JP2009517011A - デキストリン含有物質を用いた有機化合物の発酵製造 - Google Patents
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Abstract
(a1)デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベースを得るステップ;
(a2)前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも1種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地(1)を得るステップ;および
(b)前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地(1)を用いるステップ
を含み、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき0.001重量%未満添加するか、または添加しない。
Description
(a1)デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベース(Mahlgut)を得るステップ;
(a2)前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも1種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地(1)を得るステップ;および
(b)前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地(1)を用いるステップ
を含む方法に関し、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき0.001重量%未満の量で添加するか、または添加しない。
− Brenda [Schomburg I., Chang A., Hofmann O., Ebeling C., Ehrentreich F., Schomburg D. BRENDA: a resource for enzyme data and metabolic information. Trends Biochem Sci. 2002 Jan;27(1):54-6.],
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アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、アッシビヤ・ゴシッピイ(Ashbya gossypii)、アスペスギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・カンジダス(Aspergillus candidus)、アスペルギルス・フォエチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachi)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・シロウサミ(Aspergillus shirousami)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)、バシラス・シルクランス(Bacillus circulans)、バシラス・ステアロテルモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)、ブラジリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)、ブルコルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルコルデリア・フンゴラム(Burkholderia fungorum)、ブルコルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・ツクバエンシス(Candida tsukubaensis)、カウロバクター・クレッセンタス(Caulobacter crescentus)、セファロスポリウム・シャルチコラ(Cephalosporium charticola)、セファロスポリウム・エイクホルニエ(Cephalosporium eichhorniae)、セラトシスチス・パラドクサ(Ceratocystis paradoxa)、シェトミウム・テルモフィラム(Chaetomium thermophilum)、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、クラドスポリウム・レシナエ(Cladosporium resinae)、クロストリジウム属種(Clostridium sp.)、クロストリジウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム(Clostridium thermosaccharolyticum)、コニホラ・プテアナ(Coniophora puteana)、コルチシウム・ロルフシイ(Corticium rolfsii)・コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、クリプトコッカス・ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、デバリオミセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、デバリオミセス・オクチデンタリス(Debaryomyces occidentalis)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)、エンドミセス属種(Endomyces sp.)、エンドミコプシス・フィブリゲラ(Endomycopsis fibuligera)、フザリウム・ベネナータム(Fusarium venenatum)、ハロアルクラ・マリスモルツイ(Haloarcula marismortui)、ホルモコニス・レジナエ(Hormoconis resinae)、フニコラ・グリセア(Humicola grisea)、フミコラ・ラヌギノーザ(Humicola lanuginosa)、ヒポクレア・リキシイ(Hypocrea lixii)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、レンチヌラ・エドデス(Lentinula edodes)、リポミセス・コノネンコエ(Lipomyces kononenkoae)、マグナポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)、メソリゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノコッカス・ジャンナシイ(Methanococcus jannaschii)、メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、モナスカス・ルビギノサス(Monascus rubiginosus)、モナスカス属種(Monascus sp.)、ムコール・ロウシキアヌス(Mucor rouxianus)、ミコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、ミコバクテリウム・レプレ(Mycobacterium leprae)、ミコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum)、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ミロテシウム属種(Myrothecium sp.)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ノストック・プンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ペシロミセス・バリオチイ(Paecilomyces variotii)、ペネウス・ジャポニカス(Penaeus japonicus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・オキサリカム(Penicillium oxalicum)、ピクロフィラス・トリダス(Picrophilus torridus)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ラルストニア・メタリデュランス(Ralstonia metallidurans)、ラナ・ジャポニカ(Rana japonica)、リゾビウム・レグミノサラム(Rhizobium leguminosarum)、リゾプス・デレマル(Rhizopus delemar)、リゾプス・ジャバニカス(Rhizopus javanicus)、リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、リゾプス属種(Rhizopus sp.)、ロドコッカス属種(Rhodococcus sp.)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドスピリラム・ルブラム(Rhodospirillum rubrum)、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ジアスタチカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカリミコプシス・フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)、サッカロミコプシス・フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、シュワンニオミセス・オクチデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、スフィンゴモナス・アロマチシボランス(Sphingomonas aromaticivorans)、ストレプトミセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、タラロミセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii)、テルミトミセス・クリペアタス(Termitomyces clypeatus)、テルモアクチノミセス・ブルガリス(Thermoactinomyces vulgaris)、テルモアネロバクター・テングコンジェンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、テルモアネロバクテリウム・テルモサッカロリチカム(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、テルモアスカス・クルスタセウス(Thermoascus crustaceus)、テルモミセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)、テルモプテウス・テナクス(Thermoproteus tenax)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トリコデルマ・レエゼイ(Trichoderma reesei)およびトリコスポロン・アデニノボランス(Trichosporon adeninovorans)。
(b1)水性発酵培地(2)中で、有機化合物の過剰生産が可能な微生物を培養するステップ;および
(b2)デキストリン含有培地(1)を、適切であれば、慣用の糖供給材料とともに、発酵培地(2)に加えるステップ、その場合、培地(1)中に存在するデキストリンが、適切であれば、あらかじめ糖化された後に、有機化合物を過剰生産する微生物によって代謝される。
− モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、特に3〜10個のC原子を有する脂肪族モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、例えばプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、クエン酸およびジメチルマロン酸、
− 3〜10個のC原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、例えば乳酸および3−ヒドロキシプロピオン酸;
− 上記長鎖アルカノール、特に4〜10個のC原子を有するアルカノール、例えばブタノール;
− 上記ジオール、特に3〜10個、特に3〜8個のC原子を有するアルカンジオール、例えばプロパンジオール;
− 上記ケトン、特に3〜10個のC原子を有するケトン、例えばアセトン;および
− 上記炭水化物、特に二糖、例えばトレハロース。
− 酵素、例えばフィターゼ、キシラナーゼまたはグルカナーゼ、特にフィターゼ;
− アミノ酸、例えばリジン、トレオニンまたはメチオニン、特にリジンおよびメチオニン;
− ビタミン、例えばパントテン酸およびリボフラビン;ならびにその前駆体および/または誘導体;
− 二糖、例えばトレハロース;
− 3〜10個のC原子を有する脂肪族モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、例えばプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、クエン酸およびジメチルマロン酸;
− ポリヒドロキシアルカノアート、例えばポリ−3−ヒドロキシブチラートおよび、3−ヒドロキシ酪酸のコポリエステル;
− 3〜10個のC原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、例えば乳酸および3−ヒドロキシプロピオン酸;
− 3〜10個のC原子を有するケトン、例えばアセトン;
− 4〜10個のC原子を有するアルカノール、例えばブタノール;および
− 3〜8個のC原子を有するアルカンジオール、例えばプロパンジオール。
(i)総重量に基づいて50重量%を超えない、例えば5〜45重量%の範囲の部分を、ステップ(a2)で得られたデキストリン含有培地(1)から取り出し、該部分はデンプン供給材料の非デンプン性固体成分を含み、かつ残りの部分が、第1の代謝産物(A)、例えば固体の非揮発性代謝産物(A)または揮発性代謝産物(A)を製造するための発酵に供給され;かつ
(ii)この部分を、適切であればデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の全体または一部分をあらかじめ除去した後に、代謝産物(A)と同一であるか、または異なる第2の代謝産物(B)を製造するための発酵に供給する。
以下で用いられるミルベースを次のように製造した。ローターミルを使用して全粒トウモロコシ穀粒を完全に粉砕した。異なるビーター、製粉経路またはスクリーン要素を使用して、3つの異なる程度の粉末度を得た。実験室用振動スクリーン(振動分析計:Retsch Vibrotronic type VE1;スクリーニング時間5分、振幅:1.5mm)を用いるミルベースのスクリーン分析では、表1に列挙される結果が得られた。
II.1. 糖化ステップでフィターゼを用いない場合
II.1(a) 酵素によるデンプンの液化
320gの乾式製粉トウモロコシ粉(maize meal)(T71/03)を480gの水に懸濁し、連続撹拌によって310mgの塩化カルシウムと混合した。全実験期間中、撹拌を継続した。H2SO4でpHを6.5にし、混合物を35℃に加温した後、2.4gのTermamyl 120L type L(Novozymes A/S)を加えた。40分間の経過中、反応混合物を86.5℃の温度に加熱し、適切であれば、NaOHでpHを再調整し、あらかじめ設定した値にした。30分以内に、さらに400gの乾式製粉トウモロコシ粉(T71/03)を加え、該プロセス中に、温度を91℃に上げた。反応混合物をこの温度で約100分間維持した。次いで、さらに2.4gのTermamyl 120Lを加え、温度を約100分間維持した。実験中、ヨウ素デンプン反応を使用して液化の進行をモニタリングした。温度を最終的に100℃に上げ、反応混合物をさらに20分間煮沸した。期間中のこの時点で、デンプンはもはや検出できなかった。反応器を35℃に冷却した。
II.3(a) トウモロコシ粉
360gの脱イオン水を反応容器に導入した。1.54mlのCaCl2原液(100g CaCl2×2H2O/l)をマッシュに加えて、Ca2+の終濃度を約70ppmにした。継続撹拌しながら240gのトウモロコシ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。50重量%強度のNaOH水溶液を使用してpHを6.5にした後、4.0ml(=2重量%酵素/乾燥物)のTermamyl 120 L type L(Novozymes A/S)を加えた。次いでマッシュを85℃まで急速に加熱した。このプロセス中、常にpHをモニタリングし、かつ、適切であればpHを調整することが必要であった。
360gの脱イオン水を反応容器に導入した。継続撹拌しながら155gのライムギ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。温度を50℃で一定に維持した。50重量%強度のNaOH水溶液を使用してpHを5.5にした後、3.21ml(=2.5重量%酵素/乾燥物)のViscozyme L(Novozymes A/S)を加えた。30分後、追加の穀粉を加えた。まず55gの穀粉を加えた。さらに30分後、さらに50gの穀粉を加え;30分後、さらに40gの穀粉を加えた。最終添加の30分後、液化を開始させることができた。
360gの脱イオン水を反応容器に導入した。前記水を55℃に加熱し、50重量%強度のNaOH水溶液を使用してpHを6.0に調整した。温度およびpHを調節した後、3.21ml(=2.5重量%酵素/乾燥物)のShearzyme 500L(Novozymes A/S)を加えた。継続撹拌しながら155gのコムギ粉を前記溶液にゆっくり流し込んだ。温度およびpHを一定に保った。30分後、追加の穀粉を加えた。まず55gの穀粉を加えた。さらに30分後、50gの穀粉を加え;30分後、さらに40gの穀粉を加えた。最終添加の30分後、液化を開始させることができた。
ATCC13032 lysC fbr
以下のいくつかの実施例では、改変コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)株(WO 05/059144にATCC13032 lysCfbrの名称で記載されている)を用いた。
IV(a) 遺伝子データベースのスクリーニング
グルコアミラーゼ産生株の検索
1. グルコアミラーゼ(Glycoamylase)(1,4−α−D−グルカングルコヒドロラーゼ)は以下の酵素番号EC 3.2.1.3 [1]によって分類される。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、アッシビヤ・ゴシッピイ(Ashbya gossypii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・カンジダス(Aspergillus candidus)、アスペルギルス・ホエチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachi)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フェニシス(Aspergillus phoenicis)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・シロウサミ(Aspergillus shirousami)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、アテリア・ロルフシイ(Athelia rolfsii)、バシラス・シルクランス(Bacillus circulans)、バシラス・ステアロテルノフィラス(Bacillus stearothermophilus)、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)、ブルコルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルコルデリア・フンゴラム(Burkholderia fungorum)、ブルコルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・ツクバエンシス(Candida tsukubaensis)、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)、セファロスポリウム・シャルチコラ(Cephalosporium charticola)、セファロスポリウム・エイキホルニエ(Cephalosporium eichhorniae)、セラトシスチス・パラドクサ(Ceratocystis paradoxa)、ケトミウム・テルモフィラム(Chaetomium thermophilum)、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、クラドスポリウム・レジナエ(Cladosporium resinae)、クロストリジウム属種(Clostridium sp.)、クロストリジウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム(Clostridium thermosaccharolyticum)、コニオフォラ・プテアナ(Coniophora puteana)、コルチシウム・ロルフシイ(Corticium rolfsii)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、デバリオミセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、デバリオミセス・オクチデンタリス(Debaryomyces occidentalis)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)、エンドミセス属種(Endomyces sp.)、エンドミコプシス・フィブリゲラ(Endomycopsis fibuligera)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)、ハロアルクラ・マリスモルツイ(Haloarcula marismortui)、ホルモコニス・レジナエ(Hormoconis resinae)、フミコラ・グリセア(Humicola grisea)、フミコラ・ラヌギノーザ(Humicola lanuginosa)、ヒポクレア・リキシイ(Hypocrea lixii)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、レンチヌラ・エドデス(Lentinula edodes)、リポミセス・コノネンコエ(Lipomyces kononenkoae)、マグナポルテア・グリセア(Magnaporthe grisea)、メソリゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノコッカス・ジャナスキイ(Methanococcus jannaschii)、メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、モナスカス・リビギノサス(Monascus rubiginosus)、モナスカス属種(Monascus sp.)、ムコール・ロウキシアナス(Mucor rouxianus)、ミコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、ミコバクテリウム・レプレ(Mycobacterium leprae)、ミコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum)、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ミロテシウム属種(Myrothecium sp.)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ノストック・プンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ペシロミセス・バリオチイ(Paecilomyces variotii)、ペネウス・ジャポニカス(Penaeus japonicus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・オキサリカム(Penicillium oxalicum)、ピクロフィラス・トリダス(Picrophilus torridus)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ラルストニア・メタリデュランス(Ralstonia metallidurans)、ラナ・ジャポニカ(Rana japonica)、リゾビウム・レグミノサラム(Rhizobium leguminosarum)、リゾプス・デレマル(Rhizopus delemar)、リゾプス・ジャバニカス(Rhizopus javanicus)、リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、リゾプス属種(Rhizopus sp.)、ロドコッカス属種(Rhodococcus sp.)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドスピリラム・ルブラム(Rhodospirillum rubrum)、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ジアスタチカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミコプシス・フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)、サッカロミコプシス・フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、シュワンニオミセス・オクチデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、スフィンゴモナス・アロマチシボランス(Sphingomonas aromaticivorans)、ストレプトミセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、タラロミセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii)、テルミトミセス・クリペアタス(Termitomyces clypeatus)、テルモアクチノミセス・ブルガリス(Thermoactinomyces vulgaris)、テルモアネロバクター・テングコンゲンシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、テルモアネロバクテリウム・テルモサッカロリチカム(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、テルモアスカス・クルスタセウス(Thermoascus crustaceus)、テルモミセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)、テルモプロテウス・テナクス(Thermoproteus tenax)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トリコデルマ・レエゼイ(Trichoderma reesei)およびトリコスポロン・アデニノボランス(Trichosporon adeninovorans)。
振とうフラスコ試験においてグルコアミラーゼ活性に関して種々の微生物を調べる。この目的に好適な培地は、生物の成長に好適で、かつグルコアミラーゼの発現を生じさせる任意の慣用の培地である。好適な培地は市販されているか、または公開されているプロトコル(例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載のプロトコル)にしたがって調製することができる。
グルコアミラーゼコード配列に関して研究対象の生物を検査するための代替法は、前記配列に特異的なプライマーまたはプローブを利用するスクリーニングである。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を使用する振とうフラスコ実験に、液化トウモロコシ粉加水分解物を用いた。
360gの脱イオン水を反応容器に導入した。継続撹拌しながら240gのトウモロコシ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。50%強度のNaOH水溶液を用いてpHを5.8にした後、4.0ml(=2重量%酵素/乾燥物)のLiquozyme SC(Novozymes A/S製)を加えた。次いでマッシュを85℃に急速に加熱した。このプロセス中、pHを継続して検査し、適切であれば、調整した。
菌株
フィードバック調節が解除されたアルパルトキナーゼを有する、改変された野生型であるATCC13032 lysCfbrを使用した。
細胞を滅菌CM+CaAc寒天(組成:表3を参照のこと;121℃で20分)上にストリークし、次いで30℃で一晩インキュベートした。その後、細胞をプレートからかきとり、生理食塩水に再懸濁した。2つのバッフルを備えた250mlエルレンマイヤーフラスコ中の25mlの培地(表4を参照のこと)に、それぞれ、610nmでの光学濃度がOD610値0.5に達する量の、得られた細胞懸濁液を接種した。
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)を使用する振とうフラスコ実験に、液化トウモロコシ粉加水分解物を用いた。
実施例1の項目(I)に記載のように液化を実施した。
菌株
glaAプロモーターの制御下にアスペルギルス・フィクウム(Aspergillus ficuum)由来の6コピーのphyA遺伝子を有するアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)フィターゼ産生株を、WO98/46772に詳細に記載されているNP505-7の製造と同様に作製した。3つの改変glaAアンプリコン(ISO505に類似)を有するが、phyA発現カセットが組み込まれていない菌株を対照として使用した。
1バッフルを備えた100mlエルレンマイヤーフラスコ中の20mlの前培養培地(表6を参照のこと)に、それぞれ、100μlの凍結培養物を接種し、加湿シェーカー中で振とう(170rpm)しながら、34℃で24時間インキュベートする。
Claims (23)
- 少なくとも3個のC原子を有するか、または少なくとも2個のC原子と少なくとも1個のN原子を有する少なくとも1種の有機化合物を、発酵により製造する方法であって、以下のステップ:
(a1)デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベースを得るステップ;
(a2)前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも1種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地(1)を得るステップ;および
(b)前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地(1)を用いるステップ
を含み、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき0.001重量%未満添加するか、または添加しない、上記方法。 - 水性液体中のミルベースの懸濁物を、前記デンプン供給材料中に存在するデンプンのアルファ化(gelatinization)温度より高い温度まで加熱する、請求項1に記載の方法。
- 加熱をデンプン液化酵素の存在下で行う、請求項2に記載の方法。
- 液化ステップの間に、ミルベースの少なくとも一部分を水性液体中に連続的にまたはバッチ方式で添加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 得られる水性デキストリン含有培地(1)が、該培地(1)の総重量に基づき少なくとも50重量%の乾燥物含量を有する量でミルベースを水性液体中に懸濁し、そこで液化する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 得られる水性デキストリン含有培地(1)が、該培地(1)の総重量に基づき少なくとも40重量%のグルコース相当物濃度を有する量でミルベースを水性液体中に懸濁し、そこで液化する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を産生する微生物から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 以下のステップ:
(b1)水性発酵培地(2)中で、前記有機化合物を過剰生産することが可能な微生物を培養するステップ;および
(b2)デキストリン含有培地(1)を発酵培地(2)に添加し、そこで培地(1)中に存在するデキストリンが、該有機化合物を過剰生産する微生物によって代謝されるステップ
をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(b1)の発酵培地(2)が、原則として、培地(1)、前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物、通常の培地成分、および適宜、希釈のための水を含む、請求項8に記載の方法。
- ステップ(b1)において、発酵培地(2)中の糖総含量が、グルコース相当物として計算し、かつ発酵培地(2)の総重量に基づき、6〜30重量%の範囲となる量の培地(1)を、発酵培地(2)を作製するのに用いる、請求項8または9に記載の方法。
- ステップ(a1)のデンプン供給材料として穀粒を用いる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ミルベースが、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分全体の少なくとも20重量%を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- デンプン液化酵素がα−アミラーゼである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 製造される有機化合物が、ヒドロキシル基が結合していてもよく、3〜10個の炭素原子を有するモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、タンパク質原性アミノ酸および非タンパク質原性アミノ酸、プリン塩基、ピリミジン塩基;ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質;飽和および不飽和脂肪酸;4〜10個の炭素原子を有するジオール、3個以上のヒドロキシル基を有する多価アルコール、少なくとも4個の炭素原子を有する長鎖アルコール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、プロビタミン、補因子、栄養補助剤、タンパク質、カロテノイド、3〜10個の炭素原子を有するケトン、ラクトン、生体ポリマーならびにシクロデキストリンより選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 発酵に用いる微生物が、以下の代謝産物:酵素、アミノ酸、ビタミン、二糖、3〜10個のC原子を有する脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、3〜10個のC原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、3〜10個のC原子を有するケトン、4〜10個のC原子を有するアルカノール、3〜8個のC原子を有するアルカンジオールならびにポリヒドロキシアルカノアートのうち少なくとも1つを過剰生産する天然または組み換え微生物より選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物が、1種以上のアミノ酸を過剰生産するものより選択される、請求項15に記載の方法。
- 微生物が、3〜10個のC原子を有する1種以上の脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸を過剰生産するものより選択される、請求項15に記載の方法。
- 微生物が、1種以上の酵素を過剰生産するものより選択される、請求項15に記載の方法。
- 微生物が、フィターゼを過剰生産するものより選択される、請求項15または18に記載の方法。
- 微生物が、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、バシラス属(Bacillus)、アッシビヤ属(Ashbya)、エシェリキア属(Escherichia)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、アクチノバシラス属(Actinobacillus)、アネロビオスピリラム属(Anaerobiospirillum)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)およびリゾプス属(Rhizopus)より選択される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物が、コリネバクテリウム属(genus Corynebacterium)の株より選択される、請求項20に記載の方法。
- 少なくとも1種の微生物代謝産物が発酵液から枯渇するか単離され、かつ発酵液の揮発性成分が続いて実質的に除去され、固体または半固体タンパク質組成物が得られる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 発酵液の揮発性成分の少なくとも一部が、非揮発性微生物代謝産物の事前の単離または枯渇、および適宜、固体成分の事前の除去なしに除去され、非揮発性微生物代謝産物の固体調製物が得られる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
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