WO2007060234A1 - Fermentative herstellung organischer verbindungen unter einsatz dextrin-haltiger medien - Google Patents

Fermentative herstellung organischer verbindungen unter einsatz dextrin-haltiger medien Download PDF

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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil

Definitions

  • the present invention relates to the fermentative preparation of organic compounds having at least 3 C atoms or having at least 2 C atoms and at least 1 N atom using a dextrin-containing medium which comprises at least part of the non-starchy solid constituents of the starch source includes, for culturing the microorganisms.
  • Sugar-containing liquid media are a basic nutrient source for many fermentation processes; the sugars contained in the media are metabolized by the microorganisms used to obtain organic products of value.
  • starch An important source of carbon for the microorganism-mediated fermentative production of microbial metabolites is starch. This must first be liquefied and saccharified in upstream reaction steps before it can be used as a carbon source in a fermentation.
  • starch from a natural source of starch such as potatoes, cassava, cereals, z.
  • a natural source of starch such as potatoes, cassava, cereals, z.
  • wheat, corn, barley, rye, triticale or rice usually obtained in pre-purified form and then enzymatically liquefied and saccharified, and then in the actual Fer- mentation for the production of the desired metabolic products.
  • non-purified starch sources for the production of carbon sources for the fermentative production of microbial metabolites.
  • starch sources are first crushed by grinding.
  • the millbase is then subjected to liquefaction and saccharification. Since, in addition to starch, this millbase naturally also contains a number of non-starch-containing constituents which can adversely influence the fermentation, these constituents are usually separated off before the fermentation.
  • the removal can be carried out either directly after grinding (WO 02/077252, JP 2001-072701, JP 56-169594, CN 12181 11), after liquefaction (WO 02/077252, CN 1 173541) or following the saccharification (CN 1266102; Beukema et al .: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res Neth., (1983) 6, NL8302229). In all variants, however, a largely pure starch hydrolyzate is used in the fermentation.
  • More recent processes for the fermentative production of organic compounds comprise in particular a purification of the starch sources prior to fermentation, for.
  • non-purified starch sources are widely used in the fermentative production of bioethanol.
  • the starch sources usually whole cereal grains, first dry milled and then hydrolyzed the starch component of the starch source under the action of enzymes.
  • the hydrolysis both discontinuously, z. B. in stirred tanks, as well as continuously, for. B. To be performed in jet cookers.
  • Corresponding process descriptions can be found z.
  • the Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries Jaques et al. (Ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Chapter 2, pp. 7 to 23, and in McAloon et al., “Determining the cost of producing ethanol from starch and lignocellulosic feedstocks," NREL / TP-580-28989, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
  • the viscosity of the suspension can reach a critical value as a result of the introduction of solids already in the preparation of the starchy suspension, whereby z. B. a suspension with more than 30 wt .-% maize flour in water is no longer homogeneously miscible (Industrial Enzymology, 2nd ed., T. Godfrey, S. West, 1996). This limits the glucose concentration in the conventional procedure. This is not relevant in view of the fermentative production of bioethanol, since higher concentrations due to the toxicity of the product for the yeasts used for fermentation could not be implemented in any case meaningful.
  • JP 2001/275693 describes a process for the fermentative production of amino acids, in which the starch source used is peeled cassava nodules which have been ground dry. For carrying out the process, however, it is necessary to set a particle size of the ground material of ⁇ 150 ⁇ m. In the filtration used, a portion of the grind, including non-starchy ingredients, is separated prior to liquefaction / saccharification of the starch contained and subsequent fermentation. Moderate sugar concentrations are achieved in this process. A similar process is described in JP 2001/309751 for the preparation of an amino acid-containing feed additive.
  • Increased sugar concentrations in the liquid medium used for the fermentation can be achieved by using a saccharification stock, which largely contains the solid, non-starchy components of the starch source, by the in the
  • WO 2005/116228 (PCT / EP2005 / 005728) of the applicant can be achieved.
  • a separation of the solid, non-starch-containing components contained in the starch source before fermentation has surprisingly proved to be unnecessary.
  • the process described can be carried out with in-situ saccharification of the liquefied starch source.
  • a similar process using starch sources selected from cereal grains is described in PCT / EP2006 / 066057 (the earlier patent application DE 10 2005 042 541.0) of the applicant.
  • the method should in particular require a comparatively small amount of equipment and enable the use of media with high sugar concentrations. It should also be easy to handle the media used and their problem-free Characterize use in fermentation. In particular, the process should allow the use of cereals as a source of starch.
  • the invention thus provides a process for preparing at least one organic compound having at least 3 C atoms or having at least 2 C atoms and at least 1 N atom by fermentation, comprising the following steps:
  • Containing medium (1) comprising at least a portion of the non-starchy solid components of the starch source
  • enzymes which hydrolyze dextrins to monosaccharides are not added or in an amount of less than 0.001 wt .-%, based on the total weight of the starch source used.
  • the fermentation process according to the invention can be carried out efficiently in the dextrin-containing medium (1) without the need to add enzymes to be glucosed.
  • small amounts insufficient to complete saccharification typically less than 0.001% by weight, especially less than 0.0005% by weight, based on the total weight of starch source employed, may be added.
  • the inventive method largely avoids viscosity problems, such as may occur during liquefaction of the starch source at higher concentrations of millbase.
  • the terms “dextrin-containing medium” and “dextrin-containing liquid” are used interchangeably. It is obvious to a person skilled in the art that the microorganism used in the fermentation must be capable of metabolizing the dextrins contained in the aqueous dextrin-containing medium (1), without these being converted into di- and / or by external addition of saccharifying enzymes Monosaccharides must be hydrolyzed. In this case, the dextrins are metabolized by the microorganism, presumably after having been treated by strain-own saccharifying enzymes, eg. B. strain-own glucoamylases were hydrolyzed.
  • strain-own saccharifying enzymes eg. B. strain-own glucoamylases were hydrolyzed.
  • the rate of saccharification in particular glucose release
  • the rate of saccharification is adapted automatically to the requirements of the microorganisms on the one hand by the amount of biomass and, on the other hand, by the expression level of the strain's own saccharifying enzymes ,
  • reaction means the hydrolytic degradation of starch into oligosaccharides, especially dextrins.
  • sacharification or “saccharification” here and in the following mean the hydrolysis of dextrins to monosaccharides, in particular to monosaccharides such as glucose.
  • sacharifying enzyme an enzyme which hydrolyzes dextrins to monosaccharides.
  • oligosaccharides obtained by hydrolytic degradation of starch which as a rule consist of 3 to 18, in particular 6 to 12 monosaccharide units, in particular of glucose units.
  • glucose equivalents and “sugar concentration” refers to the total concentration of mono-, di- and oligosaccharides in the medium potentially available for fermentation.
  • glucose equivalents also encompasses the metabolizable sugars or sugar units other than glucose.
  • overproducing and “overproduction” are used herein and hereafter with respect to a microorganism to refer to its property of producing one or more of its metabolites in an amount in excess of the amount needed to replicate the microorganism, whereby it comes to the enrichment in the fermentation medium, wherein the enrichment can take place extra- or intracellularly.
  • Suitable starch sources for the process according to the invention are, in particular, dry grain crops or seeds which, when dried, have at least 40% by weight and preferably at least 50% by weight starch content. These are found in many of today's large-scale crops such as corn, wheat, oats, barley, rye, triticale, rice and sugar beets, potatoes, cassava and various types of millet, z. Sorghum and MiIo.
  • the starch source is preferably selected from cereals and especially among maize, rye, triticale and wheat grains.
  • the process according to the invention can also be carried out with analogous starch sources, such as, for example, a mixture of various starchy crops or seeds.
  • the respective starch source with or without the addition of liquid, for.
  • liquid for.
  • water ground, preferably without the addition of liquid. It can also be a dry grinding combined with a subsequent wet grinding.
  • hammer mills, rotor mills or roll mills are typically used;
  • agitating mixers, stirred ball mills, circulation mills, disk mills, annular chamber mills, vibrating mills or planetary mills are suitable.
  • other mills come into consideration.
  • the amount of liquid required for wet milling can be determined by the skilled person in routine experiments. Usually it is adjusted so that the content of dry matter in the range of 10 to 20 wt .-% is.
  • the millbase obtained during grinding especially in dry grinding, in step a1) flour particles, ie particulate components having a particle size in the range of 100 to 630 microns in a proportion of 30 to 100 parts by weight. %, preferably 40 to 95 wt .-%. and particularly preferably 50 to 90 wt .-%.
  • the millbase obtained contains 50 wt .-% of flour particles having a particle size of more than 100 microns.
  • at least 95% by weight of the ground flour particles have a particle size of less than 2 mm.
  • the measurement of the grain size is carried out by sieve analysis using a vibration analyzer.
  • a small one Grain size is basically advantageous for achieving a high product yield. Too small a particle size, however, can lead to problems, in particular due to lump formation / agglomeration, during mashing of the ground material during liquefaction or during work-up, eg. B. in the drying of the solids after the fermentation step lead.
  • flours are characterized by the degree of grinding or by the type of flour, and these correlate with one another in such a way that the index of the flour type increases as the degree of pulverization increases.
  • the degree of milling corresponds to the amount by weight of the flour obtained, based on 100 parts by weight of the millbase used. While grinding first pure, finest flour, z. B. from the interior of the grain, is obtained in further milling, so with increasing Ausmahlungsgrad, the proportion of Rohfaser- and shell content in the flour, the starch content is lower.
  • the degree of comminution is also reflected in the so-called flour type, which is used as a numerical value for the classification of flours, in particular of cereal flours, and which is based on the ash content of the flour (the so-called ash scale).
  • the flour type or the type number indicates the amount of ash (minerals) in mg, which remains when burning 100 g flour powder substance.
  • a higher type number means a higher degree of milling since the kernel of the cereal grain contains about 0.4% by weight, while the shell contains about 5% ash by weight.
  • the cereal flours are therefore predominantly composed of the comminuted meal body, i. H.
  • the starch component of cereal grains if the degree of milling is higher, the cereal flours also contain the crushed, protein-containing aleurone layer of the cereal grains; in the case of meal, the constituents of the proteinaceous and fat-containing seedling as well as the raw fiber and ash-containing seed shells.
  • Flours having a high degree of milling or a high type number are generally preferred for the purposes according to the invention. If grain is used as the source of starch, then preferably the whole unpeeled grains are ground and processed further, if appropriate after prior mechanical separation of germ and husks.
  • the millbase used contains at least one part, preferably at least 20% by weight, in particular at least 50% by weight, especially at least 90% by weight and especially not less than 99% by weight of those contained in the ground cereal grains starchy solid ingredients, according to the degree of milling.
  • the proportion of non-starchy solid constituents in the millbase is preferably at least 10 wt .-% and in particular at least 15 wt .-%, z. In the range of 15 to 75% by weight and especially in the range of 20 to 60% by weight.
  • the millbase provided for liquefaction is in accordance with the invention in step a2) with an aqueous liquid, for. B. fresh water, recycled process water, z. B. from a subsequent fermentation, or mixed with a mixture of these liquids.
  • an aqueous suspension is obtained.
  • such an amount of the starch source or of the millbase will be mixed with the aqueous liquid and liquefied therein that the obtained aqueous dextrin-containing liquid (1) has a concentration of glucose equivalents of at least 40 wt .-%, based on the Total weight of the medium (1), comprising.
  • the dry matter content in the medium (1) thus obtained is typically at least 50% by weight, based on the total weight of the medium (1).
  • the aqueous liquid used for suspending the solid millbase to a slightly elevated temperature, for. B. in the range of 40 to 60 ° C, pre-tempering.
  • a slightly elevated temperature for. B. in the range of 40 to 60 ° C, pre-tempering.
  • step a2) To carry out the liquefaction of the starch in the millbase in step a2), it has proven to be advantageous to mix only a subset of the total millbase with the aqueous liquid prior to the start of liquefaction and the remaining millbase continuously or discontinuously to the to give aqueous liquid.
  • the liquefaction of the millbase according to step a2) can be carried out by conventional methods known to the person skilled in the art, e.g. Example, according to the methods described in the above-cited "The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries," Chapter 2, pp. 7 to 23.
  • the liquefaction in step a2) takes place in the presence of at least one starch-liquefying enzyme.
  • starch-liquefying enzymes in particular ⁇ -amylases (enzyme class EC 3.2.1.1), for example ⁇ -amylases obtained from Bacillus lichenformis or Bacillus staeothermophilus and especially those which are liquefied by Dry Used in the production of bioethanol.
  • the ⁇ -amylases suitable for liquefaction are also commercially available, for example from Novozymes under the name Termomyl 120 L, type L; or from Genencor under the name Spezyme. It is also possible to use a combination of different ⁇ -amylases for liquefaction.
  • an aqueous liquid containing the liquefied starch portion from the millbase typically dextrins with usually 3 to 18, in particular 6 to 12 monosaccharide units, optionally further oligosaccharides, optionally small amounts of mono- and / or disaccharides (usually ⁇ 30% by weight, frequently ⁇ 25% by weight, ⁇ 20% by weight, in particular ⁇ 10% by weight, based on the total amount of mono- and / or disaccharides).
  • Di- and oligosaccharides) and the non-starchy constituents of the millbase used, in particular the solid, non-starch-containing constituents of the millbase used for the liquefaction contains.
  • the amounts of starch-liquefying enzyme and millbase be chosen so that the viscosity during the gelation process is sufficiently reduced in order to ensure effective mixing of the suspension, for. B. by means of stirring.
  • the viscosity of the reaction mixture is preferably not more than 20 Pas, particularly preferably not more than 15 Pas and very particularly preferably not more than 8 Pas.
  • the measurement of the viscosity is usually carried out with a Haake viscometer type Roto Visko RV20 with measuring system M5 and measuring device MVDIN at a temperature of 50 ° C and a shear rate of 200 s "1 .
  • the ⁇ -amylase (or the starch-liquefying enzyme used) can be initially introduced into the reaction vessel or added during the course of step a2).
  • a partial amount of the ⁇ -amylase required in step a2) is added at the beginning of step a2) or this subset is introduced in the reactor.
  • the total amount of ⁇ -amylase is usually in the range of 0.002 to 3.0 wt .-%, preferably from 0.01 to 1, 5 wt .-%, and particularly preferably from 0.02 to 0.5 wt .-% , based on the total amount of starch source used.
  • the liquefaction can be carried out above or below the gelation temperature.
  • the liquefaction in step a2) takes place at least temporarily above the gelation temperature or gelatinization temperature of the starch used (so-called cooking process).
  • the temperature required for the respective starch is known to the person skilled in the art (see the cited "The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Chapter 2, page 11) or can be determined by him in routine experiments
  • a temperature in the range of 80 to 165 ° C, preferably in the range of 90 to 150 ° C and more preferably in the range of 100 to 140 ° C is selected, the temperature is usually at least 5 K, preferably at least 10 K, and more preferably at least 20 K, for example 10 to 100 K, in particular 20 to 80 K, above the gelling temperature
  • the granular structure of the starch is destroyed (gelling), whereby its enzymatic degradation is possible.
  • step a2) is preferably present at least temporarily in the pH optimum of the liquefying enzyme, frequently at a pH in the weakly acidic range. preferably between 4.0 and 7.0, more preferably between 5.0 to 6.5, usually before or at the beginning of step a2) the pH adjustment is made; This pH is preferably controlled during liquefaction and optionally adjusted.
  • the adjustment of the pH is preferably carried out with dilute mineral acids such as H 2 SO 4 or H 3 PO 4 or with dilute alkali solutions such as NaOH or KOH.
  • At least a portion of the millbase is continuously or discontinuously added to the aqueous liquid.
  • at least 40% by weight, in particular at least 50% by weight and very particularly preferably at least 55% by weight are added to the reactor in the course of liquefaction. Frequently, the amount added will not exceed 90% by weight, in particular 85% by weight and more preferably 80% by weight.
  • the subset of regrind added in the course is fed to the reactor under conditions such as exist in the liquefaction.
  • the addition may be discontinuous, d. H.
  • Essential in this embodiment is that at the beginning of the liquefaction only a portion of the ground material, preferably not more than 60 wt .-%, in particular not more than 50 wt .-% and particularly preferably not more than 45 wt .-% of the ground material , is in the reactor and the remainder of the ground material is added during the liquefaction.
  • the liquefaction can also be continuous, z.
  • a multi-stage reaction cascade In a multi-stage reaction cascade.
  • step a2) of the process according to the invention is carried out in such a way that initially a subset of at most 60% by weight, preferably at most 50% by weight and particularly preferably at most 45% by weight, eg. B. 10 to 60 wt .-%, in particular 15 to 50 wt .-% and particularly preferably 20 to 45 wt .-%, based on the total amount of the millbase, in the aqueous liquid, is suspended and then the liquefaction is carried out.
  • a subset of at most 60% by weight preferably at most 50% by weight and particularly preferably at most 45% by weight, eg. B. 10 to 60 wt .-%, in particular 15 to 50 wt .-% and particularly preferably 20 to 45 wt .-%, based on the total amount of the millbase, in the aqueous liquid, is suspended and then the liquefaction is carried out.
  • the discontinuous or continuous, in particular portionwise addition of a portion of the millbase in the presence of at least one ⁇ -amylase is such that the viscosity of the liquid medium is at most 20 Pas, preferably at most 15 Pas and more preferably at most 8 Pas.
  • the viscosity control it has proved to be advantageous if at least 25% by weight, preferably at least 35% by weight and especially Preferably at least 50 wt .-% of the total amount of the added millbase are added at a temperature above the gelatinization temperature of the starch contained in the millbase.
  • control of the viscosity can be influenced by adding the at least one starch-liquefying enzyme, preferably an ⁇ -amylase, or / and the at least one saccharifying enzyme, preferably a glucoamylase, even in portions.
  • the aqueous liquid used for suspending the solid millbase to a slightly elevated temperature, for. B. in the range of 40 to 60 ° C, pre-tempering.
  • a slightly elevated temperature for. B. in the range of 40 to 60 ° C, pre-tempering.
  • the at least one starch-liquefying enzyme preferably an ⁇ -amylase
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time depends in this case on the activity of the respective ⁇ -amylase with respect to the starch source used under the reaction conditions and is usually in the range of 0.0004 to
  • the partial amount of the ⁇ -amylase can be mixed with the liquid used before the suspension is applied.
  • the amount or partial amount of ⁇ -amylase used before starting the heating to the applied temperature for liquefaction in particular at room temperature or only slightly elevated temperature, for. B. in the range of 20 to 30 ° C, added to the suspension.
  • the thus prepared suspension is then preferably heated to a temperature above the gelling temperature of the starch used.
  • a temperature in the range of 80 to 165 ° C, preferably selected in the range of 90 to 150 ° C, and more preferably in the range of 100 to 140 ° C, wherein the temperature is usually at least 5 K, preferably at least 10K, and more preferably at least 20K, e.g. B. 10 to 100 K, in particular 20 to 80 K above the gelation temperature.
  • a temperature in the range of 80 to 165 ° C, preferably selected in the range of 90 to 150 ° C, and more preferably in the range of 100 to 140 ° C, wherein the temperature is usually at least 5 K, preferably at least 10K, and more preferably at least 20K, e.g. B. 10 to 100 K, in particular 20 to 80 K above the gelation temperature.
  • each case 1 to 30 wt .-% and in particular 2 to 20 wt .-%, based on the total amount of regrind used, added to the starch-containing suspension.
  • the addition of the subset of the ground material not used in the preparation of the suspension can be carried out continuously during the liquefaction.
  • the temperature should be kept at the addition advantageously above the gelation temperature of the starch.
  • the reaction mixture After reaching the desired temperature or optionally after complete addition of the flour, the reaction mixture is usually a time, for. B. 10 to 60 minutes or longer, if necessary, maintained at the temperature set above the gelation temperature of the starch, d. H. overcooked.
  • the reaction mixture is then usually at a slightly lower temperature, but preferably above the gelling temperature, e.g. B. at 70 to 90 ° C, cooled.
  • a further subset of ⁇ -amylase preferably the main amount, is added.
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time is preferably 0.002 to 2.0% by weight, more preferably 0.01 to 1.0% by weight, depending on the activity of the ⁇ -amylase used under the reaction conditions. and most preferably from 0.02 to 0.4% by weight, based on the total amount of starch source used.
  • the reaction mixture is kept at the set temperature or optionally further heated until the starch detection with iodine or optionally another test for the detection of starch negative or at least substantially negative. If appropriate, one or more further portions of ⁇ -amylase, eg. B. in the range of 0.001 to 0.5 wt .-% and preferably 0.002 to 0.2 wt .-%, based on the total amount of the starch source used, are added to the reaction mixture.
  • ⁇ -amylase eg. B. in the range of 0.001 to 0.5 wt .-% and preferably 0.002 to 0.2 wt .-%, based on the total amount of the starch source used, are added to the reaction mixture.
  • the aqueous suspension containing the millbase may first be heated by introducing steam to a temperature above the gelatinization temperature of the starch contained in the starch source or the millbase, in order to liquefy the starch portion.
  • a temperature which is at least 10K and especially at least 20K, e.g. B. 10 to 100 K, in particular 20 to 80 K, above the respective gelatinization temperature.
  • the suspension is heated to temperatures in the range of 90 to 150 ° C, and especially in the range of 100 to 140 ° C.
  • the water vapor used for heating is typically superheated steam having a temperature of at least 105 ° C, especially at least 110 ° C, e.g. B. 1 has 10 to 210 ° C.
  • the steam is with Overpressure introduced into the suspension.
  • the steam preferably has a pressure of at least 1.5 bar, e.g. B. 1, 5 to 16 bar, in particular 2 to 12 bar.
  • the introduction of water vapor into the suspension is generally carried out by introducing the vapor into the suspension at overpressure, preferably at an overpressure of 1 to 10 or 11 bar, in particular 1.5 to 5 bar, and preferably at high speed.
  • overpressure preferably at an overpressure of 1 to 10 or 11 bar, in particular 1.5 to 5 bar, and preferably at high speed.
  • the suspension instantly heats up to temperatures above 90 ° C, ie to temperatures above the gelatinization temperature.
  • the heating with steam is preferably carried out in a continuously operating device into which the suspension is fed continuously with a specific delivery pressure, which results from the viscosity of the suspension, the conveying speed and the geometry of the device, and in which sens the suspension the hot steam with positive pressure, based on the delivery pressure, fed via a controllable nozzle.
  • a continuously operating device into which the suspension is fed continuously with a specific delivery pressure, which results from the viscosity of the suspension, the conveying speed and the geometry of the device, and in which sens the suspension the hot steam with positive pressure, based on the delivery pressure, fed via a controllable nozzle.
  • the suspension is not only heated but also mechanical energy is introduced into the system, which promotes a further division of Mahlgutp
  • causes a particularly uniform energy input and thus a particularly uniform gelatinization of the granular starch particles in the millbase Episode has.
  • these devices have a tubular geometry.
  • the vapor is introduced in the direction of the longitudinal axis of the tubular device.
  • the supply of the suspension is usually at an angle of at least 45 ° or perpendicular thereto.
  • the controllable nozzle typically has a conical geometry that tapers in the flow direction of the vapor.
  • a needle or arranged on a longitudinally displaceable rod cone is arranged. Needle or cone forms a gap with the cone of the nozzle.
  • these devices also include a mixing tube into which the suspension is transported after steaming and discharged from the device.
  • This mixing tube is usually arranged in the direction of the steam inlet and perpendicular to the feed.
  • the mixing tube typically forms a gap with the nozzle through which the suspension is transported. Through this gap additional shear forces act on the suspension during transport and thus increase the mechanical energy input into the suspension.
  • the mixing tube can be arranged to be displaceable in the longitudinal direction. By moving the mixing tube can be adjusted in a simple manner, the size of the gap opening and thus the pressure drop in the device.
  • Such devices are known under the name jet cookers from the prior art, for example, the device shown in "The Alcohol Textbook", Chapter 2, loc cit, Figure 13 and commercially available, for example under the name HYDROHEATER® Fa. Hydro Thermal Corp. Waukesha WI, USA.
  • the steam-treated suspension is generally subsequently transferred to a post-reaction zone in order to continue the gelling of the starch constituents.
  • a post-reaction zone In the post-reaction zone, there is typically overpressure, typically an absolute pressure in the range of 2 to 8 bar.
  • the temperatures in the post-reaction zone are typically in the range of 90 to 150 ° C.
  • the residence time in this post-reaction zone may be in the range from 1 minute to 4 hours, depending on the temperature of the suspension.
  • the post-reaction zones typically have a tubular or columnar geometry. In one embodiment, the post-reaction zone has the geometry of a vertically arranged column.
  • the suspension is applied here after leaving the device for steam treatment in the upper region of the column and removed in the lower region. In another embodiment of the invention, the post-reaction zone has a tubular geometry.
  • the suspension After leaving the post-reaction zone, the suspension is usually relaxed and then performs a liquefaction.
  • the relaxation is carried out as flash evaporation in order to cool the suspension, preferably to temperatures below 100 ° C., in particular below 85 ° C.
  • a liquefaction of the starch thus digested takes place in a separate reaction vessel. The liquefaction can be carried out in the manner described above.
  • At least a portion or the total amount, usually at least 50%, in particular at least 80%, of the total or total amount of starch-liquefying enzyme is added to the suspension of the millbase in the aqueous liquid prior to heating with steam , In this way, the liquefaction already takes place during heating to temperatures above the gelatinization temperature. The heating with water vapor and the post-reaction phase are carried out accordingly. A subsequent liquefaction in a separate reaction vessel can be omitted. Preferably, however, such liquefaction will be carried out to complete the degradation of the starch into dextrins.
  • z. As Termamyl used as ⁇ -amylase, it is advantageous to have a Ca 2+ concentration of z. B. 10 to 100 ppm, preferably 20 to 80 ppm and more preferably about 30 to 70 ppm in the liquid medium, wherein the indication ppm is by weight and g / 1000kg means.
  • the reaction mixture is kept at the set temperature until the starch detection with iodine or optionally another test for the detection of starch negative or at least substantially negative.
  • the obtained dextrin-containing liquid (1) also comprises some or all of the non-starchy solid components of the starch source. This often requires the entry of a non-negligible proportion of phytate, z. B. from the grain crop. In order to avoid the resulting inhibiting effect, it is advantageous to add at least one phytase to the medium (1) in step a2) before it is fed to a fermentation step.
  • the addition of the phytase can be done before, during or after liquefaction, provided that it has the required heat stability. Any desired phytases can be used, provided that their activity under the reaction conditions is in each case at most insignificantly limited. Preference is given to phytases with a temperature stability (T50)> 50 ° C and particularly preferably> 60 ° C.
  • T50 temperature stability
  • the amount of phytase is usually 1 to 10,000 units / kg of starch source, and more preferably 10 to 4,000 units / kg of starch source.
  • the dry matter content in the liquid (1) thus obtained is typically at least 25% by weight, preferably at least 40% by weight, in particular at least 50% by weight, especially at least 60% by weight, and is generally 80% by weight .-%, in each case based on the total weight of the medium (1), do not exceed.
  • the glucose equivalents contained in the resulting dextrin-containing liquid (1) are present essentially in the form of oligosaccharides, in particular dextrins.
  • the main constituent of these oligosaccharides or dextrins is typically glucose, wherein the medium may also contain small amounts of mono- and / or disaccharides and oligosaccharide units made up of other monosaccharide units.
  • the sugar-containing components in the dextrin-containing medium (1) i. H.
  • the mono-, di- and oligosaccharides a proportion of oligosaccharides, in particular dextrins of at least 70 wt .-%, often at least 75% by weight, in particular at least 80 wt .-%, especially at least 90 wt .-%, d. H. the proportion of mono- and disaccharides is less than 30% by weight, often less than
  • the proportion of glucose, in free or bound form, is usually below the glucose equivalents of the medium (1) in the range from 50 to 99% by weight, in particular from 75 to 97% by weight and especially from 80 to 95% by weight. %, based on the total amount of glucose equivalents.
  • the aqueous dextrin-containing liquid (1) obtained in step a2) is used according to the invention in step b) for the fermentative preparation of the desired organic compound.
  • the dextrin-containing liquid (1) is fed to a fermentation, where it serves to cultivate the microorganisms used in the fermentation.
  • the respective organic compound is obtained here as a volatile or nonvolatile microbial metabolite.
  • the obtained aqueous dextrin-containing liquid (1) is used directly in a fermentation according to step b), with the elimination of a separate saccharification tank.
  • the dextrin-containing liquid (1) on fermentation Temperature usually in the range of 32 to 37 ° C, cool before feeding it to the fermentation.
  • the aqueous dextrin-containing liquid (1) can optionally be sterilized before fermentation, wherein the microorganisms are usually killed by thermal or chemical methods.
  • the aqueous dextrin-containing liquid (1) is heated to temperatures of usually above 80.degree. C. for this purpose.
  • the killing or lysis of the cells can take place immediately before the fermentation.
  • the entire dextrin-containing liquid (1) of the lysis or killing is supplied. This can be done thermally, mechanically or chemically.
  • it has not proved necessary to carry out a sterilization step as described hereinbefore fermentation, but rather it has proven advantageous to perform no such sterilization step. Accordingly, a preferred embodiment of the invention strigg a method in which the obtained in step a2) medium (1) directly, d. H. without prior sterilization, the fermentation is fed.
  • the metabolism of the dextrins according to the invention takes place essentially without addition of saccharifying enzymes.
  • the dextrins are metabolized by the microorganism, presumably after having been metabolized by strain-own saccharifying enzymes, e.g. B. strain-own glucoamylases were hydrolyzed.
  • strain-own saccharifying enzymes e.g. B. strain-own glucoamylases were hydrolyzed.
  • saccharification of the liquefied starch components takes place parallel to the metabolism of the sugar, in particular of the monosaccharide glucose, by the microorganisms.
  • the microorganism used for fermentation is selected from microorganisms that express or produce enzymes that hydrolyze dextrins to monosaccharides, particularly those that produce or express glucoamylases.
  • microorganisms are known to those skilled in the art, or may be determined by routine experimentation, e.g. B. by
  • Screening method for example by screening for glucoamylase, z. B. by tightening the microorganism in Scierelkolbentest followed by enzyme activity on glucoamylase, or by screening with the aid of primers / probes according to the screening methods described in the Examples section, as well as database searches in enzyme databases such
  • suitable microorganisms having glucoamylase activity are Agrobacterium tumefaciens, Arxula adeninivorans, Ashbya gossypii, Aspergillus awamori, Aspergillus candidus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus kawachi, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phenicis, Aspergillus saioti, Aspergillus shirousami , Aspergillus terreus, Athelia rolfsii, Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus, Beta vulgaris, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia fungorum, Burkholderia pseudomallei, Candida albicans, Candida albi
  • the pH of the fermentation medium can be adjusted to a value in the optimal range of action for glucoamylase, z. B. to a value in the range between 3.5 and 6.0. Frequently, the pH will be set to an optimal value for fermentation, which may be outside the stated range, e.g. In the range of 6.0 to 8.0. This may be required in the fermentation in spite of the limited activity of many glucoamylases in this pH range in total advantageous or because of the set fermentation conditions, which are particularly adapted to the particular microorganism, be required.
  • the optimum pH range for the fermentation can be determined by the skilled person by means of routine experiments.
  • the fermentation medium is usually for a period of z. B. 2 to 72 hours or possibly longer, z. B. 2 to 96 hours, especially from 5 to 48 hours at the set temperature.
  • the monosaccharides, in particular glucose, obtained by hydrolysis from the dextrins are metabolized very rapidly by the microorganisms, so that as a rule no larger concentrations of monosaccharides or glucose are detectable.
  • the fermentation can be carried out in the usual manner known to the person skilled in the art.
  • the desired microorganism will usually be cultured in the liquid medium obtained by the method described here.
  • the fermentation process can be operated both batchwise and semicontinuously (fed-batch mode, including fed-batch with intermediate harvesting), with the semi-continuous mode being preferred.
  • the medium (1) obtained by the process according to the invention may optionally be used together with a conventional sugar source, i. H. metabolizable mono-, di- and / or oligosaccharides or media containing metabolizable mono-, di- and / or oligosaccharides, optionally after dilution with water and addition of conventional media components such as buffers, nutrient salts, nitrogen sources such as ammonium sulfate, urea, etc., complex inoculum ingredients containing amino acids, such as yeast extracts, peptones, CSL and the like, inoculate with the desired microorganism and multiply under fermentation conditions until the concentration of microorganisms reaches the steady state desired for fermentation.
  • a conventional sugar source i. H. metabolizable mono-, di- and / or oligosaccharides or media containing metabolizable mono-, di- and / or oligosaccharides
  • conventional media components such as buffers, nutri
  • the medium (1) is added continuously or discontinuously to the fermentation medium.
  • a typical embodiment of the method according to the invention is the fed-batch mode, which comprises the following steps:
  • a conventional sugar-containing medium for example, a glucose solution, or a liquid medium (1) according to the invention or a mixture of (1) with a conventional sugar source
  • a conventional sugar-containing medium can be prepared by first with an aqueous liquid, in particular water, adjust to a suitable sugar concentration and the usual media components for fermentation such as buffers, nutrient salts, nitrogen sources such as ammonium sulfate, urea, etc., complex Nährmedienzierer containing amino acids such as yeast extracts, peptones, CSL and the like.
  • the ratio of amount of sugar to liquid is usually preferably chosen so that the total concentration of monosaccharides in the fermentation medium (2) less than 6 wt .-%, z. B.
  • the sugar-containing batch medium thus prepared is inoculated with the desired microorganism and the microorganism is propagated in the batch medium (fermentation medium (2) under fermentation conditions until the concentration of microorganisms reaches a steady state desired for the fermentation. 2), and the desired metabolite is formed.
  • the fermentation process is maintained by adding the dextrin-containing medium (1) to the fermentation medium (2) and the metabolite overproduced by the microorganism accumulates in the fermentation broth, which accumulation may be intracellular as well as extracellular .
  • the volume ratio of fed medium (1) to the initially introduced and the microorganism-containing batch medium (fermentation medium (2)) is generally in the range of about 1:10 to 10: 1, z. In the range of 1: 5 to 5: 1, and more preferably in the range of 1: 1 to 5: 1.
  • the rate of addition of the medium (1), the sugar concentration in the fermentation medium (2) can be regulated. In general, the rate of addition will be adjusted so that total sugar concentration, ie. H.
  • the concentration of monosaccharide in the fermentation broth is preferably in the range from> 0 wt .-% to about 5 wt .-% and is in particular not more than 3 wt .-%.
  • the fermentation medium (2) in step b1) essentially comprises the dextrin-containing medium (1), the microorganisms capable of overproduction of the organic compound, media components such as buffers, nutrient salts, nitrogen sources such as ammonium sulfate, Urea, etc., complex nutrient media ingredients containing amino acids such as yeast extracts, peptones, CSL, and the like and optionally water for dilution.
  • a dextrin-containing medium (1) is optionally diluted to the desired dextrin content, z. B. in the range of 15 to 30 wt .-%, calculated as glucose equivalents and based on the total weight of the dextrin-containing medium (1), and use this directly for preparation of the fermentation medium (2) (batch medium).
  • the dextrin content of the dextrin-containing medium used to maintain the fermentation according to step b2) is usually higher, z. B. in the o. G. Areas to minimize the dilution of the fermentation medium (2).
  • This medium (1) is then used on the one hand in step b1) after dilution with water to prepare the batch medium (fermentation medium (2)) and on the other hand according to step b2) for addition to the fermentation medium (2).
  • volatile and nonvolatile, in particular nonvolatile microbial metabolites having at least 3 C atoms or having at least 2 C atoms and 1 N atom can be produced by fermentation.
  • Non-volatile products are understood as meaning those compounds which can not be obtained by distillation from the fermentation broth without being decomposed. These compounds generally have a boiling point above the boiling point of water, often above 150 ° C and especially above 200 ° C at atmospheric pressure. They are usually compounds that are solid under normal conditions (298 K, 101, 3 kPa).
  • aqueous dextrin-containing medium (1) in a fermentation for the production of nonvolatile microbial metabolites which have a melting point below the boiling point of water or / and an oily consistency at atmospheric pressure.
  • nonvolatile microbial metabolites herein includes, in particular, organic, optionally 1 or more, e.g. B. 1, 2, 3 or 4 hydroxyl-bearing mono-, di- and tricarboxylic acids having preferably 3 to 10 carbon atoms, for. Tartaric, itaconic, succinic, propionic, lactic, 3-hydroxypropionic, fumaric, maleic, 2,5-furandicarboxylic, glutaric, levulinic, gluconic, aconitic and diaminopimelic acids, citric acid; proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, e.g.
  • Lysine glutamate, methionine, phenylalanine, aspartic acid, tryptophan and threonine; Purine and pyrimidine bases; Nucleosides and nucleotides, e.g. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and adeno- sin 5'-monophosphate (AMP); lipids; saturated and unsaturated fatty acids having preferably 10 to 22 carbon atoms, e.g.
  • propanediol and butanediol polyhydric (also referred to as higher valued) alcohols having 3 or more, eg. B. 3, 4, 5 or 6 OH groups, for.
  • Enzymes such as amylases, pectinases, acidic, hybrid or neutral cells, esterases such as lipases, pancreases, proteases, xylanases and oxidoreductases such as laccase, catalase and peroxidase, glucanases, phytases; Carotenoids, z. Lycopin, beta-carotene, astaxanthin, zeaxanthin and canthaxanthin; Ketones with preferably 3 to 10 carbon atoms and optionally 1 or more hydroxyl groups, eg. Acetone and acetoin; Lactones, e.g.
  • Gamma-butyrolactone, cyclodextrins, biopolymers e.g. B. polyhydroxyacetate, polyester, z. Polylactide, polysaccharides, polyisoprenoids, polyamides; as well as precursors and derivatives of the aforementioned compounds.
  • Other compounds of interest as nonvolatile microbial metabolites are described by Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for the occurrence of normal enzyme activity. These compounds may be organic or inorganic; the cofactor molecules of the invention are preferably organic. Examples of such molecules are NAD and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP); The precursor of these cofactors is niacin.
  • the term "nutraceutical” encompasses food additives that promote health in plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and certain lipids, e.g. B. polyunsaturated fatty acids.
  • the metabolites produced under enzymes amino acids, vitamins, disaccharides, aliphatic mono- and dicarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms, aliphatic hydroxycarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms, ketones having 3 to 10 carbon atoms, alkanols with 4 to 10 carbon atoms and alkanediols having 3 to 10 and in particular 3 to 8 carbon atoms selected.
  • microorganisms used in the fermentation depend in a manner known per se on the respective microbial metabolites, as explained in detail below. They may be of natural origin or genetically modified. Examples of suitable microorganisms and fermentation processes are, for. As indicated in Table A.
  • the organic compound prepared is optionally mono-, di- and tricarboxylic acids bearing 3 to 10 carbon atoms, proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine bases, pyrimidine bases; Nucleosides, nucleotides, lipids; saturated and unsaturated fatty acids; Diols having 4 to 10 C atoms, polyhydric alcohols having 3 or more hydroxyl groups, long-chain alcohols having at least 4 C atoms, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins, provitamins, cofactors, nutraceuticals, proteins, carotenoids, ketones of 3 to 10 C atoms, lactones, biopolymers and cyclodextrins selected.
  • a first preferred embodiment of the invention relates to the use of the sugar-containing liquid medium obtainable according to the invention in a fermentative production of enzymes such as phytases, xylanases or glucanases.
  • a second preferred embodiment of the invention relates to the use of the sugar-containing liquid medium obtainable according to the invention in a fermentative production of amino acids such as lysine, methionine, threonine and glutamate
  • a further preferred embodiment of the invention relates to the use of the sugar-containing liquid medium obtainable according to the invention in a fermentative preparation of vitamins such as pantothenic acid and riboflavin, precursors and secondary products thereof.
  • Mono-, di- and tricarboxylic acids in particular aliphatic mono-, di- and tricarboxylic acids having 3 to 10 C atoms, such as propionic acid, fumaric acid, succinic acid, itaconic acid, citric acid and dimethylmalonic acid, aliphatic hydroxycarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms, such as Lactic acid and
  • C atoms such as butanol
  • Diols as mentioned above, in particular alkanediols having 3 to 10 and in particular 3 to 8 C atoms, such as propanediol;
  • Ketones as mentioned above in particular ketones having 3 to 10 carbon atoms, such as acetone; and - carbohydrates as mentioned above, in particular disaccharides such as trehalose.
  • the metabolic product produced in the fermentation by the microorganisms is polyhydroxyalkanoates such as poly-3-hydroxybutyrate and copolyester with other organic hydroxycarboxylic acids such as 3-hydroxyvaleric acid, 4-hydroxybutyric acid and others which are described in US Pat Steinbüchel (loc. Cit.) Are described, for. B. also long-chain (also referred to as longer-chain) hydroxycarboxylic acids such as 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid and 3-hydroxytetradecanoic acid, and mixtures thereof.
  • analogous conditions and procedures can be used here, as have been described for other carbon sources, eg. See, for example, S. Y. Lee, Plastic Bacteria Progress and Prospects for Polyhydroxyalkanoate Production in Bacteria, Tibtech, Vol. 14, (1996), pp. 431-438.
  • the microorganisms used in the fermentation are therefore selected from natural or recombinant microorganisms which overproduce at least one of the following metabolic products:
  • Enzymes such as phytase, xylanase or glucanase, especially phytase;
  • Amino acids such as lysine, threonine or methionine, especially lysine and methionine;
  • Vitamins such as pantothenic acid and riboflavin; Precursors and / or derivatives thereof;
  • Disaccharides such as trehalose; aliphatic mono-, di- and tricarboxylic acids having 3 to 10 C atoms, such as propionic acid, fumaric acid, succinic acid, itaconic acid, citric acid and dimethyl malonic acid;
  • Polyhydroxyalkanoates such as poly-3-hydroxybutyrate and copolyester of
  • 3-hydroxybutyric acid aliphatic hydroxycarboxylic acids having 3 to 10 C atoms such as lactic acid and 3-hydroxypropionic acid;
  • Alkanols having 4 to 10 C atoms, such as butanol having 4 to 10 C atoms, such as butanol
  • Alkanediols with 3 to 8 carbon atoms such as propanediol.
  • Suitable microorganisms are usually selected from the genera Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus and Clostridium, in particular strains of Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger, or Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbschreibii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, schermanii Propionibacterium, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum
  • the microorganism used in the fermentation is a strain of the genus Corynebacterium, in particular a strain of Corynebacterium glutamicum.
  • it is a strain of the genus Corynebacterium, especially of Corynebacterium glutamicum, which overproduces an amino acid, especially lysine, methionine or glutamate.
  • the microorganism used in the fermentation is a strain of the genus Escherichia, in particular a strain of Escherichia coli.
  • it is a strain of the genus Escherichia, especially of Escherichia coli, which overproduces an amino acid, especially lysine, methionine or threonine.
  • the metabolite produced by the microorganisms in the fermentation is lysine.
  • analogous conditions and procedures can be used here, as have been described for other carbon sources, eg. In Pfefferle et al., Supra, and U.S. 3,708,395.
  • both a continuous and a batch (batch or fed-batch) mode of operation into consideration preferred is the fed-batch mode of operation.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is methionine.
  • analogous conditions and procedures can be applied here, as have been described for other carbon sources, eg. In WO 03/087386 and WO 03/100072.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is tartaric acid.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used here, eg. In WO 01/021772.
  • the metabolite produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used here, eg. In WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is fumaric acid.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is fumaric acid.
  • the metabolite produced by the microorganisms in the fermentation is succinic acid.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources can be used here, eg. In Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498-504 (1976); EP 249773 (1987), invent .: Lemme et al. Datta; US 5504004 (1996), invent .: Guettler, Jain et al. Soni; Arch. Microbiol. 167, 332-342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus succinogenes sp.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is a phytase.
  • analogous conditions and procedures can be applied here, as have been described for other carbon sources, eg. In WO 98/55599.
  • the fermentation results in a fermentation broth, in addition to the desired microbial metabolite essentially the biomass produced during the fermentation, the non-metabolized constituents of the liquefied starch solution and in particular the non-starchy solid constituents of the starch source, such.
  • This liquid medium is also referred to in the present application as a fermentation broth, wherein the fermentation broth also comprises the added dextrin-containing medium (1), in which a partially or incomplete fermentative conversion of the sugars contained therein, ie a partially or imperfectly Constant microbial metabolism of the usable sugars (eg mono- and disaccharides) has taken place.
  • a sterilization step is optionally carried out in the manner described above.
  • a specific embodiment (I) of the invention relates to a process in which at least one microbial metabolite is removed from the fermentation broth or isolated. The volatiles of the fermentation broth are then substantially removed to yield a solid or semi-solid protein composition.
  • WO 2005/116228 PCT / EP2005 / 005728
  • the isolation or depletion of the metabolic product from the fermentation broth is generally carried out by depleting or isolating at least one metabolic product from the fermentation broth such that the content of this metabolic product in the remaining fermentation broth is at most 20% by weight, especially at most 10% by weight .-%, especially at most 5 wt .-% and especially at most 2.5 wt .-%, each based on the total weight of the remaining fermentation broth is.
  • the isolation or depletion of fine chemicals (i.e., the microbial metabolite) from the fermentation broth can be accomplished in one or more steps.
  • An essential step here is the separation of the solid constituents from the fermentation broth. This can be carried out either before or after the isolation of the desired product. Both for the isolation of recyclables and for the separation of solids, d. H.
  • Solid-liquid phase separation methods known in the art are also known, which also include steps for coarse and fine cleaning of the valuable substances as well as for packaging (eg described in Belter, P.A., Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Co.). Sons (1988), and LJllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Ed. On CD-ROM, Wiley-VCH).
  • the product of value it is advantageously possible to proceed by first removing the solid constituents from the fermentation broth, e.g. B. by centrifugation or filtration, and then isolated the desired product from the liquid phase, for. Example by crystallization, precipitation, adsorption or distillation.
  • the desired product can also be isolated directly from the fermentation broth, for. Example by using chromatographic methods or extraction method.
  • the chromatographic method is ion exchange chromatography, in which the desired product can be selectively isolated on the chromatography column.
  • the separation of the solids from the remaining fermentation broth is advantageously carried out z. B. by decantation, evaporation and / or drying.
  • these compounds can also be prepared by formulating them in quasi-solid form (pseudo-solid form) on adsorbents.
  • Suitable adsorbents for this purpose are, for. B. in WO 2005/116228 (PCT / EP2005 / 005728) indicated by the applicant.
  • Examples of compounds which can be advantageously prepared in this way are ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, furthermore propionic acid, lactic acid, propanediol, butanol and acetone.
  • These compounds in pseudo-free formulation are understood in the context of the present invention as nonvolatile microbial metabolites in solid form.
  • a further specific embodiment (II) relates to a process in which the volatile constituents of the fermentation broth are substantially removed without prior isolation or removal of a nonvolatile microbial metabolite, and optionally without prior separation of solid constituents, resulting in a solid formulation of a nonvolatile microbial Metabolism product receives.
  • a solid or at least semi-solid residue remains, which can optionally be converted by the addition of solids in a solid product.
  • the volatile constituents of the fermentation broth are advantageously up to a residual moisture content in the range of 0.2 to 30 wt .-%, preferably 1 to 20 wt .-%, particularly preferably 2 to 15 wt .-% and most preferably 5 to 15 wt .-%, based on the determined after drying total weight of the solid components, remove from the fermentation broth.
  • the residual moisture content can be determined by conventional methods known in the art, for. Example by means of thermogravimetry (Hemminger et al., Methods of thermal analysis, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).
  • Recovery of the nonvolatile metabolite (s) in solid form from the fermentation broth may be accomplished in one, two or more stages, especially in a one or two step procedure. In general, at least one, in particular the final stage for obtaining the metabolite in solid form will comprise a drying step.
  • the volatile constituents of the fermentation broth if appropriate after the aforesaid preliminary separation, are removed until the desired residual moisture content has been reached.
  • the fermentation broth first concentrate, z.
  • the proportion of volatiles removed in this step is generally from 10 to 80% by weight and in particular from 20 to 70% by weight, based on the total weight of the fermentation broth volatiles.
  • the residual volatiles of the fermentation broth are removed until the desired residual moisture content is achieved.
  • the non-volatile metabolite is substantially not removed along with the volatiles of the liquid medium, but remains with at least a portion, usually the majority, and especially the total, of the other solid components from the fermentation broth obtained residue.
  • proportions of the desired nonvolatile microbial metabolite generally not more than 20% by weight, for example from 10 to 20% by weight, may also be used.
  • the desired non-volatile microbial metabolite remains at least 90% by weight, in particular at least
  • the non-starchy solid constituents are separated from the fermentation broth, z. B. by centrifugation or filtration.
  • such pre-separation will be performed to remove coarser solid particles containing no or low levels of nonvolatile microbial metabolite.
  • formulation auxiliaries such as carrier and coating materials, binders and other additives
  • the properties of the dried metabolite present together with the solid constituents of the fermentation can be targeted with regard to various parameters such as active ingredient content, particle size, particle shape, tendency to dust, hygroscopicity, stability, In particular, storage stability, color, odor, flow behavior, agglomeration tendency, electrostatic charge, light and temperature sensitivity, mechanical stability and redispersibility are packaged in a manner known per se.
  • formulation auxiliaries include, for. As binders, support materials, powdering / flow aids, also color pigments, biocides, dispersants, antifoams, viscosity regulators, acids, alkalis, antioxidants, enzyme stabilizers, enzyme inhibitors, adsorbates, fats, fatty acids, oils o- mixtures thereof.
  • Such formulation auxiliaries are advantageously used in particular when using formulation and drying processes such as spray drying, fluid bed drying and freeze drying as drying aids.
  • formulation and drying processes such as spray drying, fluid bed drying and freeze drying as drying aids.
  • the proportion of the aforementioned additives and optionally other additives such as coating materials can vary greatly depending on the specific requirements of the respective metabolite and depending on the properties of the additives used and z. B. in the range of 0.1 to 80 wt .-% and in particular in the range of 1 to 30 wt .-%, each based on the total weight of the finished formulated product or mixture.
  • the addition of formulation auxiliaries may take place before, during or after the work-up of the fermentation broth (also referred to as product formulation or solid design) and in particular during the drying.
  • An addition of formulation auxiliaries prior to working up the fermentation broth or the metabolic product may be particularly advantageous in order to improve the processability of the substances or products to be worked up.
  • the formulation auxiliaries may be added both to the metabolic product obtained in solid form and to a solution or suspension containing it, e.g. After completion of fermentation directly to the fermentation broth or to a solution or suspension obtained in the course of the workup prior to the final drying step.
  • the adjuvants z. B. are mixed in a suspension of the microbial metabolite; Such a suspension can also be added to a carrier material, for. B. by spraying or mixing.
  • a carrier material for. B. by spraying or mixing.
  • formulation auxiliaries during drying can, for. B. play a role when a product containing the metabolic solution or suspension is sprayed.
  • addition of formulation auxiliaries z. B. when applying coatings or coatings / coating layers on dried particles. Both after drying and after a possible coating step further aids can be added to the product.
  • the removal of the volatile constituents from the fermentation broth is carried out in a manner known per se by customary processes for the separation of solid phases from liquid phases, including filtration processes and processes for evaporating volatile constituents of the liquid phases. Such methods, which may also include steps for coarse cleaning of recyclable materials and steps for packaging, z.
  • customary processes for the separation of solid phases from liquid phases including filtration processes and processes for evaporating volatile constituents of the liquid phases.
  • Such methods which may also include steps for coarse cleaning of recyclable materials and steps for packaging, z.
  • the non-volatile microbial metabolite if it is present dissolved in the liquid phase, is converted from the liquid phase to the solid phase, eg. B. by crystallization or precipitation. Subsequently, a separation of the non-volatile solid components including the metabolite, z. B. by centrifugation, decantation or filtration ration. Similarly, one can also separate oily metabolites, wherein the respective oily fermentation products by the addition of adsorbents, eg. As silica, silica gels, clay, clay and activated carbon, converted into a solid form.
  • adsorbents eg. As silica, silica gels, clay, clay and activated carbon
  • the volatiles are removed by evaporation.
  • the evaporation can be done in a conventional manner.
  • suitable methods for volatilization of volatile components are spray drying, fluidized bed drying or agglomeration, freeze drying, current and contact dryers and extrusion drying.
  • a combination of the aforementioned methods with molding methods such as extrusion, pelletizing or prilling can be made. In these latter methods, preferably partially or substantially predried metabolic product-containing mixtures are used.
  • the devolatilization of the fermentation broth comprises a spray drying process or a fluidized bed drying process including fluid bed granulation.
  • the fermentation broth optionally after a preliminary separation to remove coarse solid particles containing no or only small amounts of nonvolatile microbial metabolite, fed to one or more spray or fluidized bed drying apparatus.
  • the transport or the supply of solids-loaded fermentation broth is advantageously carried out by means of conventional transport devices for solids-containing liquids, eg. As pumps such as eccentric screw pumps (eg., The Fa. Delasco PCM) or high-pressure pumps (eg., The company LEWA Herbert Ott GmbH).
  • Carrying out a fermentation using the sugar-containing liquid medium according to the invention can also be carried out in such a way that
  • step a2) the dextrin-containing medium (1) obtained in step a2), which contains non-starch-containing solid components of the starch source, a subset of not more than 50 wt .-%, z. B. in the range of 5 to 45 wt .-%, based on the total weight, and the remaining amount of a fermentation for the preparation of a first metabolite (A), z. B. a non-volatile substance (A) in solid form or a volatile metabolite
  • the solids content of the remaining portion of the sugar-containing liquid medium is preferably at most 50% by weight, in particular at most 30% by weight, particularly preferably at most 10% by weight and very particularly preferably at most 5 wt .-% is. In particular, in this case, it is preferable to separate all the solids before fermentation to produce the second metabolite (B).
  • the compounds produced by such microorganisms in the separate fermentation are in particular among vitamins, cofactors and nutraceuticals, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides, lipids, saturated and unsaturated fatty acids, aromatic compounds, proteins, carotenoids, especially with vitamins, Cofactors and nutraceuticals, proteins and carotenoids, and especially selected from riboflavin and calcium pantothenate.
  • a preferred embodiment of this procedure relates to the parallel production of the same metabolites (A) and (B) in two separate fermentations. This is particularly advantageous if different purity requirements are to be set for different applications of the same metabolic product.
  • amino acid eg. As lysine, methionine, threonine or glutamate
  • the same amino acid to be used as a food additive is prepared using the solid-depleted fermentation broth according to ii).
  • z. B. proceed as follows. It implements a preferably large-volume fermentation for the production of metabolites A, z.
  • amino acids such as lysine, methionine, glutamate or threonine, citric acid or ethanol, eg. B. corresponding to those described in WO 2005/116228 (PCT / EP2005 / 005728) or PCT / EP2006 / 066057 (the older patent application DE 10 2005 042 541.0) described method or according to the methods known for the fermentative production of bioethanol.
  • According to i) becomes part of the medium obtained after step a2) (1) taken.
  • the part removed according to i) can be prepared according to ii) by customary methods, eg. As centrifugation or filtration, completely or partially freed from the solids, depending on the requirements of the fermentation for the production of B.
  • a solid stream separated according to i) is advantageously returned to the flow of the medium (1) of the large-volume fermentation.
  • the medium (1) produced after step ii) has concentrations of oligosaccharides as are customary in fermentative ethanol production (bioethanol), eg , B. in the range of 20 to 33 wt .-%.
  • bioethanol fermentative ethanol production
  • the carrying out of a separation of solids according to step ii) also depends here on the requirements of the fermentation for the production of the respective metabolite B.
  • the metabolite B produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • analogous conditions and procedures can be applied here, as have been described for other carbon sources, eg. In WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • a preferably large-volume fermentation is implemented for the production of metabolic products A, z.
  • amino acids such as lysine, methionine, glutamate, or citric acid or ethanol, as described above.
  • part of the medium (1) obtained after step a2) is removed and, in accordance with ii), by customary methods, e.g. As centrifugation or filtration, completely or partially freed from the solids.
  • the medium (1) freed from it, essentially completely or partially freed of the solids is fed to a fermentation according to ii) for the production of the metabolite B, in this case riboflavin.
  • the solid stream separated according to (ii) is advantageously returned to the stream of the medium (1) of the large-volume fermentation.
  • the riboflavin-containing fermentation broth produced in this manner can be worked up by analogous conditions and procedures as described for other carbon sources, e.g. In DE 4037441, EP 464582, EP 438767 and DE 3819745.
  • the separation of the crystalline present riboflavin is preferably carried out by decantation. Other types of solids separation, e.g. As filtration, are also possible.
  • the riboflavin is dried, preferably by means of spray and fluidized bed dryers.
  • the riboflavin-containing fermentation mixture produced according to ii) can be worked up by analogous conditions and procedures, such.
  • the fermentation broth is centrifuged here and the residual solids-containing fraction is treated with a mineral acid.
  • the riboflavin formed is filtered from the aqueous-acidic medium, optionally washed and then dried.
  • the metabolic product B produced by the microorganisms in the fermentation is pantothenic acid.
  • analogous conditions and procedures can be applied here, as have been described for other carbon sources, eg. In WO 01/021772.
  • the according to i) pre-cleaned, preferably substantially freed from the solids, medium (1) is fed to a fermentation according to ii) for the production of pantothenic acid.
  • the reduced viscosity compared to the solids-containing liquid medium is particularly advantageous.
  • the separated solids stream is preferably returned to the stream of the sugar-containing liquid medium (1) of the large-volume fermentation.
  • pantothenic acid-containing fermentation broth prepared according to ii) may be worked up by analogous conditions and procedures as described for other carbon sources, e.g. In EP 1050219 and WO 01/83799. After pasteurizing the entire fermentation broth, the remaining solids z. B. separated by centrifugation or filtration. The clarification of the solids separation is partially evaporated, optionally mixed with calcium chloride and dried, in particular spray-dried.
  • the separated solids can be obtained in the context of the parallel-operated, large-volume fermentation process together with the respective desired microbial metabolite (A).
  • whole or ground cereal grains preferably corn, wheat, barley, millet, triticale and / or rye may be added to the product formulation or protein composition.
  • the millables used in the following were produced as follows. Whole corn kernels were completely ground using a rotor mill. Using different Schlägerwerke, grinding tracks or sieve installations three different subtleties were achieved. A sieve analysis of the material to be ground using a laboratory vibrating sieve (vibration analysis machine: Retsch Vibrotronic type VE1, sieving time 5 min, amplitude: 1.5 mm) gave the results listed in Table 1.
  • the reaction mixture was held at this temperature for about 100 minutes. Subsequently, a further 2.4 g of Termamyl 120 L were added and the temperature was maintained for about 100 minutes. The progress of the liquefaction was followed during the time of the iodine-starch reaction. The temperature was finally raised to 100 ° C and the reaction mixture boiled for a further 20 min. To There was no strength to prove at that time. The reactor was cooled to 35 ° C.
  • the addition of further flour was started.
  • the mash was added with 0.13 ml of CaCl 2 stock solution to maintain the Ca 2+ concentration at 70 ppm.
  • the temperature was kept constant at 85 ° C. Wait at least 10 minutes to allow complete reaction before adding another portion (50 g of flour and 0.13 ml of CaCl 2 stock solution).
  • 1.67 ml of Termamyl were added; then two more portions (50 g each of flour and 0.13 ml CaCl 2 stock solution) were added. A dry matter content of 55% by weight was achieved.
  • the temperature was raised to 100 ° C and the mash was boiled for 10 minutes.
  • a sample was taken and cooled to room temperature. After dilution of the sample with deionized water (about 1:10), one drop of concentrated Lugol's solution (mixture of 5 g iodine and 10 g potassium iodide per liter) was added. A deep blue color indicated a level of residual starch; browning occurred when the starch was completely hydrolyzed. When the test indicated a level of remaining starch, the temperature was again lowered to 85 ° C and kept constant. Another 1.67 ml of Termamyl were added until the iodine-starch reaction turned out to be negative.
  • a sample was taken and cooled to room temperature. After dilution of the sample with deionized water (about 1:10), one drop of concentrated Lugol's solution (mixture of 5 g iodine and 10 g potassium iodide per liter) was added. A deep blue color indicated a level of residual starch; browning occurred when the starch was completely hydrolyzed. When the test indicated a level of remaining starch, the temperature was again lowered to 85 ° C and kept constant. Another 1.1 ml of Termamyl were added until the iodine-starch reaction turned out to be negative.
  • a modified strain of Corynebacterium glutamicum was used, which was described under the name ATCC13032 lysCfbr in WO 05/059144.
  • Glycoamylase (1, 4-alpha-D-glucan glucohydrolase) is classified by the following EC number EC 3.2.1.3 [1].
  • a search with the search query EC 3.2.1.3 was carried out in the following databases: Brenda, Swissprot, ERGO-WIT, CAZY and PIR, each receiving a list of proteins having EC 3.2.1.3.
  • Hormoconis resinae Humicola grisea, Humicola lanuginosa, Hypocrea lixii, Kluyveromyces lactis, Lentinula edodes, Lipomyces kononenkoae, Magnaporthe grisea, Mesorhizobium loti, Methanocaldococcus jannaschii, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Monascus rubiginosus, Monascus sp , Mucor rouxianus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum, Mycobacterium tuberculosis, Myrothecium sp., Neurospora crassa, Nostoc punctiforme, Oryza sativa, Paecilomyces variotii
  • glucoamylase activity Various microorganisms are tested for glucoamylase activity in a shake flask test.
  • the medium used for this purpose is any conventional medium which is suitable for the growth of the organism and leads to an expression of glucoamylase. Suitable media are commercially available or may be prepared according to published regulations (eg as described in catalogs of the American Type Culture Collection).
  • a mixture of glucose oligomers of different chain lengths can be used in a defined medium as sole carbon source. Since under fermentation conditions no thermal hydrolysis of the oligosaccharides only strains with glucoamylase and / or maltase activity can grow in this medium. As a substrate is z. B. Maldex 150 (Amylum Group). The screening is carried out under different fermentation conditions (pH, temperature).
  • Maldex 150 has the following composition (see Table 2):
  • maltodextrin mixture pure maltotetraose, maltopentaeose, etc., can be used as a carbon source for screening. After termination of the cultivation, the biomass is centrifuged off and the supernatant is filtered.
  • the clear supernatant is used in a glucoamylase activity assay (CHEN et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 51, 175-181 (2005)).
  • a reaction mixture of 0.2 ml 5OmM acetate-sodium acetate buffer (pH 5.0) with 0.5% soluble starch and 0.2 ml of supernatant is used.
  • the released glucose amount is determined using the glucose oxidase / peroxidase method (Bergmayer and Bernt, 1974).
  • One unit of glucoamylase activity is defined as the amount of enzyme which liberates 1 ⁇ mol of glucose from soluble starch per minute under the given reaction conditions.
  • a probe is constructed to identify and clone DNA sequences of various organisms encoding polypeptides having glucoamylase activity.
  • probes can be used for hybridization with the genomic or cDNA of the desired organism, followed by Southern blotting by the standard method to identify the gene of interest. Instructions for the identification of DNA sequences by hybridization will be found in the manual "The DIG System Users Guide for
  • PCR primers are synthesized. These are used in a PCR reaction with the DNA of the organism to be examined. Are appropriate binding sites for the primers, i. H. Glucoamylasecodierende genes, so the corresponding amplified oligonucleotides can be identified by means of a subsequently performed gel electrophoresis. Instructions for the Amplification of
  • PCR polymerase chain reaction
  • the addition of further flour was started. During the addition, the temperature was kept constant at 85 ° C. Wait at least 10 minutes to ensure a complete reaction before adding another portion (50 g) of flour. After adding two portions, 1.67 ml of Liquozyme were added; then two more portions (50 g each) of flour were added. A dry matter content of 55% by weight was achieved. After the addition, the temperature was raised to 100 ° C and the mash was boiled for 10 minutes.
  • a sample was taken and cooled to room temperature. After dilution of the sample with deionized water (about 1:10), one drop of concentrated Lugol's solution (mixture of 5 g iodine and 10 g potassium iodide per liter) was added. A deep blue color indicates a content of remaining starch; a browning occurs when the starch has been completely hydrolyzed.
  • the negative for starch tested mixture was placed hot in sterile containers and stored after cooling at 4 ° C.
  • the modified wild type with feedback-deregulated aspartokinase ATCC13032 lysCfbr was used.
  • compositions of the flask medium are listed in Table 4. The experiment was carried out in triplicate.
  • the flasks were incubated at 30 ° C for three days with agitation (200 rpm) in a humidified shaker cabinet.
  • the content of lysine was determined by HPLC.
  • HPLC analyzes were performed on Agilent 1 100 Series LC instruments.
  • the amino acid concentration was determined by high pressure liquid chromatography on an Agilent 1100 Series LC System HPLC. A pre-column derivatization with ortho-pthalaldehyde allows the quantification of the amino acids formed, the separation of the amino acid mixture takes place on a Hypersil AA column (Agilent).
  • An Aspergillus niger phytase production strain with 6 copies of the phyA gene from Aspergillus ficuum under the control of the glaA promoter was generated analogously to the preparation of NP505-7 described in detail in WO98 / 46772.
  • compositions of the flask medium are listed in Table 7. Out of everyone
  • the flasks were incubated at 34 ° C for 6 days and agitated (170 rpm) in a humidified shaker cabinet.
  • phytase activity with phytic acid as substrate and at a suitable phytase activity level (standard: 0.6 U / ml) in 250 mM acetic acid / sodium acetate / Tween 20 (0.1% by weight), pH 5 , 5 buffers determined.
  • the assay has been standardized for use in microtiter plates (MTP).
  • Flask phytase activity [FTU / ml]

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte: a1) Vermahlen einer Stärkequelle, wobei man ein Mahlgut erhält, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält; a2) Suspendieren des Mahlguts mit einer wässrigen Flüssigkeit und Verflüssigen des in der wässrigen Flüssigkeit enthaltenen Mahlguts in Gegenwart mindestens ei- nes Stärke verflüssigenden Enzyms, wobei man ein wässriges Dextrin-haltiges Medium (1) erhält, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Be- standteile der Stärkequelle umfasst; und b) Verwendung des wässrigen Dextrin-haltigen Mediums (1) in einer Fermentation zur Kultivierung eines Mikroorganismus, welcher zur Überproduktion der organi- schen Verbindung befähigt ist; wobei Enzyme, die Dextrine zu Monosacchariden hydrolysieren, nicht oder in einer Menge von weniger als 0,001 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der eingesetz- ten Stärkequelle, zugegeben werden.

Description

Fermentative Herstellung organischer Verbindungen unter Einsatz Dextrin-haltiger Medien
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung organischer Verbindun- gen mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom unter Einsatz eines Dextrin-haltigen Mediums, das zumindest einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst, zur Kultivierung der Mikroorganismen.
Zuckerhaltige Flüssigmedien sind eine grundlegende Nährstoffquelle für viele Fermentationsverfahren; die in den Medien enthaltenen Zuckeranteile werden von den eingesetzten Mikroorganismen verstoffwechselt, wobei man organische Wertprodukte erhält. Die Palette derart hergestellter mikrobieller Stoffwechselprodukte, d. h. organischer Verbindungen, umfasst hierbei z. B. niedermolekulare flüchtige Verbindungen wie E- thanol, nichtflüchtige Stoffwechselprodukte wie Aminosäuren, Vitamine und Carotenoi- de sowie eine Vielzahl weiterer Stoffe.
Für solche allgemein bekannten mikrobiellen Fermentationsverfahren werden in Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen unterschiedliche Kohlen- stoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, so genannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advan- ces in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-1 12).
Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung mikrobieller Stoffwechselprodukte etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.
Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung mikrobieller Stoffwechselprodukte ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktionsschritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z. B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fer- mentation zur Produktion der gewünschten Stoffwechselprodukte eingesetzt zu werden.
Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht aufgereinigter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fer- mentative Produktion mikrobieller Stoffwechselprodukte beschrieben worden. Typischerweise werden die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestand- teilen enthält, welche die Fermentation nachteilig beeinflussen können, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/077252; JP 2001-072701 ; JP 56-169594; CN 12181 11 ), nach der Verflüssigung (WO 02/077252; CN 1 173541 ) oder im An- schluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.
Neuere Verfahren zur fermentativen Herstellung von organischen Verbindungen umfassen insbesondere eine Aufreinigung der Stärkequellen vor der Fermentation z. B. die Aufreinigung von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500), oder stellen Methoden bereit, welche die Herstellung von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.
Nicht aufgereinigte Stärkequellen hingegen werden in großem Umfang bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol eingesetzt. Hierbei werden die Stärkequellen, üblicherweise ganze Getreidekörner, zunächst trocken vermählen und anschließend der Stärkebestandteil der Stärkequelle unter Einwirkungen von Enzymen hydrolysiert. Da- bei kann die Hydrolyse sowohl diskontinuierlich, z. B. in Rührkesseln, als auch kontinuierlich, z. B. In Jet-Kochern durchgeführt werden. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z. B. in „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Kapitel 2, S. 7 bis 23, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580- 28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein gravierendes Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry-Milling-Verfahrens zur Herstellung anderer mikrobieller Stoffwechselprodukte ist jedoch der über die Zuckerlösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann, z. B. im Hinblick auf die Sauerstofftransferrate bzw. den Sauerstoffbedarf der eingesetzten Mikroorganismen (vgl. hierzu Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Ae- robic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370) als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschweren kann.
Zudem kann durch den Feststoffeintrag bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension die Viskosität der Suspension einen kritischen Wert erreichen, wodurch z. B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Dies ist im Hinblick auf die fermentative Bioethanol-Herstellung insofern nicht weiter relevant, da höhere Konzentrationen aufgrund der Toxizität des Produkts für die zur Fermentation eingesetzten Hefen ohnehin nicht sinnvoll umgesetzt werden könnten.
Bei der fermentativen Herstellung anderer organischer Stoffwechselprodukte als Etha- nol ist es prinzipiell von Nachteil, der Fermentation zuckerhaltige Medien mit geringer Zuckerkonzentrationen zuzuführen, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt und sich folglich die erreichbare Endkonzentration der Wertprodukte verringert, was einerseits erhöhte Kosten bei deren Gewinnung aus dem Fermentationsmedium verursacht und die Raum-Zeit-Ausbeute abnimmt. Diese Erwägungen sind insbesondere für den Fall maßgeblich, wenn ein für eine großvolumige Bioethanol-Produktion hergestelltes Stärkehydrolysat, das herkömmlicherweise gerin- ge Zucker- bzw. Glucosekonzentrationen von bis zu etwa 30 oder 33 Gew.-% aufweist, teilweise einer geringervolumigen Nebenfermentation zur Herstellung anderer Chemikalien zugeführt werden soll.
Andererseits können höhere Konzentrationen an verstoffwechselbaren Monosacchari- den im Fermentationsmedium zu einer Inhibierung der Fermentation oder des Wachstums des Mikroorganismus führen oder eine Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen zur Folge haben. Bei E. coli führt beispielsweise eine zu hohe Konzentration freier Glucose z. B. zur Bildung von organischen Säuren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z. B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Daher können höhere Konzentrationen an verstoffwechselbaren Monosacchariden in den der Fermation zugeführten Zucker-haltigen Medien während der Zufütterungsphase die Fermentation nachteilig beeinflussen. Problematisch ist auch der Einsatz höher konzentrierter Medien in der Batch-Phase, d. h. während der Wachstumsphase der Mikro- Organismen im Fermentationsansatz, bevor der Fermentation über den Feed-Strom weitere Zucker zugeführt werden, da viele Stämme zum Wachsen Glucosekonzentrati- onen unterhalb 6 Gew.-% benötigen.
Aufgrund der dargestellten Schwierigkeiten und Einschränkungen sind Dry-Milling- Verfahren, wie sie für die Bioethanolherstellung in breitem Umfang eingesetzt werden, bei der fermentativen Herstellung anderer mikrobieller Stoffwechselprodukte als Etha- nol bislang ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung geblieben.
Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung mikrobieller
Stoffwechselprodukte sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden. So beschreibt die JP 2001/275693 ein Verfahren zur fer- mentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermählen wurden. Zur Durchführung des Verfah- rens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von < 150 μm einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden ein Teil des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Bei diesem Verfahren werden mäßige Zuckerkonzentrationen erreicht. Ein ähnliches Ver- fahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäurehaltigen Futterzusatzes beschrieben.
Erhöhte Zuckerkonzentrationen in dem zur Fermentation eingesetzten Flüssigmedium können bei Einsatz eines Mahlguts zur Verzuckerung, das weitgehend die festen, nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle enthält, durch das in der
WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) der Anmelderin beschriebene Verfahren erreicht werden. Eine Abtrennung der in der Stärkequelle enthaltenen festen, nichtstärkehaltigen Bestandteile vor der Fermentation hat sich dabei überraschenderweise als nicht erforderlich erwiesen. Das beschriebene Verfahren kann unter in-situ- Verzuckerung der verflüssigten Stärkequelle durchgeführt werden. Ein ähnliches Verfahren unter Einsatz von unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequellen wird in der PCT/EP2006/066057 (die ältere Patentanmeldung DE 10 2005 042 541.0) der Anmelderin beschrieben.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein weiteres Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen durch Fermentation bereitzustellen, das keine oder zumindest keine vollständige vorherige Abtrennung der in der Stärkequelle enthaltenen, nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile erfordert. Das Verfahren sollte insbesondere einen vergleichsweise geringen apparativen Aufwand erfordern und den Einsatz von Medien mit hoher Zuckerkonzentrationen ermöglichen. Außerdem sollte es sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien und deren problemlosen Einsatz in der Fermentation auszeichnen. Insbesondere sollte das Verfahren die Verwendung von Getreide als Stärkequelle erlauben.
Es wurde überraschend gefunden, dass ein fermentatives Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen trotz des inhärent hohen Feststoffeintrags effizient durchführbar ist, indem man durch Vermählen und Verflüssigen von Stärkequellen ohne vorheriges vollständiges Abtrennen der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ein Dextrin-haltiges Medium (1 ) herstellt und dieses ohne Zugabe verzuckernder Enzyme in einer Fermentation einsetzt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte:
a1 ) Vermählen einer Stärkequelle, wobei man ein Mahlgut erhält, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält;
a2) Suspendieren des Mahlguts mit einer wässrigen Flüssigkeit und Verflüssigen des in der wässrigen Flüssigkeit enthaltenen Mahlguts in Gegenwart mindestens ei- nes Stärke verflüssigenden Enzyms, wobei man ein wässriges Dextrin-haltiges
Medium (1 ) erhält, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst; und
b) Verwendung des wässrigen Dextrin-haltigen Mediums (1 ) in einer Fermentation zur Kultivierung eines Mikroorganismus, welcher zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigt ist;
wobei Enzyme, die Dextrine zu Monosacchariden hydrolysieren, nicht oder in einer Menge von weniger als 0,001 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der eingesetz- ten Stärkequelle, zugegeben werden.
Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren kann trotz des Gehalts an festen, nicht-stärkehaltigen Bestandteilen der eingesetzten Stärkequelle in dem Dextrin- haltigen Medium (1 ) effizient durchgeführt werden, ohne dass es der Zugabe verzu- ckernder Enzyme bedarf. Geringe Mengen, die zu einer vollständigen Verzuckerung nicht ausreichen, typischerweise weniger als 0,001 Gew.-%, insbesondere weniger als 0,0005 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der eingesetzten Stärkequelle, können jedoch zugegeben werden.
Aufgrund der Verwendung von Dextrinen zur Kultivierung des Mikroorganismus kann eine hohe Konzentration an verstoffwechselbaren Zuckern im Fermentationsmedium sowohl in der Batch-Phase als auch in der Zufütterungsphase eingestellt werden, ohne dass es zu unerwünschten Nebenreaktionen kommt, so dass eine unerwünschte Verdünnung der Fermentationsbrühe vermieden wird. Zudem werden durch das erfindungsgemäße Verfahren Viskositätsprobleme, wie sie beim Verflüssigen der Stärke- quelle bei höheren Konzentrationen an Mahlgut auftreten können, weitgehend vermieden.
Hier und im Folgenden werden die Ausdrücke "Dextrin-haltiges Medium" und "Dextrin- haltige Flüssigkeit" synonym verwendet. Es versteht sich für den Fachmann, dass der in der Fermentation eingesetzte Mikroorganismus befähigt sein muss, die in dem wäss- rigen Dextrin-haltigen Medium (1 ) enthaltenen Dextrine zu verstoffwechseln, ohne dass diese durch externen Zusatz verzuckernder Enzyme in Di- und/oder Monosacchariden hydrolysiert werden müssen. Dabei werden die Dextrine von dem Mikroorganismus verstoffwechselt, vermutlich nachdem sie durch Stamm-eigene verzuckernde Enzyme, z. B. Stamm-eigene Glucoamylasen, hydrolysiert wurden. Besonders vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist im letzteren Fall, dass während der Fermentation die Geschwindigkeit der Verzuckerung, insbesondere einer Glucosefreisetzung, einerseits durch die Menge an Biomasse und anderseits durch das Expressionsniveau der Stamm-eigenen verzuckernden Enzyme dem Bedarf der Mikroorganismen automa- tisch angepasst wird.
Der Begriff „Verflüssigung" bedeutet hier und im Folgenden den hydrolytischen Abbau von Stärke zu Oligosacchariden, insbesondere zu Dextrinen.
Die Begriffe „Verzuckerung" bzw. „Verzuckern" bedeuten hier und im Folgenden die Hydrolyse von Dextrinen zu Monosacchariden, insbesondere zu Monosacchariden wie Glucose. Unter einem "verzuckernden Enzym" wird folglich ein Enzym verstanden, das Dextrine zu Monosacchariden hydrolysiert.
Unter dem Begriff „Dextrin" werden hier und im Folgenden durch hydrolytischen Abbau von Stärke erhaltene Oligosaccharide verstanden, die in der Regel aus 3 bis 18, insbesondere 6 bis 12 Monosaccharid-Einheiten, insbesondere aus Glucose-Einheiten, bestehen.
Die Begriffe „Gehalt an Glucoseäquivalenten" und „Zuckerkonzentration" bezeichnet die Gesamtkonzentration an Mono-, Di- und Oligosacchariden im Medium, die potenziell für eine Fermentation zur Verfügung steht. Der Begriff „Glucoseäquivalente" um- fasst auch die von Glucose verschiedenen verstoffwechselbaren Zucker bzw. Zuckereinheiten. Die Begriffe „überproduzierend" bzw. „Überproduktion" werden hier und im Folgenden in Bezug auf einen Mikroorganismus verwendet, um dessen Eigenschaft zu bezeichnen, ein oder mehrere seiner Stoffwechselprodukte in einer Menge zu produzieren, die über die zur Vermehrung des Mikroorganismus benötigte Menge hinausgeht, wodurch es zur Anreicherung im Fermentationsmedium kommt, wobei die Anreicherung extra- oder intrazellulär erfolgen kann.
Als Stärkequelle kommen für das erfindungsgemäße Verfahren vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis sowie in Zuckerrüben, Kartoffeln, Cassava und verschiedenen Hirsesorten, z. B. Sorghum und MiIo. Bevorzugt ist die Stärkequelle unter Getreide und speziell unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizen- körnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit analogen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Kornfrüchte oder Samen.
Zur Herstellung der Dextrin-haltigen Flüssigkeit wird im Schritt a1 ) die jeweilige Stärke- quelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z. B. Wasser, vermählen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden.
Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.
Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermählen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1 ) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d. h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μm in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-%. und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der vermahlenen Mehlpartikel eine Korn- große von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z. B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermenta- tionsschritt, führen.
Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad ent- spricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z. B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermählen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich da- her auch in der so genannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (so genannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d. h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuron- schicht der Getreidekörner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermählen und weiter verarbei- tet, gegebenenfalls nach vorheriger mechanischer Abtrennung von Keim und Spelzen.
Erfindungsgemäß enthält das verwendete Mahlgut zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getrei- dekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an verstoffwechselbarem Zucker im dextrinhaltigen Medium (1 )) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile im Mahlgut vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 15 Gew.-%, z. B. im Bereich von 15 bis 75 Gew.-% und speziell im Bereich von 20 bis 60 Gew.-%. Das zur Verflüssigung vorgesehene Mahlgut wird in Schritt a2) erfindungsgemäß mit einer wässrigen Flüssigkeit, z. B. Frischwasser, rückgeführtem Prozesswasser, z. B. aus einer nachfolgenden Fermentation, oder mit einer Mischung dieser Flüssigkeiten vermischt. Hierbei wird man in der Regel eine wässrige Suspension erhalten. In der Regel wird man eine solche Menge der Stärkequelle bzw. des Mahlguts mit der wässrigen Flüssigkeit vermischen und in dieser verflüssigen, dass die erhaltene wässrige Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) eine Konzentration an Glucoseäquivalenten von mindestens 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ), aufweist. Der Trockenmassegehalt in dem so erhaltenen Medium (1 ) beträgt typischerweise mindestens 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ).
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zum Suspendieren des festen Mahlguts verwendete wässrige Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z. B. im Bereich von 40 bis 60 °C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevor- zugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.
Zur Durchführung der Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut gemäß Schritt a2) hat es sich als vorteilhaft erwiesen, vor dem Beginn der Verflüssigung nur eine Teilmenge des gesamten Mahlguts mit der wässrigen Flüssigkeit zu vermischen und das restliche Mahlgut erst im Verlauf der Verflüssigung kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit zu geben.
Das Verflüssigen des Mahlguts gemäß Schritt a2) kann nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, z. B. nach den in dem eingangs zitierten „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Kapitel 2, S. 7 bis 23, beschriebenen Methoden.
Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms. Hierzu können grundsätzlich alle Stärke verflüssi- genden Enzyme, insbesondere α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1 ) eingesetzt werden, beispielsweise α-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus stae- rothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bio- ethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Terma- myl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Bezeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.
Hierbei erhält man eine wässrige Flüssigkeit, welche den verflüssigten Stärkeanteil aus dem Mahlgut, typischerweise Dextrine mit in der Regel 3 bis 18, insbesondere 6 bis 12 Monosaccharid-Einheiten, gegebenenfalls weitere Oligosaccharide, gegebenenfallls geringe Mengen an Mono- und/oder Disacchariden (in der Regel < 30 Gew.-%, häufig < 25 Gew.-%, < 20 Gew.-%, insbesondere < 10 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge an Mono-, Di- und Oligosacchariden) sowie die nicht-stärkehaltigen Bestandteile des eingesetzten Mahlguts, insbesondere die festen, nicht-stärkehaltigen Bestand- teile des zur Verflüssigung eingesetzten Mahlguts enthält.
Vorteilhafterweise werden die Mengen an Stärke verflüssigendem Enzym und Mahlgut, so gewählt sein, dass die Viskosität während des Gelierungsvorgangs ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z. B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 15 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 8 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosimeter Type Roto Visko RV20 mit Messsystem M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50 °C und einer Schergeschwindigkeit von 200 s"1.
Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten α-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an α-Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelierungstemperatur durchge- führt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur bzw. Verkleisterungstemperatur der eingesetzten Stärke (so genannter Cooking Prozess). Die hierzu für die jeweilige Stärke erforderliche Temperatur ist dem Fachmann bekannt (siehe das eingangs zitierte „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Kapitel 2, S. 1 1 ) oder kann von ihm in Routineexperimenten bestimmt werden. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich von 80 bis 165 °C, bevorzugt im Bereich von 90 bis 150 °C und besonders bevorzugt im Bereich von 100 bis 140 °C gewählt, wobei die Temperatur in der Regel wenigstens 5 K, vorzugsweise mindestens 10 K, und besonders bevorzugt mindestens 20 K, z. B. 10 bis 100 K, insbesondere 20 bis 80 K ober- halb der Gelierungstemperatur liegt. Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau ermöglicht wird.
Für eine optimale Wirkung der α-Amylase (bzw. des verwendeten Stärke verflüssigen- den Enzyms) wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise im pH-Optimum des verflüssigenden Enzyms, häufig bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vor- zugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH-Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugs- weise mit verdünnten Mineralsäuren wie H2SO4 oder H3PO4 bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt man zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gemäß Schritt a2) mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich o- der diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit. Vorzugsweise gibt man hierbei wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung in den Reaktor. Häufig wird die zugegebene Menge 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-% nicht überschreiten. Vorzugsweise wird die im Verlauf zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d. h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 30 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 20 Gew.-%, z. B. 1 bis 30 Gew.-% und insbesondere 2 bis 20 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Wesentlich bei dieser Ausführungsform ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird.
Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z. B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z. B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in der wässrigen Flüssigkeit, suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die diskontinuierliche oder kontinuierliche, insbesondere portionsweise Zugabe einer Teilmenge des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen α-Amylase derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maximal 15 Pas und besonders bevorzugt maximal 8 Pas be- trägt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders be- vorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelatinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugs- weise eine α-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zum Suspendieren des festen Mahlguts verwendete wässrige Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z. B. im Bereich von 40 bis 60 °C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevorzugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.
Zu der Suspension des Mahlguts wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, gegeben. Wird eine Teilmenge des Mahlguts erst im Verlauf der Verflüssigung hinzugegeben, so gibt man anfangs vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der α-Amylase zu, z. B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte α-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an α-Amylase richtet sich in diesem Fall nach der Aktivität der jeweiligen α-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis
2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1 ,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann hierbei die Teilmenge der α-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwendeten Flüssigkeit vermengt werden.
Vorzugsweise wird die eingesetzte Menge oder Teilmenge an α-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z. B. im Bereich von 20 bis 30 °C, zu der Suspension gegeben.
Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich von 80 bis 165 °C, bevorzugt im Bereich von 90 bis 150 °C, und besonders bevorzugt im Bereich von 100 bis 140 °C gewählt, wobei die Temperatur in der Regel wenigstens 5 K, vorzugsweise mindestens 10 K und besonders bevorzugt mindestens 20 K, z. B. 10 bis 100 K, insbesondere 20 bis 80 K oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden gegebenenfalls nach und nach weitere Teilmengen der Stärkequelle, z. B. jeweils 1 bis 30 Gew.-% und insbesondere 2 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die gesamte eingesetzte Menge an Mahlgut, zu der stärkehaltigen Suspension gegeben. In diesem Fall ist es bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugebende Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alternativ kann in dieser Ausführungsform die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden.
Nach Erreichen der gewünschten Temperatur bzw. gegebenenfalls nach vollständiger Zugabe des Mehls wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z. B. 10 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, d. h. verkocht. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur, jedoch vorzugsweise oberhalb der Gelierungstemperatur, z. B. auf 70 bis 90 °C, abgekühlt. Anschließend wird gegebenenfalls eine weitere Teilmenge an α-Amylase, vorzugsweise die Hauptmenge, zugesetzt. In diesem Fall beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener α-Amylase je nach Aktivität der verwendeten α-Amylase unter den Reaktionsbedingungen vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls kön- nen hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen α-Amylase, z. B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.
Alternativ kann man die das Mahlgut enthaltende wässrige Suspension zur Verflüssigung des Stärkeanteils zunächst durch Einbringen von Wasserdampf auf eine Temperatur oberhalb der Verkleisterungstemperatur der in der Stärkequelle bzw. dem Mahlgut enthaltenen Stärke erhitzen. Typischerweise wird man auf eine Temperatur erhitzen, die wenigstens 10 K und insbesondere wenigstens 20 K, z. B. 10 bis 100 K, ins- besondere 20 bis 80 K, oberhalb der jeweiligen Verkleisterungstemperatur liegt. Insbesondere erhitzt man die Suspension auf Temperaturen im Bereich von 90 bis 150 °C, und speziell im Bereich von 100 bis 140 °C.
Bei dem zum Erhitzen eingesetzten Wasserdampf handelt es sich typischerweise um überhitzen Wasserdampf, der eine Temperatur von wenigstens 105 °C, insbesondere wenigstens 110 °C, z. B. 1 10 bis 210 °C aufweist. Vorzugsweise wird der Dampf mit Überdruck in die Suspension eingebracht. Dementsprechend weist der Dampf vorzugsweise einen Druck von wenigstens 1 ,5 bar, z. B. 1 ,5 bis 16 bar, insbesondere 2 bis 12 bar auf.
Das Einbringen von Wasserdampf in die Suspension erfolgt in der Regel so, dass man den Dampf mit Überdruck, vorzugsweise einem Überdruck von 1 bis 10 oder 11 bar, insbesondere 1 ,5 bis 5 bar und vorzugsweise mit hoher Geschwindigkeit in die Suspension einträgt. Durch das Eintragen des Dampfes erhitzt sich die Suspension augenblicklich auf Temperaturen oberhalb 90 °C, also auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur.
Vorzugsweise erfolgt das Erhitzen mit Wasserdampf in einer kontinuierlich arbeitenden Vorrichtung, in welche man die Suspension kontinuierlich mit einem bestimmten Förderdruck, der sich aus der Viskosität der Suspension, der Fördergeschwindigkeit und der Geometrie der Vorrichtung ergibt, einspeist und in die man im Bereich des Einspei- sens der Suspension den heißen Dampf mit Überdruck, bezogen auf den Förderdruck, über eine regelbare Düse einspeist. Durch das Einspeisen des Dampfs mit Überdruck wird die Suspension nicht nur erhitzt sondern es wird auch mechanische Energie in das System eingetragen, welche eine weitere Zerteilung der Mahlgutpartikel fördert, einen besonders gleichmäßigen Energieeintrag bewirkt, und somit eine besonders gleichmäßige Verkleisterung der granulären Stärkepartikel im Mahlgut zur Folge hat. Typischerweise haben diese Vorrichtungen eine röhrenförmige Geometrie. Vorzugsweise erfolgt das Eintragen des Dampfes in Richtung der Längsachse der röhrenförmigen Vorrichtung. Die Zufuhr der Suspension erfolgt in der Regel in einem Winkel von wenigstens 45° oder senkrecht hierzu. Die regelbare Düse weist typischerweise eine konische Geometrie auf, die sich in Fließrichtung des Dampfs verjüngt. In dieser Düse ist eine Nadel oder ein auf einer in Längsrichtung verschiebbaren Stange angeordneter Kegel angeordnet. Nadel bzw. Kegel bildet mit dem Konus der Düse einen Spalt. Durch Verschieben der Nadel bzw. der Stange in Längsrichtung lässt sich die Größe des Spalts und damit die Querschnittsfläche der Düsenöffnung in einfacher Weise einstellen, wodurch man in einfacher Weise die Geschwindigkeit des Dampfeintrags regulieren kann.
Typischerweise weisen diese Vorrichtungen außerdem ein Vermischungsrohr auf, in welches die Suspension nach dem Dampfeintrag transportiert und aus der Vorrichtung ausgetragen wird. Dieses Vermischungsrohr ist üblicherweise in Richtung des Dampfeintrags und senkrecht zur Einspeisung angeordnet. Das Vermischungsrohr bildet typischerweise mit der Düse einen Spalt, durch den die Suspension transportiert wird. Durch diesen Spalt wirken beim Transport zusätzliche Scherkräfte auf die Suspension und erhöhen somit den mechanischen Energieeintrag in die Suspension. Das Vermischungsrohr kann in Längsrichtung verschiebbar angeordnet sein. Durch Verschieben des Vermischungsrohrs lässt sich in einfacher Weise die Größe der Spaltöffnung einstellen und damit das Druckgefälle in der Vorrichtung.
Derartige Vorrichtungen sind unter der Bezeichnung Jet-Kocher aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise die in „The Alcohol Textbook", Kapitel 2, loc. cit, Figur 13 dargestellte Vorrichtung und kommerziell erhältlich, beispielsweise unter der Bezeichnung HYDROHEATER® der Fa. Hydro Thermal Corp. Waukesha Wl, USA.
Bei kontinuierlicher Reaktionsführung wird die mit Wasserdampf behandelte Suspensi- on in der Regel im Anschluss daran in eine Nachreaktionszone überführt, um das Gelieren der Stärkebestandteile fortzusetzen. In der Nachreaktionszone herrscht typischerweise Überdruck, typischerweise ein Absolutdruck im Bereich von 2 bis 8 bar. Die Temperaturen in der Nachreaktionszone liegen typischerweise im Bereich von 90 bis 150 °C. Die Verweilzeit in dieser Nachreaktionszone kann in Abhängigkeit von der Temperatur der Suspension im Bereich von 1 min bis 4 h betragen. Die Nachreaktionszonen weisen typischerweise eine röhrenförmige oder säulenförmige Geometrie auf. In einer Ausführungsform handelt weist die Nachreaktionszone die Geometrie einer senkrecht angeordneten Säule auf. Die Suspension wird hierbei nach Verlassen der Vorrichtung zur Dampfbehandlung im oberen Bereich der Säule aufgebracht und im unteren Bereich entnommen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist die Nachreaktionszone eine röhrenförmige Geometrie auf.
Nach Verlassen der Nachreaktionszone wird die Suspension in der Regel entspannt und man führt dann eine Verflüssigung durch. Vorzugsweise führt man die Entspan- nung als Flash-Verdampfung durch, um die Suspension abzukühlen, vorzugsweise auf Temperaturen unterhalb 100 °C, insbesondere unterhalb 85 °C. In der Regel erfolgt dann eine Verflüssigung der so aufgeschlossenen Stärke in einem separaten Reaktionsgefäß. Die Verflüssigung kann in der oben beschriebenen Weise durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt man wenigstens einen Teil oder die Gesamtmenge, in der Regel wenigstens 50 %, insbesondere wenigstens 80 % der Gesamtmenge oder die Gesamtmenge des die Stärke verflüssigenden Enzyms vor dem Erhitzen mit Wasserdampf zu der Suspension des Mahlguts in der wässrigen Flüssigkeit. Auf diese Weise erfolgt die Verflüssigung bereits während des Erhitzens auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur. Das Erhitzen mit Wasserdampf und die Nachreaktionsphase werden entsprechend durchgeführt. Eine anschließende Verflüssigung in einem separaten Reaktionsgefäß kann entfallen. Vorzugsweise wird man jedoch eine solche Verflüssigung zur Vervollständigung des Abbaus der Stärke in Dextrine durchführen. Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca2+-lonen, z. B. mit CaCI2, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z. B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteil- haft, eine Ca2+-Konzentration von z. B. 10 bis 100 ppm, bevorzugt 20 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 30 bis 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen, wobei die Angabe ppm gewichtsbezogen ist und g/1000kg bedeutet.
Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen α-Amylase, z. B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärke- quelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.
Da zur Herstellung der Dextrin-haltigen Flüssigkeit (1 ) in der Regel Mahlgut eingesetzt wird, welches im Wesentlichen alle oder nahezu alle Bestandteile der Stärkequelle, oder zumindest neben der Stärke auch einen Teil der festen nicht-stärkehaltigen Be- standteile enthält (d. h. es wird keine vollständige Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle vorgenommen), umfasst die erhaltene Dextrin- haltige Flüssigkeit (1 ) auch einen Teil oder die Gesamtmenge der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat, z. B. aus der Kornfrucht. Um die daraus resultie- rende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Medium (1 ) mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor es einem Fermentationsschritt zugeführt wird. Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist. Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbe- dingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 °C. Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 4000 Units/kg Stärkequelle.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, während der Herstellung der Dextrin-haltigen Flüssigkeit (1 ) außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicel- lulasen, Glucanasen, Xylanasen oder Proteasen, zuzusetzen. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d. h. herabsetzen (z. B. durch Spaltung langkettiger (auch als längerkettiger bezeichnet) Glucane und/oder von (Arabino)Xyla- nen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von
(Rest)Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können.
Die in Schritt a2) erhaltene Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) weist in der Regel eine Kon- zentration an Glucoseäquivalenten von mindestens 20 Gew.-% (= 200 g/kg), insbesondere mindestens 40 Gew.-% und speziell mindestens 50 Gew.-%, häufig im Bereich von 30 bis 75 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 40 bis 70 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 50 bis 65 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ), auf.
Der Trockenmassegehalt in der so erhaltenen Flüssigkeit (1 ) beträgt typischerweise mindestens 25 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 40 Gew.-%, insbesondere mindestens 50 Gew.-%, speziell mindestens 60 Gew.-%, und wird in der Regel 80 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ), nicht überschreiten.
Die in der so erhaltenen Dextrin-haltigen Flüssigkeit (1 ) enthaltenen Glucoseäquivalen- te liegen im Wesentlichen in Form von Oligosacchariden, insbesondere Dextrinen vor. Hauptbestandteil dieser Oligosaccharide bzw. Dextrine ist typischerweise Glucose, wobei das Medium auch geringe Mengen an Mono- und/oder Disacchariden und aus anderen Monosaccharid-Einheiten aufgebaute Oligosaccharid-Einheiten enthalten kann. Typischerweise umfassen die zuckerhaltigen Bestandteile im Dextrin-haltigen Medium (1 ), d. h. die Mono-, Di- und Oligosaccharide, einen Anteil an Oligosacchariden, insbesondere Dextrinen von mindestens 70 Gew.-%, häufig mindestens 75 Gew.- % insbesondere mindestens 80 Gew.-%, speziell mindestens 90 Gew.-%, d. h. der An- teil der Mono- und Disaccharide ist weniger als 30 Gew.-%, häufig weniger als
25 Gew.-%, insbesondere weniger als 20 Gew.-% und speziell weniger als 10 Gew.-%. Üblicherweise liegt der Anteil an Glucose, in freier oder gebundener Form, unter den Glucoseäquivalenten des Mediums (1 ) im Bereich von 50 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 75 bis 97 Gew.-% und speziell von 80 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Menge an Glucoseäquivalenten.
Die in Schritt a2) erhaltene wässrige Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) wird erfindungsgemäß in Schritt b) zur fermentativen Herstellung der gewünschten organischen Verbindung verwendet. Hierzu wird die Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) einer Fermentation zu- geführt, wo es zur Kultivierung der in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen dient. Die jeweilige organische Verbindung wird hierbei als flüchtiges oder nichtflüchtiges mikrobielles Stoffwechselprodukt erhalten.
In der Regel wird die erhaltene wässrige Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) unter Wegfall eines separaten Verzuckerungstanks direkt in einer Fermentation gemäß Schritt b) eingesetzt. In der Regel wird man die Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) auf Fermentations- temperatur, üblicherweise im Bereich von 32 bis 37 °C, abkühlen, bevor man es der Fermentation zuführt.
Die wässrige Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) kann vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wobei man die Mikroorganismen üblicherweise durch thermische oder chemische Verfahren abtötet. Beispielsweise heizt man hierzu die wässrige Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) auf Temperaturen von üblicherweise oberhalb 80 °C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte Dextrin-haltige Flüssigkeit (1 ) der Lyse bzw. Abtötung zuge- führt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterilisierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfin- düng ein Verfahren, bei dem das in Schritt a2) erhaltene Medium (1 ) unmittelbar, d. h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt wird.
Bei der Fermentation erfolgt die Verstoffwechselung der Dextrine erfindungsgemäß im Wesentlichen ohne Zugabe verzuckernder Enzyme. Hierbei werden die Dextrine von dem Mikroorganismus verstoffwechselt, vermutlich nachdem sie durch Stamm-eigene verzuckernde Enzyme, z. B. Stamm-eigene Glucoamylasen, hydrolysiert wurden. Vermutlich erfolgt eine Verzuckerung der verflüssigten Stärkebestandteile parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers, insbesondere des Monosaccharids Glucose, durch die Mikroorganismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist daher der zur Fermentation eingesetzte Mikroorganismus unter Mikroorganismen ausgewählt, die Enzyme exprimieren bzw. produzieren, welche Dextrine zu Monosacchariden hydrolysieren, insbesondere unter solchen, die Glucoamylasen produzieren bzw. exprimieren. Derartige Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, oder können durch Routineexperimente, z. B. durch
Screeningverfahren, beispielsweise durch ein Screening auf Glucoamylase, z. B. durch Anziehen des Mikroorganismus im Schüttelkolbentest mit anschließendem Enzymaktivitätstest auf Glucoamylase, oder durch Screening mit Hilfe von Primern/Sonden nach den im Beispielteil beschriebenen Screeningmethoden, sowie über Datenbankrecher- chen in Enzymdatenbanken wie
Brenda [Schomburg I., Chang A., Hofmann O., Ebeling C, Ehrentreich F., Schomburg D. BRENDA: a resource for enzyme data and metabolic information. Trends Biochem Sei. 2002 Jan;27(1 ):54-6.], - Swissprot [Boeckmann B., Bairoch A., Apweiler R., Blatter M. -C, Estreicher A., Gasteiger E., Martin MJ. , Michoud K., O'Donovan C, Phan I., Pilbout S., Schneider M. The SWISS-PROT protein knowledgebase and its Supplement TrEMBL in 2003 Nucleic Acids Res. 31 :365-370(2003)],
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nach der im Beispielteil beschriebenen Methode ermittelt werden.
Beispiele für geeignete Mikroorganismen mit Glucoamylaseaktivität sind Agrobacterium tumefaciens, Arxula adeninivorans, Ashbya gossypii, Aspergillus awamori, Aspergillus candidus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus kawachi, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Aspergillus sai- toi, Aspergillus shirousami, Aspergillus terreus, Athelia rolfsii, Bacillus circulans, Bacil- lus stearothermophilus, Beta vulgaris, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia fungorum, Burkholderia pseudomallei, Candida albicans, Candida antarctica, Candida glabrata, Candida tsukubaensis, Caulobacter crescentus, Cephalosporium charticola, Cephalosporium eichhorniae Ceratocystis paradoxa , Chaetomium thermophilum , Chlorobium tepidum,, Chromobacterium violaceum, Cladosporium resinae, Clostridium sp., Clostridium thermocellum, Clostridium thermosaccharolyticum, Coniophora puteana, Corticium rolfsii, Corynebacterium glutamicum, Cryptococcus neoformans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces occidentalis, Emericella nidulans, Endomyces sp., Endomycopsis fibuligera, Fusarium venenatum, Haloarcula marismortui, Hormoconis resinae, Humicola grisea, Humicola lanuginosa, Hypocrea lixii, Kluyveromyces lactis, Lentinula edodes, Lipomyces kononenkoae, Magnaporthe grisea, Mesorhizobium loti, Methanocaldococcus jannaschii, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Monascus rubiginosus, Monascus sp., Mucor rouxianus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum, Mycobacterium tuberculosis, Myrothecium sp., Neurospora crassa, Nostoc punctiforme, Oryza sativa, Paecilomyces variotii, Penaeus japonicus, Penicillium chrysogenum, Penicillium oxalicum, Picrophilus torridus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Ralstonia eutropha, Ralstonia metallidurans, Rana japonica, Rhizobium leguminosarum, Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Rhizopus sp., Rhodococcus sp., Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomycopsis fibuligera, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Shewanella oneidensis, Sphingomonas aromaticivorans, Streptomyces coelicolor, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Talaromyces emersonii, Termitomyces clypeatus, Thermoactinomyces vulgaris, Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoascus crustaceus, Thermomyces lanuginosus, Thermoproteus tenax, Thielavia terrestris, Trichoderma reesei und Trichosporon adeninovorans.
Sofern die zur Fermentation eingesetzten Mikroorganismen Stamm-eigene Glucoamy- lasen exprimieren, kann der pH-Wert des Fermentationsmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich für Glucoamylase eingestellt werden, z. B. auf einen Wert im Bereich zwischen 3,5 und 6,0. Häufig wird der pH-Wert auf einen für die Fermentation optimalen Wert einstellen, der außerhalb des genannten Bereichs liegen kann, z. B. im Bereich von 6,0 bis 8,0. Dies kann bei der Fermentation trotz der eingeschränkten Aktivität vieler Glucoamylasen in diesem pH-Bereich insgesamt vorteilhaft oder aufgrund der einzustellenden Fermentationsbedingungen, die insbesondere an den jeweiligen Mikroorganismus anzupassen sind, erforderlich sein. Den für die Fermentation optimalen pH-Wertbereich kann der Fachmann durch Routineexperimente ermitteln.
Um eine weitgehende Umsetzung der über das Medium (1 ) in das Fermentationsmedium eingebrachten Dextrine zu erzielen, wird man das Fermentationsmedium üblicherweise für einen Zeitraum von z. B. 2 bis 72 Stunden oder gegebenenfalls länger, z. B. 2 bis 96 Stunden, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur halten. Typischerweise werden die durch Hydrolyse aus den Dextrinen erhaltenen Monosaccharide, insbesondere Glucose, sehr rasch von den Mikroorganismen verstoff- wechselt, so dass in der Regel keine größeren Konzentrationen an Monosacchariden bzw. Glucose nachweisbar sind. Die Durchführung der Fermentation kann in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Hierzu wird man in der Regel den jeweils gewünschten Mikroorganismus in dem nach dem hier beschriebenen Verfahren erhaltenen Flüssigmedium kultivieren.
Das Fermentationsverfahren kann sowohl diskontinuierlich (Batchfahrweise) als auch semikontinuierlich (Fed-Batch-Fahrweise, einschließlich Fedbatch mit Zwischenernten) betrieben werden, wobei die semikontinuierliche Fahrweise bevorzugt ist.
Beispielsweise kann man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Medium (1 ) gegebenenfalls zusammen mit einer konventionellen Zuckerquelle, d. h. verstoffwechselbare Mono-, Di- und/oder Oligosaccharide oder Medien, die verstoff- wechselbare Mono-, Di- und/oder Oligosaccharide enthalten, gegebenenfalls nach Verdünnen mit Wasser und Zugabe üblicher Medienbestandteile wie Puffer, Nährsalze, Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat, Harnstoff etc., komplexe Nährmedienbestandteile, enthaltend Aminosäuren, wie Hefeextrakte, Peptone, CSL und dergleichen, mit dem gewünschten Mikroorganismus inokulieren, und diesen unter Fermentationsbedingungen vermehren, bis die Mikroorganismenkonzentration den für die Fermentation gewünschten stationären Zustand erreicht. Hierbei werden die in dem Fermentations- medium enthaltenen Dextrine verstoffwechselt und das gewünschte Stoffwechselprodukt wird gebildet (sogenannte Batchfahrweise oder Batchphase).
Bei der Fed-Batch-Fahrweise wird im Anschluss an die Batchphase, z. B. wenn die Gesamtzuckerkonzentration unter einen bestimmten Wert abgesunken ist, das Medium (1 ) kontinuierlich oder diskontinuierlich zu dem Fermentationsmedium gegeben.
Eine typische Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Fed-Batch- Fahrweise, welche die folgenden Schritte umfasst:
b1 ) Kultivieren des zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten Mikroorganismus in einem wässrigen Fermentationsmedium (2); und
b2) Zugabe des Dextrin-haltigen Mediums (1 ), gegebenenfalls zusammen mit einer konventionellen Zuckerquelle, zu dem Fermentationsmedium (2), in welchem die im Medium (1 ) enthaltenen Dextrine durch die die organische Verbindung überproduzierenden Mikroorganismen, gegebenenfalls nach vorheriger Verzuckerung, verstoffwechselt werden.
In Schritt b1 ) kann man beispielsweise zunächst ein herkömmliches zuckerhaltiges Medium, in der Regel eine Glucoselösung, oder ein erfindungsgemäßes Flüssigmedium (1 ) oder eine Mischung von (1 ) mit einer konventionellen Zuckerquelle, durch Ver- dünnung mit einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser, auf eine geeignete Zuckerkonzentration einstellen und die zur Fermentation üblichen Medienbestandteile wie Puffer, Nährsalze, Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat, Harnstoff etc., komplexe Nährmedienbestandteile, enthaltend Aminosäuren, wie Hefeextrakte, Peptone, CSL und dergleichen zugeben. Hierbei wird man das Verhältnis von Zuckermenge zu Flüssigkeit in der Regel vorzugsweise so wählen, dass die Gesamtkonzentration an Monosacchariden im Fermentationsmedium (2) weniger als 6 Gew.-%, z. B. im Bereich von ≥ 0 bis 5 Gew.-%, gerechnet als Glucoseäquivalente und bezogen auf das Gesamtgewicht des Fermentationsmediums (2), beträgt. Das so angesetzte zuckerhaltige Batch- Medium wird mit dem gewünschten Mikroorganismus inokuliert und der Mikroorganismus im Batch-Medium (Fermentationsmedium (2) unter Fermentationsbedingungen vermehrt, bis die Konzentration an Mikroorganismen einen für die Fermentation gewünschten stationären Zustand erreicht. Hierbei wird der in dem Fermentationsmedium (2) vorgelegte Zucker verstoffwechselt und das gewünschte Stoffwechselprodukt gebil- det.
In der anschließenden Fed-Batch-Phase wird der Fermentationsprozess durch Zugabe des Dextrin-haltigen Mediums (1 ) zu dem Fermentationsmedium (2) aufrechterhalten und das vom Mikroorganismus überproduzierte Stoffwechselprodukt reichert sich in der Fermentationsbrühe an, wobei die Anreicherung intrazellulär als auch extrazellulär sein kann. Hierbei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem Medium (1 ) zu dem vorgelegten und die Mikroorganismen enthaltenden Batch-Medium (Fermentationsmedium (2)) im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 :10 bis 10:1 , z. B. im Bereich von 1 :5 bis 5:1 und insbesondere im Bereich von 1 :1 bis 5:1. Insbesondere über die Zugabegeschwin- digkeit des Mediums (1 ) kann die Zuckerkonzentration im Fermentationsmedium (2) reguliert werden. In der Regel wird man die Zugabegeschwindigkeit so einstellen, dass Gesamtzucker-Konzentration, d. h. die Summe aus Oligosacchariden und Monosacchariden einen Wert von 30 Gew.-%, insbesondere 20 Gew.-% nicht überschreitet. Die Konzentration an Monosaccharid in der Fermentationsbrühe liegt vorzugsweise im Be- reich von > 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% und beträgt insbesondere nicht mehr als 3 Gew.-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium (2) in Schritt b1 ) (d. h. hier das Batch-Medium) im Wesentlichen das dextrinhaltige Medium (1 ), die zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten Mikroorganismen, Medienbestandteile wie Puffer, Nährsalze, Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat, Harnstoff etc., komplexe Nährmedienbestandteile, enthaltend Aminosäuren, wie Hefeextrakte, Peptone, CSL und dergleichen und gegebenenfalls Wasser zur Verdünnung. Hierzu wird man ein Dextrin-haltiges Medium (1 ) gegebenenfalls auf den gewünschten Dextrin-Gehalt verdünnen, z. B. im Bereich von 15 bis 30 Gew.-%, gerechnet als Glucoseäquivalente und bezogen auf das Gesamtgewicht des Dextrin-haltigen Mediums (1 ), und dieses direkt zum Ansetzen des Fermentationsmediums (2) (Batch-Medium) verwenden.
Der Dextrin-Gehalt des zur Aufrechterhaltung der Fermentation eingesetzten Dextrin- haltigen Mediums gemäß Schritt b2), liegt üblicherweise höher, z. B. in den o. g. Bereichen, um die Verdünnung des Fermentationsmediums (2) zu minimieren.
Vorzugsweise wird man so vorgehen, dass man ein Dextrin-haltiges Medium (1 ) mit einem höheren Gehalt an Dextrinen, z. B. mindestens 30 Gew.-%, speziell mindestens 40 Gew.-% und ganz speziell mindestens 50 Gew.-%, gerechnet als Glucoseäquiva- lente und bezogen auf das Gesamtgewicht des Dextrin-haltigen Mediums (1 ), herstellt. Dieses Medium (1 ) verwendet man dann einerseits gemäß Schritt b1 ) nach Verdünnung mit Wasser zum Ansetzen des Batch-Mediums (Fermentationsmedium (2)) und andererseits gemäß Schritt b2) zur Zugabe zu dem Fermentationsmedium (2).
Unter Verwendung des Dextrin-haltigen Mediums (1 ) können flüchtige und nichtflüchtige, insbesondere nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und 1 N-Atom fermentativ hergestellt werden.
Hierbei werden unter nichtflüchtigen Produkten solche Verbindungen verstanden, die sich auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrühe gewinnen lassen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101 ,3 kPa) in festem Zustand vorliegen.
Es ist jedoch auch möglich, das wässrige Dextrin-haltige Medium (1 ) in einer Fermentation zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen.
Der Begriff nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte umfasst hierin insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tra- gende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z. B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Glutar- säure, Lävulinsäure, Gluconsäure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z. B. Lysin, Glutamat, Methio- nin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan und Threonin; Purin- und Pyrimidinba- sen; Nukleoside und Nukleotide, z. B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adeno- sin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z. B. γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachi- donsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z. B. Propandiol und Butandiol; mehrwertige (auch als höherwertige be- zeichnet) Alkohole mit 3 oder mehr, z. B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z. B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; langkettige (auch als längerkettige bezeichnet) Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z. B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z. B. Butanol; Kohlenhydrate, z. B. Hyaluronsäure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z. B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z. B. Ascorbinsäure, Vitamin B6, Vitamin B12 und Riboflavin, Cofaktoren und so genannte Nutrazeutika; Proteine, z. B. Enzyme wie Amylasen, Pektinasen, saure, hybride oder neutrale ZeIIuIa- sen, Esterasen wie Lipasen, Pankreasen, Proteasen, Xylanasen und Oxidoreduktasen wie Laccase, Katalase und Peroxidase, Glucanasen, Phytasen; Carotenoide, z. B. Ly- copin, ß-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugswei- se 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z. B. Aceton und Acetoin; Lactone, z. B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z. B. Polyhydroxyacetat, Polyester, z. B. Polylactid, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrieben.
Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.
Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tie- ren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z. B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.
Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäu- ren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen ausgewählt.
Es versteht sich für den Fachmann, dass die derart auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z. B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L-Enantiomer.
Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen mikrobiellen Stoffwechselprodukten, wie unten im Einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind z. B. in Tabelle A angegeben.
Tabelle A:
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In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die hergestellte organische Verbindung unter gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbon- säuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, mehrwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, langkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutra- zeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopoly- meren und Cyclodextrinen ausgewählt.
Eine erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen oder Glucanasen.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin und Glutamat
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin, Vorläufern und Folgeprodukten davon.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von
Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono-, Di-, und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure, Bern- steinsäure, Itaconsäure, Citronensäure und Dimethylmalonsäure, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure und
3-Hydroxypropionsäure; langkettigen Alkanolen wie zuvor genannt, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10
C-Atomen wie Butanol; Diolen wie zuvor genannt, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol;
Ketonen wie zuvor genannt, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; und - Kohlehydraten wie zuvor genannt, insbesondere Disacchariden wie Trehalose.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Po- lyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester mit anderen organi- sehen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (a.a.O.) beschrieben sind, z. B. auch langkettige (auch als längerkettige bezeichnet) Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3-Hydroxytetradecansäure, sowie Mischungen davon. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei- sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate produetion in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mik- roorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte überproduzieren:
Enzyme wie Phytase, Xylanase oder Glucanase, insbesondere Phytase;
Aminosäuren wie Lysin, Threonin oder Methionin, insbesondere Lysin und Methionin;
Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon;
Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propion- säure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Itaconsäure, Citronensäure und Dimethyl- malonsäure;
Polyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester der
3-Hydroxybuttersäure; aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure und 3-Hydroxypropionsäure;
Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton;
Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; und
Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol.
Geeignete Mikroorganismen sind üblicherweise ausgewählt unter den Gattungen Co- rynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus und Rhizopus oryzae.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismus um einen Stamm aus der Gattung Corynebacterium, insbesondere um einen Stamm des Corynebacterium glutamicum. Insbesondere handelt es sich um einen Stamm der Gattung Corynebacterium, speziell des Corynebacterium glutamicum, welcher eine Aminosäure, speziell Lysin, Methionin oder Glutamat überproduziert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismus um einen Stamm aus der Gattung Escherichia, insbesondere um einen Stamm des Escherichia coli. Insbesondere handelt es sich um einen Stamm der Gattung Escherichia, speziell des Escherichia coli, welcher eine Aminosäure, speziell Lysin, Methionin oder Threonin überproduziert.
In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei- sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in Pfefferle et al., a.a.O., und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pan- tothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z. B. in der WO 01/021772. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Ri- boflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z. B. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Fu- marsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in Rhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20-L Fermen- tors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1 ), 9-15.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Bernsteinsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z. B. in Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498 -504 (1976); EP 249773 (1987), Erf.: Lemme u. Datta; US 5504004 (1996), Erf.: Guettler, Jain u. Soni; Arch. Microbiol. 167, 332 -342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK.,Actinobacillus suc- cinogenes sp. nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1 :207-16; US 5,723,322, US 5,5739,31 , US 5,521 ,075, WO99/06532, US 5,869,301 oder US 5,770,435.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 98/55599.
Bei der Fermentation resultiert eine Fermentationsbrühe, die neben dem gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukt im Wesentlichen die während der Fermentation er- zeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verflüssigten Stärkelösung und insbesondere die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z. B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze enthält. Dieses Flüssigmedium wird in der vorliegenden Anmeldung auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei die Fermentationsbrühe auch das zugegebene Dextrin-haltige Medium (1 ) umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d. h. eine teilweise oder unvoll- ständige mikrobielle Verstoffwechselung der verwertbaren Zucker (z. B. Mono- und Di- saccharide), erfolgt ist.
Vor der Isolierung oder Abreicherung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts oder Abtrennung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, wird gegebenenfalls ein Sterilisierungsschritt in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.
Eine spezielle Ausführungsform (I) der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem man wenigstens ein mikrobielles Stoffwechselprodukt aus der Fermentationsbrühe abrei- chert oder isoliert. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe werden anschließend weitgehend entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält. Eine genauere Beschreibung zur Durchführung eines solchen Verfahrens und der dabei erhaltenen Proteinzusammensetzung ist Gegenstand der WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) der Anmelderin, auf die bezüglich weiterer Details Bezug genommen wird.
Die Isolierung oder Abreicherung des Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe erfolgt in der Regel derart, dass man wenigstens ein Stoffwechselprodukt so aus der Fermentationsbrühe abreichert oder isoliert, dass der Gehalt dieses Stoffwechsel- produkts in der verbleibenden Fermentationsbrühe höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 10 Gew.-%, speziell höchstens 5 Gew.-% und ganz speziell höchstens 2,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentationsbrühe, beträgt.
Die Isolierung oder Abreicherung von Feinchemikalien (d. h. des mikrobiellen Stoffwechselprodukts) aus der Fermentationsbrühe kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Abtrennung der festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe. Diese kann entweder vor oder nach der Isolierung des Wertprodukts durchgeführt werden. Sowohl zur Isolierung von Wertstoffen als auch zur Ab- trennung von Feststoffen, d. h. Fest-Flüssig-Phasenseparation, sind im Fachgebiet übliche Methoden bekannt, die auch Schritte zur Grob- und Feinreinigung der Wertstoffe sowie zur Konfektionierung umfassen (z. B. beschrieben in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und LJII- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH).
Zur Isolierung des Wertprodukts kann man vorteilhafterweise so vorgehen, dass man zunächst die festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe entfernt, z. B. mittels Zentrifugation oder Filtration, und anschließend das Wertprodukt aus der flüssigen Phase isoliert, z. B. durch Kristallisation, Fällung, Adsorption oder Destillation. Alterna- tiv kann das Wertprodukt auch direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, z. B. durch Einsatz chromatographischer Verfahren oder von Extraktions-Verfahren. Als chromatographisches Verfahren ist insbesondere die lonenaustauschchromatographie zu nennen, bei der das Wertprodukt selektiv auf der Chromatographiesäule isoliert werden kann. In diesem Fall erfolgt die Abtrennung der Feststoffe aus der verbleibenden Fermentationsbrühe vorteilhafterweise z. B. durch Dekantieren, Eindampfen oder/und Trocknung.
Im Falle flüchtiger oder öliger Verbindungen ist in der Regel eine Kontrolle der maximalen Temperaturen während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung erforderlich. Vorteilhaft können diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert. Zu diesem Zweck geeignete Adsorbentien sind z. B. in der WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) der Anmelderin angegeben. Beispiele für Verbindungen, die vorteilhaft auf diese Weise hergestellt werden können, sind γ-Linolensäure, Dihomo-γ- Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiter- hin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindungen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.
Eine weitere spezielle Ausführungsform (II) betrifft ein Verfahren, bei dem man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ohne vorherige Isolierung oder Abrei- cherung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, und gegebenenfalls ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile, weitgehend entfernt, wobei man eine feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts erhält. Eine genauere Beschreibung zur Durchführung eines solchen Verfahrens findet sich in der PCT/EP2006/066057 (die ältere Patentanmeldung DE 10 2005 042 541.0) der Anmelderin.
Weitgehend bedeutet, dass nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile ein fester oder zumindest halbfester Rückstand verbleibt, der sich gegebenenfalls durch Zusatz von Feststoffen in ein festes Produkt überführen lässt. In der Regel bedeutet dies, die flüchtigen Bestandteile bis zu einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 30 Gew.-%, häufig nicht mehr als 20 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als 15 Gew.-%, zu entfernen. In der Regel wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe vorteilhafterweise bis auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt im Bereich von 0,2 bis 30 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 2 bis 15 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 15 Gew.-%, bezogen auf das nach Trocknung ermittelte Gesamtgewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernen. Der Restfeuchtigkeitsgehalt kann durch übliche dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, z. B. mittels Thermogravimetrie (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989). Die Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form aus der Fermentationsbrühe kann in ein, zwei oder mehreren Stufen erfolgen, insbesondere in einem ein- oder zweistufigen Vorgehen. In der Regel wird mindestens eine, insbesondere die abschließende Stufe zur Gewinnung des Stoffwechselprodukts in fester Form einen Trocknungsschritt umfassen.
Bei der einstufigen Vorgehensweise wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, entfernen, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.
Bei der zwei- oder mehrstufigen Vorgehensweise wird man die Fermentationsbrühe, zunächst aufkonzentrieren, z. B. mittels (Mikro-, Ultra-)Filtration oder thermisch durch Verdampfen eines Teils der flüchtigen Bestandteile. Der Anteil der flüchtigen Bestandteile, die in dieser Stufe entfernt werden beträgt in der Regel 10 bis 80 Gew.-% und insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe. In einer oder mehreren sich anschließenden Stufen werden die restlichen flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.
Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile des Flüssigmediums erfolgt gemäß dieser Ausführungsform (II) im Wesentlichen ohne eine vorherige Abreicherung oder gar Isolierung des Wertprodukts. Folglich wird bei der Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt im Wesentlichen nicht zusammen mit den flüchtigen Bestandteilen des Flüssigmediums entfernt, sondern verbleibt mit wenigstens einem Teil, üblicherweise mit der Hauptmenge und insbesondere mit der Gesamtmenge der sonstigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe im so erhaltenen Rückstand. Dementsprechend können aber auch - vorzugsweise geringe - Anteile des gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselpro- dukts, in der Regel maximal 20 Gew.-%, z. B. 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 10, insbesondere nicht mehr als 5 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal
2,5 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, beim Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe zusammen mit diesen entfernt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform verbleibt das gewünschte nichtflüchtige mikro- bielle Stoffwechselprodukt zu wenigstens 90 Gew.-%, insbesondere wenigstens
95 Gew.-%, speziell 99 Gew.-% und ganz speziell etwa 100 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, als Feststoff in Mischung mit dem nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile erhaltenen Teil oder der Gesamtheit der festen Bestandteile des Fermentationsmediums. Sofern gewünscht, kann vor dem Entfernen der flüchtigen Bestandteile ein Teil, z. B. 5 bis 80 Gew.-% und insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, z. B. mittels Zentrifugati- on oder Filtration. Gegebenenfalls wird man eine solche Vorabtrennung durchführen, um gröbere Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellem Stoffwechselprodukt enthalten, zu entfernen. Zur Vorfiltration können dem Fachmann bekannte, übliche Verfahren, z. B. unter Verwendung grobmaschiger Siebe, Netze, Lochbleche, oder dergleichen angewendet werden. Gegebenenfalls kann eine Abtrennung grober Feststoffpartikel auch in einem Fliehkraftabscheider erfolgen. Die hierbei eingesetzten Apparaturen wie Dekanter, Zentrifugen, Sedikanter und Separatoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt .Auf diese Weise erhält man einen festen oder halbfesten, z. B. pastösen Rückstand, welcher das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nicht-strärkehaltigen Bestandteile enthält.
Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Stoffwechselpro- dukts gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Wirkstoffgehalt, Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbesondere Lagerstabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Redispergier- barkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.
Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z. B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxi- dantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle o- der Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbesondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt. Wegen weiterer Details wird auf die PCT/EP2006/066057 (ältere Anmeldung DE 10 2005 042 541.0) verwiesen.
Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z. B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffgemischs, liegen. Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formu- lierungshilfsmitteln vor Aufarbeitung der Fermentationsbrühe bzw. des Stoffwechselprodukts kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der aufzuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z. B. nach abgeschlossener Fer- mentation direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungsschritt.
So können die Hilfsstoffe z. B. in eine Suspension des mikrobiellen Stoffwechselprodukts eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z. B. durch Aufsprühen oder Untermischen. Die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen während der Trocknung kann z. B. eine Rolle spielen, wenn eine das Stoffwechsel produkt enthaltende Lösung oder Suspension versprüht wird. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z. B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Par- tikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coatingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden.
Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe erfolgt in an sich bekannter Weise durch übliche Verfahren zur Abtrennung fester Phasen von flüs- sigen Phasen, einschließlich Filtrationsverfahren und Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile der flüssigen Phasen. Derartige Verfahren, die auch Schritte zur Grobreinigung der Wertstoffe sowie Schritte zur Konfektionierung umfassen können, werden z. B. in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnolo- gy, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH, beschrieben. Im Rahmen der Produktformulierung bzw. der Aufarbeitung nach abgeschlossener Fermentation anwendbare, dem Fachmann bekannte Verfahren, Apparaturen, Hilfsstoffe bzw. allgemeine und spezielle Ausführungsformen sind ferner in EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 und WO 92/12645 beschrieben.
In einer ersten Variante dieser Ausführungsform (II) wird man das nichtflüchtige mikro- bielle Stoffwechselprodukt, sofern es in der flüssigen Phase gelöst vorliegt, aus der flüssigen Phase in die feste Phase überführen, z. B. durch Kristallisation oder Fällung. Anschließend erfolgt eine Abtrennung der nichtflüchtigen festen Bestandteile einschließlich des Stoffwechselprodukts, z. B. mittels Zentrifugation, Dekantieren oder FiIt- ration. In ähnlicher Weise kann man auch ölige Stoffwechselprodukte abtrennen, wobei man die jeweiligen öligen Fermentationsprodukte durch Zusatz von Adsorbentien, z. B. Kieselsäure, Kieselgele, Lehm, Ton und Aktivkohle, in eine feste Form überführt.
In einer zweiten Variante dieser Ausführungsform (II) werden die flüchtigen Bestandteile durch Verdampfen entfernt. Das Verdampfen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispiele für geeignete Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile sind die Sprühtrocknung, Wirbelschichttrocknung bzw. -agglomeration, Gefriertrocknung, Strom- und Kontakttrocknern sowie Extrusionstrocknung. Auch eine Kombination der vorgenannten Verfahren mit formgebende Verfahren wie Extrusion, Pelletierung oder Prilling kann vorgenommen werden. Bei diesen letztgenannten Verfahren werden vorzugsweise teilweise oder weitgehend vorgetrocknete Stoffwechselprodukt-haltige Stoffgemische eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ein Verfahren zur Sprühtrocknung oder ein Verfahren der Wirbelschichttrocknung, einschließlich der Wirbelschichtgranulierung. Hierzu wird die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach einer Vorabtrennung zur Entfernung grober Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, einer oder mehreren Sprüh- oder Wirbelschichttrocknungsapparaturen zugeführt. Der Transport bzw. die Zuführung der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt zweckmäßigerweise mittels üblicher Transportvorrichtungen für feststoffhaltige Flüssigkeiten, z. B. Pumpen wie Exzenterschneckenpumpen (z. B. der Fa. Delasco PCM) oder Hochdruckpumpen (z. B. der Fa. LEWA Herbert Ott GmbH).
Die Durchführung einer Fermentation unter Verwendung des erfindungsgemäßen zuckerhaltigen Flüssigmediums kann auch derart erfolgen, dass man
(i) dem in Schritt a2) erhaltenen Dextrin-haltigen Medium (1 ), das nichtstärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-%, z. B. im Bereich von 5 bis 45 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht, entnimmt und die Restmenge einer Fermentation zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A), z. B. eines nichtflüchtigen Stoff- Wechselprodukts (A) in fester Form oder eines flüchtigen Stoffwechselprodukts
(A), zuführt; und
(ii) diese Teilmenge, gegebenenfalls nach vorheriger vollständiger oder teilweiser Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, einer Fermentation zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, zuführt. Im Falle der Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) beträgt der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums bevorzugt maximal 50 Gew.-%, insbesondere maximal 30 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt. Insbesondere ist es in diesem Fall bevorzugt, die gesamten Feststoffe vor der Fermentation zur Herstellung des zweiten Stoffwechselprodukts (B) abzutrennen.
Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (ii) Mikro- Organismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z. B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (ii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z. B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofakto- ren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi- den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.
Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stellen sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z. B. eine als Futtermittel- additiv zu verwendende Aminosäure, z. B. Lysin, Methionin, Threonin oder Glutamat, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z. B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure unter Einsatz der gemäß ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollständige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen fes- ten Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z. B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise kann z. B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z. B. von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Glutamat oder Threonin, von Citronensäure oder von Ethanol, z. B. entsprechend den in der WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) oder PCT/EP2006/066057 (die ältere Patentanmeldung DE 10 2005 042 541.0) beschriebe- nen Verfahren oder entsprechend den zur fermentativen Herstellung von Bioethanol bekannten Verfahren. Gemäß i) wird ein Teil des nach Schritt a2) erhaltenen Mediums (1 ) entnommen. Der gemäß i) entnommene Teil kann gemäß ii) durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit werden, je nach den Erfordernissen der Fermentation zur Herstellung von B. Das so gewonnene, gegebenenfalls vollständig oder teilweise von den Feststoffen be- freite Medium (1 ) wird gemäß ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B zugeführt. Ein gemäß i) abgetrennter Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des Mediums (1 ) der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.
Wenn das in der großvolumigen Fermentation hergestellte mikrobielle Stoffwechsel- produkt (A) Ethanol ist, so weist das nach dem Schritt ii) hergestellte Medium (1 ) Konzentrationen an Oligosacchariden auf, wie sie bei der fermentativen Ethanol-Produktion (Bioethanol) üblich sind, z. B. im Bereich von 20 bis 33 Gew.-%. Die Durchführung einer Abtrennung von Feststoffen gemäß Schritt ii) richtet sich auch hier nach den Erfordernissen der Fermentation zur Herstellung des jeweiligen Stoffwechselprodukts B.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens implementiert man eine vorzugswei- se großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z. B. von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Glutamat oder, von Citronensäure oder von Ethanol, wie oben beschrieben. Gemäß i) wird ein Teil des nach Schritt a2) erhaltenen Mediums (1 ) entnommen und gemäß ii) durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonne- ne, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite Medium (1 ) wird gemäß ii) einer Fermentation zur Produktion des Stoffwechselprodukts B, hier Riboflavin, zugeführt. Der gemäß ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des Mediums (1 ) der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.
Die auf diese Art und Weise erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in DE 4037441 , EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtrennung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z. B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z. B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrig-sauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwech- selprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 01/021772.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z. B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß i) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, Medium (1 ) wird einer Fermentation gemäß ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoff- haltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums (1 ) der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
Die gemäß ii) hergestellte Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z. B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.
Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens zusammen mit dem jeweiligen gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukt (A) gewonnen werden.
Nach der Trocknung und/oder Formulierung bzw. Konfektionierung können der Pro- duktformulierung bzw. Proteinzusammensetzung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Triticale und/oder Roggen zugegeben werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vor- liegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. Beispiele
I. Vermählen der Stärkequelle
Die im Folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermählen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor- Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1 ; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1 ,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.
Tabelle 1
Figure imgf000045_0001
II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung
11.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt
II.1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung
Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Calciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 6,5 und Erhitzen auf 35 °C wurden 2,4 g Termamyl 120L Typ L (Novozymes A/S) zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5 °C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91 °C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl 120L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der lod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100 °C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35 °C abgekühlt.
11.3 Weitere Arbeitsvorschriften zur enzymatischen Stärkeverflüssigung
II.3a) Maismehl
360 g deionisiertes Wasser wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 1 ,54 ml CaCI2 Stammlösung (100 g CaCI2 x 2 H2O / 1) wurden bis zu einer Endkonzentration von etwa 70 ppm Ca2+ in der Maische zugegeben. Unter stetem Rühren ließ man 240 g Maismehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gab man 4,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wurde dann schnell auf bis zu 85 °C erhitzt. Hierbei musste der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst werden.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur begann man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Zusätzlich gab man der Maische 0,13 ml CaCI2 Stammlösung zu, um die Ca2+-Konzentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hielt man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartete mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g Mehl und 0,13 ml CaCI2 Stammlösung) zugab. Nach Zugabe von zwei Portionen gab man 1 ,67 ml Termamyl zu; anschließend gab man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g Mehl und 0,13 ml CaCI2 Stammlösung) zu. Es wurde ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöhte man die Temperatur auf 100 °C und kochte die Maische 10 min.
Man entnahm eine Probe und kühlte diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gab man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g lod und 10 g Kaliumiodid pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigte einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung trat ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigte, wurde die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gab weitere 1 ,67 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfiel.
II.3b) Roggenmehl (inklusive Cellulase/Hemicellulase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren ließ man 155 g Roggenmehl langsam in das Wasser einrieseln. Die Temperatur wurde konstant bei 50 °C gehalten. Nach Einstellung des pH auf 5,5 mit 50 gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gab man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Viscozyme L (Novozymes A/S) zu. Nach 30 min startete man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gab man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gab man erneut 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe konnte mit der Verflüssigung begonnen werden.
1 ,7 ml CaCI2 Stammlösung (100 g CaCI2 x 2 H2O / 1) wurden zugegeben. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gab man 5,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wurde dann schnell auf 85 °C erhitzt. Hierbei wurde der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur begann man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 60 g Mehl. Zusätzlich gab man der Maische 0,13 ml CaCI2 Stamm- lösung zu, um die Ca2+-Koncentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hielt man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartete mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI2 Stammlösung) zugab. Man gab 1 ,1 ml Termamyl zu; anschließend gab man eine weitere Portionen (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI2 Stammlösung) zu. Es wurde ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöhte man die Temperatur auf 100 °C und kochte die Maische 10 min.
Man entnahm eine Probe und kühlte diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gab man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g lod und 10 g Kaliumiodid pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigte einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung trat ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigte, wurde die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gab weitere 1 ,1 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfiel.
II.3c) Weizenmehl (inklusive Xylanase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Das Wasser wurde auf 55 °C erhitzt und der pH mit 50 gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung auf 6,0 eingestellt. Nach Einstellung von Temperatur und pH gab man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S) zu. Unter stetem Rühren ließ man 155 g Weizenmehl langsam in die Lösung einrieseln. Die Temperatur und der pH wurden konstant gehalten. Nach 30 min startete man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gab man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gab man 50 g Mehl hin- zu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe konnte mit der Verflüssigung begonnen werden.
Die Verflüssigung wurde wie unter II.3b beschrieben durchgeführt.
IM. Stamm ATCC 13032 lysCfbr
In einigen der nachfolgenden Beispiele wurde ein modifizierter Stamm von Corynebac- terium glutamicum eingesetzt, der unter der Bezeichnung ATCC13032 lysCfbr in der WO 05/059144 beschrieben wurde.
IV: Identifizierung Glucoamylase-exprimierender/produzierender Stämme
IVa) Screening in Gendatenbanken
Eine Recherche auf Glucoamylase produzierende Stämme
1. Glycoamylase (1 ,4-alpha-D-glucan glucohydrolase) ist durch die folgende EC Nummer EC 3.2.1.3 klassifiziert [1].
2. Eine Recherche mit der Suchanfrage EC 3.2.1.3 wurde in den folgenden Datenbanken durchgeführt: Brenda, Swissprot, ERGO-WIT, CAZY und PIR, wobei man jeweils eine Liste von Proteinen erhielt, welche die EC 3.2.1.3 aufwiesen.
3. Die jeweiligen Ergebnislisten wurden vereinigt, und nach Treffern der taxonomi- sehen Reiche Archaea, Bacteria und Fungi gefiltert und gemäß der Speziesnamen sortiert.
4. Die Species, welche das Filterkriterium des Absatzes 3 erfüllten und für die ein Glucoamylaseeintrag in wenigstens einer der in Absatz 2 genannten Datenbanken gefunden wurde, weisen mit hoher Wahrscheinlichkeit die Fähigkeit auf, Glucoamylase zu produzieren. Im Einzelnen handelt es sich hierbei um die folgenden Spezies:
Agrobacterium tumefaciens, Arxula adeninivorans, Ashbya gossypii, Aspergillus awamori, Aspergillus candidus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus kawachi, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Aspergillus saitoi, Aspergillus shirousami, Aspergillus terreus, Athelia rolfsii, Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus, Beta vulgaris, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenoeepacia, Burkholderia fungorum, Burkholderia pseudomallei, Candida albicans, Candida antaretica, Candida glabrata, Candida tsukubaensis, Caulobacter crescentus, Cephalosporium charticola, Cephalosporium eichhorniae, Ceratocystis paradoxa, Chaetomium thermophilum, Chlorobium tepidum, Chromobacterium violaceum, Cladosporium resinae, Clostridium sp., Clostridium thermocellum, Clostridium thermosaccharolyticum, Coniophora puteana, Corticium rolfsii, Corynebacterium glutamicum, Cryptococcus neoformans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces occidentalis, Emericella nidulans, Endomyces sp., Endomycopsis fibuligera, Fusarium venenatum, Haloarcula marismortui,
Hormoconis resinae, Humicola grisea, Humicola lanuginosa, Hypocrea lixii, Kluyveromyces lactis, Lentinula edodes, Lipomyces kononenkoae, Magnaporthe grisea, Mesorhizobium loti, Methanocaldococcus jannaschii, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Monascus rubiginosus, Monascus sp., Mucor rouxianus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum, Mycobacterium tuberculosis, Myrothecium sp., Neurospora crassa, Nostoc punctiforme, Oryza sativa, Paecilomyces variotii, Penaeus japonicus, Penicillium chrysogenum, Penicillium oxalicum, Picrophilus torridus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Ralstonia eutropha, Ralstonia metallidurans, Rana japonica, Rhizobium leguminosarum, Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Rhizopus sp., Rhodococcus sp., Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomycopsis fibuligera,
Saccharomycopsis fibuligera, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Shewanella oneidensis, Sphingomonas aromaticivorans, Streptomyces coelicolor, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Talaromyces emersonii, Termitomyces clypeatus, Thermoactinomyces vulgaris, Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoascus crustaceus, Thermomyces lanuginosus, Thermoproteus tenax, Thielavia terrestris, Trichoderma reesei und Trichosporon adeninovorans.
IVb) Screening im Schüttelkolbentest mit anschließendem Enzymaktivitätstest
Verschiedene Mikroorganismen werden in einem Schüttelkolbentest auf Glucoamyla- seaktivität hin untersucht. Als Medium hierfür ist jedes konventionelle Medium nutzbar, das für das Wachstum des Organismus geeignet ist und zu einer Expression der GIu- coamylase führt. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich oder können entsprechend publizierter Vorschriften hergestellt werden (z. B. wie in Katalogen der American Type Culture Collection beschrieben).
Beispielsweise kann in einem definierten Medium als einzige Kohlenstoffquelle ein Gemisch von Glucoseoligomeren unterschiedlicher Kettenlänge eingesetzt werden. Da unter Fermentationsbedingungen keine thermische Hydrolyse der Oligosaccharide stattfindet, können nur Stämme mit einer Glucoamylase- und / oder Maltaseaktivität in diesem Medium wachsen. Als Substrat eignet sich z. B. Maldex 150 (Amylum Group). Das Screening wird unter verschiedenen Fermentationsbedingungen (pH, Temperatur) durchgeführt.
Um Glucoamylase- und Maltaseaktivität zu unterscheiden, wird vor dem Versuch die Oligosaccharidzusammensetzung der Mischung z. B. mittels HPLC analysiert. So hat z. B. Maldex 150 folgende Zusammensetzung (siehe Tabelle 2):
Tabelle 2: Zusammensetzung von Maldex 150 (Amylum Group)
Figure imgf000050_0001
Entsprechend dieser Analyse wird ein Kontrollmedium mit Maltose und Glucose angesetzt. Wachstum und Lysinproduktion im Oligosaccharidmedium, die über die Werte dieser Kontrolle hinausgehen, sind dann eindeutig einer Glucoamylaseaktivität zuzu- schreiben.
Alternativ zu einem Maltodextringemisch können auch reine Maltotetraose, Maltopen- taose usw. als Kohlenstoffquelle für ein Screening eingesetzt werden. Nach Abbruch der Kultivierung wird die Biomasse abzentrifugiert und der Überstand filtiriert.
Der klare Überstand wird in einem Glucoamylase-Aktivitätstest (CHEN et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 51 , 175-181 (2005)) eingesetzt. Dazu wird eine Reaktionsmischung aus 0,2 ml 5OmM Acetat-Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) mit 0,5 % löslicher Stärke und 0,2 ml Überstand eingesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten bei 60 °C wird die Reaktion durch 10 min Kochen bei 100 °C abgestoppt. Die freigesetzte Glucose- menge wird mit Hilfe der Glucoseoxidase/Peroxidase-Methode (Bergmayer und Bernt, 1974) bestimmt. Eine Unit Glucoamylaseaktivität ist dabei definiert als die Menge an Enzym, die unter den gegebenen Reaktionsbedingungen 1 μmol Glucose pro Minute aus löslicher Stärke freisetzt.
IVc) Screening mit Hilfe von Primern/Sonden
Eine alternative Methode zur Überprüfung, ob der zu untersuchende Organismus glu- coamylasecodierende Sequenzen besitzt, ist ein Screening mit Hilfe von Primern oder Sonden, die spezifisch für diese Sequenzen sind.
i) Ausgehend von konservierten Bereichen bekannter Glucoamylase-Gene wird eine Sonde konstruiert, um DNA-Sequenzen verschiedener Organismen zu identifizieren und klonieren, die Polypeptide mit einer Glucoamylaseaktivität codieren. Insbesondere können solche Sonden für die Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA des gewünschten Organismus genutzt werden, gefolgt von einem Southern Blot nach der Standardmethode, um das gesuchte Gen zu identifizieren. Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bac- teriology (1991 ) 41 : 255-260).
ii) Ausgehend von konservierten Bereichen bekannter Glucoamylase-Gene werden PCR-Primer synthetisiert. Diese werden in einer PCR-Reaktion mit der DNA des zu untersuchenden Organismus eingesetzt. Sind entsprechende Bindestellen für die Primer, d. h. glucoamylasecodierende Gene, vorhanden, so können die entsprechenden amplifizierten Oligonukleotide mit Hilfe einer im Anschluss durchge- führten Gelelektrophorese identifiziert werden. Anleitungen zur Amplifikation von
DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide sythesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Beispiel 1
Verflüssigtes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt.
I) Verflüssigung 360 g deionisiertes Wasser wurden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren ließ man 240 g Maismehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 5,8 mit 50 gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gab man 4,0 ml (= 2 Gew.- % Enzym/Trockenmasse) Liquozyme SC (von Novozymes A/S) zu. Die Maische wurde dann schnell auf 85 °C erhitzt. Hierbei wurde der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur begann man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Während der Zugabe hielt man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartete mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g) Mehl zugab. Nach Zugabe von zwei Portionen gab man 1 ,67 ml Liquozyme zu; anschließend gab man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g) Mehl zu. Es wurde ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.- % erreicht. Nach der Zugabe erhöhte man die Temperatur auf 100 °C und kochte die Maische 10 min.
Man entnahm eine Probe und kühlte diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gab man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g lod und 10 g Kaliumiodid pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Die negativ auf Stärke getestete Mischung wurde heiß in sterile Behälter gefüllt und nach Abkühlung bei 4 °C gelagert.
II) Fermentation mit Corynebacterium glutamicum
Stamm
Es wurde der modifizierte Wildtyp mit feedback-deregulierter Aspartokinase ATCC13032 lysCfbr verwendet.
Herstellung des Inokulums
Die Zellen wurden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammen- setzung: siehe Tabelle 3; 20 min bei 121 °C) über Nacht bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 4) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen wurden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreichte. Tabelle 3: Zusammensetzung der CM+CaAc-Agarplatten
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Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen des Kolbenmediums sind in Tabelle 4 aufgeführt. Der Ver- such wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt.
Tabelle 4: Kolbenmedien
Figure imgf000053_0002
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* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung eingestellt
Nach dem Animpfen wurden die Kolben drei Tage bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1 100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Tabelle 5: Lysinproduktion (Mittelwerte)
Fermentationszeit Lysin [g/l]
45 h 1 1 ,5
70 h 12,8
Kontrolle (45 h) 1 1 ,1
Beispiel 2
Verflüssigtes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwen- düng von Aspergillus niger eingesetzt.
I) Verflüssigung
Die Verflüssigung wurde wie bei Beispiel 1 unter I) beschrieben durchgeführt.
II) Fermentation mit Aspergillus niger
Stamm
Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Ampikons (analog ISO505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.
Herstellung des lnokulums
20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 6) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 μl einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34 °C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
Figure imgf000055_0001
* mit verdünnter Schwefelsäure eingestellt
50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 7) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft
Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen des Kolbenmediums sind in Tabelle 7 aufgeführt. Aus jeder
Probe wurden zwei Kolben angesetzt.
Tabelle 7: Kolbenmedien
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure/Na- triumacetat/Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 μl der Enzymlösung wurden mit 140 μl 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phytat: Do- decanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 μl) Trichloressigsäure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 μl) wurde überführt in 280 μl einer Lösung, die 0,32 N H2SO4, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1 ,08 Gew.-% Ascorbinsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50 °C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.
Tabelle 8: Phytaseaktivität nach Abbruch der Fermentation
Kolben Phytaseaktivität [FTU/ml]
1 569
2 696
Kontrolle 393

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte:
a1 ) Vermählen einer Stärkequelle, wobei man ein Mahlgut erhält, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält;
a2) Suspendieren des Mahlguts mit einer wässrigen Flüssigkeit und Verflüssigen des in der wässrigen Flüssigkeit enthaltenen Mahlguts in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, wobei man ein wässri- ges Dextrin-haltiges Medium (1 ) erhält, das wenigstens einen Teil der nicht- stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst; und
b) Verwendung des wässrigen Dextrin-haltigen Mediums (1 ) in einer Fermentation zur Kultivierung eines Mikroorganismus, welcher zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigt ist;
wobei Enzyme, die Dextrine zu Monosacchariden hydrolysieren, nicht oder in einer Menge von weniger als 0,001 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der eingesetzten Stärkequelle, zugegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei man die Suspension des Mahlguts in der wässrigen Flüssigkeit auf eine Temperatur oberhalb der Verkleisterungstempera- tur der in der Stärkequelle enthaltenen Stärke erhitzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Erhitzen in Gegenwart des Stärkeverflüs- sigenden Enzyms erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts im Verlauf der Verflüssigung kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man das Mahlgut in einer solchen Menge in der wässrigen Flüssigkeit suspendiert und in dieser verflüssigt, dass das erhaltene wässrige Dextrin-haltige Medium (1 ) einen Trockenmassegehalt von mindestens 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ), aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man das Mahlgut in ei- ner solchen Menge in der wässrigen Flüssigkeit suspendiert und in dieser verflüssigt, dass das erhaltene wässrige Dextrin-haltige Medium (1 ) eine Konzentration an Glukoseäquivalenten von mindestens 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums (1 ), aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Mikroorganismus unter Mikroorganismen ausgewählt ist, die Enzyme produzieren, welche Dextrine zu Monosacchariden hydrolysieren.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend zusätzlich die folgenden Schritte:
b1 ) Kultivieren des zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten
Mikroorganismus in einem wässrigen Fermentationsmedium (2); und
b2) Zugabe des Dextrin-haltigen Mediums (1 ) zu dem Fermentationsmedium (2), in welchem die im Medium (1 ) enthaltenen Dextrine durch die die organische Verbindung überproduzierenden Mikroorganismen verstoffwechselt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Fermentationsmedium (2) in Schritt b1 ) im Wesentlichen das Medium (1 ), die zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten Mikroorganismen, übliche Medienbestandteile und gegebenenfalls Wasser zur Verdünnung umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei man in Schritt b1 ) eine solche Menge des Mediums (1 ) zum Ansetzen des Fermentationsmediums (2) verwendet, dass die Gesamtkonzentration an Zucker im Fermentationsmedium (2) im Bereich von 6 bis 30 Gew.-%, gerechnet als Glukoseäquivalente und bezogen auf das Ge- samtgewicht des Fermentationsmediums (2), liegt.
1 1. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man in Schritt a1 ) als Stärkequelle Getreidekörner verwendet.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Mahlgut mindestens 20 Gew.-% der gesamten nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Stärkeverflüssigen- de Enzym eine α-Amylase ist.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die hergestellte organi- sehe Verbindung unter gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Li- piden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, mehrwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, langkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ke- tonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt ist.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der zur Fermentation eingesetzte Mikroorganismus ausgewählt ist unter natürlichen oder rekombinan- ten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte überproduzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycar- bonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoate.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine oder mehrere Aminosäuren überproduzieren, ausgewählt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine oder mehrere aliphatische Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen überproduzieren, ausgewählt ist.
18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die ein oder mehrere Enzyme überproduzieren, ausgewählt ist .
19. Verfahren nach Anspruch 15 oder 18, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine Phytase überproduzieren, ausgewählt ist.
20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Clostridium und Rhizopus.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Mikroorganismus unter Stämmen der Gattung Corynebakterium ausgewählt ist.
22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man wenigstens ein mikrobielles Stoffwechselprodukt aus der Fermentationsbrühe abreichert oder i- soliert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , wobei man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ohne vorherige Isolierung oder Abreicherung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, und gegebenenfalls ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile, mindestens teilweise entfernt, wobei man eine feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechsel- produkts erhält.
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