JP2009517664A - サンプルアレイ組織標本の妥当性を判定する方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の個別サンプル（３）を様々な位置に収容するサンプルアレイ（１）の組織標本（４）の妥当性を判定する方法および装置（１０）に関する。迅速な方式で好ましくは組織標本（４）を破壊することなく実行することができる方法および装置（１０）を作製するために、サンプルアレイ（１）の組織標本（４）を非破壊式にサンプリングする装置（１１）が提供される。前記サンプルアレイは、データバンク（１２）と、サンプリングされた組織標本（４）を処理し、各個別サンプル（３）のデータフィールドを作成し、各個別サンプルデータフィールドから少なくとも１つのパラメータを選択し、前記パラメータもしくはそのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはそのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較する計算ユニット（１６）とに接続され、前記データバンクは、組織標本（４）の個別サンプル（３）の位置に関する情報を含む。本発明は、また、少なくとも１つのしきい値に対する比較値を個別サンプル（３）の妥当性基準として表示する装置（１７）と、前記妥当性基準を記憶するメモリ（１８）とに関する。

Description

本発明は、サンプルアレイ、詳細には様々な位置にいくつかの個別サンプルを含む特定の組織サンプルアレイの組織標本（preparation）の妥当性を判定する方法に関する。

更に、本発明は、サンプルアレイ、より詳細には様々な位置にいくつかの個別サンプルを含む組織サンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する装置に関する。

診断や研究のために、医学では、様々なサンプル（例えば、組織サンプル）を収集し、そのサンプルを様々な検査にかけることが一般的である。人間や動物の生体から取り出した組織サンプルの場合には、その組織サンプルをパラフィンに埋め込み、組織サンプルの特定の選択した箇所にある円筒状コア（いわゆる「コア」）を抽出し、それを対応するサイズのパラフィンブロックの円筒状の穴に挿入することが一般的である。次に、そのような組織サンプルアレイ（組織マイクロアレイ、即ちＴＭＡ（tissue microarray））が、通常ミクロトームを利用して切断され、例えば組織標本の組織学的な研究が行われる。

診断または治療のための重要な情報をできる限り迅速に取得するために、具体的には多数の切片と個別サンプルによる前述の組織サンプルアレイが、高度な自動分析に送られる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２１５９３６号には、そのような組織サンプルアレイをできる限り迅速且つ効率的に研究する方法および装置が記載されている。

以下の説明では、主に組織サンプルアレイについて検討するが、本発明は、そのようなサンプルに限定されず、いくつかの個別サンプルを含む様々なほとんどのサンプルアレイの組織標本の事例にも適用することができる。また、人間、動物および植物組織の他に、様々なほとんどの組織と様々な由来の組み合わせが、本発明で使用するのに適している。また、組織から抽出され、ガラスサポートに一滴ずつ供給された、例えば、タンパク質や核酸などの材料を本発明で検査することができる。更に、生体からの血液や唾液などの体液を分析することができる。最後に、サンプルアレイの形で配列された培養細胞やその一部分だけでなく有機や無機材料も組織標本になり得る。

ＴＭＡ（組織マイクロアレイ）の事例では、パラフィンブロックに導入されるほぼ円筒状の個別サンプルの数は、通常、数百個の個別サンプルの範囲内にある。いわゆるターゲットブロックからできる限り多数の個別切片を得ることができるようにするには、導入された個別サンプルが、パラフィンブロック内のできる限り均一な深さに達することである。実際には、そのような組織サンプルアレイを作成する際、円筒状個別サンプルまたは「コア」の長さが異なるだけでなく、個別サンプルがパラフィンブロックに導入されるときの問題によって、パラフィンブロック内のサンプルの深さが異なることになり、従って、具体的にはパラフィンブロックの切片内のより深い領域で、個別の「コア」が部分的にしか存在しないか全く存在しないことになる。従って、切片のその後の研究を確実に評価するために、切片の妥当性を判定することが極めて重要である。具体的には、個別サンプルが切片の固有の場所にあるかどうかを評価できなければならない。

しかしながら、また、他のサンプルでは、組織標本内の個別サンプルの妥当性の評価をできることが特に重要である。このことは、一方では、特に医療分野での診断でサンプルの分析後に行なわれる評価の信頼性に極めて重要である。一方、組織標本の個別サンプルの妥当性を評価できれば、組織標本は、経済的な価値を大幅に高めることができる。

現在、組織標本の妥当性のそのような監視は、光学顕微鏡下にある組織標本のランダムサンプルに対して高コストな手動の方法で行われ、それにより妥当性を監視するためにパラフィンブロックの切片の選択が検査される。この場合、検査に使用されるサンプルアレイの切片は、通常、欠落した個別サンプルを検出し易いように組織学的に着色される。これらの切片は、着色のために後の研究に利用できなくなる。更に、そのようなランダムサンプル的な研究は、ランダムサンプル間の組織標本の実際の妥当性に関する情報を提供しない。即ち、この情報は、ランダムサンプルの数を増やすことにより強化されるが、後の研究に利用できる組織標本の数が少なくなる。更に、通常の手動で行われる監視は極めて時間がかかり、従って高コストである。

多数のサンプルの自動分析を行うことができる自動走査方法は（特に生体サンプル）、例えば、国際公開第０２／１０１６３５号に記載されている。この目的のため、フラットベッドスキャナが自動画像分析と組み合わせて使用される。この場合、分析は、いくつかの個別サンプルを含むサンプルアレイではなく、サンプルの切片で行われる。

米国特許出願公開第２００４／０１３６５８１号は、試薬で前処理した生体サンプルを顕微鏡スライド上に配置して光学的に走査する、生体サンプルの画像を自動分析する方法および装置について述べている。また、この分析は、いくつかの個別サンプルを含むサンプルアレイを対象としない。更に、サンプルは、組織標本による影響を受け、更には破壊される。

最後に、国際公開第９９／３９１８４号は、微量定量プレート内に配列された生体サンプルを自動的に画像処理し分析する装置および方法を示している。この分析もいくつかの個別サンプルを含むサンプルアレイは対象としていない。

米国特許出願公開第２００３／０２１５９３６号明細書 国際公開第０２／１０１６３５号パンフレット 米国特許出願公開第２００４／０１３６５８１号明細書 国際公開第９９／３９１８４号パンフレット

従って、本発明の目的は、組織標本の妥当性を判定するために、組織標本を破壊することなくできる限り迅速且つできる限り多く実行することができる前述の方法を提供することである。妥当性の監視は、サンプルアレイの組織標本の妥当性に関する情報をできる限り低コスト且つできる限り短時間で取得できるように自動化することである。先行技術の欠点は、回避されるかあるいは少なくとも軽減される。

本発明の別の目的は、サンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する前述の装置を提供することであり、この装置は、できる限り迅速且つ確実な妥当性の監視を可能にし、更にできる限り単純且つ堅牢に設計され、できる限り経済的に作製することができる。

本発明による第１の目的は、好ましくは各組織標本が非破壊方式で走査され、組織標本の個別サンプルのデータフィールドは、組織標本内の個別サンプルの位置と共に取得されたデータから作成され、それぞれの個別サンプルデータフィールドから少なくとも１つのパラメータが選択され、このパラメータもしくはそのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはそのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較され、その比較値は、個別サンプルの妥当性基準として使用され、妥当性が事前設定された妥当性境界より下にある組織標本の個別サンプルは、使用不能として識別され、また比較値は、個別サンプルの位置ならびに全ての使用不能な個別サンプルの位置と共に、組織標本の固有の識別と共に記憶されることにより達成される。

したがって、本発明による方法は、任意の数の組織標本またはそれぞれの組織標本を妥当性の監視にかけるだけでよく、これは、組織標本が、好ましくは非破壊式に検討され、従って更に後の研究に利用可能であるため可能である。このために、各組織標本の非破壊処置と走査および対応データの収集が行われる。個別サンプルがサンプルアレイ内にある位置は、サンプルアレイの個別サンプルが配置される事前設定された位置でもよく、個別サンプルの決定された実際の位置でもよい。個別サンプルがあるべき位置または存在する位置に基づいて、それぞれの個別サンプルのデータフィールド内のデータを分離することができ、これらのデータフィールドを追加の処理に送ることもできる。この追加の処理のために、少なくとも１つのパラメータが選択され、そのパラメータもしくはそのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはそのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較される。それぞれの個別サンプルに関して得られた比較値は、最終的に個別サンプルの妥当性基準として使用され、組織標本の個別サンプルは、位置情報と共に記憶される。従って、本発明による方法の結果として、組織標本のすべての個別サンプルの妥当性基準を含むデータセットが存在する。この場合、組織標本の品質の全体的な評価だけでなく、個別サンプルが存在するかどうかの評価が行われることが重要である。最も単純な場合、この妥当性基準は、二値でもよく、即ち、個別サンプルが存在するかどうかに関する１つの評価だけを行うものでもよい。ほとんどの各組織標本に実行されるそのような妥当性の監視によって、様々な個別サンプルが存在しない組織標本を後の研究に使用することもできる。例えば、妥当性の監視で得られたデータは、後の研究、例えば組織標本の組織学的研究に採用され、その結果、組織標本内の欠陥があるかまたは存在しない個別サンプルを、得られたデータから除去することができ、従って誤解釈が生じることがなくなる。サンプルアレイ（具体的には組織サンプルアレイ）によって自動的に実行される組織標本の分析は、そのような付加的なデータセットによってのみ可能であり、これにより、組織標本の妥当性の確実な評価が行われる。組織標本の妥当性を判定する方法は、実行される組織標本の研究の直前あるいはそれより早いいかなる時間に実行されてもよく、データは、データベースに組織標本に関する追加の情報と共に記憶され、それにより後の研究に利用可能になる。データベースにデータを記憶する代わりに、データは、いわゆるフラットファイル形式で保存されてもよい。本発明による方法によって、例えば、ＴＭＡ（組織マイクロアレイ）の場合、サンプルアレイの切片に関するはるかに多数の後の研究にかけられ、従って、研究のためだけでなく診断や治療のために、しばしば限定される組織リソースからより多くの情報を得ることができる。従って、妥当性の監視に使用できないと見なされる個別サンプルを明白に識別するデータセットが存在する。従って、存在しないか使用不能な個別サンプルを含む組織標本も後の研究に適しており、その理由は、存在しないか破壊された個別サンプルが明白に識別され、そのような個別サンプルの後の研究によって得られたデータを廃棄することができるからである。従って、誤解釈のおそれなしに、後の研究に、サンプルアレイのより多くの組織標本が利用可能である。本発明による非破壊方法を、個別の組織標本が損なわれたか或いは破壊された他の方法と組み合わせることにより、当然ながら、重要な追加情報を得ることができるようになる。

好都合なことに、サンプルアレイの組織標本は光学的に走査され、得られた画像は記憶される。組織標本は、そのような光学的方法による影響を受けず、従って更に後の研究に利用可能である。従って、基本的に、後の研究に利用可能な組織標本の数を減らすことなく、研究のすべての組織標本を妥当性の判定に使用することができる。更に、光学走査は、特に高速かつ自動化も可能であり、それにより短時間に多数の組織標本を研究することができる。

組織標本に光を照射することができ、透過光の画像を得ることができる。この単純な方法は、光源と、組織標本を通過する伝達光を記録するカメラまたはフラットベッドスキャナを含む。このようにして、例えば、欠落した個別サンプルを特に容易に検出することができる。透過光法では、キャプチャした画像のネガを作成することができ、それによりコントラスト差のために、欠落した個別サンプルまたは破壊した個別サンプルの検出が容易になる。

透過光法の代替または追加として、組織標本は、光、具体的にはレーザ光で刺激されることが好ましく、得られた自己蛍光放射の画像が記録され記憶される。サンプルを破壊しない別の適切な検査方法は、自己蛍光、即ち特定波長の光で刺激された要素に生じる放射を使用することである。具体的には、通常個別の円形サンプルがパラフィンに埋め込まれた組織サンプルアレイの組織標本の研究では、特に自己蛍光研究が適しており、その理由は、共通の組織サンプルと対照的なパラフィンが蛍光放射を減少させ、従って個別サンプルと周囲のパラフィンの間のコントラストが高くなるからである。個別サンプルとパラフィン間のこの高いコントラストのために、個別サンプルが存在するかどうかの評価を、特に単純な画像処理方法によって行うことができる。分析方法が単純なほど、妥当性検査の自動監視をできる限り迅速に実行するために必要なコンピュータ能力は低くなる。

詳細には、人間または動物の生体からの組織サンプルでは、様々な波長の光源またはより広い波長範囲を有する光源（例えば、水銀灯）および様々なフィルタを使用することができる。蛍光顕微鏡の場合は、例えば、以下の特性を有する紫外線ランプと３つの異なるフィルタが使用される。

蛍光スキャナの場合は、２つの異なる波長を有するレーザが、例えばＣＹ３（インドカルボシアニン）やＣＹ５（インドジカルボシアニン）などの特殊な蛍光材料と共に使用される。ＣＹ３は、例えば、５３０ｎｍで励起され、５９５ｎｍの波長で光を放射することができる。ＣＹ５は、６３０ｎｍで刺激され、６８０ｎｍで蛍光を放射する。

また、サンプルアレイの組織標本を様々な波長の合成光で刺激したときによりよい結果を得ることができる。そのような「マルチスペクトル撮像」の場合は、様々な光源が使用され、従ってより多くの情報が得られる。光源として、例えば、アルゴンイオンやヘリウム／ネオンレーザなどのレーザが利用可能である。更に、個別サンプルの有無を検出するために、レーザの代わりに広い波長範囲を有する光源を使用することができる。例えば、水銀灯や光ファイバ装置を光源として使用することができる。

データの後処理を容易にするために、組織標本の画像は、例えばＴＩＦＦやＪＰＧ形式の標準形式で記憶されることが好ましい。これにより、既存の画像処理プログラムの応用が可能になり、研究前のデータ変換が不要になる。

組織標本の画像は、少なくとも１つの二値画像に変換されると有利である。二値画像は、論理０と論理１のマトリクスから構成され、このマトリクスから個別サンプルの存在の可能性を判定することができ、従って個別サンプルの妥当性の評価を行うことができる。そのような二値画像は、使用されるパラメータが、１つのしきい値またはいくつかのしきい値と比較されるように作成される。複数のパラメータが使用される場合は、後でアルゴリズム内において組み合わせることができるいくつかの二値画像が蓄積される場合がある。

組織標本のキャプチャされた画像を、様々な基準に従ってフィルタリングすることができる。その場合、画像を記録するカメラなどの前に配置されたメカニカルフィルタと、画像データが通る電子フィルタが両方とも使用される。

好ましくは断面によって個別サンプルを平均化し、個別サンプルの妥当性を判定するパラメータとして使用される蛍光強度は、それぞれの個別サンプルデータフィールドから選択され、組織標本の妥当性を判定するために使用されるパラメータとして使用することができる。例えば、蛍光強度を、２つの方向、具体的には個別サンプルの通常円形断面を介した２つの主軸方向に検出することができ、得られた分布から個別サンプルの妥当性を評価することができる。データは、事前設定されたしきい値と比較され、次に、比較値は、個別サンプルの妥当性基準として使用される。それぞれのしきい値は、実験値から得ることもでき、標準化された統計的手法（例えば、いわゆるボックスプロット法）によって自動的に決定することもできる。この値は、蛍光強度をパラメータとして使用するとき、周りの画素の強度と比較されることが好ましく、画像の画素全体にわたる蛍光強度の分布が作成される。例えば、パラメータの導出値として蛍光強度の変動などを使用することができる。

この場合において、サンプルアレイの組織標本の使用不能な個別サンプルを合計することができる。この合計から、組織標本のまだ使用可能な個別サンプルの数を評価することができる。

組織標本の使用不能な個別サンプルの合計を事前設定された境界値と比較し、サンプルアレイの組織標本が、この境界値を超えたときに使用不能なものとして識別された場合は、その組織標本を後の研究から除外することができる。これにより、１切片当たりの特に多数の使用不能な個別サンプルが分かり、その結果、特に繊細で複雑で場合によって極めて高コストな研究を回避することができる。

また、決定された使用不能な個別サンプルの合計に基づいて組織標本を分類することができ、その分類値を組織標本の固有の識別と共に記憶することができる。この重要な情報を組織標本に関する後の研究に使用することができる。例えば、実際に時間がかかり高コストな研究には、使用不能なサンプルが極めて少ないかまたは全くなく、従って特に高い品質を有する組織標本だけを使用することが望ましい場合がある。しかしながら、迅速且つ低コストで行える研究では、多数の使用不能な個別サンプルを含む組織標本、すなわち低品質の組織標本を使用してもよく、その結果重要な情報を供給することができる。組織標本の固有の識別は、例えば、識別番号によって提供することができ、この識別番号は、例えばガラスサポート上に組織標本の他にバーコードの形で配置されてもよい。バーコードを読み取ることによって、組織標本の妥当性に関してデータベースに記憶された情報にアクセスし、その情報を後の研究に使用することができる。

前述の方法に加えて、組織標本の顕微鏡画像も記録し、妥当性の判定に使用することができる。そのような顕微鏡画像は、付加的な有利な情報を含むことができる。組織標本の個別サンプルの妥当性の評価は、例えば蛍光放射で得られた画像を含む顕微鏡画像の重ね合せによって強化することができる。

蛍光強度の代替または追加として、個別サンプルの幾何学的形状を個別サンプルデータフィールドから決定し、個別サンプルの妥当性を判定するパラメータとして使用することもできる。例えば、個別サンプルの輪郭を様々な画像認識方法によって個別サンプルデータフィールドから決定し、個別サンプルの理想的な形状（例えば、円）と比較することができる。個別サンプルの決定された形状が理想的な形状から逸脱しすぎている場合は、その個別サンプルを使用不能なものとして廃棄することができる。例えば、組織サンプルアレイの場合に円筒状サンプルをパラフィンブロックに導入したときに、組織サンプルの変形により後の検査結果が歪むことがある。

妥当性の監視をできる限り迅速に行なえるようにするために、いくつかの組織標本が自動的に順次または並列に処理され、組織標本の個別サンプルの妥当性に関して得られたデータが、組織標本の識別と共に記憶されることが好ましい。従って、早ければサンプルアレイの組織標本を作成後に組織標本の妥当性に関するデータを収集し記憶することができる。その場合、これらのデータは、特定の後の研究のための組織標本の選択に利用可能である。

組織標本（具体的には組織サンプルアレイ）内の個別サンプルの理論位置は、事前設定され記憶されることが好ましい。組織標本の任意の個別サンプルのデータフィールドを作成するためにこれらの位置値を使用することができる。

本発明の別の特徴によれば、組織標本内の個別サンプルの実際の位置が組織標本の画像から決定される。これは、例えばいわゆる「領域拡張（region growing）」を適用することによって行うことができる。この数学的手法を利用することにより、画像の特定の画素、いわゆるシードポイントが、ランダムジェネレータによって事前に設定され、この計算には特定数の周囲画素が含まれる。この場合、シードポイントの強度が周囲のポイントの強度と比較され、計算に組み込まれる。「領域拡張」法は、主に、表面領域のサイズ、表面領域の数および表面領域のエッジ長さを決定して、湾曲を表面の縁と一致させて、重心とより高いモーメントならびに円形分散または楕円分散を計算するのに適している。個別サンプルの実際位置は、「領域拡張」法を適用し、その後で個別サンプルの中心を決定する方法を適用することにより決定することができる。

更に、いずれの場合も個別サンプルの実際位置を記憶された理論位置と比較することができ、ずれがあった場合は事前設定された位置データを適切に補正することができる。いわゆる「グリッド法（gridding）」の場合、データは分析され、通常長方形のグリッド上にプロットされる。その結果、例えばサンプルアレイの切片を作製することにより、しばしば個別サンプルのグリッドのひずみが生じる場合がある。個別サンプルの位置が明らかに確保されたとき、妥当性監視も確実に実行することができる。

本発明による第２の目的は、また、サンプルアレイの組織標本の妥当性を判定するための前述の装置によって達成され、サンプルアレイの組織標本を非破壊式に走査する装置が設けられ、走査装置は、組織標本の個別サンプルの位置に関する情報を含むデータベースと、走査した組織標本を処理するコンピュータユニットとに接続され、且つそれぞれの個別サンプルのデータフィールドを生成し、それぞれの個別サンプルデータフィールドから少なくとも１つのパラメータを選択し、このパラメータもしくはそのパラメータから得られた値またはパラメータもしくはそのパラメータから得られた値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較するコンピュータユニットに接続されており、個別サンプルの妥当性基準として少なくとも１つのしきい値と少なくとも１つのパラメータもしくはそのパラメータから得られた値またはパラメータもしくはそのパラメータから得られた値の組み合わせの比較値を表示する装置と、この妥当性基準を組織標本の個別サンプルの位置と共に記憶するメモリとが設けられる。従って、本発明によるサンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する装置は、通常、対応する走査装置に接続され、これにより得られた情報を処理するコンピュータユニットを含む。

ここで、走査装置は、光源と、組織標本の画像を記録する装置とによって構成されることが好ましい。透過光法の場合、光源が組織標本の上に配置され、走査装置が組織標本の下に配置され、その結果、走査装置が、組織標本を透過する光を検出することができる。自己蛍光の場合、光源と走査装置は組織標本の上に配置される。

記録装置は、対応する光源によって励起された組織標本の蛍光放射を記録する蛍光スキャナの形で設けられてもよい。

光源は、レーザによって構成されてもよく、それにより波長は、それぞれの条件と蛍光色素の使用とに一致される。

また、様々な波長範囲内のいくつかの光源が設けられてもよく、極めて広い波長範囲の光を放射する光源が設けられてもよい。

更に、切片の記録画像を少なくとも１つの二値画像に変換する装置が設けられてもよい。

得られたデータの妥当性を高めるために、記録された組織標本の画像をフィルタリングするフィルタ装置を設けることができる。既に述べたように、これらは、記録装置の前にハードウェアとして配置されたフィルタでもよく、取得したデータのソフトウェア調整を行うフィルタでもよい。

更に、妥当性を判定するための追加情報を作成する組織標本を記録する顕微鏡が設けられてもよい。

できるだけ高速の分析を可能にするために、組織標本を自動で供給し排出する装置が設けられてもよい。

また、いくつかの組織標本を収容するマガジンを設けることができ、妥当性の判定のためにこのマガジンから組織標本が自動的に取り出され再び戻される。従って、組織標本の妥当性をある程度自動的に決定することができる。

組織標本内の個別サンプルの実際の位置を決定する装置が設けられることが好ましい。これにより、しばしば望ましい位置に対応しない個別サンプルの実際位置を確実な方式で決定することができる。

最後に、組織標本内の個別サンプルの位置を補正する装置を設けることができ、この装置は、個別サンプルの実際位置を決定するために組織標本を収容する装置に接続される。その結果、サンプルアレイが切断されたときに通常生じる配列個別サンプルのグリッドのひずみを補正することができる。

以下では、添付図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。

図１は、サンプルアレイ１、詳細には組織サンプルアレイ（ＴＭＡ組織マイクロアレイ）からの組織標本（または切片）４の作製を示す図表を示す。サンプルアレイ１は、個別の円筒状サンプル３、詳細には組織サンプル、が導入された平行六面体パラフィンブロック２を含む。個別サンプル３の異なる由来と個別サンプル３をパラフィンブロック２に導入するときの機械的な問題のために、パラフィンブロック２内の個別サンプル３の深さは、実際には様々である。好ましくはミクロトームで行われる、サンプルアレイ１から組織標本２または切片を作製する際、様々な位置にある個別サンプル３は、具体的にはサンプルアレイ１の深い方の領域でしばしば欠損する。組織標本４内のこれらの欠損した個別サンプル３は、その後の組織学的または組織病理学的研究で利用できず、したがって研究から得られる情報が減少する。したがって、組織標本４の妥当性を評価することは極めて重要である。

図１の左側に図示したように、サンプルアレイ１の組織標本５または切片の選択は、先行技術による品質管理（ＱＣ）に使用される。この場合、組織標本５は、通常、組織学的に着色され、顕微鏡画像の色の違いに基づいて組織標本５内の個別サンプル３の有無が評価される。妥当性の監視後、組織標本５は、他の研究に利用できなくなる。これにより、使用できる組織標本４の数が全体として減少する。更に、先行技術によって行われる妥当性の監視は、ランダムサンプル方式で選択された組織標本５のなかの組織標本に関して比較的信頼性が低い情報を提供し、妥当性を確実に評価することができない。

従って、妥当性の監視によって破壊されず、従って後の研究でも利用可能な、サンプルアレイ１の組織標本４の妥当性を判定する方法および装置が必要である。

図２は、サンプルアレイ１の組織標本４の平面図を示し、個別サンプル３は、個別サンプル３の明白な割当てを可能にする特定のパターンで配置されている。示した例では、カラムは、個別サンプル３の穴の部分によって二値形式で符号化されている。従って、組織標本４を作製した後で、例えばガラスサポートを回転させるかねじることにより個別サンプル３が混同されることはない。サンプルアレイ１または組織標本４内の個別サンプル３の位置は、明白に割り当てられる。

図３は、サンプルアレイ１の組織標本４の妥当性を判定するための本発明による方法を示すブロック図を示す。最初に、ブロック１０１によりサンプルアレイ１が作製され、ブロック１０２によりサンプルアレイ１から組織標本４が作製される。次に、ブロック１０３により、組織標本４を破壊することなく妥当性の監視が行われる。ブロック１０４に対応して、いくつかの個別サンプル３を含むサンプルアレイ１の組織標本４が非破壊式に走査され、その結果、組織標本４のデータフィールドが得られる。組織標本４の非破壊走査は、例えば、透過光法および／または自己蛍光の印加によって行うことができる。ブロック１０５に対応して、組織標本４での個別サンプル３の位置の情報を使用して、切片４の任意の個別サンプル３のデータフィールドを作製する。この場合は、組織標本４内の個別サンプル３の理論位置あるいは比較後に決定された（「グリッド」法による）理論位置と共に組織標本４内の個別サンプル３の実際の位置が使用される。次に、ブロック１０６に従って、これらの個別サンプルデータフィールドが処理されて、個別サンプルデータフィールドから少なくとも１つのパラメータが選択され、次にブロック１０７に従って、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較され、比較値が、個別サンプル３の妥当性基準として使用され、組織標本４の個別サンプル３の位置と共に記憶される。ブロック１０７で得られた妥当性監視の結果は、ブロック１０８による組織標本４の追加の研究結果と組み合わされ、ブロック１０９で分析にかけられる。ブロック１０８で組織標本４のこれらの追加の研究の結果が作成された場合、この結果は、追加情報を作成する様々な手動で実行される方法を含むことができる。最後に、ブロック１１０により方法が完了しデータが記憶される。妥当性の判定によって、サンプルアレイ１の組織標本４からのデータの解釈を強化し且つ組織標本４のより適切な使用を可能にする重要な情報が作成される。

図４ａと図４ｂに、サンプルアレイ１の組織標本４の２つの個別サンプル３の自己蛍光画像（autofluorescence image）の例を示す。ここで、実際の測定結果の図表を検討する。図４ａの個別サンプル３は、ほぼ理想的な円形であり、取り囲んでいるパラフィンブロック２と明白に異なる。図４ａは、特に高品質の個別サンプル３の画像を示す。

これと対照的に、図４ｂは、パラフィンブロック２内の大きく変形した穴５を示し、この穴５内には個別サンプル３またはパラフィンの残留物６がある。この個別サンプル３は、大きく変形しているか全く存在せず、従って後の研究に利用できない。

図５ａと図５ｂは、図４ａと図４ｂによる個別サンプル３を使用してサンプルアレイ切片の妥当性を判定する方法の変形を示す。この場合、例えば、蛍光強度Ｉは、分布がｘ軸とｙ軸に対して評価され、パラメータとして選択される。図５ａのグラフ７は、ｘ軸に応じた蛍光強度ΣＩの和を示し、図５ａのグラフ８は、ｙ方向の蛍光強度ΣＩの和を示す。グラフ７とグラフ８のプロットは、実質的に個別サンプル３の真中における蛍光強度ΣＩの極大を示す変換点を示す。次に、グラフ７と８に対応する強度を更に処理することができ、例えば、平均が求められ１つまたは複数のしきい値と比較される。例えば、この比較値は、個別サンプル３の妥当性の基準として使用され、例えば、組織標本４の個別サンプル３の位置データと共にデータベースに記憶される。図５ａによる強度プロットから、図４ａに従って示された個別サンプル３の特に高い品質が明らかになる。

しかしながら、図５ｂによる個別サンプルにおけるｘ方向とｙ方向の蛍光強度Ｉのプロット７と８は明らかに異なり、一方は、極めて低い強度を示し、他方は、理想的な事例から明らかに逸脱し且つ個別サンプル３の妥当性基準として使用することができるプロットを示す。示した例では、蛍光強度Ｉのプロットは、図５ａによる個別サンプル３と比較して極小であることを示す。従って、蛍光強度Ｉのパラメータから、サンプルアレイ１の組織標本４内の個別サンプル３の妥当性の評価を特に迅速且つ確実に行うことができる。

図６ａと図６ｂは、図４ａと図４ｂによる個別サンプル３の更に２つの可能なデータセットを示す。この場合、自己蛍光強度Ｉは、個別サンプル３の画像の画素（即ち、個別サンプルデータフィールド）に基づいて描かれ、これから様々な値が計算される。例えば極値や平均値など、横線で示されるようなこれらの得られたパラメータを、個別サンプル３の妥当性基準として使用することができる。図６ｂによりグラフにまとめることができるように、個別サンプル３のデータフィールドの個別画素の位置に基づく強度Ｉは、図６ａによるグラフとは明らかに異なる。

図６ａと図６ｂは、いわゆるボックスプロット測定の結果を示す。四分位点によって決定された長方形は、データの５０％を含むボックスと呼ばれる。四分位点の間隔は、ボックスの長さから読み取ることができる。これは、上位四分位点と下位四分位点の差によって決まる変化の程度である。別の四分位点として、中心値（通過線（through-going line））が示される。追加の横線は、いわゆるウィスカ（whisker）として指定され、その最大長は、四分位点の間隔の１．５倍であり、これからデータを決定することができる。破線で示した一番上の線と一番下の線は、上側ウィスカと下側ウィスカの極値を示す。これらの範囲を超えている値は、外れ値（outlier）と呼ばれ、サンプルの妥当性の判定に使用される。

図７は、この方法による妥当性の単純な判定の別の例を示し、ここで蛍光強度Ｉは、個別サンプル３の位置Ｌに対する対数目盛で示されている。この場合、黒の点は、材料が存在する個別サンプル３の位置または個別サンプル３の画像の画素を示し、白い点は、材料が存在しない個別サンプル３の位置を示す。手動で決定したしきい値Ｓより下の黒い点は、技術的な理由で材料が存在しないことを示す。これは、個別サンプル３の妥当性基準として使用される。また、しきい値Ｓの決定は、組織標本のデータから自動的に決定することもでき、それにより、いわゆる適応システムの場合は、ある通路から別の通路へのしきい値の変化が生じる場合がある。

最後に、図８は、様々な位置にいくつかの個別サンプル３を含むサンプルアレイ１の組織標本４の妥当性を判定するための可能な装置１０のブロック図を示す。装置１０は、サンプルアレイ１の組織標本４を非破壊的に走査するユニット１１を有する。走査ユニット１１は、組織標本４の個別サンプル３の位置による情報を含むデータベース１２に接続されてもよい。走査ユニット１１は、具体的には、光源１３、好ましくはレーザと、組織標本４の画像を記録するための装置１４とを含む。追加情報のために、組織標本４の画像を記録する顕微鏡１５を配置することができる。走査ユニット１１は、走査した組織標本４のデータを対応するように処理し、すべての個別サンプル３のデータフィールドを作成するコンピュータユニット１６に接続される。コンピュータユニット１６では、それぞれの個別サンプルデータフィールドからパラメータが選択され、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較され、比較値は、表示装置１７（例えば、画面）に示され、妥当性の基準として、組織標本４の個別サンプル３の位置と共にメモリ１８に記憶される。組織標本４の妥当性を判定する方法をより効率的に実行するために、組織標本４を自動的に供給し除去する装置１９を提供することができ、この装置１９は、対応するリポジトリ２１から取り出されたいくつかの組織標本４を受け取るためのリザーバ２０に接続されることが好ましい。

例として、主に組織サンプルアレイ（ＴＭＡ、組織マイクロアレイ）について詳細に検討するが、本発明は、既に前に述べたように、いくつかの個別サンプルを含むほとんど様々なサンプルアレイに使用することができる。

［組織サンプルアレイの切片に本方法を適用する例］
サンプルアレイ組織標本の妥当性を判定する当該方法は、１つの組織標本当たりに利用できる個別サンプルを識別するのに適している。この例では、それぞれ４５０個の個別サンプルまたは「コア」を有する組織サンプルアレイ（ＴＭＡ、組織マイクロアレイ）を研究する。組織サンプルアレイは、各ケースに特定の器官または組織の３０個の個別サンプルを収容し、これらの個別サンプルは、後の表の列に挙げられている。サンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する当該の方法によって、次に、１つの組織当たりの個別サンプルの数を決定することができ、これは、これらの組織標本に関する以下の研究に不可欠である。この場合、個別サンプルのそれぞれの位置に基づいて、存在しない個別サンプルあるいは使用できない個別サンプルを判定する。しかしながら、存在しない個別サンプルまたは破壊された個別サンプルの数だけが、個別サンプルの位置なしに決定された場合は、例えば、さらに多数または少数の個別サンプルが存在する組織のタイプに関する評価を行うことができないので、組織マイクロアレイの当該の事例での情報が不十分になる。後の表は、１５個の異なる組織で構成された４５０個の個別サンプルを含む組織サンプルアレイの２つの切片に対する本発明による方法の適用を示す。この場合、それぞれの欠落した個別サンプルまたは破壊された個別サンプルが明白に識別され、その結果、最終的に、使用可能な個別サンプルの数を決定することができるようになる。表の第２列は、組織サンプルアレイの切片番号４内の１つのタイプの組織当たりの使用可能な個別サンプルの数を示す。４５０個の個別サンプルのうち合計１４個は、欠陥があり、従って使用不可か欠落しており、従って後の研究にも利用できない。表の第３列は、同じ組織サンプルアレイの切片番号１３７の結果を示す。この場合、４５０個の個別サンプルのうち２２３個が既に破壊されているかまたは存在しない。これにより、多くの個別サンプルがパラフィンブロック内にまだ入っておらず、従って特に組織サンプルアレイの深い方の切片内に欠落しているという前述の問題が明らかになる。しかしながら、特定の研究または特定のタイプの組織の研究では、この追加の情報の知識により、いくつかのサンプルが使用できない切片も使用することができ、また当該技術分野で限られた数の組織サンプルを最適に使用することができる。例えば、切片番号１３７の子宮頸、乳房または卵巣の組織サンプルの研究は有用であり、その理由は、この場合には、個別サンプルの大部分が存在するからである。これに対し、例えば３０個の肝臓サンプルのうちの４個しか個別サンプルが存在しない。従って、組織標本の欠落した個別サンプルの知識を使用して、後で自動分析のためにデータをフィルタリングすることができる。

通常、患者に関する情報も組織サンプルアレイの個別サンプルにより提供される。例えば、当該の例における組織の１タイプ当たり３０個の個別サンプルは、１０の異なるソース、即ち、例えば１０名の異なる患者からのものである。従って、理想的な事例では、同じソースまたは同じ患者からの３個の個別サンプルが存在する。本発明による方法によって、組織標本のそれぞれの個別サンプルの妥当性が判定され、その結果、例えば、理想的な場合に存在する３個すべての個別サンプルを使用することができるタイプの組織を評価することができ、例えば２個だけが使用できるか、１個の個別サンプルだけが使用できるか、１つの個別サンプルも使用できないかを決定することができる。組織標本に関する特定の研究では、この情報は、当然ながらかなり重要である。しかしながら、本発明による方法によって得られる情報がどのように処理されるかは、それぞれの用途と組織標本に関するその後の研究に大きく依存する。

サンプルアレイの切片の作製を示す図表である。 サンプルアレイの例示的な切片の平面図である。 本発明によるサンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する方法を示すブロック図である。 組織標本の個別サンプルの有無または大きな損傷の例を示す図である。 組織標本の個別サンプルの有無または大きな損傷の例を示す図である。 パラメータとして蛍光強度を使用した図４ａによる個別サンプルの測定結果を示す図である。 パラメータとして蛍光強度を使用した図４ｂによる個別サンプルの測定結果を示す図である。 図４ａによる個別サンプルの２つの可能なデータセットを示す図である。 図４ｂによる個別サンプルの２つの可能なデータセットを示す図である。 自己蛍光を使用する本発明による方法の別の実施形態の測定結果を示す図である。 サンプルアレイの組織標本の妥当性を判定する装置の実施形態のブロック図である。

Claims (31)

1. 複数の個別サンプル（３）を様々な位置に収容するサンプルアレイ（１）、具体的には組織サンプルアレイの組織標本（４）の妥当性を判定する方法であって、好ましくは各組織標本（４）が非破壊方式で走査され、
   組織標本（４）の各個別サンプル（３）のデータフィールドが、組織標本（４）内の個別サンプル（３）の位置と共に得られたデータから作成され、
   少なくとも１つのパラメータは、各個別サンプルデータフィールドから選択され、このパラメータもしくはこのパラメータから得られた値またはパラメータもしくはこのパラメータから得られた値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較され、比較値は、個別サンプル（３）の妥当性基準として使用され、
   妥当性が事前設定された妥当性境界値より下にある組織標本（４）の任意の個別サンプル（３）が使用不能として識別され、
   比較値は、個別サンプル（３）の位置ならびにすべての使用不能な個別サンプル（３）の位置と共に、組織標本（４）の固有の識別と共に記憶される、方法。
2. 組織標本（４）は、光学的に走査され、画像が記憶される、請求項１に記載の方法。
3. 組織標本（４）は、光が照射され、透過光の画像が記録される、請求項２に記載の方法。
4. 組織標本（４）は、光、具体的にはレーザ光で刺激され、組織標本（４）の得られた蛍光放射の画像が記録され記憶される、請求項２または３に記載の方法。
5. 記録された画像は、フィルタリングされる、請求項４に記載の方法。
6. 組織標本（４）は、様々な波長の混合光で刺激される、請求項４または５に記載の方法。
7. 組織標本（４）の画像は、例えばＴＩＦＦまたはＪＰＧ形式などの標準形式で記憶される、請求項３から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 組織標本（４）の画像は、少なくとも１つの二値画像に変換される、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 組織標本（４）の記録された画像は、フィルタリングされる、請求項４から８のいずれか１項に記載の方法。
10. パラメータとして、蛍光強度が、好ましくは個別サンプル（３）の断面全体にわたって平均化され、個別サンプル（３）の妥当性を判定するパラメータとして使用される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 組織標本（４）の使用不能な個別サンプル（３）は、合計される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 組織標本（４）の使用不能な個別サンプル（３）の合計は、事前設定された境界値と比較され、この境界値を超えたときにサンプルアレイ（１）の組織標本（４）が使用不能として識別される、請求項１１に記載の方法。
13. 組織標本（４）は、使用不能な個別サンプル（３）の決定された合計に基づいて分類され、分類値が、組織標本（４）の固有識別と共に記憶される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 組織標本（４）の顕微鏡画像が、記録され、妥当性の判定に使用される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 個別サンプルの幾何学的形状は、個別サンプルデータフィールドから決定され、個別サンプル（３）の妥当性を判定するパラメータとして使用される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
16. いくつかの組織標本（４）は、自動的に順次または並列に処理され、組織標本（４）の個別サンプル（３）の妥当性に関して得られたデータは、組織標本（４）の識別と共に記憶される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 組織標本内の個別サンプル（３）の位置は、事前設定され記憶される、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 組織標本（４）上の個別サンプル（３）の実際の位置は、組織標本（４）の画像から決定される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 個別サンプル（３）の実際の位置は、記憶された位置と比較され、ずれがあった場合には記憶された位置データが適切に補正される、請求項１８に記載の方法。
20. 複数の個別サンプル（３）を様々な位置に収容するサンプルアレイ（１）、具体的には組織サンプルアレイの組織標本（４）の妥当性を判定する装置（１０）であって、サンプルアレイ（１）の組織標本（４）を非破壊式に走査する装置（１１）が設けられ、前記走査装置（１１）は、組織標本（４）の個別サンプル（３）の位置に関する情報を含むデータベース（１２）と、走査した組織標本（４）を処理し、各個別サンプル（３）のデータフィールドを生成し、各個別サンプルデータフィールドから少なくとも１つのパラメータを選択し、このパラメータもしくはこのパラメータから得られた値またはパラメータもしくはこのパラメータから得られた値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較するコンピュータユニット（１６）に接続され、
    個別サンプル（３）の妥当性基準として少なくとも１つのしきい値との比較値を表示する装置（１７）が設けられ、この妥当性基準を組織標本（４）の個別サンプル（３）の位置と共に記憶するメモリ（１８）が設けられた、装置。
21. 走査装置（１１）は、光源（１３）と、組織標本（４）の画像を記録する装置（１４）とによって構成される、請求項２０に記載の装置。
22. 記録装置（１４）は、蛍光スキャナによって構成される、請求項２１に記載の装置。
23. 光源（１３）は、レーザによって構成される、請求項２１または２２に記載の装置。
24. 様々な波長範囲内にあるいくつかの光源（１３）が設けられた、請求項２１から２３に記載の装置。
25. 組織標本（４）の記録された画像を少なくとも１つの二値画像に変換する装置が設けられた、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の装置。
26. 組織標本（４）の記録された画像をフィルタリングするフィルタ装置が設けられた、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の装置。
27. 妥当性を判定する追加情報を作成するために組織標本（４）を記録する顕微鏡（１５）が設けられた、請求項２０から２６のいずれか１項に記載の装置。
28. 組織標本（４）を自動的に供給し排出する装置（１９）が設けられた、請求項２０から２７のいずれか１項に記載の装置。
29. いくつかの組織標本（４）を収容するマガジン（２０）が設けられ、妥当性の判定のために前記マガジン（２０）から組織標本（４）が自動的に取り出され戻される、請求項２０から２８のいずれか１項に記載の装置。
30. 組織標本（４）内の個別サンプル（３）の実際位置を決定する装置が設けられた、請求項２０から２９のいずれか１項に記載の装置。
31. 組織標本（４）内の個別サンプル（３）の位置を補正する装置が設けられ、前記補正装置は、個別サンプル（３）の実際位置を決定するために組織標本（４）を記録する装置に接続された、請求項２０から３０のいずれか１項に記載の装置。

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