WO2007042597A1 - Método absoluto de cuantificación de compuestos orgánicos - Google Patents

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José Ignacio GARCIA ALONSO
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Definitions

  • the present invention refers to the field of Instrumental Analytical Chemistry and more specifically refers to the methods of determining organic compounds using chromatographic separation systems, without the need to perform a calibration of the instrumental response of the specific equipment for each compound, and its application would cover sectors such as environmental or industrial process control.
  • the sample proceeds to its dissolution or leaching of the organic compounds to be determined with a suitable solvent.
  • a suitable solvent In the case of liquid samples, only the extraction of the organic compounds to a suitable solvent is required. At this time, or later, some type of internal pattern could be added to the sample to correct subsequent errors of the methodology.
  • These internal standards may be i) a compound other than those to be determined that is not present in the sample (internal standard method), ii) one or more of the compounds to be determined where the isotopic abundance of any of the elements present in the compound (isotopic dilution method) or iii) one or more of the compounds to be determined but without modifying the natural isotopic abundances (standard addition method).
  • the internal standard can be added directly to the sample.
  • Isotopic dilution is a classical technique of elementary determination described more than 50 years ago. It is based on the intentional alteration of the isotopic abundance of an element in the sample by the addition of a known amount of the same element with an altered isotopic abundance (tracer) and the measurement of the final isotopic abundance in the mixture by Mass Spectrometry.
  • This principle can be applied to the determination of the amount of an element that elutes from a chromatographic system using the isotopic dilution in line whose fundamental principle has already been described in various publications ⁇ a ( 5 )] -
  • the sample and the plotter are mixed in Continuous (in flow) after the chromatographic separation and the measurement of the isotopic relationship in the mixture R m is performed as a function of time by Mass Spectrometry. If the plotter contribution to the mixture remains constant over time, the isotopic ratio measured in the mixture (R m ) will depend solely on the contribution of the element to be analyzed from the sample, which may be constant or variable.
  • the isotopic dilution When the isotopic dilution is used in line for elementary analysis after a chromatographic separation, it is essential that there is an isotopic balance between the eluted compounds of the chromatographic column and the chemical compound used as a tracer and containing the isotopically enriched element.
  • the authors of the present invention provide a method of quantification of organic compounds, which eliminates and / or simplifies some of the steps known in the state of the art in a process of absolute determination of organic compounds.
  • Absolute determination means any determination or method performed without calibration, that is, without the need to use pure standards for each compound to be analyzed.
  • An aspect of the present invention provides a method of quantification of organic compounds comprising the following steps: a. separate the compounds from the sample by chromatography; b. the compounds separated in (a) are mixed with a carbon-13 enriched tracer; C. the mixtures of section (b) react chemically obtaining CO 2 ; d. measure the isotopic ratio of 12 CV 13 C generated in (c) by mass spectrometer; and. transforming the 12 C / 13 C isotopic ratio chromatogram into carbon mass flow chromatogram by means of the inline isotopic dilution equation; where if the tracer is CO2 enriched in carbon-13, the mixture of said tracer may also be performed after the chemical reaction of the compounds separated in (a).
  • the method of the present invention comprises a chemical reaction capable of quantitatively transforming the carbon present in each organic compound eluted from the chromatography column into carbon dioxide (CO 2) as a means to achieve isotopic equilibrium.
  • said chemical reactions can be: a) a gas phase combustion reaction using oxygen, mixtures of oxygen-argon or oxygen-hydrogen; b) a solid phase oxidation reaction using metal oxides (CuO, Ag 2 O or others) in the presence of catalysts; or c) a liquid phase oxidation reaction using strong oxidants (permanganate, dichromate, persulfate, or others)
  • the carbon dioxide from the chemical reaction of each organic compound in the sample is continuously mixed with a carbon-13-enriched tracer before being introduced into the ionization source of the Mass Spectrometer for analysis by in-line isotopic dilution.
  • the method of the present invention to introduce the carbon isotopically labeled with 13 C, tracer, and perform the isotopic dilution in line, comprises three equally valid alternative forms: a) Introduce the tracer directly as carbon dioxide enriched in 13 C.
  • the first case that is, using CO2 enriched in 13 C as a tracer
  • it can be introduced at any time in the chromatographic system (in the mobile phase, after the column or after the chemical reaction).
  • the tracer is a compound other than carbon CO2
  • the introduction will always before the chemical reaction to convert the compound used as a tracer also in CO2 enriched in 13 C.
  • the mixture obtained a mixture of the organic compound to be analyzed and the tracer, is introduced into a Mass Spectrometer for the measurement of the isotopic ratio of carbon, 12 CV 13 C, by continuously obtaining thus the mass flow chromatogram.
  • the measurement of the isotopic ratio 12 CV 13 C can be performed, depending on the ionization source used, both in the monopositive ions themselves carbon to masses 12 and 13 as in other ions derived therefrom as, for example, in CO 2 + to masses 44 and 45, respectively.
  • the method developed in the present invention allows to reach the isotopic equilibrium between the compounds eluting from the chromatographic column and the isotopically enriched tracer as a previous step to its introduction into the ionization source.
  • the achievement of this prior isotopic equilibrium makes it possible to choose the most suitable ionization source for the analysis of organic compounds, which could work under high vacuum providing greater sensitivity and lower carbon contamination, which would result in better detection limits for organic compounds. .
  • the present invention provides a method of absolute determination of organic compounds through the use of isotopic dilution in line, with high sensitivity and precision through the continuous measurement of the 12 CV 13 C isotopic ratio at the exit of a Chromatographic system using ionization sources alternative to inductive coupling plasma.
  • the absolute method of quantification of organic compounds of the present invention comprises, with respect to the quantification methodologies of organic compounds described in the prior art, the following advantages:
  • Another aspect of the present invention is the application of the described method, both in liquid chromatography separations and in gas chromatography separations, in environmental test laboratories and in industrial process control laboratories where routine determinations of organic compounds are made, of Chemical structure known, by chromatographic techniques.
  • the present invention can be incorporated into chromatographic equipment that uses Mass Spectrometry as a detection system (simple GC-MS or HPLC-MS equipment) and therefore, consists of an instrumental modification capable of commercialization by analytical instrumentation companies.
  • Fig. 1. Illustration of the basic principle of the analysis by isotopic dilution. Where: “A. i.” it is isotopic abundance; “M” is sample; “Mez.” it's mix; “T” is plotter; “a” is the isotope a; and “b” is the isotope b.
  • Fig. 2. Illustration of the principle of isotopic dilution in line for a liquid chromatography system.
  • B. HPLC HPLC pump
  • Fs. Ms mobile phases
  • J. it is syringe
  • Vi injection valve
  • Te enriched plotter
  • Bp peristaltic pump
  • F. i. (EM) is the ionization source of the Mass Spectrometer.
  • the basic principle of isotopic dilution analysis is illustrated in Figure 1 for an element that has two isotopes: a and b.
  • the isotope a is the most abundant in the sample while the tracer is enriched in the isotope b.
  • the isotopic abundance in the mixture will be a linear combination of the abundances in the sample and plotter that will depend on the amount of element present in the sample and the amount of tracer added.
  • the measurement of the isotopic ratio R m in the mixture allows determining the quantity of the element in the original sample.
  • This basic principle can be applied to the determination of the amount of an element that elutes from a chromatographic system using the in-line isotopic dilution whose fundamental principle is illustrated in Figure 2 for a liquid chromatography system.
  • the sample and the tracer are mixed continuously (in flow) after Ia Chromatographic separation and the measurement of the isotopic relationship in the mixture R m is performed as a function of time by Mass Spectrometry.
  • Carbon dioxide enriched in 13 C was prepared dissolved in pressurized Helium.
  • the container containing the tracer had an outlet orifice and the gas flow was controlled by a mass flow controller that regulated exactly the tracer flow added to the mixture.
  • a combustion interface was installed consisting of a ceramic tube where copper wires were introduced, previously oxidized in a stream of air to CuO, and that could be maintained at an adequate temperature (> 850
  • Any organic compound would produce the previous reaction in a quantitative way, converting it into carbon dioxide, water and, in the presence of heteroatoms, other reaction products (NO 2 , SO 2 , etc.).
  • the isotopic carbon ratios in the molecular ion CO 2 + at masses 44 (for carbon 12) and 45 (for carbon 13) could be measured.
  • the isotopic ratio measured isotope ratio became 12 C / 13 C taking into account the natural isotopic abundances of oxygen.

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Abstract

El método se refiere a la cuantificación de compuestos orgánicos que eluyen de un sistema cromatográfico sin la utilización de patrones, que comprende la conversión en continuo del carbono de estos compuestos en dióxido de carbono (CO2) mediante una reacción química y su mezcla, previa a la separación o posterior, con un flujo conocido y constante de un compuesto de carbono, preferentemente CO2, enriquecido en el isótopo carbono-13 (13C). La mezcla se introduce en un Espectrómetro de Masas 10 donde se mide en continuo la relación isotópica 12C/13C ya sea en el carbono o en algún ión característico proveniente de éste. Esta relación isotópica se convierte en una medida de flujo másico de carbono utilizando la dilución isotópica en línea.

Description

Método absoluto de cuantificación de compuestos orgánicos
La presente invención se refiere al campo de Ia Química Analítica Instrumental y más concretamente se refiere a los métodos de determinación de compuestos orgánicos utilizando sistemas cromatográficos de separación, sin necesidad de Ia realización de un calibrado de Ia respuesta instrumental del equipo específico para cada compuesto, y su aplicación abarcaría sectores como el medioambiental o el de control de procesos industriales.
ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
Cuando se desea determinar el contenido de uno o varios compuestos orgánicos en una muestra cualquiera llegada a un laboratorio de análisis se sigue, en general, los siguientes pasos:
a) Si Ia muestra es sólida se procede a su disolución o lixiviación de los compuestos orgánicos a determinar con un disolvente adecuado. En el caso de muestras líquidas, únicamente se requiere Ia extracción de los compuestos orgánicos a un disolvente adecuado. En este momento, o más tarde, se podrían añadir a Ia muestra algún tipo de patrón interno para corregir errores posteriores de Ia metodología. Estos patrones internos pueden ser i) un compuesto distinto de los que se han de determinar que no está presente en Ia muestra (método del patrón interno), ii) uno o varios de los compuestos a determinar donde se ha alterado Ia abundancia isotópica de alguno de los elementos presentes en el compuesto (método de dilución isotópica) o iii) uno o varios de los compuestos a determinar pero sin modificar las abundancias isotópicas naturales (método de adiciones estándar). Cuando Ia muestra es líquida se puede añadir el patrón interno directamente sobre Ia muestra.
b) Una vez extraídos los compuestos del sólido o cuando Ia muestra es líquida puede ser necesario un proceso de preconcentración o de separación de otros compuestos interferentes por técnicas de separación no cromatográficas cuyo rendimiento hay que determinar. c) Finalmente, Ia muestra ya preparada se inyecta en un sistema cromatográfico para Ia separación de los distintos compuestos orgánicos presentes y su detección con un dispositivo instrumental adecuado.
d) La señal, en área o altura de pico, se compara con una línea de calibrado preparada a partir de patrones puros para cada compuesto a determinar ya que Ia señal instrumental es diferente para cada compuesto. Esta calibración permite determinar el contenido del compuesto orgánico en Ia muestra inyectada. Cabe resaltar que esta etapa del análisis es, sin duda alguna, Ia de mayor coste del proceso ya que los patrones certificados son caros y cada compuesto presente en Ia muestra requiere su calibración independiente, Io que requiere tiempo y dinero.
e) En el caso de que se haya utilizado algún tipo de los patrones internos descritos más arriba las metodologías de cuantificación difieren ligeramente.
La dilución isotópica es una técnica clásica de determinación elemental descrita hace ya más de 50 años. Se basa en Ia alteración intencionada de Ia abundancia isotópica de un elemento en Ia muestra por Ia adición de una cantidad conocida del mismo elemento con una abundancia isotópica alterada (trazador) y Ia medida de Ia abundancia isotópica final en Ia mezcla mediante Espectrometría de Masas.
Este principio puede aplicarse a Ia determinación de Ia cantidad de un elemento que eluye de un sistema cromatográfico utilizando Ia dilución isotópica en línea cuyo principio fundamental ya ha sido descrito en diversas publicaciones ^ a (5)]- La muestra y el trazador se mezclan en continuo (en flujo) tras Ia separación cromatográfica y Ia medida de Ia relación isotópica en Ia mezcla Rm se realiza en función del tiempo mediante Espectrometría de Masas. Si el aporte de trazador a Ia mezcla se mantiene constante en el tiempo, Ia relación isotópica medida en Ia mezcla (Rm) dependerá únicamente del aporte del elemento a analizar proveniente de Ia muestra, que puede ser constante o variable. Cuando se utiliza Ia dilución isotópica en línea para análisis elemental tras una separación cromatográfica es imprescindible que exista un equilibrio isotópico entre los compuestos eluidos de Ia columna cromatográfica y el compuesto químico utilizado como trazador y que contiene al elemento enriquecido isotópicamente.
La consecución de este equilibrio isotópico se ha descrito en el estado de Ia técnica utilizando el plasma de acoplamiento inductivo como fuente de ionización, ya que es capaz de romper todos los enlaces químicos tanto en los compuestos provenientes de Ia columna cromatográfica como del compuesto químico que contiene al trazador [(i) a (5)]. Por tanto, Ia eficacia del proceso de ionización será independiente de Ia naturaleza del compuesto químico que contiene al analito o al trazador enriquecido. Para Ia determinación de compuestos orgánicos por dilución isotópica en línea existe una publicación en el estado de Ia técnica que describe el uso del plasma de acoplamiento inductivo como fuente de ionización y ácido benzoico marcado con 13C como trazador (6). Esta fuente de ionización no es Ia más adecuada para Ia determinación de carbono debido al bajo rendimiento del proceso de ionización para este elemento y a Ia posible contaminación por carbono atmosférico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención proporcionan un método de cuantificación de compuestos orgánicos, que elimina y/o simplifica algunos de los pasos conocidos en el estado de Ia técnica en un procedimiento de determinación absoluta de compuestos orgánicos.
Se entiende por "determinación absoluta" o "método absoluto" a cualquier determinación o método realizado sin calibrado, es decir, sin necesidad de usar patrones puros para cada compuesto a analizar.
Un aspecto de Ia presente invención proporciona un método de cuantificación de compuestos orgánicos que comprende los siguientes pasos: a. separar los compuestos de Ia muestra mediante cromatografía; b. los compuestos separados en (a) se mezclan con un trazador enriquecido en carbono-13; c. las mezclas del apartado (b) reaccionan químicamente obteniéndose CO2; d. medir Ia relación isotópica de 12CV13C generada en (c) mediante espectrómetro de masas; e. transformar el cromatograma de relación isotópica 12C/13C en cromatograma de flujo másico de carbono mediante Ia ecuación de Ia dilución isotópica en línea; donde si el trazador es CO2 enriquecido en carbono-13, Ia mezcla de dicho trazador puede realizarse también posterior a Ia reacción química de los compuestos separados en (a).
El método de Ia presente invención comprende una reacción química capaz de transformar cuantitativamente el carbono presente en cada compuesto orgánico que eluye de Ia columna cromatográfica en dióxido de carbono (CO2) como medio para alcanzar el equilibrio isotópico. Donde dichas reacciones químicas pueden ser: a) una reacción de combustión en fase gaseosa utilizando oxígeno, mezclas de oxígeno-argón u oxígeno-hidrógeno; b) una reacción de oxidación en fase sólida utilizando óxidos metálicos (CuO, Ag2O u otros) en presencia de catalizadores; ó c) una reacción de oxidación en fase líquida utilizando oxidantes fuertes (permanganato, dicromato, persulfato, u otros)
El dióxido de carbono proveniente de Ia reacción química de cada compuesto orgánico de Ia muestra se mezcla en continuo con un trazador enriquecido con carbono-13 antes de su introducción en Ia fuente de ionización del Espectrómetro de Masas para su análisis por dilución isotópica en línea.
El método de Ia presente invención, para introducir el carbono marcado isotópicamente con 13C, trazador, y realizar Ia dilución isotópica en línea, comprende tres formas alternativas igualmente válidas: a) Introducir el trazador directamente como dióxido de carbono enriquecido en 13C.
b) Introducir el trazador como otro compuesto de carbono (orgánico o inorgánico, como por ejemplo carbonato sódico) enriquecido en 13C disuelto en una fase líquida.
c) Introducir el trazador como otro compuesto volátil de carbono enriquecido en 13C, como por ejemplo el metano.
En el primero de los casos, es decir, utilizando CO2 enriquecido en 13C como trazador, éste puede introducirse en cualquier momento en el sistema cromatográfico (en Ia fase móvil, después de Ia columna o después de Ia reacción química). Mientras que, para el segundo y tercer caso, es decir, cuando el trazador es un compuesto de carbono distinto al CO2, Ia introducción se hará siempre antes de Ia reacción química para convertir el compuesto utilizado como trazador también en CO2 enriquecido en 13C.
En una realización preferida del método de Ia presente invención Ia mezcla obtenida, mezcla del compuesto orgánico a analizar y el trazador, se introduce en un Espectrómetro de Masas para Ia medida de Ia relación isotópica del carbono, 12CV13C, de forma continua obteniendo así el cromatograma de flujo másico.
El aporte del elemento a Ia mezcla procedente de Ia muestra varía con el tiempo debido a Ia separación cromatográfica y por tanto, las ecuaciones de Ia dilución isotópica se modifican introduciendo el flujo másico del elemento como variable desconocida ^ a (5)]- La representación del flujo másico en función del tiempo será el denominado cromatograma de flujo másico. La integración de cada pico cromatográfico nos proporciona de forma absoluta Ia masa del elemento en dicho pico. La concentración en Ia muestra original se calcula conociendo Ia masa (o el volumen) de muestra inyectada en el sistema cromatográfico κi) a (5)]-
La medida de Ia relación isotópica 12CV13C se puede realizar, en función de Ia fuente de ionización utilizada, tanto en los propios iones monopositivos de carbono a masas 12 y 13 como en otros iones derivados de éstos como, por ejemplo, en el CO2 + a masas 44 y 45, respectivamente.
El método desarrollado en Ia presente invención permite alcanzar el equilibrio isotópico entre los compuestos que eluyen de Ia columna cromatográfica y el trazador enriquecido isotópicamente como paso previo a su introducción en Ia fuente de ionización. La consecución de este equilibrio isotópico previo permite elegir Ia fuente de ionización más adecuada para el análisis de compuestos orgánicos, que podría trabajar a alto vacío proporcionando una mayor sensibilidad y menores contaminaciones de carbono, Io que se traduciría en mejores límites de detección para compuestos orgánicos.
Por Io tanto, Ia presente invención proporciona un método de determinación absoluta de compuestos orgánicos mediante el uso de Ia dilución isotópica en línea, con alta sensibilidad y precisión a través de Ia medida continua de Ia relación isotópica 12CV13C a Ia salida de un sistema cromatográfico utilizando fuentes de ionización alternativas al plasma de acoplamiento inductivo.
El método absoluto de cuantificación de compuestos orgánicos de Ia presente invención comprende, respecto a las metodologías de cuantificación de compuestos orgánicos descritas en el estado de Ia técnica anterior, las siguientes ventajas:
a) Es un método universal que serviría para cualquier compuesto orgánico independientemente de su forma química ya que el carbono presente en todo compuesto orgánico es susceptible de ser transformado cuantitativamente en CO2 mediante una de las reacciones químicas descritas previamente.
b) Es un método absoluto que no requiere Ia utilización de patrones de calibrado para cada compuesto a determinar, Io que disminuye ostensiblemente el coste y el tiempo de los análisis en los laboratorios de rutina. De hecho, permitiría Ia cuantificación absoluta de todo compuesto que contenga carbono presente en Ia muestra, y que eluya del sistema cromatográfico, en una sola inyección sin necesidad de patrón alguno.
c) Utiliza Ia dilución isotópica por cuanto puede considerarse un método primario de análisis directamente trazable al Sistema Internacional de unidades.
d) Requiere una mínima modificación de los sistemas cromatográficos actuales para introducir Ia reacción química y el flujo de carbono 13 enriquecido.
e) Utiliza Espectrómetros de Masas de bajo coste ya que no se requieren altas precisiones en las relaciones isotópicas medidas.
f) Permite Ia utilización de patrones internos para corregir errores metodológicos durante Ia preparación de Ia muestra, variaciones en el volumen inyectado o variaciones de volumen debidas a Ia evaporación del disolvente, dado que esta metodología permite determinar también de forma absoluta Ia cantidad de patrón interno inyectada.
Otro aspecto de Ia presente invención es Ia aplicación del método descrito, tanto en separaciones por cromatografía líquida como en separaciones por cromatografía de gases, en laboratorios de ensayo medioambientales y en laboratorios de control de procesos industriales donde se realicen determinaciones rutinarias de compuestos orgánicos, de estructura química conocida, por técnicas cromatográficas.
En concreto, Ia determinación de hidrocarburos alifáticos en diversos tipos de muestras, de hidrocarburos aromáticos, pesticidas, compuestos organoclorados, etc. sería factible con esta invención. Por tanto, uno de los campos de aplicación más inmediatos es al análisis medioambiental de contaminantes orgánicos en laboratorios de ensayo. Un segundo campo de aplicación importante sería en el control de calidad de productos industriales y farmacéuticos y en el control de procesos químicos, realizados normalmente en los laboratorios de las propias plantas de producción. Otros campos de aplicación, dentro de Ia Química Analítica, podrían ser Ia optimización y estudio de procesos de preparación de muestras (extracción líquido-líquido, extracción sólido-líquido, microextracción en fase sólida, etc.) dado que Ia cuantificación absoluta que se realiza por este método puede servir para estudiar y optimizar estos procesos con elevada fiabilidad. Un caso particular es Ia selección y utilización de patrones internos para corregir errores en los procesos de separación.
Desde el punto de vista instrumental, Ia presente invención se podrá incorporar en equipos cromatográficos que emplean Ia Espectrometría de Masas como sistema de detección (equipos sencillos de GC-MS o HPLC- MS) y por tanto, consiste en una modificación instrumental susceptible de comercialización por las empresas de instrumentación analítica.
Estos equipos modificados permitirían Ia realización de análisis de rutina de compuestos orgánicos con una elevada precisión y exactitud, a bajo coste para los laboratorios y en un tiempo considerablemente más corto que los métodos tradicionales de calibrado externo y adiciones estándar.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1.- Ilustración del principio básico del análisis por dilución isotópica. Donde: "A. i." es abundancia isotópica; "M" es muestra; "Mez." es mezcla; "T" es trazador; "a" es el isótopo a; y "b" es el isótopo b.
Fig. 2.- Ilustración del principio de Ia dilución isotópica en línea para un sistema de cromatografía líquida. Donde: "B. HPLC" es bomba de HPLC; "Fs. ms." son fases móviles; "J." es jeringa; "V.i." es válvula de inyección; "C." es columna; "T.e." es trazador enriquecido; "B.p." es bomba peristáltica; y "F. i. (E. M.)" es fuente de ionización del Espectrómetro de Masas.
Fig. 3.- Esquema de una realización preferente en Cromatografía de Gases. Donde: "Int.c." es Interfase de combustión; "Iny.c." es inyector del cromatógrafo; "CG." es Cromatógrafo de gases; "U" es unión; "E. M." es Espectrómetro de Masas; "F.l.(i.e.)" es fuente de ionización de impacto electrónico; "Cc." es columna cromatográfica; "C.f.m." es controlador de flujo másico; y "Dep. 13CC^ (He)" es depósito de CO2 enriquecido en 13C
EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE
Para una mejor comprensión del método descrito en Ia presente invención se explicará el procedimiento a seguir para Ia determinación de compuestos orgánicos por Cromatografía de Gases utilizando un Espectrómetro de Masas de cuadrupolo con una fuente de ionización de impacto electrónico.
El principio básico del análisis por dilución isotópica se ilustra en Ia Figura 1 para un elemento que posee dos isótopos: a y b. Como se puede observar, el isótopo a es el más abundante en Ia muestra mientras que el trazador está enriquecido en el isótopo b. La abundancia isotópica en Ia mezcla será una combinación lineal de las abundancias en Ia muestra y trazador que dependerá de Ia cantidad de elemento presente en Ia muestra y de Ia cantidad de trazador adicionada. La medida de Ia relación isotópica Rm en Ia mezcla (isótopo a / isótopo b) permite determinar Ia cantidad del elemento en Ia muestra original.
Este principio básico puede aplicarse a Ia determinación de Ia cantidad de un elemento que eluye de un sistema cromatográfico utilizando Ia dilución isotópica en línea cuyo principio fundamental se ilustra en Ia Figura 2 para un sistema de cromatografía líquida. Como se puede observar en Ia Figura 2 Ia muestra y el trazador se mezclan en continuo (en flujo) tras Ia separación cromatográfica y Ia medida de Ia relación isotópica en Ia mezcla Rm se realiza en función del tiempo mediante Espectrometría de Masas.
El dióxido de carbono enriquecido en 13C se preparó disuelto en Helio presurizado. El recipiente que contenía el trazador tenía un orificio de salida y el flujo de gas fue controlado mediante un controlador de flujo másico que reguló exactamente el flujo de trazador añadido a Ia mezcla.
Por otro lado, a Ia salida de Ia columna cromatográfica se instaló una interfase de combustión consistente en un tubo cerámico donde se introdujeron hilos de cobre, oxidados previamente en una corriente de aire a CuO, y que se pudieron mantener a una temperatura adecuada (> 850
0C) para que ocurra Ia reacción genérica:
CnH2n+2 + (3n+1)CuO -» nCO2 + (n+1) H2O + (3n+1)Cu
de forma cuantitativa y donde CnH2n+2 fue un hidrocarburo alifático cualquiera.
Cualquier compuesto orgánico produciría Ia reacción anterior de forma cuantitativa convirtiéndose en dióxido de carbono, agua y, en caso de presencia de heteroátomos, otros productos de reacción (NO2, SO2, etc).
El flujo de dióxido de carbono marcado con 13C se añadió a Ia salida de Ia interfase de combustión y Ia mezcla así generada se introdujo, a través de un tubo de sílice fundida, en Ia fuente de ionización de un Espectrómetro de Masas.
Utilizando una fuente de ionización de impacto electrónico se pudo medir las relaciones isotópicas del carbono en el ion molecular CO2 + a masas 44 (para el carbono 12) y 45 (para el carbono 13). La relación isotópica medida se convirtió en relación isotópica 12C/13C teniendo en cuenta las abundancias isotópicas naturales del oxígeno.
Esa relación isotópica se introdujo en Ia ecuación de Ia dilución isotópica en línea (1) para así obtener el cromatograma de flujo másico y poder determinar directamente Ia masa de carbono en cada pico cromatográfico tras su correspondiente integración. Un esquema general de esta realización se ilustra en Ia Figura 3.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de cuantificación de compuestos orgánicos que comprende: a. separar los compuestos de Ia muestra mediante cromatografía; b. los compuestos separados en (a) se mezclan con un trazador enriquecido en carbono-13; c. las mezclas del apartado (b) reaccionan químicamente obteniéndose CO2; d. medir Ia relación isotópica de 12C/13C generada en (c) mediante espectrómetro de masas; e. transformar el cromatograma de relación isotópica 12C/13C en cromatograma de flujo másico de carbono mediante Ia ecuación de Ia dilución isotópica en línea; donde si el trazador es CO2 enriquecido en carbono-13, Ia mezcla de dicho trazador puede realizarse también posterior a Ia reacción química de los compuestos separados en (a).
2. Método según Ia reivindicación 1 , donde el trazador es un compuesto de carbono.
3. Método según Ia reivindicación 2, donde el trazador es carbonato sódico.
4. Método según Ia reivindicación 2, donde el trazador es un compuesto volátil de carbono.
5. Método según Ia reivindicación 4, donde el trazador es metano.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde Ia separación es mediante cromatografía líquida o cromatografía de gases.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Ia medida de Ia relación isotópica 12C/13C se realiza directamente.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Ia medida de la relación isotópica se realiza mediante iones derivados de 12C y 13C.
9. Método según Ia reivindicación anterior donde los iones derivados de Ia relación 12CV13C son CÜ2+ a masas 44 y 45 respectivamente.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde Ia fuente de ionización del espectrómetro de masas es de impacto electrónico.
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