WO2007026698A1 - 麦芽飲料老化臭原因遺伝子及びその利用 - Google Patents

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WO2007026698A1
WO2007026698A1 PCT/JP2006/316980 JP2006316980W WO2007026698A1 WO 2007026698 A1 WO2007026698 A1 WO 2007026698A1 JP 2006316980 W JP2006316980 W JP 2006316980W WO 2007026698 A1 WO2007026698 A1 WO 2007026698A1
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gene
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malt
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Kazuyoshi Takeda
Kazuhiro Sato
Hisao Kuroda
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National University Corporation Okayama University
Sapporo Breweries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a malt beverage aging odor-causing gene and its use, and particularly to a gene involved in the conversion of linoleic acid in barley malt to 2 (E) -nonenal and its use. is there.
  • Malt used as a raw material for malt beverages such as beer and happoshu contains a large amount of lipids and fatty acids. These lipids and fatty acids are oxidized by the enzyme lipoxygenase or autoxidation in the preparation step of the process for producing the malt sparkling beverage. As a result, lipid hydroperoxide and fatty acid hydroperoxide are produced (see Non-Patent Document 1). The lipid hydroperoxide is hydrolyzed by a lipase contained in malt to be a fatty acid hydroperoxide.
  • the fatty acid hydroperoxide produced as described above produces decomposition products such as aldehydes having an aging odor, a blue odor, a fatty acid odor, etc., by thermal decomposition or chemical decomposition. These degradation products are known to be a factor that significantly impairs the flavor of malt beverages (products) (see Non-Patent Document 2).
  • 2 (E) -nonenal also known as “trans_2_nonenal”
  • trans_2_nonenal 2 (E) -nonenal
  • trans_2_nonenal also known as “trans_2_nonenal”
  • a low-threshold aldehyde is thought to be a causative agent of the forced odor generated during the storage of beer.
  • HPL fatty acid hydroperoxidase
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-522434 (published July 29, 2004)
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-16202 (published January 22, 2004)
  • Non-patent Reference 1 Kobayashi, N., Kaneda, K., Kano, Y., and Koshino, S., J. Ferment. B ioeng., 76, 371-375, 1993
  • Non-Patent Document 2 Drost, B. W., van Eerde, P., Hoekstra, S. F., and Strating, J., Proc. Of the 13th Congress, Estoril, Portugal, 1971
  • Patent Document 3 Drost, BW, van den Berg, R., Freijee, FJM, van der Velde, E. G., and Hollemans, M., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124—131 , 1990
  • Non-Special Terms 4 Kuroda, H., Furusho, S., Maeba, H., and Takashio, M., Characterizat ion of factors involved in the production of 2 (E) -nonenal during masnmg. Biosci. Bio technol. Biochem. 67: 691-697 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Kobayashi, Tsuji, Kaneda, H., Kano, Y., and Koshino, S., J. Am. Soc. B rew. Chem., 52 (4): 141-5, 1994
  • Non-Patent Document 6 Hisao Kuroda, Identification and Functional Analysis of Rice 9-Fatty Hydroperoxidase Gene: Abstracts of 2004 Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (Poster la Gene ⁇ Nucleic Acid 3PA -056), 2004
  • Non-Patent Document 3 In the method of raising the preparation temperature as shown in Non-Patent Document 3, the action of proteolytic enzymes and saccharifying enzymes is also suppressed. Therefore, there is a problem that the nutrient quality necessary for fermentation is insufficient and the flavor quality is impaired. In other words, such a method has a limit in suppressing the aging odor without impairing the flavor quality.
  • lipid hydroperoxide contained in malt is hydrolyzed to fatty acid hydroperoxide by lipase in mash.
  • decomposition products such as aldehydes are generated from lipid hydroperoxide without involvement of lipoxygenase. Therefore, there is a limit to the suppression of aging odor and improvement of flavor quality by suppressing lipoxygenase alone as in the above method (see Non-Patent Document 5).
  • HPL contained in the malt decomposes and cleaves the fatty acid hydroperoxide when producing mash in the production process of the malt beverage to produce a decomposition product. Therefore, by using malt with low HPL activity as a raw material, the production of degradation products (aging substances) can be effectively suppressed, and a malt beverage with better flavor quality may be produced (patent document). 2).
  • a method for producing malt with low HPL activity a method for producing malt using barley with low HPL activity as a raw material is considered as one of the effective methods.
  • a method for producing such barley with low HPL activity conventional methods for breeding by crossing and molecular breeding methods such as genetic modification techniques can be considered. The method of crossing takes a long time, and there is a possibility that varieties exhibiting the desired phenotype cannot be obtained.
  • molecular biology techniques if the target gene, in this case, the HPL gene, has been identified, the desired phenotype is displayed relatively easily. Varieties can be produced.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to cause malt beverage aging odors useful for producing malt for producing malt beverages with reduced aging odors. It is to provide the gene and its use.
  • 9-linoleic acid is a causative gene for malt beverage aging odor that is useful for producing malt for producing a malt beverage with reduced aging odor.
  • HPL gene that catalyzes the degradation of hydroperoxide, ie 9 / 13—
  • HPL gene was successfully isolated from barley for the first time, and the present invention was completed.
  • the gene according to the present invention is characterized by encoding the protein described in the following (a) or (b).
  • the gene preferably has the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as an open reading frame region.
  • the gene hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent hybridization conditions, and 9- / 13 -It is characterized by encoding a protein having fatty acid hydroperoxidase activity.
  • a protein that is effective in the present invention is characterized in that it is encoded by the gene that is effective in the present invention.
  • the protein is characterized by being a protein described in the following (a) or (b).
  • (B) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added, and 9 / 13-fatty acid hydroperoxidase Protein with activity.
  • the modified protein useful in the present invention is deficient in 9- / 13-fatty acid hydroperoxidase activity or reduced in specific activity by introducing a mutation into the amino acid sequence of the protein. It is characterized by that.
  • the gene according to the present invention includes a gene encoding the modified protein.
  • a recombinant expression vector according to the present invention is characterized by including the gene according to the present invention.
  • the transformant according to the present invention is characterized in that the gene according to the present invention described above or the above recombinant expression vector is introduced.
  • the transformant preferably has a 9- / 13-fatty acid hydroperoxidase activity lower than that of the wild type.
  • the plant according to the present invention is characterized by containing the modified protein.
  • the method for producing a beverage according to the present invention is characterized by using the transformant or the plant.
  • the beverage is preferably a malt beverage.
  • the beverage of the present invention is characterized by being manufactured by a method including the above-described method for manufacturing a beverage.
  • the gene according to the present invention encodes a protein having 9- / 13-fatty acid hydroperoxide lyase activity. Therefore, by producing a transformant in which the expression of the gene is suppressed or a mutant strain having a mutation in the gene, 13—It is effective to produce varieties with low fatty acid hydroperoxidase activity.
  • the use of barley with improved varieties as described above as a malt raw material has the effect of producing a malt beverage that has little aging odor and is less likely to cause aging odor during storage, that is, less likely to age. Play.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the reaction mechanism of CYP74 family proteins.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the mechanism of 2 (E) -nonenal generation.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of HvHPL2 clone.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of comparing the primary structures of proteins in barley and rice CYP74C and CYP74A.
  • FIG. 5 is a diagram showing a phylogenetic tree of the CYP74 family of barley and rice.
  • FIG. 6 is a chromatogram showing the results of functional analysis of HvHPL2 recombinant protein.
  • HPL is a kind of cytochrome P450 and is widely present in the plant kingdom. In dicotyledonous plants, it is known that there are two types of HPL. Specifically, CYP74B (hereinafter also referred to as “13-HPL”) that decomposes a fatty acid having a hydroperoxide at the 13th position, and CYP74C (hereinafter referred to as “13-HPL”) that decomposes a fatty acid having a hydroperoxide at the 9th or 13th position. “9-/ 13 -HPLJ” is present (see Figure 1). Of these, 9- / 13-HPL is linoleic acid 9-hydroperoxide (hereinafter also referred to as "9_HPOD”) To catalyze the reaction to form 2 (E) -nonenal.
  • 9_HPOD linoleic acid 9-hydroperoxide
  • HPL involved in the production of 2 (E) -nonenal which is the causative agent of the aging odor of beer described above, is “9_Zl3_HPL” (see FIG. 2).
  • HPOD is Although DNA (called “HvHPL”) was identified, 9_ / 13_HPL was not identified.
  • HPL is a member of the CYP74 family.
  • HPL is also a member of the CYP74 family.
  • arsenide synthase hereinafter also referred to as “A0S”; AOS is CY P74A).
  • DES divinyl ether synthase
  • DES is C YP74D
  • the gene according to the present invention is a malt beverage aging odor-causing gene, and specifically a gene encoding a protein having 9—Z13—HPL activity.
  • genes according to the present invention include a gene encoding "(a) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1".
  • HvHPL2 gene The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was isolated and identified from barley as a gene encoding a protein having 9-Z13-HPL activity, ie, CYP74C. It is. This gene is hereinafter referred to as “HvHPL2 gene”.
  • the cDNA of this HvHPL2 gene has a size of 1665 base pairs (about 1.6 kbp), and the 140th nucleotide and the 142nd nucleotide sequence are the start codon (ATG).
  • the 1615th base sequence from the 1613th force is a stop codon (TGA). Therefore, the HvHPL gene has an open reading frame (ORF) from the 140th to the 1615th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and this ORF has 1476 base pairs. It has a size of about 1.5 kbp.
  • SEQ ID NO: 2 shows the base sequence representing the ORF region of cDNA of HvHPL2 gene.
  • the gene according to the present invention includes "(b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.” And a gene encoding a protein having 9_ / l 3_HPL activity ”
  • “one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” means that a known mutant peptide such as site-directed mutagenesis is prepared.
  • the number of amino acids that can be substituted, deleted, inserted, and / or added by the method preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less
  • the protein (b) is a mutant protein of the protein (a).
  • “Mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by a known method for producing a variant protein, but may be a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring variant protein. .
  • a DN comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • examples include a gene that hybridizes with DNA comprising a base sequence complementary to A under stringent hybridization conditions and encodes a protein having 9-Z13-HPL activity.
  • hybridization under stringent hybridization conditions means that at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably at least 97% identity between sequences. This means that hybridization occurs only when it exists.
  • stringent hybridization conditions include, for example, a hybridization solution (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM After incubation at 42 ° C in sodium phosphate (pH 7.6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 / ig / ml denatured sheared salmon sperm DNA, approximately 65 The conditions for washing the filter in 0 ⁇ 1 X SSC at ° C can be mentioned.
  • the hybridization is performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. Molecular loning'A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold pnng Harbor Laboratory (1989). There is no particular limitation. Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (ie, the more difficult it is to hybridize).
  • the gene for the present invention includes, by itself, a polynucleotide encoding the amino acid sequence 'J of the mature protein; a coding sequence of the mature protein and an additional sequence (for example, a sequence encoding a leader sequence). ) (Eg preprotein or proprotein sequence or preproprotein sequence); role in introns, non-coding 5 'sequences and non-coding 3' sequences (eg transcription, mRNA processing (including splicing and polyadenylation signals)) A transcriptional untranslated arrangement responsible for 1J); including, but not limited to, additional coding sequences encoding additional amino acids that provide additional functionality.
  • the present invention includes mutants of the gene according to the present invention.
  • Such variants include those produced by one or several nucleotide substitutions, deletions, or additions, as described above.
  • a substitution, deletion, or addition can include one or more nucleotides.
  • Variants can be altered in the coding or non-coding regions, or both. Co Mutations in the domain can generate conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions.
  • the mutant also includes a gene encoding a modified protein of the proteins (a) and (b). Since the modified protein will be described later, here, the details are not described here, but (a) and (b) those having a specific activity lower than the specific activity of the protein (for example, k Low, high K value, etc.) or no such activity
  • A, C, G and T represent adenine, cytosine, guanine and thymine bases.
  • amino acids and amino acid residues use the one-letter code or three-letter code specified by IUPAC and IUB.
  • the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”. “Polynucleotide” means a polymer of nucleotides. Therefore, the term “gene” in this specification includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA (mRNA, etc.) such as sense strand and antisense strand constituting the DNA. The antisense strand can be used as a probe or as an antisense agent.
  • DNA includes, for example, cDNA or genomic DNA obtained by cloning techniques, chemical synthesis techniques, or a combination thereof.
  • the DNA may be a “genomic” type DNA containing a non-coding sequence such as an intron which is a form contained in the genome of an animal, or obtained via mRNA using a reverse transcriptase or a polymerase. It may be cDNA, ie, “transcribed” DNA that does not contain non-coding sequences such as introns.
  • nucleic acid includes any simple nucleotide and / or polynucleotide comprising a modified nucleotide, such as cDNA, mRNA, total RNA, hnRNA, and the like.
  • Modified nucleotides include inosin, acetylcytidine, methylcytidine, methyladenosine, and phosphoric acid esters including methylguanosine, as well as nucleotides that can be generated by the action of ultraviolet light or chemical substances.
  • base sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” and is indicated as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C and T, respectively).
  • Polynucleo The “base sequence” of a tide or polynucleotide is intended to be a sequence of deoxyribonucleotides relative to a DNA molecule or polynucleotide, and ribonucleotides (A, G, C, and R) relative to an RNA molecule or polynucleotide.
  • U) is intended for the corresponding sequence (each thymidine deoxynucleotide (T) in the deoxynucleotide sequence identified here is replaced by the ribonucleotide uridine (U)).
  • RNA molecule having the sequence of SEQ ID NO: 2 or 4" represented by using the abbreviation of deoxyribonucleotide refers to each deoxynucleotide A, G, or C of SEQ ID NO: 2 or 4 Force It is intended to indicate an RNA molecule having a sequence that is substituted by the corresponding ribonucleotide A, G or C and where the deoxynucleotide T is replaced by ribonucleotide U.
  • polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 or a fragment thereof includes the sequence shown by each of the dioxynucleotides A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 2 or 4. Contemplates a polynucleotide or fragment portion thereof.
  • the method for obtaining the gene according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method using differential screening (subtraction cloning).
  • this method according to a known technique, direct hybridization in a test tube is repeated, and the target cDNA (gene useful in the present invention) is concentrated.
  • Each step in the differential screening may be performed under conditions that are normally used.
  • the clones thus obtained can be analyzed in more detail by creating a restriction enzyme map and determining its nucleotide sequence (sequencing). From these analyses, it can be easily confirmed whether a DNA fragment containing the gene sequence according to the present invention has been obtained.
  • a method for isolating and cloning a DNA fragment containing the gene according to the present invention by a known technique can be mentioned.
  • a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of the above cDNA sequence and screen a genomic DNA library or cDNA library.
  • Such a probe is specific to at least a part of each cDNA sequence or its complementary sequence. As long as it is a probe that hybridizes, any probe of any length may be used.
  • examples of a method for obtaining the gene according to the present invention include a method using an amplification means such as PCR.
  • primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences IJ), and genomic DNA (or A large amount of DNA fragments containing the gene according to the present invention can be obtained by performing PCR or the like using a cDNA) or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers.
  • the cDNA is obtained by extracting the germinating mRNA of germinated seeds and reverse-trancribing the mRNA.
  • HPL activity is often detected in germs of germinated seeds (from 3 to 7 days after germination). The gene concerning can be acquired.
  • a polynucleotide having the sequence may be synthesized using a known chemical synthesis.
  • sequence of the probe is selected from sequences encoding a region considered to be important for the function of the protein according to the present invention (for example, a consensus sequence of a heme binding site in the HvHPL2 protein), By screening genomic DNA (or cDNA) libraries of various plants and other organisms, it is highly possible to isolate genes encoding homologous molecules and related molecules having functions equivalent to those of the protein of the present invention. ,.
  • mutant of the gene according to the present invention can naturally occur like a natural allelic mutant.
  • allelic variant is intended one of several interchangeable forms of a gene that occupies a given locus on an organism's chromosome.
  • non-naturally occurring variants can be generated, for example, using mutagenesis techniques known in the art.
  • the protein according to the present invention is a protein involved in the generation of a causative substance of an aging odor in a malt beverage, specifically, a protein having 9 ⁇ / 13 ⁇ HPL activity.
  • proteins having amino acid substitutions, deletions, insertions, and amino acid sequences with Z or added, and having 9_ / 13-HPL activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a translation product of the above-mentioned HvHPL2 gene.
  • HvHPL2 protein The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a translation product of the above-mentioned HvHPL2 gene.
  • HvHPL2 protein the above protein is referred to as HvHPL2 protein.
  • this HvHPL2 protein is composed of 491 amino acid residues, and its molecular mass is about 53.7 kDa.
  • the protein according to the present invention may be a polypeptide in which one or several amino acids of the protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, attached or deleted. . Conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions are preferred. Particularly preferred are silent substitutions, additions and deletions. If it is the above, the protein or the part of the protein that is useful in the present invention or its characteristics are not changed. In these respects, conservative substitution is particularly preferable.
  • the present invention also includes a modified protein of the protein useful in the present invention, in other words, a mutant protein (mutant).
  • modified proteins include variants produced by one or several amino acid substitutions, deletions or additions.
  • a substitution, deletion, or addition can include one or more amino acids.
  • the modified protein has a specific activity that is lower than that of the proteins (a) and (b) above (for example, k
  • the protein used in the present invention may be chemically synthesized or recombinantly produced using only a protein isolated from nature. That is, the protein according to the present invention may be in a state isolated and purified from cells, tissues or the like, or a state in which the protein-encoding gene is introduced into the host cell and the protein is expressed in the cell. It may be.
  • the protein which is useful in the present invention may contain an additional polypeptide.
  • the additional polypeptide include a marker sequence (eg, a mating IJ encoding a peptide that facilitates purification of the fused protein).
  • the marker amino acid sequence may be a hex histidine peptide (eg, a tag provided in a pQE vector (Qiagen, INC.)).
  • hexahistidine peptides are useful for convenient purification of fusion proteins.
  • many public and Z or commercially available marker amino acid sequences are available.
  • the “HA” tag is a useful peptide for purification corresponding to an epitope from influenza hemagglutinin (HA) protein. is there.
  • fusion proteins in which Fc is fused to the N-terminal or C-terminal of the protein that is useful in the present invention are also useful for purification.
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” or “peptide”.
  • HvHPL2 protein is a member belonging to the CYP74 family and classified as CYP74C.
  • HvHPL2 protein catalyzes a reaction that cleaves and decomposes 9-HPOD in which linoleic acid has been converted into 3 (Z) -nonenal by, for example, 9-lipoxygenase (see FIG. 2).
  • 3 (Z) -nonenal is thought to be isomerized to 2 (E) -nonenal enzymatically (by isomerase) or non-enzymatically.
  • HvHPL protein is a protein that contributes to the production of 2 (E) -nonenal, which is a causative substance of the aging odor of malt beverages in the production process of malt beverages. So far, 9-lipoxygenase protein in malt has been identified, but in the present invention, a new HvHPL2 protein was successfully identified.
  • a mutant having a mutation in the activity of the HvHPL2 protein is obtained. If used, it is possible to breed barley that has an anti-aging effect when used as a raw material for malt beverages such as beer.
  • the method for obtaining the protein according to the present invention is not particularly limited.
  • a biological sample containing the protein according to the present invention for example, a cell, tissue, organism
  • Simple purification from individual etc. for example, a cell, tissue, organism
  • the protein according to the present invention is purified from plant material, it is preferably extracted from the germ of the germinated seed.
  • HPL activity is often detected in germs of germinated seeds (from 3 to 7 days after germination), and as described above, by using germs of germinated seeds as a material, the present invention is more efficient.
  • the protein can be purified.
  • the purification method is not particularly limited, and a cell or tissue force cell extract may be prepared by a known method, and the cell extract may be purified using a known method such as a column.
  • a cell or tissue force cell extract may be prepared by a known method, and the cell extract may be purified using a known method such as a column.
  • the crude protein fraction extracted from cells or tissues can be subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) to purify and separate the protein according to the present invention.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the buffer used for purification is preferably a buffer containing about 0.01 to 0.5% of a nonionic surfactant such as Triton X-100 or Tween 20 as a solubilizer.
  • a nonionic surfactant such as Triton X-100 or Tween 20
  • the use of the buffer having the above-described structure facilitates solubilization of the protein, and the protein according to the present invention can be purified more efficiently.
  • the buffer preferably contains a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol dithiothreitol.
  • a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol dithiothreitol.
  • the buffer solution contains a protease inhibitor (for example, a complete protease thease inhibitor manufactured by Roche).
  • a protease inhibitor for example, a complete protease thease inhibitor manufactured by Roche.
  • the target protein here, the protein according to the present invention
  • Other methods for obtaining the protein according to the present invention include a method using a gene recombination technique or the like. In this case, for example, after the gene according to the present invention is incorporated into a vector or the like, it is introduced into a host cell so that it can be expressed by a known method, and the protein obtained by translation in the cell is purified. Can be adopted. Specific methods such as gene introduction (transformation) and gene expression will be described later.
  • the method for producing the mutant protein is not particularly limited.
  • a site-directed mutagenesis method Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.
  • a method of creating a mutant protein by introducing a point mutation into a base sequence using the PCR method or A well-known method for producing a mutant protein such as a method for producing a mutant strain by inserting a transposon can be used.
  • alterations can be made so that one or several bases are substituted, deleted, inserted, and Z or added. Can be produced.
  • a commercially available kit may be used for producing the variant protein.
  • a protein having a specific activity lower than the specific activities of the proteins (a) and (b) described above for example, k is low, , K value is high
  • the mutations described above are important sites in the enzymatic reaction (amino acid residues such as active center and Z or substrate binding site). Group). Then, a desired modified protein with high efficiency can be obtained.
  • the method for obtaining a protein according to the present invention is not limited to the above, and may be, for example, a protein that is chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer or the like.
  • the gene according to the present invention can be obtained using a cell-free protein synthesis solution. You can synthesize peptides that are useful in the present invention.
  • a recombinant expression vector useful for the present invention comprises the gene of the present invention that codes for the protein described in (a) or (b) above.
  • a recombinant expression vector in which cDNA is inserted for example, a recombinant expression vector in which cDNA is inserted.
  • a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but it is not particularly limited.
  • the manufacturing method can be performed using a known method.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, an appropriate promoter sequence is selected in order to reliably express the gene, and this and the gene capable of producing the present invention incorporated into various plasmids or the like are used as expression vectors.
  • Strong expression vectors include, for example, phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors, and virally derived vectors (eg, bacterial plasmids, butteriophages, yeast episomes, yeast).
  • Chromosome elements eg, noculovirus, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, tribox virus, pseudorabies virus, and retrovirus
  • viruses eg, noculovirus, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, tribox virus, pseudorabies virus, and retrovirus
  • vectors derived from combinations thereof eg, cosmids and phagemids
  • plasmid vectors are introduced in a precipitate neutral force, such as a calcium phosphate precipitate, or in a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, the vector can be packaged in vitro using an appropriate packaging cell line and then transduced into host cells. Retroviral vectors can also be replicable or replication defective. In the latter case, viral propagation generally occurs only in complementary host cells.
  • a vector containing a cis-acting regulatory region for the gene of interest is preferred.
  • Appropriate trans-acting factors can be supplied by the host, supplied by a complementary vector, or supplied by the vector itself upon introduction into the host.
  • the vector is inducible and / or cell type specific. It is preferred to provide specific expression that can be Particularly preferred among such vectors are vectors that are inducible by environmental factors that are easy to manipulate, such as temperature and nutrient additives.
  • pQE70, pQE60, and pQE_9 available from Qiagen force
  • pBS vector Phagescript vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Acceptable from Stratagene; ptrc99a, pKK223_3, pKK233_3, pDR540, pRIT5 (Phrmacia force available).
  • pWLNEO pSV2CAT, p0G44, pXT1, and pSG
  • pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL available from Phrmacia
  • vectors preferable for use in plants for example, plasmids "pBI121”, “pBI221”, “pBI101” (all manufactured by Clontech), "pTA7001”, “pTA7002” (Aoyama et al. (1997) ) Plant J. 11: 605), ⁇ ⁇ ⁇ 211 J (Hajdukiewicz et al "Plant Mol. Biol. 25: 9 89 (1994).
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and drug resistance such as tetracycline resistance gene or ampicillin resistance gene for culture in E. coli and other bacteria. Gene.
  • drug resistance genes such as neomycin resistance gene, no, idaromomycin resistance gene and the like can be used.
  • a gene deleted in the host cell is used as a marker, and a plasmid containing this marker and the gene according to the present invention is introduced into the host cell as an expression vector.
  • the introduction of the gene according to the present invention can be confirmed from the expression of the marker gene.
  • a protein that is useful for the present invention may be expressed as a fusion protein.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Proteins that are useful in the present invention may be expressed as GFP fusion proteins.
  • the gene according to the present invention may be linked to a vector containing a selection marker for growth in a host cell.
  • DNA inserts also operate on appropriate promoters (eg, phage ⁇ PL promoter 1, E. coli lac promoter, trp promoter, and tac promoter, SV40 early and late promoters, and retroviral LTR promoter). It is preferable that they are connected. As other suitable promoters, conventionally known promoters can be used.
  • appropriate promoters eg, phage ⁇ PL promoter 1, E. coli lac promoter, trp promoter, and tac promoter, SV40 early and late promoters, and retroviral LTR promoter.
  • Known bacterial promoters suitable for use in the present invention include E. coli lad and lacZ promoters, T3 and T7 promoters, gpt promoters, PR promoters and PL promoters, and trp promoters. It is. Suitable eukaryotic promoters include CMV immediate early promoter, HSV thymidine kinase promoter, early SV40 promoter and late SV40 promoter, retrovirus LTR promoter (eg, Rous sarcoma virus (RSV) promoter), and meta-mouthonein. Promoters (eg, mouse metamouth thionein I promoter) are listed.
  • promoters suitable for use in plant cells are the cauliflower mosaic wines 35S promoter (Odell et al., Nature, 313: 810 (1985)) and the rice actin promoter (Zhang et al. , Plant Cell, 3: 1155 (1991)) and corn ubiquitin promoter (Cornejo et al, Plant Mol. Biol., 23: 567 (1993)).
  • promoters for inducible expression are expressed by external factors such as infection and invasion of filamentous fungus 'bacteria' virus, low temperature, high temperature, drying, UV irradiation, spraying of specific compounds, etc. Examples of such promoters are known. Examples of such promoters include rice chitinase gene promoters (Xu et al., Plant Mol. Biol., 30: 387 (1996)) expressed by infection and invasion of filamentous fungal 'bacterial' viruses and tobacco. Promoter of PR protein gene (Ohshima et al., Plant Cell 2:95 (1990)), promoter of rice ipl 9 ”induced by low temperature (Aguan et al., Mol.
  • the rice chitinase gene promoter and tobacco PR protein gene promoter are also induced by specific compounds such as salicylic acid, and "rabl 6" is also induced by spraying the plant hormone abscisic acid. It may also include the use of a vector system having a system that allows inducible gene expression in plants by treatment with darcocorticoids or estrogen.
  • PTA7001, pTA7002 are vectors that can be induced by darcocorticoid treatment, and pER10 (Zuo et al. , Plant J., 24: 265 (2000)).
  • a promoter for specific expression of proliferating cells for example, the promoter of tobacco NPK1 gene expressed in S to M phase (Nishihama et al., Genes Dev., 15: 352 (2000)), Tobacco NACK1 gene promoter (Nishihama et al, Cell, 109: 87 (2002)), Nitinichi CYM gene promoter (Ito et al., Plant J., 11: 983 (1997)), S Nichinichi CYS gene promoter (I to et al., Plant J., 11: 983 (1997)), an Arabidopsis thaliana cdc2a gene promoter (Chung et al., FEBS) Lett., 362: 215 (1995)).
  • tissue-specific promoters include US 5459252 and US 5633363 (root-specific), US 5097025 ((i) seed, (ii) mature plant), US 5391725 ((i) chloroplasts) , (Ii) Itoda Cytoplasm, US 4886753 (nodule), US 5646333 (epidermis), US 5110 732 ((i) root, (ii) storage root), US 5618988 (storage organ), US 5401836 and US 5792925 (Root), US 4943674 (fruit), US 5495007 (phloem), and US 5824 857 (Vascular Structure) can be found in the patent literature. Each of these patent documents is incorporated herein by reference.
  • the Arabidopsis AtHB8 promoter (Baima et al. Development 121: 4171 (1995)), a promoter specific to the vascular pre-formation layer, and the ACL5 promoter specific to stems and roots ( Hanzawa et al. The EMBO Journal, 19: 4248 (2000)), a tomato RBCS3A promoter specific to the above-ground part (Meier et al. Plant Physiol. 107: 1105 (1995)) and the like can also be used.
  • the recombinant expression vector preferably further contains a site for transcription initiation and transcription termination, and a ribosome binding site for translation in the transcription region.
  • the coding portion of the mature transcript expressed by the vector construct will contain a transcription start AUG at the beginning of the polypeptide to be translated and a stop codon appropriately located at the end.
  • transcription of DNA by higher eukaryotes can be increased by inserting an enhancer sequence into the vector.
  • An enhancer is a cis-acting element of DNA, usually about 10-300 bp, that acts to increase the transcriptional activity of a promoter in a given host cell type.
  • enhancers include the SV40 enhancer (which is located 100-270 bp on the late side of the replication origin), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polio enhancer on the late side of the replication origin, and An adenovirus enhancer.
  • the host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be preferably used.
  • suitable hosts include cells (eg, E. coli cells, Streptomyces cells, and Salmonella typhimurium cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9) Cell); animal cells (eg, CH cells, COS cells, and Bowes melanoma cells); and plant cells (eg, dicotyledonous plants such as Arabidopsis thaliana and tobacco, monocotyledonous plants such as rice and barley). .
  • cells eg, E. coli cells, Streptomyces cells, and Salmonella typhimurium cells
  • fungal cells eg, yeast cells
  • insect cells eg, Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9 Cell
  • animal cells eg, CH cells, COS cells, and Bowes melanoma cells
  • plant cells eg, dicotyled
  • cells derived from mammalian cells such as human mice, silkworm-derived cells, insects such as Drosophila melanogaster, bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast) Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharo myces pombe), nematode aenornaoditis elegans, Xenopuslaevis
  • insects such as Drosophila melanogaster
  • bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast) Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharo myces pombe)
  • nematode aenornaoditis elegans Xenopuslaevis
  • Xenopuslaevis examples include oocytes, but are not particularly limited. Appropriate culture media and conditions for the above-described host cells may be known in the art.
  • a method for introducing the above expression vector into a host cell that is, a transformation method is not particularly limited.
  • Elect mouth position method, calcium phosphate method, ribosome method, DE AE dextran method, microinjection method, cationic lipid mediated method Conventionally known methods such as transformation and infection can be suitably used. Such methods are described in many standard laboratory manuals such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding a partial fragment of the protein of the present invention for recombinantly generating a partial fragment (fragment) of the protein of the present invention.
  • a transformant (host cell) genetically engineered with a recombinant expression vector can be provided.
  • the present invention may include an invention relating to the production of the protein according to the present invention or a fragment thereof by the above-described recombinant technique. That is, the present invention may include a method for producing the protein or fragment thereof according to the present invention using a recombinant technique.
  • Recombinant proteins produced by vigorous techniques can be used for ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, It can be recovered from recombinant cell culture and purified by well-known methods including hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography (“HPLC”) is used for purification.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the transformant according to the present invention is a transformant into which the gene according to the present invention has been introduced, that is, a transformant into which the recombinant expression vector described in ⁇ 6> above has been introduced.
  • gene introduced means that the gene is introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
  • the “transformant” means not only a cell “tissue” organ but also an individual organism.
  • a method for producing a transformant (production method) according to the present invention comprises the above-described recombinant expression vector.
  • the method of transforming one can be mentioned.
  • the organisms to be transformed are not particularly limited, and examples include various microorganisms, animals, and plants exemplified in the above section ⁇ 6>.
  • a gene according to the present invention or a homologous gene derived from a plant of another species and having homology to the gene according to the present invention is known genetic engineering.
  • a transformant in which the expression level of the gene is artificially controlled (overexpressed or suppressed) by introducing it into a host cell by a technique (gene manipulation technique) can be mentioned.
  • the present invention includes plants in which the activity of the protein according to the present invention is modified.
  • plant in which the activity of the protein according to the present invention is modified refers to a plant in which the expression of the protein or the function of the protein according to the present invention is changed, and the expression level of the protein or the function of the expressed protein is Plants that have changed at a detectable level as compared to the wild type are preferred.
  • the “change in the expression level” means constitutive expression, inducible expression, overexpression, ectopic expression, and suppression of expression.
  • the plant material used for transformation is not particularly limited.
  • Protoplasts, cells, callus, organ leaves, seeds, germs, pollen, egg cells, zygotes, etc. can grow. Plant materials, flowers, fruits, leaves, roots, or parts of plants such as cuttings can be used.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. For example, protoplast cocultivation method, leaf disk method, etc., method using infection of Agrobataterium bacteria, polyethylene glycol method, electoral position method, microinduction method, particle gun method, ribosome method, etc. For example, an introduction method using a simple vector system can be mentioned.
  • the plant material and method used for the transformation exemplified above may be selected according to the type of host.
  • 9-Z13-plant with low HPL activity and utilization of the plant will be described below, but the present invention is not limited thereto. Les.
  • plant with reduced 9_Z13 HPL activity refers to a plant with reduced enzyme activity due to a decrease in the content of 9- Z13 HPL protein compared to wild-type plants.
  • -H PL protein qualitative changes, specifically reduced specific activity (eg, decreased k or K value)
  • the plant is not particularly limited, but in the present embodiment, wheat is preferable, and barley is particularly preferable.
  • barley it is possible to produce malt with low 9 ⁇ / 13 ⁇ HPL activity. If such malt is used in the production of malt beverages such as beer, the production of 2 (E) nonenal during storage can be reduced, and a malt beverage with less cardboard odor can be produced.
  • the production of causative substances of aging odors can be suppressed in the manufacturing process. That is, according to the present invention, it is possible to achieve both improvement (maintenance) of flavor quality and suppression of aging odor in malt beverages.
  • malt beverage means malt-only beer, ale, dry beer, your beer, light beer, low alcohol beer, low calorie beer, porter, Bock beer, stout, malt liquor, sparkling liquor, non-alcoholic malt liquor, etc. are included.
  • alternative malt beverages are included.
  • Alternative malt beverages include, for example, fruit flavors such as lemon, orange, lime or strawberry or malt beverages with a citrus flavor, malt beverages with a liquor flavor such as vodka, rum or tequila, and coffee flavored malt beverages. Are listed.
  • the method for producing a plant with low 9-Z13 HPL activity as described above is not particularly limited. For example, it can be obtained by selecting a plant exhibiting such a phenotype from naturally occurring mutants. In addition, the plant can be artificially produced. In that case, for example, the following methods (I) to (VIII) can be used.
  • Transformation Plants can be transformed with various nucleic acid molecules designed to manipulate the gene expression according to the invention or to modify the structure of the gene according to the invention.
  • This embodiment includes transformation using a gene encoding the above-described modified protein according to the present invention. It should be noted that the transformation method and the plant material used for transformation may be appropriately used as exemplified in the above item ⁇ 7>.
  • the gene according to the present invention can be targeted for site-directed mutagenesis using chimeric RNAZDNA oligonucleotides.
  • chimeric RNA / DNA oligonucleotides are obtained from plant cells (Zhu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; and Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774. -8778) and mammalian cells (Yoon et al., 1 999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076), it is known that mutations can be introduced at desired positions.
  • the chimeric RNA / DNA oligonucleotide can be transformed using the transformation method exemplified in item 7> above or a plant material.
  • Whether or not a mutation has been introduced at a desired position can be confirmed and tracked by using a conventionally known method such as a PCR-based method.
  • the gene according to the present invention is targeted for site-directed mutagenesis using a chimeric RNA / DNA oligonucleotide, a mutation can be introduced into a specific site in the gene according to the present invention. it can.
  • the mutation in the coding region of the gene according to the present invention may cause a frame shift that is not particularly limited, or may cause truncation of a protein that is a translation product and a decrease in Z or substrate specificity. Including insertions, deletions and substitutions.
  • Antisense expression 9 Z13— A plant with reduced HPL activity can also be realized by expressing an antisense strand of the gene according to the present invention in the plant. Transformation using an expression vector containing an antisense nucleic acid sequence can be performed using the transformation method exemplified in ⁇ 7> above.
  • DNA encoding a protein having a dominant negative trait means that the activity of the protein encoded by the endogenous gene of the present invention inherent in the plant body is lost by expressing the DNA. It refers to DNA that encodes a protein having a function of decreasing.
  • Suppression of the endogenous expression of the gene according to the present invention can also be achieved by co-suppression caused by transformation of DNA having the same or similar sequence as the gene (target gene) sequence according to the present invention.
  • “Co-suppression” is a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as a target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is suppressed. That means. The details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol., 7: R793, 1997; Curr. Biol, 6: 810, 1996).
  • a vector DNA prepared so as to express a gene capable of working with the present invention or a DNA having a similar sequence to the target plant is transformed into the target plant. What is necessary is just to select the plant in which growth was suppressed from the obtained plant after conversion.
  • the gene used for co-suppression need not be exactly the same as the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90. / o or more (e.g., 95./ 0 or more) that have a sequence identity of.
  • the sequence identity can be determined by a conventionally known method.
  • UV irradiation may also be used.
  • RNA interference refers to the expression of double-stranded RNA derived from foreign DNA when a DNA in which a sequence identical or similar to the target endogenous gene is placed in inverted repeats is introduced into the plant, resulting in the expression of the target gene. This is a phenomenon in which the expression of is suppressed.
  • RNA interference as a first step, complementary RNA is synthesized using a target gene mRNA and a double-stranded RNA derived from the introduced sequence as a complex and an associated sequence as a primer.
  • this complex is fragmented by endogenous RNases.
  • double-stranded RNA fragmented to 20-30 base pairs functions again as a secondary RNA interference signal, and is thought to degrade the mRNA of the endogenous target gene again.
  • Curr. Biol, 7: R793, 1997; Curr. Biol, 6: 810, 1996 an optimal transformation method may be selected according to the type of host.
  • RNA interference in order to obtain a plant body in which the genes that are relevant to the present invention are suppressed by RNA interference First, a vector DNA prepared so as to express a gene in which the gene according to the present invention or a DNA having a sequence similar thereto is arranged in inverted repeats is transformed into a target plant. Next, a plant having a reduced 9- / 13-HPL activity may be selected from the obtained plant body.
  • the gene used for RNA interference does not have to be completely identical to the target gene, but at least 10 bases are the same continuously, preferably 20 to 100 bases are the same continuously. More preferably, 50 bases are identical in succession.
  • the gene used for RNA interference may be a gene having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95% or more) of sequence identity with the target gene. Even more preferably, a gene having a sequence identity of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (eg, 95% or more) with the target gene is arranged in inverted repeats. Can be mentioned. In particular, it is preferable that these target genes and genes having sequence identity are arranged in inverted repeats with a spacer sequence in between. The identity of the sequence can be determined using a conventionally known method.
  • the full length of the target gene may be used, but at least 25 bases are preferred, preferably 50 bases, more preferably 100 bases, and even more preferably 500. If you have a base,
  • RNA interference can also be realized by plant virus infection. Plant viruses that have single-stranded RNA as a genome take the form of double-stranded RNA during the replication process. Therefore, when the target gene sequence is inserted into a plant virus genome together with an appropriate promoter and the plant is infected with this recombinant virus, double-stranded RNA of the target gene sequence is generated along with the replication of the virus. Will be. As a result, it is possible to obtain the effect of RNA interference (Angell et al., Plant J. 20, 357-362, (1999)) 0
  • transposon tag line By using the transposon gene as a mutagen, a transposon tag line can be created in a desired plant or the like. In this way, a plant with a low 9- / 13-HPL activity is produced by selecting a plant with a reduced expression level of the protein according to the present invention or a plant with a reduced activity from the produced transposon tag line. be able to. [0147]
  • the transposon gene can be introduced into a plant by the transformation method described above.
  • the method for selecting a plant having reduced 9- / 13-HPL activity from the plant produced by the above method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • the Northern plot method can be exemplified as a method for evaluating the expression level of a gene.
  • the protein expression level can be determined by an immunological method such as ELISA or Western plotting using an antibody that specifically recognizes the protein of the present invention.
  • a method for directly evaluating 9 ⁇ / 13 ⁇ HPL activity a method disclosed in Patent Document 2 can be used as a method for directly evaluating 9 ⁇ / 13 ⁇ HPL activity.
  • Such a plant extract can be obtained by adding a predetermined amount of pulverized plant to a predetermined amount of buffer solution (for example, acetate buffer solution) and stirring for a predetermined time.
  • buffer solution for example, acetate buffer solution
  • degradation products include aldehydes produced by the decomposition of HPOD, and specific examples include nonenal (trans_2_nonenal), hexanal, hexenal, and nonenagenal. It is done.
  • the method for measuring the production amount of the decomposition product is not particularly limited, and is measured by a known method.
  • a method in which a decomposition product is derivatized with various derivatization reagents and measured by high performance liquid chromatography (HPLC), or a method in which the decomposition product is measured by gas chromatography can be used.
  • the method for measuring the amount of decrease in HPOD is not particularly limited and is measured by a known method.
  • a method for measuring the amount of decrease in HPOD as a substrate by ultraviolet absorption can be used. .
  • HPL activity can be evaluated as low activity as the amount of such degradation products produced is low or the production rate is slow, or the amount of decrease in HPOD is small or the rate of reduction is slow.
  • HPL activity can be calculated by calculating the following formula from the measured value measured by the above method.
  • Enzyme activity decrease in UV absorbance at 234 nm in 1 minute X O. 667 X total amount of reaction solution (mL) ⁇ enzyme solution volume (mL) ⁇ enzyme solution concentration (g / mL)
  • the detection limit by the above method is 0. ImU / g in the method of measuring the amount of decomposition products (aldehydes), and in the method of measuring the decrease in fatty acid hydroperoxide by ultraviolet absorption. lnkat / g.
  • Zg or less more preferably 0. ImU / g or less, or 5 nkat / g or less, more preferably Ink at / g or less.
  • the method for producing a beverage of the present invention comprises the above-described transformant according to the present invention, or the above (
  • the malt beverage includes the malt beverages exemplified above.
  • a method for producing a malt beverage using malt produced from barley having a low 9_Z13_HPL activity is described below. I will explain below.
  • a method for producing a malt beverage a method including a saccharification step, a wort boiling step, a cooling step, a fermentation step, and an aging step can be mentioned. The above method can also be used in the present invention. Hereinafter, each step will be described.
  • the saccharification step is a step of obtaining a sugar solution by saccharifying a raw material containing malt.
  • the malt used in the present invention is malt produced from barley with low 9- / 13-HPL activity, that is, malt with low HPL activity.
  • malt having an enzyme activity of 2 mU / g or less, more preferably 0 ⁇ lmU / g or less, or 5 nkat / g or less, more preferably lnkat / g or less is preferable.
  • such malt is preferably obtained by germinating barley with sufficient water and air and drying to remove young shoots.
  • Malt is an enzyme source necessary for wort production and at the same time a major starch source as a raw material for sugar cane.
  • dye peculiar to malt drink can be provided by drying malt.
  • barley can be soaked to 40 to 45% of the degree of soaking, then germinated at 10 to 20 ° C. for 3 to 6 days, and then roasted to obtain the desired malt.
  • the method for saccharifying the raw material containing malt is not particularly limited.
  • the raw material containing malt and water for charging are charged in a charging kettle and mixed, and the mixture is mixed at a predetermined temperature (preferably 65 to 75). After heating to ° C), the saccharified solution can be obtained by removing soot by filtration if necessary.
  • the proportion of malt used in the raw material is appropriately selected according to the type of malt beverage such as beer and happoshu.
  • a commercially available or separately prepared malt extract may be mixed with water for charging, and auxiliary materials such as corn starch, corn grits, rice, and sugars may be added as necessary.
  • the wort boiling step is a step of adding hops to the wort obtained by filtering the saccharified solution and boiling the mixture.
  • the hop content in the saccharified solution is preferably in the range of 0.5 to 3. Og ZL, and the boiling time of the mixture is preferably 90 to 120 minutes. This gives a malt drink-specific aroma and bitterness, and also stops the function of the malt enzyme.
  • the wort (hot wort) after the wort boiling step is cooled to a predetermined temperature.
  • the cooled wort is then subjected to a fermentation process.
  • the hot wort is preferably cooled to 15 ° C or lower.
  • a fermentation broth is obtained by adding yeast to the wort after the cooling process and fermenting the wort.
  • the yeast used in the fermentation process is not particularly limited as long as it is a substance that metabolizes the sugar in wort to produce alcohol or carbon dioxide (eg, alcoholic yeast that performs so-called alcoholic fermentation). Examples include Saccharomyces cereviche and Saccharomyces uvalum.
  • the fermentation conditions are not particularly limited, but the fermentation temperature is preferably 15 ° C or lower, more preferably 8 to 10 ° C, and the fermentation time is preferably 8 to 10 days.
  • the fermented liquor thus obtained is aged and then filtered to obtain a malt beverage.
  • the conditions in the ripening process are not particularly limited, but for example, the re-fermentation and aging of the remaining extract can be suitably performed by storing it in a closed tank etc. and storing it at a storage temperature of 5 to 3 ° C for 30 to 90 days. it can.
  • the filtration conditions are not particularly limited, but filtration is performed using diatomaceous earth, PVPP (polyvinylepolypyrrolidone), silicagenole, cellulose powder, etc. as a filter aid. Filtered malt foamed beverages are packed in tanks, sacked, bottled, canned, etc. and shipped to the market.
  • PVPP polyvinylepolypyrrolidone
  • silicagenole cellulose powder, etc.
  • malt beverages examples include beer and happoshu.
  • the malt beverage produced by the production method of the present invention has a low content of aging substances such as aldehydes produced by the decomposition of malt-derived fatty acid hydroperoxide.
  • the 9-Z13-HPL activity in malt beverages has decreased quantitatively and / or qualitatively. Therefore, the malt beverage has an effect of having little aging odor even when stored for a long period of time, that is, excellent aging durability.
  • HvHPL2 one of the genes that can be used in the present invention, can also be used as a genetic marker It is.
  • an oligonucleotide containing a base substitution present in the base sequence of the barley chromosome in the base sequence can be used as a genetic marker. Therefore, if an oligonucleotide as described above is designed in the HvHPL2 gene region on the barley chromosome, the oligonucleotide can be used as a genetic marker.
  • Such genetic markers can be used for mapping genetic marker groups, isolation of specific genes, and breed improvement.
  • HvHPL2 full-length cDNA
  • homology analysis of amino acid sequences of OsHPLl protein, ⁇ sHPL2 protein, and HvHPL2 protein revealed that the homology of these proteins was very high, as shown in FIG.
  • a phylogenetic tree of barley and rice CYP74 family genes including the OsHPLl gene, the OsHPL2 gene, and the HvHPL2 gene was prepared.
  • the OsHPLl gene, the OsHPL2 gene, and the HvHPL2 gene were shown to be closely related to each other.
  • the HvHPL2 protein was structurally similar to the rice CYP74C protein (ie, OsHPLl protein and OsHPL2 protein).
  • the ORF region of the HvHPL2 gene was amplified by PCR using the following primer 1 and primer 2, and the fragment was blunt-ended.
  • Primer l 5 _GAGGATCCATGACGTCCAAGGTACCCAACAGC-3, (SEQ ID NO: 11)
  • Primer 2 5, -GGAAGCTTGCTACTACTATAGTCACTCGGCCC-3 '(; ⁇ ⁇ ⁇ IJ ⁇ No. 12)
  • Tag peptide MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS (SEQ ID NO: 13)
  • pRSETA-HvHPL2 was transformed into BL21 (DE3) pLysS.
  • Production in E. coli and affinity purification of the recombinant protein were performed as follows.
  • the transformed strain is pre-cultured in 100 ml of LB medium at 16 ° C and when the OD reaches 0.7.
  • isopropyl mono- ⁇ -thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 2 mM.
  • the cells were further cultured for 16 hours under the same conditions, and then the cells were collected by centrifugation.
  • Cells are suspended in 10 ml of lOmM Tris—HCl (pH 7.2), 0.1% Tween20, ImM ⁇ -mercaptoethanol, frozen at 80 ° C., thawed, and 100 U DNase 1 (diluted). Tubongene) was added. After incubating at 25 ° C. for 10 minutes, the sample was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at 1000 O X g, and the supernatant was used as an E. coli lysate. Protein concentration was measured using Bio-Rad protein assay (Bio-Rad). The enzyme function was analyzed using a part of the E. coli lysate thus obtained.
  • the recombinant protein had the activity of decomposing linoleic acid and linolenic acid having hydroperoxide at the 9- or 13-position to produce aldehydes such as 3 (Z) -nonenal (Fig. (See 6).
  • aldehydes such as 3 (Z) -nonenal (Fig. (See 6).
  • AOS and DES activities were not observed.
  • the present invention provides a gene involved in the generation of a causative substance of an aging odor in a malt beverage. Therefore, if the gene according to the present invention is used, it can be used for improving the variety of barley in which the expression of proteins involved in the generation of the causative substance of aging odor in malt beverages is suppressed. In addition, the use of a mutant of the gene can improve the variety of barley that exhibits the above-mentioned effects. Furthermore, the present invention is not limited to the above-mentioned improvement of barley varieties, but can be applied to the improvement of varieties of all wheat, more broadly monocotyledons.
  • genes and proteins that are useful in the present invention can be used to determine the aging of malt beverages.
  • the present invention can provide a malt beverage that is unlikely to age, using the plant obtained by the above-described variety improvement as a raw material.

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Abstract

　本発明は、老化臭が低減された麦芽飲料を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺伝子、及びその利用を提供する。本発明にかかる麦芽飲料老化臭原因遺伝子は、９－／１３－ＰＨＬタンパク質をコードする遺伝子である。それゆえ、当該遺伝子の発現抑制や、当該遺伝子への変異導入がなされた植物においては、９－／１３－ＰＨＬタンパク質の発現量を低下させたり、９－／１３－ＰＨＬタンパク質の活性を低下させたりすることができる。それゆえ、そのような上記植物として、オオムギを用いれば、９－／１３－ＰＨＬ活性の低い麦芽を提供することができる。このような麦芽は、老化臭が低減された麦芽飲料の製造に用いることができる。

Description

明 細 書
麦芽飲料老化臭原因遺伝子及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、麦芽飲料老化臭原因遺伝子及びその利用に関するものであって、特に 、ォォムギ麦芽中のリノール酸から 2 (E)—ノネナールへの変換に関与する遺伝子及 びその利用に関するものである。
背景技術
[0002] ビール、発泡酒などの麦芽飲料の原料として利用される麦芽には、多量の脂質及 び脂肪酸が含まれている。これら脂質及び脂肪酸は、麦芽発泡飲料を製造する工程 のうちの仕込工程において、酵素リポキシゲナーゼ又は自動酸化により酸化される。 その結果、脂質ヒドロペルォキシド及び脂肪酸ヒドロペルォキシドが生成される（非特 許文献 1を参照）。また、上記脂質ヒドロペルォキシドは、麦芽に含まれるリパーゼに より加水分解を受け、脂肪酸ヒドロペルォキシドとなる。
[0003] 上記のように生成された脂肪酸ヒドロペルォキシドは、熱分解又は化学的分解によ り、老化臭、青臭み、脂肪酸臭などを有するアルデヒド類といった分解生成物を生じ る。これら分解生成物は、麦芽飲料 (製品）の香味を著しく損なう要因となることが知ら れている（非特許文献 2を参照）。例えば、閾値の低いアルデヒドとして知られる 2 (E) -ノネナール（「トランス _ 2 _ノネナール」ともいう）は、ビールの保存中に生成する力 ードボード臭の原因物質であると考えられている。
[0004] そこで、このような分解生成物の生成を抑える技術の開発が求められ、これまでに レ、くつかの方法が提案されている。具体的な方法としては、麦芽飲料の製造工程に ぉレ、て仕込温度を上げてリポキシゲナーゼ活性を抑制する方法や、リポキシゲナ一 ゼ活性の低い麦芽を用いる方法、例えば、高温で処理しリポキシゲナーゼを失活さ せた麦芽を用いる方法や酵素活性が低下した変異型リポキシゲナーゼー 1を有する ォォムギ植物由来の麦芽を用いる方法などが挙げられる（特許文献 1、非特許文献 3 を参照）。
[0005] ところで、本発明者らは、これまでに、麦芽中において、 9 リノ一ノレ酸ヒドロペルォ キシドを 2 (E)—ノネナールに変換する活性を発見し、本活性がビール老化に影響し うることを見出してレ、る（非特許文献 4を参照）。
[0006] さらに、この活性は酵素であり、双子葉植物で明らかにされた脂肪酸ヒドロペルォキ シドリアーゼ (以下、「HPL」ともいう）と非常に良く似た性質を有することを明らかにし ている（特許文献 2を参照）。すなわち、上述した脂肪酸ヒドロペルォキシドの分解を 触媒する HPLが麦芽中に存在することを見出している。
特許文献 1：特開 2004— 522434号公報（平成 16 (2004)年 7月 29日公開） 特許文献 2：特開 2004— 16202号公報（平成 16 (2004)年 1月 22日公開） 非特許文献 1： Kobayashi, N. , Kaneda, Η·， Kano, Y.， and Koshino, S.， J. Ferment. B ioeng., 76, 371-375 , 1993
非特許文献 2 : Drost, B. W.， van Eerde, P. , Hoekstra, S. F.， and Strating, J. , Proc. of the 13th Congress, Estoril, Portugal , 1971
特許文献 3 : Drost, B. W.， van den Berg, R.， Freijee, F. J.M., van der Velde, E. G ·, and Hollemans, M., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124—131, 1990
非特言午文献 4 : Kuroda, H. , Furusho, S., Maeba, H., and Takashio, M. , Characterizat ion of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during masnmg. Biosci. Bio technol. Biochem. 67:691-697 (2003)
非特許文献 5 : Kobayashi, Ν· , Kaneda, H.， Kano, Y.， and Koshino, S.， J. Am. Soc. B rew. Chem., 52(4): 141-5， 1994
非特許文献 6：黒田久夫ほカ イネ 9-脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ遺伝子の同 定と機能解析：日本分子生物学会 2004年会要旨集 (ポスター la 遺伝子 ·核酸 3PA -056) , 2004年
発明の開示
[0007] 非特許文献 3に示すような仕込温度を上げる方法では、タンパク質分解酵素や糖 化酵素の作用も抑制される。そのため、発酵に必要な栄養源が不足し、香味品質が 損なわれるという問題がある。つまり、このような方法では、香味品質を損なうことなぐ 老化臭を抑制するには限界がある。
[0008] また、麦芽を高温で処理し、リポキシゲナーゼを失活させた麦芽を用いる方法では 、香味バランスが崩れたり、香味品質に悪影響を与えたりするという問題がある。すな わち、このような方法も、上記方法と同様に、香味品質を損なうことなぐ老化臭を抑 制する方法として十分なものではない。
[0009] また、特許文献 1に開示される酵素活性が低下した変異型リポキシゲナーゼ— 1を 有するォォムギ植物由来の麦芽を用いる方法では、保存中のビールにおける 2 (E) 一ノネナールの生成を抑制する効果は見られるものの、老化臭抑制の観点からは改 善できる余地を残している。
[0010] そもそも、上述したように、麦芽に含まれる脂質ヒドロペルォキシドは、もろみ中のリ パーゼにより脂肪酸ヒドロペルォキシドに加水分解される。つまり、リポキシゲナーゼ が関与することなぐ脂質ヒドロペルォキシドからアルデヒド類などの分解生成物が生 成されてしまう。したがって、上記の方法のようなリポキシゲナーゼ単独の抑制による 老化臭の抑制及び香味品質の改善には限界がある (非特許文献 5を参照)。
[0011] 一方、麦芽中に含まれる HPLは、麦芽飲料の製造工程において、もろみを製造す る時に脂肪酸ヒドロペルォキシドを分解 '開裂し、分解生成物を生成する。そのため、 HPL活性の低い麦芽を原料として利用することにより、分解生成物 (老化物質)の生 成が効果的に抑制され、より香味品質のよい麦芽飲料を製造できる可能性がある (特 許文献 2を参照)。
[0012] このような HPL活性の低い麦芽を生産する方法としては、上記のような問題は抱え る力 麦芽を高温で処理し HPL活性を失活させる方法が考えられる。しかし、 HPL は高い熱安定性を示すため、そのような方法を用いることをできなレ、（特許文献 1を参 照）。
[0013] そこで、 HPL活性の低い麦芽を生産する方法として、 HPL活性の低いォォムギを 原料として麦芽を生産する方法が有効な方法の 1つとして考えられる。そのような HP L活性の低いォォムギを生産する方法としては、従来の交配による品種改良法や、 分子生物学的手法、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた品種改良法が考えられ る。交配による方法は、長い年月がかかるうえ、所望の表現型を示す品種が得られな い可能性もある。それに対して、分子生物学的手法を用いる場合、標的となる遺伝子 、この場合、 HPL遺伝子が同定されていれば、比較的容易に所望の表現型を示す 品種を作製することができる。
[0014] しかしながら、ォォムギでは、これまでに、 9 _リノール酸ヒドロペルォキシドの分解 を触媒する、すなわちビールの老化臭の原因物質の生成に関与する HPLの遺伝子 は単離されていない。そのため、分子生物学的手法を用いて、上述したような HPL 活性の低レ、ォォムギを生産することができなレ、。
[0015] そこで、ォォムギにおいて、 9 _リノール酸ヒドロペルォキシドの分解を触媒する HP
L遺伝子のように、麦芽飲料の老化臭の原因物質の生成に関与する遺伝子を同定 することが求められていた。
[0016] 本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、老化臭が低減さ れた麦芽飲料を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺 伝子、及びその利用を提供することにある。
[0017] 本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、老化臭が低減された麦芽飲料 を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺伝子として、 9 リノール酸ヒドロペルォキシドの分解を触媒する HPL遺伝子、すなわち 9 /13—
HPL遺伝子を、ォォムギから初めて単離することに成功し、本発明を完成するに至 つた。
[0018] すなわち、本発明にかかる遺伝子は、以下の（a)又は (b)に記載のタンパク質をコ ードすることを特徴としてレ、る。
[0019] (a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0020] (b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷 入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ 9一 /13—脂肪酸ヒドロペル ォキシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
[0021] また、上記遺伝子は、配列番号 2に示される塩基配列をオープンリーディングフレ ーム領域として有することが好ましレ、。
[0022] さらに、上記遺伝子は、配列番号 2に示される塩基配列からなる DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下でハイブリ ダイズし、かつ 9— /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性を有するタンパク質 をコードすることを特徴としてレ、る。 [0023] 本発明に力かるタンパク質は、上記の本発明に力かる遺伝子にコードされることを 特徴としている。
[0024] また、上記タンパク質は、以下の（a)又は (b)に記載のタンパク質であることを特徴 としている。
[0025] (a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0026] (b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷 入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ 9一 /13—脂肪酸ヒドロペル ォキシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
[0027] 本発明に力かる改変型タンパク質は、上記タンパク質のアミノ酸配列に変異が導入 されることによって、 9— /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性が欠損してい る、又は比活性が減少していることを特徴としている。
[0028] さらに、本発明にかかる遺伝子には、上記改変型タンパク質をコードする遺伝子も 含まれる。
[0029] 本発明に力かる組換え発現ベクターは、上記の本発明にかかる遺伝子を含むこと を特徴としている。
[0030] また、本発明にかかる形質転換体は、上記の本発明にかかる遺伝子、又は上記組 換え発現ベクターを導入してなることを特徴としてレ、る。
[0031] 上記形質転換体は、 9— /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性が野生型よ りも低下してレ、ることが好ましレ、。
[0032] 本発明にかかる植物は、上記改変型タンパク質を含むことを特徴としている。
[0033] 本発明にかかる飲料の製造方法は、上記形質転換体、又は上記植物を用いること を特徴としている。
[0034] 上記飲料は、麦芽飲料であることが好ましい。
[0035] また、本発明の飲料は、上記の飲料の製造方法を含む方法で製造されることを特 徴としている。
[0036] 以上のように、本発明にかかる遺伝子は、 9— /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリア ーゼ活性を有するタンパク質をコードしている。それゆえ、当該遺伝子の発現が抑制 された形質転換体や、当該遺伝子に変異をもつ変異株を生産することにより、 9一/ 13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性が低い品種を作出することができるとレ、 う効果を奏する。また、上記のように品種改良されたォォムギを麦芽原料として用いる ことによって、老化臭が少なぐまた、保存中にも老化臭が発生しにくい、すなわち老 化が起こりにくい麦芽飲料を製造できるという効果を奏する。
[0037] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであ ろう。
図面の簡単な説明
[0038] [図 1]CYP74ファミリータンパク質の反応機構を説明する図である。
[図 2]2 (E)—ノネナールの生成機構を説明する図である。
[図 3]HvHPL2クローンの塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
[図 4]ォォムギ及びイネの CYP74Cと CYP74Aとにおいて、タンパク質の一次構造 を比較した結果を示す図である。
[図 5]ォォムギ及びイネの CYP74ファミリーの系統樹を示す図である。
[図 6]HvHPL2組換えタンパク質の機能解析結果を示すクロマトグラムである。
発明を実施するための最良の形態
[0039] < 1.本発明の背景 >
まず、本発明を完成させるに至るまでの背景について説明する。
[0040] HPLは、シトクローム P450の 1種で植物界に広く存在する。また、双子葉植物にお いては、 HPLには 2つのタイプがあることが知られている。具体的には、 13位にヒドロ ペルォキシドを有する脂肪酸を分解する CYP74B (以下、「13— HPL」ともいう）と、 9位又は 13位にヒドロペルォキシドを有する脂肪酸を分解する CYP74C (以下、「9 -/13 -HPLJともいう）とが存在する（図 1を参照）。これらのうち、 9— /13— HPL は、リノール酸 9—ヒドロペルォキシド（以下、「9_HPOD」ともいう）を分解し、 2 (E) -ノネナールを生成する反応を触媒する。
[0041] すなわち、上述のビールの老化臭の原因物質となる 2 (E)—ノネナールの生成に 関与する HPLは、「9_Zl3_HPL」である（図 2を参照）。
[0042] し力し、上記 2つのタイプの HPLのうち、 13— HPODは、ォォムギにおいて、その c DNA (「HvHPL」と呼ばれる）が同定されてレ、るものの、 9_/13 _ HPLは同定さ れていなかった。
[0043] 一方、本発明者らは、最近、 in silicoスクリーニングにより、単子葉植物では初め て、ィネからじ丫？74じ（「03^«^1」、「OsHPL2」と命名）を単離した（非特許文献 6 を参照）。 OsHPLl及び OsHPL2は、これらと同じ CYP74ファミリーに属するアレン ォキシド合成酵素（以下、「A〇S」ともいう。なお、 AOSは、 CYP74Aである）と構造 上、非常に似ていた。そのため、 OsHPLl及び〇sHPL2は、 AOSと誤ってァノテ一 シヨンされていた。つまり、本発明者らは、イネでは 17万クローン以上もの完全長 cD NAが解析されていたにも関わらず、同定されることがな力 た CYP74Cの候補を抽 出し、初めて同定することに成功した。
[0044] 上述のように、 HPLは、 CYP74ファミリーのメンバーである力 CYP74ファミリーに は、 HPL以外に、アレンォキシド合成酵素（以下、「A〇S」ともいう；なお、 AOSは CY P74Aである）、ジビニルエーテル合成酵素（以下、「DES」ともレ、う。なお； DESは C YP74Dである）などが含まれる（図 1を参照）。つまり、 CYP74ファミリーには、異なる 酵素活性を有するタンパク質が複数含まれている。したがって、 OsHPLl及び OsH PL2を同定した経緯力 も明らかなように、 CYP74ファミリーに属する可能性がある タンパク質が新規に見出されたとしても、そのタンパク質の一次構造、すなわち、アミ ノ酸配列から、そのタンパク質が有する活性を推定することは困難である (非特許文 献 6を参照)。つまり、 CYP74ファミリーに属することまでは比較的容易に導き出せた としても、 CYP74ファミリーの中の具体的にどの酵素であるかを証明することは非常 に困難である。また、現在の技術では、 CYP74Aと CYP74Cの活性の差異を構造 やモチーフから推定することはできなレ、。
[0045] このような状況下において、本発明者らは、後述の実施例に示すように、ォォムギ 由来の CYP74C遺伝子を単離 ·同定することに成功し、本発明を完成させるに至つ た。
[0046] 本発明の実施形態について、以下、詳細に説明するが、本発明は、これに限定さ れるものではない。
[0047] く 2.本発明にかかる遺伝子〉 本発明にかかる遺伝子は、麦芽飲料老化臭原因遺伝子であって、具体的には、 9 — Z13— HPL活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
[0048] 本発明にかかる遺伝子の具体的な例としては、「（a)配列番号 1に示されるアミノ酸 配列からなるタンパク質」をコードする遺伝子が挙げられる。
[0049] 上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、 ォォムギから 9— Z13— HPL活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、すなわ ち CYP74Cとして、単離 ·同定されたものである。当該遺伝子を以後「HvHPL2遺伝 子」と称する。
[0050] この HvHPL2遺伝子の cDNAは、配列番号 3に示すように、 1665塩基対（約 1. 6 kbp)のサイズを有しており、 140番目力も 142番目の塩基配列が開始コドン (ATG) であり、 1613番目力ら 1615番目の塩基配列が終止コドン (TGA)である。したがつ て、上記 HvHPL遺伝子は、配列番号 3に示す塩基配列のうち、 140番目力ら 1615 番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF)として有しており、この ORFは、 1476塩基対（約 1. 5kbp)のサイズを有している。 HvHPL2遺伝子の cDN Aのうち、 ORF領域を表す塩基配列を配列番号 2に示す。
[0051] また、本発明にかかる遺伝子として、「（b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個 又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からな り、かつ 9_/l 3_HPL活性を有するタンパク質」をコードする遺伝子が挙げられる
[0052] 本明細書において、「1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入、及び/又は付 加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により 置換、欠失、揷入、及び/又は付加できる程度の数 (好ましくは 10個以下、より好ま しくは 7個以下、さらに好ましくは 5個以下）のアミノ酸が置換、欠失、揷入、及び Z又 は付加されることを意味する。このように、上記 (b)のタンパク質は、上記（a)のタンパ ク質の変異タンパク質であるといえる。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変 異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する 同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
[0053] さらに、本発明にかかる遺伝子として、配列番号 2に示される塩基配列からなる DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントなハイブリダィゼーシヨン条件 下でハイブリダィズし、かつ 9— Z13— HPL活性を有するタンパク質をコードする遺 伝子が挙げられる。
[0054] 上記「ストリンジヱントなハイブリダィゼーシヨン条件下でハイブリダィズ」するとは、少 なくとも 90%の同一性、好ましくは少なくとも 95%の同一性、最も好ましくは少なくとも 97%の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダィゼーシヨンが起こることを 意味する。 「ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件」の具体的な例として、例え ば、ハイブリダィゼーシヨン溶液（50%ホルムアミド、 5 X SSC (150mMの NaCl、 15 mMのクェン酸三ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンハート液 、 10%硫酸デキストラン、及び 20 /i g/mlの変性剪断サケ精子 DNAを含む）中にて 42°Cでー晚インキュベーションした後、約 65°Cにて 0· 1 X SSC中でフィルターを洗 浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダィゼーシヨンは、 J.Sambrook e t al. Molecularし loning'A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold pnng Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定される ものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高くな る（すなわち、ハイブリダィズし難くなる）。
[0055] また、本発明に力かる遺伝子には、それ自体によって、成熟タンパク質のアミノ酸配 歹' Jをコードするポリヌクレオチド;成熟したタンパク質のコード配列及びさらなる配列（ 例えば、リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列又はプロタン パク質配列又はプレプロタンパク質配列）；イントロン、非コード 5 '配列及び非コード 3 '配列（例えば、転写、 mRNAプロセシング（スプライシング及びポリアデュル化シグ ナルを含む）において役割を担う転写非翻訳配歹 1J)；さらなる機能性を提供するような さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列が含まれるが、これらに限定されるも のではない。
[0056] さらに、本発明には、本発明にかかる遺伝子の変異体も含まれる。このような変異 体は、上述したように、 1又は数個のヌクレオチド置換、欠失、又は付カ卩によって生成 される変異体を含む。置換、欠失、又は付加は、 1つ以上のヌクレオチドを含み得る。 変異体は、コード若しくは非コード領域、又はその両方において変化され得る。コー ド領域における変異は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加を 生成し得る。
[0057] また、上記変異体には、上記（a)および (b)タンパク質の改変型タンパク質をコード する遺伝子も含まれる。改変型タンパク質については、後述するので、ここでは、詳 細については述べなレ、が、上記（a)および (b)タンパク質の比活性よりも低い比活性 しか有さなレ、（例えば、 k が低い、 K値が高いなど）、又は当該活性を全く有さない
cat m
タンパク質であることが好ましレ、。
[0058] なお、本明細書において、特に断らない限り、 A、 C、 G及び Tは、アデニン、シトシ ン、グァニン及びチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸及びアミノ酸残基は、 IUPAC 及び IUBの定める 1文字表記又は 3文字表記を使用する。
[0059] また、本明細書において、「遺伝子」との用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「 核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意 味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、 2本鎖 DNAのみならず、そ れを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各 1本鎖 DNAや RNA(mRNA 等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用 できる。
[0060] 「DNA」には、例えばクローニングゃ化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得 られるような cDNAやゲノム DNA等が含まれる。すなわち、 DNAとは、動物のゲノム 中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形 DNAであつ てもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いて mRNAを経て得られる cDNA、 すなわちイントロンなどの非コード配列を含まなレ、「転写」形 DNAであってもよい。
[0061] また、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び/又は修飾ヌクレオチドから なるポリヌクレオチド、例えば cDNA、 mRNA、全 RNA、 hnRNA、等が含まれる。「 修飾ヌクレオチド」には、イノシン、ァセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノ シン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天 的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
[0062] 「塩基配列」との用語は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デォキシリボヌクレオ チド（それぞれ A、 G、 C及び Tと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオ チド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、 DNA分子又はポリヌクレオチドに対して のデォキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そして RNA分子又はポリヌクレオチドに 対してのリボヌクレオチド (A、 G、 C及び U)の対応する配列（ここで特定されるデォキ シヌクレオチド配列における各チミジンデォキシヌクレオチド (T)は、リボヌクレオチド のゥリジン (U)によって置き換えられる）を意図する。
[0063] 例えば、デォキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される「配列番号 2又は 4の配 列を有する RNA分子」とは、配列番号 2又は 4の各デォキシヌクレオチド A、 G又は C 力 対応するリボヌクレオチド A、 G又は Cによって置換され、そしてデォキシヌクレオ チド Tが、リボヌクレオチド Uによって置き換えられる配列を有する RNA分子を示すこ とを意図する。また、「配列番号 2又は 4に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド 又はそのフラグメント」とは、配列番号 2又は 4の各デォキシヌクレオチド A、 G、 C及び /又は Tによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分を意図する。
[0064] < 3.本発明にかかる遺伝子の取得方法 >
本発明にかかる遺伝子を取得する方法 (又は遺伝子の生産方法）は、特に限定さ れるものではないが、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクシヨンクロ 一ユング）を利用する方法を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って 、試験管内での直接的ハイブリダィゼーシヨンを繰り返し、 目的の cDNA (本発明に 力かる遺伝子）を濃縮すればょレ、。
[0065] 上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いら れる条件の下で行えばよい。これによつて得られたクローンは、制限酵素地図の作成 及びその塩基配列決定 (シークェンシング）によって、さらに詳しく解析することができ る。これらの解析によって、本発明にかかる遺伝子配列を含む DNA断片を取得した か容易に確認することができる。
[0066] また、本発明にかかる遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明に かかる遺伝子を含む DNA断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例え ば、上記 cDNA配列の一部配列と特異的にハイブリダィズするプローブを調製し、ゲ ノム DNAライブラリーや cDNAライブラリーをスクリーニングすればよレ、。このようなプ ローブとしては、上記各 cDNA配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的に ハイブリダィズするプローブであれば、いかなる配歹 長さのものを用いてもよい。
[0067] また、本発明にかかる遺伝子を取得する方法として、 PCR等の増幅手段を用いる 方法を挙げることができる。例えば、本発明に力かる遺伝子の cDNA配列のうち、 5 ' 側及び 3 '側の配列（又はその相補配歹 IJ)の中からそれぞれプライマーを調製し、これ らプライマーを用いてゲノム DNA (又は cDNA)等を鎳型にして PCR等を行レ、、両プ ライマー間に挟まれる DNA領域を増幅することで、本発明にかかる遺伝子を含む D NA断片を大量に取得できる。
[0068] なお、本発明に力かる遺伝子の取得において、 cDNAを用いる場合、当該 cDNA は、発芽種子の胚芽力 mRNAを抽出し、その mRNAを逆転写して得ることが好ま しい。ォォムギでは、 HPL活性は、発芽種子 (発芽後 3日から 7日）の胚芽に多く検出 されること力ら、上記のように、発芽種子の胚芽を材料に用いることにより、効率よぐ 本発明にかかる遺伝子を取得することができる。
[0069] また遺伝子配列情報をもとにして、該配列をもつポリヌクレオチドを、公知の化学合 成を用いて合成してもよい。
[0070] また、上記プローブの配列を、上記本発明にかかるタンパク質の機能上重要と考え られる領域（例えば、上記 HvHPL2タンパク質におけるヘム結合部位のコンセンサス 配列等）をコードする配列の中から選択し、各種植物やその他の生物のゲノム DNA ( 又は cDNA)ライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に力かるタンパク質と同等 の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離できる可能性が高 レ、。
[0071] また、本発明にかかる遺伝子の変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天 然に生じることが可能である。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所 定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の 1つが意図される。ま た、天然に存在しない変異体は、例えば、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて 生成され得る。
[0072] <4.本発明に力かるタンパク質〉
本発明にかかるタンパク質は、麦芽飲料における老化臭の原因物質の生成に関与 するタンパク質であって、具体的には、 9— /13— HPL活性を有するタンパク質であ る。
[0073] 本発明に力かるタンパク質の具体的な例としては、 （a)配列番号 1に示されるァミノ 酸配列からなるタンパク質、（b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個又は数個の アミノ酸が置換、欠失、揷入、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ 9_ /13 - HPL活性を有するタンパク質が挙げられる。
[0074] 上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、上述の HvHPL2遺 伝子の翻訳産物である。これ以後、上記タンパク質を、 HvHPL2タンパク質と称する
[0075] この HvHPL2タンパク質は、配列番号 1に示すように、 491アミノ酸残基力らなり、 その分子質量は、約 53. 7kDaである。
[0076] さらに、本発明にかかるタンパク質は、配列番号 2に示される塩基配列によってコー ドされるタンパク質の 1又は数個のアミノ酸が置換、付カ卩又は欠失したポリペプチドで あってもよい。保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加が好ましぐ 特に好ましいものは、サイレント置換、付加、及び欠失である。上記のものであれば、 本発明に力かるタンパク質又はその一部の特性及び活性を変化させなレ、。これらの 点において、保存的置換であることが特に好ましい。
[0077] また、本発明には、本発明に力かるタンパク質の改変型タンパク質、言レ、換えれば 、変異タンパク質 (変異体)も含まれる。このような改変型タンパク質は、 1又は数個の アミノ酸置換、欠失、又は付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、又は 付加は、 1つ以上のアミノ酸を含み得る。本発明では、上記改変型タンパク質は、上 記（a)および (b)のタンパク質の比活性よりも低レ、比活性しか有さなレ、（例えば、 k
cat が低い、 K値が高いなど）、又は当該活性を全く有さないタンパク質であることが好
m
ましい。
[0078] また、本発明に力かるタンパク質は、天然から分離されたものだけでなぐ化学合成 されても組換え生成されてもよい。つまり、本発明にかかるタンパク質は、細胞、組織 などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿 主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、 本発明に力かるタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。 [0079] 上記付加的なポリペプチドとしては、例えば、マーカー配列（例えば、融合されたタ ンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配歹 IJ)を例示することができる。本 発明の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、へキサ一ヒスチジンぺ プチド（例えば、 pQEベクター（Qiagen, INC.)において提供されるタグ）であってもよ レヽ。 Gentzら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)において記載されてい るように、へキサ一ヒスチジンペプチドは、融合タンパク質の簡便な精製に有用である 。また、これ以外にも、多くの公的及び Z又は商業的に入手可能なマーカーアミノ酸 配列を利用可能である。例えば、 Wilsonら、 Cell 37: 767 (1984)によって記載されて いるように、「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA)タンパク質由来のェピ トープに対応する精製のために有用なペプチドである。他にも、本発明に力かるタン ノ^質の N末端又は C末端に Fcを融合させた融合タンパク質も精製のために有用で ある。
[0080] なお、本明細書において、「タンパク質」との用語は、「ポリペプチド」又は「ペプチド 」と交換可能に使用している。
[0081] 本発明に力かるタンパク質の機能について、上述の HvHPL2タンパク質を例に挙 げて説明すると以下の通りである。
[0082] HvHPL2タンパク質は、図 1に示すように、 CYP74ファミリーに属するメンバーであ り、 CYP74Cに分類される。 HvHPL2タンパク質は、例えば、 9—リポキシゲナーゼ によって、リノール酸が変換された 9— HPODを 3 (Z)—ノネナールに開裂分解する 反応を触媒する（図 2を参照）。その後、 3 (Z)—ノネナールは酵素的（イソメラーゼに よる）または非酵素的に 2 (E)—ノネナールに異性化されると考えられている。このリノ ール酸から 2 (E)—ノネナールへの一連の変換反応は、ビールなどの麦芽飲料の製 造の際、仕込工程中に起こるものである。すなわち、 HvHPLタンパク質は、麦芽飲 料の製造工程において、麦芽飲料の老化臭の原因物質である 2 (E)—ノネナールの 生成に寄与するタンパク質である。これまでに、麦芽中の 9—リポキシゲナーゼタンパ ク質は同定されていたが、本発明において、新たに HvHPL2タンパク質を同定する ことに成功した。
[0083] したがって、本発明によれば、 HvHPL2タンパク質の活性に変異のある変異体を 利用すれば、ビールなどの麦芽飲料の原料としたときに、老化抑制効果のあるォォ ムギを育種することが可能である。
[0084] < 5.本発明にかかるタンパク質の取得方法〉
本発明にかかるタンパク質を取得する方法（又はタンパク質の生産方法）は、特に 限定されるものではないが、まず、本発明にかかるタンパク質を含有する生物学的試 料 (例えば、細胞、組織、生物個体等）などから単純精製する方法を挙げることができ る。
[0085] 植物材料から、本発明にかかるタンパク質を精製する場合、発芽種子の胚芽から 抽出することが好ましい。ォォムギでは、 HPL活性は、発芽種子 (発芽後 3日から 7日 )の胚芽に多く検出されることから、上記のように、発芽種子の胚芽を材料に用いるこ とによって、効率よぐ本発明にかかるタンパク質を精製することができる。
[0086] また、精製方法についても特に限定されるものではなぐ公知の方法で細胞や組織 力 細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて 精製すればよい。例えば、細胞又は組織より抽出した粗タンパク質画分を高速液体 クロマトグラフィー（HPLC)にかけ、本発明にかかるタンパク質の精製.分離を行うこ とがでさる。
[0087] 精製に用いる緩衝液には、可溶化剤として Triton X— 100や Tween20などの非 イオン性界面活性剤を 0. 01 -0. 5%程度含有した緩衝液を用いることが好ましい。 一般に、 CYP74ファミリータンパク質は、膜蛋白質であるので、上記構成の緩衝液を 用いることにより、タンパク質の可溶化が容易となり、効率よぐ本発明にかかるタンパ ク質を精製することができる。
[0088] また、上記緩衝液は、 β—メルカプトエタノールゃジチオスレィトールなどの還元剤 を含むことが好ましい。上記還元剤を含むことにより、タンパク質が有する SH基 (チォ ール基）が酸化され、ジスルフイドを形成するのを防ぐことができる。
[0089] さらに、上記緩衝液は、プロテアーゼインヒビター (例えば、ロシュ製のコンプリートプ 口テアーゼインヒビターなど)を含むことが好ましレ、。上記プロテアーゼインヒビターを 含むことにより、タンパク質の精製過程において、 目的タンパク質 (ここでは、本発明 にかかるタンパク質）がプロテアーゼによって分解されるのを防ぐことができる。 [0090] また、その他の本発明にかかるタンパク質を取得する方法として、遺伝子組み換え 技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明にかかる遺伝子をべク ターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞 内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製するという方法などを採用することが できる。遺伝子の導入 (形質転換)や遺伝子の発現等の具体的な方法にっレ、ては後 述する。
[0091] なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿 主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、及び宿主には様々なもの が存在するので、 目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を精製 する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なる力 タグの利用等によつ て比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
[0092] 変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば 、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、 P CR法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、ある いはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作 製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（a)のタンパク質を コードする cDNAの塩基配列において、 1又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及 び Z又は付加されるように改変をカ卩えることによって作製することができる。また、変 異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
[0093] また、本発明に力かる改変型タンパク質として、上記例示した上記（a)および (b)の タンパク質の比活性よりも低い比活性しか有さなレ、（例えば、 k が低レ、、 K値が高
cat m レ、など）、又は当該活性を全く有さないタンパク質を製造する場合、上記変異は、例 えば、活性中心及び Z又は基質結合部位のような酵素反応において重要な部位（ァ ミノ酸残基）に導入することが好ましい。そうすれば、効率よぐ所望の改変型タンパク 質を得ることができる。
[0094] 本発明にかかるタンパク質の取得方法は、上述に限定されることなぐ例えば、市販 されているペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよい。またその 他の例としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかかる遺伝子 から本発明に力かるペプチドを合成してもよレ、。
[0095] < 6.本発明に力かる組換え発現ベクター >
本発明に力かる組換え発現ベクターは、上記（a)又は (b)に記載のタンパク質をコ ードする本発明の遺伝子を含むものである。例えば、 cDNAが揷入された組換え発 現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又 はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も 公知の方法を用いて行えばょレ、。
[0096] ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなぐ宿主（ホスト）細胞中で発 現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確 実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にか 力る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればょレヽ 。力かる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスべク ター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、ェピソームベクター、及びウィルス由 来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バタテリオファージ、酵母ェピソーム、酵母染色 体エレメント、ウィルス（例えば、ノくキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィル ス、アデノウイルス、トリボックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、及びレトロウイルス）、 並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利 用可能である。
[0097] 一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中力、又 は荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウィルスである場合、ベタ ターは、適切なパッケージング細胞株を用いて in vitroでパッケージングされ得、次い で宿主細胞に形質導入され得る。また、レトロウイルスベクターは、複製可能か又は 複製欠損であり得る。後者の場合、ウィルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞に おいてのみ生じる。
[0098] また、 目的の遺伝子に対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適 切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供 給され得るか、又は宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。この点 に関する好ましい実施態様としては、ベクターは、誘導性及び/又は細胞型特異的 であり得る特異的な発現を提供するものであることが好適である。このようなベクター の中で特に好ましいベクターは、温度及び栄養添加物のような操作することが容易で ある環境因子によって誘導性のベクターである。
[0099] 細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、 pQE70、 pQE60、及び pQE_ 9 (Qiagen力ら入手可肯 )； pBSベクター、 Phagescriptベクター、 Bluescriptベ クタ一、 pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A (Stratageneから入手可肯 ；並 びに ptrc99a、 pKK223_ 3、 pKK233 _ 3、 pDR540, pRIT5 (Phrmacia力ら人手 可能）が含まれる。
[0100] また、好ましい真核生物ベクターの中には、 pWLNEO、 pSV2CAT、 p〇G44、 p XT1、及び pSG (Stratageneから入手可能）；並びに pSVK3、 pBPV、 pMSG、及び pSVL (Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
[0101] 植物における使用に好ましいベクターの中には、例えば、プラスミド「pBI121」、「p BI221」、「pBI101」（いずれも Clontech社製）、「pTA7001」、「pTA7002」(Aoyam aら (1997) Plant J. 11:605)、 ΓΡΡΖΡ211 J (Hajdukiewicz et al" Plant Mol. Biol. 25:9 89(1994)などが含まれる。
[0102] 本発明に力かる遺伝子が宿主細胞に導入されたか否力、さらには宿主細胞中で確 実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。すなわち 、発現ベクターは、少なくとも 1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このような選 択マーカーとしては、例えば、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクタ一 ゼ又はネオマイシン耐性、 E. coli及び他の細菌における培養についてはテトラサイ クリン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。 また、植物細胞においては、ネオマイシン耐性遺伝子、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子 等の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。さらに、その他にも宿主細胞中で欠失し ている遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかる遺伝子とを含む プラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによつてマーカー遺伝 子の発現から本発明にかかる遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発 明に力かるタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよ 例えば、ォワンクラゲ 由来の緑色蛍光タンパク質 GFP (GreenFluorescent Protein)をマーカーとして用い、 本発明に力かるタンパク質を GFP融合タンパク質として発現させてもよい。また、本 発明にかかる遺伝子は、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクタ 一に結合されてもよい。
[0103] また、 DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、ファージ λ PLプロモータ 一、 E. coli lacプロモーター、 trpプロモーター、及び tacプロモーター、 SV40初期 プロモーター及び後期プロモーター、並びにレトロウイルス LTRのプロモーター）に 作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、従来公知 のプロモーターを利用可能である。
[0104] 本発明において、使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、 E. coli lad 及び lacZプロモーター、 T3プロモーター及び T7プロモーター、 gptプロモーター、 え PRプロモーター及びえ PLプロモーター、並びに trpプロモーターが含まれる。適 切な真核生物プロモーターとしては、 CMV前初期プロモーター、 HSVチミジンキナ ーゼプロモーター、初期 SV40プロモーター及び後期 SV40プロモーター、レトロウイ ルス LTRのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウィルス（RSV)のプロモーター）、並び にメタ口チォネインプロモーター（例えば、マウスメタ口チォネイン Iプロモーター）が挙 げられる。
[0105] また、植物細胞での使用に適したプロモーターの中には、カリフラワーモザイクウイ ノレスの 35Sプロモーター（Odell et al.， Nature, 313:810(1985))、イネのァクチンプロ モーター（Zhang et al.， Plant Cell, 3: 1155(1991))、トウモロコシのュビキチンプロモ 一ター（Cornejo et al, Plant Mol. Biol., 23:567(1993))などが含まれる。
[0106] また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌'細菌'ウイ ルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの 外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このような プロモーターとしては、例えば、糸状菌'細菌'ウィルスの感染や侵入によって発現す るイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al., Plant Mol. Biol., 30:387(1996)) やタバコの PRタンパク質遺伝子のプロモーター (Ohshima et al., Plant Cell 2:95(1990 ))、低温によって誘導されるイネの ipl 9」遺伝子のプロモーター（Aguan et al., Mol. Gen Genet. , 240: 1(1993))、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp7 2」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al., Planta, 193:57(1994))、乾燥によつ て誘導されるシロイヌナズナの「rabl 6」遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1406(1990))、紫外線の照射によって誘導されるパセリの力 ノレコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J., 8:651(1989 ))、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ モーター（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624(1987))などが挙げられ る。
[0107] また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコの PRタンパク質遺伝子のプロ モーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rabl 6」は植物ホルモンのァ ブシジン酸の散布によっても誘導される。またダルココルチコイドやエストロジヱンの 処理によって植物内で誘導的遺伝子発現が可能であるシステムを有するベクター系 の使用も含有し得る。ダルココルチコイド処理によって発現誘導可能なベクターとして は pTA7001、 pTA7002(Aoyama et al., Plant J., 11 :605(1997))や、ェストロジェン 処理によって発現誘導が可能なベクターとしては pER10(Zuo et al. , Plant J., 24:265 (2000))が挙げられる。
[0108] また、増殖細胞特異的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば S〜M期 に発現するタバコ NPK1遺伝子のプロモーター (Nishihama et al., Genes Dev., 15:35 2(2000))、 M期に発現するプロモーターとしてタバコ NACK1遺伝子のプロモーター（ Nishihama et al , Cell, 109:87(2002))、ニチニチソゥ CYM遺伝子プロモーター (Ito et al., Plant J.，11 :983(1997))、 S期に発現するニチニチソゥ CYS遺伝子プロモーター (I to et al. , Plant J.，11 :983(1997))、増殖細胞において細胞周期を通じて発現が認めら れるシロイヌナズナ cdc2a遺伝子のプロモーター (Chung et al., FEBS Lett. ,362:215( 1995))などが挙げられる。
[0109] また、組織特異的プロモーターの例としては、 US 5459252および US 563336 3 (根特異的）、 US 5097025 ( (i)種子、（ii)成熟植物）、 US 5391725 ( (i)葉緑 体、（ii)糸田胞質ゾノレ）、 US 4886753 (根粒）、 US 5646333 (表皮）、 US 5110 732 ( (i)根、（ii)貯蔵根）、 US 5618988 (貯蔵器官）、 US 5401836および US 5792925 (根）、 US 4943674 (果実）、 US 5495007 (師部）、および US 5824 857 (脈管構造)の特許文献に見出すことが可能である。これら特許文献は各々、本 明細書に援用される。
[0110] これらのプロモーターに加え、維管束の前形成層特異的なプロモーターであるシロ ィヌナズナ AtHB8プロモーター (Baima et al. Development 121 :4171(1995))、茎や 根に特異的なシロイヌナズナ ACL5プロモーター (Hanzawa et al. The EMBO Journal , 19:4248(2000))、地上部に特異的なトマト RBCS3Aプロモーター (Meier et al. Plant Physiol. 107: 1105(1995))なども使用することができる。
[0111] 組換え発現ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、及び、転写領 域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によ つて発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転 写開始 AUGを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
[0112] また、高等真核生物による DNAの転写は、ベクター中にェンハンサー配列を挿入 することによって増大させ得る。ェンハンサ一は、所定の宿主細胞型におけるプロモ 一ターの転写活性を増大するように働ぐ通常約 10〜300bpの DNAのシス作用性 エレメントである。ェンハンサ一の例としては、 SV40ェンハンサー（これは、複製起点 の後期側上の 100〜270bpに位置される）、サイトメガロウィルスの初期プロモーター ェンハンサー、複製起点の後期側上のポリオ一マエンハンサー、及びアデノウイルス ェンハンサ一が挙げられる。
[0113] また、上記宿主細胞は、特に限定されるものではな 従来公知の各種細胞を好適 に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体 (例えば、 E. coli細胞 、 Streptomyces細胞、及び Salmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細 胞）；昆虫細胞（例えば、 Drosophila S2細胞及び Spodoptera Sf9細胞）；動物細胞（ 例えば、 CH〇細胞、 COS細胞、及び Bowes黒色腫細胞）；並びに植物細胞（例え ばシロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物、イネ、ォォムギなどの単子葉植物）が挙 げられる。より具体的には、ヒトゃマウス等の哺乳類の細胞だけでなぐ例えば、カイコ ガ由来の細胞をはじめとして、キイ口ショウジヨウバエ等の昆虫、大腸菌（Escherichia coli)等の細菌、酵母（出芽酵母 Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母 Schizosaccharo myces pombe)、線虫し aenornaoditis elegans、フノリフッメフエル (Xenopuslaevis)の 卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞 のための適切な培養培地及び条件は当分野で公知ものを利用可能である。
[0114] 上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定 されるものではな エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DE AEデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフエクシ ヨン、感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、 Davi sら、 Basic Methods In Molecular Biology (1986)のような多くの標準的実験マ二ユア ルに記載されている。
[0115] なお、本発明は、本発明にかかるタンパク質の部分断片（フラグメント）を組換え的 に生成するための、本発明に力かるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオ チドを含む組換え発現ベクター、組換え発現ベクターで遺伝子操作された形質転換 体 (宿主細胞)を提供することもできる。
[0116] さらに、本発明には、上述の組換え技術によって本発明にかかるタンパク質、又は そのフラグメントの産生に関する発明も含まれ得る。すなわち、本発明には、組換え 技術を利用して本発明にかかるタンパク質やそのフラグメントを生産する方法も含ま れ得る。力かる技術によって生産された組換えタンパク質は、硫安沈殿又はエタノー ル沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の 方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、 高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」 )が精製のために用いられる。
[0117] < 7.本発明にかかる形質転換体 >
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかる遺伝子が導入された形質転換体、 すなわち、上記 < 6 >の項に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体で ある。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法 (遺伝子操作技 術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、 上記「形質転換体」とは、細胞 '組織'器官のみならず、生物個体を含む意味である。
[0118] 本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、上述した組換え発現べクタ 一を形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特 に限定されるものではなぐ上記 < 6 >の項で例示した各種微生物や動物、植物を 挙げることができる。
[0119] 本発明にかかる好ましい形質転換体としては、本発明にかかる遺伝子、又は、他種 植物に由来し、本発明にかかる遺伝子に相同性を有する相同遺伝子を、公知の遺 伝子工学的手法 (遺伝子操作技術）により、宿主細胞に発現可能に導入することによ り、当該遺伝子の発現量を人為的にコントロール (過剰発現又は抑制）した形質転換 体が挙げられる。
[0120] つまり、本発明には、本発明にかかるタンパク質の活性が改変された植物も含まれ る。上記「本発明にかかるタンパク質の活性が改変された植物」とは、本発明にかか るタンパク質の発現またはタンパク質の機能が変化した植物であり、該タンパク質の 発現量または発現したタンパク質の機能が野生型と比較して検出可能なレベルで変 化している植物が好ましい。なお、「発現量の変化」とは、恒常的発現、誘導的発現、 過剰発現、異所的発現、発現の抑制を含む意味である。
[0121] 宿主生物が植物である場合、形質転換に用いる植物材料は特に限定されるもので はなぐプロトプラスト、細胞、カルス、器官葉、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子等 の増殖可能な植物材料、花、実、葉、根、又は挿木等の植物体の一部等を用いるこ とができる。さらに、形質転換する方法についても特に限定されるものではなぐ従来 公知の方法を用いることができる。例えば、プロトプラスト共存培養法やリーフディスク 法等ァグロバタテリゥム属細菌の感染を利用する方法、ポリエチレングリコール法、ェ レクト口ポレーシヨン法、マイクロインジヱクシヨン法、パーティクルガン法、リボソーム法 、適切なベクター系を用いた導入法等を例に挙げることができる。
[0122] 上記例示した形質転換に用いる植物材料及び方法は、宿主の種類に応じて、最適 な方法を選択すればよい。
[0123] < 8.本発明にかかる遺伝子及びタンパク質の利用〉
(8 - 1. 9— /13— HPL活性の低い植物）
本発明に力かる遺伝子の利用の一形態として、 9— Z13— HPL活性の低い植物、 当該植物の利用について、以下説明するが、本発明はこれに限定されるものではな レ、。
[0124] 本発明にかかる遺伝子、及び Z又は改変型タンパク質をコードする遺伝子を用い れば、 9— /13— HPL活性が低下した植物を生産することができる。ここでいう「9_ Z13 HPL活性が低下した植物」とは、野生型植物に比べて、 9— Z13 HPLタ ンパク質の含有量が減少したため、当該酵素活性が低下した植物と、 9-/13-H PLタンパク質の質的な変化、具体的には比活性が低下（例えば、 k の低下や K値
cat m の上昇など）したために、当該酵素活性が低下した植物との両方を含む意味である。 また、 9 /13— HPLタンパク質の量的減少と、質的減少とが共に起こった植物で あってもよレヽ。
[0125] 上記の植物は特に限定されるものではないが、本実施形態では、ムギ類、特にォ ォムギであることが好ましい。上記植物がォォムギである場合、 9— /13— HPL活性 が低い麦芽を製造することが可能となる。このような麦芽をビールなどの麦芽飲料の 製造に用いれば、保存時における 2 (E) ノネナールの生成が低減され、カードボー ド臭の少ない麦芽飲料を製造することができる。また、製造工程においても、老化臭 の原因物質の生成を抑制することができる。すなわち、本発明によれば、麦芽飲料に おいて、香味品質の向上 (維持）と、老化臭の抑制とを両立させることができる。
[0126] なお、本明細書にぉレ、て、「麦芽飲料」とは、麦芽のみのビール、エール、ドライビ ール、ユア一ビアー、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポータ 一、ボックビール、スタウト、麦芽酒、発泡酒、ノンアルコール麦芽酒などが含まれる。 さらに、代替麦芽飲料も含まれる。代替麦芽飲料としては、例えば、レモン、オレンジ 、ライム若しくはイチゴのような果実風味又は柑橘類風味の麦芽飲料、ウォッカ、ラム 、又はテキーラのような酒風味の麦芽飲料や、コーヒー風味の麦芽飲料などが挙げら れる。
[0127] 上記のような 9— Z13 HPL活性の低い植物を製造する方法は、特に限定される ものではない。例えば、天然に存在する変異体からこのような表現型を示す植物を選 抜することによって得ることができる。また、人為的に当該植物を製造することができ る。その場合、例えば、以下の（I)〜 (VIII)のような方法を用いることができる。
[0128] (I)形質転換 植物を、本発明にかかる遺伝子発現を操作するように、又は本発明にかかる遺伝 子の構造を改変するように設計された種々の核酸分子を用いて形質転換することが できる。本実施形態には、上述した本発明にかかる改変型タンパク質をコードする遺 伝子を用いた形質転換も含まれる。なお、形質転換方法や、形質転換に用いる植物 材料にっレ、ては、上記 < 7 >項で例示したものを適宜用いればょレ、。
[0129] (II)突然変異誘発
本発明にかかる遺伝子を、キメラ RNAZDNAオリゴヌクレオチドを用いる部位特 異的突然変異誘発の標的とすることができる。これらのキメラ RNA/DNAオリゴヌク レオチドは、植物細胞（Zhuら、 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773;及び Bee thamら、 1999， Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778)及び哺乳動物細胞（Yoonら、 1 999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076)において所望の位置に突然変異を導入 できることが知られている。なお、キメラ RNA/DNAオリゴヌクレオチドは、上記く 7 >項で例示した形質転換方法や、植物材料を用いて形質転換することができる。
[0130] また、所望の位置に突然変異が導入されてレ、るか否かは、従来公知の方法、例え ば、 PCRに基づく方法などを用いることにより、確認及び追跡することができる。
[0131] したがって、本発明にかかる遺伝子を、キメラ RNA/DNAオリゴヌクレオチドを用 いる部位特異的突然変異誘発の標的とすれば、本発明にかかる遺伝子中の特定の 部位に変異を導入することができる。
[0132] 上記方法によれば、本発明にかかる遺伝子のプロモーター領域において、 1ヌクレ ォチド以上の変異を導入し、本発明にかかる遺伝子の転写をダウンレギュレート又は ノックアウトすること力 Sできる。また別の様式として、本発明にかかる遺伝子のコード領 域に変異を導入することによって、 9— /13— HPL活性が低下した変異型 9— /13 — HPLタンパク質、すなわち本発明に力かる改変型タンパク質を発現させることがで きる。
[0133] なお、本発明にかかる遺伝子のコード領域における変異は、特に限定されるもので はなぐフレームシフトを生じさせたり、翻訳産物であるタンパク質の末端切断及び Z 又は基質特異性の低下を生じさせたりする揷入、欠失及び置換を含むものである。
[0134] (III)アンチセンス発現 9— Z13— HPL活性が低下した植物は、当該植物において、本発明にかかる遺 伝子のアンチセンス鎖を発現させることによつても実現することができる。アンチセン ス核酸配列を含有する発現ベクターを用いた形質転換は、上記 < 7 >項で例示した 形質転換方法を用いて行うことができる。
[0135] (IV)標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子発現
植物に内在する本発明にかかる遺伝子の発現の抑制は、本発明にかかる遺伝子（ 標的遺伝子）のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換するこ とによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有 するタンパク質をコードする DNA」とは、該 DNAを発現させることによって、植物体 が本来もつ内在性の本発明にかかる遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失も しくは低下させる機能を有するタンパク質をコードする DNAのことを指す。
[0136] なお、形質転換方法や、形質転換に用いる植物材料については、上記く 7 >項で 例示した方法を用いればょレ、。
[0137] (V)共抑制
内在性の本発明にかかる遺伝子の発現の抑制は、本発明にかかる遺伝子 (標的遺 伝子）配列と同一もしくは類似した配列を有する DNAの形質転換によってもたらされ る共抑制によっても達成され得る。 「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一 若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺 伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制 の機構の詳細は明らかではなレ、が、植物においてはしばしば観察される (Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol, 6:810, 1996)。例えば、本発明にかかる遺伝子が共抑制 された植物体を得るためには、本発明に力かる遺伝子若しくはこれと類似した配列を 有する DNAを発現できるように作製したベクター DNAを目的の植物へ形質転換し、 得られた植物より生育が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子 は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90。/o以上 (例えば、 95。/0以上）の配列の同一性を有す る。配列の同一性は、従来公知の方法で決定することができる。
[0138] (VI)化学的突然変異誘発 化学的突然変異原である公知な化合物で種子などを処理することによつても、 9 - Zl 3— HPL活性が低下した植物を生産することができる。上記化学的突然変異原 としては、アジ化ナトリウム（NaN )、メタンスルホン酸ェチル（EMS)、アジドグリセ口
3
ール (AG、 3_ァジド_ 1 , 2 _プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（MNU)、及 びマレイン酸ヒドラジド（MH)などが例示できる。また、 UV照射を用いてもよい。
[0139] また、上記植物がォォムギである場合、アジィ匕ナトリウムを用いることが好ましい。そ うすれば、ォォムギゲノムの DNA (デォキシリボ核酸）配列において安定な変異を誘 導すること力 Sできる。
[0140] 上記方法によれば、本発明にかかる遺伝子のプロモーター領域において、 1ヌクレ ォチド以上の変異を導入し、本発明にかかる遺伝子の転写をダウンレギュレート又は ノックアウトすること力 Sできる。また別の様式として、本発明にかかる遺伝子のコード領 域に変異を導入することによって、 9— /13— HPL活性が低下した変異型 9— /13 — HPLタンパク質、すなわち本発明に力かる改変型タンパク質を発現させることがで きる。
[0141] (VII) RNA干渉
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配 列を逆位反復に配置した DNAの形質転換によってもたらされる RNA干渉によっても 達成されうる。 「RNA干渉」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した 配列を逆位反復に配置した DNAを形質転換により導入すると、外来 DNAに由来す る 2本鎖 RNAが発現し、標的遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。 RNA干 渉の機構としては、第 1段階として、標的遺伝子の mRNAと導入配列由来の 2本鎖 R NAが複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的な RNAが合成される 。第 2段階として、内在性 RNaseによってこの複合体が断片化される。第 3段階として 、 20〜30塩基対に断片化した 2本鎖 RNAが二次的な RNA干渉のシグナルとして 機能することによって再び、内在性の標的遺伝子の mRNAを分解すると考えられて レヽる (Curr. Biol, 7:R793, 1997; Curr. Biol, 6:810， 1996)。なお、形質転換法は、上 述したように、宿主の種類に応じて、最適な方法を選択すればよい。
[0142] 例えば、本発明に力かる遺伝子が RNA干渉によって抑制された植物体を得るため には、まず、本発明にかかる遺伝子若しくはこれと類似した配列を有する DNAを逆 位反復に配置した DNAを発現できるように作製したベクター DNAを目的の植物へ 形質転換する。次に、得られた植物体から 9— /13— HPL活性が低下した植物を 選抜すればよい。
[0143] RNA干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少な くとも 10塩基以上が連続して同一であり、好ましくは 20塩基から 100塩基が連続して 同一であり、さらに好ましくは 50塩基が連続して同一である。また RNA干渉に用いる 遺伝子は、標的遺伝子と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましく は 90%以上（例えば、 95%以上）の配列の同一性を有する遺伝子であってもよい。 さらにより好ましくは、標的遺伝子と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さら に好ましくは 90%以上 (例えば、 95%以上）の配列の同一性を有する遺伝子が逆位 反復に配置したものが挙げられる。とりわけ、これらの標的遺伝子と配列の同一性を 有する遺伝子がスぺーサー配列を挟んで逆位反復に配置されたものが好ましい。配 列の同一性は、従来公知の方法を用いて決定することができる。
[0144] RNA干渉に用いる遺伝子の長さとしては、標的遺伝子の全長を使用してもよいが 、少なくとも 25塩基あればよぐ好ましくは 50塩基、より好ましくは 100塩基、さらに好 ましくは 500塩基あればょレ、。
[0145] また、 RNA干渉は植物ウィルスの感染によっても実現可能である。ゲノムとして 1本 鎖 RNAをもつ植物ウィルスは、その複製過程において 2本鎖 RNA形態をとる。そこ で、植物ウィルスゲノム中に目的遺伝子配列を適当なプロモーターと共に挿入し、こ の組換えウィルスを植物に感染させた場合、該ウィルスの複製に伴い目的遺伝子配 列の 2本鎖 RNAが生成されることになる。その結果、 RNA干渉の効果を得ることが できる（Angell et al., Plant J. 20, 357-362,(1999)) 0
[0146] (VIII)トランスポゾン
トランスポゾン遺伝子を変異原として利用し、所望の植物等において、トランスポゾ ンタグ系統を作出することができる。このようにして、作出したトランスポゾンタグ系統 から、本発明にかかるタンパク質の発現量が低下した植物や、活性が低下した植物 を選抜することにより、 9— /13— HPL活性の低い植物を作出することができる。 [0147] トランスポゾン遺伝子の植物への導入方法は、上述した形質転換法により行うことが できる。
[0148] 上記のような方法で製造した植物から、 9— /13— HPL活性が低下した植物を選 抜する方法は、特に限定されるものではなぐ従来公知の方法を用いることができる。 例えば、遺伝子の発現量を評価する方法としては、ノーザンプロット法などが例示で きる。また、タンパク質の発現量は、本発明にかかるタンパク質を特異的に認識する 抗体を用いた ELISA法やウェスタンプロット法などの免疫学的方法を用いることがで きる。さらに、 9— /13— HPL活性を直接評価する方法として、上記特許文献 2に開 示されるような方法を用いることができる。
[0149] 9 /13— HPL活性の具体的な測定方法としては、（i)植物抽出液に HPODをカロ える等して植物抽出液中の HPODの量を所定値とした後に、所定条件下（例えば、 25°Cで 15分間）インキュベートし、 HPODが HPLにより分解されて生成した分解生 成物の生成量を測定し評価する方法、（ii)植物抽出液に HPODをカ卩える等して植 物抽出液中の HPODの量を所定値とした後に、所定条件下インキュベートし、 HPO Dが HPLにより分解されることによる HPODの減少量を測定し評価する方法が挙げ られる。このような植物抽出液は、所定量の粉砕植物を所定量の緩衝液 (例えば、酢 酸緩衝液）に加え、所定時間攪拌することにより得ることができる。また、このような分 解生成物としては、 HPODが分解されて生成したアルデヒド類が挙げられ、具体的 には、ノネナール（トランス _ 2_ノネナール）、へキサナール、へキセナール、ノナジ ェナールなどが挙げられる。
[0150] 上記分解生成物の生成量を測定する方法としては、特に制限されず、公知の方法 により測定される。例えば、各種誘導体化試薬で分解生成物を誘導体化し、高速液 体クロマトグラフィー（HPLC)で測定する方法、分解生成物をガスクロマトグラフィー で測定する方法が使用できる。また、このような HPODの減少量を測定する方法とし ては、特に制限されず、公知の方法により測定されるが、例えば、基質である HPOD の減少量を紫外吸光で測定する方法が使用できる。
[0151] HPL活性は、このような分解生成物の生成量が少ない又は生成速度が遅いほど、 或いは HPODの減少量が少なレ、又は減少速度が遅レ、ほど、活性が低いと評価でき る。また、 HPL活性は、上記方法により測定された測定値から、以下の式により算出 することにより言平価することもできる。
[0152] (i)分解生成物（アルデヒド類）の生成量を測定する方法では、以下の計算式によつ て脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性 (酵素活性)を算出する。
[0153] 酵素活性 (mU/g) = 1分間における分解生成物の生成量（μ M) X反応液全量（ mL) ÷酵素液量 (mL) ÷酵素液濃度（gZmL)
(ii)脂肪酸ヒドロペルォキシドの減少量を紫外吸光で測定する方法では、以下の計 算式によって酵素活性を算出する。
[0154] 酵素活性 (nkat/g) = l分間における 234nmの紫外吸光度減少 X O. 667 X反 応液全量 (mL) ÷酵素液量 (mL) ÷酵素液濃度（g/mL)
なお、上記方法による検出限界は、分解生成物（アルデヒド類）の生成量を測定す る方法では 0. ImU/gであり、脂肪酸ヒドロペルォキシドの減少量を紫外吸光で測 定する方法では lnkat/gである。
[0155] 上記の方法によれば、 9— /13— HPL活性の低い植物を選抜することができる。
[0156] 上記植物がォォムギであれば、当該ォォムギを用いて、 HPL活性の低い麦芽を製 造することができる。本実施形態に力かる 9— /13— HPL活性の低いォォムギを用 いて、麦芽を製造する場合、 HPL活性は低いことが好ましいが、具体的には、 2mU
Zg以下、より好ましくは 0. ImU/g以下、または 5nkat/g以下、より好ましくは Ink at/g以下であることが好ましい。
[0157] (8 - 2.飲料の製造方法）
本発明の飲料の製造方法は、上述した本発明にかかる形質転換体、または上記（
8 - 1)に例示した植物を用いていればよ その他の具体的な構成は特に限定され るものではない。すなわち、製造する飲料に応じて、当該飲料の製造方法として、従 来公知の方法を用いればよい。また、上記飲料も特に限定されるものではないが、麦 芽飲料であることが好ましい。上記麦芽飲料には、先に例示した麦芽飲料が含まれ る。
[0158] なお、本発明にかかる飲料の製造方法の実施形態として、 9 _Z13 _HPL活性の 低いォォムギから製造された麦芽を用いて、麦芽飲料を製造する方法について、以 下説明する。麦芽飲料の一般的な製造方法として、糖化工程、麦汁煮沸工程、冷却 工程、発酵工程、及び熟成工程を含む方法が挙げられる。本発明においても上記方 法を用いることができる。以下、各工程について説明する。
[0159] 〔糖化工程〕
糖化工程は、麦芽を含む原料を糖化させることにより糖ィ匕液を得る工程である。本 発明で用いられる麦芽は、 9— /13— HPL活性の低いォォムギから製造された麦 芽、すなわち HPL活性の低い麦芽である。具体的には、酵素活性が 2mU/g以下、 より好ましくは 0· lmU/g以下、又は 5nkat/g以下、より好ましくは lnkat/g以下 である麦芽が好ましい。また、このような麦芽はォォムギに水分と空気とを十分に与え て発芽させ、乾燥して幼芽を取り除レ、たものであることが好ましい。麦芽は麦汁製造 に必要な酵素源であると同時に糖ィ匕の原料として主要な澱粉源となる。また、麦芽を 焙燥することにより、麦芽飲料特有の香味と色素とを付与することができる。例えば、 ォォムギを浸麦度 40〜45%まで浸麦した後、 10〜20°Cで 3〜6日間発芽させ、これ を焙煎することによって目的の麦芽を得ることができる。
[0160] 麦芽を含む原料を糖化する方法は、特に制限されないが、例えば、麦芽を含む原 料と仕込み用水とを仕込み釜に入れて混合し、その混合物を所定の温度（好ましくは 65〜75°C)に加温した後、必要に応じて濾過により滓を除去して糖化液を得ることが できる。原料中の麦芽の使用比率は、ビール、発泡酒等の麦芽飲料の種類に応じて 適宜選定される。また、このとき、市販又は別途調製されたモルトエキスを仕込み用 水と混合してもよ 必要に応じてコーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類などの副 原料を添加してもよい。
[0161] 〔麦汁煮沸工程〕
麦汁煮沸工程は、糖化液を濾過して得られる麦汁にホップを添加し、その混合物を 煮沸する工程である。上記糖化液におけるホップの含有量は好ましくは 0. 5〜3. Og ZLの範囲内であり、また、当該混合物の煮沸時間は好ましくは 90〜120分間であ る。これにより、麦芽飲料特有の香りと苦味とが付与され、また、麦芽の酵素の働きが 止められる。
[0162] 〔冷却工程〕 冷却工程では、麦汁煮沸工程後の麦汁 (熱麦汁）を、所定の温度まで冷却する。冷 却された麦汁は、その後、発酵工程に供される。この冷却工程においては、熱麦汁を 通常 15°C以下まで冷却することが好ましい。
[0163] 〔発酵工程〕
発酵工程では、冷却工程後の麦汁に酵母を添加して、麦汁を発酵させることにより 発酵液が得られる。発酵工程で用いられる酵母は、麦汁内の糖分を代謝してアルコ ールゃ炭酸ガス等を産生するもの（レ、わゆるアルコール発酵を行う酒類酵母）であれ ば特に制限されず、具体的には、サッカロミセス'セレピシェ、サッカロミセス'ゥバル ム等が挙げられる。
[0164] また、発酵条件については特に制限されないが、発酵温度は好ましくは 15°C以下 、より好ましくは 8〜： 10°Cであり、発酵時間は好ましくは 8〜： 10日である。このようにし て得られる発酵液を熟成した後、これを濾過することによって、麦芽飲料が得られる。
[0165] 〔熟成工程〕
熟成工程における条件は特に制限されないが、例えば密閉タンク等に貯蔵して貯 蔵温度— 5〜3°Cで 30〜90日間貯蔵することにより残存エキスの再発酵と熟成とを 好適に行うことができる。
また、濾過条件についても特に制限されないが、濾過助剤として珪藻土、 PVPP (ポ リビエノレポリピロリドン）、シリカゲノレ、セルロースパウダー等を用いて濾過を行う。濾過 された麦芽発泡飲料はタンク詰め、たる詰め、瓶詰め、缶詰め等されて市場に出荷さ れる。
[0166] 本発明の方法で製造可能な麦芽飲料としては、例えば、ビール、発泡酒が挙げら れる。本発明の製造方法により製造された麦芽飲料は、麦芽由来の脂肪酸ヒドロぺ ルォキシドが分解されることにより生成するアルデヒド類等の老化物質の含有量が少 なレ、。また、麦芽飲料に含まれる 9— Z13— HPL活性は、量的及び/質的に減少し ている。したがって、当該麦芽飲料は、長期間保存した場合にも、老化臭が少ない、 すなわち老化耐久性に優れているという効果を奏するものである。
[0167] (8 - 3.遺伝マーカーとしての利用）
本発明に力かる遺伝子の一つである HvHPL2は、遺伝マーカーとしても利用可能 である。具体的には、塩基配列中に、ォォムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基 置換を含んでいるオリゴヌクレオチドは、遺伝マーカーとして利用することができる。し たがって、ォォムギ染色体上の HvHPL2遺伝子領域において、上記のようなオリゴ ヌクレオチドを設計すれば、当該オリゴヌクレオチドを遺伝マーカーとして利用するこ とができる。このような遺伝マーカーは、マッピング用の遺伝マーカー群や特定の遺 伝子の単離、および品種改良等の用途に用いることができる。
[0168] なお、本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなぐ特許請求の範囲 に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技 術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含 まれる。
[0169] 〔実施例〕
本発明について、実施例及び図 3〜5に基づいてより具体的に説明するが、本発明 はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなぐ種々 の変更、修正、及び改変を行うことができる。
[0170] 〔実施例 1 : HvHPL2遺伝子の単離'同定〕
まず、本発明者らが既に単離に成功していたイネ由来の OsHPLl遺伝子および O sHPL2遺伝子と、イネ由来の AOS遺伝子（OsAOSl遺伝子および OsAOS2遺伝 子）とにおいて、一次構造を詳細に解析した。その結果、ヘム結合部位の配列は両 者の間では保存されている力 その他の領域は両者の間では明確に異なることが分 かった。
[0171] そこで、イネ由来の OsHPLl遺伝子および OsHPL2遺伝子におけるヘム結合部 位コンセンサス配列（PSEGNKQCPGKDMVVAVGRLMVAVGRLMVA；配列番号 4を 参照）と相同領域をもつォォムギ ESTを公開データベースよりスクリーニングし、ォォ ムギの CYP74C候補の抽出を試みた。
[0172] その結果、 4種の EST (GenBankァクセシヨン番号： CA032976、 BQ757665, A 】465309、及び BF259843)が抽出された。し力し、これらは、それぞれ部分的に配 列が一致したことから、同一の遺伝子であると考えられた。
[0173] 次に、上記の EST配列を利用して、 5 '—RACE法によりォォムギ発芽種子の胚芽 (cv. Haruna Nijo)より完全長 cDNA(HvHPL2と命名）を取得し、その塩基配 歹 1Jを決定した（配列番号 3、および図 3を参照）。さらに、 HvHPL2遺伝子に存在する 最長の ORF (オープンリーディングフレーム）力も HvHPL2タンパク質の一次構造を 予測したところ、 HvHPL2タンパク質は 491アミノ酸残基からなり、その分子質量は、 約 53. 7kDaであると推定された。
[0174] ここで、 OsHPLlタンパク質、〇sHPL2タンパク質、及び HvHPL2タンパク質のァ ミノ酸配列の相同性解析を行ったところ、図 4に示すように、これらのタンパク質の相 同性は非常に高かった。さらに、 OsHPLl遺伝子、 OsHPL2遺伝子、及び HvHPL 2遺伝子を含め、ォォムギおよびイネの CYP74ファミリー遺伝子の系統樹を作成した 。その結果、図 5に示すように、 OsHPLl遺伝子、 OsHPL2遺伝子、及び HvHPL2 遺伝子は、互いに近縁関係にあることが示された。つまり、 HvHPL2タンパク質は、 イネの CYP74Cタンパク質（すなわち、 OsHPLlタンパク質及び〇sHPL2タンパク 質)と構造的に類似していた。
[0175] しかし、上述したように、 CYP74ファミリーに属するタンパク質は、一次構造が類似 しているため、一次構造からだけでは、そのタンパク質が有する活性を予測すること が困難である。また、現在の技術では、 CYP74Aと CYP74Cの活性の差異を構造 やモチーフから推定することはできない。したがって、タンパク質を実際に発現させ、 酵素機能を確定しなければならなレ、。そこで、 HvHPL2タンパク質について、 9— H PL活性、 13— HPL活性、 AOS活性及び DES活性を測定することにした。
[0176] まず、それらの活性を測定するにあたり、 HvHPL2遺伝子の予測〇RF領域（配列 番号 2を参照）を発現ベクターに組込み、組換えタンパク質を大腸菌内で発現させた
[0177] 大腸菌における組換えタンパク質の発現は、以下のようにして行った。
[0178] まず、下記のプライマー 1およびプライマー 2を用いて、 PCR法により、 HvHPL2遺 伝子の ORF領域を増幅し、その断片を平滑末端処理した。
[0179] プライマー l : 5，_GAGGATCCATGACGTCCAAGGTACCCAACAGC-3，（配列番 号 11)
プライマー 2： 5， -GGAAGCTTGCTACTACTATAGTCACTCGGCCC-3 ' (；酉己歹 IJ番 号 12)
次に、上記平滑末端処理した断片を pUCl 18の Hindi部位にクローニング後、大 腸菌発現ベクター pRSETA (インビトロジェン)の BamHI— Hindlllにサブクローニン グした。これを pRSETA_HvHPL2と命名した。なお、これらのプラスミドは、大腸菌 内で、 N末端に以下のアミノ酸配列からなる 36残基のタグペプチドを付加したタンパ ク質を合成する。
[0180] タグペプチド： MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS (配列番 号 13)
次に、 pRSETA—HvHPL2を BL21 (DE3) pLysSに形質転換した。大腸菌内 生産および組換えタンパク質のァフィ二ティー精製は以下の方法に従った。形質転 換株を 100mlの LB培地で 16°Cの条件で前培養し、 OD が 0. 7に到達した時点で
600
、終濃度 2mMとなるようにイソプロピル一 β—チォガラクトピラノシドを添加した。同じ 条件でさらに 16時間培養し、その後細胞を遠心分離によって回収した。細胞に 10m 1の lOmM Tris— HCl (pH7. 2)、 0. 1 % Tween20、 ImM β—メルカプトエタノ ールに懸濁し、— 80°Cで凍結し、融解した後、 100Uの DNase 1(二ツボンジーン） を添加した。 25°C、 10分間インキュベートした後に、サンプルを 4°C、 10分間、 1000 O X gの条件で遠心分離を行い、上清を大腸菌ライセートとして用いた。タンパク質濃 度は、 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad)を用いて測定した。このようにして得られた大 腸菌ライセートの一部を利用して、酵素機能の解析を行った。
[0181] その結果、組換えタンパク質は 9位又は 13位にヒドロペルォキシドを有するリノール 酸及びリノレン酸を分解し、 3 (Z)—ノネナール等のアルデヒドを生成する活性を有し た（図 6を参照）。また、 HPLC— MS分析を行レ、、生成物を解析した結果、 AOSと D ES活性は認められなかった。このこと力ら、 HvHPL2は CYP74Cに属することが明 らかとなつた。
[0182] 発明を実施するための最良の形態の項においてなされた具体的な実施形態また は実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような 具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではな 本発明の精神と次に記 載する特許請求事項の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものであ る。
産業上の利用の可能性
[0183] 以上のように、本発明は、麦芽飲料における老化臭の原因物質の生成に関与する 遺伝子を提供する。それゆえ、本発明にかかる遺伝子を用いれば、麦芽飲料におけ る老化臭の原因物質の生成に関与するタンパク質の発現が抑制されたォォムギの品 種改良に用いることができる。また、当該遺伝子の変異体を用いることによつても、上 記効果を奏するォォムギの品種改良を行うことができる。さらに、本発明は上記ォォ ムギの品種改良にとどまらず、ムギ類全般、より広くは単子葉植物全般の品種改良に 用レ、ることができる。
[0184] また、本発明に力かる遺伝子およびタンパク質は、麦芽飲料の老化を判定するため に用レ、ることもできる。
[0185] さらに、本発明は、上述した品種改良により得られた植物を原材料として、老化が 起こりにくい麦芽飲料を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)又は (b)に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入 、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ 9 /13 脂肪酸ヒドロペルォ キシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
[2] 配列番号 2に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有するこ とを特徴とする遺伝子。
[3] 配列番号 2に示される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジヱントなハイブリダィゼーシヨン条件下でハイブリダィズし、かつ 9— /13— 脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴と する遺伝子。
[4] 請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の遺伝子にコードされることを特徴とするタンパ ク質。
[5] 以下の（a)又は (b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号 1のアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入 、及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ 9一 /13—脂肪酸ヒドロペルォ キシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
[6] 請求項 4又は 5に記載のタンパク質のアミノ酸配列に変異が導入されることによって 、 9— /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性が欠損している、又は比活性が 減少してレ、ることを特徴とする改変型タンパク質。
[7] 請求項 6に記載の改変型タンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
[8] 請求項:!〜 3、又は 7のいずれか 1項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換 え発現ベクター。
[9] 請求項：!〜 3、又は 7のいずれ力 1項に記載の遺伝子又は請求項 8に記載の組換え 発現ベクターを導入してなることを特徴とする形質転換体。
[10] 9 /13—脂肪酸ヒドロペルォキシドリアーゼ活性力 野生型よりも低下しているこ とを特徴とする請求項 9に記載の形質転換体。
[11] 請求項 6に記載の改変型タンパク質を含むことを特徴とする植物。
[12] 飲料の製造方法において、請求項 9又は 10に記載の形質転換体、又は請求項 11 に記載の植物を原材料として用いることを特徴とする飲料の製造方法。
[13] 上記飲料が麦芽飲料であることを特徴とする請求項 12に記載の飲料の製造方法。
[14] 請求項 12又は 13に記載の飲料の製造方法を含む方法によって製造されることを 特徴とする飲料。
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