WO2007048978A2 - Procede de detection du cancer - Google Patents

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WO2007048978A2
WO2007048978A2 PCT/FR2006/051108 FR2006051108W WO2007048978A2 WO 2007048978 A2 WO2007048978 A2 WO 2007048978A2 FR 2006051108 W FR2006051108 W FR 2006051108W WO 2007048978 A2 WO2007048978 A2 WO 2007048978A2
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nucleic acids
mammal
risk
cancer
sequences
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PCT/FR2006/051108
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Alexander Krause
Philippe Leissner
Malick Paye
Bruno Mougin
Fabien Schweighoffer
Laurent Bracco
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Biomerieux Sa
Exonhit Therapeutics Sa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present application relates to methods and compositions useful for the detection of cancer in mammals, particularly humans.
  • it describes serum markers of cancers and their uses in diagnostic methods.
  • It also relates to tools and / or kits that can be used for the implementation of these methods (reagents, probes, primers, antibodies, chips, cells, etc.), their preparation and their uses.
  • the invention is useful for detecting the presence or the evolution of a cancer in mammals, in particular breast cancer, including in the early phase.
  • breast cancer The diagnosis of breast cancer is usually done by mammography. However, it is estimated that the minimum size of a mammogram-detectable tumor is 1 cm, which has an evolutionary history of 8 years on average during diagnosis. Smaller tumors are much less malignant than can be extrapolated from their sizes: the aggressiveness of large tumors does not only come from their size, but also from their "inherent aggression", which increases with age. a tumor (Bucchi et al., Br J Cancer 2005, pp. 156-161; Norden T, Eur J Cancer 1997, pp. 624-628).
  • the present application provides a set of biological markers that can be used, alone or in combination, preferably in combination, to reliably detect, characterize or track the presence or evolution of a cancer in a mammal, preferably breast cancer.
  • the invention is particularly advantageous insofar as it can be implemented from whole blood without the need for tissue biopsy or separation steps.
  • the present application results from the identification of serum genetic markers characteristic of human patients with breast cancer.
  • serum genetic markers characteristic of human patients with breast cancer.
  • These markers correspond for example to variations in splicing or gene expression levels, and may allow, alone or, advantageously, in combination, to detect in patients the presence or stage of evolution of a cancer. They advantageously make it possible to detect the presence of a breast cancer, as early as the early phases thereof (namely stages I and II, that is to say, in particular at a stage where a mammogram would be ineffective), reliably and simply, from a whole blood sample. They can also detect early breast cancers that can not be detected by mammography because it is below its detection limit.
  • An object of the present application relates to a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or risk of developing cancer in a mammal, including determining the presence (or absence or amount of (relative) ), in a biological sample of the mammal, one, preferably several target molecules selected from: a) nucleic acids comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1-437 or a distinctive fragment thereof having at least 15 preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, b) the nucleic acids having a sequence complementary to a sequence according to a), c) the functional analogues of nucleic acids according to a) or b), or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c), the presence (or absence or (relative) amount) of such target molecules in the sample being indicative of the presence or of the risk of developing cancer at this mammal.
  • the method comprises the combined determination of the presence or absence or (relative) amount of at least 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70 or more of the molecules. targets as defined above.
  • the "combined" determination refers to the fact that a hybridization profile (or signature) involving multiple markers is determined.
  • the combined determination is typically performed simultaneously, i.e., by overall measurement of an expression profile. Nevertheless, the combined determination can also be performed by parallel or sequential measurements of several markers, leading to the identification of a profile.
  • the invention makes it possible to establish and determine a hybridization profile (or a signature) on a set of markers, in order to evaluate the presence or risk of developing cancer in a mammal.
  • the hybridization profile is typically performed using a combination of several markers selected by the targets indicated above, for example containing all of these targets.
  • the method of the invention comprises determining the presence (or absence or (relative) quantity) in a biological sample of the mammal, at least 5 different target molecules selected from those defined above, preferably at least 10.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or (relative) amount) of a particular mammalian biological sample of particular subsets of target molecules selected from those defined above.
  • Such subsets, described in the examples, are particularly suitable for the detection, particularly in the early phase, of the presence of breast cancer in patients from a whole blood sample.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids of the invention.
  • the set of a panel of targets (or signatures) comprising markers as defined in elements a) to d) above, preferably all the molecules of one of the panels 1 to 11 defined in the this request.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, of all the nucleic acids of the Panel 1, comprising the sequences shown in Table 4, column 1, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, nucleic acids comprising the sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 and 312 (PANEL 2) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a complementary sequence thereof and and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 2 a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a complementary sequence thereof and and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising the Sequences represented in SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 27, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 161, 188, 225, 228, 240, 280 and 312 (PANEL 3) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a complementary sequence thereof and / or analogs functional groups thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 312 PANEL 312
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising the sequences represented in SEQ ID NOs: 13, 16-19, 23, 26-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 145, 148, 158, 160, 161 , 164, 189, 190, 225, 229, 240, 248, 280, 281, 284, 299, 300, 310 and 312 (PANEL 4) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16 , 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 4 distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16 , 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary there
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising the sequences represented in SEQ ID NOs: 7, 13, 14, 16-19, 23-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148 , 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 228, 229, 240, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300, 310 and 312 (PANEL 5) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 5 distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising the sequences represented in SEQ ID NOs: 5, 7, 13, 14, 16-20, 23-28, 47, 51-55, 58, 64, 69, 80, 81, 88-90, 116, 121, 125, 137 , 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 188-191, 208, 222, 225, 228, 229, 236, 240, 242, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298 -300 and 309-312 (PANEL 6) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary to those and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 6 or a distinctive fragment
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, of all the nucleic acids of Panel 7, comprising the sequences shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the examples provided in the present application indeed show that this panel of markers makes it possible to predictively detect the presence, the risk of developing or the stage of evolution of a cancer.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, of all the nucleic acids of Panel 8, comprising the sequences shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, all the nucleic acids of Panel 9, comprising the sequences shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19 , 20, 25 or 30 consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or absence or quantity (relative)), in a biological sample of the mammal, of all the nucleic acids of Panel 10, comprising the sequences shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the method further comprises the detection of one or more of the other target molecules as defined above.
  • the method of the invention comprises the combined determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising the sequences represented in SEQ ID NO: 23, 52, 53, 148 and 225 (PANEL 11), or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or Consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • PANEL 11 the sequences represented in SEQ ID NO: 23, 52, 53, 148 and 225
  • PANEL 11 a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or Consecutive bases, or having a sequence complementary thereto and / or functional analogues thereof from other species, and / or polypeptides encoded by these nucleic acids.
  • the examples provided in this application show in effect that this panel of markers makes it possible to predictive
  • the method of the invention comprises the determination of the presence (or the absence or the (relative) amount), in a biological sample of the mammal, of the nucleic acids comprising respectively the sequences represented in SEQ ID NOs: 1-437 or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, or nucleic acids having a complementary sequence of these.
  • Another particular object of the invention thus lies in a method for detecting the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising contacting, under conditions allowing hybridization between complementary sequences, nucleic acids derived from a mammalian blood sample and a set of probes specific for the following target molecules: a) the nucleic acids comprising the sequences represented in one of the PANELS 1 to 11 as defined above, or a fragment that is distinctive from those with at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, to obtain a hybridization profile, the hybridization profile being characteristic of the presence or risk of developing a breast cancer in this mammal.
  • this analysis reveals numerous genes involved in the signaling cascades used in the transduction of messages initiated by the stimulation of TLRs, in the secretion of cytokines or in the activation of T lymphocytes.
  • the invention thus demonstrates that alterations in these signaling cascades occur in cancer patients, and that any gene or RNA involved in these cascades or any deregulation in these genes or RNA may constitute a marker of the presence or predisposition to cancer. Such alterations can occur during the oxidative stress imposed by tumor cells on monocytes, macrophages and dendritic cells.
  • a particular object of the invention relates to a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or risk of developing cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a sample.
  • mammalian biology preferably in a sample (derived) of blood, an alteration in a gene or RNA participating in a signaling pathway involved in the immune response (innate or acquired), the presence of such alteration being indicative the presence or risk of developing cancer in this mammal.
  • the signaling pathway involved in the immune response is advantageously selected from TLR stimulation, cytokine secretion, or T cell activation.
  • TLRs toll-like receptors
  • Multiple TLRs react to different ligands that can be carried by pathogens or tumor cells and induce the production of various pro-inflammatory cytokines by dendritic cells. This phenomenon is accompanied by a presentation of antigens to na ⁇ ve T cells, thus initiating a specific acquired immune response.
  • the receivers we can preferentially mention the receivers, the adapters, enzymes, factors involved in the regulation of gene expression, chemokines, cytokines and interleukins.
  • a particular object of the invention is a method for detecting in vitro or ex vivo the presence or risk of developing cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a biological sample of the mammal , preferably in a sample (derived) of blood, an alteration in a gene or RNA involved in the regulation of the signaling cascade controlling the phenomenon of innate immunity. More particularly, this phenomenon mobilizes the cascade initiated by TLRs and regulates the activity of macrophage and dendritic cells.
  • Another particular object of the invention resides in a method for detecting in vitro or ex vivo the presence or risk of developing cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a biological sample of the mammal. mammal, preferably in a sample (derived) of blood, an alteration in a gene or RNA involved in the regulation of the signaling cascade controlling the phenomenon of acquired or adaptive immunity. More specifically, this phenomenon involves T cell receptors (TCRs).
  • TCRs T cell receptors
  • Yet another particular object of the invention is a method for detecting in vitro or ex vivo the presence or risk of developing cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a biological sample. of the mammal, preferably in a sample (derived) of blood, an alteration in a gene or RNA involved in the transition, the coordination between the innate and acquired immunities. More particularly, these genes are involved in the biosynthesis of lipid molecules from precursors such as arachidonic acid.
  • a particular object of the invention therefore lies in a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a sample.
  • mammalian biology preferably in a blood (derived) sample, an alteration in a gene or RNA involved in the stimulation of TLRs, in the secretion of cytokines, or in the activation of T lymphocytes, said gene or RNA being advantageously selected from receptors, adapters, enzymes, factors involved in the regulation of gene expression, chemokines, cytokines and interleukins, the presence of such alteration being indicative of the presence or risk of developing cancer in this mammal.
  • alteration in a gene or RNA denotes for the purposes of the invention any alteration of the expression, namely in particular a deregulation in the splicing leading to the appearance of particular spliced forms, or to a modification of the quantity ( relative) or the relationship between the different forms of splicing.
  • RNA sequences whose expressions are affected by splice impairment can be deposited or synthesized on any solid support and hybridized with nucleic probes derived from control blood and blood from cancer patients for selection. the most discriminating oligonucleotides. More broadly, the oligonucleotides can be chosen as representative of any mRNA encoding any protein involved in the innate and acquired immunities. More particularly, these oligonucleotides can derive from the genes indicated in Table 6. The alterations can also be detected in terms of the structure or levels of expression of the polypeptides encoded by these genes or RNAs, for example by means of specific antibodies. as will be described in detail in the rest of the text.
  • a particular object of the invention therefore lies in a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a sample.
  • mammalian biology preferably in a sample (derived) blood, an alteration in at least one, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 corresponding genes or RNA indicated in Table 5, in particular an alteration of the splicing of such a gene or RNA, the presence of such an alteration being an indication of the presence or risk of developing cancer in this mammal.
  • Another particular object of the invention therefore lies in a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising determining the presence (or absence) in a mammal.
  • biological sample of the mammal preferably in a sample (derived) from blood, an alteration in at least one, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 genes or
  • RNA shown in Table 6 in particular an alteration of the splicing of such a gene or RNA, the presence of such alteration being an indication of the presence or risk of developing cancer in this mammal.
  • the present invention is based on the demonstration and characterization of serum biological events characteristic of the presence of breast cancer in a human patient.
  • These events constitute (bio) markers, the detection of which in a patient makes it possible, preferably in combination, to determine, even at an early stage, the risk of developing such a cancer or the presence of such a cancer.
  • markers and transcripts are used interchangeably, except when the context gives them a specific meaning.
  • the identified biological events typically correspond to changes in the regulation of gene expression. It may be a partial or total inhibition of the expression of genes or RNA, or certain forms of genes or RNA, an increase in the expression of genes or certain forms of genes or RNA, the appearance or disappearance of gene splicing forms, etc.
  • the invention is therefore based on the detection, in a sample, of one or more target molecules representative of the biological events thus identified.
  • these target molecules can be chosen from: a) nucleic acids comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 1-437 or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, b) the nucleic acids having a sequence complementary to a sequence according to a), c) the functional analogues of nucleic acids according to a) or b), or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c).
  • the target molecule may be the full sequence of the gene or I 1 RNA or protein corresponding to the sequences SEQ ID NOs: 1-437, or a distinctive fragment thereof, that is to say, a fragment including the sequence is specific for said gene or RNA, or said protein, and / or comprises a domain of variability (splicing, deletion, polymorphism, etc.) representative of the biological event to be detected.
  • the complete list of markers and the corresponding genes are shown in Table 1.
  • the term "functional analog” refers to an analogue from another mammalian species. Indeed, the sequences SEQ ID NOs: 1-437 have been identified from human subjects, and these sequences constitute effective markers adapted to the detection of cancer in human patients. Nevertheless, for an application of the methods of the invention to other mammalian species, it is generally preferable to use functional analogues of these sequences, characterized in the species under consideration. These analogs can be identified by any technique known to those skilled in the art, in particular in view of the sequences provided in the application and the names of the corresponding genes.
  • the method comprises determining the presence of at least one nucleic acid according to a) to c).
  • the method is used to detect cancer in a human subject and includes determining the presence of at least one nucleic acid according to a) or b). More preferably still, the method comprises the combined detection of the presence (or absence) or the quantity (relative or absolute) of a panel of target markers, as defined in this application (Panels 1 to 11 or Tables 5 and 6).
  • a particular embodiment of the invention is a method for detecting the presence or risk of developing breast cancer in a mammal, comprising the combined determination of the presence or amount (relative or absolute) in a sample mammalian blood, a set of molecules comprising at least the following target molecules: a) nucleic acids comprising the sequences of PANEL 1 or 11 shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15 preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) nucleic acids having a sequence complementary sequence according to a), and / or c) functional analogues of nucleic acids according to a) or b) from another species, and / or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c), the presence of such target molecules in the sample being an indication of the presence or the risk of developing breast cancer in this mammal.
  • a particular embodiment of the invention is a method for detecting the presence or risk of developing breast cancer in a mammal, comprising the combined determination of the presence or amount, in a mammalian blood sample, the following target molecules: a) nucleic acids comprising the sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228 , 240 and 312 (PANEL 2) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) the nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, and / or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c ) the presence of such target molecules in the sample being an indication of the presence or risk of developing breast cancer in that
  • a particular embodiment of the invention is a method for detecting the presence or risk of developing breast cancer in a mammal, comprising the combined determination of the presence or amount, in a mammalian blood sample, the following target molecules: a) the nucleic acids comprising the PANEL sequences shown in Table 4, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or consecutive bases, and / or b) nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, and / or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c), the presence of such target molecules in the sample being an indication of the presence or risk of developing breast cancer in this mammal.
  • Another specific object of the invention is a method for detecting the presence or risk of developing breast cancer in a mammal, comprising detecting, in a blood sample of the mammal, the following target molecules: a) the acids nucleic acids comprising the sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 and 312 (PANEL 2) or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) the nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, and / or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c), the presence, absence or (relative) amount of these target molecules in the sample being an indication of the presence or risk of developing breast
  • the invention also allows the definition of additional panels, comprising at least some markers as defined above, which may optionally be combined with other markers.
  • additional panels can be obtained by testing the presence or absence of these markers in patient samples, to define other predictive combinations, where appropriate specific pathologies.
  • RNA samples are useful in the present invention, such as, for example, Northern blotting, selective hybridization, the use of probed oligonucleotide-coated supports, the amplification of nucleic acid, nucleic acid such as, for example, by RT-PCR, quantitative PCR or ligation-PCR, etc.
  • a nucleic probe eg an oligonucleotide
  • a nucleic probe capable of selectively or specifically detecting the target nucleic acid in the sample.
  • the amplification may be carried out according to various methods known per se to those skilled in the art, such as PCR, CSF, transcription-mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA), NASBA, the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Southern blotting, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • TMA transcription-mediated amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • NASBA the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Southern blotting, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • the method comprises the detection of the presence or absence or the (relative) amount of a nucleic acid according to a) to c) by selective hybridization or selective amplification.
  • Selective hybridization is typically performed using nucleic probes, preferably immobilized on a support, such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • a support such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, etc.
  • the nucleic probes may be any nucleic acid (DNA, RNA, PNA, etc.), preferably single-stranded, comprising a sequence specific for a target molecule as defined in a) to c) above.
  • the probes typically comprise from 5 to 400 bases, preferably from 8 to 200, more preferably less than 100, and even more preferentially less than 75, 60, 50, 40 or even 30 bases.
  • the probes may be synthetic oligonucleotides, produced on the basis of the target molecule sequences of the invention according to conventional synthesis techniques. Such oligonucleotides typically have from 10 to 50 bases, preferably from 20 to 40, for example about 25 bases.
  • oligonucleotides are used to detect the same target molecule. They may be oligonucleotides specific for different regions of the same target molecule, or centered differently on the same region. It is also possible to use pairs of probes, one of which is perfectly matched to the target molecule, and another has a mismatch, thus making it possible to estimate the background noise. In the following examples, 6 to 11 pairs of 25 base oligonucleotides were used for each target molecule.
  • the probes may be synthesized beforehand and then deposited on the support, or synthesized directly in situ, on the support, according to methods known per se to those skilled in the art.
  • the probes can also be manufactured by genetic techniques, for example by amplification, recombination, ligation, etc.
  • the probes thus defined constitute another object of the present application, as well as their uses (essentially in vitro) for the detection of cancer in a subject.
  • a set of nucleic probes comprising all or a fragment of at least 15 consecutive bases, preferably 17, is used.
  • Hybridization can be carried out under standard conditions known to those skilled in the art and adjustable by it (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, CoId Spring Harbor Laboratory Press). In particular, the hybridization can be carried out under conditions of high, medium or low stringency, depending on the desired level of sensitivity, the quantity of available material, etc. For example, appropriate hybridization conditions include a temperature of 55 to 63 ° C for 2 to 18 hours on low density media. Other hybridization conditions may be required for high density media, such as a temperature. hybridization between 45 and 55 ° C.
  • washes can be performed to remove unhybridized molecules, typically in SSC buffers comprising SDS, such as a buffer comprising 0.1 to 10 X SSC and 0.5-0.01% SDS.
  • SSC buffers comprising SDS
  • Other wash buffers containing SSPE, MES, NaCl or EDTA may also be used.
  • the nucleic acids are prehybridized in hybridization buffer (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) typically containing 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA. 65 ° C for 30 min.
  • hybridization buffer Random Hybrid Buffer, Amersham
  • the nucleic acids of the sample are then contacted with the probes
  • the nucleic acids of the sample are marked beforehand with any known labeling (radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent, etc.).
  • the supports are then washed in 5 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes, then in a 0.2 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS.
  • the hybridization profile is analyzed according to conventional techniques, for example by measuring the marking on the support by means of a suitable instrument (for example Instantlmager, Packard Instruments).
  • Hybridization conditions can naturally be adjusted by those skilled in the art, for example by modifying the hybridization temperature and / or the saline concentration of the buffer, as well as by adding auxiliary substances such as formamide or simple DNA. strand.
  • a particular object of the invention thus lies in a method for detecting the presence or the risk of developing breast cancer in a mammal, comprising contacting, under conditions allowing hybridization between complementary sequences, nucleic acids derived from a mammalian blood sample and from a set of probes specific for the following target molecules: at least: a) nucleic acids comprising the sequences of one of the panels 1 to 11 defined above, or a fragment characterized by them having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) the nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, to obtain a hybridization profile, the hybridization profile being characteristic of the presence or risk of developing breast cancer in this mammal.
  • a particular object of the invention thus lies in a method for detecting the presence or risk of developing breast cancer in a mammal, comprising bringing into contact, under conditions allowing hybridization between complementary sequences, nucleic acids derived from a mammalian blood sample and a set of probes specific for the following target molecules: a) the nucleic acids comprising the sequences represented in one of the PANELS 1, 2 or 11 as defined above, or a a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) the nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and or c) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, to obtain a hybridization profile, the hybridization profile being characteristic of the presence or the risk of developing oppose breast cancer in this mammal.
  • the methods of the invention also use other target molecules and / or other probes, especially the subsets of target molecules mentioned in the present application.
  • another particular object of the invention resides in a method for detecting the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising contacting, under conditions allowing hybridization between complementary sequences, nucleic acids derived from a sample of mammalian blood and a set of probes specific for at least two distinct molecules selected from the following targets: a) nucleic acids comprising the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-437 or a distinctive fragment of these having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, and / or b) the nucleic acids having a sequence complementary to sequences according to a), and / or c ) the functional analogues of the nucleic acids according to a) or b) from another species, to obtain a hybridization profile, the hybridization profile being characteristic of the presence or risk of development to develop cancer in
  • the hybridization profile can be compared to one or more reference profiles, including a reference profile characteristic of healthy subjects and / or subjects with cancer, the comparison making it possible to determine the probability or the risk that the tested patient is reached. of a cancer.
  • the comparison is made using computer programs known per se to those skilled in the art.
  • the selective amplification is preferably performed using a primer or pair of primers for amplifying all or part of one of the target nucleic acids in the sample, when present therein.
  • the primer may be specific for a target sequence according to SEQ ID NO: 1-437, or a region flanking the target sequence in a nucleic acid of the sample.
  • the primer typically comprises a single-stranded nucleic acid, preferably between 5 and 50 bases long, preferably between 5 and 30.
  • Such a primer constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in in vitro) for the detection of cancer in a subject.
  • another object of the invention is the use of a nucleotide primer or a set of nucleotide primers for the amplification of all or part of one or, preferably, several genes or RNAs comprising a target sequence according to SEQ ID NO: 1-437, for the detection of a cancer in a mammal, preferably breast cancer, particularly in a human being. human.
  • Another particular object of the invention resides in a method for detecting the presence or the risk of developing a cancer in a mammal, comprising bringing into contact, under conditions allowing amplification, nucleic acids derived from a blood sample.
  • amplification profile being characteristic of the presence or risk of develop cancer in this mammal.
  • the method comprises determining the presence of a polypeptide according to d).
  • the detection of a polypeptide in a sample can be carried out by any technique known per se, such as in particular by means of a specific ligand, for example an antibody or an antibody fragment or derivative.
  • the ligand is an antibody specific for the polypeptide, or a fragment of such an antibody (for example an Fab, Fab ', CDR, etc.), or a derivative of such an antibody (for example a single antibody). chain, ScFv).
  • the ligand is typically immobilized on a support, such as a slide, ball, column, plate, etc.
  • the presence of the target polypeptide in the sample can be detected by demonstrating a complex between the target and the ligand, for example using a labeled ligand, using a second revealing ligand marked, etc.
  • Immunological techniques that can be used and are well known are ELISA, RIA, etc.
  • Antibodies specific for the target polypeptides may be produced by conventional techniques, including immunizing a non-human animal with an immunogen comprising the polypeptide (or an immunogenic fragment thereof), and recovering antibodies (polyclonal) or producing cells (to produce monoclonals). Techniques for producing poly- or monoclonal antibodies, ScFv fragments, human or humanized antibodies are described for example in Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94 / 02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93 / 01288.
  • the immunogen may be synthetically manufactured, or by expression, in a suitable host, of a target nucleic acid as defined above.
  • a suitable host of a target nucleic acid as defined above.
  • Such an antibody, monoclonal or polyclonal, as well as its derivatives having the same antigenic specificity, are also an object of the present application, as well as their use for detecting cancer.
  • the method of the invention is applicable to any biological sample of the mammal under test, in particular any sample comprising nucleic acids or polypeptides.
  • a sample of blood, plasma, platelet, saliva, urine, stool, etc. may be advantageously mentioned, more generally any tissue, organ or, advantageously, biological fluid comprising nucleic acids or polypeptides.
  • the sample is a blood or plasma sample.
  • the invention results indeed from the identification of blood markers of cancer, and thus allows detection of these pathologies without tissue biopsy, but only from blood samples.
  • the sample can be obtained by any technique known per se, for example by sampling, by non-invasive techniques, from collections or banks. samples, etc.
  • the sample may also be pre-treated to facilitate the accessibility of the target molecules, for example by lysis (mechanical, chemical, enzymatic, etc.), purification, centrifugation, separation, etc.
  • the PaxGene system is used (Feezor et al., Physiol Genomics 2004, pp. 247-254).
  • the sample can also be labeled, to facilitate the determination of the presence of the target molecules (fluorescent, radioactive, luminescent, chemical, enzymatic labeling, etc.).
  • the biological sample is a whole blood sample, that is to say having not undergone a separation step, which may optionally be diluted.
  • the invention is applicable to any mammal, preferably humans.
  • the method of the invention is particularly useful for the detection of breast cancer, including the presence, risk of development or stage of development of breast cancer in humans.
  • the data provided in the examples show that the invention makes it possible to detect the presence of breast cancer with a sensitivity greater than 92% and a specificity greater than 86%.
  • It is particularly suitable for screening for breast cancer at early stages, that is, at stages I or II (as defined in the classification of malignant tumors TNM ("Classification of Malignant Tumors") developed and maintained by UICC ("International Union against Cancer").
  • TNM classification is also used by the AJCC (American Joint Committee on Cancer) and FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics).
  • a particular object of the present application relates to a method for detecting the presence, evolution or risk of developing breast cancer in a human subject, comprising the combined determination of the presence (or absence or quantity thereof ( relative)), in a biological sample of the human subject, target molecules selected from: a) nucleic acids comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1-
  • the method comprises the combined determination of the presence, absence or quantity of 5, 10, 20, 30, 40, 50 or 60 target molecules as defined above.
  • Another particular object of the present application relates to a method for detecting the presence, evolution or risk of developing breast cancer in a human subject, comprising contacting a biological sample of the subject containing nucleic acids with a product comprising a support on which are immobilized nucleic acids comprising a sequence complementary to and / or specific to one or, preferably, several target molecules chosen from (i) nucleic acids comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1- 437 or a fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases and (ii) the nucleic acids having a sequence complementary to a sequence according to ), and determining the hybridization profile, the profile indicating the presence, the stage or the risk of developing breast cancer in said human subject.
  • the product comprises distinct nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different target molecules as mentioned above.
  • nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of one or, preferably, several target molecules selected from (i) nucleic acids comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1-437 or a fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases and (ii) the nucleic acids having a sequence complementary to a sequence according to (i).
  • the product comprises distinct nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different target molecules as mentioned above.
  • it comprises distinct nucleic acids comprising a sequence complementary and / or specific to one of the panels of markers as defined in the present application.
  • Another object of the present application relates to a product comprising a support on which is immobilized at least one, preferably several, nucleic acids comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-437, or a functional analogue thereof.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different nucleic acids selected from the nucleic acids mentioned above.
  • the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1-376.
  • a product comprising a support on which at least one ligand of a polypeptide encoded by a target nucleic acid as defined above, that is to say a nucleic acid comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1-437, a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, a nucleic acid having a complementary sequence thereof or a functional analogue thereof.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different polypeptide ligands selected from the polypeptides mentioned above.
  • the support can be any solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic acids or polypeptides.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, polystyrene, teflon, etc.
  • the reagents can be immobilized on the surface of the support by known techniques, or, in the case of nucleic acids, synthesized directly in situ on the support. Immobilization techniques include passive adsorption (Inouye et al., J. Clin Microbiol 28 (1990) 1469), the covalent bond.
  • the product of the invention comprises a plurality of synthetic oligonucleotides, of a length of between 5 and 100 bases, specific for one or more target nucleic acids defined in a) to c).
  • the products of the invention typically comprise control molecules for calibrating and / or normalizing the results.
  • kits comprising a compartment or container comprising at least one, preferably several, nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of a target nucleic acid as defined above and / or a , preferably several ligands of a target polypeptide as defined above.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more nucleic acids and / or different ligands selected from the nucleic acids and ligands mentioned above.
  • the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1-437 or a ligand for each of the target polypeptides as defined above.
  • the kit may furthermore comprise reagents for a hybridization or immunological reaction, as well as, if appropriate, controls and / or instructions.
  • Another subject of the invention relates to the use of a product or kit as defined above for the detection of a cancer in a mammalian subject, preferably a human subject, in particular breast cancer.
  • Another subject of the invention relates to a nucleic acid with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-437, or a distinctive fragment thereof comprising at least 15 consecutive bases, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30, or a nucleic acid having a sequence complementary thereto, or a functional analogue thereof.
  • the invention also relates to a cloning vector or expression comprising these nucleic acids, as well as any recombinant cell comprising such a vector or nucleic acid.
  • Another subject of the invention relates to the use of a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-437, or a distinctive fragment thereof comprising at least 15 consecutive bases, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30, or a nucleic acid having a complementary sequence thereof, or a functional analogue thereof, for the detection (essentially in vitro) of cancer in a mammalian subject .
  • a blood sample is taken from a mammal to be tested.
  • the blood sample is optionally processed to make the nucleic acids more accessible, and these are labeled.
  • the nucleic acids are then applied to a product as defined above and the hybridization profile is determined, to diagnose the presence or absence of cancer in the subject.
  • the method of the invention is simple, practiced ex vivo, and allows the early detection of cancer from a blood sample.
  • Figure 1 PCR amplification of DATAS cDNAs derived from Profiling # 1 (PBMN) using 10 pairs of semi-degenerate primers. DATAS profiling was performed in both directions (stage I & II cancers versus controls and controls against stage I & II cancers). A positive control using cDNA from HepG2 cells is included.
  • Figure 2 PCR amplification of DATAS cDNAs derived from Profiling # 2 (PBMO) using 10 pairs of semi-degenerate primers. DATAS profiling was performed in both directions (stage III & IV cancers versus controls and controls against stage III & IV cancers). A positive control using cDNA from HepG2 cells is included
  • Figure 3 PCR amplification of DATAS cDNAs derived from Profiling # 3 (PBMP) using 10 pairs of semi-degenerate primers. DATAS profiling was performed in both directions (stage I to IV cancers versus controls and controls against stage I to rV cancers). A positive control using cDNA from HepG2 cells is included.
  • Figure 4 Specific configuration of probes to measure the expression of variants generated by alternative splicing.
  • Probe A common to both isoforms, measures the expression of both variants.
  • Probe B specific for the additional sequence of the long form, as well as probes C and D, specific for the junction sequences around this additional sequence measure the expression of the long isoform.
  • the E probe specific for the junction resulting from the absence of the additional sequence, measures the expression of the short isoform.
  • Figure 5 Definition of the "target” sequences. 15 nucleotides on either side of each junction and up to 500 nucleotides for the additional and common upstream sequences are captured.
  • Figure 6 Sequences "targets and associated data. Description of the columns: idn °: identification number of the splicing event; Description: type of splicing event; long form: accession number of the long form; short form: accession number of the short form; target A to E: Sequences of targets A to E; long. : size of the sequences of the previous column.
  • Figure 7 Hierarchical clustering on 37 controls and 55 patients using 100 oligonucleotides.
  • RNA samples 5 ml of whole blood taken from two PaxGene tubes. These samples included 37 blood samples from healthy control patients (S, obtained from the French Blood Establishment) and 55 samples from patients with stage I / II breast cancer (CI / II). 2. Extraction of total RNA from the blood sample
  • RNA samples were collected directly into PAXGene -TM Blood RNA tubes (PreAnalytix, Hombrechtikon, CH). After the blood sample collection step and in order to obtain a total lysis of the cells, the tubes were left at ambient temperature for 4 h and then stored at -20 ° C. until the biological material was extracted. Specifically, in this protocol, total RNAs were extracted using PAXGene Blood RNA® kits (PreAnalytix) according to the manufacturer's recommendations. Briefly, the tubes were centrifuged (15 min, 3000 g) to obtain a nucleic acid pellet. This pellet was washed and taken up in a buffer containing proteinase K necessary for protein digestion (10 min at 55 ° C.).
  • RNAse free DNAse set Qiagen, Hilden, Germany.
  • the quality of the total RNAs was analyzed by the AGILENT 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany).
  • DATAS is a technology for profiling gene expression between two samples that allows characterizing qualitative differences in messenger RNAs, such as those generated by alternative splicing. This proprietary technology is described in US Patent 6,251,590.
  • RNAs corresponding to the two situations, one normal (mN) and the other pathological (mP) are isolated from the blood samples using the PAXgene system (PreAnalytix) described above. These RNAs (50 ⁇ g per group) are converted to complementary DNAs (cN) and (cP) using reverse transcriptase (RT) (Invitrogen) and a biotinylated oligodT25 oligonucleotide (Invitrogen). Samples contributing to 50 ⁇ g per group are shown in Tables A to F.
  • Hybrids mN / cP and cN / mP are then made in the liquid phase. After ethanol precipitation of mN and cP and cN and mP, the precipitates are taken up in 30 ⁇ l of hybridization solution containing 80% formamide and 0.1% SDS for incubation at 40 ° C overnight. The heteroduplexes are then captured using magnetic beads Streptavidin (Dynal). A magnet keeps the balls in the tube during rinsing operations. The beads / heteroduplexes are then taken up in 50 .mu.l of RNAseH buffer and incubated with RNaseH (Invitrogen) for 30 minutes at 37.degree. The supernatant is recovered after a new application of the magnet.
  • RNaseH Invitrogen
  • RNAsel action is removed by DNAsel action (Ambion). After inactivation of the enzyme, the fragments of RNAs are precipitated with ethanol and taken up in DEPC treated water supplemented with RNAse out (Ambion). The RNA fragments are then reverse transcribed (TaqMan Reverse transcription kit, Applied Biosystem) using random hexamer oligonucleotides. The complementary DNAs obtained are then amplified by PCR using semi-degenerate primers. 10 pairs of primers are generally used. The amplicons obtained can be visualized by agarose gel electrophoresis (FIGS. 1, 2 and 3). There are heterogeneous amplified populations of nature and intensity that vary according to the primers and the samples used.
  • amplified populations are cloned into a TOPO TA cloning vector (Invitrogen) to be transformed into a strain of competent E. coli bacteria (Invitrogen).
  • the colonies are subcultured into 96-well plates and grown overnight in 2XTY supplemented with ampicillin. A glycerol stock (50%) is then made.
  • 1728 clones were sequenced in the framework of DATAS profiling No. 1, 1920 were cloned and sequenced in the framework of DATAS profiling n ° 2 and 1920 were cloned and sequenced in the framework of DATAS profiling n ° 3.
  • Table G summarizes the number of clones characterized in the three profiling banks.
  • a so-called “singleton” clone means that the sequence of this clone has been identified only once in the bank and that no other clone covers this sequence.
  • a “cluster” is a group of clones whose sequences overlap. The three DATAS profilings generated 1741 non-redundant clones.
  • the 1741 DATAS clones could be associated with 1170 different genes, some non-overlapping DATAS fragments being associated with different regions of the same gene.
  • microarray splice variants require the use of a particular probe configuration.
  • Any reference messenger RNA / splice variant pair can be modeled as long isoform / short isoform ( Figure 4).
  • a splice variant associated with an exon skip will be the short isoform relative to the reference variant.
  • a splice variant with a new exon or intron retention will be the long isoform relative to the reference variant.
  • Other alternative splicing events (uses of 5 'or 3' splicing sites) can also be modeled in the same way.
  • the set of probes necessary for measuring the expression of splice variants is also indicated in FIG. 4.
  • This set consists of two traditional "exon" A and B probes and three exon-exon junction probes. or exon-intron C, D and E.
  • Probe A measures the expression of both isoforms
  • probes B, C and D express the long isoform
  • probe E expresses the short form.
  • the target sequences corresponding to the junction probes C, D and E are defined by a length of 30 nucleotides, 15 nucleotides on either side of the junction. It is thus possible to "cover" any junction by probes of 25 nucleotides of the type: 10/15, 11/14, 12/13, 13/12, 14/11 and 15/10 (the sign / representing the zone of junction).
  • the constraints are less strong on the "exonic" probes A and B.
  • the additional sequence, specific for the long form (sequence 2 of FIG.
  • sequence 1 of FIG. 4 defines the target sequences for these probes with however a ceiling of 500 nucleotides for sequences that may exceed this size.
  • the definition of the target sequences is summarized in Figure 5.
  • the 1170 genes corresponding to the 1741 DATAS clones were used to identify, for each of them, the cDNAs and ESTs represented in the public sequence data banks, potentially having qualitative differences. of sequences, source of splicing events. The events retained are located within 100 nucleotides with respect to the 5 'or 3' ends of the DATAS fragments.
  • This information includes, for a given event: an identification number of the event, the nature of the event, the access numbers of the long and short forms, the target sequences A to E and the size of these target sequences.
  • each event was characterized by its five A-E target sequences.
  • a and B 11 pairs of 25 nucleotide probes were designed, whereas the C, D, or E target sequences were detected with 6 pairs of 25 nucleotide probes.
  • pair of probes is meant a first probe that hybridises perfectly (this is called PM probes or perfect match) with one of the cDNAs from a target transcript, and a second probe, identical to the first probe at the same time. except for a mismatch (this is called a MM or mismatched probe) in the center of the probe.
  • PM probes or perfect match a first probe that hybridises perfectly
  • second probe identical to the first probe at the same time. except for a mismatch (this is called a MM or mismatched probe) in the center of the probe.
  • MM probe was used to estimate the background noise corresponding to a hybridization between two nucleotide fragments of non-complementary sequence.
  • the complementary DNAs (cDNAs) of the mRNAs contained in the total RNAs as purified above were obtained from 400 ng of total RNAs by using of a Klenow 3'-5'-exonuclease enzyme, 100 units of SuperScript II reverse transcription enzyme (Invitrogen), 10 units of RNAse H Superase-IN inhibitor (Ambion, Huntigdon, UK) and 200 pmol of "random" primer containing the T7 promoter (RP-T7-primer, Eurogenetec, Seraing, Belgium).
  • Reverse transcription was performed with 800 units of SuperScriptII (Invitrogen) and 10 units of an RNAse H inhibitor, in the presence of Klenow enzyme, for 1 h at 37 ° C.
  • the double-stranded cDNA resulting from this approach was then purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and quantified by spectrophotometry.
  • the fragmented cDNAs were then labeled with biotin using 330 units of terminal transferase (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) and 1 ⁇ l of DNA Labeling Reagent (DLR-Ia, 5mM) [Affymetrix] per microgram cDNA for 60 min at 37 ° C.
  • the entire fragmented and labeled cDNA was finally hybridized on the custom DNA chip (labeled "A520138F", cf Example 6) according to a standard hybridization protocol adapted to 11 ⁇ m chips.
  • RNA variants representing about 800 genes
  • hybridization buffer Affymetrix
  • oligonucleotides oligo B2
  • the biotinylated and hybrid cDNAs on the chip were revealed by the use of streptavidin-phycoerythrin solution and the signal was amplified by the use of anti-streptavidin antibodies.
  • Hybridization was performed in a GeneChip Hybridization oven (Affymetrix), and the Euk GE-WS2 protocol of Affymetrix was followed. The washing and revelation steps were carried out on a "Fluidics Station 450" station (Affymetrix). Each chip was then analyzed on an Affymetrix G3000 GeneArray Scanner scanner at a resolution of 1.5 microns to identify hybridized areas on the chip.
  • This scanner allows the detection of the signal emitted by the fluorescent molecules after excitation by an argon laser using the epifluorescence microscope technique. For each position, a signal is obtained which is proportional to the quantity of cDNAs fixed. The signal was then analyzed by GeneChip Operating Software (GCOS 1.2, Affymetrix). In order to prevent the variations obtained by the use of different chips, a standardization approach using the "Bioconductor” tool has been carried out, which makes it possible to harmonize the average distribution of the raw data obtained for each chip. The results obtained on one chip can then be compared to the results obtained on another chip.
  • the GCOS 1.2 software also included the inclusion of a statistical algorithm to consider whether a transcript was expressed or not.
  • the inventors have also studied the simultaneous expression of 100 nucleotide sequence transcripts chosen from the sequences presented in Table 2 to obtain an expression profile.
  • 89% of patients were correctly classified. More specifically, 31 of the 37 controls and 51 of 55 patients were correctly classified, which corresponds to a sensitivity of 92.7% and a specificity of 83.7%.
  • hierarchical clustering In this unsupervised analysis, a Control is positioned among the patients (to the left of the red dotted line, see Figure 7), and 10 patients are among the healthy controls (to the right of the red dotted line).
  • Figure 7 shows the hierarchical clustering analysis of blood samples obtained from 55 patients with early stage cancer (CI / II, also called D) and 37 patients (healthy donors) using the expression of 100 genes identified by algorithmic analysis.
  • the hierarchical clustering function of the Spotfire software organizes the CI / II patients and controls in columns, and genes in rows so as to obtain adjacent patients or genes with comparable expression profiles.
  • the Pearson correlation coefficient was used as a similarity index for genes and patients.
  • the results correspond to the Affymetrix fluorescence level normalized by the "bioconductor" tool.
  • the expression levels of each gene were normalized by calculating a reduced centered variable.
  • White represents low levels of expression, gray intermediate levels and black high levels.
  • the height of the branches of the dendrogram indicates the index of similarity between the expression profiles.
  • the inventors have demonstrated a combination of 66 markers, based on the sequences SEQ ID Nos: 5, 7, 13, 14, 16-20, 23-28, 47, 51-55, 58, 64, 69, 80, 81, 88-90, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 188-191, 208, 222, 225, 228, 229, 236, 240, 242, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300 and 309-312 (see Table 3). This combination correctly classifies more than 80% of the samples.
  • the inventors have also demonstrated a combination of 53 markers, based on the sequences SEQ ID Nos: 7, 13, 14, 16-19, 23-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89 , 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 228, 229, 240, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300, 310 and 312.
  • This combination also makes it possible to correctly classify more than 80% of the samples.
  • the inventors have also demonstrated a combination of 42 markers, based on the sequences SEQ ID Nos: 13, 16-19, 23, 26-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116 , 121, 125, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 229, 240, 248, 280, 281, 284, 299, 300, 310 and 312.
  • This combination also makes it possible to classify correctly more than 80% of the samples.
  • the inventors have demonstrated a combination of 22 markers, based on the sequences SEQ ID Nos: 18, 19, 23, 26, 27, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 161, 188, 225, 228, 240, 280 and 312. This combination correctly classifies 76% of the samples.
  • the inventors have also demonstrated a combination of 18 markers, based on the target sequences SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 and 312 shown in Table 3. This combination correctly classifies 76% of the samples.
  • Panel 1 includes all the sequences common to Panels 7-9.
  • Panel 11 comprises all the sequences common to all Panels 1 to 10, i.e. the nucleic acids comprising the sequences shown in SEQ ID NO: 23, 52, 53, 148 and 225 (see Table 4).
  • Table C Selected Samples for the Late Breast Cancer Group for DATAS # 2 (PBMO)
  • Table D Samples selected for the control group for DATAS # 2 (PBMO)
  • Table E Samples selected for the all-stage breast cancer group for DATAS # 3 (PBMP).
  • Table 1- List of 437 transcripts expressed differentially during the development of breast cancer.
  • Table 5 List of genes / transcripts identified from DATAS libraries derived from profiling the blood of breast cancer patients as being associated with immunity signaling pathways.
  • IFIT1 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1
  • NM 001008540 (CXCR4), variant 1 transcript, mRNA. 11/2005
  • LSP1 lymphocyte-specific protein 1
  • nuclear receptor subfamily 3 group C, member 1 (glucocorticoid receptor) (NR3C1),
  • ANXA11 Homo sapiens annexin A11 (ANXA11), transcript
  • NM 001175 beta (ARHGDIB), mRNA. 10/2005
  • IL8RB interleukin 8 receptor beta
  • NM 001629 activating protein (ALOX5AP), mRNA. 11/2005
  • CD97 antigen CD97
  • FTH 1 Homo sapiens ferritin, heavy polypeptide 1 (FTH 1),
  • MAP2K3 mitogen-activated protein kinase kinase 3
  • variant A transcript variant A transcript
  • NM 002985 (CCL5), mRNA. 11/2005
  • SP2 transcription factor SP2 transcription factor
  • tumor necrosis receptor factor superfamily member 14 (herpesvirus entry mediator)
  • NM 003820 (TNFRSF14), mRNA. 11/2005
  • NM 003853 protein (IL18RAP), mRNA. 10/2005
  • NM 004120 inducible GFP2
  • mRNA 9/2005 Homo sapiens colony stimulating factor receptor 3
  • CSF3R granulocyte
  • variant 4 transcript mRNA
  • NM 203346 vigilin (vigilin) (HDLBP), mRNA. 10/2005

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Abstract

La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la détection du cancer chez les mammifères, en particulier les humains. Elle décrit notamment des marqueurs sériques des cancers et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en œuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence ou l'évolution d'un cancer chez les mammifères, notamment du cancer du sein, y compris en phase précoce.

Description

Procédé de détection du cancer
La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la détection du cancer chez les mammifères, en particulier les humains. Elle décrit notamment des marqueurs sériques des cancers et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en œuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence ou l'évolution d'un cancer chez les mammifères, notamment du cancer du sein, y compris en phase précoce.
Chez la femme, le cancer du sein est la première cause de mortalité par cancer dans les pays industrialisés. L'âge est le facteur de risque le plus important. Ainsi, le risque augmente de 0,5% par année d'âge dans les pays occidentaux. D'autres facteurs de risques sont connus tels que le nombre des grossesses et l'âge de la première grossesse, l'allaitement, l'âge de la puberté et de la ménopause, les traitements oestrogéniques après la survenue de la ménopause, le stress et la nutrition.
Le diagnostic du cancer du sein est généralement effectué par mammographie. Toutefois, il est estimé que la taille minimale d'une tumeur repérable par mammographie est de 1 cm, ce qui présente un passé évolutif de 8 ans en moyenne lors du diagnostic. Les petites tumeurs sont beaucoup moins malignes que ce que l'on peut extrapoler de leurs tailles : l'agressivité des grosses tumeurs ne vient pas seulement de leurs tailles, mais aussi de leur « agressivité inhérente », qui augmente avec l'âge d'une tumeur (Bucchi et al., Br J Cancer 2005, p. 156-161 ; Norden T, Eur J Cancer 1997, p. 624-628).
Le bénéfice d'une mammographie a été démontré sur des centaines de milliers de patientes ces 30 dernières années. Toutefois, des biais existent dans ces tests, tels que une dépendance de la sensibilité à l'âge, à la prise d'hormones, au nombre de mammographies effectuées, à l'expérience du médecin et autres (voir Fletcher and Elmore, NEJM 2003, p. 1672f or Baines CJ, Breast J 2005, S7-10). L'analyse de l'expression d'un panel de gènes cibles est également pertinente dans la lutte contre le cancer du sein, et on peut citer notamment l'analyse d'un panel de 176 gènes qui sont exprimés de manière différentielle entre des patientes exprimant le récepteur ER et des patientes n'exprimant pas le récepteur ER (Bertucci et al, Human Molecular Genetics, 2000 ; 9 : 2981-2991). On peut citer également l'analyse d'un panel de 37 gènes qui permet de diagnostiquer un cancer du sein d'une façon précoce (Sharma et al, , Breast cancer Research 2005, 7 : R634-R644). Toutefois, les patientes incluses dans cette étude avaient toutes des soupçons d'une maladie mammaire (« suspect initial mammogram « ), et ce panel de gènes pourrait être mal adapté pour un test de routine de diagnostic du cancer du sein préalablement à toute mammographie.
Il existe donc un besoin important de disposer d'outils et de tests diagnostiques capables de détecter le cancer de manière fiable, simple et à un stade précoce.
La présente demande fournit un ensemble de marqueurs biologiques qui peuvent être utilisés, seuls ou en combinaison(s), de préférence en combinaison(s), pour détecter, caractériser ou suivre, de manière fiable, la présence ou l'évolution d'un cancer chez un mammifère, de préférence le cancer du sein. L'invention est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle peut être mise en œuvre à partir de sang total, sans nécessiter de biopsie tissulaire ni d'étapes de séparations.
Plus particulièrement, la présente demande résulte de l'identification de marqueurs génétiques sériques caractéristiques de patientes humaines présentant un cancer du sein. Ces marqueurs correspondent par exemple à des variations d'épissage ou de niveaux d'expression de gènes, et peuvent permettre, seuls ou, avantageusement, en combinaison, de détecter chez des patients la présence ou le stade d'évolution d'un cancer. Ils permettent avantageusement de détecter la présence d'un cancer du sein, dès les phases précoces de celui-ci (à savoir les stades I et II, c'est-à-dire notamment à un stade où une mammographie serait inefficace), de manière fiable et simple, à partir d'un échantillon de sang total. Ils peuvent également permettre de détecter des cancers du sein précoces non détectables par mammographie, car en deçà de son seuil de détection. Un objet de la présente demande concerne une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, d'une, de préférence plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1- 437 ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence (ou l'absence ou la quantité (relative)) de telles molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
Dans une variante particulière de mise en œuvre, la méthode comprend la détermination combinée de la présence ou absence ou quantité (relative) d'au moins 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou plus des molécules cibles telles que définies ci-dessus. La détermination "combinée" désigne le fait qu'un profil d'hybridation (ou une signature) impliquant plusieurs marqueurs est déterminé. La détermination combinée est typiquement réalisée de manière simultanée, c'est-à-dire par mesure globale d'un profil d'expression. Néanmoins, la détermination combinée peut également être effectuée par mesures en parallèle ou séquentielle de plusieurs marqueurs, conduisant à l'identification d'un profil. L'invention permet en effet d'établir et de déterminer un profil d'hybridation (ou une signature) sur un ensemble de marqueurs, afin d'évaluer la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère. Le profil d'hybridation est typiquement réalisé en utilisant une combinaison de plusieurs marqueurs choisis par les cibles indiquées ci-dessus, par exemple contenant l'ensemble de ces cibles.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, d'au moins 5 molécules cibles distinctes choisies parmi celles définies ci-dessus, de préférence d'au moins 10.
Dans des modes préférés de mise en œuvre, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de sous-ensembles particuliers de molécules cibles choisies parmi celles définies ci-dessus. De tels sous-ensembles, décrits dans les exemples, sont particulièrement adaptés à la détection, notamment en phase précoce, de la présence d'un cancer du sein chez des patientes à partir d'un échantillon de sang total.
Ainsi, dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques de l'ensemble d'un panel de cibles (ou signatures) comprenant des marqueurs tels que définis aux éléments a) à d) ci-dessus, de préférence de l'ensemble des molécules de l'un des panels 1 à 11 définis dans la présente demande.
Ainsi, dans un mode particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de l'ensemble des acides nucléiques du Panel 1, comprenant les séquences représentées dans le Tableau 4, colonne 1, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 et 312 (PANEL 2) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 27, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 161, 188, 225, 228, 240, 280 et 312 (PANEL 3) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux- ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 13, 16-19, 23, 26-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 229, 240, 248, 280, 281, 284, 299, 300, 310 et 312 (PANEL 4) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 7, 13, 14, 16-19, 23-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 228, 229, 240, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300, 310 et 312 (PANEL 5) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 5, 7, 13, 14, 16-20, 23-28, 47, 51-55, 58, 64, 69, 80, 81, 88-90, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 188-191, 208, 222, 225, 228, 229, 236, 240, 242, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300 et 309-312 (PANEL 6) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de l'ensemble des acides nucléiques du Panel 7, comprenant les séquences représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de l'ensemble des acides nucléiques du Panel 8, comprenant les séquences représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de l'ensemble des acides nucléiques du Panel 9, comprenant les séquences représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, de l'ensemble des acides nucléiques du Panel 10, comprenant les séquences représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un autre mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID No: 23, 52, 53, 148 et 225 (PANEL 11), ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou ayant une séquence complémentaire de celles-ci et/ou des analogues fonctionnels de ceux-ci provenant d'autres espèces, et/ou des polypeptides codés par ces acides nucléiques. Les exemples fournis dans la présente demande montrent en effet que ce panel de marqueurs permet de détecter de manière prédictive la présence, le risque de développer ou le stade d'évolution d'un cancer. Dans un mode particulier, la méthode comprend en outre la détection d'une ou plusieurs des autres molécules cibles telles que définies précédemment.
Dans un mode spécifique de mise en œuvre, la méthode de l'invention comprend la détermination de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du mammifère, des acides nucléiques comprenant respectivement les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 1-437 ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, ou des acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de celles-ci.
Un autre objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans l'un des PANELS 1 à 11 tels que définis ci-avant, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Par ailleurs, l'analyse des différents gènes identifiés dans l'invention, dont l'expression est altérée chez les patients, montre qu'ils appartiennent à des familles de gènes impliquées dans des voies de signalisation cellulaire ou dans des mécanismes de régulation communs. Ainsi notamment, cette analyse fait apparaître de nombreux gènes impliqués dans les cascades de signalisation mises en œuvre dans la transduction des messages initiés par la stimulation des TLRs, dans la sécrétion de cytokines ou dans l'activation des lymphocytes T. L'invention met ainsi en évidence que des altérations dans ces cascades de signalisation se produisent chez les patients atteints de cancer, et que tout gène ou ARN participant à ces cascades ou toute dérégulation dans ces gènes ou ARN peut constituer un marquer de la présence ou de la prédisposition au cancer. De telles altérations peuvent se produire lors du stress oxydatif imposé par les cellules tumorales aux monocytes, aux macrophages et aux cellules dendritiques. Ce stress fait partie des conséquences des différentes interactions cellulaires qui se produisent entre le système immunitaire et les cellules cancéreuses au niveau de la tumeur. La mise en évidence, dans la circulation sanguine, d'événements moléculaires révélateurs des altérations des cascades de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires représente donc un nouvel outil et une nouvelle approche permettant de mettre en évidence la présence d'une tumeur dans l'organisme à partir d'un prélèvement sanguin.
Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN participant à une voie de signalisation impliquée dans la réponse immunitaire (innée ou acquise), la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère. La voie de signalisation impliquée dans la réponse immunitaire est avantageusement choisie parmi la stimulation des TLRs, la sécrétion de cytokines, ou l'activation des lymphocytes T.
La stimulation première des cellules dendritiques représente la réponse innée et se fait par l'intermédiaire des récepteurs toll-like (TLRs). De multiples TLRs réagissent à différents ligands qui peuvent être portés par des pathogènes ou des cellules tumorales et induisent la production de différentes cytokines pro-inflammatoires par les cellules dendritiques. Ce phénomène s'accompagne d'une présentation des antigènes aux cellules T naïves, initiant ainsi une réponse immunitaire acquise spécifique. Parmi les acteurs moléculaires de ces cascades de signalisation, on peut ainsi citer préférentiellement les récepteurs, les adaptateurs, les enzymes, les facteurs impliqués dans la régulation de l'expression des gènes, les chemokines, les cytokines et les interleukines.
Un objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter in vitro ou ex vivo la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN impliqué dans la régulation de la cascade de signalisation contrôlant le phénomène de l'immunité innée. Plus particulièrement, ce phénomène mobilise la cascade initiée par les TLRs et régule l'activité des cellules macrophagiques et dendritiques.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter in vitro ou ex vivo la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN impliqué dans la régulation de la cascade de signalisation contrôlant le phénomène de l'immunité acquise ou adaptative. Plus particulièrement, ce phénomène implique les récepteurs des lymphocytes T (TCRs).
Encore un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter in vitro ou ex vivo la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN impliqué dans la transition, la coordination entre les immunités innées et acquises. Plus particulièrement ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse de molécules lipidiques à partir de précurseurs tels que l'acide arachidonique.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN impliqué dans la stimulation des TLRs, dans la sécrétion de cytokines, ou dans l'activation des lymphocytes T, ledit gène ou ARN étant avantageusement sélectionné parmi les récepteurs, les adaptateurs, les enzymes, les facteurs impliqués dans la régulation de l'expression des gènes, les chemokines, les cytokines et les interleukines, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
L'altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention toute altération de l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans l'épissage conduisant à l'apparition de formes épissées particulières, ou à une modification de la quantité (relative) ou du rapport entre les différentes formes d'épissage.
Comme il sera décrit dans la suite du texte, la présente demande décrit l'identification de dérégulations de l'épissage des acteurs des cascades de signalisation impliquées dans les immunités innées et acquises dans le sang de patients atteints de cancer (Tableau 5). Des oligonucléotides, dérivés des séquences d'ARN dont les expressions sont affectées par altération de l'épissage peuvent être déposés ou synthétisés sur tout support solide et hybrides avec des sondes nucléiques dérivées de sang contrôle et de sang de patients atteints de cancer permettant de sélectionner les oligonucléotides les plus discriminants. De façon plus large, les oligonucléotides peuvent être choisis comme représentatifs de tout ARNm codant pour toute protéine impliquée dans les immunités innées et acquises. Plus particulièrement, ces oligonucléotides peuvent dériver des gènes indiqués dans le tableau 6. Les altérations peuvent également être détectées au niveau de la structure ou des niveaux d'expression des polypeptides codés par ces gènes ou ARN, par exemple au moyen d'anticorps spécifiques, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans au moins un, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 gènes ou ARN correspondants indiqués dans le Tableau 5, en particulier d'un altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
Un autre objet particulier de l'invention réside donc dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans au moins un, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 gènes ou
ARN correspondants indiqués dans le Tableau 6, en particulier d'un altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
Molécule Cible
La présente invention repose sur la mise en évidence et la caractérisation d'événements biologiques sériques caractéristiques de la présence d'un cancer du sein chez un patient humain. Ces événements constituent des (bio)marqueurs, dont la détection chez un patient permet, de préférence en combinaison, de déterminer, même à un stade précoce, le risque de développer un tel cancer ou la présence d'un tel cancer. Au sens de l'invention, les termes marqueurs et transcrits sont utilisés de manière interchangeable, sauf lorsque le contexte leur donne un sens spécifique.
Les événements biologiques identifiés correspondent typiquement à des modifications dans la régulation de l'expression de gènes. Il peut s'agir d'une inhibition partielle ou totale de l'expression de gènes ou d'ARN, ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, d'une augmentation de l'expression de gènes ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, de l'apparition ou de la disparition de formes d'épissages de gènes, etc.
L'invention repose donc sur la détection, dans un échantillon, d'une ou plusieurs molécules cibles représentatives des événements biologiques ainsi identifiés. Comme indiqué précédemment, ces molécules cibles peuvent être choisies parmi : a) les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1- 437 ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c).
La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de I1ARN ou de la protéine correspondant aux séquences SEQ ID NOs: 1-437, ou un fragment distinctif de celle-ci, c'est-à-dire un fragment dont la séquence est spécifique dudit gène ou ARN, ou de la dite protéine, et/ou comporte un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.) représentatif de l'événement biologique à détecter. La liste complète des marqueurs, ainsi que les gènes correspondants sont indiqués dans le tableau 1.
Le terme « analogue fonctionnel » désigne un analogue provenant d'une autre espèce de mammifère. En effet, les séquences SEQ ID NOs: 1-437 ont été identifiées à partir de sujets humains, et ces séquences constituent des marqueurs efficaces et adaptés à la détection du cancer chez les patients humains. Néanmoins, pour une application des méthodes de l'invention à d'autres espèces de mammifères, il est généralement préférable d'utiliser des analogues fonctionnels de ces séquences, caractérisés dans l'espèce considérée. Ces analogues peuvent être identifiés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment en considération des séquences fournies dans la demande et des noms des gènes correspondants.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c).
Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode est utilisée pour détecter un cancer chez un sujet humain et comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) ou b). Plus préférentiellement encore, la méthode comprend la détection combinée de la présence (ou absence) ou de la quantité (relative ou absolue) d'un panel de marqueurs cibles, tels que définis dans la présente demande (Panels 1 à 11 ou Tableaux 5 et 6).
Un mode de réalisation particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la détermination combinée de la présence ou de la quantité (relative ou absolue), dans un échantillon de sang du mammifère, d'un ensemble de molécules comprenant au moins les molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences du PANEL 1 ou 11 représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, et/ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence de telles molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Un mode de réalisation particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la détermination combinée de la présence ou de la quantité, dans un échantillon de sang du mammifère, des molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 et 312 (PANEL 2) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, et/ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence de telles molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Un mode de réalisation particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la détermination combinée de la présence ou de la quantité, dans un échantillon de sang du mammifère, des molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences du PANEL 10 représentées dans le Tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, et/ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence de telles molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Un autre objet spécifique de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la détection, dans un échantillon de sang du mammifère, des molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 et 312 (PANEL 2) ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, et/ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence, l'absence ou la quantité (relative) de ces molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
L'invention permet également la définition de panels supplémentaires, comprenant au moins certains marqueurs tels que définis précédemment, qui peuvent éventuellement être combinés à d'autres marqueurs. De tels panels peuvent être obtenus en testant la présence ou non de ces marqueurs dans des échantillons de patients, pour définir d'autres combinaisons prédictives, le cas échéant spécifiques de pathologies particulières.
Détection d'un acide nucléique
Différentes techniques permettant la détection d'une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence ou de la quantité (relative) d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective. L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Dans un mode particulièrement avantageux, on utilise plusieurs oligonucléotides (ou sondes) différents pour détecter la même molécule cible. Il peut s'agir d' oligonucléotides spécifiques de régions différentes de la même molécule cible, ou centrés différemment sur un même région. On peut également utiliser des couples de sondes, dont un membre est parfaitement apparié à la molécule cible, et un autre présente un mésappariement, permettant ainsi d'estimer le bruit de fond. Dans les exemples qui suivent, on a utilisé 6 à 11 couples d'oligonucléotides de 25 bases pour chaque molécule cible.
Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.
Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection d'un cancer chez un sujet. De manière particulièrement préférée, on utilise un ensemble de sondes nucléiques comprenant tout ou un fragment de 15 bases consécutives au moins, de préférence de 17,
19, 20, 22 ou 25 bases consécutives au moins, de chacune des séquences SEQ ID NO : 1-
437, ou d'un brin complémentaire de celles-ci, avantageusement immobilisées sur un support. L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, CoId Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63 °C pendant 2 à 18 heures sur des supports de basse densité D'autres conditions d'hybridation peuvent être nécessaires pour des supports de haute densité, comme une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCl ou du EDTA peuvent également être utilisés.
Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C pendant 30 min.
Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes
(typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65 °C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléique de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65°C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon ainsi que par ajout de substances auxiliaires comme le formamide ou de l'ADN simple brin.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles suivantes au moins: a) les acides nucléiques comprenant les séquences de l'un des panels 1 à 11 définis précédemment, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer du sein chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans l'un des PANELS 1, 2 10 ou 11 tels que définis ci-avant, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez ce mammifère.
Dans des modes particuliers de mise en œuvre, les procédés de l'invention utilisent en outre d'autres molécules cibles et/ou d'autres sondes, notamment les sous-ensembles de molécules cibles mentionnés dans la présente demande. Ainsi, un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique d'au moins deux molécules distinctes choisies parmi les cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs: 1-437 ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
Le profil d'hybridation peut être comparé à un ou plusieurs profils de référence, notamment un profil de référence caractéristique de sujets sains et/ou de sujets atteints de cancer, la comparaison permettant de déterminer la probabilité ou le risque que le patient testé soit atteint d'un cancer. Typiquement, la comparaison est réalisée au moyen de programmes informatiques connus en soi de l'homme du métier.
L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible selon SEQ ID NO : 1-437, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'un cancer chez un sujet.
A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un ou, de préférence plusieurs gènes ou ARN comprenant une séquence cible selon SEQ ID NO : 1-437, pour la détection d'un cancer chez un mammifère, de préférence du cancer du sein, tout particulièrement chez un être humain.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble d'amorces spécifique d'au moins deux molécules distinctes choisies parmi les cibles suivantes: a) les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID NOs:
1-437 ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'amplification, le profil d'amplification étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
Détection d'un polvpeptide
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence d'un polypeptide selon d). La mise en évidence d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence du polypeptide cible dans l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc.
Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al., Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al., Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter un cancer.
Mise en œuyre du procédé
La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides.
Dans un mode de mise en œuvre préféré et particulièrement avantageux, l'échantillon est un échantillon de sang ou plasma. L'invention découle en effet de l'identification de marqueurs sanguins du cancer, et permet donc une détection de ces pathologies sans biopsie tissulaire, mais uniquement à partir de prélèvements sanguins.
L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour iàciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. Avantageusement, on utilise le système PaxGene (Feezor et al., Physiol Genomics 2004, : pp. 247-254). L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.).
Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon biologique est un échantillon de sang total, c'est-à-dire n'ayant pas subi d'étape de séparation, qui peut être éventuellement dilué.
L'invention est applicable à tout mammifère, de préférence les humains. La méthode de l'invention est particulièrement utile pour la détection du cancer du sein, notamment de la présence, du risque de développement ou du stade de développement du cancer du sein chez l'être humain. Ainsi, les données fournies dans les exemples montrent que l'invention permet de détecter la présence d'un cancer du sein avec une sensibilité supérieure à 92% et une spécificité supérieure à 86%. Elle est particulièrement adaptée au dépistage du cancer du sein à des stades précoces, c'est-à-dire aux stades I ou II (tels que définis dans la classification des tumeurs malignes TNM ("Classification of Malignant Tumours") développée et maintenue par l'UICC ("International Union Against Cancer")). La classification TNM est également utilisée par l'AJCC ("American Joint Committee on Cancer") et par la FIGO ("International Fédération of Gynecology and Obstetrics").
Un objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence, l'évolution ou le risque de développer un cancer du sein chez un sujet humain, comprenant la détermination combinée de la présence (ou de l'absence ou de la quantité (relative)), dans un échantillon biologique du sujet humain, de molécules cibles choisies parmi: a) les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-
437 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), et c) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) ou b).
De préférence, la méthode comprend la détermination combinée de la présence, absence ou quantité de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 molécules cibles telles que définies ci-dessus.
Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence, l'évolution ou le risque de développer un cancer du sein chez un sujet humain, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du sujet contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'une ou, de préférence, plusieurs molécules cibles choisies parmi (i) les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-437 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives et (ii) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon (i), et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence, le stade ou le risque de développer un cancer du sein chez ledit sujet humain. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus molécules cibles différentes telles que mentionnées ci-dessus.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'une ou, de préférence, plusieurs molécules cibles choisies parmi (i) les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-437 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives et (ii) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon (i). De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus molécules cibles différentes telles que mentionnées ci-dessus. De préférence, il comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique de l'un des panels de marqueurs tels que définis dans la présente demande.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-437, ou un analogue fonctionnel de celles-ci.
De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1-376.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un acide nucléique cible tel que défini ci-dessus, c'est-à-dire un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-437, un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci-dessus.
Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403. Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs acides nucléiques cibles définis en a) à c).
Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un acide nucléique cible tel que défini ci- dessus et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un polypeptide cible tel que défini précédemment. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1-437 ou un ligand pour chacun des polypeptides cibles tels que définis ci-dessus. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection d'un cancer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain, en particulier du cancer du sein.
Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique de séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1-437, ou un fragment distinctif de celles-ci comprenant au moins 15 bases consécutives, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci. L'invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression comportant ces acides nucléiques, ainsi que toute cellule recombinante comprenant un tel vecteur ou acide nucléique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1-437, ou un fragment distinctif de celles-ci comprenant au moins 15 bases consécutives, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, pour la détection (essentiellement in vitro) d'un cancer chez un sujet mammifère.
Selon un exemple particulier de mise en œuvre de l'invention, on prélève un échantillon de sang d'un mammifère à tester. L'échantillon de sang est éventuellement traité de manière à rendre les acides nucléiques plus accessibles, et ceux-ci sont marqués. Les acides nucléiques sont ensuite appliqués sur un produit tel que défini ci-avant et le profil d'hybridation est déterminé, permettant de diagnostiquer la présence ou non d'un cancer chez le sujet. La méthode de l'invention est simple, pratiquée ex vivo, et permet la détection précoce d'un cancer à partir d'un échantillon de sang.
II est entendu que toute technique équivalente peut être utilisée dans le cadre de la présente demande pour déterminer la présence d'une molécule cible.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Amplification par PCR des cDNAs DATAS issus du profilage n°l (PBMN) à l'aide de 10 couples d'amorces semi-dégénérées. Le profilage DATAS a été effectué dans les deux directions (cancers stade I & II contre contrôles et contrôles contre cancers stade I & II). Un contrôle positif à l'aide de cDNA issu de cellules HepG2 est inclus.
Figure 2 : Amplification par PCR des cDNAs DATAS issus du profilage n°2 (PBMO) à l'aide de 10 couples d'amorces semi-dégénérées. Le profilage DATAS a été effectué dans les deux directions (cancers stade III & IV contre contrôles et contrôles contre cancers stade III & IV). Un contrôle positif à l'aide de cDNA issu de cellules HepG2 est inclus Figure 3 : Amplification par PCR des cDNAs DATAS issus du profilage n°3 (PBMP) à l'aide de 10 couples d'amorces semi-dégénérées. Le profilage DATAS a été effectué dans les deux directions (cancers stade I à IV contre contrôles et contrôles contre cancers stade I à rV). Un contrôle positif à l'aide de cDNA issu de cellules HepG2 est inclus Figure 4 : Configuration spécifique de sondes pour mesurer l'expression de variants générés par épissage alternatif. La sonde A , commune aux deux isoformes mesure l'expression des deux variants. La sonde B, spécifique de la séquence additionnelle de la forme longue, ainsi que les sondes C et D, spécifiques des séquences de jonction autour de cette séquence additionnelle mesurent l'expression de l'isoforme longue. La sonde E, spécifique de la jonction issue de l'absence de la séquence additionnelle, mesure l'expression de l'isoforme courte.
Figure 5: Définition des séquences "cibles". 15 nucléotides de part et d'autre de chaque jonction et jusqu'à 500 nucléotides pour les séquences additionnelle et commune en amont sont captures. Figure 6: Séquences « cibles et données associées. Description des colonnes : idn° : n° d'identification de l'événement d'épissage ; Description : type d'événement d'épissage ; forme longue : n° d'accession de la forme longue ; forme courte : n° d'accession de la forme courte ; cible A à E : Séquences des cible A à E ; long. : taille des séquences de la colonne précédente. Figure 7 : Clustering hiérarchique sur 37 contrôles et 55 patientes en utilisant 100 oligonucléotides.
EXEMPLES
1. Caractéristiques des échantillons biologiques
Les exemples présentés ci après ont été réalisés initialement à partir de 92 échantillons sanguins ( 5 ml de sang total, prélevé dans deux tubes PaxGene). Ces échantillons regroupaient 37 échantillons sanguins provenant de patientes contrôles saines (S, obtenus de l'Etablissement Français du Sang) et 55 échantillons de patientes atteintes d'un cancer du sein aux stades I/II (CI/II). 2. Extraction des ARN totaux de l'échantillon sanguin
Les prélèvements sanguins ont été collectés directement dans des tubes PAXGene -TM Blood RNA (PreAnalytix, Hombrechtikon, CH). Après l'étape de prélèvement de l'échantillon sanguin et afin d'obtenir une lyse totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 h puis conservés à -20°C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus précisément, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXGene Blood RNA® (PreAnalytix) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (15 min, 3000 g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min à 55°C). Une nouvelle centrifugation (5 min, 19 000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin column et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNAse free DNAse set (Qiagen, Hilden, Allemagne). La qualité des ARN totaux a été analysée par le bioanalyzer AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne).
3. Expériences de profilage DATAS
Trois séries de profilage « DATAS » ont été effectuées entre les groupes suivants :
DATAS n°l : Cancers du sein précoces (Stade I et II) contre groupe Contrôle (étude
PBMN)
DATAS n°2 : Cancers du sein tardifs (Stade III et IV) contre groupe Contrôle (étude
PBMO)
DATAS n°3 : Cancers du sein (Stade I, II, III et IV) contre groupe Contrôle (étude PMNP)
DATAS est un technologie de profilage de l'expression génétique entre deux échantillons qui permet de caractériser les différences qualitatives au niveau des ARNs messagers, telles que celles générées par épissage alternatif. Cette technologie propriétaire est décrite dans le brevet US 6,251,590.
Les ARNs totaux correspondant aux deux situations, l'une normale (mN) et l'autre pathologique (mP), sont isolés à partir des échantillons sanguins à l'aide du système PAXgene (PreAnalytix) décrit ci-dessus. Ces ARNs (50 μg par groupe) sont convertis en ADN complémentaires (cN) et (cP) à l'aide de reverse transcriptase (RT) (Invitrogen) et d'un oligonucleotide oligodT25 biotinylé (Invitrogen). Les échantillons ayant contribué aux 50 μg par groupe sont indiqués dans les tableaux A a F.
Des hybrides mN/cP et cN/mP sont ensuite réalisés en phase liquide. Après précipitation à l'éthanol de mN et cP et de cN et mP, les précipitats sont repris dans 30 μl de solution d'hybridation contenant 80% formamide et 0.1% SDS pour une incubation à 40°C sur la nuit. Les hétéroduplexes sont ensuite capturés à l'aide de billes magnétiques Streptavidine (Dynal). Un aimant permet de maintenir les billes dans le tube pendant les opérations de rinçage. Les billes / hétéroduplexes sont alors reprises dans 50 μl de tampon RNAseH et incubées avec la RNaseH (Invitrogen) 30 minutes à 37°C. Le surnageant est récupéré après une nouvelle application de l'aimant. L' ADN résiduel est éliminé par action de la DNAsel (Ambion). Après inactivation de l'enzyme, les fragments d'ARNs sont précipités à l'éthanol et repris dans de l'eau traitée au DEPC supplémentée de RNAse out (Ambion). Les fragments d'ARNs sont ensuite reverse transcrits (kit Reverse transcription TaqMan, Applied Biosystem) à l'aide d'oligonucléotides hexamères aléatoires. Les ADNs complémentaires obtenus sont alors amplifiés par PCR à l'aide d'amorces semi- dégénérées. 10 couples d'amorces sont généralement utilisés. Les amplicons obtenus peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 1, 2 et 3). On observe des populations amplifiées hétérogènes de nature et d'intensité qui varient selon les amorces et les échantillons utilisés.
Ces populations amplifiées sont clones dans un vecteur de clonage TOPO TA (Invitrogen) pour être transformés dans une souche de bactéries E. CoIi compétentes (Invitrogen). Les colonies sont repiquées dans des plaques 96 puits et cultivées sur la nuit dans un milieu 2XTY supplémenté d'ampicilline. Un stock glycérolé (50%) est alors effectué. Généralement, on repique une plaque 96 puits par couple d'amorce pour une des deux directions. Cela fournit ainsi 96x10x2 = 1920 colonies à caractériser.
1728 clones ont été séquences dans le cadre du profilage DATAS n°l, 1920 ont été clones et séquences dans le cadre du profilage DATAS n° 2 et 1920 ont été clones et séquences dans le cadre du profilage DATAS n° 3.
4. Analyse Bioinformatique
Le tableau G récapitule le nombre de clones caractérisés dans les trois banques de profilage. Un clone qualifié de « singleton » signifie que la séquence de ce clone n'a été identifiée qu'une seule fois dans la banque et qu'aucun autre clone ne recouvre cette séquence. Un « cluster » correspond à un groupe de clones dont les séquences se chevauchent. Les trois profilages DATAS ont ainsi générés 1741 clones non redondants.
Tableau G : Caractérisation des clones obtenus au sein des trois banques DATAS
Figure imgf000033_0001
Une analyse bio informatique a été effectuée sur les 1741 clones afin d'identifier les gènes auxquels ils sont associés et les événements d'épissage connus dans les banques publiques d'acides nucléiques correspondants.
Ainsi, les 1741 clones DATAS ont pu être associés à 1170 gènes différents, certains fragments DATAS non chevauchant étant associés à différentes régions du même gène.
5. Sélection et dessin des événements cibles pour le dessin du microarray La détection et la quantification de l'expression de variants d'épissage par microarray nécessite l'utilisation d'une configuration de sondes particulière. Tout couple ARN messager de référence / variant d'épissage peut être modélisé en tant que Isoforme longue / Isoforme courte (Figure 4). Ainsi, un variant d'épissage associé à un saut d'exon sera l'isoforme courte par rapport au variant de référence. Un variant d'épissage comportant un nouvel exon ou une rétention d'intron sera l'isoforme longue par rapport au variant de référence. Les autres événements d'épissage alternatifs (utilisations de sites cryptiques 5' ou 3' d'épissage) peuvent également être modélisés de la même manière.
Le jeu de sondes nécessaire à la mesure de l'expression de variants d'épissage est également indiqué sur la figure 4. Ce jeu est composé de deux sondes « exoniques » traditionnelles A et B et de trois sondes de jonction de type exon-exon ou exon-intron C, D et E. La sonde A mesure l'expression des deux isoformes, les sondes B, C et D l'expression de l'isoforme longue et la sonde E l'expression de la forme courte.
Afin de concevoir toutes ces sondes, il est nécessaire d'identifier les événements d'épissage correspondant aux fragments DATAS, puis les régions « cibles » à partir desquelles seront dessinées les sondes. Les séquences cibles correspondant aux sondes de jonction C, D et E sont définies par une longueur de 30 nucléotides, 15 nucléotides de part et d'autre de la jonction. Il est ainsi possible de « couvrir » toute jonction par des sondes de 25 nucléotides de type : 10/15, 11/14, 12/13, 13/12, 14/11 et 15/10 ( le signe / représentant la zone de jonction). Les contraintes sont moins fortes sur le sondes « exoniques » A et B. La séquence additionnelle, spécifique de la forme longue (séquence 2 de la figure 4) et la séquence commune en amont du site d'épissage (séquence 1 de la figure 4) définissent les séquences cibles pour ces sondes avec toutefois un plafond de 500 nucléotides pour les séquences pouvant dépasser cette taille. La définition des séquences cibles est résumée figure 5.
Ainsi, les 1170 gènes correspondant aux 1741 clones DATAS ont été utilisés pour identifier, pour chacun d'entre eux les cDNAs et ESTs représentés dans les banques publiques de données de séquences, présentant potentiellement des différences qualitatives de séquences, source d'événements d'épissages. Les événements retenus sont localisés à moins de 100 nucléotides par rapport aux extrémités 5' ou 3' des fragments DATAS.
2108 événements ont ainsi été retenus et répertoriés dans un classeur Excel dont une partie décrivant les informations extraites est représentée sur la figure 6. Ces informations comprennent, pour un événement donné : un numéro d'identification de l'événement, la nature de l'événement, les numéros d'accès des formes longues et courtes, les séquences cibles A à E et la taille de ces séquences cibles.
Un contrôle qualité strict a été appliqué pour la définition de ces séquences. Les ambiguités sur certains nucléotides ont été corrigées en les substituant par les nucléotides correspondant sur l'ARN de référence RefSeq ou à partir de l'ADN génomique. Toutes les séquences cibles ont été réalignées afin de confirmer leur appartenance aux formes courtes ou longues appropriées.
6. Dessin des sondes et de la puce
Afin de pouvoir mesurer l'expression des 2108 événements décrits précédemment, une puce à ADN à façon a été conçue. Sur cette puce, chaque événement était caractérisé par ses cinq séquences cibles A-E. Pour chaque séquence A et B, 11 couples de sondes de 25 nucléotides ont été conçus, alors que les séquences cibles du type C, D, ou E ont été détectées avec 6 couples de sondes de 25 nucléotides.
Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridait parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ADNc issus d'un transcrit cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariement (on parle alors de sonde MM ou mismatched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithme Référence Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat. Genêt. 1 Suppl., 20-24). Si le design d'au moins 6 sondes pour les séquences A et B ou d'au moins 4 sondes pour les séquences C, D, et E était impossible, ces séquences ne figuraient pas sur la puce à façon. Une telle situation peut résulter de séquences de basse complexité, contenant des structures répétitives ou des structures « hairpin » consécutives ou non-consécutives. Une taille de séquences A-E inférieure à 30 nucléotides menait également à l'exclusion de ces sondes. Uniquement les séquences de bonne qualité, orientées en direction 5' -> 3', servaient pour les design des sondes effectuées selon les consignes d'Affymetrix.
7. Synthèse d'ARNc, obtention et marquage des ADNc et fragmentation
Afin d'analyser l'expression des transcrits cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux tels que purifiés ci dessus, ont été obtenus à partir de 400 ng d'ARN totaux par l'utilisation d'une enzyme de Klenow 3'-5'-exonuclease, de 100 unités de l'enzyme de transcription reverse SuperScript II (Invitrogen), 10 unités de l'inhibiteur de la RNAse H Superase-IN (Ambion, Huntigdon, UK) et 200 pmol d'amorce « random » contenant le promoteur T7 (RP-T7-primer, Eurogenetec, Seraing, Belgique).
La totalité des ADNc ainsi obtenue a ensuite été engagée dans une transcription in-vitro, qui a été effectuée avec un kit MEGAscript T7 (Ambion) pendant 16h à 37°C. L' ARNc résultant a été ultérieurement purifié sur colonne avec un RNeasy Mini kit (Invitrogen), et la qualité de l'ARNc obtenu a été analysée par le bioanalyzer AGILENT 2100. Les ARNc purifiés ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie, et la solution d'ARNc a été ajustée à une concentration de 1,24 μg/μl d'ARNc. Vingt-six microgrammes d'ARNc ont ensuite été dispatchés sur deux tubes Eppendorf, et 3 μg d'amorces « random » sont ajoutés à chaque tube. La transcription reverse a été effectuée avec 800 unités de SuperScriptlI (Invitrogen) et 10 unités d'un inhibiteur de la RNAse H, en présence d'enzyme de Klenow, pendant Ih à 37°C. L'ADNc à double-brin résultant de cette approche a ensuite été purifié à l'aide du QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) et quantifié par spectrophotométrie. Seize microgrammes d'ARNc, repartis sur trois tubes Eppendorf, ont ensuite été fragmentés avec 0.6 unités de DNAse I par tube pendant 10 minutes à 37°C. L'efficacité de la fragmentation a été vérifiée à l'aide du bioanalyzer 2100 (Agilent). Les ADNc fragmentés ont ensuite été marqués avec de la biotine en utilisant 330 unités du terminale transferase (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) et 1 μl de DNA Labeling Reagent (DLR-Ia, 5 mM) [Affymetrix] par microgramme de ADNc pendant 60 min à 37°C.
La totalité d'ADNc fragmenté et marqué a finalement été hybridée sur la puce à ADN à façon (intitulée « A520138F », cf exemple 6) selon un protocole d'hybridation standard adapté à des puces 11 μm.
8. Mise en évidence de profils d'expression pour le diagnostic du cancer du sein à partir d'échantillon sanguins
8.1. Mise en évidence d'un profil d'expression des transcrits permettant de discriminer les patientes Contrôles (S) des patientes atteintes d'un cancer en stade I/II
L'expression d'environ 2000 variants d'ARN, représentant environ 800 gènes, a été analysée et comparée entre des patientes S et C I/II. Pour cela, 16 μg d'ADNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 μl de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à 50°C sur des puces d'expression. Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de lavage, des ARN qualifiés de « contrôle » biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (oligo B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, les ADNc biotinylés et hybrides sur la puce, ont été révélés par l'utilisation d'une solution de streptavidine-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti- streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation « GeneChip Hybridisation oven » (Affymetrix), et le protocole Euk GE-WS2 du protocole d' Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station « Fluidics Station 450 » (Affymetrix). Chaque puce a ensuite été analysée sur un scanner Affymetrix G3000 GeneArray Scanner à une résolution de 1,5 microns afin de repérer les zones hybridées sur la puce. Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité d'ADNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel GeneChip Operating Software (GCOS 1.2, Affymetrix). Afin de prévenir les variations obtenues par l'utilisation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normalisation utilisant l'outil « Bioconductor », qui permet d'harmoniser la distribution moyenne des données brutes obtenues pour chaque puce. Les résultats obtenus sur une puce peuvent alors être comparés aux résultats obtenus sur une autre puce. Le logiciel GCOS 1.2 permettait aussi d'inclure un algorithme statistique pour considérer si un transcrit était exprimé ou non.
A partir des 6.242 groupes de sondes, représentant environ 2.000 transcrits, de la puce, les inventeurs ont sélectionné les transcrits pertinents qui étaient corrélés au développement d'un cancer du sein. Les transcrits qui ont un niveau d'expression trop iàible sur la majorité des puces ainsi que les transcrits qui ne présentent pas de variation importante entre les différentes puces ont été exclus (Li et al, 2001, Bioinformatics, 17 : 1131-1142). La recherche d'un panel de transcrits discriminant les groupes de patientes EFS et CI/II a été réalisée par une technique de Data Mining, nommée « random forest algorithm » (http://ligarto.org/rdiaz/Papers/iornadas.bioinfo.randomForest.pdf). Outre l'analyse des données avec l'algorithme random forest, qui représente une analyse de type multivariée, une analyse dite « univariée » servait également à identifier des transcrits différentiellement exprimés entre les patientes EFS et CI/II. Cette analyse, nommée SAM (pour « Significance Analysis of Microarrays ») est principalement basée sur une version modifiée du test t de Student qui permet de prévenir le biais introduit par les gènes avec une variabilité faible. Cette approche permet de contrôler le taux de gènes faux positifs dans une analyse univariée.
L'ensemble des analyses mentionnées ci-dessus a permis de mettre en évidence un premier panel de transcrits, comprenant 318 transcrits pertinents selon l'invention (cf tableau 1, SEQ ID Nos: 1-318). L'augmentation ou la diminution d'expression de chacun de ces transcrits, observée chez les patientes S par rapport aux patientes C I/II est présentée dans le tableau 1.
Les inventeurs ont étudié l'expression simultanée de 318 transcrits pour obtenir un profil d'expression. En utilisant la méthode de random forest, 90 % des patients étaient correctement classifiés. Plus précisément, 32 des 37 contrôles et 51 des 55 patientes ont été correctement classifiés, ce que correspond à une sensibilité de 92,7 % et une spécificité de 86,4 %.
Outre l'analyse sur les 92 échantillons initiaux, une analyse supplémentaire a été effectuée afin de valider la pertinence de la signature identifié ci-dessus : une cohorte indépendante de cinq contrôles saines et 16 cancer du sein phase I/II a été analysée en aveugle. L'analyse d'une cohorte indépendante est un des meilleurs moyens pour tester la valeur prédictive d'une signature de gènes ou de transcrits (cf. The SMRS working group, Nat Biotech 2005,
7 : p.833-838). Basé sur les séquences SEQ ID Nos: 1-318, l'algorithme random forest a classé correctement cinq contrôles sur cinq et 13 patientes sur seize (86% de classification).
Par des expériences supplémentaires d'hybridations et d'analyses, réalisées sur 188 patients, 119 cibles supplémentaires ont pu être identifiées, correspondant aux séquences SEQ ID NO : 319-437 (Cf Tableau 1 ).
8.2. Identification d'un panel prédictif de 100 marqueurs (PANEL 7)
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de 100 transcrits de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences présentées dans le tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. En utilisant la méthode de random forest, 89 % des patients étaient correctement classifiés. Plus précisément, 31 des 37 contrôles et 51 des 55 patientes ont été correctement classifiés, ce qui correspond à une sensibilité de 92,7 % et une spécificité de 83,7 %. Ces résultats ont été confirmés avec une autre technique d'analyse, le clustering hiérarchique. Dans cette analyse non-supervisée, une Contrôle se positionne parmi les patientes (à gauche de la ligne pointillée rouge, cf. figure 7), et 10 patientes figurent parmi les contrôles saines (à droite de la ligne pointillée rouge). La figure 7 représente l'analyse de clustering hiérarchique d'échantillons de sang obtenu à partir de 55 patients atteintes d'un cancer en stade précoce (C I/II, appelé également D) et 37 patients Contrôles (donneuses saines) en utilisant l'expression de 100 gènes identifiés par l'analyse algorithmique. La fonction de clustering hiérarchique du logiciel Spotfire organise les patients C I/II et contrôles en colonnes, et les gènes en lignes de manière à obtenir en position adjacente les patients ou les gènes présentant des profils d'expression comparables. Le coefficient de corrélation de Pearson a été utilisé comme indice de similarité pour les gènes et les patients. Les résultats correspondent au niveau de fluorescence Affymetrix normalisé par l'outil « bioconductor ». Afin de tenir compte des différences constitutives d'expression entre les gènes, les niveaux d'expression de chaque gène ont été normalisés en calculant une variable centrée réduite. Le blanc représente les faibles niveaux d'expression, le gris les niveaux intermédiaires et le noir les niveaux forts. La hauteur des branches du dendrogramme indique l'indice de similarité entre les profils d'expression.
Outre l'analyse sur les 92 échantillons initiaux, une analyse supplémentaire a été effectué afin de valider la pertinence de la signature identifié ci dessus : une cohorte indépendante de cinq contrôles saines et 16 cancer du sein phase I/II a été analysée en aveugle. Basé sur les top 100, l'algorithme random forest a classé correctement cinq contrôles sur cinq et 14 patientes sur seize (90% de classification).
Parmi cette combinaison de 100 gènes marqueurs, les inventeurs ont mis en évidence que des panels plus restreints permettaient également de discriminer les patients contrôles des patientes atteintes d'un cancer du sein, comme décrit dans les exemples suivants.
8.3. Identification d'un panel prédictif de 66 marqueurs (PANEL 6)
Les inventeurs ont mis en évidence une combinaison de 66 marqueurs, basée sur les séquences SEQ ID Nos : 5, 7, 13, 14, 16-20, 23-28, 47, 51-55, 58, 64, 69, 80, 81, 88-90, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 188-191, 208, 222, 225, 228, 229, 236, 240, 242, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300 et 309-312 (voir tableau 3). Cette combinaison permet de classifier correctement plus de 80 % des échantillons.
8.4. Identification d'un panel prédictif de 53 marqueurs (PANEL 5)
Les inventeurs ont également mis en évidence une combinaison de 53 marqueurs, basée sur les séquences SEQ ID Nos : 7, 13, 14, 16-19, 23-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 137, 139, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 228, 229, 240, 245, 248, 252, 280, 281, 284, 290, 298-300, 310 et 312. Cette combinaison permet également de classifier correctement plus de 80 % des échantillons.
8.5. Identification d'un panel prédictif de 42 marqueurs (PANEL 4)
Les inventeurs ont également mis en évidence une combinaison de 42 marqueurs, basée sur les séquences SEQ ID Nos : 13, 16-19, 23, 26-28, 47, 51-55, 58, 69, 80, 81, 89, 116, 121, 125, 145, 148, 158, 160, 161, 164, 189, 190, 225, 229, 240, 248, 280, 281, 284, 299, 300, 310 et 312. Cette combinaison permet également de classifier correctement plus de 80 % des échantillons.
8.6. Identification d'un panel prédictif de 22 marqueurs (PANEL 3)
Les inventeurs ont mis en évidence une combinaison de 22 marqueurs, basée sur les séquences SEQ ID Nos : 18, 19, 23, 26, 27, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 161, 188, 225, 228, 240, 280 et 312. Cette combinaison permet de classifier correctement 76 % des échantillons.
8.7. Identification d'un panel prédictif de 18 marqueurs (PANEL 2)
Les inventeurs ont aussi mis en évidence une combinaison de 18 marqueurs, basée sur les séquences cibles SEQ ID NOs: 18, 19, 23, 26, 51, 52, 53, 54, 55, 69, 80, 125, 145, 148, 225, 228, 240 et 312 présentées dans le tableau 3. Cette combinaison permet de classifier correctement 76 % des échantillons.
Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 18 marqueurs est un bon outil pour discriminer les patientes ayant un fort risque de rechute des patientes ayant un faible risque de rechute. L'utilisation de panel de gènes restreint est particulièrement adaptée pour obtenir un outil de détection et de pronostic. En effet, l'analyse de l'expression d'une dizaine de marqueurs ne nécessite pas la fabrication à façon de puce à ADN, et peut être mise en œuvre directement par des techniques de PCR ou de NASBA, ou puce de basse densité, ce qui présente un atout économique important et une mise en œuvre simplifiée. 8.8. Identification de panels prédictifs de marqueurs (PANELS 1 et 7-9)
Les inventeurs ont mis en évidence des combinaisons de 100, 104 et 110 marqueurs, basées sur les séquences cibles SEQ ID Nos : 1-437, permettant de détecter la présence d'un cancer du sein chez des sujets. Ces panels sont décrits dans le Tableau 4. Le Panel 1 comprend l'ensemble des séquences communes aux Panels 7-9.
8.9. Identification d'un panel prédictif de 90 marqueurs (PANELS 10 et 11)
Par des expériences supplémentaires d'hybridations et d'analyses, réalisées sur 188 patients, les inventeurs ont mis en évidence une combinaison de 90 marqueurs, basée sur les séquences SEQ ID Nos : 11; 12; 18; 23; 51 a 53; 59; 60; 105; 148; 150; 191; 195; 206; 225 a 227; 229; 280; 281; 308 a 310; 312; 327; 343; 360; 367; 377 a 437 (voir Tableau 4).
Cette combinaison permet de classifier correctement 86,1 % des échantillons de cancer du sein précoce. Les gènes de ce panel sont, par ailleurs, spécifiques pour les cancers du sein précoce. Dans des tests supplémentaires, 19 échantillons de sang provenant de femmes atteintes d'un cancer du côlon et 20 échantillons de sang de femmes atteintes d'un cancer du sein métastatique ont été analysés sur des puces à façon tel que décrites ci-dessus. Pour chacune de ces deux maladies, seulement 3 patientes présentaient une expression similaire des 90 marqueurs inclus dans le panel 10. Par conséquent, 84,2% (16 sur 19) des cancers du côlon et 85% (17 sur 20) des cancers du sein métastatiques testés n'ont pas été confondus avec des cancer du sein précoce.
Le Panel 11 comprend l'ensemble des séquences communes à l'ensemble des Panels 1 à 10, c'est-à-dire les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID No: 23, 52, 53, 148 et 225 (voir Tableau 4).
8.10. Identification de cascades de signalisation de la réponse immunitaire L'analyse des différents gènes identifiés dans l'invention, dont l'expression est altérée chez les patients, montre qu'ils appartiennent à des familles de gènes impliquées dans des voies de signalisation cellulaire ou dans des mécanismes de régulation communs. Ainsi notamment, cette analyse fait apparaître de nombreux gènes impliqués dans les cascades de signalisation mises en œuvre dans la réponse immunitaire (innée ou acquise), et notamment dans la transduction des messages initiés par la stimulation des TLRs, dans la sécrétion de cytokines ou dans l'activation des lymphocytes T.
Les demandeurs ont ainsi défini des panels de gènes, liés ou participant à des voies de signalisation de la réponse immune, qui constituent des cibles d'intérêt pour la détection du cancer. Ces panels sont donnés dans les Tableaux 5 et 6.
Tableau A : Echantillons sélectionnés pour le groupe cancer du sein précoce pour le DATAS n°1 (PBMN)
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Tableau B : Echantillons sélectionnés pour le groupe contrôle pour le DATAS n°1 (PBMN)
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Tableau C : Echantillons sélectionnés pour le groupe cancer du sein tardif pour le DATAS n°2 (PBMO)
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Tableau D : Echantillons sélectionnés pour le groupe contrôle pour le DATAS n°2 (PBMO)
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Tableau E : Echantillons sélectionnés pour le groupe cancer du sein tous stades pour le DATAS n°3 (PBMP).
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Tableau F : Echantillons sélectionnés pour le groupe contrôle pour le DATAS n°3 (PBMP)
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Tableau 1- Liste de 437 transcrits exprimés différentiellement lors du développement d'un cancer du sein.
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Les variants SEQ ID Nos: 308-318 correspondent à de nouvelles ESTs
Tableau 2 - Panel de 100 marqueurs exprimés différentiellement dans les cancers du sein (PANEL 7)
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Tableau 3 - Panel de 66 marqueurs exprimés différentiellement dans les cancers du sein
(PANEL 6)
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Tableau 4- Tableau récapitulatif des panels 1-11 de marqueurs exprimés différentiellement dans les cancers du sein
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Tableau 5. Liste des gènes /transcrits identifiés parmi les banques DATAS issues du profilage des sangs de patientes atteintes de cancer du sein comme étant associés à des voies de signalisation de l'immunité.
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Homo sapiens interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 (IFIT1 ), transcript variant
NM 001001887 1 , mRNA. 10/2005
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4
NM 001008540 (CXCR4), transcript variant 1 , mRNA. 11/2005
Homo sapiens lymphocyte-specific protein 1 (LSP1),
NM 001013255 transcript variant 4, mRNA. 10/2005
Homo sapiens nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 (glucocorticoid receptor) (NR3C1),
NM 001018076 transcript variant 4, mRNA. 11/2005
Homo sapiens annexin A11 (ANXA11 ), transcript
NM 001157 variant a, mRNA. 10/2005
Homo sapiens Rho GDP dissociation inhibitor (GDI)
NM 001175 beta (ARHGDIB), mRNA. 10/2005
Homo sapiens E74-like factor 4 (ets domain
NM 001421 transcription factor) (ELF4), mRNA. 10/2005
Homo sapiens FYN binding protein (FYB-120/130)
NM 001465 (FYB), transcript variant 1 , mRNA. 11/2005
Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta (IL8RB),
NM 001557 mRNA. 11/2005
Homo sapiens arachidonate 5-lipoxygenase-
NM 001629 activating protein (ALOX5AP), mRNA. 11/2005
Homo sapiens acyloxyacyl hydrolase (neutrophil)
NM 001637 (AOAH), mRNA. 9/2005
NM 001760 Homo sapiens cyclin D3 (CCND3), mRNA. 10/2005
Homo sapiens CD97 antigen (CD97), transcript
NM 001784 variant 2, mRNA. 10/2005
Homo sapiens ferritin, heavy polypeptide 1 (FTH 1),
NM 002032 mRNA. 11/2005
Homo sapiens inositol 1 ,4,5-trisphosphate 3-kinase B
NM 002221 (ITPKB), mRNA. 10/2005
Homo sapiens myeloid differentiation primary
NM 002468 response gène (88) (MYD88), mRNA. 11/2005
Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MAP2K3), transcript variant A, mRNA.
NM 002756 10/2005
Homo sapiens chemokine (C-C motif) ligand 5
NM 002985 (CCL5), mRNA. 11/2005
Homo sapiens Sp2 transcription factor (SP2), mRNA.
NM 003110 10/2005
Homo sapiens nuclear factor (erythroid-derived 2)-like
NM 003204 1 (NFE2L1 ), mRNA. 10/2005
Homo sapiens zinc finger protein 36, C3H type,
NM 003407 homoloq (mouse) (ZFP36), mRNA. 11/2005
Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (herpesvirus entry mediator)
NM 003820 (TNFRSF14), mRNA. 11/2005
Homo sapiens interleukin 18 receptor accessory
NM 003853 protein (IL18RAP), mRNA. 10/2005
Homo sapiens guanylate binding protein 2, interferon-
NM 004120 inducible (GBP2), mRNA. 9/2005
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Homo sapiens colony stimulating factor 3 receptor
(granulocyte) (CSF3R), transcript variant 4, mRNA.
NM 172313 10/2005
Homo sapiens high density lipoprotein binding protein
NM 203346 (vigilin) (HDLBP), mRNA. 10/2005
Tableau 6. Liste des gènes /transcrits associés à des voies de signalisation de l'immunité
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détection, dans un échantillon biologique du mammifère, a) des acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans SEQ ID No:
23, 52, 53, 148 et 225 (PANEL 11), ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) des acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) des analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, et/ou d) des polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c), la présence, l'absence ou la quantité (relative) de ces molécules cibles dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les acides nucléiques selon a) sont choisis parmi les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans l'un des panels 1-10 du tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les acides nucléiques selon a) comprennent les acides nucléiques comprenant les séquences représentées dans le panel 10 du tableau 4, ou un fragment distinctif de celles-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives.
4. Méthode pour détecter in vitro ou ex vivo la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un gène ou ARN impliqué dans la stimulation des TLRs, dans la sécrétion de cytokines, ou dans l'activation des lymphocytes T, ledit gène ou ARN étant avantageusement sélectionné parmi les récepteurs, les adaptateurs, les enzymes, les facteurs impliqués dans la régulation de l'expression des gènes, les chemokines, les cytokines et les interleukines, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
5. Méthode selon la revendication 4, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans au moins un, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 gènes ou ARN correspondants indiqués dans le Tableau 5, en particulier d'un altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
6. Méthode selon la revendication 4, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence) dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans au moins un, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 gènes ou ARN correspondants indiqués dans le Tableau 6, en particulier d'un altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant une indication de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique par hybridation sélective ou amplification sélective.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique d'un ensemble de molécules cibles choisi parmi: a) les acide nucléiques de l'un des panels 1 à 11 définis dans les revendications 1 et 2 ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
9. Méthode selon la revendication 8, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles suivantes : a) les acide nucléiques du panel 11 ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
10. Méthode selon la revendication 5, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique d'au moins deux gènes ou ARNs correspondants indiqués dans les Tableaux 5 et 6.
11. Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que les sondes sont immobilisées sur un support.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour détecter la présence ou le risque de développer un cancer chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction d'amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble d'amorces spécifique d'un ensemble de molécules cibles choisi parmi : a) les acides nucléiques de l'un des panels 1 à 11 définis dans les revendications 1 et 2 ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, et/ou b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire de séquences selon a), et/ou c) les analogues fonctionnels des acides nucléiques selon a) ou b) provenant d'une autre espèce, pour obtenir un profil d'amplification, le profil d'amplification étant caractéristique de la présence ou du risque de développer un cancer chez ce mammifère.
13. Méthode selon la revendication 6 ou 7, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction d'amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble d'amorces spécifique d'au moins deux gènes ou ARN correspondants indiqués dans les Tableaux 5 et 6.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un polypeptide codé par lesdits gènes ou ARN au moyen d'un anticorps spécifique ou d'un fragment ou dérivé de celui-ci.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon issu de sang, de préférence un échantillon de sang total.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour détecter la présence d'un cancer du sein en phase précoce de stade I ou II.
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour détecter la présence d'un cancer du sein en phase précoce non détectable par mammographie.
18. Utilisation d'une sonde nucléique spécifique d'un acide nucléique cible tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8, ladite sonde comprenant de 15 à 400 bases, pour la détection in vitro d'un cancer chez un sujet humain.
19. Utilisation d'une amorce nucléique permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique cible tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7, ladite amorce étant simple-brin, d'une longueur comprise entre 5 et 50 bases, pour la détection in vitro d'un cancer chez un sujet humain.
20. Produit comprenant un support sur lequel sont immobilisées au moins deux sondes d'acides nucléiques distinctes comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins deux acides nucléiques cibles distincts comprenant au moins deux séquences choisies parmi SEQ ID NO: 1-437, ou d'au moins un gène ou ARN indiqué dans le Tableau 5 ou 6.
21. Produit selon la revendication 20, comprenant un support sur lequel sont immobilisées au moins un ensemble de sondes d'acides nucléiques distinctes comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique des acides nucléiques de l'un des panels 1 à 11 définis dans la revendication 1.
22. Utilisation d'un produit selon la revendication 20 pour la détection in vitro ou ex vivo de la présence ou du risque de développer un cancer chez un mammifère.
23. Utilisation d'un produit selon la revendication 21 pour la détection in vitro ou ex vivo de la présence ou du risque de développer un cancer du sein chez un mammifère.
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