WO2007039315A1

WO2007039315A1 - Pflanzen mit gesteigerter produktion von hyaluronan ii

Info

Publication number: WO2007039315A1
Application number: PCT/EP2006/009774
Authority: WO
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer Cropscience Ag
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2007-04-12
Also published as: AU2006298962A1; BRPI0616844A2; JP2009509556A; CN101297041A; ZA200803693B; CA2624496A1; EP1941047A1; US20080250533A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine erhöhte Menge an Hyaluronan synthetisieren, sowie Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen, als auch Verfahren zur Herstellung von Hyaluronan mit Hilfe dieser Pflanzenzellen oder Pflanzen. Erfindungsgemäße Pflanzenzellen oder genetisch modifizierte Pflanzen weisen dabei die Aktivität einer Hyaluronansynthase und zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer UDP-Glucose Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) im Vergleich zu Wildtyp Pflanzenzellen bzw. Wildtyp Pflanzen auf. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Pflanzen mit gesteigerter Hyaluronansynthese zur Herstellung von Hyaluronan und Lebens- oder Futtermitteln, die Hyaluronan enthalten.

Description

Pflanzen mit gesteigerter Produktion von Hyaluronan Il

Hyaluronan ist ein in der Natur vorkommendes, unverzweigtes, lineares

Mucopolysaccharid (Glucosaminoglucan), welches aus alternierenden Molekülen von Glucuronsäure und N-Acetyl-Glucosamin zusammengesetzt ist. Der Grundbaustein von Hyaluronan besteht aus dem Disaccharid Glucuronsäure-beta-1 ,3-N-Acetyl-

Glucosamin. Diese Wiederholungseinheit ist im Hyaluronan durch beta-1 ,4-

Verknüpfungen miteinander verbunden.

Im Bereich der Pharmazie wird häufig der Begriff Hyaluronsäure verwendet. Da Hyaluronan meist als Polyanion und nicht als freie Säure vorliegt, wird im Folgenden der Begriff Hyaluronan bevorzugt verwendet, wobei beide Molekülformen von der jeweiligen Bezeichnung als umfasst gelten.

Hyaluronan besitzt außergewöhnliche physico-chemische Eigenschaften, wie z.B. Eigenschaften von Polyelektrolyten, viskoelastische Eigenschaften, eine hohe

Wasserbindekapazität, Eigenschaften der Gelbildung, die, neben weiteren

Eigenschaften von Hyaluronan, in einem Übersichtsartikel von Lapcik et al. (1998,

Chemical Reviews 98(8), 2663-2684) beschrieben sind.

Hyaluronan ist Bestandteil von extrazellulärem Bindegewebe und Körperflüssigkeiten von Vertebraten. Beim Menschen wird Hyaluronsäure von der Zellmembran aller

Körperzellen, vor allem der mesenchymalen Zellen, synthetisiert und kommt ubiquitär im Körper vor, mit einer besonders hohen Konzentration in den Bindegeweben, der extrazellulären Matrix, der Nabelschnur, der Gelenkflüssigkeit, dem Knorpelgewebe, der Haut und dem Glaskörper des Auges (Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural- Dissertation, Virchow-Klinikum Medizinische Fakultät Charite der Humboldt Universität zu Berlin; Fräser et al., 1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33). Kürzlich konnte Hyaluronan auch in tierischen nicht-Vertebraten Organismen (Mollusken) nachgewiesen werden (Volpi und Maccari, 2003, Biochimie 85, 619- 625). Weiterhin synthetisieren einige human pathogene gram-positive Bakterien (Gruppe A und C Streptococcus) und gram-negative Bakterien (Pasteurella) Hyaluronan als Exopolysaccharide, die diese Bakterien vor dem Zugriff des Immunsystems ihres Wirtes bewahren, da Hyaluronan eine nicht immunogene Substanz darstellt. Viren, welche einzellige und teilweise als Endosymbionten in Paramecium Spezies vorkommende Grünalgen der Gattung Chlorella infizieren, vermitteln den einzelligen Grünalgen nach Virusinfektion die Fähigkeit, Hyaluronan zu synthetisieren (Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23). Jedoch ist die Fähigkeit zur Hyaluronsynthese kein Merkmal, dass den betreffenden Algen zuzuordnen ist. Die Fähigkeit der Algen, Hyaluronan zu synthetisieren wird durch eine Infektion eines Virus, dessen Genom eine Hyaluronansynthase codierende Sequenz aufweist, vermittelt (DeAngelis, 1997, Science 278, 1800-1803). Weiterhin enthält das Virus Genom Sequenzen, codierend für eine UDP-Glucose-Dehydrogenase (UDP-GIc-DH). UDP-GIc-DH katalysiert die Synthese von UDP-Glucuronsäure, das von der Hyaluronansynthase als Substrat verwendet wird (DeAngelis et al., 1997, Science 278, 1800-1803, Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23). Welche Rolle die Expression von UDP-GIc-DH in Virus infizierten Chlorella Zellen für die Hyaluronansynthese spielt und ob sie für die Hyaluronansynthese benötigt werden, ist nicht bekannt.

Natürlich vorkommende Pflanzen selbst weisen in ihrem Genom keine Nucleinsäuren auf, die Proteine codieren, welche die Synthese von Hyaluronan katalysieren und, obwohl eine Vielzahl an pflanzlichen Kohlenhydraten beschrieben und charakterisiert wurden, konnten bisher weder Hyaluronan noch dem Hyaluronan verwandte Moleküle in nicht infizierten, natürlich vorkommenden Pflanzen nachgewiesen werden (Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23). Die Katalyse der Hyaluronansynthese wird durch ein einziges, Membran integriertes oder Membran assoziiertes Enzym, der Hyaluronansynthase bewerkstelligt. Die bisher untersuchten Hyaluronansynthasen können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Hyaluronansynthasen der Klasse I und Hyaluronansynthasen der Klasse Il (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682).

Eine weitere Unterscheidung der Hyaluronansynthasen aus Vertebraten erfolgt an Hand der identifizierten Isoenzyme. Die verschiedenen Isoenzyme werden in der Reihenfolge ihrer Identifizierung mit arabischen Nummern bezeichnet (z.B. hsHASI , hsHAS2, hsHAS3).

Der Mechanismus des Transfers von synthetisierten Hyaluronanmolekülen über die Cytoplasmamembran hinweg in das die Zelle umgebende Medium, ist noch nicht vollständig geklärt. Frühere Hypothesen, gingen davon aus, dass der Transport über die Zellmembran hinweg von der Hyaluronansynthase selbst bewerkstelligt würde. Neuere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass der Transport von Hyaluronanmolekülen über die Cytoplasmamembran durch einen energieabhängigen Transport mittels dafür zuständiger Transportproteine stattfindet. So wurden durch Mutagenese Streptococcus Stämme erzeugt, bei welchen die Synthese eines aktiven Transportproteins inhibiert war. Diese Stämme synthetisierten weniger Hyaluronan als entsprechende Wildtyp Bakterienstämme (Ouskova et al., 2004, Glycobiology 14(10), 931-938). In humanen Fibroblastenzellen konnte mit Hilfe von auf bekannte Transportproteine spezifisch inhibierend wirkenden Agentien gezeigt werden, dass sowohl die Menge an produziertem Hyaluronan, als auch die Aktivität von Hyaluronansynthasen reduziert werden kann (Prehm und Schumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410). Ob und wenn überhaupt, in welcher Menge Transportproteine, die Hyaluronan transportieren können, in Pflanzen vorliegen, ist nicht bekannt.

Die außergewöhnlichen Eigenschaften des Hyaluronans eröffnen eine Vielfalt an Möglichkeiten für die Anwendung auf verschiedensten Gebieten, wie z.B. der Pharmazie, der Kosmetikindustrie, in der Lebens- und Futtermittel Herstellung, bei technischen Anwendungen (z.B: als Schmierstoffe) etc. Die wichtigsten Anwendungen, bei denen Hyaluronan zurzeit verwendet wird, liegen im medizinischen und kosmetischen Bereich (siehe z.B. Lapcik et al., 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684, Goa und Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566). Im medizinischen Bereich werden Hyaluronan enthaltende Produkte derzeit zur intraartikulären Arthrosebehandlung sowie bei den Ophthalmika, die bei Operationen am Auge zum Einsatz kommen, verwendet. Auch für die Behandlung von Gelenkerkrankungen bei Rennpferden wird Hyaluronan eingesetzt. Daneben ist Hyaluronsäure Bestandteil einiger Rhinologica, die z.B. in Form von Augentropfen und Nasalia der Befeuchtung trockener Schleimhäute dienen. Hyaluronan enthaltende Injektionslösungen werden als Analgetika und Antirheumatica verwendet. Hyaluronan oder derivatisiertes Hyaluronan enthaltende Auflagen werden bei der Wundheilung eingesetzt. Als Dermatika werden Hyaluronan enthaltende Gelimplantate zur Korrektur von Hautdeformationen in der plastischen Chirugie verwendet. Für pharmakologische Anwendungen wird Hyaluronan mit einem hohen Molekulargewicht bevorzugt.

In der Schönheitsmedizin zählen Hyaluronpräparate zu den geeigneten Hautfüllmaterialien. Durch Einspritzen von Hyaluronan erreicht man für eine begrenzte Zeit die Glättung von Falten oder ein vergrößertes Lippenvolumen. In kosmetischen Produkten, insbesondere in Hautcremes und Lotionen findet Hyaluronan wegen seiner hohen Wasserbindungskapazität häufig Anwendung als Feuchtigkeitsspender.

Weiterhin werden Hyaluronan enthaltende Präparate als so genannte Nutraceuticals (Nahrungsergänzungsmittel) vertrieben, die auch bei Tieren (z.B. Hunde, Pferde) zur Vorbeugung und Linderung von Arthrose angewandt werden.

Für gewerbliche Zwecke verwendetes Hyaluronan wird zurzeit aus tierischen Geweben (Hahnenkämmen) isoliert oder fermentativ mittels Bakterienkulturen hergestellt. Ein Verfahren zur Isolierung von Hyaluronan aus Hahnenkämmen oder alternativ aus Nabelschnüren ist beschrieben in US 4,141 ,973. Neben Hyaluronan kommen in tierischen Geweben (z.B. Hahnenkämme, Nabelschnüre) noch weitere, mit Hyaluronan verwandte Mucopolysaccharide, wie Chondrotinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparansulfat und Heparin vor. Tierische Organismen weisen weiterhin Proteine (Hyaladherine) auf, die spezifisch an Hyaluronan binden und für verschiedenste Funktionen im Organismus, wie z.B. dem Abbau von Hyaluronan in der Leber, der Funktion von Hyaluronan als Leitstruktur für die Zellwanderung, die Regulierung der Endocytose, die Verankerung von Hyaluronan an der Zelloberfläche oder die Ausbildung von Hyaluronan Netzwerken notwendig sind (Turley, 1991 , Adv Drug Delivery Rev 7, 257 ff.; Laurent und Fräser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic und Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 ff; Knudson und Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.).

Die zur bakteriellen Produktion von Hyaluronan verwendeten Streptococcus Stämme gehören ausschließlich zu den human pathogenen Bakterien. Diese Bakterien produzieren auch beim Kultivieren (pyrogene) Exotoxine und Haemolysine (Streptolysin, (insbesondere alpha- und beta-Haemolysin) (Kilian, M.: Streptococcus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J. F. (Eds.). Kapitel 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp. 174-188, 2002, ISBN 0443070776), die ins Kulturmedium abgegeben werden. Dieses erschwert die Reinigung und Isolierung des Hyaluronans, welches mit Hilfe von Streptococcus Stämmen hergestellt wurde. Besonders für phamazeutische Anwendungen stellt das Vorliegen von Exotoxinen und Haemolysinen in den Präparaten ein Problem dar. US 4,801 ,539 beschreibt die Herstellung von Hyaluronan durch Fermentation eines mutagenisierten Bakterienstammes (Streptococcus zooedemicus). Der verwendete mutagenisierte Bakterienstamm synthetisiert kein beta-Haemolysin mehr. Es wurde dabei eine Ausbeute von 3,6 g Hyaluronan pro Liter Kultur erreicht. EP 0694616 beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung von Streptococcus zooedemicus oder Streptococcus equi, worin unter den verwendeten Kulturbedingungen kein Streptolysin, aber erhöhte Mengen an Hyaluronan synthetisiert werden. Es wurde dabei eine Ausbeute von 3,5 g Hyaluronan pro Liter Kultur erreicht. Streptococcus Stämme geben während der Kultur das Enzym Hyaluronidase in das Kulturmedium ab, was dazu führt, dass auch bei diesem Produktionssystem das Molekulargewicht während der Aufreinigung reduziert wird. Die Verwendung von Hyaluronidase negativen Streptococcus Stämmen oder von Produktionsverfahren, bei welchen die Produktion von Hyaluronidase während der Kultur inhibiert wird, zur Produktion von Hyaluronan, sind in US 4,782,046 beschrieben. Es wurde dabei eine Ausbeute von bis zu 2,5 g Hyaluronan pro Liter Kultur erreicht, wobei ein maximales mittleres Molekulargewicht von 3,8x10⁶ Da bei einer Molekulargewichtsverteilung von 2,4x10⁶ bis 4,0x10⁶ erhalten wurde.

US 20030175902 und WO 03 054163 beschreiben die Herstellung von Hyaluronan mit Hilfe der heterologen Expression einer Hyaluronansynthase aus Streptococcus equisimilis in Bacillus subtilis. Um die Produktion von ausreichenden Mengen an Hyaluronan zu erlangen ist neben der heterologen Expression einer Hyaluronansynthase auch die gleichzeitige Expression einer UDP-Glucose- Dehydrogenase in den Bacillus Zellen notwendig. Die absolute Menge an Hyaluronan, die bei der Produktion mit Hilfe von Bacillus subtilis erhalten wird, ist in US 20030175902 und WO 03 054163 nicht angegeben. Es wurde ein maximales mittleres Molekulargewicht von ca. 4,2x10⁶ Da erhalten. Dieses mittlere Molekulargewicht wurde jedoch nur für den rekombinanten Bacillus Stamm erhalten, bei welchem ein Gen codierend das Hyaluronansynthase Gen aus Streptococcus equisimilis und das Gen codierend die UDP-Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis unter Kontrolle des amyQ Promotors in das Bacillus subtilis Genom integriert war und gleichzeitig das Bacillus subtilis endogene cxpY Gen (codierend eine P450 Cytochromoxidase) inaktiviert war.

WO 05 012529 beschreibt die Herstellung von transgenen Tabakpflanzen, die mit Nucleinsäuremolekülen, codierend Hyaluronansynthasen aus Chlorella infizierenden Viren transformiert wurden. In WO 05 012529 wurden zum einen Nucleinsäuresequenzen, codierend Hyaluronansynthase des Chlorellavirus CVHI1- Stammes und zum anderen des Chlorellavirus CVKA1 -Stammes für die Transformation von Tabakpflanzen verwendet. Die Synthese von Hyaluronan konnte nur für eine Pflanze, die nach Transformation mit einer Nucleinsäuresequenz, codierend eine Hyaluronansynthase, die aus dem Chlorellavirus CVKA1 -Stamm isoliert wurde, nachgewiesen werden. Für Tabakpflanzen, die mit einer Nucleinsäuresequenz, codierend eine Hyaluronansynthase, die aus dem Chlorellavirus CVHH-Stamm isoliert wurde, konnte keine Hyaluronansynthese in den entsprechenden transgenen Pflanzen nachgewiesen werden. Die Menge an Hyaluronan, die von der einzigen in WO 05 012529 erhaltenen, Hyaluronan produzierenden transgenen Tabakpflanze synthetisiert wurde, ist mit ca. 4,2 μg Hyaluronan pro ml Messvolumen angegeben was unter Berücksichtigung der Beschreibung zur Durchführung des betreffenden Experiments etwa einer Menge von maximal 12 μg an produziertem Hyaluronan pro Gramm Frischgewicht an Pflanzenmaterial entspricht.

Hyaluronansynthase katalysiert die Synthese von Hyaluronan ausgehend von den Edukten UDP-N-Acetyl Glucosamin und UDP-Glucuronsäure. Beide genannten Edukte kommen in pflanzlichen Zellen vor.

UDP-Glucuronsäure dient in pflanzlichen Zellen als Metabolit für einen von mehreren möglichen Synthesewegen der Ascorbinsäure (Lorence et al., 2004, Plant Physiol 134, 1200-1205) und als zentrales Metabolit für die Synthese der Zellwandbestandteile Pektin und Hemicellulose, die im Endoplasmatischen Reticulum der Pflanzenzelle synthetisiert werden (Reiter, 1998, Plant Physiol Biochem 36(1 ), 167-176). Das wichtigste und am häufigsten vorkommende Monomer des Pektins stellt die D-Galacturonsäure dar (2004, H. W. Heldt in „Plant Biochemistry", 3rd Edition, Academic Press, ISBN 0120883910), welche unter Verwendung von UDP-Glucuronsäure synthetisiert wird. Weiterhin können u.a. auch UDP-Xylose, UDP-Arabinose, UDP-Galaturonsäure und UDP-Apiose, Metabolite für die Synthese von Hemicellulose und Pektin, unter Verwendung von UDP- Glucuronsäure synthetisiert werden (Seitz et al., 2000, Plant Journal, 21(6), 537- 546). UDP-Glucuronsäure kann in pflanzlichen Zellen entweder mittels des Hexosephosphat Stoffwechsels, umfassend u.a. die Umsetzung von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure durch UDP-GIc-DH oder mittels des oxidativen myo-lnositol Stoffwechselweges, umfassend die Umsetzung von Glucuronat-1 -Phosphat zu UDP- Glucuronsäure mittels Glucuronat-1 -Phosphat Uridilyltransferase synthetisiert werden. Beide Stoffwechselwege zur Synthese von Glucuronsäure scheinen unabhängig voneinander, alternativ in unterschiedlichen

Geweben/Entwicklungsstadien von Arabidopsis Pflanzen zu existieren (Seitz et al., 2000, Plant Journal 21(6), 537-546). Welchen Beitrag die beiden genannten Stoffwechselwege (Hexosephosphat- oder oxidativer myo-lnositol-Stoffwechselweg) jeweils bezüglich der Synthese von UDP-Glucuronsäure leisten, ist noch nicht geklärt (Kärkönen, 2005, Plant Biosystems 139(1), 46-49).

Das Enzym UDP-GIc-DH katalysiert die Umsetzung von UDP-Glucose zu UDP- Glucuronsäure. Samac et al. (2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113- 116, Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182) beschreiben die gewebespezifische Überexpression einer UDP-GIc-DH aus Sojabohne in Phloemzellen von Alfalfa mit dem Ziel, den Pektingehalt in Stengeln dieser Pflanzen zu erhöhen. Obwohl die Aktivität der UDP-GIc-DH um mehr als 200% gegenüber entsprechenden Wildtyp Pflanzen gesteigert werden konnte, war die Menge an Pektin die von entsprechenden Pflanzen produziert wurde, geringer, als die Menge an Pektin, die von entsprechenden Wildtyp Pflanzen produziert wurde. Die Menge an Xylose und Rhamnose Monomeren in der Zellwandfraktion der betreffenden transgenen Pflanzen war erhöht, wohingegen die Menge an Mannose Monomeren in der Zellwandfraktion verringert war. Die konstitutive Überexpression einer UDP-GIc-DH in Arabidosis Pflanzen führte dazu, dass die betreffenden Pflanzen im Vergleich mit entsprechenden Wildtyp Pflanzen ein aberrantes Wachstum zeigten und einen Zwerg (dwarf) Phänotyp aufwiesen. Die Zellwandfraktion der entsprechenden Pflanzen wies eine erhöhte Menge an Mannose und Galactose und eine verringerte Menge an Xylose, Arabinose und Uronsäuren im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp Pflanzen auf (Roman, 2004, „Studies on The RoIe of UDP-GIc-DH in Polysaccharide Biosynthesis", Dissertation, Acta Universitatis Upsaliensis, ISBN 91-554-6088-7, ISSN 0282-7476). Diese Ergebnisse stehen also zumindest teilweise im Widerspruch zu den Ergebnissen von Samac et al. (2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press, Edittor Ashok Mulehandani, 1167-1182), die eine verringerte Menge an Mannose und eine erhöhte Menge an Xyolse in der Zellwandfraktion entsprechender transgener Pflanzen nachgewiesen hatten.

Die Produktion von Hyaluronan mit Hilfe der Fermentation von Bakterien Stämmen ist mit hohen Kosten verbunden, da die Bakterien in geschlossenen, sterilen Behältnissen, unter aufwendigen, kontrollierten Kulturbedingungen (siehe z.B. US 4,897,349) fermentiert werden müssen. Weiterhin ist die Menge an Hyaluronan, die mittels Fermentation von Bakterien Stämmen produziert werden kann, beschränkt durch die jeweils bestehenden Produktionsanlagen. Dabei ist auch zu berücksichtigen, dass Fermenter wegen physikalischer Gesetzmäßigkeiten nicht für übermäßig große Kulturvolumen gebaut werden können. Insbesondere ist hier die für eine effiziente Produktion gleichmäßige Durchmischung von durch von außen zugeführten Substanzen (z.B. essentielle Nährstoffquellen für Bakterien, Reagenzien zur pH Regulierung, Sauerstoff) mit dem Kulturmedium zu erwähnen, die in großen Fermentern, wenn überhaupt, nur mit großem technischen Aufwand gewährleistet werden kann.

Das Vorhandensein von anderen Mucopolysacchariden und von spezifisch an Hyaluronan bindenden Proteinen in tierischen Geweben macht die Aufreinigung von Hyaluronan aus tierischen Organismen aufwendig. Die Verwendung von Hyaluronan haltigen medizinischen Präparaten, die mit tierischen Proteinen verunreinigt sind, kann bei Patienten zu unerwünschten immunologischen Reaktionen des Körpers führen (US 4,141 ,973), insbesondere dann, wenn der Patient eine Allergie gegen tierische Proteine (z.B. Hühnereiweiß) aufweist. Weiterhin sind die Mengen (Ausbeuten) an Hyaluronan, die aus tierischen Geweben in ausreichender Qualität und Reinheit gewonnen werden können, gering (Hahnenkamm: 0,079% w/w, EP 0144019, US 4,782,046), was dazu führt, dass große Mengen an tierischen Geweben verarbeitet werden müssen. Ein weiteres Problem bei der Isolierung von Hyaluronan aus tierischen Geweben besteht darin, dass das Molekulargewicht des Hyaluronans während der Aufreinigung verringert wird, weil tierische Gewebe auch ein Hyaluronan abbauendes Enzym (Hyaluronidase) aufweisen.

Streptococcus Stämme produzieren neben den bereits erwähnten Hyaluronidasen und Exotoxinen auch Endotoxine, die, wenn in phamakologischen Produkten vorhanden, Risiken für die Gesundheit des Patienten darstellen. In einer wissenschaftlichen Studie wurde gezeigt, dass selbst auf dem Markt befindliche Hyaluronan enthaltende medizinische Präparate noch nachweisbare Mengen an bakteriellen Endotoxinen aufweisen (Dick et al., 2003, Eur J Opthalmol. 13(2), 176- 184). Ein weiterer Nachteil des mit Hilfe von Streptococcus Stämmen produzierten Hyaluronans besteht darin, dass das isolierte Hyaluronan ein geringeres Molekulargewicht aufweist, als Hyaluronan, welches aus Hahnenkämmen isoliert wurde (Lapcik et al. 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684). US 20030134393 beschreibt die Verwendung eines Streptococcus Stammes zur Produktion von Hyaluronan, welcher eine besonders ausgeprägte Hyaluronan Kapsel (supercapsulated) synthetisiert. Das nach Fermentation isolierte Hyaluronan wies ein Molekulargewicht von 9, 1x10⁶ Da auf. Jedoch betrug die Ausbeute lediglich 350 mg pro Liter.

Einige der Nachteile der Produktion von Hyaluronan mittels bakterieller Fermentation oder durch Isolierung aus tierischen Geweben könnten durch die Produktion von Hyaluronan mittels transgener Pflanzen zwar ausgeschlossen werden, jedoch würden die bisher erreichten Mengen an Hyaluronan, die mittels transgener Pflanzen hergestellt werden können, eine relativ große Anbaufläche benötigen, um größere Mengen an Hyaluronan zu produzieren. Weiterhin ist die Isolierung oder Aufreinigung von Hyaluronan aus Pflanzen, die einen geringen Hyaluronangehalt aufweisen wesentlich aufwendiger und kostenintensiver als aus Pflanzen, die einen höheren Hyaluronangehalt aufweisen.

Obwohl Hyaluronan außergewöhnliche Eigenschaften aufweist, wird es für technische Anwendungen wegen seiner geringen Verfügbarkeit und des hohen Preises bisher, wenn überhaupt, selten eingesetzt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, Hyaluronan in ausreichender Menge und Qualität zur Verfügung zu stellen, sowie die Möglichkeit zu eröffnen, Hyaluronan auch für technische Anwendungen und Anwendungen im Lebensmittel- und Futtermittelbereich zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder genetisch modifizierte Pflanzen, die ein in ihr Genom stabil integriertes Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Pflanzenzellen oder besagte Pflanzen zusätzlich eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der (enzymatischen) Aktivität einer UDP-Glucose Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) aufweisen im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen.

Die genetische Modifikation erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen kann dabei jede genetische Modifikation sein, die eine stabile Integration eines Nucleinsäuremoleküls, codierend eine Hyaluronansynthase in eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze bewirkt und die zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der (enzymatischen) Aktivität einer UDP-GIc-DH in genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder genetisch modifizierten Pflanzen führt, im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen.

Der Begriff „Wildtyp-Pflanzenzelle" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass es sich um Pflanzenzellen handelt, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen dienten, d.h. deren genetische Information, abgesehen von den eingeführten genetischen Modifikationen, die zu einer stabilen Integration eines Nucleinsäuremoleküls, codierend eine Hyaluronansynthase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führen, der einer erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzelle entspricht.

Der Begriff „Wildtyp-Pflanze" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass es sich um Pflanzen handelt, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen dienten, d.h. deren genetische Information, abgesehen von den eingeführten genetischen Modifikationen, die zu einer stabilen Integration eines Nucleinsäuremoleküls, codierend eine Hyaluronansynthase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führen, der einer erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanze entspricht. Der Begriff „entsprechend" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass beim Vergleich von mehreren Gegenständen die betreffenden Gegenstände, die miteinander verglichen werden, unter gleichen Bedingungen gehalten wurden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „entsprechend" im Zusammenhang mit Wildtyp-Pflanzenzelle oder Wildtyp- Pflanze, dass die Pflanzenzellen oder Pflanzen, die miteinander verglichen werden, unter gleichen Kulturbedingungen aufgezogen wurden und dass sie ein gleiches (Kultur-) Alter aufweisen.

Unter dem Begriff „Hyaluronansynthase" (EC 2.4.1.212) soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Protein verstanden werden, das ausgehend von den Substraten UDP-Glucuronsäure (UDP-GIcA) und N-Acetyl-Glucosamin (UDP- GIcNAc) Hyaluronan synthetisiert. Die Katalyse der Hyaluronsynthese folgt dabei folgenden Reaktionsschemen:

nUDP-GIcA + nUDP-GIcNAc → beta-1 ,4-[GlcA-beta-1 ,3-GIcNAc]_n + 2 nUDP

Nucleinsäuremoleküle und korrespondierende Proteinsequenzen, codierend Hyaluronansynthasen sind u.a. für folgende Organismen beschrieben: Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) ocHas2 (EMBL AB055978.1 , US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1 , US 20030235893); Pavian (Papio anubis) paHasi (EMBL AY463695.1); Frosch {Xenopus laevis) xlHasi (EMBL M22249.1 , US 20030235893), xlHas2 (DG42) (EMBL AF168465.1 ), xlHas3 (EMBL AY302252.1 ); Mensch (Homo sapiens) hsHASI (EMBL D84424.1 , US 20030235893), hsHAS2 (EMBL U54804.1 , US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1 , US 20030235893); Maus (Mus musculus), mmHasi (EMBL D82964.1 , US 20030235893), mmHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3 (EMBL U86408.2, US 20030235893); Rind (Bos taurus) btHas2 (EMBL AJ004951.1 , US 20030235893); Huhn (Gallus gallus) ggHas2 (EMBL AF106940.1 , US 20030235893); Ratte (Rattus norvegicus) mHas 1 (EMBL AB097568.1 , Itano et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), rnHas2 (EMBL AF008201.1); mHas 3 (NCBI NMJ72319.1 , Itano et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), Pferd (Equus caballus) ecHAS2 (EMBL AY056582.1 , Gl:23428486), Schwein (Sus scrofa) sscHAS2 (NCBI NM_214053.1 , Gl:47522921 ), sscHas 3 (EMBLAB159675), Zebrafisch (Danio rerio) brHasi (EMBL AY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1) brHas3 (EMBL AF190743.1); Pasteυrella multocida pmHas (EMBL AF036004.2); Streptococcus pyogenes spHas (EMBL₁ L20853.1 , L21187.1 , US 6,455,304, US 20030235893); Streptococcus equis seHas (EMBL AF347022.1 , AY173078.1), Streptococcus uberis suHasA (EMBL AJ242946.2, US 20030235893), Streptococcus equisimilis seqHas (EMBL AF023876.1 , US 20030235893); Sulfolobus solfataricus ssHAS (US 20030235893), Sulfolobus tokodaii stHas (AP000988.1 ), Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893).

Unter dem Begriff „UDP-Glucose Dehydrogenase (UDP-GIc-DH)" (E.C. 1.1.1.22) soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Protein verstanden werden, das aus UDP-Glucose (UDP-GIc) und NAD⁺ UDP-Glucuronsäure (UDP-GIcA) und NADH synthetisiert. Diese Katalyse folgt dabei folgendem Reaktionsschema:

UDP-GIc + 2 NAD⁺ → UDP-GIcA + 2 NADH

Der Begriff „erhöhte Aktivität eines Proteins mit der (enzymatischen) Aktivität einer UDP-GIc-DH" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der

Expression endogener Gene, die Proteine mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren und/oder eine Erhöhung der Menge an Transkripten codierend Proteine mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH und/oder eine Erhöhung der Menge an Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH in den Zellen und/oder eine Erhöhung der enzymatischen Aktivität von Proteinen mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH in den

Zellen.

Eine Erhöhung der Expression kann beispielsweise bestimmt werden durch Messung der Menge an Transkripten, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc- DH, z.B. durch Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR. Eine Erhöhung bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Menge an Transkripten im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen oder nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen um mindestens 50%, insbesondere um mindestens 70%, bevorzugt um mindestens 85% und besonders bevorzugt um mindestens 100%. Eine Erhöhung der Menge an Transkripten, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH bedeutet auch, dass Pflanzen oder Pflanzenzellen, die keine nachweisbaren Mengen an Transkripten, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen, nach erfindungsgemäßer genetischer Modifikation nachweisbare Mengen an Transkripten, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen.

Die Erhöhung der Menge an Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH, die eine erhöhte Aktivität dieser Proteine in den betreffenden Pflanzenzellen zur Folge hat, kann beispielsweise bestimmt werden durch immunologische Methoden wie Western-Blot-Analyse, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) oder RIA (Radio Immune Assay). Methoden zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch mit einem bestimmten Protein reagieren, d.h. die spezifisch an besagtes Protein binden, sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Lottspeich und Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Die Herstellung solcher Antikörper wird von einigen Firmen (z.B. Eurogentec, Belgien) als Auftragsservice angeboten. Eine Erhöhung der Menge an Protein bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Menge an Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc- DH im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen oder nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen um mindestens 50%, insbesondere um mindestens 70%, bevorzugt um mindestens 85% und besonders bevorzugt um mindestens 100%. Eine Erhöhung der Menge an Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH bedeutet auch, dass Pflanzen oder Pflanzenzellen, die keine nachweisbare Menge eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen, nach erfindungsgemäßer genetischer Modifikation eine nachweisbare Menge eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen.

Die Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH in pflanzlichen Extrakten kann mit dem Fachmann bekannten Methoden wie z.B. beschrieben in WO 00 11192 beschrieben werden. Eine bevorzugte Methode zur Ermittlung der Menge der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH ist in Allgemeine Methoden, Punkt 5 aufgeführt. Eine Erhöhung der Menge an (enzymatischer) Aktivität von Proteinen mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH, bedeutet vorzugsweise eine Erhöhung der Aktivität solcher Proteine um mindestens 50%, bevorzugt um mindestens 70%, insbesondere bevorzugt um mindestens 85% und besonders bevorzugt um mindestens 100% im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen oder nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen. Eine Erhöhung der Menge an (enzymatischer) Aktivität von Proteinen mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH bedeutet auch, dass Pflanzen oder Pflanzenzellen, die keine nachweisbare Menge eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen, nach erfindungsgemäßer genetischer Modifikation eine nachweisbare Menge eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen.

Unter dem Begriff „Genom" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Gesamtheit des in einer pflanzlichen Zelle vorliegenden Erbmaterials verstanden werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass neben dem Zellkern auch andere Kompartimente (z.B. Piastiden, Mitochondrien) Erbmaterial enthalten.

Unter dem Begriff „stabil integriertes Nucleinsäuremolekül" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Integration eines Nukleinsäuremoleküls in das

Genom der Pflanze verstanden werden. Ein stabil integriertes Nucleinsäuremolekül zeichnet sich dadurch aus, dass es bei der Replikation des entsprechenden

Integrationsortes zusammen mit den wirtseigenen, den Integrationsort flankierenden

Nucleinsäuresequenzen vervielfältigt wird, so dass der Integrationsort in dem replizierten Tochter DNA Strang von den selben Nucleinsäuresequenzen umgeben ist, wie auf dem abgelesenen Mutter Strang, der als Matrize für die Replikation dient.

Für die stabile Integration von Nucleinsäuremolekülen in eine pflanzliche Wirtszelle steht eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung der DNA mittels des biolistischen Ansatzes sowie weitere Möglichkeiten (Übersicht in „Transgenic Plants", Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7). Die Verwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46 und bei An et al. EMBO J. 4, (1985), 277- 287 beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z.B. Rocha- Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33), für die Transformation von Tomatenpflanzen z.B. US 5,565,347.

Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels auf Agrobacteriυm Transformation basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11 , (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner und Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Ein alternatives System zur Transformation von monokotylen Pflanzen ist die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721- 726). Die Transformation von anderen Gräsern, wie z.B. der Rutenhirse (switchgrass, Panicum virgatum) ist ebenfalls beschrieben (Richards et al., 2001 , Plant Cell Reporters 20, 48-54). Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al., s.o.; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307). Alle vorstehenden Methoden sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet.

Erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen bieten gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil, dass sie höhere Mengen an Hyaluronan produzieren als Pflanzen, die nur die Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweisen. Dieses ermöglicht die Hyaluronan Produktion mit geringem Aufwand, da die Isolierung von Hyaluronan aus Pflanzen mit höherem Hyaluronangehalt weniger aufwendig und kostengünstiger ist. Weiterhin sind geringere Anbauflächen notwendig, um mit erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen Hyaluronan zu produzieren im Vergleich zu im Stand der Technik beschriebenen Pflanzen. Dieses führt zu der Möglichkeit, Hyaluronan in ausreichender Menge auch für technische Anwendungen zur Verfügung zu stellen, bei welchen es wegen der geringen Verfügbarkeit und des hohen Preises zurzeit keine Verwendung findet. Pflanzlichen Organismen der Gattung Chlorella, die mit einem Virus infiziert sind, sind nicht geeignet für die Produktion von größeren Mengen von Hyaluronan. Virus infizierte Algen weisen für die Produktion von Hyaluronan den Nachteil auf, dass sie die Gene, die für die Hyaluronansynthase notwendig sind, nicht stabil in ihr Genom integriert haben (Van Etten und Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494), so dass für die Produktion von Hyaluronan immer wieder eine erneute Virusinfektion erfolgen muss. Daher ist es nicht möglich, einzelne Chlorella Zellen zu isolieren, die kontinuierlich die gewünschte Qualität und Quantität an Hyaluronan synthetisieren. Weiterhin findet die Produktion von Hyaluronan in Virus infizierten Chlorella Algen nur für eine begrenzte Zeit statt und die Algen werden durch von dem Virus bewirkte Lyse bereits etwa 8 Stunden nach der Infektion abgetötet (Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516). Demgegenüber bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen unbegrenzt vegetativ oder sexuell vermehrt werden können und dass sie kontinuierlich Hyaluronan produzieren.

Die in WO 05 012529 beschriebenen transgenen Pflanzen, die ein Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase, aufweisen, synthetisieren eine relativ geringe Menge an Hyaluronan. Demgegenüber bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen deutlich höhere Mengen an Hyaluronan synthetisieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren.

Da beobachtet wurde, dass Hyaluronan über die Entwicklungszeit in pflanzlichem Gewebe akkumuliert, soll die Menge an Hyaluronan bezüglich der Frischgewichtes bzw. bezüglich des Trockengewichtes in erfindungsgemäßen genetisch modifizierten

Pflanzenzellen oder in erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen besonders bevorzugt zum Zeitpunkt der Ernte oder wenige (ein bis zwei) Tage vor der Ernte betreffender Pflanzenzellen bzw. betreffender Pflanzen bestimmt werden. Insbesondere wird dabei solches Pflanzenmaterial (z.B. Knollen, Samen, Blätter) bezüglich der Menge an Hyaluronan eingesetzt, das zur weiteren Verarbeitung herangezogen werden soll.

Erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren, lassen sich dadurch nachweisen, dass man das von ihnen synthetisierte Hyaluronan isoliert und dessen Struktur nachweist.

Da pflanzliches Gewebe den Vorteil aufweist, dass es keine Hyaluronidasen enthält, kann zum Nachweis des Vorliegens von Hyaluronan in erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen eine einfache und schnelle Isolierungsmethode verwendet werden. Dazu wird zu dem zu untersuchenden Pflanzengewebe Wasser hinzu gegeben, bevor das Pflanzengewebe mechanisch (z.B. unter zu Hilfenahme einer Kugelmühle, Schlagmühle, eines Warring Blendors, eines Entsafters etc.) zerkleinert wird. Anschließend kann bei Bedarf erneut Wasser zu der Suspension hinzu gegeben werden, bevor Zelltrümmer und Wasser unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation oder Sieben abgetrennt werden. Der Nachweis des Vorliegens von Hyaluronan kann anschließend im nach Zentrifugation erhaltenen Überstand z.B. mittels eines spezifisch an Hyaluronan bindenden Proteins erfolgen. Ein Verfahren zum Nachweis von Hyaluronan mit Hilfe eines spezifisch an Hyaluronan bindenden Proteins ist z.B. in US 5,019,498 beschrieben. Testkits, zur Durchführung der in US 5,019,498 beschrieben Methode, sind käuflich erwerbbar (z.B. das Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001 ; siehe auch Allgemeine Methoden Punkt 4). Parallel dazu kann ein Aliquot des erhaltenen Überstandes der Zentrifugation zunächst mit einer Hyaluronidase verdaut werden, bevor der Nachweis des Vorliegens von Hyaluronan mit Hilfe des spezifisch an Hyaluronan bindenden Proteins, wie oben beschrieben, erfolgt. Durch die Einwirkung der Hyaluronidase in dem Parallelansatz wird das darin vorliegende Hyaluronan abgebaut, so dass nach vollständigem Verdau keine signifikanten Mengen an Hyaluronan mehr nachweisbar sind.

Weiterhin kann der Nachweis des Vorliegens von Hyaluronan im Überstand der Zentrifugation auch mit anderen Analysemethoden, wie z.B. der IR-, NMR- oder Massen-Spektroskopie, erfolgen.

Wie bereits oben ausgeführt, ist zur Zeit nicht geklärt, welcher Stoffwechselweg (Hexosephosphat- oder oxidativer myo-lnositol-Stoffwechselweg) in pflanzlichen Zellen hauptsächlich für die Synthese von UDP-Glucuronsäure verwendet wird und ob beide Stoffwechselwege einen unterschiedlichen quantitativen Beitrag je nach Gewebe und/oder Entwicklungsstadium der Pflanze zur Synthese von UDP- Glucuronsäure leisten. Weiterhin führte die Überexpression einer UDP-GIc-DH in transgenen Pflanzen zu nicht konsistenten Ergebnissen und das Ziel mittels eines solchen Ansatzes den Pektingehalt der Zellwand zu erhöhen konnte nicht erreicht werden. Zusätzlich unterliegt die Regulation der Aktivität von Proteinen mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH einer Inhibierung durch UDP-Xylose. Dieses wurde sowohl für betreffende Proteine, die aus Prokaryonten (Campbell et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(6), 3416-3422; Schiller et al., 1973, Biochim. Biophys Acta 293(1), 1-10), aus tierischen Organismen (Balduini et al., 1970, Biochem. J. 120(4), 719-724) und aus Pflanzen (Hinterberg, 2002, Plant Physiol. Biochem. 40, 1011-1017) stammen, gezeigt.

Die Literatur enthält keine Hinweise darauf, wodurch die Menge an synthetisiertem Hyaluronan in Pflanzenzellen begrenzt sein könnte. Es wurde daher überraschenderweise gefunden, dass genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder genetisch modifizierte Pflanzen, die ein Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase aufweisen und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer UDP-GIc-DH im Vergleich zu genetisch modifizierten Pflanzenzellen bzw. genetisch modifizierten Pflanzen, die (nur) die Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweisen, signifikant höhere Mengen an Hyaluronan produzieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine erhöhte

Menge an Hyaluronan produzieren im Vergleich zu genetisch modifizierten

Pflanzenzellen bzw. im Vergleich zu genetisch modifizierten Pflanzen, die (nur) die

Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweisen oder im Vergleich zu genetisch modifizierten Pflanzenzellen bzw. im Vergleich zu genetisch modifizierten Pflanzen, die die Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweisen und keine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen.

Unter dem Begriff. „Pflanzenzelle oder Pflanze, die (nur) die Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweist", soll im Zusammenhang mit der vorliegenden

Erfindung eine genetisch modifizierte Pflanzenzelle oder eine genetisch modifizierte

Pflanze verstanden werden, wobei die genetische Modifikation darin besteht, dass sie ein Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen aufweist.

Insbesondere zeichnen sich „Pflanzenzellen oder Pflanzen, die (nur) die Aktivität einer Hyaluronansynthase" aufweisen, dadurch aus, dass sie Hyaluronan synthetisieren und dass sie keine zusätzlichen genetischen Modifikationen, die über das Einführen eines Nucleinsäuremoleküls, codierend eine Hyaluronansynthase, in nicht genetisch modifizierte Wildtyp Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierte Wildtyp Pflanzen hinausgeht, aufweisen. Bevorzugt weisen solche Pflanzen keine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH auf. Die Menge an Hyaluronan, die von Pflanzenzellen oder Pflanzen produziert wird, kann mit Hilfe der bereits oben beschriebenen Methoden, z.B. unter Verwendung eines käuflichen Testkits, (z.B. das Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001) bestimmt werden. Eine im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugte Methode zur Bestimmung des Hyaluronangehaltes in Pflanzenzellen oder Pflanzen ist unter Allgemeine Methoden, Punkt 4 beschrieben.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen um Pflanzenzellen einer grünen Landpflanze bzw. um grüne Landpflanzen, die Hyaluronan synthetisieren.

Der Begriff „grüne Landpflanze (Embryophyta)" ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, wie er in Strasburger, „Lehrbuch der Botanik", 34. Aufl., Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6) definiert ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen von mehrzelligen Pflanzen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, die mehrzellige Organismen darstellen. Es handelt sich bei dieser Ausführungsform daher um Pflanzenzellen oder Pflanzen die nicht von einzelligen Pflanzen (Protisten) stammen oder keine Protisten sind.

Bei den erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzenzellen bzw. um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl um monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen, d.h. Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung von Mensch und Tier oder für die Produktion von Biomasse bzw. die Herstellung von Substanzen für technische, industrielle Zwecke (z.B. Mais, Reis, Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Maniok, Kartoffel, Tomate, Rutenhirse (Panicum virgatum), Sago, Mungbohne, Erbse, Sorghum, Möhre, Aubergine, Rettich, Raps, Luzerne, Sojabohne, Erdnuss, Gurke, Kürbis, Melone, Lauch, Knoblauch, Kohl, Spinat, Süßkartoffel, Spargel, Zucchini, Salat, Artischocke, Süßmais, Pastinak, Schwarzwurzel, Topinamubur, Banane, Zuckerrübe, Zuckerrohr Rote Bete, Brokkoli, Kohl, Zwiebel, gelbe Rübe, Löwenzahn, Erdbeere, Apfel, Aprikose, Pflaume, Pfirsich, Weintrauben, Blumenkohl, Sellerie, Paprika, Steckrübe, Rhabarber). Besonders bevorzugt handelt es sich um Tomaten- oder Kartoffelpflanzen.

In einer vorzugsweisen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine virale Hyaluronansynthase codiert. Bevorzugt codiert das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül eine Hyaluronansynthase eines Virus, der Algen infiziert. Bezüglich eines Virus, der Algen infiziert, codiert das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül vorzugsweise eine Hyaluronansynthase eines Chlorella infizierenden Virus, besonders bevorzugt eine Hyaluronansynthase eines Paramecium bursaha Chlorella Virus 1 und insbesondere bevorzugt eine Hyaluronansynthase eines Paramecium bursaria Chlorella Virus eines H1 Stammes.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass die Codons des Nucleinsäuremoleküls codierend eine Hyaluronansynthase verändert sind, im Vergleich zu den Codons des Nucleinsäuremoleküls, welches die Hyaluronansynthase des Ursprungsorganismus der Hyaluronansynthase codieren. Besonders bevorzugt sind die Codons der Hyaluronansynthase dahingehend verändert, dass sie an die Häufigkeit der Verwendung der Codons der Pflanzenzelle oder der Pflanze, in dessen Genom sie integriert sind oder werden, angepasst sind.

Aminosäuren können auf Grund der Degeneration des genetischen Codes durch ein oder mehrere Codons codiert werden. Unterschiedliche Organismen verwenden die jeweils für eine Aminosäure codierenden Codons mit unterschiedlicher Häufigkeit. Das Anpassen der Codons einer codierenden Nucleinsäuresequenz an die Häufigkeit ihrer Verwendung in der Pflanzenzelle oder in der Pflanze, in dessen Genom die zu exprimierende Sequenz integriert werden soll, kann zu einer erhöhten Menge an translatiertem Protein und/oder zur Stabilität der betreffenden mRNA in den betreffenden Pflanzenzellen oder Pflanzen beitragen. Der Fachmann kann die Häufigkeit der Verwendung von Codons in betreffenden Pflanzenzellen oder Pflanzen ermitteln, indem er möglichst viele codierende Nucleinsäuresequenzen des betreffenden Organismus dahingehend untersucht, wie häufig bestimmte Codons für die Codierung einer bestimmten Aminosäure verwendet werden. Die Häufigkeit der Verwendung von Codons bestimmter Organismen ist dem Fachmann geläufig und kann mit Hilfe von Computerprogrammen einfach und schnell durchgeführt werden. Entsprechende Computerprogramme sind öffentlich zugänglich und werden u.a. im Internet frei zur Verfügung gestellt (z.B. http://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/; http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html). Das Anpassen der Codons einer codierenden Nucleinsäuresequenz an die Häufigkeit ihrer Verwendung in der Pflanzenzelle oder in der Pflanze, in dessen Genom die zu exprimierende Sequenz integriert werden soll, kann durch in vitro Mutagenese oder bevorzugt durch Neusynthese der Gensequenz erfolgen. Methoden zur Neusynthese von Nucleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt. Eine Neusynthese kann z.B. dadurch erfolgen, dass zunächst einzelne Nucleinsäureoligonucleotide synthetisiert werden, diese mit zu ihnen komplementären Oligonucleotiden hybridisiert werden, so dass sie einen DNA- Doppelstrang ausbilden, bevor die einzelnen doppelsträngigen Oligonucleotide so miteinander ligiert werden, dass die gewünschte Nucleinsäuresequenz erhalten wird. Die Neusynthese von Nucleinsäuresequenzen inklusive der Anpassung der Häufigkeit der Verwendung der Codons an einen bestimmten Zielorganismus kann auch als Auftrag an Firmen, die dieses als Dienstleistung anbieten, vergeben werden (z.B. Entelechon GmbH, Regensburg, Germany).

Bevorzugt ist das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es eine Hyaluronansynthase codiert, dessen Aminosäuresequenz mit der unter SEQ ID NO 2 dargestellten Aminosäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es eine Hyaluronansynthase codiert, die die unter SEQ ID No 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform weist das Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase mit der unter SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es die unter SEQ ID NO 3 dargestellte Nucleinsäuresequenz aufweist.

Das Plasmid IC 341-222, enthaltend ein synthetisches Nucleinsäuremolekül, das eine Paramecium bursaria Chlorella Virus Hyaluronansynthase codiert, wurde am 25.08.2004 unter der Nummer DSM16664 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland. Die in SEQ ID NO 2 dargestellte Aminosäuresequenz kann von der codierenden Region der in Plasmid IC 341-222 integrierten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden und codiert für eine Paramecium bursaria Chlorella Virus Hyaluronansynthase.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Protein codiert, dessen Aminosäuresequenz von der codierenden Region der im Plasmid DSM16664 inserierten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden kann oder dass es ein Protein codiert, dessen Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz, die von der codierenden Region der im Plasmid DSM16664 inserierten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden kann, eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei das Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet ist, dass es die in Plasmid DSM16664 integrierte, Hyaluronansynthase codierende Nucleinsäuresequenz darstellt oder dass sie mit der in Plasmid DSM16664 integrierten Nucleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein in ihr Genom stabil integriertes fremdes Nucleinsäuremolekül aufweisen, wobei besagtes fremdes Nucleinsäuremolekül zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führt, im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen bzw. zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen.

Unter dem Begriff "fremdes Nukleinsäuremolekül" versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein solches Molekül, das entweder natürlicherweise in entsprechenden Wildtyp-Pflanzenzellen nicht vorkommt, oder das in der konkreten räumlichen Anordnung nicht natürlicherweise in Wildtyp-Pflanzenzellen vorkommt oder das an einem Ort im Genom der Wildtyp-Pflanzenzelle lokalisiert ist, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt. Bevorzugt ist das fremde Nukleinsäuremolekül ein rekombinantes Molekül, das aus verschiedenen Elementen besteht, deren Kombination oder spezifische räumliche Anordnung natürlicherweise in pflanzlichen Zellen nicht auftritt.

Unter dem Begriff „rekombinantes Nukleinsäuremolekül" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül verstanden werden, welches unterschiedliche Nucleinsäuremoleküle aufweist, die natürlicherweise nicht in einer Kombination vorliegen, wie sie in einem rekombinanten Nucleinsäuremolekül vorliegen. So können rekombinante Nucleinsäuremoleküle z.B., neben Nucleinsäuremolekülen, die eine Hyaluronansynthase und/oder ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren, zusätzliche Nucleinsäuresequenzen aufweisen, welche natürlicherweise nicht in Kombination mit den genannten Nucleinsäuremolekülen vorliegen. Die genannten zusätzlichen

Nucleinsäuresequenzen, die auf einem rekombinanten Nucleinsäuremolekül in Kombination mit einem eine Hyaluronansynthase oder einem ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codierenden Nucleinsäuremolekül vorliegen, können dabei beliebige Sequenzen sein. Sie können z.B. genomische und/oder pflanzliche Nucleinsäuresequenzen darstellen. Bevorzugt handelt es sich bei genannten zusätzlichen Nucleinsäuresequenzen um regulatorische Sequenzen (Promotoren, Terminationssignale, Enhancer), besonders bevorzugt um regulatorische Sequenzen, die in pflanzlichem Gewebe aktiv sind, insbesondere bevorzugt um gewebespezifische regulatorische Sequenzen die in pflanzlichem Gewebe aktiv sind. Methoden zur Erzeugung rekombinanter Nucleinsäuremoleküle sind dem Fachmann bekannt und umfassen gentechnische Methoden wie z.B. die Verbindung von Nucleinsäuremolekülen durch Ligation, genetische Rekombination oder die Neusynthese von Nucleinsäuremolekülen (siehe z.B. Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) CoId Spring Harbour Laboratory Press, CoId Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition ( 2002),ISBN: 0471250929).

Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und genetisch modifizierte Pflanzen, die ein in ihr Genom stabil integriertes fremdes Nucleinsäuremolekül oder mehrere in ihr Genom stabil integrierte fremde Nucleinsäuremoleküle aufweisen, die eine Hyaluronansynthase codieren und die zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führt/führen, im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzen, lassen sich von besagten Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. besagten Wildtyp-Pflanzen unter anderem dadurch unterscheiden, dass sie ein fremdes Nucleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp-Pflanzen nicht vorkommt oder dadurch, dass ein solches Molekül an einem Ort im Genom der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzelle oder im Genom der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanze integriert vorliegt, an dem es bei Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp-Pflanzen nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung. Ferner lassen sich derartige erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen von nicht genetisch modifizierten Wildtyp- Pflanzenzellen bzw. nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzen dadurch unterscheiden, dass sie mindestens eine Kopie des fremden Nucleinsäuremoleküls stabil integriert in ihr Genom enthalten, gegebenenfalls zusätzlich zu natürlicherweise in den Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp-Pflanzen vorkommenden Kopien eines solchen Moleküls. Handelt es sich bei dem (den) in die erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen eingeführten fremden Nucleinsäuremolekül(en) um zusätzliche Kopien zu bereits natürlicherweise in den Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp-Pflanzen vorkommenden Molekülen, so lassen sich die erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen und die erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen von Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp-Pflanzen insbesondere dadurch unterscheiden, dass diese zusätzliche(n) Kopie(n) an Orten im Genom lokalisiert ist (sind), an denen sie bei Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Wildtyp- Pflanzen nicht vorkommt (vorkommen). Nachgewiesen werden kann die stabile Integration eines Nucleinsäuremoleküls in das Genom einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze durch genetische und/oder molekularbiologische Methoden. Eine stabile Integration eines Nucleinsäuremoleküls in das Genom einer Pflanzenzelle oder in das Genom einer Pflanze zeichnet sich dadurch aus, dass das stabil integrierte Nucleinsäuremolekül bei der Nachkommenschaft, der besagtes Nucleinsäuremolekül vererbt wurde, in derselben genomischen Umgebung vorliegt wie in der Elterngeneration. Das Vorliegen einer stabilen Integration einer Nucleinsäuresequenz im Genom einer Pflanzenzelle oder im Genom einer Pflanze kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, u.a. mit Hilfe der Southem-Blot Analyse der RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Nam et al., 1989, The Plant Cell 1 , 699-705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750), auf PCR basierenden Methoden, wie z.B. die Analyse von amplifizierten Fragment Längenunterschieden (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem et al., 2001 , Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160) oder der Verwendung von mit Restriktionsendonucleasen geschnittenen amplifizierten Fragmenten (Cleaved Amplified Polymorphie Sequences, CAPS) (Konieczny und Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis et al., 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachern et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753) nachgewiesen werden.

Prinzipiell kann ein fremdes Nucleinsäuremolekül jedes beliebige Nucleinsäuremolekül sein, das in der Pflanzenzelle oder Pflanze eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH bewirkt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen auch durch die Verwendung der so genannten Insertionsmutagenese (Übersichtsartikel: Thorneycroft et al., 2001 , Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601) hergestellt werden. Unter Insertionsmutagenese ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung insbesondere das Inserieren von Transposons oder so genannter Transfer DNA (T-DNA) in ein Gen oder in die Nähe eines Gens, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH zu verstehen, wobei dadurch die Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH in der betreffenden Zelle erhöht wird.

Bei den Transposons kann es sich dabei sowohl um solche handeln, die in der Zelle natürlicherweise vorkommen (endogene Transposons), als auch um solche, die natürlicherweise nicht in besagter Zelle vorkommen, sondern mittels gentechnischer Methoden, wie z.B. Transformation der Zelle, in die Zelle eingeführt wurden (heterologe Transposons). Die Veränderung der Expression von Genen mittels Transposons ist dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die Nutzung von endogenen und heterologen Transposons als Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie ist in Ramachandran und Sundaresan (2001 , Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252) dargestellt.

Die T-DNA Insertionsmutagenese beruht darauf, dass bestimmte Abschnitte (T-DNA) von Ti-Plasmiden aus Agrobacterium in das Genom von pflanzlichen Zellen integrieren können. Der Ort der Integration in das pflanzliche Chromosom ist dabei nicht festgelegt, sondern kann an jeder beliebigen Stelle erfolgen. Integriert die T- DNA in einen Abschnitt oder in die Nähe eines Abschnittes des Chromosoms, der eine Genfunktion darstellt, so kann dieses zur Erhöhung der Genexpression und damit auch zur Änderung der Aktivität eines durch das betreffende Gen codierten Proteins führen.

Die in das Genom inserierten Sequenzen (insbesondere Transposons oder T-DNA) zeichnen sich dabei dadurch aus, dass sie Sequenzen enthalten, die zu einer Aktivierung von regulatorischen Sequenzen eines Gens, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führt ("activation tagging"). Bevorzugt zeichnen sich in das Genom inserierten Sequenzen (insbesondere Transposons oder T-DNA) dadurch aus, dass sie in der Nähe von endogenen Nucleinsäuremolekülen im Genom der Pflanzenzelle oder der Pflanze integriert sind, die ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren.

Erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und genetisch modifizierte Pflanzen können z.B. mit Hilfe der Methode des so genannten "activation taggings" (siehe z. B. Waiden et al., Plant J. (1991), 281-288; Waiden et al., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528) erzeugt werden. Diese Methode beruht auf der Aktivierung endogener Promotoren durch "enhancer"-Sequenzen, wie z.B. dem Enhancer des 35S RNA-Promoters des Blumenkohlmosaikvirus oder dem Octopinsynthase- Enhancers.

Unter dem Begriff „T-DNA activation tagging" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein T-DNA Fragment verstanden werden, das "enhancer"- Sequenzen enthält und durch Integration in das Genom einer Pflanzenzelle zu der Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führt.

Unter dem Begriff „Transposon activation tagging" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Transposon verstanden werden, das "enhancer"- Sequenzen enthält und durch Integration in das Genom einer Pflanzenzelle zu der Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH führt. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, dadurch charakterisiert, dass ein fremdes Nucleinsäuremolekül ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH codiert.

Erfindungsgemäß kann das fremde Nucleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH aus einem beliebigen Organismus stammen, bevorzugt stammt besagtes Nucleinsäuremolekül aus Bakterien, Pilzen, Tieren, Pflanzen oder Viren, besonders bevorzugt aus Bakterien, Pflanzen oder Viren, insbesondere bevorzugt aus Viren.

Bezüglich Viren stammt das das fremde Nucleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH vorzugsweise aus einem Virus, der Algen infiziert, bevorzugt aus einem Virus, der Algen der Gattung Chlorella infiziert, besonders bevorzugt aus einem Paramecium bursaria Chlorella Virus und insbesondere bevorzugt aus einem Paramecium bursaria Chlorella Virus eines H1 Stammes. Anstelle eines natürlich vorkommenden Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH kann auch ein mittels Mutagenese erzeugtes Nucleinsäuremolekül in erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen eingeführt sein, wobei sich besagtes mutagenisierte fremde Nucleinsäuremolekül dadurch auszeichnet, dass es ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH codiert, das eine verringerte Inhibition durch Stoffwechselmetabolite (z.B. des Glucoronsäurestoffwechsels) aufweist.

Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann bekannt. So sind Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren aus Viren z.B. für den Chlorella Virus 1 (NCBI acc No NCJ300852.3), aus Bakterien z.B. für Escherichia coli (EMBL acc No: AF176356.1), aus Pilzen für z.B. Aspergillus niger (EMBL acc No AY594332.1), Cryptococcus neoformans (EMBL acc AF405548.1 ), aus Insekten für z.B. Drosophila melanogaster (EMBL acc No AF001310.1 ), aus Vertebraten für z.B. Homo sapiens (EMBL acc No AF061016.1), Mus mυsculυs (EMBL acc No AF061017.1 ), Bos taurus (EMBL acc No AF095792.1 ), Xenopus laevis (EMBL acc No AY762616.1) oder aus Pflanzen für z.B. Pappel (EMBL acc No AF053973.1), Colocasia escυlenta (EMBL acc No AY222335.1 ), Dunaliella salina (EMBL acc No AY795899.1), Glycine max (EMBL acc No U53418.1 ) beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID NO 5 angegebenen Aminosäuresequenz codieren; b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 60% zu der unter SEQ ID NO 5 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen; c) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO 4 oder die unter SEQ ID NO 6 dargestellte Nucleotidsequenz oder eine komplementäre Sequenz umfassen; d) Nucleinsäuremolekülen, welche zu den unter a) oder c) beschriebenen Nucleinsäuresequenzen eine Identität von mindestens 70% aufweisen; e) Nucleinsäuremolekülen, welche mit mindestens einem Strang der unter a) oder c) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen unter stringenten Bedingungen hybridisieren; f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetisches Codes von der Sequenz der unter a) oder c) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht; und g) Nucleinsäuremolekülen, die Fragmente, allelische Varianten und/oder Derivate der unter a), b), c), d), e) oder f) genannten Nucleinsäuremoleküle darstellen.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Besonders bevorzugt bedeutet "Hybridisierung" eine Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen: Hybridisierungspuffer:

2xSSC; 10xDenhardt-Lösung (Fikoll 400+PEG+BSA; Verhältnis 1 :1 :1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 μg/ml Heringssperma DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 25 M Natriumphoshphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS Hybridisierungstemperatur: T=65 bis 68°C

Waschpuffer: O₁IxSSC; 0,1% SDS

Waschtemperatur: T=65 bis 68⁰C.

Nucleinsäuremoleküle, die mit Nucleinsäuremolekülen, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH hybridisieren, können aus einem beliebigen Organismus stammen, sie können daher aus Bakterien, Pilzen, Tieren, Pflanzen oder sie können aus Viren stammen.

Nucleinsäuremoleküle, die mit Nucleinsäuremolekülen, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH hybridisieren, stammen vorzugsweise aus einem Virus, der Algen infiziert, bevorzugt aus einem Virus, der Algen der Gattung Chlorella infiziert, besonders bevorzugt aus einem Paramecium bυrsaria Chlorella Virus und insbesondere bevorzugt aus einem Paramecium bursaria Chlorella Virus eines H1 Stammes.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den genannten Molekülen hybridisieren können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der genannten Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY) oder durch Amplifikation mittels PCR.

Als Hybridisierungsprobe zur Isolierung einer Nucleinsäuresequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH können z.B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im Wesentlichen die unter SEQ ID NO 4 oder SEQ ID NO 6 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenzen aufweisen.

Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente oder Oligonucleotide handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines in Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, sollte eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erfolgen, um festzustellen, ob es sich um Proteine handelt, die die Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen. Methoden, wie bestimmt werden kann, ob ein Protein die Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP- GIc-DH aufweist, sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausreichend beschrieben (z.B. De Luca et al., 1976, Connective Tissue Research 4, 247-254; Bar-Peled et6 al., 2004, Biochem. J. 381 , 131-136; Turner und Botha, 2002, Archives Biochem. Biophys. 407, 209-216).

Die mit den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen insbesondere Fragmente, Derivate und allelische Varianten der genannten Nucleinsäuremoleküle. Der Begriff „Derivat" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Identität zu diesen Sequenzen aufweisen. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei z.B. durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Der Begriff „Identität" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Sequenzidentität über die gesamte Länge der codierenden Region eines Nucleinsäuremoleküls oder die gesamte Länge einer Aminosäuresequenz, die ein Protein codiert, von mindestens 60%, insbesondere eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95%. Unter dem Begriff „Identität" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Anzahl der übereinstimmenden Aminosäuren/Nucleotide (Identität) mit anderen Proteinen/Nucleinsäuren, ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität betreffend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH durch Vergleiche der unter SEQ ID NO 5 angegebenen Aminosäuresequenz bzw. die Identität betreffend ein Nucleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP_Glc_DH durch Vergleiche der unter SEQ ID NO 4 oder SEQ ID NO 6 angegebenen Nucleinsäuresequenzen zu anderen Proteinen/Nucleinsäuren mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Vorzugsweise wird die Identität mittels des bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogramms ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) ermittelt. ClustalW wird öffentich zur Verfügung gestellt von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL- Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1 , D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls von verschiedenen Internetseiten, u.a. beim IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) und beim EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie bei allen gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK), heruntergeladen werden. Vorzugsweise wird das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt, um die Identität zwischen im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Proteinen und anderen Proteinen zu bestimmen. Dabei sind folgende Parameter einzustellen: KTUPLE=I , TOPDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=IO, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET,

ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. Vorzugsweise wird das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt, um die Identität zwischen z.B. der Nucleotidsequenz der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleinsäuremoleküle und der Nucleotidsequenz von anderen Nucleinsäuremolekülen zu bestimmen. Dabei sind folgende Parameter einzustellen:

KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=IO, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted.

Identität bedeutet ferner, dass funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Spezies oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten. Eine spezielle Form von Derivaten stellen z.B. Nucleinsäuremoleküle dar, die auf Grund der Degeneration des genetischen Codes von im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleinsäuremolekülen abweichen.

Die von den verschiedenen Derivaten der Nucleinsäuremoleküle codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf.

Dazu können z.B. biologische Aktivität, Substratspezifität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z.B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc. Bevorzugte Eigenschaften von Proteinen mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH sind dem Fachmann bekannt, wurden oben bereits erörtert und sind hier entsprechend anzuwenden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei Nucleinsäuremoleküle codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH dadurch gekennzeichnet sind, dass die Codons besagter Nucleinsäuremoleküle verändert sind, im Vergleich zu den Codons der Nucleinsäuremoleküle, welche besagtes Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH des Ursprungsorganismus codieren. Besonders bevorzugt sind die Codons der Nucleinsäuremoleküle codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH dahingehend verändert, dass sie an die Häufigkeit der Verwendung der Codons der Pflanzenzelle oder der Pflanze, in dessen Genom sie integriert sind oder werden, angepasst sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die stabil in das Genom der Pflanzenzelle oder der Pflanze integrierten fremden Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Hyaluronansynthase und/oder codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH mit regulatorischen Elementen verknüpft sind, die die Transkription in Pflanzenzellen initiieren (Promotoren). Es kann sich um homologe oder heterologe Promotoren handeln. Bei den Promotoren kann es sich um konstitutive, gewebespezifische, entwicklungsspezifische oder um durch äußere Einflüsse (z.B. nach Applikation chemischer Substanzen, durch Einwirkung abiotischer Faktoren wie Hitze und/oder Kälte, Trockenheit, Krankheitsbefall etc.) regulierte Promotoren handeln. Dabei können Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Hyaluronansynthase oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc- DH, die in das Genom einer erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzelle oder einer erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanze integriert sind, mit jeweils demselben Promotor verknüpft sein, oder es können unterschiedliche Promotoren mit den einzelnen Sequenzen verknüpft sein.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, wobei mindestens ein fremdes Nucleinsäuremolekül, besonders bevorzugt mindestens zwei fremde Nucleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe von Nucleinsäuremolekülen codierend eine Hyaluronansynthase oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH mit einem gewebespezifische Promotoren verknüpft ist (sind). Bevorzugte gewebespezifische Promotoren stellen Promotoren dar, die die Initiation der Transkription spezifisch in pflanzlichen Knollen-, Blatt-, Frucht- oder Samenzellen initiieren.

Zur Expression von Nucleinsäuremolekülen, die eine Hyaluronansynthase oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren, werden diese vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. Sowohl in Bezug auf die Pflanze als auch in Bezug auf das zu exprimierende Nucleinsäuremolekül kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus oder der Ubiquitin-Promotor aus Mais oder der Cestrum YLCV (Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087; Stavolone et al., 2003, Plant Mol. Biol. 53, 703-713) für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein fruchtspezifischer Promotor für Tomate wie z.B. der Polygalacturonase Promotor aus Tomate (Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062) oder der E8 Promotor aus Tomate (Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618) oder der ACC Oxidase Promotor aus Pfirsich (Moon und Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS 1 -Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine endosperm-spezifische Expression der HMWG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor, Promotoren von Zein-Genen aus Mais (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), Glutelin-Promotor (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218), ein Shrunken-1 Promotor (Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380), ein Globulin Promotor (Nakase et al., 1996, Gene 170(2), 223-226) oder ein Prolamin Promotor (Qu und Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125). Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiviert werden (siehe beispielsweise WO 9307279). Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können samenspezifische Promotoren verwendet werden, wie z.B. der USP- Promoter aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in Vicia faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). Auch die Verwendung von Promotoren, die im Genom von Algen infizierenden Viren vorkommen, sind für die Expression von Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen geeignet (Mitra et al., 1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra und Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1 ), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516).

Unter dem Begriff „gewebespezifisch" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die überwiegende Beschränkung einer Ausprägung (z.B. die Initiation der Transkription) auf ein bestimmtes Gewebe verstanden werden.

Unter den Begriffen „Knollen-, Frucht-, oder Samenzelle" sollen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung alle Zellen verstanden werden, die in einer Knolle, Frucht bzw. in einem Samen enthalten sind.

Unter dem Begriff „homologer Promotor" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Promotor verstanden werden, der natürlicherweise in Pflanzenzellen oder Pflanzen vorkommt, die für die Herstellung erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzenzellen bzw. erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen verwendet wurden (homolog bezüglich der Pflanzenzelle oder Pflanze) oder ein Promotor verstanden werden, der die Regulation der Expression eines Gens in dem Organismus reguliert, aus dem die Sequenz isoliert wurde (homolog bezüglich des zu exprimierenden Nucleinsäuremoleküls).

Unter dem Begriff „heterologer Promotor" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Promotor verstanden werden, der natürlicherweise nicht in Pflanzenzellen oder Pflanzen vorkommt, die für die Herstellung erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzenzellen bzw. erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen verwendet wurden (heterolog bezüglich der Pflanzenzelle oder Pflanze) oder ein Promotor verstanden werden, der natürlicherweise in dem Organismus, aus dem eine zu exprimierende Nucleinsäuresequenz isoliert wurde, nicht zur Regulation der Expression besagter Nucleinsäuresequenz vorkommt (heterolog bezüglich des zu exprimierenden Nucleinsäuremoleküls).

Ferner kann eine Terminationssequenz (Polyandenylierungssignal) vorhanden sein, die der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript dient. Dem PoIy-A- Schwanz wird eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.

Es können auch Intronsequenzen zwischen dem Promotor und der codierenden Region vorhanden sein. Solche Intronsequenzen können zur Stabilität der Expression und zu einer erhöhten Expression in Pflanzen führen (CaIMs et al., 1987, Genes Devel. 1 , 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991 , Mol. Gen. Genet. 225, 81- 93; Rethmeier et al., 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 , 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569). Geeignete Intronsequenzen sind beispielsweise das erste Intron des sh1-Gens aus Mais, das erste Intron des Poly-Ubiquitin Gens 1 aus Mais, das erste Intron des EPSPS Gens aus Reis oder eines der beiden ersten Introns des PAT1 Gens aus Arabidopsis.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Pflanzen, enthaltend erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen. Derartige Pflanzen können durch Regeneration aus erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen erzeugt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch verarbeitbare oder konsumierbare Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, enthaltend erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen.

Unter dem Begriff „verarbeitbare Teile" sollen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Pflanzenteile verstanden werden, die Verwendung in der Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln finden, die als Rohstoffquelle für industrielle Prozesse, als Rohstoffquelle für die Herstellung pharmazeutischer oder als Rohstoffquelle für die Herstellung kosmetischer Produkte eingesetzt werden.

Unter dem Begriff „konsumierbare Teile" sollen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Pflanzenteile verstanden werden, die dem Menschen als Nahrungsmittel dienen oder als Tierfutter verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen, enthaltend erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen.

Der Begriff „Vermehrungsmaterial" umfasst dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder sexuellem Weg. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskulturen, Rhizome oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial umfasst beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen, etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Knollen, Früchte oder Samen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung emtebare Pflanzenteile erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen, wie Früchte, Speicherwurzeln, Wurzeln, Blüten, Knospen, Sprosse, Blätter oder Stämme, vorzugsweise Samen, Früchte oder Knollen, wobei diese erntebaren Teile erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen enthalten.

Bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäßes Vermehrungsmaterial oder erfindungsgemäße erntebare Teile von Pflanzen, enthaltend Hyaluronan. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um erfindungsgemäßes Vermehrungsmaterial oder erfindungsgemäße erntebare Teile von Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren.

Der Begriff „Kartoffelpflanze" oder „Kartoffel" meint im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Pflanzenspezies der Gattung Solanum, besonders Knollen produzierende Spezies der Gattung Solanum und insbesondere Solanum tuberosum.

Der Begriff „Tomatenpflanze" oder „Tomate" meint im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Pflanzenspezies der Gattung Lycopersicon, besonders Lycopersicon esculentum.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass erntebare Teile, Vermehrungsmaterial, verarbeitbare Teile oder konsumierbare Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen mehr Hyaluronan enthalten als in der Literatur beschriebene transgene Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren. Erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen sind daher nicht nur besonders geeignet zur Verwendung als Rohmaterial, aus dem Hyaluronan isoliert werden kann, sondern auch als direkte Verwendung als Nahrungs-/Futtermittel oder zur Herstellung von Nahrungs-/Futtermitteln, welche einen vorbeugenden oder therapeutischen Charakter aufweisen (z.B. zur Vorbeugung gegen Osteoarthritis, US 6,607,745). Da erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen einen höheren Hyaluronangehalt aufweisen als in der Literatur beschriebene Pflanzen, müssen geringere Mengen an erntebaren Teilen, Vermehrungsmaterial, verarbeitbaren Teilen oder konsumierbaren Teilen von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen eingesetzt werden, um solche Nahrungs-/Futtermittel herzustellen. Werden konsumierbare Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen z.B. direkt als so genanntes „Nutraceutical" konsumiert, so ist es möglich einen positiven Effekt bereits durch den Verzehr geringerer Mengen an Substanz zu erreichen. Diese kann u.a. bei der Herstellung von Tierfutter eine besondere Bedeutung erlangen, da Tierfutter mit einem zu hohen Gehalt an pflanzlichen Bestandteilen, für verschiedenste Tierarten nicht als Futtermittel geeignet ist. Durch die hohe Wasserbindungskapazität von Hyaluronan weisen erntebare Teile, Vermehrungsmaterial, verarbeitbare Teile oder konsumierbare Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen weiterhin den Vorteil auf, dass bei der Herstellung von verfestigten Nahrungs-/Futtermitteln weniger Dickungsmittel eingesetzt werden müssen. So kann z.B. bei der Herstellung von Gelee weniger Zucker verwendet werden, was einen zusätzlichen positiven Gesundheitseffekt mit sich bringt. Bei der Herstellung von Nahrungs-/Futtermitteln, bei welchen es notwendig ist, dem pflanzlichen Rohstoff Wasser zu entziehen, besteht der Vorteil bei der Verwendung von erntebaren Teilen, Vermehrungsmaterial, verarbeitbaren Teilen oder konsumierbaren Teilen von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen darin, dass dem betreffenden Pflanzenmaterial weniger Wasser entzogen werden muss, was zu geringern Produktionskosten führt und durch schonendere Herstellungsverfahren (z.B. geringere und/oder kürzere Wärmezufuhr) einen erhöhten Nährwert der betreffenden Nahrungs-/Futtermittel gewährleistet. So muss z.B. bei der Herstellung von Tomaten Ketchup weniger Energie zugeführt werden, um die gewünschte Konsistenz zu erreichen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, worin a) eine Pflanzenzelle, genetisch modifiziert wird, wobei die genetische Modifikation die folgenden Schritte i bis ii umfasst i) Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, codierend eine

Hyaluronansynthase in die Pflanzenzelle ii) Einführung einer genetischen Modifikation in die Pflanzenzelle, wobei die genetische Modifikation zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzenzellen führt wobei die Schritte i bis ii in beliebiger Reihenfolge, einzeln oder beliebige Kombinationen der Schritte i bis ii gleichzeitig durchgeführt werden können b) aus Pflanzenzellen von Schritt a) eine Pflanze regeneriert wird; c) gegebenenfalls weitere Pflanzen mit Hilfe der Pflanzen nach Schritt b) erzeugt werden, wobei gegebenenfalls aus Pflanzen erhalten aus Schritt b) i oder b) ii Pflanzenzellen isoliert werden und die Verfahrensschritte a) bis c) solange wiederholt werden, bis eine Pflanze erzeugt wurde, die ein fremdes

Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase aufweist und eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc- DH im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp- Pflanzenzellen aufweist .

Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer Pflanze die Hyaluronan synthetisiert, worin a) eine Pflanzenzelle, genetisch modifiziert wird, wobei die genetische Modifikation die folgenden Schritte i bis ii in beliebiger Reihenfolge umfasst oder beliebige Kombinationen der folgenden Schritte i bis ii einzeln oder gleichzeitig durchgeführt werden i) Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, codierend eine

Hyaluronansynthase in die Pflanzenzelle ii) Einführung einer genetischen Modifikation in die Pflanzenzelle, wobei die genetische Modifikation zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH, im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzenzellen führt b) aus Pflanzenzellen enthaltend die genetische Modifikation gemäß den Schritten i) a) i ii) a) ii iii) a) i und a) ii, eine Pflanze regeneriert wird c) in Pflanzenzellen von Pflanzen gemäß Schritt i) b) i eine genetische Modifikation gemäß Schritt a) ii, ii) b) ii eine genetische Modifikation gemäß Schritt a) i, eingeführt und eine Pflanze regeneriert wird d) gegebenenfalls weitere Pflanzen mit Hilfe der Pflanzen, erhalten nach einem der Schritte b) iii oder c) i oder c) ii erzeugt werden. Für die laut Schritt a) in die Pflanzenzelle eingeführten genetischen Modifikationen gilt, dass es sich grundsätzlich um jede Art von Modifikation handeln kann, die zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc- DH führt.

Die Regeneration der Pflanzen gemäß Schritt b) und gegebenenfalls Schritt c) der erfindungsgemäßen Verfahren kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen (z.B. beschrieben in „Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

Die Erzeugung weiterer Pflanzen (je nach Verfahren gemäß Schritt c) oder Schritt d)) der erfindungsgemäßen Verfahren kann z.B. erfolgen durch vegetative Vermehrung (beispielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Calluskultur und Regeneration ganzer Pflanzen) oder durch sexuelle Vermehrung. Die sexuelle Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d.h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften miteinander gekreuzt und vermehrt. Die Auswahl erfolgt dabei bevorzugt in der Weise, dass die weiteren Pflanzen (die je nach Verfahren gemäß Schritt c) oder Schritt d) erzeugt werden) die in den vorangegangenen Schritten eingeführten Modifikationen aufweisen.

In erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren, können die genetischen Modifikationen zur Erzeugung der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen gleichzeitig oder in aufeinander folgenden Schritten erfolgen. Es ist dabei unerheblich, ob für auf einander folgende genetische Modifikationen, die zu einer erhöhten Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH führt, die gleiche Methode verwendet wird wie für die genetische Modifikation, die für die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, codierend eine Hyaluronansynthase in die Pflanzenzelle verwendet wird.

In einer weiteren Ausführungsform erfindungsgemäßer Verfahren zur Herstellung Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, besteht die genetische Modifikation in der Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in das Genom Pflanzenzelle, wobei das Vorhandensein oder die Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls zu einer erhöhten Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH der Pflanzenzelle führt.

Wie oben bereits für zur genetischen Modifikation in die Pflanzezelle oder Pflanze eingebrachten fremden Nukleinsäuremolekülen beschrieben, kann es sich in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, um ein einzelnes Nucleinsäuremolekül oder um mehrere Nucleinsäuremoleküle handeln. So können die fremden Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Hyaluronansynthase bzw. codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH zusammen auf einem einzigen Nucleinsäuremolekül vorliegen oder sie können auf getrennten Nucleinsäuremolekülen vorliegen. Liegen die Nucleinsäuremoleküle codierend eine Hyaluronansynthase und codierend ein Protein mit der Aktivität auf mehreren Nucleinsäuremolekülen vor, so können diese Nucleinsäuremoleküle gleichzeitig oder in aufeinander folgenden Schritten in eine Pflanzenzelle eingeführt werden.

Weiterhin können zur Einführung eines fremden Nukleinsäuremoleküls bei der Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die

Hyaluronan synthetisiert, anstelle einer Wildtyp-Pflanzenzelle bzw. Wildtyp-Pflanze,

Mutantenzellen bzw. Mutanten, die sich dadurch auszeichnen, dass sie bereits eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH aufweisen, verwendet werden. Weist die Mutantenzelle bzw. die Mutante bereits eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH im

Vergleich zu entsprechenden Wildtyp Pflanzenzellen bzw. Wildtyp Pflanzen auf, so ist es zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer

Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, ausreichend, dass in besagte Mutantenzelle bzw. Mutante ein fremdes Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase einzuführen.

Die weiter oben gemachten Angaben zur Verwendung von Mutanten für die Herstellung erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen, sind hier entsprechend anzuwenden.

In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, worin das Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase in Schritt a) ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine virale

Hyaluronansynthase codieren, b) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hyaluronansynthase eines Chlorella infizierenden Virus codieren, c) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hyaluronansynthase eines Paramecium bυrsaria Chlorella Virus 1 codieren, d) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hyaluronansynthase eines Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 des

Stammes H1 codieren, e) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass die Codons des Nucleinsäuremoleküls codierend eine Hyaluronansynthase verändert sind, im Vergleich zu den Codons des Nucleinsäuremoleküls, welches die Hyaluronansynthase des Ursprungsorganismus der Hyaluronansynthase codieren, f) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass die Codons der Hyaluronansynthase dahingehend verändert sind, dass sie an die Häufigkeit der Verwendung der Codons der Pflanzenzelle oder der Pflanze, in dessen Genom sie integriert werden oder sind, angepasst sind, g) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hyaluronansynthase mit der unter SEQ ID NO 2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder dass sie eine Hyaluronansynthase codieren, dessen Aminosäuresequenz mit der unter SEQ ID No 2 dargestellten Aminosäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweist, h) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet , dass sie ein Protein codieren, dessen Aminosäuresequenz von der codierenden Region der im Plasmid DSM16664 inserierten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden kann oder dass sie ein Protein codieren, dessen Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz, die von der codierenden Region der im Plasmid

DSM16664 inserierten Nucleinsäuresequenz abgeleitet werden kann, eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweist., i) Nucleinsäuremoleküle, die eine unter SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellte Nucleinsäuresequenz umfassen oder die zu der unter SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweisen j) Nucleinsäuremoleküle, die die in Plasmid DSM16664 inserierte Nucleinsäuresequenz umfassen oder die mit der in Plasmid DSM16664 inserierten Nucleinsäuresequenz eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweisen k) Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Hyaluronansynthase, wobei die

Hyaluronansynthase codierenden Nucleinsäuresequenzen mit regulatorischen

Elementen (Promotor) verknüpft sind, die die Transkription in Pflanzenzellen initiieren oder

I) Nucleinsäuremoleküle, nach k), wobei die Promotoren gewebespezifische Promotoren, besonders bevorzugt Promotoren, die die Initiation der

Transkription spezifisch in pflanzlichen Knollen-, Blatt-, Frucht- oder Samenzellen initiieren, darstellen.

In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, worin das fremde Nucleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus a) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren, welches aus Viren, Bakterien, Tieren oder Pflanzen, stammt, b) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH eines Chlorella infizierenden Virus codieren, c) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH eines Paramecium bursaria Chlorella Virus codieren, d) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass die Codons des Nucleinsäuremoleküls codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH verändert sind, im Vergleich zu den Codons des Nucleinsäuremoleküls, welches das entsprechende Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH des Ursprungsorganismus codiert, e) Nucleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, dass die Codons des Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH dahingehend verändert sind, dass sie an die

Häufigkeit der Verwendung der Codons der Pflanzenzelle oder der Pflanze, in dessen Genom sie integriert werden oder sind, angepasst sind, f) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID NO 5 angegebenen Aminosäuresequenz codieren; g) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, dessen Sequenz eine

Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% zu der unter SEQ ID NO 5 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen; h) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO 4 oder die unter SEQ ID NO 6 dargestellte Nucleotidsequenz oder eine komplementäre Sequenz umfassen; i) Nucleinsäuremolekülen, welche zu den unter h) beschriebenen Nucleinsäuresequenzen eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere bevorzugt von mindestens 95% aufweisen; j) Nucleinsäuremolekülen, welche mit mindestens einem Strang der unter f) oder h) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen unter stringenten Bedingungen hybridisieren; k) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetisches Codes von der Sequenz der unter f) oder h) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht; und

I) Nucleinsäuremolekülen, die Fragmente, allelische Varianten und/oder Derivate der unter a), b), c), d), e), f) oder h) genannten Nucleinsäuremoleküle darstellen, m) Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc- DH, wobei die ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH codierenden Nucleinsäuresequenzen mit regulatorischen Elementen (Promotor) verknüpft sind, die die Transkription in Pflanzenzellen initiieren oder n) Nucleinsäuremoleküle, nach m), wobei die Promotoren gewebespezifische Promotoren, besonders bevorzugt Promotoren, die die Initiation der Transkription spezifisch in pflanzlichen Knollen-, Blatt-, Frucht- oder Samenzellen initiieren, darstellen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert zur Herstellung erfindungemäßer genetisch modifizierter Pflanzen verwendet.

Pflanzen erhältlich nach erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronan, umfassend den Schritt der Extraktion von Hyaluronan aus erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen, aus erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, aus erfindungsgemäßem Vermehrungsmaterial, aus erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzenteilen oder aus Pflanzen oder Teilen dieser Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren. Vorzugsweise umfasst ein solches Verfahren auch den Schritt des Erntens der kultivierten erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen, der erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, des erfindungsgemäßen Vermehrungsmaterials, der erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzeteile, der erfindungsgemäßen verarbeitbaren Pflanzenteile vor der Extraktion des Hyaluronans und besonders bevorzugt ferner den Schritt der Kultivierung erfindungsgemäßer genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßer genetisch modifizierten Pflanzen vor dem Ernten.

Im Gegensatz zu bakteriellen oder tierischen Geweben weisen pflanzliche Gewebe keine Hyaluronidasen auf und enthalten keine Hyaladherine. Daher ist wie oben bereits beschrieben die Extraktion von Hyaluronan aus pflanzlichen Geweben mit Hilfe relativ einfacher Verfahren möglich. Die oben beschriebenen wässrigen Extrakte aus pflanzlichen Zellen oder Geweben, enthaltend Hyaluronan, können bei Bedarf mit dem Fachmann bekannten Methoden, wie z.B. von mehrfach hintereinander folgenden Fällungen mit Ethanol, weiter aufgereinigt werden. Eine bevorzugte Methode zur Aufreinigung von Hyaluronan ist unter Allgemeine Methoden Punkt 3 beschrieben.

Die bereits beschriebenen Verfahren zur Extraktion von Hyaluronan aus erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen sind auch für die Isolierung von Hyaluronan aus erfindungsgemäßem Vermehrungsmaterial, aus erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzenteilen oder aus Pflanzen oder Teilen dieser Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren, anwendbar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzenzellen, erfindungsgemäßer genetisch modifizierter Pflanzen, erfindungsgemäßen Vermehrungsmaterials, erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzeteilen, erfindungsgemäßen verarbeitbaren Pflanzenteilen oder von Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, zur Herstellung von Hyaluronan.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, enthaltend erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen. Es ist dabei unerheblich, ob die Pflanzenzellen intakt oder nicht mehr intakt sind, weil sie z.B. durch Prozessierungsverfahren zerstört wurden. Bevorzugt handelt es sich bei den Zusammensetzungen um Nahrungs- oder Futtermittel, um pharmazeutische oder um kosmetische Produkte.

Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, enthaltend Bestandteile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen, von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, von erfindungsgemäßem Vermehrungsmaterial, von erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzenteilen oder von Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und enthaltend rekombinante Nucleinsäuremoleküle, wobei die rekombinanten Nucleinsäuremoleküle dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Nucleinsäuremoleküle umfassen, die eine Hyaluronansynthase und ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren.

Eine stabile Integration von fremden Nucleinsäuremolekülen in das Genom einer Pflanzenzelle oder Pflanze führt dazu, dass die fremden Nucleinsäuremoleküle nach Integration in das Genom der Pflanzenzelle oder Pflanze von genomischen pflanzlichen Nucleinsäuresequenzen flankiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Zusammensetzungen daher dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Nucleinsäuremoleküle, enthaltend in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung von genomischen pflanzlichen Nucleinsäuresequenzen flankiert sind. Die genomischen pflanzlichen Nucleinsäuresequenzen können dabei beliebige Sequenzen sein, die im Genom der Pflanzenzelle oder Pflanze, die zur Herstellung der Zusammensetzung verwendet wurde, natürlicherweise vorliegen.

Bei den in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthaltenden rekombinanten Nucleinsäuremolekülen kann es sich um einzelne oder verschiedene rekombinante Nucleinsäuremoleküle handeln, bei welchen Nucleinsäuremoleküle, die eine Hyaluronansynthase und Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH codieren, auf einem einzigen Nucleinsäuremolekül vorliegen, oder um solche, bei welchen die genannten Nucleinsäuremoleküle auf getrennten rekombinanten Nucleinsäuremolekülen vorliegen handeln. Je nachdem, in welcher Weise die Nucleinsäuremoleküle, codierend eine Hyaluronansynthase bzw. codierend ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-GIc-DH in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorliegen, können sie von identischen oder von unterschiedlichen genomischen pflanzlichen Nucleinsäuresequenzen flankiert sein.

Dass erfindungsgemäße Zusammensetzungen rekombinante Nucleinsäuremoleküle enthalten, kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, wie z.B. auf Hybridisierung basierenden Methoden oder bevorzugt mit auf PCR (Polymerase Chain Reaction) basierenden Methoden nachgewiesen werden.

Vorzugsweise enthalten erfindungsgemäße Zusammensetzungen mindestens 0,005%, bevorzugt mindestens 0.01%, besonders bevorzugt mindesten 0,05%, insbesondere bevorzugt mindestens 0,1% Hyaluronan.

Wie oben bereits ausgeführt können erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen, erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, erfindungsgemäßes Vermehrungsmaterial, erfindungsgemäße erntebare Pflanzeteile, erfindungsgemäße verarbeitbare Pflanzenteile, erfindungsgemäßen konsumierbare Pflanzenteile oder Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Nahrungs- oder Futtermittel herzustellen. Aber auch die Verwendung als Rohstoff für technische Anwendungen ist möglich, ohne dass Hyaluronan isoliert werden muss. So können z.B. erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen bzw. Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen auf Ackerflächen aufgebracht werden, um eine erhöhte Wasserbindung des Bodens zu erreichen. Weiterhin ist eine Verwendung von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen oder erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen zur Herstellung von Trocknungsmitteln (z.B. für die Verwendung beim Versand von Gegenständen, die empfindlich auf Feuchtigkeit reagieren) oder als Absorber von Flüssigkeiten (z.B. in Babywindeln, oder zum Aufsaugen ausgelaufener wässriger Flüssigkeiten) möglich. Für solche Anwendungen können je nach Bedarf ganze erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, Teile von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen oder zerkleinerte (z.B. zermahlene) erfindungsgemäße genetisch modifizierten Pflanzen oder erfindungsgemäße Pflanzenteile Verwendung finden. Insbesondere für Gebiete, in denen gemahlene Pflanzen oder Pflanzenteile zur Anwendung kommen, sind Pflanzenteile, die Hyaluronan enthalten, jedoch selbst einen geringen Wasseranteil aufweisen. Es handelt es sich hierbei bevorzugt um Körner von Getreidepflanzen (Mais, Reis, Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Sago, oder Sorghum). Da erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen und erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen einen höheren Gehalt an Hyaluronan aufweisen, als in der Literatur beschriebene transgene Pflanzen, muss im Vergleich zu diesen für technische Anwendungen weniger Material eingesetzt werden, wenn erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen oder erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen verwendet werden.

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, worin erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzenzellen, erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen, erfindungsgemäßes Vermehrungsmaterial, erfindungsgemäße erntebare Pflanzeteile, erfindungsgemäße verarbeitbare Pflanzenteile, erfindungsgemäße konsumierbare Pflanzenteile oder Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, verwendet werden. Bevorzugt handelt es sich bei den Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung um Verfahren zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen oder Verfahren zur Herstellung zur Herstellung eines kosmetischen Produktes.

Verfahren zur Herstellung von Lebens- oder Futtermitteln sind dem Fachmann bekannt. Verfahren für die Verwendung von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen oder erfindungsgemäßen Pflanzenteilen auf technischen Gebieten sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und umfassen u.a., sind aber nicht ausschließlich beschränkt auf das Zerkleinern oder das Mahlen von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen oder erfindungsgemäßen Pflanzenteilen. Einige Vorteile, die sich aus der Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände für die Herstellung von Nahrungs-/Futtermitteln oder für den Einsatz in technischen Gebieten ergeben, sind bereits oben beschrieben worden.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung um ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die Hyaluronan enthält.

Zusammensetzungen erhältlich nach einem Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen, erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, erfindungsgemäßem Vermehrungsmaterial, erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzeteilen, erfindungsgemäßen verarbeitbaren Pflanzenteilen, erfindungsgemäßen konsumierbaren Pflanzenteilen oder Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung von erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzenzellen, erfindungsgemäßen genetisch modifizierten Pflanzen, erfindungsgemäßem Vermehrungsmaterial, erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzeteilen, erfindungsgemäßen verarbeitbaren Pflanzenteilen, erfindungsgemäßen konsumierbaren Pflanzenteilen oder von Pflanzen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, zur Herstellung von Lebens- oder Futtermitteln, zur Herstellung eines Pharmazeutikums oder zur Herstellung eines kosmetischen Produktes.

Beschreibung der Sequenzen SEQ ID N0 1 : Nucleinsäuresequenz, codierend eine Hyaluronansynthase des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1.

SEQ ID NO 2: Aminosäuresequenz einer Hyaluronansynthase des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1. Die dargestellte Aminosäuresequenz kann von SEQ ID NO 1 abgeleitet werden.

SEQ ID NO 3: Synthetische Nucleinsäuresequenz, codierend eine

Hyaluronansynthase des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1.

Die Synthese der Codons der dargestellten Sequenz erfolgte in der

Weise, dass sie an die Verwendung von Codons in Pflanzenzellen angepasst ist. Die dargestellte Nucleinsäuresequenz codiert ein

Protein mit der unter SEQ ID No 2 dargestellten Aminosäuresequenz.

SEQ ID NO 4: Nucleinsäuresequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1. SEQ ID NO 5: Aminosäuresequenz eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-

DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1. Die dargestellte Aminosäuresequenz kann von SEQ ID NO 4 abgeleitet werden.

SEQ ID NO 6: Synthetische Nucleinsäuresequenz, codierend ein Protein mit der

Aktivität einer UDP-GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1. Die Synthese der Codons der dargestellten Sequenz erfolgte in der Weise, dass sie an die Verwendung von Codons in Pflanzenzellen angepasst ist. Die dargestellte Nucleinsäuresequenz codiert ein Protein mit der unter SEQ ID No 5 dargestellten Aminosäuresequenz. SEQ ID NO 7: Synthetisches Oligonucleotid, dass in Beispiel 1 verwendet wurde. SEQ ID NO 8: Synthetisches Oligonucleotid, dass in Beispiel 1 verwendet wurde.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 : Stellt eine Eichgerade und die dazugehörige Gleichung der Regressionsgeraden dar, welche zur Berechnung des Hyaluronangehaltes in pflanzlichem Gewebe verwendet wurde. Die Eichgerade wurde mit Hilfe des käuflich erwerbbaren Testkits (Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001) und den darin mitgelieferten Standardlösungen erstellt.

Allgemeine Methoden

Im Folgenden werden Methoden beschrieben, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese Methoden stellen konkrete Ausführungsformen dar, beschränken die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf diese Methoden. Dem Fachmann ist bekannt, dass er durch Modifikation der beschriebenen Methoden und/oder durch Ersetzen einzelner Methoden bzw. Methodenteile durch alternative Methoden bzw. alternative Methodenteile die Erfindung in gleicher weise ausführen kann.

1. Transformation von Kartoffelpflanzen

Kartoffelpflanzen wurden mit Hilfe von Agrobacterium, wie bei Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989), 23-29) beschrieben, transferiert.

2. Isolierung von Hyaluronan aus pflanzlichem Gewebe

Pflanzenmaterial wurde zum Nachweis des Vorliegens von Hyaluronan und zur Bestimmung des Hyaluronangehaltes in pflanzlichem Gewebe folgender maßen aufgearbeitet: Zu ca. 0,3 g Knollenmaterial wurden 200 μl Wasser (demineralisiert,

Leitfähigkeit >18 MΩ) zugegeben und mit einer Labor-Schwingkugelmühle (MM200,

Firma Retsch, Germany) zerkleinert (30 sec. bei 30 HZ). Anschließend erfolgte eine weitere Zugabe von 800 μl Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) und eine gute Durchmischung (z.B. mit Hilfe eines Vortex). Die Zelltrümmer und unlösliche

Bestandteile wurden vom Überstand durch 5 minütiges Zentrifugieren bei 16000xg abgetrennt.

3. Aufreinigung von Hyaluronan

Ca. 100 Gramm Knollen wurden geschält, in etwa 1 cm³ kleine Stücke geschnitten und nach Zugabe von 100 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) in einem Warring Blendor für ca. 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit zerkleinert. Anschließend wurden die Zelltrümmer über ein Teesieb abgetrennt. Die abgetrennten Zelltrümmer wurden nochmals mit 300 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) aufgeschlemmt und erneut über ein Teesieb abgetrennt. Die beiden erhaltenen Suspensionen (100 ml + 300 ml) wurden vereinigt und für 15 Minuten bei 13000xg zentrifugiert. Dem erhaltenen Zentrifugationsüberstand wurde NaCI bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Nachdem das NaCI gelöst war, erfolgte eine Fällung, durch Zugabe des doppelten Volumens Ethanol, anschließendem gutem Durchmischen und Inkubation über Nacht bei -20⁰C. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 15 Minuten bei 13000xg. Der nach dieser Zentrifugation erhaltene, sedimentierte Niederschlag wurde in 100 ml Puffer (5OmM TrisHCI, pH 8, 1mM CaCb) gelöst, bevor Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und die Lösung für 2 Stunden bei 42⁰C inkubiert wurde. Es folgte eine Inkubation für 10 Minuten bei 95⁰C. Es wurde zu dieser Lösung erneut NaCI bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Nachdem das NaCI gelöst war, erfolgte eine erneute Fällung, durch Zugabe des doppelten Volumens Ethanol, gutem Durchmischen und Inkubation für ca. 96 Stunden bei -20⁰C. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 15 Minuten bei 13000xg. Der nach dieser Zentrifugation erhaltene, sedimentierte Niederschlag wurde in 30 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) gelöst und erneut mit NaCI bis zu einer Endkonzentration von 1 % versetzt. Durch Zugabe des doppelten Volumens Ethanol, gutem Durchmischen und Inkubation über Nacht bei -2O⁰C erfolgte eine erneute Fällung. Der nach anschließender 15 minütiger Zentrifugation bei 13000xg erhaltene Niederschlag wurde in 20 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) gelöst.

Eine weitere Aufreinigung erfolgte mittels Zentrifugalfiltration. Dazu wurden jeweils 5 ml des gelösten Niederschlages über einen Membranfilter (CentriconAmicon, Porenweite 10000 NMWL, Prod. Nr. UCF8 010 96) gegeben und bei 2200xg solange zentrifugiert, bis noch ca. 3 ml der Lösung oberhalb des Filters übrig waren. Anschließend wurden noch zweimal jeweils 3 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) zu der über der Membran befindlichen Lösung hinzu gegeben und jeweils erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert, bis am Ende noch ca. 3 ml der Lösung oberhalb des Filters übrig waren. Die nach Zentrifugalfiltration noch über der Membran vorliegenden Lösungen werden abgenommen und die Membran noch mehrmals (drei- bis fünfmal) mit ca. 1 ,5 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) gespült. Alle noch über der Membran vorliegenden Lösungen und die Spüllösungen werden vereinigt, mit NaCI bis zu einer Endkonzentration von 1% versetzt, nach Lösen des NaCI mit dem doppelten Volumen an Ethanol versehen, gemischt und durch Lagerung bei -2O⁰C über Nacht gefällt. Der nach anschließender 15 minütiger Zentrifugation bei 13000xg erhaltene Niederschlag wurde in 4 ml Wasser (demineralisiert, Leitfähigkeit ≥18 MΩ) gelöst und anschließend gefriergetrocknet (24 Stunden bei einem Druck von 0,37 mbar, Gefriertrocknungsanlage Christ Alpha 1-4, Firma Christ, Osterode).

4. Nachweis von Hyaluronan und Bestimmung des Hyaluronangehaltes

Der Nachweis von Hyaluronan erfolgte mit Hilfe eines käuflich erwerbbaren Tests (Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001) nach den Angaben des Herstellers, die durch Bezugnahme hiermit als Gegenstand in die Beschreibung aufgenommen sind. Das Testprinzip beruht auf der Verfügbarkeit eines spezifisch an Hyaluronan bindenden Proteins (HABP) und erfolgt ähnlich einem ELISA, wobei eine Farbreaktion den Hyaluronangehalt in der untersuchten Probe anzeigt. Die zu vermessenden Proben sollten daher für die quantitative Bestimmung von Hyaluronan in solch einer Konzentration eingesetzt werden (z.B: verdünnen der jeweiligen Probe oder Verwendung von weniger Wasser für die Extraktion von Hyaluronan aus dem pflanzlichen Gewebe, je nachdem ob ein Grenzwert über- oder unterschritten wurde), dass sie innerhalb der angegebenen Grenzen liegen. In parallel-Ansätzen wurden Aliquots der zu bestimmenden Proben zunächst einem Hyaluronidaseverdau unterzogen, bevor sie mit dem käuflich erwerbbaren Test (Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001) vermessen wurden. Der Hyaluronidaseverdau erfolgte mit 400 μl Kartoffelknollen Extrakt in Hyaluronidase Puffer (0,1 M Kalium Phosphatpuffer, pH 5,3; 150 mm NaCI) durch Zugabe von 5 μg (~3 units) Hyaluronidase (Hyaluronidase Typ III from Sigma, Prd. Nr. H 2251) bei einer Inkubation von 30 min bei 37 ⁰C.

Anschließend wurden alle Proben jeweils in einer Verdünnung von 1 :10 für die Bestimmung des Hyaluronangehaltes eingesetzt. 5. Bestimmung der Aktivität einer UDP-GIc-DH

Die Bestimmung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH wird wie bei Spicerl et al. (1998, J. Bacteriol. 273 (39), 25117-25124) beschrieben durchgeführt.

Beispiele

1. Herstellung des pflanzlichen Expressionsvektors IR 47-71

Das Plasmid pBinAR ist ein Derivat des binären Vektorplasmids pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721), das folgendermaßen konstruiert wurde: Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfasst, wurde als EcoR I / Kpn I Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al, 1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858) isoliert und zwischen die EcoR I und Kpn I Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC18 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pUC18-35S. Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera- Estrella et al, 1983 Nature, 303, 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen Hind III und Pvu Il ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal (3 ^'-Ende) des Octopin Synthase-Gens (Gen 3) der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACHδ (Gielen et al, 1984, EMBO Journal 3, .835-846) umfasst (Nucleotide 11749-11939). Nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II- Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die Sph I- und Hind Ill-Schnittstellen von pUC18-35S ligiert. Daraus resultierte das Plasmid pA7. Hier wurde der gesamte Polylinker enthaltend den 35S-Promotor und Ocs-Terminator mit EcoR I und Hind III herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBin19 ligiert. Dabei entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230).

Der Promotor des Patatin Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) wurde als Dra I Fragment (Nukleotide -1512 - +14) in den mit Ssf I geschnittenen Vektor pUC19, dessen Enden mit Hilfe der T4-DNA Polymerase geglättet worden waren, ligiert. Daraus entstand das Plasmid pUC19- B33. Aus diesem Plasmid wurde der B33-Promotor mit EcoR I und Sma I herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBinAR ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33. Um weitere Klonierungsschritte zu erleichtern, wurde die MCS (Multiple Cloning Site) erweitert. Hierfür wurden zwei komplementäre Oligonucleotide synthetisiert, für 5 Minuten auf 95°C erhitzt, auf Raumtemperatur langsam abgekühlt, um ein gutes fixieren (annealen), zu ermöglichen und in die SaI I- und Kpn I Schnittstellen von pBinB33 kloniert. Die dazu verwendeten Oligonucleotide wiesen folgende Sequenz auf:

5'-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggA gCT Cgg TAC-3¹ 5'-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCT g-3¹ Das erhaltene Plasmid wurde mit IR 47-71 bezeichnet.

2. Herstellung des pflanzlichen Expressionsvektors pBinARHyg

Das Fragment, enthaltend den 35S-Promotor, den Ocs-Terminator und die gesamte Multiple Cloning Site wurde mittels der Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III aus pA7 herausgeschnitten und in den mit den gleichen Restiktionsendonukleasen geschnittenen Vektor pBIBHyg Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pBinARHyg bezeichnet.

3. Synthese von Nucleinsäuremolekülen

a) Synthese von Nucleinsäuremolekülen codierend eine Hyaluronansynthase des

Paramecium bursaria Chlorella Virus 1

Die Nucleinsäuresequenz, codierend eine Hyaluronansynthase aus Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , wurde von der Firma Medigenomix GmbH (München, Deutschland) synthetisiert und in den Vektor pCR2.1 der Firma Invitrogen (Prod. Nr. K2000-01) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit IC 323-215 bezeichnet. Die synthetische Nucleinsäuresequenz codierend das HAS Protein aus Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , ist unter SEQ ID NO 3 dargestellt. Die korrespondierende, ursprünglich aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 isolierte Nucleinsäuresequenz, ist unter SEQ ID NO 1 dargestellt.

b) Synthese von Nucleinsäuremolekülen codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 Die Nucleinsäuresequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH aus Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , wurde von der Firma Entelechon GmbH synthetisiert und in den Vektor pCR4Topo der Firma Invitrogen (Prod. Nr. K4510-20) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit IC 339-222 bezeichnet. Die synthetische Nucleinsäuresequenz codierend das UDP-GIc-DH Protein aus Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , ist unter SEQ ID NO 6 dargestellt. Die korrespondierende, ursprünglich aus Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 isolierte Nucleinsäuresequenz, ist unter SEQ ID NO 4 dargestellt.

4. Herstellung des pflanzlichen Expressionsvektors IC 341-222, umfassend eine codierende Nucleinsäuresequenz für eine Hyaluronansynthase des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1

Aus dem Plasmid IC 323-215 wurden mittels Restriktionsverdau mit BamH I und Xho I Nucleinsäuremoleküle, umfassend die codierende Sequenz der Hyaluronansynthase, isoliert und in die BamH I und Xho I Schnittstellen des Plasmides IR 47-71 kloniert. Der erhaltene pflanzliche Expressionsvektor wurde mit IC 341-222 bezeichnet.

5. Herstellung des pflanzlichen Expressionsvektors IC 349-222, umfassend codierende Nucleinsäuresequenzen für ein Protein mit der Aktivität einer UDP-

GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1

Aus dem Plasmid IC 339-222 wurden mittels Restriktionsverdau mit BamH I und Kpn I Nucleinsäuremoleküle, umfassend die codierende Sequenz für ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 isoliert und in das mittels gleicher Restriktionsendonukleasen geschnittene Plasmide pA7 kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit IC 342-222 bezeichnet.

Aus dem Plasmid IC 342-222 wurden durch Restriktionsverdau mit Xba I und Kpn I Nucleinsäuremoleküle, umfassend die codierende Sequenz für ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH des Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 isoliert und in den mit Xba I und Kpn I geschnittenen Expressionsvektor pBinAR Hyg kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit IC 349-222 bezeichnet. 6. Transformation von Pflanzen, mit pflanzlichen Expressionsvektoren, die Nucleinsäuremoleküle enthalten, die eine Hyaluronansynthase codieren

Kartoffelpflanzen (cv Desiree) wurden mit dem pflanzlichen Expressionsvektor IC 341-222, enthaltend eine codierende Nucleinsäuresequenz für eine Hyaluronansynthase aus Parameciυm bursaria Chlorella Virus 1 unter der Kontrolle des Promotors des Patatin Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) nach der unter Allgemeine Methoden Punkt 1 angegebnen Methode transformiert. Die erhaltenen transgenen Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid IC 341-222 transformiert waren, wurden mit 365 ES bezeichnet.

7. Analyse der transgenen Pflanzen, die mit pflanzlichen Expressionsvektoren, umfassend Nucleinsäuremoleküle, die eine Hyaluronansynthase codieren, transformiert wurden

a) Erstellung einer Eichreihe

Eine Eichreihe wurde unter Verwendung der im käuflichen Testkit (Hyaluronic Acid (HA) Test Kit der Firma Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. Nr. 029-001) beiliegenden Standardlösungen nach den vom Hersteller angegeben Verfahren erstellt. Für die Bestimmung der Extinktion von 1600 ng/ml Hyaluronan wurde die zweifache Menge, bezogen auf die vom Hersteller vorgegebene Menge des mitgelieferten Standards, enthaltend 800 ng/ ml Hyaluronan eingesetzt. Es wurden je drei unabhängige Messreihen durchgeführt und der betreffende Mittelwert bestimmt. Es wurde folgende Eichreihe erhalten:

Tabelle 1: Messwerte zur Ermittlung einer Eichkurve für die quantitative Bestimmung des Hyaluronangehaltes in pflanzlichem Gewebe. Mit Hilfe von Software (Microsoft Office Excel 2002, SP2) wurden die erhaltenen Messwerte in ein Diagramm eingetragen und die Funktionsgleichung der Trendlinie bestimmt (siehe Fig 1 ) E_450Rm bezeichnet die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450 nm, Stabw bezeichnet die Standardabweichung des errechneten Mittelwertes von den Einzelwerten.

b) Analyse von Kartoffelknollen, der Linien 365 ES Einzelne Pflanzen der Linie 365 ES wurden im Gewächshaus in 6 cm Töpfen in Erde kultiviert. Ca. jeweils 0,3 g Material von Kartoffelknollen der einzelnen Pflanzen wurden nach der unter Allgemeine Methoden Punkt 2 beschriebenen Methode aufgearbeitet. Die Menge des darin in den jeweiligen Pflanzenextrakten enthaltenen Hyaluronans wurde mit der unter Allgemeine Methoden Punkt 4. beschriebenen Methode und unter zur Hilfenahme der in Beispiel 7a) und Fig 1 dargestellten Eichgerade bestimmt. Der nach Zentrifugation erhaltene Überstand wurde dabei in einer Verdünnung von 1 :10 für die Bestimmung des Hyaluronangehaltes eingesetzt, Für ausgewählte Pflanzen wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle 2: Menge an Hyaluronan (in μg Hyaluronan pro g Frischgewicht), das von unabhängigen, ausgewählten transgenen Pflanzen der Linie 365 ES produziert wurde. Spalte 1 bezeichnet die Pflanze, von welcher Knollenmaterial geerntet wurde („Wildtyp" bezeichnet hierbei Pflanzen, die nicht transformiert sind, jedoch den Genotyp aufweisen, der als Ausgangsmaterial für die Transformation verwendet wurde). Spalte 2 gibt die Menge des Knollenmaterials an, welches von der betreffenden Pflanze für die Bestimmung des Hyaluronangehaltes eingesetzt wurde. Spalte 3 enthält die gemessene Extinktion einer 1 :10 Verdünnung des jeweiligen Pflanzenextraktes. Spalte 4 wurde mit Hilfe der Regressionsgeradengleichung (siehe Fig 1) unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors wie folgt berechnet: ((Wert Spalte 3 - 0,149)/0,00185) x 10. Spalte 5 gibt die Menge Hyaluronan bezogen auf das eingesetzte Frischgewicht an und wurde wie folgt berechnet: (Wert Spalte 4 / Wert Spalte 2) / 1000. „n.d." beteichnet nicht detektierbare Mengen.

8. Transformation von Pflanzen, die Hyaluronan synthetisieren, mit pflanzlichen Expressionsvektoren, umfassend codierende Nucleinsäuresequenzen für ein Protein mit der Aktivität einer UDP-GIc-DH Kartoffelpflanzen der Linien 365 ES 13 und 365 ES 74 wurden jeweils mit dem pflanzlichen Expressionsvektor 349-222, nach der unter Allgemeine Methoden Punkt 1 angegebnen Methode transformiert.

Claims

Patentansprüche

1. Genetisch modifizierte Pflanzenzelle, die ein in ihr Genom stabil integriertes Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Pflanzenzelle zusätzlich eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-Glucose-Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) aufweist, im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp Pflanzenzellen.

2. Genetisch modifizierte Pflanzenzelle nach Anspruch 1 wobei die erhöhte Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer UDP-Glucose-Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in die Pflanzezelle hervorgerufen wird.

3. Genetisch modifizierte Pflanzenzelle nach Anspruch 1 wobei das fremde Nucleinsäuremolekül ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer UDP- Glucose-Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) codiert.

4. Genetisch modifizierte Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 , 2 oder 3 die eine erhöhte Menge an Hyaluronan synthetisiert im Vergleich zu Pflanzenzellen, die die Aktivität einer Hyaluronansynthase aufweisen und keine erhöhte Aktivität einer UDP-Glucose-Dehydrogenase (UDP-GIc-DH) aufweisen.

5. Pflanze enthaltend genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 5, enthaltend genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Erntebare Pflanzenteile von Pflanzen nach Anspruch 5, enthaltend genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

8. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die Hyaluronan synthetisiert, worin a) eine Pflanzenzelle, genetisch modifiziert wird, wobei die genetische Modifikation die folgenden Schritte i bis ii umfasst i) Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls, codierend eine

Hyaluronansynthase in die Pflanzenzelle ii) Einführung einer genetischen Modifikation in die Pflanzenzelle, wobei die genetische Modifikation zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer UDP-Glucose-Dehydrogenase (UDP- GIc-DH) im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp-Pflanzenzellen führt wobei die Schritte i bis ii in beliebiger Reihenfolge, einzeln oder beliebige Kombinationen der Schritte i bis ii gleichzeitig durchgeführt werden können b) aus Pflanzenzellen von Schritt a) eine Pflanze regeneriert wird; c) gegebenenfalls weitere Pflanzen mit Hilfe der Pflanzen nach Schritt b) erzeugt werden, wobei gegebenenfalls aus Pflanzen erhalten aus Schritt b) i oder b) ii Pflanzenzellen isoliert werden und die Verfahrensschritte a) bis c) solange wiederholt werden, bis eine Pflanze erzeugt wurde, die ein fremdes Nucleinsäuremolekül, codierend eine Hyaluronansynthase aufweist und die eine erhöhte Aktivität eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer GFAT im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyp- Pflanzenzellen aufweist .

9. Verfahren zur Herstellung von Hyaluronan, umfassend den Schritt der Extraktion von Hyaluronan aus genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, aus Pflanzen nach Anspruch 5 aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 6 aus erntebaren Pflanzenteilen nach Anspruch 7 oder aus Pflanzen erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 8.

10. Verwendung einer genetisch modifizierte Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Pflanze nach Anspruch 5, Vermehrungsmaterial nach Anspruch 6, erntebaren Pflanzenteilen nach Anspruch 7 oder von Pflanzen, erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 8 zur Herstellung von Hyaluronan.

11. Zusammensetzung enthaltend genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

12. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend Hyaluronan, worin genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, Pflanzen nach Anspruch 5, Vermehrungsmaterial nach Anspruch 6, erntebare Pflanzenteile nach Anspruch 7 oder Pflanzen erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 8 verwendet werden.

13. Verwendung von genetisch modifizierte Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, von Pflanzen nach Anspruch 5, von Vermehrungsmaterial nach Anspruch 6, von erntebaren Pflanzenteilen nach Anspruch 7 oder von Pflanzen, erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 8, zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 11.