ES2273601B1 - Metodo absoluto de cuantificacion de compuestos organicos. - Google Patents
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Abstract
Método absoluto de cuantificación de compuestos orgánicos que eluyen de un sistema cromatográfico sin la utilización de patrones. Consiste en la conversión en continuo del carbono de estos compuestos en dióxido de carbono (CO2) mediante una reacción química y su mezcla, previa a la separación o posterior, con un flujo conocido y constante de un compuesto de carbono, preferentemente CO2, enriquecido en el isótopo carbono-13 (13C). La mezcla se introduce en un Espectrómetro de Masas donde se mide en continuo la relación isotópica 12C/13C ya sea en el carbono o en algún ión característico proveniente de éste. Dicha relación isotópica se convierte en una medida de flujo másico de carbono utilizando la dilución isotópica en línea. La integración de cada pico cromatográfico proporciona de forma: absoluta la masa de carbono en dicho pico. De aplicación en sectores como el medioambiental o en el control de procesos industriales.
Description
Método absoluto de cuantificación de compuestos
orgánicos.
La presente invención se refiere a un método de
cuantificación de compuestos orgánicos que permite determinar de
forma absoluta la masa de los distintos compuestos orgánicos que
eluyen de un sistema cromatográfico sin necesidad de la realización
de un calibrado de la respuesta instrumental del equipo especifico
para cada compuesto.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la Química Analítica Instrumental y más concretamente
dentro de los métodos de determinación de compuestos orgánicos
utilizando sistemas cromatográficos de separación y su campo de
aplicación cubriría sectores como el medioambiental o el de control
de procesos industriales.
Cuando se desea determinar el contenido de uno o
varios compuestos orgánicos en una muestra cualquiera llegada a un
laboratorio de análisis se siguen, en general, los siguientes
pasos:
- a)
- Si la muestra es sólida se procede a su disolución o lixiviación de los compuestos orgánicos a determinar con un disolvente adecuado. En el caso de muestras líquidas, únicamente se requiere la extracción de los compuestos orgánicos a un disolvente adecuado. En este momento, o mas tarde, se podrían añadir a la muestra algún tipo de patrón interno para corregir errores posteriores de la metodología. Estos patrones internos pueden ser i) un compuesto distinto de los que se han de determinar que no está presente en la muestra (método del patrón interno), ii) uno o varios de los compuestos a determinar donde se ha alterado la abundancia isotópica de alguno de los elementos presentes en el compuesto (método de dilución isotópica) o iii) uno o varios de los compuestos a determinar pero sin modificar las abundancias isotópicas naturales (método de adiciones estándar). Cuando la muestra es líquida se puede añadir el patrón interno directamente sobre la muestra.
- b)
- Una vez extraídos los compuestos del sólido o cuando la muestra es líquida puede ser necesario un proceso de preconcentración o de separación de otros compuestos interferentes por técnicas de separación no cromatográficas cuyo rendimiento hay que determinar.
- c)
- Finalmente, la muestra ya preparada se inyecta en un sistema cromatográfico para la separación de los distintos compuestos orgánicos presentes y su detección con un dispositivo instrumental adecuado.
- d)
- La señal, en área o altura de pico, se compara con una línea de calibrado preparada a partir de patrones puros para cada compuesto a determinar ya que la señal instrumental es diferente para cada compuesto. Esta calibración permite determinar el contenido del compuesto orgánico en la muestra inyectada. Cabe resaltar que esta etapa del análisis es, sin duda alguna, la de mayor coste del proceso ya que los patrones certificados son caros y cada compuesto presente en la muestra requiere su calibración independiente, lo que requiere tiempo y dinero.
- e)
- En el caso de que se haya utilizado algún tipo de los patrones internos descritos más arriba las metodologías de cuantificación difieren ligeramente.
La presente invención pretende eliminar o
simplificar algunos de los pasos descritos más arriba mediante la
utilización de la dilución isotópica en linea (ver referencias 1 a
5). La dilución isotópica es una técnica clásica de determinación
elemental descrita hace ya más de 50 años. Se basa en la alteración
intencionada de la abundancia isotópica de un elemento en la
muestra por la adición de una cantidad conocida del mismo elemento
con una abundancia isotópica alterada (trazador) y la medida de la
abundancia isotópica final en la mezcla mediante Espectrometría de
Masas. Este principio fundamental se ilustra en la Figura 1 para un
elemento que posee dos isótopos: a y b. Como se puede observar, el
isótopo a es el más abundante en la muestra mientras que el
trazador está enriquecido en el isótopo b. La abundancia isotópica
en la mezcla será una combinación lineal de las abundancias en la
muestra y trazador que dependerá de la cantidad de elemento
presente en la muestra y de la cantidad de trazador adicionada. La
medida de la relación isotópica R_{m} en la mezcla
(isótopo a/isótopo b) permite determinar la cantidad del elemento en
la muestra original.
Este principio puede aplicarse a la
determinación de la cantidad de un elemento que eluye de un sistema
cromatográfico utilizando la dilución isotópica en línea cuyo
principio fundamental se ilustra en la Figura 2 para un sistema de
cromatografía líquida y que ya ha sido descrito en diversas
publicaciones (ver referencias 1 a 5).
Como se puede observar en la Figura 2 la muestra
y el trazador se mezclan en continuo (en flujo) tras la separación
cromatográfica y la medida de la relación isotópica en la mezcla
R_{m} se realiza en función del tiempo mediante
Espectrometría de Masas. Si el aporte de trazador a la mezcla se
mantiene constante en el tiempo, la relación isotópica medida en la
mezcla (R_{m}) dependerá únicamente del aporte del
elemento a analizar proveniente de la muestra, que puede ser
constante o variable. En nuestro caso, el aporte del elemento a la
mezcla procedente de la muestra varía con el tiempo debido a la
separación cromatográfica y por tanto, las ecuaciones de la
dilución isotópica se modifican introduciendo el flujo másico del
elemento como variable desconocida (ver referencias 1 a 5). La
representación del flujo másico en función del tiempo será el
denominado cromatograma de flujo másico. La integración de cada
pico cromatográfico nos proporciona de forma absoluta la masa del
elemento en dicho pico. La concentración en la muestra original se
calcula conociendo la masa (o el volumen) de muestra inyectada en
el sistema cromatográfico (ver referencias 1 a 5). Como se puede
observar, este procedimiento elimina directamente el paso d)
descrito anteriormente ya que la cuantificación se realiza
directamente durante la separación cromatográfica (paso c).
Cuando se pretende utilizar la dilución
isotópica en línea para análisis elemental tras una separación
cromatográfica es imprescindible que exista un equilibrio isotópico
entre los compuestos eluídos de la columna cromatográfica y el
compuesto químico utilizado como trazador que contiene el elemento
enriquecido isotópicamente. La consecución de este equilibrio
isotópico se ha descrito en la literatura únicamente utilizando el
plasma de acoplamiento inductivo como fuente de ionización ya que
es capaz de romper todos los enlaces químicos tanto en los
compuestos provenientes de la columna cromatográfica como del
compuesto químico que contiene al trazador (ver referencias 1 a 5).
Por tanto, la eficacia del proceso de ionización será independiente
de la naturaleza del compuesto químico que contiene al analito o al
trazador enriquecido. Para la determinación de compuestos orgánicos
por dilución isotópica en línea existe sólo una publicación en la
literatura utilizando el plasma de acoplamiento inductivo como
fuente de ionización y ácido benzoico marcado con ^{13}C como
trazador (ver referencia 6). Sin embargo, esta fuente de ionización
no es la más adecuada para la determinación de carbono debido al
bajo rendimiento del proceso de ionización para este elemento y a
la posible contaminación por carbono atmosférico.
- (1)
- "Isotope dilution analysis for trace element speciation. A tutorial review". Rodríguez González, P; Marchante Gayón, JM; García Alonso, JI; Sanz Medel, A. SPECTROCHIMICA ACTA PART B-ATOMIC SPECTROSCOPY, 2005, 60 (2): 151-207.
- (2)
- "Isotope-dilution mass spectrometry". Heumann KG. INTERNATIONAL JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY AND ION PROCESSES, 1992, 118:575-592.
- (3)
- "Speciation of essential elements in human serum using anion-exchange chromatography coupled to post-column isotope dilution analysis with double focusing ICP-MS"Muñiz CS, Marchante Gayón, JM; García Alonso, JI; Sanz Medel, A. JOURNAL OF ANALYTICAL ATOMIC SPECTROSCOPY, 2001, 16 (6): 587-592.
- (4)
- "Quantitative speciation of selenium in human serum by affinity chromatography coupled to post-column isotope dilution analysis ICP-MS". Reyes LH, Marchante-Gayón JM, García Alonso, JI; Sanz Medel, A. JOURNAL OF ANALYTICAL ATOMIC SPECTROSCOPY, 2003, 18 (10): 1210-1216.
- (5)
- "Determination of cadmium in biological and environmental materials by isotope dilution inductively coupled plasma mass spectrometry: effect of flow sample introduction methods"Mota JPV, de la Campa MRF, García Alonso, JI; Sanz Medel, A. JOURNAL OF ANALYTICAL ATOMIC SPECTROSCOPY, 1999, 14 (2): 113-120.
- (6)
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La presente invención aplica la dilución
isotópica en línea a la determinación absoluta de compuestos
orgánicos con alta sensibilidad y precisión mediante la medida
continua de la relación isotópica ^{12}C/^{13}C a la salida de
un sistema cromatográfico utilizando fuentes de ionización
alternativas al plasma de acoplamiento inductivo. Estas otras
fuentes de ionización, que podrían trabajar a alto vacío,
proporcionarían una mayor sensibilidad y menores contaminaciones de
carbono, lo que se traduciría en mejores limites de detección para
compuestos orgánicos. Para ello, se ha desarrollado un
procedimiento que permite alcanzar el equilibrio isotópico entre
los compuestos que eluyen de la columna cromatográfica y el
trazador enriquecido isotópicamente como paso previo a su
introducción en la fuente de ionización. La consecución de este
equilibrio isotópico previo nos permitiría elegir la fuente de
ionización más adecuada para el análisis de compuestos orgánicos
sin tener que recurrir necesariamente, como hasta ahora, al plasma
de acoplamiento inductivo.
La presente invención utiliza una reacción
química capaz de transformar cuantitativamente el carbono presente
en cada compuesto orgánico que eluye de la columna cromatográfica
en dióxido de carbono (CO_{2}) como medio para alcanzar el
equilibrio isotópico. Este dióxido de carbono proveniente de los
compuestos orgánicos de la muestra se mezcla con un compuesto
volátil de carbono marcado con ^{13}C enriquecido antes de su
introducción en la fuente de ionización del Espectrómetro de Masas
para su análisis por dilución isotópica en línea.
Para introducir el carbono marcado
isotópicamente con ^{13}C, trazador, y realizar la dilución
isotópica en línea, la presente invención comprende dos formas
alternativas igualmente válidas:
- a)
- Introducir el trazador directamente como dióxido de carbono enriquecido en ^{13}C (realización preferente).
- b)
- Introducir el trazador como otro compuesto volátil de carbono (por ejemplo metano) enriquecido ^{13}C.
En el primero de los casos (utilización de
CO_{2}) el trazador puede introducirse en cualquier momento en el
sistema cromatográfico (en la fase móvil, después de la columna o
después de la reacción química) mientras que para el segundo caso
(metano) la introducción se hará siempre antes de la reacción
química para convertir el compuesto utilizado como trazador también
en CO_{2}.
La mezcla así obtenida se introduce en un
Espectrómetro de Masas para la medida de la relación isotópica del
carbono de forma continua obteniendo así el cromatograma de flujo
másico. La medida de la relación isotópica ^{12}C/^{13}C se
puede realizar, en función de la fuente de ionización utilizada,
tanto en los propios iones monopositivos de carbono a masas 12 y 13
como en otros iones derivados de éstos como, por ejemplo, en el
CO_{2}^{+} a masas 44 y 45, respectivamente.
El método absoluto de cuantificación de
compuestos orgánicos objeto de la invención presenta, respecto a
las metodologías actuales de cuantificación de compuestos
orgánicos, las siguientes ventajas:
- a)
- Es un método universal que serviría para cualquier compuesto orgánico independientemente de su forma química ya que el carbono presente en todo compuesto orgánico es susceptible de ser transformado cuantitativamente en CO_{2} mediante una reacción química.
- b)
- Es un método absoluto que no requiere la utilización de patrones de calibrado para cada compuesto a determinar, lo que disminuye ostensiblemente el coste y el tiempo de los análisis en los laboratorios de rutina. De hecho, permitiría la cuantificación absoluta de todo compuesto que contenga carbono presente en la muestra, y que eluya del sistema cromatográfico, en una sola inyección sin necesidad de patrón alguno.
- c)
- Utiliza la dilución isotópica por cuanto puede considerarse un método primario de análisis directamente trazable al Sistema Internacional de unidades.
- d)
- Requiere una mínima modificación de los sistemas cromatográficos actuales para introducir la reacción química y el flujo de carbono 13 enriquecido.
- e)
- Utiliza Espectrómetros de Masas de bajo coste ya que no se requieren altas precisiones en las relaciones isotópicas medidas.
- f)
- Permite la utilización de patrones internos para corregir errores metodológicos durante la preparación de la muestra, variaciones en el volumen inyectado o variaciones de volumen debidas a la evaporación del disolvente, dado que esta metodología permite determinar también de forma absoluta la cantidad de patrón interno inyectada.
La presente invención puede ser empleada tanto
en separaciones por cromatografía líquida como en separaciones por
cromatografía de gases y podrá encontrar aplicación en laboratorios
de ensayo medioambientales y en laboratorios de control de procesos
industriales donde se realicen determinaciones rutinarias de
compuestos orgánicos, de estructura química conocida, por técnicas
cromatográficas. En concreto, la determinación de hidrocarburos
alifáticos en diversos tipos de muestras, de hidrocarburos
aromáticos, pesticidas, compuestos organoclorados, etc. sería
factible con esta invención. Por tanto, uno de los campos de
aplicación más inmediatos es al análisis medioambiental de
contaminantes orgánicos en laboratorios de ensayo. Un segundo campo
de aplicación importante sería en el control de calidad de
productos industriales y farmacéuticos y en el control de procesos
químicos, realizados normalmente en los laboratorios de las propias
plantas de producción.
Otros campos de aplicación, dentro de la Química
Analítica, podrían ser la optimización y estudio de procesos de
separación no cromatográficos (extracción
liquido-liquido, extracción
sólido-liquido, microextracción en fase sólida,
etc.) dado que la cuantificación absoluta que se realiza por este
método puede servir para estudiar y optimizar estos procesos con
elevada fiabilidad. Un caso particular es la selección y
utilización de patrones internos para corregir errores en los
procesos de separación no cromatográficos.
Desde el punto de vista instrumental, la
presente invención se podrá incorporar en equipos cromatográficos
que emplean la Espectrometría de Masas como sistema de detección
(equipos sencillos de GC-MS o
HLC-MS) y por tanto, consiste en una modificación
instrumental susceptible de comercialización por las empresas de
instrumentación analítica. Estos equipos modificados permitirían la
realización de análisis de rutina de compuestos orgánicos con una
elevada precisión y exactitud, a bajo coste para los laboratorios y
en un tiempo considerablemente más corto que los métodos
tradicionales de calibrado externo y adiciones estándar.
Figura 1: Ilustración del principio básico del
análisis por dilución isotópica.
Figura 2: Ilustración del principio de la
dilución isotópica en línea para un sistema de cromatografía
líquida.
Figura 3: Esquema de una realización
preferente.
Para una mejor comprensión del proceso objeto de
la presente invención se explicará el procedimiento a seguir para
la determinación de compuestos orgánicos por Cromatografía de Gases
utilizando un Espectrómetro de Masas de cuadrupolo con una fuente
de ionización de impacto electrónico, que se podría considerar como
"realización preferente" de la invención. Esto no significa que
la invención no pueda aplicarse a otras técnicas cromatográficas o
con las otras alternativas descritas previamente.
El dióxido de carbono enriquecido en ^{13}C se
prepara disuelto en Helio presurizado. El recipiente que contiene
el trazador tendría un orificio de salida y el flujo de gas iría
controlado mediante un controlador de flujo másico que regularía
exactamente el flujo de trazador añadido a la mezcla.
Por otro lado, a la salida de la columna
cromatográfica se instada una interfase de combustión consistente
en un tubo de sílice fundida donde se introducen hilos de cobre,
oxidados previamente en una corriente de aire a CuO, y que se puede
mantener a una temperatura adecuada (> 850ºC) para que ocurra la
reacción genérica:
C_{n}H_{2n+2}
+ (3n+1) \ CuO \Rightarrow nCO_{2} + (n+1) \ H_{2}O + (3n+1) \
Cu
de forma cuantitativa y donde
C_{n}H_{2n+2} es un hidrocarburo alifático cualquiera.
Cualquier compuesto orgánico produciría la reacción anterior de
forma cuantitativa convirtiéndose en dióxido de carbono, agua y, en
caso de presencia de heteroátomos, otros productos de reacción
(NO_{2}, SO_{2}, etc). El flujo de dióxido de carbono marcado
con ^{13}C se añadiría a la salida de la interfase de combustión y
la mezcla así generada se introduciría, a través de un tubo de
sílice fundida, en la fuente de ionización de un Espectrómetro de
Masas. Utilizando una fuente de ionización de impacto electrónico
se podrían medir las relaciones isotópicas del carbono en el ión
molecular CO_{2}^{+} a masas 44 (para el carbono 12) y 45 (para
el carbono 13). La relación isotópica medida se convertiría en
relación isotópica ^{12}C/^{13}C teniendo en cuenta las
abundancias isotópicas naturales del oxígeno si fuera necesario.
Esa relación isotópica se introduciría en la ecuación de la
dilución isotópica en linea (ver referencia 1) para obtener el
cromatograma de flujo másico y así poder determinar directamente la
masa de carbono en cada pico cromatográfico tras su correspondiente
integración. Un esquema general de esta realización preferida se
ilustra en la Figura
3.
Claims (4)
1. Método absoluto de cuantificación de
compuestos orgánicos caracterizado por la utilización de la
dilución isotópica en línea acoplada a un sistema de separación
cromatográfico para la determinación de la cantidad (masa) de
carbono que eluye en cada pico cromatográfico.
2. Método absoluto de cuantificación de
compuestos orgánicos, según la reivindicación 1,
caracterizado porque los compuestos orgánicos eluidos del
sistema cromatográfico se transforman cuantitativamente en dióxido
de carbono mediante una reacción química y se mezclan, antes o
después de la reacción química, con un compuesto volátil
enriquecido en carbono-13 (trazador).
3. Método absoluto de cuantificación de
compuestos orgánicos, según las reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el uso de la medida en continuo de la
relación isotópica ^{12}C/^{13}C en la mezcla generada mediante
un Espectrómetro de Masas, directamente o derivada de una relación
isotópica medida en un ión molecular, para construir así un
cromatograma de flujo másico de carbono en base a la ecuación de la
dilución isotópica en línea.
4. Método absoluto de cuantificación de
compuestos orgánicos, según las reivindicaciones anteriores,
caracterizado por la utilización del cromatograma de flujo
másico para determinar de forma absoluta la masa de carbono presente
en cada pico cromatográfico tras la integración matemática de
dichos picos respecto al tiempo.
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