WO2007049468A1

WO2007049468A1 - 脳梗塞抑制剤

Info

Publication number: WO2007049468A1
Application number: PCT/JP2006/320436
Authority: WO
Inventors: Masahiro Nishibori; Shuji Mori; Hideo Takahashi; Yasuko Tomono; Naoto Adachi; Keyue Liu
Original assignee: National University Corporation Okayama University; Ehime University
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2007-05-03
Also published as: EP1946774B1; EP1946774A1; JP3876325B1; EP1946774A4; JP2007119347A; US20090252739A1

Abstract

　本発明は、実際の脳梗塞に沿う長時間にわたる虚血後の脳組織壊死に対して有効であり、且つ副作用の少ない脳梗塞抑制剤を提供することを課題とする。本発明に係る脳梗塞の抑制剤は、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。

Description

明細書

脳梗塞抑制剤

技術分野

[0001] 本発明は、脳虚血により引き起こされる脳梗塞を抑制するための薬剤に関するものである。

背景技術

[0002] 脳梗塞とは、脳血管における動脈硬化や、脳以外の血管でできた血栓が脳に運搬されることなどを原因として、脳血管が閉塞したり細くなることによって、脳の血流が不足して血流障害組織が壊死に陥る疾病をいう。いったん脳梗塞が生じると、壊死した脳組織は元通りにはならないため、たとえ生命を取り留めた場合でも、運動麻痺ゃ感覚障害や言語障害のみならず痴呆症状が残る場合が多い。その一方で、近年、高血圧、心臓病、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病といわれる疾病が増加しており、それに伴って脳梗塞の危険性が増している。我が国において、脳梗塞を中心とする脳血管障害は癌や虚血性心疾患に次いで死因の第 3位を占めており、このことは欧米先進諸国でも同様である。従って、効果的な脳梗塞の処置手段が切望されている。

[0003] ところが、これまでのところ真に有効な治療手段は未だ見出されてヽな、。例えば、脳梗塞の原因となった血栓を溶解して血流を再開させるために、組織型プラスミノーゲンァクチベータなどの血栓溶解剤が使用されている。しかし、血流再開により生じるフリーラジカルを原因とする障害も脳梗塞の病態に深く関与しており、血栓溶解剤のみでは、脳組織の壊死に対する根本的な解決方法とはならな、。

[0004] 日本では、脳梗塞の治療剤として唯一エダラボンが承認されて、る。しかし、当該薬剤には肝機能障害ゃ腎機能障害等の副作用が見られ、特に、肝機能検査値異常など臨床検査値の異常変動は、投与患者の実に 21. 4%にも及ぶというデータもある。いかに致死的な疾患である脳梗塞に対する治療手段といえども、この様な高い副作用発生率には問題がある。また、当該薬剤は、虚血再灌流時に生じ、脳組織障害の原因となるフリーラジカルから脳組織を保護するためのフリーラジカルス力べンジャ一である。よって、フリーラジカルを原因とする脳組織障害は軽減できても、低酸素状態などその他の原因に起因する脳組織障害には効果を示さないと考えられる。

[0005] 例えば、脳梗塞においては、脳血管の透過性が過剰に亢進し、血液内のタンパク質が血管外に漏出し、脳浮腫が引き起こされる。この機構としては、マトリックスメタルプロテア一ゼと、う酵素の活性が過剰に亢進し、血管の基底膜が消化されるとの仮説が立てられている。よって、フリーラジカルスカベンジャーであるエダラボンでは、か力る症状を抑制できな、と考えられる。

[0006] その他、グルタミン酸受容体アンタゴニストやエストロゲン受容体関連薬、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害薬などの応用が検討されているが、これらの効果は十分とはいえない。

[0007] 薬剤以外の治療手段としては、低体温療法がある。しかし、その実施に要する費用が高額である上に、免疫力の低下による感染症や出血傾向などがあり、一般的な実施は困難である。

[0008] ところで、 HMGB1 (High Mobility Group box 1)は、げっ歯類からヒトまで 95%以上のアミノ酸配列が等しいタンパク質である。この HMGB1は正常細胞にも存在する力全身性炎症反応症候群の 1つである敗血症において放出される菌体内毒素である LPS (リポ多糖）による刺激によって血中濃度が上昇し、最終的な組織障害をもたらす。よって、特表 2003— 520763号公報に記載の技術では、炎症性サイト力インカスケードの活性化を特徴とする症状を治療するために、 HMGアンタゴ-ストを投与している。また、この症状の一例として虚血再灌流障害が挙げられており、 HMGアンタゴニストとして HMGB1タンパク質と結合する抗体が例示されている。

[0009] し力し特表 2003— 520763号公報に記載されている虚血再灌流障害は、全身性炎症反応症候群に含まれる症状や疾患として例示されている約 100種の疾患のうちの 1つにしか過ぎず、また、いかなる臓器における障害であるかの記載はない。さらに当該文献の実施例では、 TNFや LPS等による刺激により HMGB1が誘導されることや、抗 HMGB1抗体を投与することにより LPSによるマウスの死亡率が低減したこと、敗血症や多臓器不全 (MOF)のヒトにおいて血清 HMGB1レベルが上昇すること等が示されて!/ヽるが、抗 HMGB1抗体が虚血再灌流障害に対する効果を示すことは、具体的に実証されていない。少なくとも、特表 2003— 520763号公報の技術が対象としているのは全身性の炎症性疾患の治療であり、脳梗塞の抑制は志向されていない。

[0010] また、特表 2005— 512507号公報には、抗 HMGB1抗体力炎症性サイト力インカスケードに関係する疾患を治療し得る旨が記載されており、当該疾患の 1つとして脳梗塞も例示されている。

[0011] し力し、特表 2005— 512507号公報において、脳梗塞は 100を超える疾患の例示のうちの 1つにしか過ぎない。また、実施例で治療効果が実証されている疾患は、盲腸の穿刺と敗血症のみであり、脳梗塞に対する効果は実証されていない。

発明の開示

[0012] 上述した様に、これまでにも脳梗塞を治療や抑制するための薬剤は知られていた力いずれも副作用や有効性などの点で問題があり、新規の作用機序を有する薬剤が切望されている。例えば、日本で唯一承認されている脳梗塞治療剤であるエダラボンは、副作用など問題が多ぐまた、有効性も限定的なレベルに留まっている。従つて、真に優れた脳梗塞抑制剤が求められている状況にある。

[0013] そこで、本発明が解決すべき課題は、実際の脳梗塞に相当する長時間にわたる虚血後の脳組織壊死に対しても有効であり、且つ副作用の少ない脳梗塞抑制剤を提供することにある。

[0014] 本発明者らは、上記課題を解決すベぐ脳梗塞の抑制に有効な薬剤につき種々検討を進めた。その結果、抗 HMGB1モノクローナル抗体力過去に報告されているいカゝなる薬剤よりも優れた効果を有することを見出して、本発明を完成した。

[0015] 例えば、エダラボンは虚血再灌流により生じるフリーラジカルを除去し、主に虚血再灌流障害を抑制する。それに対して本発明薬剤は、主に虚血から脳組織を直接保護し、低酸素状態等による脳組織のダメージ自体を抑制できる。その結果、本発明薬剤は、低酸素状態等による障害領域のみならず、その周辺に形成される虚血再灌流障害をも抑制することができる。

[0016] 本発明の脳梗塞抑制剤は、抗 HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。 [0017] 本発明では、抗 HMGBlモノクローナル抗体を、脳梗塞の抑制剤を製造するために使用する。

[0018] また、本発明に係る脳梗塞の抑制方法は、抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与することを特徴とする。

[0019] 本発明の脳梗塞抑制剤は、脳血栓や脳塞栓等による長時間にわたる虚血を原因とする脳組織壊死を、効果的に抑制することができる。また、現在使用されている抗体薬剤を考慮すれば、重篤な副作用を生じる可能性は極めて少ないと考えられる。従つて、本発明の脳梗塞抑制剤は、これまで特に有効な処置手段のな力つた脳梗塞を抑制できるものとして、極めて有用である。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]抗 HMGB1モノクローナル抗体の HMGB1活性中和作用を示す図である。図 1 (A)は HMGB1を添カ卩したことによる単球上に発現した ICAM— 1量を示し、図 1 ( B)は、 HMGB1の添カ卩と同時に抗 HMGB1モノクローナル抗体を添カ卩した場合の I CAM— 1量を示す。

[図 2]抗 HMGB1モノクローナル抗体の投与による脳梗塞の抑制効果を示す図である。 2時間の脳虚血カも 24時間後において、対照抗体投与群では矢印に示す箇所に脳梗塞が生じて、るが、抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群では脳梗塞が全く見られない。

[図 3]抗 HMGB1モノクローナル抗体の投与による脳血管透過性亢進の抑制効果を示す図である。脳虚血を負荷しなかった非投与群では、色素である Evans blueの漏出は見られない。一方、脳虚血を負荷した上で対照抗体を投与した対照抗体投与群では、明確な漏出が見られる。本発明に係る抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与した抗 HMGB1抗体投与群では、かかる漏出は明らかに抑制されている。

[図 4]対照抗体投与群と抗 HMGB1抗体投与群との間で、脳組織における Evans b lueの漏出量を比較するための図である。抗 HMGB 1モノクローナル抗体を投与することによって、脳血管透過性亢進を有意に抑制できることが分かる。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 本発明の脳梗塞抑制剤は、抗 HMGB1モノクローナル抗体を有効成分の 1つとする。抗 HMGB1モノクローナル抗体は、 HMGB1へ特異的に結合してこれを中和し、脳神経細胞の壊死を抑制する。その一方で、他の化合物等には作用しない。よって、副作用が生じる可能性はないか、極めて少ないと考えられる。

[0022] 抗 HMGB1モノクローナル抗体の調製は、常法に従えばよい。例えば、市販の H MGB1を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞ゃ脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイプリドーマを得る。このハイプリドーマをクローユングし、 HMG B1へ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればょ、。

[0023] 本発明に係る脳梗塞抑制剤の剤形や投与形態は特に問わないが、脳虚血に対する緊急性を考慮すれば、注射剤として静脈内投与することが好ましい。その場合、溶媒としては、 pHを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。また、抗体を塩類等と共に凍結乾燥した場合には、純水、蒸留水、滅菌水等も使用できる。その濃度も通常の抗体製剤のものとすればよぐ l〜5mgZ mL程度とすることができる。但し、注射剤の浸透圧は、血漿と同等にする必要がある

[0024] 脳梗塞は、一般的に、脳血栓や脳塞栓等による虚血により生じ、肉眼でわかる程度の大きさの形態的障害 (壊死)を伴う。一方、一時的な脳血流の低下や小さな血栓等によるごく短時間 (例えば、数分から十数分間）の虚血を原因とするアポトーシスでは、数日後、虚血に弱い部位で神経細胞のみの脱落が生じる。このアポトーシスにより症状が生じたとしても、脳梗塞の場合よりもはるかに軽度で生命を脅かすに至らない。本発明の脳梗塞抑制剤は、長時間虚血による脳梗塞をターゲットにしているが、このような遅発性の神経細胞アポトーシスに対しても有効であることが推定される。

[0025] ここで、長時間虚血における「長時間」は特に制限されないが、少なくとも虚血により脳組織の壊死が直接引き起こされる程度の時間をいう。具体的な時間としては、虚血の原因や程度、或いは個人差等にもよるが、虚血の発生力実際に処置が行なわれるまでを考慮して、例えば 1時間以上、更には 1. 5時間以上、特に 2時間以上を挙げることがでさる。

[0026] 本発明に係る脳梗塞抑制剤の投与は、虚血前において予防的に行なうこともできるが、虚血中または虚血後とすることが好ましい。即ち、長時間虚血の発生後に単独で、或いは血栓溶解剤の投与と共に、もしくは再灌流後に、本発明の脳梗塞抑制剤を投与する。

[0027] 本発明に係る脳梗塞抑制剤の投与時は特に制限されないが、好適には虚血中または虚血再灌流後に投与する。ここで「虚血中または虚血再灌流後」において、「虚血中」と「虚血再灌流後」は明確に区別されず、例えば血栓溶解剤の投与など虚血再灌流のための何らかの処置の直前または直後、当該処置と同時、或いは当該処置から所定時間後などを表す。少なくとも、虚血前の投与は「虚血中または虚血再灌流後」には含まれない。虚血前における投与は実質的に予防剤としての使用となり、突発的に発生しその発生時を特定できない脳梗塞の場合、虚血前投与は難しい。

[0028] 本発明の脳梗塞抑制剤を虚血中または虚血再灌流後に投与することによって、再灌流時の脳血流低下、再灌流障害の原因となるグルタミンの遊離や活性酸素の産生、白血球の血管内皮への接着、および神経終末電位依存性カルシウムチャンネルの活性ィ匕などを抑制し、脳虚血により生じる脳内炎症のごく初期段階を抑制できると考えられる。より好ましくは、再灌流の直後に投与する。ここでの「直後」は、厳密に再灌流の直後を!、うものではなぐ例えば血栓溶解剤の投与など虚血再灌流のために何らかの処置をしてから 30分以内をいう。

[0029] 後述する実施例で示す通り、体重約 300gのラットに対して 1回当たり 200 gの抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与した場合に、顕著な脳梗塞の抑制効果が得られた。斯カる結果力考えると、ヒトに対する投与量は、 1回当たり抗 HMGB1モノクローナル抗体を 0. 2〜5mgZkgとし得、より好適には 0. 2〜2mgZkgとする。但し、これら薬剤の投与量は、患者の年齢や性別、疾患の重篤度等によって適宜変更すベきである。

[0030] また、本発明の脳梗塞抑制剤は、複数回にわたって或いは持続的に投与することが好ましい。脳梗塞の処置においては、脳組織の抗 HMGB1モノクローナル抗体濃度を長時間にわたって一定濃度以上に維持する必要があるからである。具体的には、虚血再灌流中または虚血再灌流直後とその後 6〜12時間ごとに投与することが好ましい。また、持続的に投与する場合には、点滴等により 1回分の投与量を 1〜数時間かけて投与することが好ま、。

実施例

[0031] 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなぐ前 ·後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。

[0032] 実施例 1 抗 HMGB1モノクローナル抗体の調製

(a)ラットの免疫

巿販のゥシ胸腺由来 HMGB1と HMGB2との混合物（和光純薬工業社製、コード番号： 080— 070741) lmgZmLを 2mLガラス製注射筒にとり、別の 2mLガラス製注射筒に等容量のフロイント完全アジュバンドをとつた。これら注射筒を連結管により連結した。上記混合物とアジュバンドを、当該連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルシヨンを得た。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足躕に、得られたエマルシヨンを 0. lmLずつ、計 0. 2mL注射投与した。 2週間後、頸静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与力も 5週間後に無菌的に取り出した。得られた 2個のリンパ節から、約 6 X 10⁷個の細胞を回収することができた。

[0033] (b)細胞融合とクローニング

上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマ SP2ZO— Agl4 (SP2)細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を 96穴マイクロプレートに蒔いた。 1週間後、最初の ELISAスクリーニングを行ない、陽性ゥエルについて、ウェスタンプロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すゥエル細胞を 24穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルェントな状態である約 2 X 10⁵まで殖やした。次いで、 0. 5mLの凍結培地（GIT培地にゥシ胎児血清を 10%とジメチルスルホキシドを 10%添加したもの）を用いて、当該細胞を液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、 96穴マイクロプレートでクローユングした。

[0034] (c)抗体の精製

回転培養装置 (Vivascience社製）により上記陽性細胞を 2週間大量培養し、濃度 2〜3mgZmLの抗体液を得た。この抗体液をァフィ-ティゲル (インビトロジェン社製、 MEP— HyperCel)と中性 pH下で混和し、抗 HMGB1抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、 pH4のグリシン—塩酸バッファ一により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、直径 2cm X長さ 97cmのセファ口ース CL6Bゲル濾過カラムによって、さらに精製した。

[0035] 実施例 2

上記実施例 1で調製した抗 HMGB1モノクローナル抗体の中和活性を試験した。

[0036] 先ず、健常人の末梢血から常法により 1 X 10⁶ZmLの末梢血単核球を調製し、 10 %ゥシ胎児血清を含む動物細胞培養用基礎培地 (シグマ社製、 RPMI1640)で 24 時間培養した。次いで、和光純薬社製のゥシ胸腺由来 HMGB1Z2混合物力精製したゥシ HMGB1を 0. OOl lO /z gZmLの濃度で培地に添カ卩し、単球を刺激した。 HMGB1の添加から 24時間後に細胞を回収し、 HMGB1により単球上に発現した ICAM- 1 (intercellular adhesion molecule- 1)の発現量を蛍光抗体法（FACS法）で定量した。結果を図 1 (A)に示す。図 1 (A)中、「 * *」は HMGB1を添カ卩しない場合に比して t—テストにより p< 0. 01で有意差があった場合を示す。当該結果より、 10 /z gZmLの HMGB1により単球上の ICAM—1の発現が有意に上昇することが分かつた o

[0037] 次に、上記手順において 10 μ gZmLの HMGB1添加と同時に 0〜： LOO μ g/mL の抗 HMGB1モノクローナル抗体を添カ卩し、上記と同様に蛍光抗体法を用いて ICA M— 1の発現量を定量した。結果を図 1 (B)に示す。図 1 (B)中、「 #」は抗体を添カロしない場合に比して t—テストにより pく 0. 05で有意であった場合を示し、「# #」«p < 0. 01で有意であった場合を示す。また、一番右の白抜きカラムは、 HMGB1を添カロしな力つた場合の結果である。当該結果より、実施例 1で調製した抗 HMGB1モノクローナル抗体は、 1 _μ gZmL以上の濃度で HMGB1を有意に中和できることが実証された。

[0038] 実施例 3

15匹のウィスター系雄性ラット（体重：約 300g)を、抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群 7匹と対照抗体投与群 8匹に分けた。これらラットを、 2%ハロタンおよび 50% 笑気の混合ガスにより麻酔し、自発呼吸させた。次いで、仰向けにしたラットの頸部を正中切開し、右総頸動脈を露出させた。へパリン (100単位)を腹腔内投与した後、総頸動脈の内頸と外頸の分枝部力シリコンコーティングした 4· 0ナイロン糸を右内頸動脈に挿入することによって、右中大脳動脈の基始部を 2時間閉塞した。ナイロン糸の先端は、分岐部から 18mmの位置に置いた。切開部を縫合した後、麻酔から回復させた。術中、電子式温度計を直腸に挿入し、ランプにより直腸温を 37. 0±0. 1 °Cに維持した。麻酔から回復した後には、全てのラットの対側肢に麻痺が認められた

[0039] 血流を再開する 5分前に、ラットを再度麻酔した。皮膚縫合を開いた後、ナイロン糸を 5mm抜去することによって、中大脳動脈閉塞から 2時間後に脳における血流を再開させた。抗体投与群には、再灌流時に抗 HMGB1モノクローナル抗体 200 g (リン酸緩衝 NaCl液 0. 2〜0. 4mLへ溶解したもの）を尾静脈力も投与した。さら〖こ 6時間後、同量の抗体を投与した。また、対照抗体投与群には同量のラッ HgGを投与した。

[0040] 血流再開から 24時間経過した後、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与することにより麻酔した。その後、へノリンを加えた生理食塩水で脳を灌流し、断頭した。速やかに脳を摘出し、生理食塩水ですすいだ。視交叉と乳頭体尾側端との間で脳を 2mmの厚さで冠状にスライスし、これらの脳スライスを 37°Cの 2%塩化トリフエ-ルテトラゾリゥムのリン酸緩衝液 (0. lmol/L, pH7. 4)溶液中、 30分間インキュベートした。その結果、生存細胞に存在する脱水素酵素の作用により塩化トリフエ-ルテトラゾリゥムは還元され、組織が暗赤色に染色された。一方、梗塞部位における死滅組織は染色されな力つた。これらの脳スライスを、リン酸緩衝ホルマリン中で一晩保存した。脳の冠状断染色の結果を図 2に示す。図 2において左側は対照抗体投与群、右側は抗 HMGB 1モノクローナル抗体投与群のそれぞれ 3匹の典型例であり、横方向に並べられた 3断面は同一個体由来のものであり、 3断面の左側が前方の断面である。その後、抗体投与実験に関与しなかった第三者的な実験者が、コンピュータを用 Vヽて線条体領域と大脳皮質領域における梗塞部位の大きさ（単位： mm³)を測定した。また、得られた脳梗塞部位の大きさを t—テスト (unpaired)で検定した。各値の平均値を表 1に示す。

[0041] [表 1]

[0042] 表中の値 (単位: mm³)は、脳梗塞の大きさ（平均値士標準偏差)を示し、「 *」は対応する対照群に対して p< 0. 05で有意であった場合を示し、「* *」は p< 0. 01で有意であった場合を示す。

[0043] 当該結果によれば、対照群では大脳皮質領域から線条体領域にかけて脳梗塞が認められたが、抗体投与群では脳梗塞巣は全く認められな力つた。

[0044] 以上の通り、本発明の脳梗塞抑制剤は、虚血による影響から脳組織を保護することによって、低酸素状態等による直接の障害領域である「コア」の形成を顕著に抑制できる。よって、本発明の脳梗塞抑制剤は、極めて優れた脳梗塞の抑制作用を示すことが実証された。

[0045] 実施例 4

17匹のウィスター系雄性ラットを、抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群 8匹と対照抗体投与群 9匹に分け、上記実施例 3と同様の方法により 2時間の局所脳虚血を負荷した。抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群には、再灌流時 (血流再開直後）と血流再開から 6時間後および 24時間後の計 3回、抗 HMGB1モノクローナル抗体を 200 gずつ投与した。対照抗体投与群には、同量のラット IgGを投与した。次いで、血流再開から 48時間経過後に脳スライスを作成した。線条体領域と大脳皮質領域における梗塞部位の大きさの値の平均値を表 2に示す。

[0046] [表 2]

[0047] 当該結果の通り、血流再開力 48時間経過後においても抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与することにより脳梗塞を有意に抑制できることが実証された。但し、 24 時間経過後に比べて多少の脳梗塞が生じている。これは、低酸素状態等による直接の障害領域であるコアの周りにおいて、時間経過により再灌流障害が進行する結果である。

[0048] 対照群では、上記実施例 3の通りコアが形成されていることから、 48時間後にコアの周辺に形成される障害領域であるべナンブラが発達し、重篤な脳梗塞が生じている。これに対して抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群では、上記実施例 3の通りコァ自体の形成が抑制されていることから、ペナンブラの発達も抑制され、軽微な症状しか表れていない。

[0049] 以上の通り、本発明の脳梗塞抑制剤によれば、脳梗塞を顕著に抑制できることが実証された。

[0050] 実施例 5

9匹のウィスター系雄性ラットを、抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群 3匹、対照抗体投与群 3匹、および非投与群 3匹に分け、上記実施例 3と同様の方法により、抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群と対照抗体投与群に 2時間の局所脳虚血を負荷した。抗 HMGB1モノクローナル抗体投与群には、血流再開直後に抗 HMGB1モノクローナル抗体を 200 g投与した。また、抗 HMGB1モノクローナル抗体の投与直後に、 2%Evans blue生理食塩水を 20mgZkgの用量で尾静脈力も投与した。 Evans blueは血中タンパク質であるアルブミンと結合することから、血管から漏出したアルブミンを可視化することができる。対照抗体投与群には、同量の抗 Keyhole

Limpetモノクローナル抗体と Evans blueを投与した。なお、当該抗体は、抗 HM GB1モノクローナル抗体と同じ IgG2aクラスに属する。また、非投与群には頸部手術のみ適用して局所脳虚血を負荷せず、且つ上記と同様に Evans blueのみを投与した。

[0051] Evans blue等の投与から 3時間後に 50mgZkgのペントバルビタールを腹腔内投与し、深麻酔下に左心室から 150mlの生理食塩水を灌流した後、脳を摘出した。図 3に、摘出脳の断面写真を示す。非投与群では、血管内から脳内への Evans blu eの移行はほとんど認められない。対照抗体投与群では、虚血側の視床下部、線条体、および大脳皮質の何れにも Evans blueの脳内への移行が認められ、この領域の脳血管透過性が亢進していることがわかる。一方、抗 HMGB1抗体投与群では、対照抗体投与群で見られた脳血管透過性が著明に抑制されており、特に、 24時間後に梗塞巣を形成する線条体と大脳皮質では、 Evans blueの漏出はほとんど抑制されていた。

[0052] また、抗 HMGB1抗体投与群と対照抗体投与群の脳を、 0. 6N H PO：アセトン

3 4

= 5 : 13の混合溶液中でホモジェナイズし、 Evans blueを抽出することによって、 Ev ans blueの漏出量を定量ィ匕した。結果を図 4に示す。図 4中、「*」は対応する対照群に対して p< 0. 05で有意であった場合を示し、「* *」は p< 0. 01で有意であつた場合を示す。当該結果より、抗 HMGB1モノクローナルは、 Evans blueの漏出を有意に抑制できることが実証された。

[0053] 以上の結果から、抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与することによって、脳虚血による血中タンパク質の脳組織内への漏出を効率よく抑制でき、脳障害の原因となる脳浮腫の抑制が可能であることが分かる。

[0054] 比較例 1

本発明薬剤の優れた脳梗塞抑制作用をより明確にするために、上記実施例 3と同様の方法によって、脳梗塞を直接治療する薬剤として日本で唯一承認されているェダラボン（ 3 -メチル 1 フエ-ル - 2-ビラゾリン— 5 オン)の脳梗塞抑制効果を gi験し 7こ。

[0055] 具体的には、 12匹のウィスター系雄性ラット（体重:約 300g)を、エダラボン投与群 6匹と生理食塩水投与群 (対照群) 6匹に分け、上記実施例 3と同様の方法により 2時間の局所脳虚血を負荷した。エダラボン投与群には、再灌流時にエダラボン 3mgZ kgを尾静脈力も投与した。さらに 6時間後、同量のエダラボンを尾静脈力も投与した。また、対照群には同量の生理食塩水を投与した。血流再開から 24時間経過した後、上記実施例 3と同様に脳スライスを作製し、染色した。その後、実験に関与しなかつた第三者的な実験者が、コンピュータ (ソフト: Scion Image)を用いて線条体領域と大脳皮質領域における梗塞部位の大きさ（単位: mm³)を測定した。また、得られた脳梗塞部位の大きさを t テスト（unpaired)で検定した。結果を表 3に示す。なお、表 3中の「NS」は、対照群に比して有意差が無!、ことを示す。 [0056] [表 3]

[0057] 表 3の結果の通り、脳の虚血再灌流後にエダラボンを投与した場合においては、対照群に比して、大脳皮質で約 22%、線条体で約 35%、合計で約 27%、脳梗塞サイズが低減されている。しかし、これらエダラボンの脳梗塞抑制効果は、大脳皮質、線条体、これらの合計の何れにおいても、統計学上有意なものではなかった。

[0058] 一方、上記実施例 3と 4の結果の通り、抗 HMGB1モノクローナル抗体は、大脳皮質、線条体、これらの合計の何れにおいても、統計学上有意に且つ強力に脳梗塞を抑帘 Uすることができる。

[0059] 従って、抗 HMGB1モノクローナル抗体は、脳梗塞抑制剤として承認されて!、るェダラボンよりも優れた脳梗塞抑制効果を有することが実証されたことになる。

Claims

請求の範囲

[1] 抗 HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする脳梗塞抑制剤。

[2] 長時間虚血による脳梗塞を抑制するためのものである請求項 1に記載の脳梗塞抑制剤。

[3] 虚血中または虚血再灌流後に投与するものである請求項 1または 2に記載の脳梗塞抑制剤。

[4] 複数回投与するものである請求項 1〜3のいずれかに記載の脳梗塞抑制剤。

[5] 虚血中または虚血再灌流直後と、その後 6〜12時間ごとに投与するものである請求項 4に記載の脳梗塞抑制剤。

[6] 抗 HMGB1モノクローナル抗体を、 1回当たり 0. 2〜5mgZkg投与するものである請求項 4または 5に記載の脳梗塞抑制剤。

[7] 虚血中または虚血再灌流後、持続的に投与するものである請求項 1〜3のいずれ力に記載の脳梗塞抑制剤。

[8] 脳梗塞の抑制剤を製造するための抗 HMGB1モノクローナル抗体の使用。

[9] 抗 HMGB1モノクローナル抗体を投与することを特徴とする脳梗塞の抑制方法。