zwischen der Einzelprobe und dem umliegenden Paraffin resultiert, aufgrund dieses hohen Kontrastes zwischen Einzelprobe und Paraffin lässt sich die Aussage, ob eine Einzelprobe vorhanden ist oder nicht, durch besonders einfache
Bildverarbeitungsverfahren durchführen. Je einfacher die Auswerteverfahren desto weniger Rechnerleistung ist für einen möglichst schnellen automatischen Durchlauf der Relevanzkontrolle erforderlich.
Insbesondere bei Gewebsproben aus menschlichen oder tierischen Organismen können Lichtquellen verschiedener Wellenlängen oder Lichtquellen mit einem breiteren Wellenlängenbereich, beispielsweise Quecksilberlampen, und verschiedene Filter zur Anwendung kommen. Im Falle eines Fluoreszenzmikroskops werden beispielsweise Ultraviolett-Lampen und drei verschiedene Filter beispielsweise mit folgenden Charakteristika eingesetzt.
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Im Falle von Fluoreszenz-Scannern werden beispielsweise Laser bei zwei verschiedenen Wellenlängen zusammen mit hochspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen, wie z.B. CY3 (Indocarbocyanin) oder CY5 (Indodicarbocyanin) verwendet. CY3 kann beispielsweise bei 530 nm angeregt werden und sendet Licht mit einer Wellenlänge von 595 nm aus. CY5 wird mit 630 nm angeregt und sendet eine Fluoreszenz-Strahlung mit 680 nm aus.
Bessere Ergebnisse können auch dadurch erzielt werden, dass das Präparat der Probenarrays mit kombiniertem Licht verschiedener Wellenlänge angeregt wird. Beim derartigen „Multispectral ima- gingλΛ werden verschiedene Lichtquellen eingesetzt und dadurch mehr Informationen erhalten. Als Lichtquellen stehen beispielsweise Laser wie Argon-Ionen oder Helium/Neon-Laser zur Verfügung. Darüber hinaus können anstelle von Lasern auch Lichtquellen mit breitem Wellenlängenbereich zur Detektion des Vorhandenseins oder NichtVorhandenseins der Einzelproben herangezogen werden. Beispielsweise können Quecksilberlampen oder fiberoptische Geräte als Lichtquellen eingesetzt werden.
Um die nachfolgende Bearbeitung von Daten zu erleichtern, werden die Bilder der Präparate vorzugsweise in einem standardisierten Format, beispielsweise im TIFF- oder JPG-Format gespeichert. Dies ermöglicht auch die Anwendung vorhandener Bildverarbeitungsprogramme und erfordert keine Umwandlung der Daten vor der Untersuchung.
Vorteilhafterweise wird das Bild des Präparats in zumindest ein binäres Bild transformiert. Ein binäres Bild besteht aus einer Matrix von logischen Nullen und logischen Einsen, aus denen die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins einer Einzelprobe ermittelt und somit eine Aussage über die Relevanz der Einzelprobe getroffen werden kann. Derartige binäre Bilder werden so erzeugt, dass der verwendete Parameter mit einem Schwellwert oder mehreren Schwellwerten verglichen wird. Wenn mehr als ein Para- meter benützt wird, können mehrere Binärbilder anfallen, welche zu einem späteren Zeitpunkt im Algorithmus kombiniert werden können.
Die aufgenommenen Bilder der Präparate können nach verschiedenen Gesichtspunkten gefiltert werden. Dabei kommen sowohl mechanische Filter, welche vor die Kamera oder dgl. zur Aufnahme der Bilder gesetzt werden, als auch elektronische Filter, welche von den Bilddaten durchlaufen werden, zur Anwendung.
Als Parameter, der aus jedem Einzelprobendatenfeld ausgewählt wird und zur Bestimmung der Relevanz der Präparate herangezogen wird, kann die Fluoreszenzintensität verwendet werden, welche vorzugsweise über den Querschnitt der Einzelprobe gemittelt und als Parameter zur Feststellung der Relevanz der Einzelproben verwendet wird. Beispielsweise kann die Fluoreszenzintensität in zwei Richtungen, insbesondere in den zwei Hauptachsenrichtungen über den normalerweise kreisförmigen Querschnitt der Einzelprobe erfasst werden und aus der resultierenden Verteilung eine Aussage über die Relevanz der Einzelprobe getroffen werden. Die Daten werden mit einem vorgegebenen Schwellwert verglichen und danach der Vergleichswert als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe verwendet. Der jeweilige Schwellwert kann aus Erfahrungswerten resultieren oder mittels standardisierter statistischer Methoden, beispielsweise so genannten Box-Plot-Verfahren, auch automatisch bestimmt werden. Bei Verwendung der Fluoreszenzintensität als Parameter werden die Werte vorzugsweise im Verhältnis mit der Intensität der umgebenen Pixel gesetzt und eine Verteilung der Fluoreszenzintensität über die Pixel des Bildes erzeugt. Als abgeleitete Werte eines Parameters können beispielsweise die Variabilität in der Fluoreszenzintensität oder dgl. herangezogen werden.
Dabei können die unverwertbaren Einzelproben eines Präparats des Probenarrays summiert werden. Aus dieser Summe kann eine Aussage über die Anzahl der noch verwertbaren Einzelproben eines Präparats getroffen werden.
Wenn die Summe der unverwertbaren Einzelproben eines Präparats mit einem vorgegebenen Grenzwert verglichen wird, und bei Über- schreiten dieses Grenzwerts das Präparat des Probenarrays als unverwertbar identifiziert wird, kann das Präparat von nachfolgenden Untersuchungen ausgeschlossen werden. Dies macht bei einer besonders großen Anzahl von unverwertbaren Einzelproben pro Schnitt Sinn, da dadurch nachfolgende besonders heikle, aufwändige und eventuell auch sehr kostenintensive Untersuchungen vermieden werden können.
Ebenso kann das Präparat aufgrund der ermittelten Summe unverwertbarer Einzelproben klassifiziert werden und ein Klassifizierungswert zusammen mit einer eindeutigen Kennung des Präparats gespeichert werden. Diese wichtige Information kann für nachfolgende Untersuchungen des Präparats herangezogen werden. Beispielsweise kann es zweckmäßig sein, für besonders zeit- und kostenintensive Untersuchungen nur solche Präparate heranzuziehen, bei welchen keine oder nur eine sehr geringe Anzahl von Einzelproben unverwertbar sind, welche also besonders hohe Qualität aufweisen. Hingegen kann bei Untersuchungen, welche rasch und billig durchführbar sind, auch ein Präparat mit einer großen Anzahl von unverwertbaren Einzelproben, also ein Präparat mit niedriger Qualität, verwendet werden und dadurch wichtige Information liefern. Die eindeutige Kennung des Präparats kann beispielsweise durch eine Kennnummer, welche auch in Form eines Barcodes neben dem Präparat beispielsweise am Glasträger angeordnet sein kann, vorgesehen sein. Durch Einlesen des Barcodes können dann die in einer Datenbank gespeicherten Informationen über die Relevanz des Präparats aufgerufen und für nachfolgende Untersuchungen herangezogen werden.
Zusätzlich zu den oben genannten Verfahren kann auch ein mikroskopisches Bild des Präparats aufgenommen und zur Relevanzbestimmung verwendet werden. Derartige mikroskopische Bilder können weitere interessante Informationen enthalten. Durch die Überlagerung des mikroskopischen Bildes mit dem Bild, welches beispielsweise aus der Fluoreszenzstrahlung resultiert, kann die Aussage über die Relevanz der Einzelproben des Präparats verbessert werden.
Zusätzlich oder alternativ zur Fluoreszenzintensität kann auch die geometrische Form der Einzelprobe aus dem Einzelprobendaten- feld ermittelt werden und als Parameter zur Feststellung der Relevanz der Einzelproben verwendet werden. Beispielsweise kann aus dem Einzelprobendatenfeld die Kontur der Einzelprobe durch verschiedene Bilderkennungsverfahren ermittelt und mit der idealen Form der Einzelprobe, beispielsweise der Kreisform, verglichen werden. Bei zu großer Abweichung der ermittelten Form der Einzelprobe von der idealen Form kann diese als unverwertbar verworfen werden. Beispielsweise kommt es beim Einbringen von zylindrischen Proben in den Paraffinblock bei Gewebsprobenarrays manchmal zu Deformationen der Gewebsproben, welche nachfolgende Untersuchungsergebnisse verfälschen können.
Um die Relevanzkontrolle möglichst rasch durchführen zu können, werden vorzugsweise mehrere Präparate automatisch sequenziell oder parallel verarbeitet und die erhaltenen Daten über die Relevanz der Einzelproben der Präparate zusammen mit einer Kennung der Präparate gespeichert. Somit können bereits nach der Herstellung der Präparate von Probenarrays Daten über die Relevanz der Präparate gesammelt und gespeichert werden. Diese Daten stehen dann für eine Auswahl der Präparate für bestimmte nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung.
Die theoretischen Positionen der Einzelproben auf einem Präparat, insbesondere Gewebsprobenarray, sind vorzugsweise vorgegeben und gespeichert. Diese Positionswerte können zur Erzeugung der Datenfelder jeder Einzelproben des Präparats herangezogen werden.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist vorgesehen, dass die tatsächlichen Positionen der Einzelproben auf einem Präparat aus einem Bild des Präparats ermittelt werden. Dies kann beispielsweise durch Anwendung des so genannten „Region Growing" erfolgen. Mit Hilfe dieser mathematischen Methode werden bestimmte Pixel des Bildes, die so genannten Saatpunkte, mittels eines Zufallsgenerators vorgegeben und es wird eine bestimmte Anzahl umgebender Pixel in die Berechnung einbezogen. Dabei wird die Intensität des Saatpunkts mit den Intensitäten der umgebenden Punkte verglichen und in die Berechnung miteinbezogen. Das „Region Growing"-Verfahren eignet sich vor allem zur Bestimmung der Größe von Flächen, der Anzahl von Flächen, der Randlänge von Flächen, zum Anpassen einer Kurve an den Rand einer Fläche, zur Berechnung des Schwerpunkts und höheren Momenten sowie der Kreisvarianz bzw. elliptischen Varianz. Die Bestimmung der tatsächlichen Position der Einzelproben kann durch Anwendung des „Region Growing"-Verfahrens und anschließender Methode zur Bestimmung des Zentrums der Einzelproben durchgeführt werden.
Weiters können die tatsächlichen Positionen der Einzelproben mit den allenfalls gespeicherten, theoretischen Positionen verglichen werden und bei Abweichung die vorgegebenen Positionsinformationen entsprechend korrigiert werden. Beim so genannten „Gridding" werden die Daten analysiert und auf ein üblicherweise rechtwinkeliges Raster abgebildet. Dadurch kann dem Umstand begegnet werden, dass es bei der Anfertigung beispielsweise von Schnitten aus Probenarrays häufig zu einer Verzerrung des Rasters der Einzelproben kommt. Wenn die Position der Einzelproben eindeutig festgelegt ist, kann die Relevanzkontrolle auch zuverlässiger durchgeführt werden.
Gelöst wird die zweite erfindungsgemäße Aufgabe auch durch eine oben genannte Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays, bei der eine Einrichtung zur zerstörungsfreien Abtastung der Präparate der Probenarrays vorgesehen ist, welche Abtasteinrichtung mit einer die Information über die Positionen der Einzelproben der Präparate enthaltenden Datenbank und mit einer Rechnereinheit zur Verarbeitung der abgetasteten Präparate und zur Erzeugung von Datenfeldern je Einzelprobe und zur Auswahl zumindest eines Parameters aus jedem Einzelprobendatenfeld und zum Vergleich dieses Parameters oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verbunden ist, und dass eine Einrichtung zur Anzeige des Wertes des Vergleichs des zumindest einen Parameters oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit dem zumindest einen Schwellwert als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe, und ein Speicher zum Speichern dieses Relevanzkriteriums zusammen mit der Position der Einzelprobe des Präparats vorgesehen ist. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays gemäß der vorliegenden Erfindung besteht daher üblicherweise aus einer Rechnereinheit, welche mit einer entsprechenden Abtasteinrichtung verbunden ist und die erhaltenen Informationen entsprechend verarbeitet.
Dabei ist die Abtasteinrichtung vorzugsweise durch eine Lichtquelle und eine Einrichtung zur Aufnahme eines Bildes des Präparats gebildet. Im Falle des Durchlichtverfahrens ist die Lichtquelle oberhalb des Präparats und die Abtasteinrichtung unterhalb des Präparats angeordnet, so dass die Abtasteinrichtung das durch das Präparat hindurchscheinende Licht erfassen kann. Im Falle der Autofluoreszenz sind die Lichtquelle und die Abtasteinrichtung oberhalb des Präparats angeordnet.
Die Aufnahmeeinrichtung kann durch einen Fluoreszenzscanner gebildet sein, der die Fluoreszenzstrahlung des Präparats, welches mit einer entsprechenden Lichtquelle angeregt wurde, aufnimmt.
Die Lichtquelle kann durch einen Laser gebildet sein, wobei die Wellenlänge an die jeweiligen Gegebenheiten und die Verwendung allfälliger Fluorochrome angepasst wird.
Ebenso können mehrere Lichtquellen in verschiedenen Wellenlängenbereichen vorgesehen sein oder auch eine Lichtquelle, welche Licht in einem sehr breiten Wellenlängenbereich aussendet.
Weiters kann eine Einrichtung zur Transformation des aufgenommenen Bildes des Schnitts in zumindest ein binäres Bild vorgesehen sein.
Um die Relevanz der erhaltenen Daten zu erhöhen, kann eine Filtereinrichtung zum Filtern der aufgenommenen Bilder der Präparate vorgesehen sein. Wie bereits oben erwähnt, kann es sich dabei um Filter handeln, welche vor die Aufnahmeeinrichtung Hardwaremäßig angeordnet werden, aber auch um Filter, welche Softwaremäßig eine Bereinigung der erhaltenen Daten vornehmen.
Zusätzlich kann ein Mikroskop zur Aufnahme der Präparate zur Schaffung zusätzlicher Information zur Relevanzbestimmung vorgesehen sein. Um eine möglichst rasche Analyse zuzulassen, kann eine Einrichtung zur automatischen Zu- und Abführung der Präparate vorgesehen sein.
Ebenso kann ein Magazin zur Aufnahme einer Vielzahl von Präparaten vorgesehen sein, aus welchem die Präparate zur Relevanzbestimmung automatisiert entnommen und wieder retourniert werden. Somit kann eine teilautomatisierte Relevanzbestimmung der Präparate erzielt werden.
Vorzugsweise ist eine Einrichtung zur Ermittlung der tatsächlichen Positionen der Einzelproben auf dem Präparat vorgesehen. Damit kann die reale Position der Einzelproben, welche häufig nicht mit der gewünschten Position übereinstimmt, zuverlässig ermittelt werden.
Schließlich kann eine Einrichtung zur Korrektur der Positionen der Einzelproben auf dem Präparat vorgesehen sein, welche mit einer Einrichtung zur Aufnahme des Präparats zur Ermittlung der tatsächlichen Positionen der Einzelproben verbunden ist. Dadurch können die üblicherweise beim Schneiden eines Probenarrays entstehenden Verzerrungen des Rasters der angeordneten Einzelproben korrigiert werden.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Darin zeigen:
Fig. 1 ein schematisches Bild zur Veranschaulichung der Herstellung von Schnitten aus Probenarrays;
Fig. 2 die Draufsicht auf ein Beispiel eines Schnitts eines Probenarrays;
Fig. 3 ein Blockschaltbild zur Veranschaulichung des Verfahrens zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 4a und 4b Beispiele einer vorhandenen und einer nicht-vorhandenen bzw. stark beschädigten Einzelprobe eines Präparats;
Fig. 5a und 5b die Messergebnisse bei den Einzelproben gemäß Fig. 4a und 4b unter Verwendung der Fluoreszenzintensität als Parameter;
Fig. βa und βb zwei mögliche Datensätze der Einzelproben gemäß Fig. 4a und 4b;
Fig. 7 das Messergebnis einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Ausnützung der Autofluoreszenz; und
Fig. 8 ein Blockschaltbild einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenar- rays .
Fig. 1 zeigt ein schematisches Bild zur Veranschaulichung der Herstellung von Präparaten 4 bzw. Schnitten aus Probenarrays 1, insbesondere Gewebsprobenarrays (TMAs tissue microarrays) . Das Probenarray 1 besteht aus einem quaderförmigen Paraffinblock 2, in den einzelne zylindrische Proben 3, insbesondere Gewebsproben, eingebracht werden. Aufgrund unterschiedlicher Herkunft der Einzelproben 3, aber auch aufgrund von mechanischen Problemen beim Einbringen der Einzelproben 3 in den Paraffinblock 2, ist die Tiefe der Einzelproben 3 im Paraffinblock 2 in der Praxis unterschiedlich. Bei der Anfertigung von Präparaten 4 bzw. Schnitten aus dem Probenarray 1, was vorzugsweise mit einem Mikrotom durchgeführt wird, fehlen insbesondere in tieferen Regionen des Probenarrays 1 häufig Einzelproben 3 an verschiedenen Positionen. Diese fehlenden Einzelproben 3 auf den Präparaten 4 stehen bei nachfolgenden histologischen oder histopathologischen Untersuchungen nicht zur Verfügung und reduzieren somit die aus den Untersuchungen erhaltenen Informationen. Es ist daher sehr wichtig, über die Relevanz der Präparate 4 eine Aussage treffen zu können.
Wie im linken Bild der Fig. 1 schematisch dargestellt, wird gemäß dem Stand der Technik eine Auswahl an Präparaten 5 bzw. Schnitten des Probenarrays 1 zur Qualitätskontrolle (QC) herangezogen. Dabei werden die Präparate 5 üblicherweise histologisch eingefärbt und aufgrund von Farbunterschieden im Mikroskopbild eine Aussage über das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Einzelprobe 3 am Präparat 5 gemacht. Die Präparate 5 stehen nach der Relevanzkontrolle nicht mehr für andere Untersuchungen zur Verfügung. Dies reduziert die Anzahl der insgesamt verwert- baren Präparate 4. Zudem bietet eine nach dem Stand der Technik durchgeführte Relevanzkontrolle eine relativ unsichere Information, da für die Präparate zwischen den stichprobenartig ausgewählten Präparaten 5 keine zuverlässigen Aussagen über deren Relevanz getroffen werden kann.
Es besteht daher ein Bedarf an einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Bestimmung der Relevanz der Präparate 4 eines Pro- benarrays 1, welche durch die Relevanzkontrolle nicht zerstört werden und somit für nachfolgende Untersuchungen weiterhin zur Verfügung stehen.
Fig. 2 zeigt eine Draufsicht auf ein Präparat 4 eines Probenar- rays 1, bei dem die Einzelproben 3 in einem bestimmten Muster angeordnet sind, welches eine eindeutige Zuordnung der Einzelproben 3 zulässt. Im dargestellten Beispiel sind mit einem Teil der Löcher für die Einzelproben 3 die Spalten binär kodiert. Somit ist es nach Herstellung der Präparate 4 nicht möglich, die Einzelproben 3 beispielsweise durch Umdrehen oder Verdrehen des Glasträgers zu verwechseln. Die Position der Einzelproben 3 im Probenarray 1 bzw. auf dem Präparat 4 ist eindeutig zugeordnet.
Fig. 3 zeigt ein Blockschaltbild zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten 4 von Probenarrays 1. Beginnend mit der Herstellung eines Probenarrays 1 gemäß Block 101 werden gemäß Block 102 die Präparate 4 aus den Probenarrays 1 hergestellt. Danach wird gemäß Block 103 die Relevanzkontrolle ohne Zerstörung der Präparate 4 eingeleitet. Entsprechend Block 104 werden die Präparate 4 der Probenarrays 1, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben 3, zerstörungsfrei abgetastet, resultierend in einem Datenfeld des Präparats 4. Die zerstörungsfreie Abtastung der Präparate 4 kann beispielsweise im Durchlichtverfahren und bzw. oder durch Anwendung der Autofluoreszenz erfolgen. Entsprechend Block 105 wird die Information der Positionen der Einzelproben 3 auf dem Präparat 4 dazu verwendet, Datenfelder jeder Einzelprobe 3 des Schnittes 4 zu erzeugen. Dabei kann die theoretische Position der Einzelprobe 3 auf dem Präparat 4 oder die nach dem Vergleich der ermittelten tatsächlichen Positionen der Einzelproben 3 auf dem Präparat 4 mit den theoretischen Positionen (nach dem „Grid- ding"-Verfahren) herangezogen werden. Diese Einzelprobendatenfelder werden nun entsprechend Block 106 derartig verarbeitet, dass zumindest ein Parameter aus dem Einzelprobendatenfeld ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten gemäß Block 107 mit zumindest einem Schwellwert verglichen wird und der Vergleichswert als Relevanzkriterium für die Einzelprobe 3 verwendet und zusammen mit der Position der Einzelprobe 3 des Präparats 4 gespeichert wird. Das Ergebnis der bei Block 107 erhaltenen Relevanzkontrolle kann mit Ergebnissen von zusätzlichen Untersuchungen des Präparats 4 entsprechend Block 108 zusammengeführt und in Block 109 einer Analyse unterzogen werden. Bei diesen in Block 108 geschaffenen Ergebnissen von zusätzlichen Untersuchungen des Präparats 4 kann es sich um unterschiedliche auch manuell vorgenommene Verfahren handeln, welche zusätzliche Informationen schaffen. Schließlich wird das Verfahren gemäß Block 110 beendet und die Daten gespeichert. Durch die Relevanzbestimmung wird wichtige Information geschaffen, die eine Interpretation der Daten aus den Präparaten 4 der Probenarrays 1 verbessert und eine bessere Ausnützung der Präparate 4 zulässt.
In Fig. 4a und 4b sind Beispiele von Autofluoreszenzaufnahmen zweier Einzelproben 3 eines Präparates 4 eines Probenarrays 1 dargestellt. Dabei handelt es sich um schematische Abbilder tatsächlicher Messergebnisse. Die Einzelprobe 3 aus Fig. 4a ist nahezu ideal kreisförmig und hebt sich vom umgebenden Paraffinblock 2 deutlich ab. Fig. 4a zeigt das Bild einer Einzelprobe 3 mit besonders hoher Qualität.
Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 4b ein stark deformiertes Loch 5 im Paraffinblock 2, in welchem ein Rest 6 der Einzelprobe 3 oder an Paraffin vorliegt. Diese Einzelprobe 3 ist stark deformiert bzw. gar nicht vorhanden und steht daher für nachfolgende Untersuchungen nicht zur Verfügung.
Die Fig. 5a und 5b zeigen eine Variante eines Verfahrens zur Bestimmung der Relevanz von Probenarrayschnitten unter Verwendung der Einzelproben 3 gemäß den Fig. 4a und 4b. Dabei wird als Parameter beispielsweise die Fluoreszenzintensität I gewählt, deren Verteilung in Abhängigkeit der x- und y-Achse ausgewertet wird. Fig. 5a zeigt in Diagramm 7 die Summe der Fluoreszenzintensität ∑I in Abhängigkeit der x-Achse und Diagramm 8 die Summe der Fluoreszenzintensität ∑I in y-Richtung. Die Verläufe der Diagramme 7 und 8 weisen einen Wendepunkt auf, der ein lokales Maximum der Fluoreszenzintensität ∑I im Wesentlichen in der Mitte der Einzelprobe 3 zeigt. Die Intensitätsverläufe entsprechend den Diagrammen 7 und 8 können nunmehr weiter verarbeitet werden, beispielsweise ein Mittelwert gebildet und mit einem oder mehreren Schwellwert (en) verglichen werden. Dieser Vergleichswert wird als Relevanzkriterium für die Einzelprobe 3 verwendet und zusammen mit der Positionsinformation der Einzelprobe 3 des Präparats 4 beispielsweise in einer Datenbank gespeichert. Aus den Intensitätsverläufen gemäß Fig. 5a zeigt sich eine besonders hohe Qualität der Einzelprobe 3 gemäß Fig. 4a.
Hingegen sind die Verläufe 7 und 8 der Fluoreszenzintensitäten I in x- und y-Richtung bei der Einzelprobe gemäß Fig. 5b deutlich unterschiedlich und weisen einerseits eine wesentlich niedrigere Intensität auf und andererseits einen deutlich vom Idealfall abweichenden Verlauf, der als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe 3 herangezogen werden kann. Im dargestellten Beispiel weist der Verlauf der Fluoreszenzintensität I ein lokales Minimum im Vergleich zur Einzelprobe 3 gemäß Fig. 5a auf. Aus dem Parameter der Fluoreszenzintensität I kann also besonders rasch und zuverlässig eine Aussage über die Relevanz der Einzelprobe 3 auf dem Präparat 4 des Probenarrays 1 getroffen werden.
Die Fig. βa und 6b zeigen zwei weitere mögliche Datensätze der Einzelproben 3 gemäß den Fig. 4a und 4b. Dabei wird die Autofluoreszenzintensität I in Abhängigkeit des Pixels der Aufnahme der Einzelprobe 3, also des Einzelprobendatenfeldes dargestellt und verschiedene Werte daraus berechnet. Diese abgeleiteten Parameter, wie z.B. Extremwerte, Mittelwerte oder dgl., wie durch die horizontalen Linien eingezeichnet, können als Relevanzkriterium für die Einzelprobe 3 herangezogen werden. Wie dem Diagramm gemäß Fig. 6b entnommen werden kann, unterscheiden sich die Intensitäten I in Abhängigkeit der Lokalisation der Einzelpixel des Datenfeldes der Einzelprobe 3 deutlich von jenen gemäß Fig. βa. Die Fig. 6a und 6b zeigen die Ergebnisse so genannter Boxplot- Messungen. Als Box wird das durch die Quartile bestimmte Rechteck bezeichnet, welche 50 % der Daten umfasst. Durch die Länge der Box ist der Interquartilsabstand abzulesen. Dies ist ein Maß der Streuung, welches durch die Differenz des oberen und unteren Quartiis bestimmt ist. Als weiteres Quartil ist der Median (durchgehende Linie) eingezeichnet. Die weiteren horizontalen Linien werden als so genannte Whisker bezeichnet, deren Länge maximal das 1,5-fache des Interquartilabstands beträgt und aus den Daten bestimmbar ist. Die oberste und die unterste strich- liert gezeichnete Linie zeigen die Extremwerte des oberen und unteren Whiskers. Werte, welche außerhalb dieser Grenzen liegen, werden als Ausreißer bezeichnet und zur Relevanzbestimmung der Probe herangezogen.
Es zeigt Fig. 7 ein weiteres Beispiel einer einfachen Relevanzbestimmung gemäß dem vorliegenden Verfahren, wobei die Fluoreszenzintensität I im logarithmischen Maßstab in Abhängigkeit der Position L der Einzelprobe 3 dargestellt wird. Dabei zeigen die dunklen Punkte Positionen der Einzelproben 3 bzw. Pixel des Bildes der Einzelprobe 3 an, an welchen Material vorhanden ist und die weißen Punkte Positionen der Einzelproben 3 ohne Material. Schwarze Punkte unterhalb des manuell ermittelten Schwellwerts S weisen darauf hin, dass Material aus technischen Gründen nicht vorhanden ist. Dies wird als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe 3 herangezogen. Die Bestimmung des Schwellwerts S kann auch automatisch aus den Daten des Präparats ermittelt werden, wobei eine Veränderung des Schwellwerts von einem Durchgang zum anderen bei so genannten lernenden Systemen möglich ist.
Schließlich zeigt Fig. 8 ein Blockschaltbild einer möglichen Vorrichtung 10 zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten 4 von Probenarrays 1, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben 3 an verschiedenen Positionen. Die Vorrichtung 10 weist eine Einrichtung 11 zur zerstörungsfreien Abtastung der Präparate 4 der Probenarrays 1 auf. Die Abtasteinrichtung 11 kann mit einer Datenbank 12 verbunden sein, welche Information über die Position der Einzelproben 3 der Präparate 4 enthält. Die Abtasteinrichtung 11 ist insbesondere durch eine Lichtquelle 13, vorzugsweise einen Laser, gebildet und eine Einrichtung 14 zur Aufnahme eines Bildes des Präparats 4. Für weitere Informationen kann ein Mikroskop 15 zur Aufnahme eines Bildes der Präparate 4 angeordnet sein. Die Abtasteinrichtung 11 ist mit einer Rechnereinheit 16 verbunden, welche die Daten der abgetasteten Präparate 4 entsprechend verarbeitet und Datenfelder je Einzelprobe 3 erzeugt. In der Rechnereinheit 16 wird ein Parameter aus jedem Einzelprobendatenfeld ausgewählt und dieser Parameter oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verglichen und der Vergleichswert auf einer Anzeigeeinrichtung 17, beispielsweise einem Bildschirm, dargestellt und in einem Speicher 18 als Relevanzkriterium zusammen mit der Position der Einzelprobe 3 des Präparates 4 gespeichert. Zur effizienteren Abwicklung des Verfahrens zur Bestimmung der Relevanz der Präparate 4 kann eine Einrichtung 19 zur automatischen Zu- und Abführung der Präparate 4 vorgesehen sein, welche vorzugsweise mit einem Magazin 20 zur Aufnahme einer Vielzahl von Präparaten 4, die aus einem entsprechenden Lager 21 entnommen wurden, verbunden ist.
Obgleich in den Beispielen hauptsächlich auf Gewebsprobenarrays (TMAs, tissue microarrays) eingegangen wird, ist die vorliegende Erfindung, wie bereits oben erwähnt, für verschiedenste Proben- arrays, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben, anwendbar.
Beispiel für die Anwendung des Verfahrens an den Schnitten eines Gewebsprobenarrays
Das gegenständliche Verfahren zur Bestimmung der Relevanz von Probenarray-Präparaten eignet sich zur Identifizierung der verfügbaren Einzelproben je Präparat. Im vorliegenden Beispiel wird ein Gewebsprobenarray (TMA, Tissue Microarray) mit jeweils 450 Einzelproben bzw. „Cores" untersucht. Das Gewebsprobenarray enthält jeweils 30 Einzelproben eines bestimmten Organs bzw. Gewebes, welche in den Zeilen der folgenden Tabelle aufgelistet sind. Durch das gegenständliche Verfahren zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten von Probenarrays kann nunmehr die Anzahl der Einzelproben je Gewebe festgelegt werden, was für nachfolgende Untersuchungen an diesen Präparaten wesentlich ist. Dabei wird anhand der jeweiligen Position der Einzelprobe festgestellt, welche Einzelprobe nicht vorhanden bzw. nicht verwertbar ist. Würde hingegen nur die Anzahl der nicht vorhandenen Einzelproben oder zerstörten Einzelproben ohne deren Position festgestellt, würde dies im gegenständlichen Fall eines Tissue Microarrays eine unzureichende Information liefern, da beispielsweise keine Aussage darüber getroffen werden kann, von welcher Gewebeart mehr oder weniger Einzelproben vorhanden sind. Die unten stehende Tabelle zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens an zwei Schnitten eines Gewebsprobenarrays bestehend aus 450 Einzelproben aus 15 verschiedenen Geweben. Dabei wird jede fehlende oder zerstörte Einzelprobe eindeutig identifiziert, so dass im Endeffekt die Anzahl der verwertbaren Einzelproben festgelegt werden kann. Spalte 2 der Tabelle zeigt die Anzahl der verwertbaren Einzelproben je Gewebsart bei Schnitt Nr. 4 des Gewebsprobenarrays. Insgesamt 14 der 450 Einzelproben sind defekt und somit nicht verwertbar oder fehlen und stehen somit ebenfalls für nachfolgende Untersuchungen nicht zur Verfügung. Spalte 3 der Tabelle zeigt das Ergebnis für Schnitt Nr. 137 des gleichen Gewebsprobenarrays. Dabei sind bereits 223 von 450 Einzelproben zerstört oder nicht vorhanden. Dies zeigt deutlich das oben beschriebene Problem, dass viele Einzelproben nicht so weit in den Paraffinblock ragen und somit gerade bei tieferen Schnitten des Gewebsprobenarrays fehlen. Für bestimmte Untersuchungen oder für Untersuchungen an bestimmten Gewebsarten können jedoch bei Kenntnis dieser Zusatzinformation nunmehr auch solche Schnitte verwendet werden, bei welchen mehr Einzelproben unverwertbar sind und es kann die an sich beschränkte Anzahl an Gewebsproben optimal ausgenützt werden. Beispielsweise wird eine Untersuchung der Gewebsproben der Zervix, Mamma oder des Ovars an Schnitt Nr. 137 durchaus sinnvoll sein, da in diesem Fall eine Mehrzahl der Einzelproben vorhanden ist, wohingegen beispielsweise nur vier von 30 Leberproben vorhanden sind. Die Kenntnis der fehlenden Einzelproben eines Präparats kann daher dazu verwendet werden, die Daten für nachfolgende automatisierte Analysen zu filtern.
Über jede Einzelprobe des Gewebsprobenarrays liegt üblicherweise auch eine Information über den Patienten vor. Beispielsweise stammen die 30 Einzelproben je Gewebsart im gegenständlichen Beispiel von 10 verschiedenen Quellen, also beispielsweise 10 verschiedenen Patienten. Demnach existieren von der selben Quel- Ie bzw. dem selben Patienten im Idealfall 3 Einzelproben. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Relevanz jeder Einzelprobe des Präparats bestimmt, so dass beispielsweise eine Aussage darüber getroffen werden kann, von welcher Gewebsart alle 3 der im Idealfall vorhandenen Einzelproben verwertbar sind oder von welcher beispielsweise nur 2 oder nur 1 oder gar keine Einzelprobe verwertbar ist. Für bestimmte Untersuchungen an dem Präparat ist diese Information natürlich von erheblicher Bedeutung. Wie die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Informationen aufbereitet werden, hängt jedoch stark vom jeweiligen Anwendungsfall und den nachfolgenden Untersuchungen an den Präparaten ab.
TABELLE
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Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten (4) von Probenarrays (1), insbesondere Gewebsprobenarrays, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben (3) an verschiedenen Positionen, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise jedes Präparat (4) zerstörungsfrei abgetastet wird, aus den erhaltenen Daten zusammen mit den Positionen der Einzelproben (3) auf dem Präparat (4) Datenfelder jeder Einzelprobe (3) des Präparats (4) erzeugt werden, aus jedem Einzelprobendatenfeld zumindest ein Parameter ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verglichen wird, und der Vergleichswert als Kriterium für die Relevanz der Einzelprobe
(3) verwendet wird, und jene Einzelproben (3) des Präparats (4), deren Relevanz unter einem vorgegebenen Relevanzgrenzwert liegt, als unverwertbar identifiziert werden, und dass der Vergleichswert zusammen mit der Position der Einzelprobe (3) sowie die Positionen aller unverwertbaren Einzelproben (3) zusammen mit einer eindeutigen Kennung des Präparats (4) gespeichert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (4) optisch abgetastet und das Bild gespeichert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (4) mit Licht beleuchtet und ein Bild des durchscheinenden Lichts aufgenommen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (4) mit Licht, insbesondere Laserlicht, angeregt wird und ein Bild der resultierenden Fluoreszenzstrahlung des Präparats (4) aufgenommen und gespeichert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das aufgenommene Bild gefiltert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (4) mit kombiniertem Licht verschiedener Wellenlängen angeregt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Bild des Präparats (4) in einem standardisierten Format, beispielsweise im TIFF- oder JPG-Format gespeichert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Bild des Präparats (4) in zumindest ein binäres Bild transformiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgenommenen Bilder der Präparate (4) gefiltert werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Parameter die Fluoreszenzintensität, vorzugsweise über den Querschnitt der Einzelprobe (3) gemittelt und als Parameter zur Feststellung der Relevanz der Einzelproben (3) verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die unverwertbaren Einzelproben (3) eines Präparats (4) summiert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Summe der unverwertbaren Einzelproben (3) eines Präparats (4) mit einem vorgegebenen Grenzwert verglichen wird und bei Überschreiten dieses Grenzwerts das Präparat (4) des Probenarrays (1) als unverwertbar identifiziert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (4) aufgrund der ermittelten Summe unverwertbarer Einzelproben (3) klassifiziert wird und ein Klassifizierungswert zusammen mit einer eindeutigen Kennung des Präparats (4) gespeichert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein mikroskopisches Bild des Präparats (4) aufgenommen und zur Relevanzbestimmung verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn- zeichnet, dass aus dem Einzelprobendatenfeld die geometrische Form der Einzelprobe ermittelt und als Parameter zur Feststellung der Relevanz der Einzelproben (3) verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Präparate (4) automatisch sequentiell oder parallel verarbeitet und die erhaltenen Daten über die Relevanz der Einzelproben (3) der Präparate (4) zusammen mit einer Kennung der Präparate (4) gespeichert werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionen der Einzelproben (3) auf einem Präparat (4) vorgegeben und gespeichert sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die tatsächlichen Positionen der Einzelproben (3) auf einem Präparat (4) aus einem Bild des Präparats (4) ermittelt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die tatsächlichen Positionen der Einzelproben (3) mit den gespeicherten Positionen verglichen werden, und bei Abweichung die gespeicherten Positionsinformationen entsprechend korrigiert werden.
20. Vorrichtung (10) zur Bestimmung der Relevanz von Präparaten (4) von Probenarrays (1), insbesondere Gewebsprobenarrays, enthaltend eine Vielzahl an einzelnen Proben (3) an verschiedenen Positionen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung (11) zur zerstörungsfreien Abtastung der Präparate (4) der Probenarrays (1) vorgesehen ist, welche Abtasteinrichtung (11) mit einer die Information über die Positionen der Einzelproben (3) der Präparate (4) enthaltenden Datenbank (12) und mit einer Rechnereinheit (16) zur Verarbeitung der abgetasteten Präparate (4) und zur Erzeugung von Datenfeldern je Einzelprobe (3) und zur Auswahl zumindest eines Parameters aus jedem Einzelprobendatenfeld und zum Vergleich dieses Parameters oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verbunden ist, und dass eine Einrichtung (17) zur Anzeige des Wertes des Vergleichs mit dem zumindest einen Schwellwert als Relevanzkriterium für die Einzelprobe (3), und ein Speicher (18) zum Speichern dieses Relevanzkriteriums zusammen mit der Position der Einzelprobe (3) des Präparates (4) vorgesehen ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtasteinrichtung (11) durch eine Lichtquelle (13) und eine Einrichtung (14) zur Aufnahme eines Bildes des Präparates (4) gebildet ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeeinrichtung (14) durch einen Fluoreszenzscanner gebildet ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (13) durch einen Laser gebildet ist.
24. Vorrichtung nach Anspruch 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Lichtquellen (13) in verschiedenen Wellenlängenbereichen vorgesehen sind.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Transformation des aufgenommenen Bildes des Präparats (4) in zumindest ein binäres Bild vorgesehen ist.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine Filtereinrichtung zum Filtern der aufgenommenen Bilder der Präparate (4) vorgesehen ist.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop (15) zur Aufnahme der Präparate (4) zur Schaffung zusätzlicher Information zur Relevanzbestimmung vorgesehen ist.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung (19) zur automatischen Zu- und Abführung der Präparate (4) vorgesehen ist.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 28, dadurch ge- kennzeichnet, dass ein Magazin (20) zur Aufnahme einer Vielzahl von Präparaten (4) vorgesehen ist, aus welchem die Präparate (4) zur Relevanzbestimmung automatisiert entnommen und wieder re- tourniert werden.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Ermittlung der tatsächlichen Position der Einzelproben (3) auf dem Präparat (4) vorgesehen ist.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Korrektur der Positionen der Einzelproben (3) auf dem Präparat (4) vorgesehen ist, welche Korrektureinrichtung mit einer Einrichtung zur Aufnahme des Präparats (4) zur Ermittlung der tatsächlichen Positionen der Einzelproben (3) verbunden ist.
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